Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem
Vegyészmérnöki- és Biomérnöki kar Vegyészmérnök MSc. Analitikai és szerkezetvizsgálati szakirány
Diplomadolgozat
Gyógynövények és kivonataik ICP-analitikai vizsgálata Témavezető: Dr. Szentmihályi Klára Belső konzulens: Dr. Koczka Béla
Készítette: Szabó Zoltán Neptun kód: GYDH5L
2015.
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés ................................................................................................................. 3 2. Elméleti áttekintés.................................................................................................... 6 2.1. Az ICP-OES ...................................................................................................... 6 2.1.1. Az ICP spektrum jellemzői ........................................................................ 7 2.1.2. Kimutatási lehetőségek ............................................................................... 7 2.2. Az ICP-MS módszer ......................................................................................... 7 2.2.1. Kimutatási lehetőségek ............................................................................... 8 2.3. UV-VIS Spektrofotometria ............................................................................... 9 2.3.1. Flavonoidtartalom....................................................................................... 9 2.3.2. Szabadgyökfogó-képesség ...................................................................... 10 3. Kísérletek, módszerek ............................................................................................ 12 3.1. Felhasznált anyagok ........................................................................................ 12 3.1.1. Növényi minták ........................................................................................ 12 3.1.2. Referencia anyagminta ............................................................................. 12 3.1.3. Alkalmazott reagensek ............................................................................. 12 3.2. Vizes kivonat készítése ................................................................................... 14 3.3. Drogfeltárás ..................................................................................................... 15 3.4. Vizsgálati módszerek ...................................................................................... 19 3.4.1. Az elemtartalom mérés ICP-OES készülékkel ......................................... 19 3.4.2. Elemtartalom mérés ICP-MS készülékkel................................................ 20 3.4.3. UV-VIS spektrométeres mérések ............................................................. 21 3.5. Statisztikai számítások .................................................................................... 25 4. Eredmények és értékelésük .................................................................................... 27 4.1. ICP-OES mérési módszer validálása .............................................................. 27 4.1.1.Szelektivitás ............................................................................................... 27 4.1.3. Linearitás .................................................................................................. 28 4.1.3.Torzítatlanság vizsgálata ........................................................................... 31 4.1.5. Referenciaanyag visszanyerése ................................................................ 35 4.1.6. Ismételhetőség .......................................................................................... 36 4.1.7. Kimutatási határ meghatározás................................................................. 37 4.1.8. Meghatározási határ mérése ..................................................................... 38 4.1.9. Range (Mérési tartományok meghatározása) ........................................... 38
1
