Gyógyszermaradványok analitikai meghatározása szilárd mintákból (Duna iszap, hordalék és szennyvíziszap) csatolt GCMS-(MS) technikával
Dobor József II. éves PhD-hallgató
Környezetkémiai Doktori Iskola Témavezető: Oltiné Dr. Varga Margit ELTE-TTK, Kémiai Intézet, Analitikai Kémiai Tanszék
1 -08 Budapest, 2009-06
Célkitűzéseim 1. Analitikai módszer megalkotása a vizsgált vegyületcsalád meghatározására szilárd fázisról (minták: szennyvíziszap, Duna iszap, Duna hordalék) mikrohullámmal segített extrakciót követően, GC-MS, és GC-MS/MS mérési módszerrel. 2. A szennyvíztisztítás végtermékeként képződő kevert (aerob lebontási termék) és eleven iszap (anaerob lebontási termék) szennyezettségének megállapítása a további felhasználás, és a kezelés megítélése céljából. 3. A Duna iszap és part menti hordalék minták szennyezettségének hosszú távú (több éves monitoring) ellenőrzése a parti szűrésű kutak vízminőségének biztosítása céljából. Lehetséges összefüggések felderítése az időjárási tényezők (vízállás, csapadékmennyiség, napfény stb.) és a szennyezettség mértékének változása között. 4. A szennyvíztisztítás során végbemenő folyamatok modellezése a kiválasztott vegyületcsaládon az élő rendszerhez közel álló feltételek között a fizikai-kémiai folyamatok (szorpció) és a mikrobiológiai lebomlás arányának megállapítása céljából. 2
A vizsgált, nem szteroid gyulladásgátló gyógyszerek kémiai szerkezete
IBUPROFEN
A kiválasztás indokai: NAPROXEN
- Felhasználásuk jelentős - Metabolizációjuk részleges
KETOPROFEN
- Lebontásuk a szennyvíztisztítási eljárások során részleges - Vízoldhatók - Perzisztensek
DIKLOFENAK
- Irodalmi adatok nagy száma - Markerek
3
I. Szennyvíziszap vizsgálata 1. Mintavétel
Eleven iszap: a biológiai szennyvíztisztítás során keletkező, a mikrobiológiai lebontást végző, baktériumban gazdag iszap. Kevert iszap: a primer (a mechanikai tisztítás során képződő) iszap és az eleveniszap feleslegének az aktuális technológiai paraméterektől függő keveréke.
Fotó: a FCSM, Észak-pesti telepét ábrázolja 4
2. A minta előkészítése Az analitikai feldolgozást megelőző műveletek: - Centrifugálás (FCSM, Észak-pesti telepe) - Szárítás (száritószekrény, 40 °C; liofilizálás) - Aprítás, homogenizálás - Tárolás (hűtve, üvegedényben)
A feldolgozás analitikai lépései: -MASE (microwave assisted solvent extraction=mikrohullámmal segített oldószer extrakció) -DME (dispersive matrix extraction=diszperziós mátrix feltárás) Cél: a mátrix hatás csökkentése. E célból intenzív rázatás történik a szorbenssel (neutrális Al2O3, mesh: 70-230) Al2(SO4)3 elektrolit jelenlétében, majd centrifugálás, vagy szűrés. -SPE (solid phase extrcaction=szilárd-fázisú extrakció) -származékképzés -mérés -kiértékelés 5
2. A minta előkészítése MASE (= microwave assisted solvent extraction = mikrohullámmal segített oldószer extrakció)
DME, tisztítási lépések (dispersive matrix extraction = diszperziós mátrix feltárás)
6
