Tudományos Diákköri Dolgozat
GELENCSÉR ANNAMÁRIA
Hagyományos kínai gyógynövények az alfa-szinuklein amiloid képződés gátlásában
Dr. Tompa Péter MTA-SZBK Enzimológiai Intézet
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2010
Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás…………………………………………………………………………..3 Bevezetés………………………………………………………………………………………4 Amiloidózis……………………………………………………………………………………6 1. Az amiloid kialakulásának kinetikája……………………………………………...6 2. Az amiloid szerkezeti modellje…………………………………………………….6 3. A lag-fázis idejének csökkentése…………………………………………………..8 Hagyományos
kínai
gyógynövények
(Traditional
Chinese
Medicine,
TCM)
használata……………………………………………………………………………………10 Munkám célja………………………………………………………………………………..12 Kísérleti rész…………………………………………………………………………………13 α-synuclein kifejeztetése (WT, A30P, A53T, E46K)………………………………...13 Amiloid képződés nyomon követése………………………………………………….14 Módszerek…………………………………………………………………………….15 Eredmények………………………………………………………………………………….17 1. Kinetika…………………………………………………………………………....17
2. Fémionok hatása…………………………………………………………………...17 3. TCM-ek hatása…………………………………………………………………….18 4. #1 TCM……………………………………………………………………………19
5. #2, #6 TCM hatása az amiloid képződésre………………………………………..20 6. #2, #6 TCM hatása a kialakult amiloid szálakra…………………………………..21 Következtetések……………………………………………………………………………...24 Függelék……………………………………………………………………………………...25 Irodalom……………………………………………………………………………………...28
2
Köszönetnyilvánítás Elsődlegesen
hálás
köszönet
Dr.
Tompa
Péternek,
az
Enzimológiai
Intézet
csoportvezetőjének, aki amellett, hogy mentorom volt a teljes kutatási tevékenység során, jelen dolgozat elkészüléséhez is nagyban hozzájárult. Köszönettel tartozom Dr. Buday László igazgatónak is, amiért engedélyezte, hogy kutatómunkámat az Enzimológiai Intézetben folytassam. Köszönetet mondok továbbá Ságiné Házy Eszter Ph.D. hallgatónak a kutatási folyamatban nyújtott támogatás, a kutatási anyagok feltétel nélküli rendelkezésre bocsátása, valamint a kutató-lét során megtett első lépések levezénylése miatt. Ezen felül köszönet illeti kínai együttműködő partnerünket, Jingyan Zhang professzor asszonyt, aki amellett, hogy rendelkezésünkre bocsátotta a kínai gyógynövénykivonatokat, biztosította a dolgozathoz elengedhetetlenül szükséges háttérirodalmat különös tekintettel a számomra leküzdhetetlen akadályokat jelentő nyelvi nehézségek áthidalására. Emellett köszönet Dr. Mező Gábornak, az ELTE oktatójának, aki amellett, hogy lehetővé tette számomra az Enzimológiai Intézettel való kapcsolatfelvételt, ígéretet tett arra, hogy belső konzulensként egy majdani diplomadolgozat folyamán segíti e téma továbbélését a TDK keretein túl is. Továbbá köszönet mindenkinek, aki ötletekkel, tanácsokkal és építő kritikával segítette a kutatást és a TDK dolgozat előmenetelét.
3
Bevezetés Bár a Parkinson-kórra, napjaink második leggyakoribb neurodegeneratív betegségére (az első az Alzheimer-kór) utaló tüneti feljegyzéseket évezredekkel korábbról találhatunk, magát a betegséget kevesebb, mint 200 éve, egészen pontosan 1817-ben írta le először névadója, James Parkinson. A lassú lefutású, legfőképpen az agy substantia nigra (1. ábra) részében lévő idegsejtek degenerációját okozó Parkinson-kór- tipikusan öregkori betegség, nagyrészt a 60 év felettieket sújtja. A betegség tipikus tüneteit a dopaminerg (dopamin neurotranszmitterrel működő) idegsejtek elvesztése okozza, amelyek a teljesség nélkül a következők: remegés, a mozgásszervek merevsége és lassulása, apróléptű, csoszogó járás, mimikaszegénység, egyensúlyzavarok. A felsorolt fizikai tünetek azonban nagyon
gyakran pszichés
problémákkal, úgy mint- szorongás, alvászavar és depresszió is együtt járnak.. Mivel a tüneteket a dopamin hiánya okozza, a dopaminszintet helyreállító gyógyszerekkel lehetséges a betegség tüneti kezelése, a sejtpusztulás megakadályozására azonban a mai ismereteink szerint nincs mód [1].
1.
ábra: A substantia nigra helye az agyban
2. ábra: Lewy-testek mikroszkópos felvétele
A kór klinikai markere az ún. Lewy-testek (2. ábra) jelenléte [2], amelyek az idegsejtekben lerakódó toxikus aggregátumok, melyek kiváltják a neuronok pusztulását. Fő komponensük az α-szinuklein nevű fehérje, mely elsősorban a preszinaptikus terminálokon fordul elő, funkciója egyelőre még nem tisztázott, a közvélekedés szerint azonban a szinaptikus transzmisszió befolyásolásában játszhat szerepet [1]. Az α-szinuklein rövid (140 aminosav hosszú), jól oldódó, hőstabil, rendezetlen fehérje [6], melynek 3 öröklődő, szintén a Parkinson kórhoz köthető mutánsa, A53T [3], A30P [3, 4] és E46K [5], ismert. 4
A fehérje három régiót tartalmaz: egy amfipatikus N-terminális régiót (1.-60. aminosav), egy ún. NAC [Függ.][7] részt (61.-95. aminosav) és egy prolinban és savas aminosavakban gazdag C-terminális részt (96.-140. aminosav). A leginkább hidrofób, és ennek következtében β-konformációba való rendeződésre hajlamos része a NAC régió -aminek ezért kulcsszerepe van az aggregátumok kialakulásában-, míg legrendezetlenebb régiója a C-terminális rész, amint azt szemléletesen rendezetlenséget jósló programmal (pl. IUPred [Függ.]) mutatható be (3.ábra).