4.1.10. Mintaelőkészítések összehasonlítása ...................................................... 39 4.2. Bodza drog ICP vizsgálatai ............................................................................. 41 4.2.1. Bodzaminták elemtartalom vizsgálata ICP-OES-sel ................................ 41 4.2.2. Elemtartalom meghatározása ICP-MS módszerrel .................................. 43 4.3. Bodza vizes kivonatának vizsgálata ................................................................ 45 4.3.1.Bodza elemtartalmának kioldódása teába ................................................. 45 4.3.2. Táplálkozástani szempontból fontos értékek meghatározása ................... 47 4.4.Spektrofotometriás mérések ............................................................................. 49 4.4.1. Összes flavonoidtartalom meghatározása ................................................. 49 4.4.2. Szabadgyökfogó-kapacitás meghatározása .............................................. 49 5. Összefoglalás ......................................................................................................... 51 6. Irodalomjegyzék .................................................................................................... 54 7. Köszönetnyilvánítás ............................................................................................... 57 8. Nyilatkozat ............................................................................................................. 58
2
1. Bevezetés A gyógynövények alkalmazása és fogyasztása egyidős az emberi történelemmel. Már az őskorban is az akkori emberek fájdalmaik enyhítésére és esetleges megbetegedéseikre gyakran a természetben leltek orvosságot. A történelem során ez mit sem változott, mivel minden kultúra nagy becsben tartotta a növények gyógyító erejét, valamint az újkori gyógyszereink nagy többsége a természetben fellelhető növények hatóanyagait használják fel sajátjuk alkotóvázának. Sokáig csak tapasztalati úton győződhettünk meg arról, hogy a növény, melyet fogyasztunk, a szervezetünkre káros vagy hasznos összetevőket tartalmaz, azonban a technika fejlődésével ezekre pontosabb választ adhatunk. Ma már a modern gyógyszeriparnak köszönhetően rengeteg betegségre sikerült félszintetikus vagy épp szintetikus hatóanyagot találni, azonban továbbra is fontos szerepet töltenek be életünkben a gyógynövények. Az egyes gyógynövények gyógyhatásait az idők folyamán kitapasztalták, azonban fontos megvizsgálnunk a pontos elemösszetételét, a makro- és mikroelemek mennyiségét a mai technológiával is, mielőtt forgalomba hozzuk. Az emberi szervezetben lejátszódó anyagcsere-folyamatok következményeként létrejönnek úgynevezett szabad gyökök. Túltermelődésük káros, mivel megzavarják a sejtek természetes működését, kárt tehetnek a sejtfal membránjában, valamint ebből kifolyólag serkentik a sejtek öregedését. (1) A szabad gyökök megkötésében fontos flavonoidok meghatározása nagy trendet mutat manapság, ezért szükségesnek tartottam a növény teljes feltérképezése szempontjából a flavonoidtartalom meghatározását is. A szervezetben zajló káros folyamatokat gátló vegyületek vizsgálatán kívül fontos, hogy megvizsgáljuk, hogy a növényből készített tea elfogyasztásával az elembevitel mekkora hányadát fedi le a napi szükségleti értéknek.(2) Dolgozatomban egy analitikai módszerfejlesztést tűztem ki célul, ahol az egyes teljesítményjellemzőket, mint például a torzítatlanságot, kimutatási és meghatározási határt, valamint linearitást vizsgáltam. Teljes módszervalidálásra idő hiányában nem került sor, de a meghatározott teljesítményjellemzők alapján érdemes lenne folytatni
3
a módszerfejlesztést. A módszerrel szemben támasztott követelmények a 1. számú táblázatban vannak összefoglalva. 1. táblázat: Validálás során meghatározandó teljesítményjellemzők és azokkal szemben támasztott követelmények Teljesítményjellemző Szelektivitás Linearitás Torzítatlanság Ismételhetőség Kimutatási határ Meghatározási határ
Ahhoz,
hogy
Teljesítményjellemzővel szemben támasztott követelmény Kiválasztott vonalak zavarásmentes mérése Regressziót követően a korrelációs koefficiens>0,98 Visszanyerés 95-105% között Relatív standard deviáció értéke <5% Jel/Zaj értéke 3:1 vagy a vakminta szórásának 3-szorosa A kimutatási határ 10-szerese
megfelelő
megbízhatóságáról,
képet
szükséges
kapjunk
a
referenciaanyag
módszer
pontosságáról,
alkalmazása.