2. A minta előkészítése SPE (solid phase extraction, szilárd fázisú extrakció), OASIS® HLB
Származékképzés (HMDS) 1.LÉPÉS: 125 µL „1,25 G NH2OH.HCL Pyr 2,5% , 30 PERC-EN 70 ºC 2.LÉPÉS: 225 µL HMDS MAJD 25 µL TFA KERÜL AZ EDÉNYEKBE, 90 PERC, 70 ºC
7
3. Mérés, kiértékelés A kiértékeléshez felhasznált fragmens ionok tömegszámai MSMS-MS
Vizsgá Vizsgált vegyü vegyület
MS
ibuprofen
fragmentá fragmentált
detektá detektált
160+161+263
161
145
naproxen
185+243+302
243
170
ketoprofen
104+105+324+325 325
325
207+250+324
diklofenak
214+242+277
179+207+214
179+207+214
Varian 4000 GC-MS-MS - GC-MS - GC-MS-MS üzemmódban
VARIAN 4000 GC/MS/MS SYSTEM (VARIAN, WALNUT CREEK, CA, USA) CP-8400 AUTOSAMPLER TÍPUSA Varian CP-1079 PROGRAMOZHATÓ INJEKTOR TÍPUSA SGE (Victoria, Australia); SGE BPX5 KOLONNA TÍPUSA HŐMÉRSÉKLET ADATOK TRANSFER LINE,
forte capillary: 30 m x 0.25 mm; df. =0.25 µm. 280 °C, 210 °C and 80 °C,
ION TRAP ÉS MANIFOLD
HŐMÉRSÉKLET PROGRAM
Kezd 100 °C-on, 1percig marad 100 °C , ezt követően felfűtés 300 °C –ra (20 °C/min) 5,5 percig 300 °C-on, 8 (összesen 16,5 perc.)
MASE* optimális feltételeinek kidolgozása 1. (hőmérsékletfüggés) A vizsgált vegyületek visszanyerési értékei a mikrohullámmal segített extrakció hőmérsékletének függvényében (minta: desztillált víz).
T [ °C ]
Visszanyerések % (R.S.D. %)
t [perc] Ibuprofen
Naproxen
Ketoprofen
Diklofenak
100
30
97 (±5)
99 (±4)
97 (±5)
97 (±4)
140
30
60 (±6)
80 (±5)
97 (±5)
71 (±4)
180
30
50 (±4)
61 (±4)
92 (±5)
58 (±5)
Addícionált mennyiség: 2x10-8 mol/L
* Microwave assisted solvent extraction (MASE) 9
MASE* optimális feltételeinek kidolgozása 2. (időfüggés) A vizsgált komponensek visszanyerési értékei a mikrohullámú extrakciós idő függvényében, különböző szennyvíziszap mintákon , mérés GC-MS, SIM.
t [perc]
30 20 10 30 20 10
Minta típusa
Kevert iszap Eleven iszap
Visszanyerések % (R.S.D. %) Ibuprofen
Naproxen
Ketoprofen
Diklofenak
103 (±12)
103 (±11)
101 (±13)
106 (±12)
77 (±11)
87 (±12)
81 (±16)
76 (±11)
47 (±16)
64 (±14)
64 (±17)
57 (±16)
101 (±12)
98 (±12)
99 (±14)
103 (±10)
89 (±14)
89 (±14)
80 (±16)
69 (±13)
69 (±16)
72 (±15)
54 (±18)
25 (±17)
Addícionált mennyiség: 2x10-8 mol/L * Microwave assisted solvent extraction (MASE) 10
A vizsgált gyógyszervegyületek visszanyerési értékei különböző mennyiségű addíció esetén, kevert iszap mintákon (a teljes munkafolyamatra)
Addíció, x10-6 mmol/L
Kevert iszap
Deszt. víz
Visszanyerések, % (R.S.D. %) Ibuprofen
Naproxen
Ketoprofen
Diklofenak
5,00
95 (±7)
99 (±5)
98 (±6)
102 (±5)
2,50
103 (±12)
103 (±12)
101 (±16)
106 (±15)
1,23
95 (±11)
97 (±11)
104 (±13)
91 (±14)
0,63
97 (±12)
91 (±13)
102 (±14)
91 (±13)
0,31
85 (±16)
83 (±15)
102 (±17)
89 (±15)
MASE paraméterek Oldószer:
deszt. víz
Max. hőmérséklet: 100 °C Időtartam:
30 perc
11
A vizsgált gyógyszervegyületek visszanyerési értékei különböző mennyiségű addíció esetén, eleven iszap mintákon (a teljes munkafolyamatra)
Eleven iszap
Deszt. víz