3.
ábra: Rendezetlenség jóslása, szekvencia alapján IUPred programmal
Az α-szinuklein szekvencia további érdekessége az alábbi ábrán szemléltetésre kerülő 6 aminosavból álló, hétszer, nem teljesen konzerváltan megismétlődő KTKEGV motívum (4. ábra). 10 20 30 40 50 60 MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK 70 80 90 100 110 120 EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP 130 140 DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA 4. ábra: α-szinuklein szekvencia, az ismétlődő motívumokkal
A motívum a fent említett mutánsokban is megmarad: az A30P mutáns a 2. és 3., az A53T a 4. és 5. ismétlődés között helyezkedik el, míg az E46K a 4. ismétlődő szakaszban található. A NAC régió tekintetében azonban eddig még nem találtak mutációt. Az α-szinuklein más neurodegeneratív betegségekben is szerepet játszik, úgy, mint például az agykérgi Lewy-test demencia (LBD), Alzheimer-kór, „multiple system atrophy” (MSA), amiotróp laterális szklerózis (ALS), Hallervorden-Spatz szindróma, és a „now called neurodegeneration with brain iron accumulation type 1” (NBIA 1), mely betegségeket az irodalomban „synucleopathies” (szinukleinopátiák) gyűjtőnéven nevezik [8].
5
Mivel a betegségek mindegyikében lassú, halálos és az orvostudomány jelen állása szerint gyógyíthatatlan folyamatról van szó, alapvető fontosságú lehet a betegség hátterében álló fehérje aggregációjának (amiloidképzésének) megakadályozására, illetőleg a képződött aggregátumok szétszedésére vonatkozó kutatások.
Amiloidózis 1. Az amiloid kialakulásának kinetikája [1] Az amiloid szál kialakulása a fehérje alapvető szerkezeti átrendeződésével jár, mely a natív állapot stabilitása miatt lassan megy végbe, ezért egy kritikus méretű rost kialakulása sebesség-meghatározó az amiloidok képződésének szempontjából. Többek között ezért, in vitro a folyamat 3 fázisra bontható: az első az előbbiekben megindokolt úgynevezett lag-fázis (késleltetés, a kritikus rostok kialakulása), amit egy gyors növekedési fázis követ, végezetül pedig telítési görbébe megy át a folyamat. A késleltetés in vivo is megfigyelhető, nagyrészt ennek köszönhető, hogy a betegségek csak idős korban jelentkeznek. 2. Az amiloid szerkezeti modellje A szinukleionopátiák, és más neurodegeneratív betegségek hátterében is fehérje aggregátumok – amiloidok – kialakulása áll. Az amiloid képződés egy fehérjeszerkezeti hiba, melynek lényege, hogy a párhuzamosan futó peptidláncok között az aminosav-sorrendtől függetlenül- hidrogénhidak alakulhatnak ki, melyek így β-szerkezetet alkotnak. Ez a szerkezet sok esetben a láncban található aminosavaktól függetlenül stabil, ezért kialakulásával gyakorlatilag minden fehérje esetében számolni kell. Ez azt jelenti, hogy akárhány, ily módon párhuzamosan futó lánc „összekapcsolódhat” és óriásméretű- akár szabad szemmel is láthatóaggregátumot képezhet, melynek kialakulása gyakran irreverzibilis folyamat. Az ily módon képződött aggregátumokat hívjuk amiloidoknak.
6
5.
ábra: Az amiloid kialakulásának sémája[1]
A fenti ábrán bemutatott képződési folyamat az alábbi lépésekből, egységekből áll: a) A fehérje natív állapotban van. b) Külső behatások, vagy mutáció hatására a szerkezet felbomlik, egyfajta „olvadt” állapotba kerül. Rendezetlen fehérjéknél ez az állapot tekinthető natív állapotnak. c) Teljesen kitekeredett, denaturált állapot d) A polipeptidlánc bizonyos szakaszai a szomszédos fehérjével hidrogénhidakon keresztül összekapcsolódnak. Ez gyakran időben a leghosszabb szakasz. Egy kritikus méret fölött az aggregáció irreverzibilis, további fehérjemolekulák befogásával egyre nő a lánc. e) Amiloid rostokká alakul az aggregátum. Ezek a rostok a szervezet különböző pontjain lerakódnak, és toxikusságuk révén elpusztítják a sejteket. Az előbbiekben, kinetikai és elméleti megfontolások alapján megfogalmazott képződési folyamat a gyakorlatban is jól nyomon követhető, az alábbi AFM-el [Függ.] rögzített sorozaton (6. ábra), amelynek keretében először csak a kezdeti oligomerek/kis rostok láthatók, majd az egyre nagyobb hosszúságú és számú amiloid szálak is megfigyelhetővé válnak.
7
6.
