Gyógyszerek és DNS mutációk kimutatása vérből AKI kíváncsi kémikus kutatótábor
Kolostyák Zsuzsanna, Békés Márta, Varga Bálint
2010. Július 2.
Enzimek; metabolizmus - A legtöbb biokémiai lépést enzimek katalizálják - Specifikusak - A szubsztrát átalakítása után változatlanul maradnak vissza - Az átalakítást metabolizmusnak nevezzük - A keletkezett termék a metabolit
Citokróm P450 szupercsalád - Testidegen anyagok (gyógyszerek, növényvédőszerek) átalakítása - Elsősorban a májban fejeződik ki, de megtalálható más szervekben is (pl. tüdő, vese) - Az enzimek rendszerbe sorolása aminosav sorrendjük homológiája alapján történik CYP2D6 enzim alcsalád család
- A leggyakoribb gyógyszermetabolizálók a CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6,CYP3A4, CYP3A5
Metodika Vér Szérum izolálása Vérszint meghatározása Betegek:
P.N. K.T. G.L.
Vizsgált hatóanyagok:
Carbamazepine Risperidone Quetiapine
Fehérvérsejt izolálása
?
DNS izolálása Genotipizálás pontmutációk kimutatása 2C9*2
2C19*3
P.N.
2C9*3
3A5*3
K.T.
2C19*2
G.L.
Clonazepam
Vizsgáló módszer:
LC-MS technika
Kvantitatív real time PCR
hatóanyag
terápiás
metabolizmus
plazma
alkalmazott
kategória
IS
koncentráció carbamaze pine
4-12 ug/ml
quetiapine
70-170 ng/ml, túladagolás esetén postmortem vérszint: 25 ug/ml
CYP2C8, CYP3A4
6-metilrisperidone
antiepileptikum
antipszichotikum, generációs, atípusos
2.
CYP3A4
clonidine és 6metilrisperidone
antipszichotikum, generációs, atípusos
2.
antiepileptikum, anxiolitikum
risperidone
20-60 ng/ml
CYP2D6
clonidine és 6metilrisperidone
clonazepam
20-70 ng/ml
CYP3A4
6-metilrisperidone
pánikbetegségben ng/ml
a
küszöb:
17
LC-MS Folyadékkromatográf (HPLC)
Tömegspektrométer (MS)
Metodika Vér Szérum izolálása Vérszint meghatározása Betegek:
P.N. K.T. G.L.
Vizsgált hatóanyagok:
Carbamazepine Risperidone Quetiapine
Fehérvérsejt izolálása
?
DNS izolálása Genotipizálás pontmutációk kimutatása 2C9*2
2C19*3
P.N.
2C9*3
3A5*3
K.T.
2C19*2
G.L.
Clonazepam
Vizsgáló módszer:
LC-MS technika
Kvantitatív real time PCR
Real Time PCR (polimeráz láncreakció) TaqMan próbával
Carbamazepin MRM 237/194
Clonazepam
Vérszérumszintek Minta\hatóanya g
Carbamazepi ne (μg/ml)
Clonazepam (ng/ml)
Risperidone (ng/ml)
Quetiapine (ng/ml)
KT1
0
18,76
21,12
247,6
KT2
0
18,48
21,14
276,8
PN1
4,68
16,36
-
-
PN2
4,92
16,36
-
-
GL1
0
11,56
-
-
GL2
0
14,76
-
-
Terápiás plazma konc.
4-12
17-70
20-60
70-170
2C9*3 - homozigóta vad
PCR eredmények 2C19*2
2C19*3
2C9*2
2C9*3
3A5*3
P. N.
Homozigóta vad
Homozigóta Homozigóta Homozigóta vad vad vad
Heterozigóta
K. T.
Homozigóta vad
Homozigóta Homozigóta Homozigóta vad vad vad
Homozigóta mutáns
G. L.
Heterozigóta Homozigóta Homozigóta Heterozigóta vad vad
Homozigóta mutáns
PCR eredmények 2C19*2
2C19*3
2C9*2
2C9*3
3A5*3
P. N.
Homozigóta vad
Homozigóta Homozigóta Homozigóta vad vad vad
Heterozigóta
K. T.
Homozigóta vad
Homozigóta Homozigóta Homozigóta vad vad vad
Homozigóta mutáns
G. L.
Heterozigóta Homozigóta Homozigóta Heterozigóta vad vad
Homozigóta mutáns
P.N: a gyorsabb metabolizmus miatt dózisnövelés
PCR eredmények 2C19*2
2C19*3
2C9*2
2C9*3
3A5*3
P. N.
Homozigóta vad
Homozigóta Homozigóta Homozigóta vad vad vad
Heterozigóta
K. T.
Homozigóta vad
Homozigóta Homozigóta Homozigóta vad vad vad
Homozigóta mutáns
G. L.
Heterozigóta Homozigóta Homozigóta Heterozigóta vad vad
Homozigóta mutáns
P.N: a gyorsabb metabolizmus miatt dózisnövelés K.T: magas Quet. c miatti dóziscsökkentés
PCR eredmények 2C19*2
2C19*3
2C9*2
2C9*3
3A5*3
P. N.
Homozigóta vad
Homozigóta Homozigóta Homozigóta vad vad vad
Heterozigóta
K. T.
Homozigóta vad
Homozigóta Homozigóta Homozigóta vad vad vad
Homozigóta mutáns
G. L.
Heterozigóta Homozigóta Homozigóta Heterozigóta vad vad
Homozigóta mutáns
P.N: a gyorsabb metabolizmus miatt dózisnövelés K.T: magas Quet. c miatti dóziscsökkentés G.L: a mutáns enzimekkel metabolizálódó gyógyszerek kerülése
Módszerek •SNP analízis TaqMan próbákkal: CYP2C19*2 G>A báziscsere azonosításának példáján Sense szál: forward primer és a próba az anti sense szálhoz fog bekötni GCATATTGTA AGATATGCAA G/A GGAACCCATA GTAAAAGAAC
TCTATACCTT TATTAAATGC TTTTAATTTA ATAAATTATT GTTTTCTCTT TAATTTTCCC ACTATCATTG ATTATTTCCC ACAAATTACT TAAAAACCTT GCTTTTATGG AAAGTGATAT TTTGGAGAAA ACCAAGAATC GATGGACATC AACAACCCTC GGGACTTTAT TGATTGCTTC
Forward primer szekvencia: 5’-CTTAGATATGCAATAATTTTCCCAC-3’ Reverse primer szekvencia: 5’-GAAGCAATCAATAAAGTCCCGA-3’ Vad típusú próba szekvencia: 5’ CalGold540-TGATTATTTCCCGGGAACCCATAAC-BHQ-1 3’ Mutáns típusú próba szekvencia: 5’ Quasar670-TGATTATTTCCCAGGAACCCATAAC-BHQ-2 3’