Visszanyerések, % (R.S.D. %)
Addíció, x10-6 mmol/L
Ibuprofen
Naproxen
Ketoprofen
Diklofenak
5,00
95 (±7)
99 (±5)
98 (±6)
102 (±5)
2,50
101(±11)
98(±12)
99(±12)
103(±11)
1,25
96 (±15)
96(±13)
98(±15)
101(±13)
0,63
89(±14)
89(±11)
101(±20)
89(±13)
0,31
85(±18)
88(±15)
84(±22)
84(±22)
MASE paraméterek Oldószer:
deszt. víz
Max. hőmérséklet: 100 °C Időtartam:
30 perc
12
A vizsgált gyógyszervegyületek LOQ értékei GC-MS és GC-MSMS módszerek alkalmazása esetén
LOQ értékek ng/g GC-MS (SIM)
GC-MS-MS
LC-MS*
ibuprofen
20
8
20
naproxen
15
11
-
ketoprofen
19
9
50
diklofenak
22
14
20
LOQ = limit of quantification, meghatározási határ : az a legkisebb koncentráció vagy anyagmennyiség, amely még elfogadható megbízhatósággal határozható meg. Számszerű megadása: a vak minta átlaga + 10-szer a vakminta szórása.
* Irodalmi adat 13
AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA KÜLÖNBÖZŐ EXTRAKCIÓS ÉS MÉRÉSI MÓDSZEREKET ALKALMAZVA (ELEVEN ISZAP) 160 140
extrakció mikrohullámmal
extrakció ultrahanggal
120 100 80 60 40 20 0 GC-MS
GCMS/MS Ibuprofen
GC-MS
GCMS/MS Naproxen
GC-MS
GCMS/MS Ketoprofen
ng vizsgált komponens / g száraz minta
GC-MS
GCMS/MS
Diklofenak 14
AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA KÜLÖNBÖZŐ EXTRAKCIÓS ÉS MÉRÉSI MÓDSZEREKET ALKALMAZVA (KEVERT ISZAP) 160 140
extrakció mikrohullámmal
extrakció ultrahanggal
120 100 80 60 40 20 0 GC-MS
GCMS/MS Ibuprofen
GC-MS
GCMS/MS Naproxen
GC-MS
GCMS/MS Ketoprofen
ng vizsgált komponens / g száraz minta
GC-MS
GCMS/MS
Diklofenak 15
II. Duna víz, üledék és hordalék vizsgálata Budapesti Központi Szennyvíztisztító Telep
Mintavétel havonta üledék, hordalék üledék, hordalék és víz
Fővárosi Vízművek
Iszap (Üledék): Max. 30 cm mélységből, max. 100 cm távolságban a meder szélétől, a vízzel fedett terület alatti réteg. Hordalék: Max. 100 cm távolságban a meder szélétől a part menti réteg.
16
A vizsgált vegyületek visszanyerési értékei a mikrohullámmal segített extrakció idejének függvényében (minta: desztillált víz).
extrakció ideje [perc]
Visszanyerések % (R.S.D. %) Ibuprofen Naproxen
Ketoprofen
Diklofenak
30
95 (13)
95 (12)
101 (15)
97 (10)
20
97 (12)
99 (10)
96 (14)
95 (11)
10
67 (14)
88 (11)
87 (12)
73 (14)
Addícionált mennyiség: 2x10-8 mol/L 17
A vizsgált gyógyszervegyületek visszanyerési értékei különböző mennyiségű addíció, különböző szilárd minták esetén(a teljes munkafolyamatra) és az LOQ értékek meghatározása
Visszanyerések % (R.S.D. %)
minták
Addícionált mennyiség [mol/L] Ibuprofen
Naproxen
Ketoprofen
Diklofenak
Csepel, hordalék
2x10-8
96 (13)
97 (11)
100 (13)
97 (10)
2x10-9
99 (12)
98 (13)
102 (16)
96 (14)
Kvassay D, iszap
2x10-8
97 (13)
99 (10)
96 (14)
95 (11)
2x10-9
95 (14)
96 (14)
99 (15)
97 (13)
4
3
6
5
LOQ ng/g
Mért értékek MASE paraméterek Oldószer:
deszt. víz
Max. hőmérséklet: 100 °C Időtartam:
20 perc
Ibuprofen: < LOQ Naproxen: LOQ- 20 ng/g Ketoprofen: < LOQ Diklofenac: LOQ- 50 ng/g Az adatok kiértékelése folyamatban van.