ábra: Amiloid képződés (nem publikált eredmények, Ságiné Házy Eszter által készített felvétetek a hollandiai Twente- Egyetemen)
3. A lag-fázis idejének csökkentése A lag-fázis hossza nagyban függ a körülményektől, hiszen in vitro kísérletekbenamelyek során az amiloid képződését fluoreszcens festékkel Tioflavin-T-vel [ThT, Függ.] követik nyomon [11]- bizonyították, hogy a késleltetést befolyásolja egyrészt a pH (7. ábra), másrészt a hőmérséklet (8. ábra), valamint a fehérje-koncentráció (9. ábra). Ezeket a változásokat érzékeltetik az alábbi ábrák.
7. ábra: pH hatása az amiloid képződés sebességére [9}
8. ábra: hőmérséklet hatása az amiloid képződés sebességére [9]
8
9. ábra: fehérje-koncentráció hatása az amiloid képződés sebességére [10]
A fent említetteken kívül nehézfém-ionok jelenléte is hatással van az amiloid képződésre. Egy 1986-88-as michigani felmérés szerint szignifikánsan nagyobb volt a Parkinson-kór általi halálozás aránya, olyan területeken élőknél, ahol a lakóhely közelében papír-, vas- illetve réz feldolgozó gyárak voltak [12]. A betegek agyában a substantia nigra terület megnövekedett redox-aktív iontartalma (pl. réz, vas) alapján úgy gondolják, az oxidatív stressz is szerepet játszhat az idegsejtek pusztulásában. In vitro kísérletek kimutatták, hogy a többértékű fémionok lényegesen gyorsítják, és így elősegítik az amiloid képződést (10. ábra). A fémionok megváltoztatják a fehérje környezetében a töltéssűrűséget, ezáltal elősegítik a rendezetlen α-szinuklein szerkezetváltozását.
10. ábra: Fémionok hatása az amiloid képződésre ([Mn+] = 2mM) [10]
9
Hagyományos kínai gyógynövények (Traditional Chinese Medicine, TCM) használata A modern szintetikus gyógyszerek orvoslásban betöltött szerepe mellett újra előtérbe kerül a gyógynövények használata is. Kínában egyrészt nagy hagyománya van a gyógyhatású növények alkalmazásának, másrészt széleskörűen kiterjedt adatbázis áll rendelkezésre az alkalmazásuk során elsajátított tapasztalatokról, valamint a különböző füvek betegségekre való hatásáról. Ma teljes kutatóintézetek foglalkoznak e növények hatásának megértésével, kutatják azokat a vegyületeket, amelyek egy-egy betegséget meggyógyítanak. A neurodegeneratív betegségek gyógyítására irányuló kutatások egyik szegmense a különböző TCM-ek vizsgálata, melyeknek neuron-védő szerepet tulajdonítanak. Kínai együttműködő partnereink az amiloid képződés gátlásának szempontjából6 gyógynövényt találtak figyelemre méltónak. Ezek a növények az alábbiak: Gastrodia elata (Tian ma), Cistanche deserticola (Rou Cong Rong), Sichuan lovage rhizome (Chuan Xiong), Polygonum multiforum thunb (Fo-ti), Acorus tatarinowii schott és Uncaria rhynchophylla (Gou Teng) (11. ábrasorozat).
Gastrodia elata
Polygonum multiforum thunb
Cistanche deserticola
Acorus tatarinowii schott 11. ábrasorozat: Kínai gyógynövények
10
Sichuan lovage rhizome
Uncaria rhynchophylla
Az alábbiak szerint ezeket a gyógynövényeket olyan körülmények között használták, ami
kapcsolatban
lehet
kognitív
kórképekkel,
időskori
elbutulással
(demencia),
neurodegeneratív betegségekkel. Gastrodia elata: az orchideák családjába tartozó évszázadok óta használt gyógynövény. A hagyományos kínai orvoslásban fejfájásra, szédülésre, epilepsziára, valamint agyvérzés illetve időskori elbutulás esetén használják, legújabban neuron-védő szerepét vizsgálják. Például, az Alzheimer-kórt okozó amiloid-β által kiváltott sejthalál esetén védő hatásúnak bizonyult a növény éteres kivonata [13]. Cistanche deserticola: a „sivatagok ginzengjének” becézett növényt szintén évszázadok óta használják a vesebetegségek-, az impotencia-, illetve a terméketlenség kezelésére. 1980 óta hatásspektrumát, hatásmechanizmusát részletes vizsgálatoknak vetették alá, amely alapján kijelenthetjük, hogy különböző kivonatai hatásosnak bizonyulnak a tanulás és memóriazavarok javításában, a vesebetegség gyógyításában, az Alzheimeres betegek kezelésében, az immunerősítésben. A növényben található feniletanoid glikozidokat [Függ.] vélik neuron-védő hatásúnak [14]. Sichuan lovage rhizome: menstruációs görcsök, szív- és érrendszeri betegségek, fejfájás esetén használt gyógynövény. Polygonum multiforum thunb: a kínai gyógyászatban az idős kori betegségek kezelésére, veseproblémákra, a memória javítására használták ezt a növényt. In vivo kísérletek alapján neuron-védő hatást tulajdonítanak neki [15]. Acorus tatarinowii schott: étvágytalanság, halláskárosodás, epilepsziás rohamok esetén használják. A legújabb kutatások alapján szintén neuron-védő szerepet tulajdonítanak neki [16]. Uncaria rhynchophylla: a „cats claw”, vagyis „macskakarom” néven ismert növényt leginkább szív- és érrendszeri panaszokra, a központi idegrendszerrel kapcsolatos problémákra
használják.