Többféle
referenciaanyag használata lehetséges módszervalidálás során, azonban a hitelesített referenciaanyag minta alkalmazása a legelfogadottabb. Fontos, hogy a használt mintaelőkészítési módszer megfelelő eredményeket szolgáltasson a mérés során, ezért célom volt három típusú mintaelőkészítés összevetése, majd a kiválasztott feltárási technikával elvégezni a mintaelőkészítést. Dolgozatomban az ICP-OES mellett egy másik, szintén induktív csatolású plazmát felhasználó technikát, az ICP-MS-t is használtam a gyógynövény elemtartalmának
meghatározására,
valamint
a
feltárási
módszer
jóságának
vizsgálatára. A diplomadolgozatom témáját a Sambucus nigra L. vagy fekete bodza adta. A növény az Adoxaceae vagy más néven pézsmaboglárkafélék családjába tartozik. A fekete bodza (1. ábra) vagy népies nevén festőbodza, egész Európa területén elterjedt növény. Előfordulása gyakori, a jó környezethez való alkalmazkodása miatt szinte bárhol megtalálható: utak mentén, árokparton, akár a városban is. Magasságára 3-10 m jellemző. Levelei sötétzöldek, az ágakon egymással szemben helyezkednek el, szélük
4
fogazott. Virágai aprók, jellegzetesen illatosak. A virágzat bogernyő virágzat. A termés fekete színű húsos bogyó. (3) A múltban a növény minden részét felhasználták a gyökerétől egészen a levelekig, azonban ezen felhasználások az idővel elfelejtődtek és mára szinte csak a virágát és a bogyóját használják fel főleg táplálkozásra és gyógyászatra. A virágból készült főzetek segítségével orvosolni lehetett a székrekedést, a szemgyulladást, de használták vértisztítóként is. A szárított virágból főzött teát használják meghűlések kezelésére, mivel kiváló lázcsillapító és köhögéscsillapító hatása van. Bogyóját ételszínezékként használják.
1. ábra: A fekete bodza növényi része
5
2. Elméleti áttekintés 2.1. Az ICP-OES Az ICP-t ionforrásként alkalmazó készülékek elemösszetétel meghatározásra a legkorszerűbb technikák közé tartoznak. A mérések elvégzéséhez folyadék halmazállapotú minták szükségesek. A beüzemelést követően a folyékony halmazállapotú minták egy perisztaltikus pumpa segítségével a porlasztókamrába kerülnek, ahonnan argon vivőgáz segítségével a plazmába kerülnek. A 6000-10000 K hőmérsékletű plazmában történő bekerülést követően a minta atomizálódik, ionizálódik. (2. ábra). A 2. ábra Tatár Enikő és Záray Gyula: Környezetminősítés című elektronikus jegyzetéből származik. Az emissziós méréseknél az atomok gerjesztődnek és a gerjesztett állapotból alapállapotba történő átmenetüket követően energiát bocsátanak ki fény és hő formájában. Polikromátor segítségével a plazma fényemisszióját spektrálisan felbontjuk, majd az egyes elemek adott hullámhosszú vonalának intenzitását optikai detektoron mérjük. A régebbi típusú szekvenciális készülékek
esetében
a
monokromátoron
áthaladó
fotonokat
egy
fotoelektronsokszorozó detektálja, míg a szimultán készülékekben a polikromátort több fotoelektronsokszorozó követi. A legújabb műszerek általában szilárdtest detektorokkal (félvezető) vannak felszerelve, melyek lehetnek töltés csatolt detektorok (CCD) vagy töltés injektálásos detektorok (CID). (4)(5)
2. ábra: Induktív csatolású plazma sugárforrás sematikus felépítése
6
2.1.1. Az ICP spektrum jellemzői Az ICP-sugárforrással kapott színképeknek vonalas összetevői vannak, melyek hasznos információi a színképeknek. A minőségi információt abból nyerjük, hogy adott elem milyen hullámhosszú sugárzást bocsát ki a relaxáció során (3. ábra). A mennyiségi információt, az elemkoncentráció és a detektált jel közötti lineáris összefüggés segítségével kapjuk meg. (3. ábra).
3. ábra: Az ICP spektrum minőségi (bal) és mennyiségi (jobb) jellemzői
2.1.2. Kimutatási lehetőségek Az ICP-OES előnye, hogy 70-80 elem vizsgálatát teszi lehetővé köztük a fémek, az átmeneti fémek, továbbá nem fémes elemek közül a foszfor, illetve a kén, azonban olyan elemek, mint a hidrogén, illetve az oxigén, valamint a halogének nagy része egyáltalán nem mérhető.