18
Az előadás anyagából eddig megjelent közlemények: Dobor József, Varga Margit, Záray Gyula. Gyógyszermaradványok meghatározása szennyvíziszap mintákban mikrohullámú extrakciót követően GC-MS módszerrel (poszter) IV. Kárpát-medencei Környezettudományi Konferencia, Debrecen, 2008 Konferencia kiadvány, 2008. 198-204 o.
Közlésre beküldve: József Dobor, Margit Varga, György Palkó, Gyula Záray Determination of acidic drugs in sewage sludge by microwave assisted solvent extraction using gas chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-tandem mass spectrometry
Science of the Total Environment submitted
19
Köszönetnyilvánítás: Oltiné Dr. Varga Margitnak docensasszonynak, témavezetőmnek Dr. Záray Gyula professzornak és támogatásukért és hogy lehetőséget adtak a kutatások elvégzésére. A Fővárosi Csatornázási Művek Zrt.-nek: Makó Denise Magdolnának és Erdélyi Istvánnak, a Környezettudományi Kooperációs Kutató Központ által összefogott konzorcium tagjáainak és dolgozóinak a szakmai és anyagi támogatásért. Perlné Dr. Molnár Ibolya professzorasszonynak, Zsigrainé Dr. Vasanits Anikónak, Helenkár Andrásnak, Sebők Ágnesnek A GC-MS-(MS) módszerek rendelkezésünkre bocsátásáért és hasznos gyakorlati segítségükért. Dr. Barkács Katalinnak a TOC vizsgálatok elvégzéséért. Dr. Kiss Évának a rázógép rendelkezésünkre bocsátásáért. Az Analitikai Kémiai és a Fizikai Kémiai Tanszék technikusainak a segítségükért.
A Fővárosi Polgári Védelmi Igazgatóság igazgatójának Dr. Benkovics Zoltán dandártábornoknak, felettesemnek támogatásáért. Továbbá szeretném kifejezni köszönetemet azoknak a kollégáimnak is, akik konstruktív szakmai vitával és filozófiával fejlesztették és fejlesztik szakmaiságomat! 20
Megvalósult tervek 1. Analitikai módszer kidolgozása a vizsgált vegyületcsalád meghatározására szilárd fázisról (minták: szennyvíziszap, Duna iszap, Duna hordalék) mikrohullámmal segített extrakciót követően, GC-MS, és GC-MS/MS mérési módszerrel. 2. A szennyvíztisztítás végtermékeként képződő kevert (aerob lebontási termék) és eleven iszap (anaerob lebontási termék) szennyezettségének megállapítása a további felhasználás, és a kezelés megítélése céljából. Folyamatban van: 3. A Duna iszap és part menti hordalék minták szennyezettségének hosszú távú (több éves) ellenőrzése a parti szűrésű kutak vízminőségének biztosítása céljából. Lehetséges összefüggések felderítése az időjárási tényezők (vízállás, csapadékmennyiség, napfény stb.) és a szennyezettség mértékének változása között. 4. A szennyvíztisztítás során végbemenő folyamatok modellezése a kiválasztott vegyületcsaládon az élő rendszerhez közel álló feltételek között a fizikai-kémiai folyamatok (szorpció) és a mikrobiológiai lebomlás arányának megállapítása céljából. 21
Köszönöm a megtisztelő figyelmet!
22