Fő
alkotóelemei
között
alkaloidok
találhatók,
melyek
vérnyomáscsökkentő hatásúak [17]. Az Alzheimer kórral kapcsolatba hozható amiloid-β aggregációjának gátlására tett kísérletek is kecsegtetőek [18].
11
Munkám célja Mint már említettem, αaz
-szinuklein amiloid képzése több neurodegeneratív
betegséghez is köthető, melyek mai ismereteink szerint még gyógyíthatatlanok. Talán a természetből vett ötletekkel (vagyis a növényekben található aktív komponensek megtalálásával)
juthatunk
közelebb
számos
betegség
kezeléséhez.
E
gondolat
megvalósításának, gyakorlatba való átültetésének fontos szegmense az én munkám, melynek során a kiemelt kínai medicinák hatását vizsgáltam in vitro az α-szinuklein amiloid képzésére abból a célból, hogy potenciális gátló hatású vegyületeket azonosítsak. Ezek az eredmények fontos lépést jelenthetnek gyógyszerhatású készítmények kidolgozása, illetve kezelések kifejlesztése felé.
12
Kísérleti rész α-synuclein kifejeztetése (WT, A30P, A53T, E46K) Kiindulás: az α-synuclein génjét tartalmazó pRK172 vektorból, mely BL21 (DE3) Star E. coli sejtekbe van transzformálva. A -70°C-on tárolt sejteket 5 ml NZYM tápban egy éjszakán át 37°C-on felszaporítom Carbenicillin [Függ.] antibiotikum mellett. Másnap kifejeztetem a fehérjét: az éjszaka felszaporított sejteket 500 ml NZYM tápba pipettázom, antibiotikumot adok hozzá és OD600=0,6-0,8-ig tovább szaporítom. 100µl IPTG-t [Függ.] adok hozzá, 4 órán át 37°C-on indukálok: ekkor fejeződik ki a fehérje. 20 perc alatt Sigma 4-16K típusú centrifuga segítségével ülepítem a sejteket (4000 rpm, 4°C), másnapig -20°C-on tárolom. Következő nap 100 ml lízispufferben felszuszpendálom a sejteket, 4°C-on kevertetem 1 órán át. A baktériumsejtek roncsolása ultrahanggal történik: 2 x 2 percig szonikálok közte 1 perc szünettel, a szuszpenziót jégben tartom, hogy ne melegedjen fel. A sejttörmeléket centrifugálással ülepítem (Sigma 4-16K készülék, 9000rpm, 4°C, 30perc), a fehérje a felülúszóban marad. A felülúszóhoz 1g Streptomicin-szulfátot [Függ.] adok, fél órán át kevertetem 4˘C-on. Ekkor az esetlegesen még megmaradt DNS-törmelékek kicsapódnak. A csapadékot lefugálom (Sigma 4-16K készülék, 9000rpm, 4°C, 30 perc). A felülúszóban lévő fehérjét 29,5 g ammónium-szulfáttal ((NH4)2SO4) csapom ki- egy órát kevertetem 4°C-on. Végül a kicsapódott fehérjét centrifugálással ülepítem (Sigma 4-16K készülék, 9000rpm, 4°C, 30perc), a csapadék -20°C-on tárolható másnapig. A csapadékot 100 ml 10mM Tris [Függ.] pufferben (pH=7,4) feloldom, 0,2 mikronos steril szűrőn átszűröm. A fehérjét anion cserélő oszlopon tisztítom (ld. módszerek)- azokból a frakciókból, melyek a kromatogram alapján tartalmazhatják a kívánt fehérjét, mintát veszek, SDS-PAGE-sel (ld. módszerek) ellenőrzöm a frakciók fehérjetartalmát. A megfelelő frakciókat összeöntöm, százszoros mennyiségű desztillált vízben 16 órán át 3500 Da-s (Serva) membránban dializálom (közben egyszer vízcsere). Végül liofilizálom a fehérjét, amelyet felhasználásig -20°C-on tárolok. Felhasznált oldatok: NZYM táp összetétele: N-Z Care Plus, NaCl, élesztő, MgSO4·7H2O, H2O; pH=7 Lízispuffer összetétele: 10mM Tris [Függ.], 1mM EDTA [Függ.], 1mM PMSF [Függ.]; pH=8, mindig frissen készítve
13
Amiloid képződés nyomon követése A méréshez a liofilizált fehérjét megfelelő pufferben feloldom: 4mg/ml-es oldatot készítek. Ezután 100kDa-os szűrőn (Amicon Ultra-0,5 ml) szűröm a preparálás során keletkezett oligomerek eltávolítása céljából. Meghatározom a szűrés után maradt fehérjeoldat koncentrációját (ld. Módszerek), általában 100-160 µM-os az oldat. Standardizálás céljából 100µM-ra hígítom a pufferrel. Ezután előkészítem a méréshez a 100 µM-os fehérjeoldatot: 100 µl-enként szétosztom egy plate-be (BRAND, 96 lyukú, fekete), 1 µl Tioflavin-T törzsoldatot adok hozzá, ezen kívül a mérésnek megfelelő anyagokat (CuCl2-oldat CdCl2-oldat, TCM)- ld. Eredmények. A méréseket Biotek SYNERGYMx típusú plate-olvasóban végzem. Paraméterek:- termosztálás: 37°C-on - mérési mód: fluoreszcencia - gerjesztés: 445nm - emisszió: 485 nm - érzékenység: 75 % A mérés menete a mérés típusától függ: a) Kinetika mérése: 2 perc inkubálás, majd mérés, ezután 2 óránkénti mérés 3-4 napig. A mérések között a műszerben a plate folyamatosan 800 rpm-en rázódik. b) TCM hatásának vizsgálata: 1. A mintához az előkészítés során adom hozzá a TCM-et. Ebben az esetben 0 és 90 óránál végzek mérést, Cu2+, ill. Cd2+ mellett 0 és 24 óránál. A két időpont között külső rázóban kevertetem a mintákat 37°C-on 800 rpm-mel. A növekedés arányát figyelem. 2. Amiloidok képződése után adom hozzá a TCM-et. Ekkor az előkészítés során a TCM-eket kihagyom. A Cu2+-t nem tartalmazó mintáknak kb. 4 nap szükséges az amiloid képzéshez, a Cu2+-t tartalmazóknak 24-36 óra. Ezután adom hozzá a különböző mennyiségű TCM-et. A mérés menete: a TCM hozzáadása után a plate-olvasóban 10 másodpercig rázódik a plate, majd mérés következik. Ezután fél órán át percenként mér a műszer.