2.2. Az ICP-MS módszer Az ICP-MS módszer feltalálásakor a fejlesztők célja egy olyan műszeres technika kifejlesztése volt, mely az atomemissziós módszert teljesen kiszorítja. A technika rutinszerű alkalmazása rávilágított a módszer lehetőségeire. A folyékony halmazállapotú mintákat egy automata mintaadagoló rendszer a porlasztást követően továbbítja a plazmába. Az induktív csatolású plazma mint ionforrás atomizálja, 7
ionizálja a beérkező mintát, majd azt egy nagyvákuum alatt működő rendszerbe továbbítja. Az ionforrás nincs a vákuumrendszerben, így üzeme egyszerűbb, viszont szükség van egy úgynevezett interfészre, amellyel a keletkezett ionokat képesek vagyunk továbbítani veszteség nélkül. A plazma fő tömegét az argon adja, valamint az ICP-oldal felépítése teljesen azonos az ICP-OES-nél alkalmazottal. Az ionok bejuttatása az atmoszférikus nyomáson működő plazmából a nagyvákuumban működő tömegspektrométerbe az ICP-MS legkritikusabb része. A megvalósítása úgy történik, hogy két, egymást követő, koaxiális, középen 0,7-1,0 mm átmérőjű furattal ellátott kónuszon áramlik át a plazmából vett minta. Ebben a két lépcsőben történik meg a nyomás csökkentése a tömegspektrométerben uralkodó értékre. Az első kónusz (sampler) mögötti köztes térben a nyomás néhány mbar. Mivel itt a gázáram jelentősen felgyorsul, így a tartózkodási idő csupán néhány ezred másodperc, továbbá a hirtelen nyomásesés miatt a gázt alkotó részecskék közötti szabad úthossz nagyságrendekkel megnő, kicsi a lehetősége annak, hogy a részecskék egymással ütközzenek, és rekombináció, valamint egyéb reakciók miatt az ionösszetétel megváltozzon. A második kónusz (szkimmer) után a nyomás már kisebb, mint 10-4 mbar. A gáznyalábból a semleges részecskék diffúzióval távoznak, és a vákuumszivattyú eltávolítja őket, a töltött részecskék (ionok, elektronok) pedig továbbhaladnak az ionoptika felé. Az ionoptika megfelelően kialakított fém- vagy grafitelektródákból áll, amelyek között meghatározott lefutásúak az elektromos erővonalak. Az ilyen elektromos téren való áthaladás során a töltött részecskék pályája módosul, hasonlóan, mint a fény a más törésmutatójú közegbe való átlépésekor, viszont az ionok pályája nem hirtelen törik meg, hanem elhajlik, mintha a fény számára a törésmutató folyamatosan változna. A tömeganalizátor végzi el a plazmából kivett ionáram tömeg/töltés (m/z) szerinti szétválasztását. A detektálást elektronsokszorozókkal érjük el.
(4)(6)
2.2.1. Kimutatási lehetőségek Az ICP-MS módszer 70-75 elem vizsgálatát teszi lehetővé, és a kapott spektrumokat kevés spektrális zavarás, illetve kiváló kimutatási határok jellemezik. A módszerrel a főkomponensek meghatározása nehézkes, valamint vannak tiltott tartományok (m=40 g/mol), ezért főként nyomelemek meghatározására használják.
8
2.3. UV-VIS Spektrofotometria A minta UV (180-400 nm), valamint látható (400-800 nm) fénnyel történő besugárzását követően, a minta elnyeli azt, és a molekulák elektroneloszlása megváltozik. A kötő, lazító, illetve nemkötő elektronjaik kisebb energiájú pályákról nagyobb energiájú pályákra ugranak át, vagyis gerjesztődnek. A vizsgálat során a folyadék halmazállapotú mintákat sugárforrás segítségével megvilágítják, mely rendszerint UV tartományban deutérium lámpa, míg látható tartományban wolfrám lámpával történik. A mérés során a fényelnyelést adott hullámhosszon mérjük, ezért szükséges egy monokromátor egység, amely elkülöníti a vizsgálandó hullámhosszt a sugárforrás fényének további alkotóitól. A kiválasztott hullámhosszú fény áthalad a mintán, majd a detektorba kerülve a beérkező elektromágneses sugárzást elektromos árammá alakítva jelfeldolgozó rendszeren keresztül megkapjuk a mintára vonatkozó abszorpciós spektrumot. A mérendő anyag szelektív, színes komplexet eredményező reakciót követően mérhető. Az UV-VIS spektrofotometria egy gyors, pontos és széles körben alkalmazható módszer, azonban a spektrum vonalai több komponens elnyeléséből is adódhatnak, így más analitikai mérésekkel is szükséges alátámasztani az eredményeket. Egyes növények közismertek a flavonoidtartalmukról, és azok szabadgyökfogókapacitásáról, ennek mérésére alkalmas módszer az analitikai kémia egyik leggyakrabban alkalmazott módszere, az UV-VIS spektrofotometria, amely a flavonoidtartalom meghatározása mellett a vasredukáló-képesség mérését is lehetővé teszi.