14
Fontosnak tartom megjegyezni, hogy bár in vitro kísérleteket végeztem, a lehetőségekhez mérten megpróbáltam minél inkább közelíteni a fiziológiás körülményekhez: a mérések 37 °C-on, körülbelül fiziológiás pH-n, vizes extraktumok segítségével történtek. Felhasznált oldatok: Puffer a fehérje feloldásához: 10mM Tris, 50mM NaCl, 0,02% NaN3, törzsoldatokból mindig frissen készítve (törzsoldatok: 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,02% NaN3) Tioflavin-T (ThT) törzsoldat: 500 µM ThT [Függ.] 50 mM glicinben, pH = 8,0 CuCl2 és CdCl2-oldat: 5, illetve 50 mM-os törzsoldatokat használok. TCM: a vizes TCM-kivonatokat kínai együttműködő partnereinktől kapom készen.
Módszerek 1. Fehérjetisztítás anion cserélő oszlopon: Célja: α-synuclein tisztítása más szennyező fehérjéktől Oszlop: Resource Q, 6ml Gradiens: A: 10mM Tris (pH=7,4) → B: 10mM Tris, 1M NaCl (pH=7,4), steril szűrt, a pufferek buborék mentesítve vannak. Lineáris gradienst használok, max. 50% B puffer, 25 oszloptérfogat. Az α-synuclein kb. 25,5% B-nél eluálódik.
12. ábra: Példa kromatogramra
2. SDS-PAGE: SDS-poliakrilamid gélelektroforézis Fehérjék méret szerinti elválasztását és detektálását teszi lehetővé. Lényege: az SDS [Függ.] alifás láncával kötődik a fehérjéhez, kitekeri a fehérjeláncot, felszínét 15
egyenletesen bevonja negatív töltéssel. A nettó töltés arányos a mérettel, így a fehérje mozgékonysága a gélben csak méretfüggő lesz. Szeparáló gél: 15% akrilamidot tartalmaz Koncentráló gél: 4% akrilamidot tartalmaz :
13. ábra: Példa gélfuttatásra
Bár a fehérjék csak 14,5 kDa nagyságúak, rendezetlenségük miatt nagyobb molekulatömegnek megfelelő sávban futnak. 3. Fehérjekoncentráció meghatározása: Jasco V-550 típusú spektrofotométeren 280nm-en mért fényelnyelés mérésével Vak: 10mM Tris, pH=7,4 Minta: 10 mM Trisben (pH=7,4) ötvenszeres hígítás Paraméterek: - mód: abszorbancia -
válasz: gyors
-
résszélesség: 2,0 nm
-
leolvasási sebesség: 1000 nm/min
-
leolvasás kezdete: 350 nm
-
leolvasás vége: 220 nm
-
leolvasás: 2,0 nm-enként
Kiértékelés: Lambert-Beer törvény alapján: A = ε·c·l A: abszorbancia, a mért érték ε: abszorpciós koefficiens, értéke: 5960 l: küvettahossz, értéke: 1 cm c: koncentráció, a keresett mennyiség (az egyenletből számolt értéket 50-nel kell szorozni a hígítás miatt. 16
Eredmények 1. Kinetika Munkám első szakaszában ellenőrzésként az irodalomból ismert amiloid képződési kinetikák nyomon követését végeztem el. Ezen mérések segítségével állítottam be a plateolvasó optimális paramétereit. A 14. ábrán példaként egy-egy mérés eredménye látható. A különböző szakaszok (lag-fázis, növekedés, telítés) elkülönülése mellett az is jól látszik az ábrán, hogy az A30P és E46K mutánsok szálképzése a vad típusú (WT) α-szinukleinhez képest sokkal gyorsabb.
Relatív intenzitás
Kinetika WT A30P E46K A53T
1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 0
10
20
40
30
50
60
70
80
90
t(h)
14. ábra: Kinetika mérése
2. Fémionok hatása A mérések gyorsítása és az intenzitásnövekedés szórásának csökkentése érdekében a továbbiakban fémionokat adtam a mérendő fehérje oldatokhoz. Különböző fémionkoncentrációk hatását vizsgáltam az amiloid képzésre. A koncentrációk: 100 µM, 500 µM és 2000 µM. A különböző mutánsok esetében különböző fémion-koncentrációk segítették legjobban az amiloid szálak képződést, így a későbbi TCM-es mérésekhez az optimalizált fémion-koncentrációkat használtam: - WT: 500 µM Cu2+, 500 µM Cd2+ -
A30P: 2000 µM Cu2+, 500 µM Cd2+
-
E46K: 500 µM Cu2+, 2000 µM Cd2+
-
A53T: 100 µM Cu2+, 100 µM Cd2+
Megjegyzendő, hogy a kadmium hatása az irodalomnak megfelelően valamennyivel kisebb volt a rézhez képest, viszont attól eltérően már a 24 órás méréseknél is volt hatása.
17
3. TCM-ek hatása Ezek után elkezdődhetett a TCM-ek hatásának vizsgálata az amiloid képzésre (a kísérleti részben b)/1.-ként leírt módszer). Először az összes rendelkezésemre álló növényi kivonatot teszteltem: 24 órás méréseket végeztem, 100 µl fehérje oldathoz 1 µl TCM-et adva. A TCM-minták: #1: Gastrodia elata #2: Cistanche deserticola #3: Sichuan lovage rhizome #4: Polygonum multiforum thunb #5: Acorus tatarinowii schott #6: Uncaria rhynchophylla A TCM-ek gyakorlatilag ugyanazt a hatást mutatták a vad típusú fehérjénél, mind a mutánsoknál, így az egyik mutáns példáján mutatom be a mérési eredményeket (15. ábra). Az ábrán jól látszik a megnövekedett jelintenzitás a fémionok jelenlétében a fém nélküli mintához viszonyítva (csak 24 óra után!). A diagram utolsó részében kontrollmérések találhatók, a fehérje oldat helyett csak a feloldásához használt puffert mértem be. Így ki lehetett küszöbölni a TCM-ek esetleges kölcsönhatását a ThT-vel.
15. ábra: TCM-ek hatása az amiloid képződésre fémionok mellett.
18
Ha ugyanezeket a 24 órás méréseket fémionok nélkül végeztem el, természetesen nem vártam jelintenzitás növekedést a fehérjéknél önmagukban, azonban érdekes megfigyelés, hogy az #1 TCM a fémionok nélkül is jelentős mértékben elősegítette az amiloid képződést (16. ábra).
Intenzitás változás aránya A53T
A53T+TCM#6
A53T+TCM#5
A53T+TCM#4
A53T+TCM#3
A53T+TCM#2
A53T+TCM#1
A53T
40 35 30 25 20 15 10 5 0
16. ábra: TCM-ek hatása az amiloid képződésre fémionok nélkül
A mérések eredménye: az #1 TCM jelentős mértékben növeli az amiloid szálak képződését, a #2 és #6 TCM viszont teljes mértékben gátolják azt. A szálnövekedést a többi növényi kivonat is gátolja valamilyen mértékben, de a további mérésekhez csak ezt a 3 kiemelt mintát használtam, mivel ezeknek volt a legnagyobb hatásuk. Továbbá, mivel a réz- és a kadmium ionok mellett is ugyanolyan volt a TCM-ek hatása, a későbbiekben a fémionos méréseknél csak a Cu2+-t használtam.
4. #1 TCM A következő kísérletekben először az #1 TCM-et vizsgáltam. Bár az ellenkező hatást érte el, mint ami várható volt, további vizsgálatát ez indokolta. Ugyanis egyes elgondolások szerint a kisebb α-szinuklein oligomerek toxikusabbak, mint maguk az amiloidok, így akár az amiloid képzés irányába eltolt hatás is lehet jó. Különböző mennyiségben adtam a fehérjéhez a TCM-et, keresve, hogy van-e esetleg egy kritikus mennyiség, ami már növeli az amiloid képzést. Sajnos nem találtam ilyen kritikus mennyiséget, sőt, ahogy a 17. ábra mutatja, nem is látható egyirányú növekedés a TCM mennyiségének növelésével. 19
Ezután olyan mérést végeztem, mely során a kész amiloidokhoz adtam a TCM-et (b)/2. módszer), hátha tovább növeli az amiloid szálak képződését, de ebben a kísérleti elrendezésben sem figyeltem meg lényeges hatást. Így a továbbiakban a két gátló hatású TCM-re koncentráltam.
17. ábra: #1 TCM titrálás: 0,2- 5µl TCM/ 100 µl fehérje
5. #2, #6 TCM hatása az amiloid képződésre A két gátló hatású TCM-nél is először megpróbáltam behatárolni, hogy minimálisan körülbelül mennyi TCM szükséges ahhoz, hogy csökkentse az amiloid képződést. Először a 0,2-5 µl TCM/ 100 µl fehérje oldat intervallumban mértem (0,2; 0,5; 1; 2; 5). Mivel az amiloid képződést már 0,2 µl TCM hozzáadása teljesen legátolta, kisebb mennyiségekre tértem át (ezekhez 10-szeresére hígított TCM- kivonatot használtam). A 18. ábra egy fémion nélküli 90 órás mérést mutat, a 19. pedig egy Cu2+- ionok által segített 24 órás mérést. Az ábrákból látható, hogy már nagyon kis mennyiségű TCM is hatással van a fehérjék aggregációjára.