2.3.1. Flavonoidtartalom Szent-Györgyi Albert és Rusznyák István nevéhez fűződik az első bioflavonoid felfedezése, amelyet 1936-ban paprikából izoláltak és P-vitaminnak neveztek el. A flavonoidok a szervezet alapvető elemei és nagyban elősegítik a vitaminok működését, illetve hatását, viszont az elnevezéssel ellentétben nem sorolhatók a vitaminokhoz. 9
A flavonoidok erősítik a szervezet immunrendszerét, a káros folyamatokat megszüntetik, illetve sejtfiatalító hatással is bírnak. Legnagyobb számban, gyümölcsökben, zöldségekben és különböző teákban találhatóak meg, így könnyen pótolhatóak a szervezet számára. A bodzanövény összes flavonoidtartalmát UV-VIS spektrofotometriával mértem. A kinyert flavonoidokat alumínium-komplexbe kötötten mértem, mely 418 nm-es maximális elnyelésű halványsárgás színű oldatot eredményezett. A flavonoidok, önmagukban sárga színűek, ebből eredeztethető a nevük is, mely latinul sárgát jelent.(7) Szerkezetileg a polifenolokhoz soroljuk őket. A flavan alapszerkezetre épülő különböző oxo-, hidroxicsoportok és kettős kötések alapján csoportosítjuk a flavonoidokat, mely funkciós csoportok az A, B és C jelű gyűrűre kerülhetnek. (4. ábra)
4. ábra: Flavan alapváz szerkezete
Napjainkban 4-5000 különböző flavonoid ismert. Az antioxidáns hatásért főleg a „C” gyűrű telítetlensége és oxocsoportja a felelős, valamint a különálló gyűrű para és meta diszubsztituált hidroxilcsoportjai. A flavonoidok fényelnyelése alumíniumkomplexbe kötötten mérhető.
2.3.2. Szabadgyökfogó-képesség Az antioxidáns tulajdonság értékelésére gyakran használt mérési módszer a FRAP-módszer (8), amely elsősorban a biológiában és az orvoslásban használatos. A
10
Ferric Reducing Ability of Plants szóból ered, amely a növények vasredukálóképességét jelöli. Az emberi szervezetet károsító szabad gyököket a növények flavonoidjai, polifenoljai és egyéb antioxidáns tulajdonságú összetevői képesek redukálni. A komplexbe zárt vas(III) antioxidánsok hatására vas(II)-vé redukálódik. A reakció során elektronátmenet következik be, amely színváltozással jár: színtelenből kékes-lilás színűvé válik (5. ábra). A változást 593 nm-en detektáljuk.
5. ábra: FRAP módszer elvi alapja
11
3. Kísérletek, módszerek 3.1. Felhasznált anyagok 3.1.1. Növényi minták A méréseimhez szükséges minták különböző helyekről származtak. A szárított virágzatot a Herbária Zrt. által gyártott és forgalmazott fekete bodzavirágból (Sambuci flos) szereztem. Gyártási szám: 01531. Azonosító szám: H-104/12. A további növényi minták Csongrád megyéből, egy Kistelek nevű városból származnak.