20
18. ábra: #2, #6 TCM titrálás fémion nélkül
19. ábra: #2, #6 TCM titrálás fémion mellett
21
6. #2, #6 TCM hatása a kialakult amiloid szálakra Eddigi méréseim csak azt mutatták, hogy a szálképződés folyamatát a TCM-ek gátolják. A következő mérésekkel sikerült azt is bebizonyítanom, hogy ezen anyagok képesek szétszedni az amiloid szálakat. Ebben az esetben a b)/2. eljárással végeztem méréseimet. Bár a méréseket elvégeztem mind a fémionok nélkül képződött, mind a Cu2+ által segített amiloidokra, azt tapasztaltam, hogy a fémion nélküli minták fluoreszcenciás jelintenzitása nagyon szórt, míg a Cu2+-t tartalmazóké egységesebb volt, így az intenzitás arányának csökkenését nem találtam kiértékelhetőnek a Cu2+ nélküli minták esetében. A fémionos mérésekből viszont meggyőzően látszik (20., 21., 22. ábra), hogy az egyre nagyobb mennyiségben hozzáadott TCM-ek lecsökkentik a ThT jelintenzitását, tehát előidézik az amiloid szétesését, már fél órán belül!
E46K+Cu2+
2ul#6
1 ul #6
0,5 ul#6
0,2ul#6
0,1ul #6
0,01ul#6
2ul#7 új
1 ul #2
0,5 ul#2
0,2ul#2
0,1ul #2
0,01ul#2
1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00
20. ábra: Jelintenzitás csökkenésének aránya TCM hozzáadása előtti intenzitáshoz képest
22
Arány a kezdeti intenzitáshoz képest
E46K + #2TCM 1.00
0,01ul#2 0,1ul #2 0,2ul#2 0,5 ul#2 1 ul #2 2ul#2
0.75 0.50 0.25 0.00 0
10
20
30
t(min)
Arány a kezdeti intenzitáshoz képest
21. ábra: Az amiloid szálak szétesésének nyomon követése a #2 TCM esetében
E46K + #2TCM 1.0
0,01ul#6 0,1ul #6 0,2ul#6 0,5 ul#6 1 ul #6 2ul#6
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0
10
20
30
t(min) 22. ábra: Az amiloid szálak szétesésének nyomon követése a #6 TCM esetében
23
Következtetések Az általam vizsgált különböző neuron-védő hatásúnak tartott kínai gyógynövények mindegyikéről elmondható, hogy in vitro hatással van azα -szinuklein amiloid képzésére. Mivel növényi kivonatokkal dolgoztam, a hatáshoz rendelhető félmaximális koncentráció értékeket nem lehetett meghatározni, azonban a nagy hígítások mellett is megfigyelhető hatások arra utalnak, hogy a növényekben nagyon hatásos vegyületek léteznek. További bizakodásra ad okot, hogy a kiemelt és részletesen tanulmányozott TCM-ek nem csak gátolták az aggregációt, a már kialakult amiloidokat is képesek voltak szétszedni. Úgy gondolom, hogy ez egy jó jel annak érdekében, hogy egy kicsit közelebb kerüljünk a Parkinson-kórból való felgyógyulás lehetősége felé. Természetesen ezek csak a kezdeti lépések. A továbbiakban egyrészt szeretnénk megtalálni a növényekben lévő aktív komponenseket, melyek a gátló hatást okozzák, másrészt AFM-es méréseket végezni azokkal a mintákkal, ahol a TCM előidézte az amiloidok szétesését, hogy megtudjuk, esetleg csak oligomerekre sikerült szétszedni a szálakat, vagy monomer α -szinuklein fehérjék keletkeztek. Tervbe vettük a megfigyelt hatások sejtbiológiai megerősítését is, az amiloidok toxicitására érzékeny sejtes tesztek segítségével. Összességében megállapítható, hogy kezdeti vizsgálataim rendkívül bíztatóak, számos hatásos és gyógyszerfejlesztési szempontból potenciálisan ígéretes vegyületre mutatnak rá. Mindezek fényében kijelenthetem, hogy érdemes kutatni a hagyományos kínai gyógynövények hatásait, mert lehet, hogy a fejfájás és hasonló kisebb betegségek gyógyítása mellett nagyobb lehetőségek is rejlenek bennük.
24
Függelék: NAC: non-Aβ component of AD amyloid Neve onnan származik, hogy az Alzheimer-kórra (AD) jellemző amiloidban az βA -n kívül más peptidet is találtak, melyet NAC-nak neveztek el. Ennek prekurzoraként nevezték el NACP-nek a140 aminosav hosszú fehérjét, mely egyet jelent az α-szinukleinnel. IUPred: fehérje rendezetlenséget predikáló interneten hozzáférhető program: iupred.enzim.hu. Lényege: míg a globuláris fehérjék aminosavai között kölcsönhatások stabilizálják a szerkezetet, addig a rendezetlen fehérjéknél szekvenciájukból adódóan az ilyen kölcsönhatások nem jellemzők. A program algoritmusa ezeket az aminosav párokat veszi végig. A kölcsönható párok hiányából lehet következtetni a rendezetlenségre. A 0,5 fölötti értékű régiók tekinthetők biztosan rendezetlennek. AFM: Atomic Force Microscopy = atomi erő mikroszkópia Közvetlen módszer amiloid rostok jelenlétének vizsgálatára ThT: Tioflanin-T Specifikusan amiloid szálakhoz kapcsolódik, ebben az állapotában gerjesztve kék fényt emittál (maximum 478-484nm-nél), így jelenlétében fluoreszcenciás méréssel az amiloid képződés nyomon követhető.