3.1.2. Referencia anyagminta Az általam használt referencia anyag CRM, vagyis hitelesített lucerna p-alfalfa referenciaanyag volt. A referenciaanyagot a Slovak Institute of Metrology forgalmazza és az eredményeket 20 laboratórium körméréseként adták meg. Regisztrációs száma: 128/03. A teljes hitelesítő bizonylat másolata a 1. számú mellékletben megtekinthető. A mérés pontosságának biztosítása érdekében a referenciaanyagunkat szárítószekrényben 100 °C-on 60 percig kiszárítottuk.
3.1.3. Alkalmazott reagensek Az ICP-OES, valamint az ICP-MS módszerekhez történő mintafeltárásához analitikai tisztaságú vegyszereket használtunk fel. A mérésekhez Carlo Erba által forgalmazott 65%-os tömény salétromsavat, illetve a Reanal által forgalomba hozott 30%-os hidrogén-peroxidot, továbbá 18,2 megaohm ellenállású ultratiszta vizet, melyet Millipore többlépcsős tisztító berendezéssel lett előállítva. Az ICP-OES módszer validálása során és a méréseknél a munkastandard oldatok készítéséhez 1000 mg/l koncentrációjú Ca-, Mg-, S-, P- egyelemes Spectrascan standardokat, illetve 100 mg/l koncentrációjú Spektrum 3D multielemes standardokat használtam fel. Az UV-VIS műszerrel történő vizsgálatokon belül az összes flavonoidtartalom, valamint
a
szabadgyökfogó-kapacitás
meghatározáshoz
analitikai
tisztaságú
finomvegyszereket használtam fel, melyeket a 2. és 3. táblázatban foglaltam össze. 12
2. táblázat: Flavonoidtartalom meghatározáshoz felhasznált vegyszerek Vegyszer
Forgalmazó/Gyártó
hexametilén-tetramin
Fluka
aceton
Reanal
37% HCl
Scharlau
ultratiszta víz
Millipore
etil-acetát
Reanal
nátrium-szulfát
Reanal
ecetsav
Reanal
metanol
Chemolab
alumínium-klorid
Reanal
13
3. táblázat: FRAP módszerhez felhasznált vegyszerek listája Vegyszer
Forgalmazó/Gyártó
FeSO4*7H2O
Reanal
nátrium-acetát
Reanal
ecetsav
Reanal
2,4,6-tripiridil-S-triazin
Fluka
ultratiszta víz
Millipore
37% HCl
Scharlau
ecetsav
Reanal
metanol
Chemolab
alumínium-klorid
Reanal
3.2. Vizes kivonat készítése A fekete bodza vizes kivonatának előkészítése során 1 g drogra 20 ml forrásban lévő vizet engedtem, majd óraüveggel lefedve 10 percig állni hagytam. A 10 perces forrázatokat, melynek elkészítését a VIII. Magyar Gyógyszerkönyv tartalmaz, a kihűlésüket követően szűrőpapíron leszűrtem. A szűrletből 20 ml-es végtérfogatú mintákat az elkészülést követően szintén ICP-OES-sel vizsgáltam meg. A mérés során három párhuzamos mintát állítottam elő.(9)
14
3.3. Drogfeltárás a) Blokkroncsolóval történő feltárás A szárított mintákból analitikai mérleg segítségével a roncsoló edénybe bemértem 0,5 g-ot. Ezután a mintákra 10 ml tömény (65%-os) salétromsavat mértem. A sav bemérését követően a visszafolyós hűtővel ellátott roncsoló edényeket a Velp Scientifica típusú blokkroncsolóba helyeztem (6. ábra). A roncsolás során a mintában lévő szerves alkotók a sav hatására szén-dioxiddá, vízgőzzé, valamint nitrózus gázokká alakulnak. A roncsolást, melynél a fűtési program 180 °C-ra volt beállítva, körülbelül 6-8 órát vett igénybe. A mintákhoz hozzámértem 4 ml 30%-os hidrogénperoxidot, lehűlésüket követően további fél órát melegítettem őket. Ezek után a feltárt drogot mérőlombikba öntöttem és 25 ml-re egészítettem ki ioncserélt vízzel. Párhuzamosan elkészítettem a vakoldatot, mely 10 ml tömény salétromsavat, 4 ml hidrogén-peroxidot