TCM: Traditional Chinese Medicine. Ez a betűszó használatos általánosságban az irodalomban a hagyományos kínai gyógyszerekre. Feniletanoid glikozidok: az ábrán az alapváz látható, az R csoportoktól függően nagyon sok fajta feniletanoid glikozid létezik.
Carbenicillin:
25
Streptomicin-szulfát:
IPTG: Izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid-hatására a baktériumsejtek szaporodása lecsökken, helyette a célfehérjét fejezik ki.
Tris: 2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol
EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav-komplexképző
PMSF: fenil-metil-szulfonil-fluorid- proteázgátló: sejthalál esetén fehérjéket lebontó proteázok szabadulnak fel, ezt akadályozza meg a PMSF.
26
SDS: nátrium-dodecil-szulfát
27
Irodalom 1. Csermely Péter, Tompa Péter (2007) Kórós fehérjék, fehérjeszerkezeti betegségek, Dr. Mandl József és Dr. Machovich Raymund szerk. Orvosi Patobiokémia könyvben Budapest, Medicina Könyvkiadó Zrt 61-70. oldal 2. Galvin, J.E., V.M. Lee, M.L. Schmidt, P.H. Tu, T. Iwatsubo, and J.Q. Trojanowski (1999) Pathobiology of the Lewy body. Adv Neurol 80: 313-24. 3. Polymeropoulos, M.H., C. Lavedan, E. Leroy, S.E. Ide, A. Dehejia, A. Dutra, B. Pike, H. Root, J. Rubenstein, R. Boyer, E.S. Stenroos, S. Chandrasekharappa, A. Athanassiadou, T. Papapetropoulos, W.G. Johnson, A.M. Lazzarini, R.C. Duvoisin, G. Di Iorio, L.I. Golbe, and R.L. Nussbaum (1997) Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science 276: 2045-7. 4. Kruger, R., W. Kuhn, T. Muller, D. Woitalla, M. Graeber, S. Kosel, H. Przuntek, J.T. Epplen, L. Schols, and O. Riess (1998) Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet 18: 106-8. 5. Zarranz, J.J., J. Alegre, J.C. Gomez-Esteban, E. Lezcano, R. Ros, I. Ampuero, L. Vidal, J. Hoenicka, O. Rodriguez, B. Atares, V. Llorens, E. Gomez Tortosa, T. del Ser, D.G. Munoz, and J.G. de Yebenes (2004) The new mutation, E46K, of alphasynuclein causes Parkinson and Lewy body dementia. Ann Neurol 55: 164-73. 6. Weinreb, P.H., W. Zhen, A.W. Poon, K.A. Conway, and P.T. Lansbury, Jr. (1996) NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry 35: 13709-15. 7. Ueda, K., H. Fukushima, E. Masliah, Y. Xia, A. Iwai, M. Yoshimoto, D.A. Otero, J. Kondo, Y. Ihara, and T. Saitoh (1993) Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 11282-6. 8. Bennett, M. Catherine (2005) The role of α-synuclein in neurodegenerative diseases. Pharmacology &Therapeutics 105: 311-331 9. Uversky, V. N., Li,J. and Fink, A.L. (2001)Evidence for a Partially Folded Intermediate in α-Synuclein Fibril Formation J. Biol. Chem. 276: 10737–10744 10. Uversky, V. N., Li,J. and Fink, A.L. (2001) Metal-triggered Structural Transformations, Aggregation, and Fibrillation of Human α-Synuclein J. Biol. Chem. 276: 44284-44296 11. Voropai, E. S., Samtsov, M. P., Kaplevskii, K. N., Maskevich, A. A., Stepuro, V. I., Povarova, O. I., Kuznetsova, M., Turoverov, K. K., Fink, A. L. Uversky, V. N. (2003) Spectral Properties of Thioflavin T and its complexes with amyloid fibrils J. of Applied Spectroscopy 70: No. 6 12. Rybicki, B. A., Johnson, C. C., Uman, J., and Gorell, J. M. (1993) Parkinson's disease mortality and the industrial use of heavy metals in Michigan. Movement Disorders 8, 87–92 13. H.-J. Kim et al. (2003) Ethyl ether fraction of Gastrodia elata Blume protects amyloid β peptide-induced cell death Journal of Ethnopharmacology 84 95_/98 14. Y. Jiang, P.-F. Tu (2009) Analysis of chemical constituents in Cistanche species J. Chromatogr. A 1216 1970–1979 15. Li, X., Matsumoto, K., Murakami, Y., Tezuka, Y., Wu, Y., Kadota, S. (2005) Neuroprotective effects of Polygonum multiforum on nigostriatal dopaminergic 28
degeneration induced by paraquat and maneb in mice Pharmacology, Biochemistry and behavior 82: 345-352 16. Huang Z, Mao QQ, Zhong XM, Feng CR, Pan AJ, Li ZY. (2009) J Ethnopharmacol. 125(3):456-60 17. Shi, J.S., Yu, J.X., Chen, X.P., Xu, R.X. (2003) Pharmacological actions of Uncaria alkaloids, rhynchophylline and isorhynchophylline Acta Pharmacol Sin 24 (2): 97101 18. Fujiwara H, Iwasaki K, Furukawa K, Seki T, He M, Maruyama M, Tomita N, Kudo Y, Higuchi M, Saido TC, Maeda S, Takashima A, Hara M, Ohizumi Y, Arai H. (2006) J Neurosci Res. 84:427-33.
29