tartalmaz,
melyeket
szintén
25
ml-re
egészítettem
mérőlombikban. (10)
6. ábra: Velp Scientifica blokkroncsolóval történő feltárás
15
ki
b) Főzőpoharas feltárás A szárított mintákból 0,5 g-ot főzőpohárba mértem, majd 10 ml tömény 65%-os salétromsavat adtam hozzá. A főzőpoharat óraüveggel letakarva a főzőlapra helyeztem és 100 °C-on elvégeztem a feltárást. A gázfejlődés megszűnése után a kitisztult oldatokhoz 4 ml 30%-os hidrogén-peroxidot adtam hozzá, és 15 percig tovább forraltam az oldatokat. Az elkészült mintákat leszűrtem szűrőpapír segítségével egy mérőlombikba, és 25 ml-re egészítettem ki ioncserélt vízzel. (7. ábra)
7. ábra: Főzőpohárban történő mintafeltárás
c) Mikrohullámú feltárás A mintákból analitikai mérleg segítségével a 100 ml térfogatú PFA-ból készített roncsoló edényekbe 0,5 g-t mértem be, majd hozzáadtam 10 ml 36%-os salétromsavat és 4 ml 30%-os hidrogén-peroxidot. A beméréseket követően a roncsoló betéteket záródugóval láttam el és az így lezárt mintákat egy nyomástartó köpenybe helyeztem el. A bomba anyaga kerámia, ezért jellemző rá a jó nyomástűrés és hőelvezetés (40 bar, 210 °C) (8. ábra).
16
8. ábra: PFA roncsoló betét, valamint a kerámiából készült köpeny
Az első bomba záródugója különleges kialakítású, melyben a hőmérséklet és nyomásszabályzó egységek helyezkednek el. Ennek segítségével ellenőrizhető, hogy a beállított roncsoló program megfelelően zajlik-e le a készülékben, mely programot, továbbá a roncsolórendszer paramétereit a 4. táblázat tartalmazza. A mikrohullámú roncsolással egy gyors és hatékony mintafeltárási módszerrel végezhetjük el a szerves minták roncsolását.(11)
17
9. ábra Az Anton-Paar Multiwave 3000 mikrohullámú berendezés 4. táblázat: Az Anton-Paar Multiwave 3000 mikrohullámú roncsolóval alkalmazott nagynyomású feltárási módszer beállítási paraméterei
Felfűtési idő
15 perc
Felfűtési
200 °C
hőmérséklet Hőntartás
20 perc
Hűtési idő
60 perc
18
3.4. Vizsgálati módszerek 3.4.1. Az elemtartalom mérés ICP-OES készülékkel A méréseket Spectro Genesis típusú ICP-OES készülék segítségével végeztem el, melyben egy 27,12 MHz-es üzemelési frekvenciával működő rádiófrekvenciás generátor található. A mintákat keresztáramlásos pneumatikus porlasztással visszük be a plazmába. Az aeroszol előállítását Scott típusú ködkamra látja el. A készülék optikai részében új megoldást alkalmazó Pasche-Runge polikromátor és CCD detektorsor működik, mely 175-770 nm-es tartományon belüli lefedésre képes. A műszer optikai felbontóképessége 0,029 nm. A mérés során alkalmazott plazmabeállítási paramétereket a 5. táblázat tartalmazza.
10. ábra: Spectro Genesis típusú ICP-OES készülék fényképe
5.táblázat: ICP-OES plazma beállítási paraméterei Plazma beállítási paraméterek Plasma Power 1240 W Coolant Flow 13,7 L/min Auxiliary Flow 0,60 L/min Nebulizer 0,96 L/min Optic Flash 1 L/min
19
3.4.2. Elemtartalom mérés ICP-MS készülékkel A ICP-MS-sel történő méréshez egy Thermo Fischer Scientific iCAP Qc típusú mérőműszert alkalmaztam (15. ábra). A berendezésben a minták porlasztását nagynyomású
hidraulikus
porlasztó,
valamint
egy
hozzá
csatlakoztatott
ciklonrendszerű ködkamra végzi. A plazma előállításáért egy ~27 MHz-en üzemelő rádiófrekvenciás generátor felel. Az interfészen belül a sampler kónusz Ni/Cu ötvözetből, míg a szkimmer Ni-ből van. A készülék ionoptikájában az úgynevezett RAPID elrendezést használják, mely mozaikszó a Right Angluar Positive Ion Deflection szavakból ered. A készülékben olajrotációs szivattyú és turbomolekuláris szivattyú állítja elő a szükséges vákuumot. Az esetleges zavarásokat reakció cella módszerrel küszöböli ki. Az ionok tömeg/ töltés szerinti szétválasztását kvadrupol tömeganalizátor végzi. A detektálás elektronsokszorozóval történik. A mérés során alkalmazott plazmabeállítást a 6. számú táblázat tartalmazza. 6. táblázat: ICP-MS készülék plazmabeállítási paraméterei Plazmabeállítási paraméterek Plasma Power
1550 W
Cool Gas Flow
14 L/min
Aux. Gas Flow
0,8 L/min
Nebulizer Gas Flow
0,99 mL/min
Cell Gas
He
Cell Gas Flow Rate
4,1 mL/min
20
11. ábra: ICP-MS berendezés
3.4.3. UV-VIS spektrométeres mérések Az UV-VIS mérésekhez Hewlett-Packard 8453 típusú spektrofotométer készüléket használtam. A műszer fényforrása egy wolfram, továbbá egy deutérium lámpa. A wolfram lámpa 350-800 nm, míg a deutérium lámpa 185-390 nm hullámhosszú fény kibocsátására képes. A mintából érkező fényt a felbontást követően diódasoros detektorral detektálunk, mely körülbelül 1 nm-es felbontóképességgel rendelkezik.
12. ábra: HP 8453 típusú készülék
21
3.4.3.1.Flavonoidtartalom mérés mintaelőkészítése Visszafolyós hűtős lombikba bemértem 0,6 g száraz mintát és 1 ml 0,5 %-os hexametilén-tetramint,
ami
megakadályozza
a
zavaró
antocián-alumínium
komplexek kialakulását. Ezt követően a mintákhoz hozzáadtam 20 ml acetont és 2 ml 25%-os sósavat, majd 65-70 fokon 30 percig reagáltattam. Az így képződött szuszpenziót leszűrtem egy 50 ml-es lombikba és szűrőpapíron fennmaradt mintát 2*10 ml acetonnal átmostam és jelig töltöttem. Ebből 20 ml–t rázólombikba mértem, ugyanennyi desztillált vizet öntöttem hozzá, és 1*15, 2*10 ml etil-acetáttal kiráztam. Az etil-acetátos fázist desztillált vízzel savmentesre mostam, és nátrium-szulfáton szárítottam. A szárító só mennyisége akkor elegendő, amikor rázás hatására pelyhes darabokban száll. A kiszárított fázist 50 ml-es lombikba szűrtem, és jelig töltöttem etil-acetáttal. Egy 25 ml-es lombikba kivettem 10 ml-t, hozzáadtam 10 ml metanolosecetsavat és 1 ml alumínium-kloridot. A metanolos-ecetsav oldat felel a pH beállításáért, illetve az alumínium-klorid feloldásáért. A metanollal jelre töltött mérőlombikokat 30 percig állni hagytam, majd a küvettába hozzávetőleg 3 ml-t töltve elvégeztem a mérést. 418 nm-en kaptam maximális elnyelést. A flavonoidoknak kisebb hullámhosszon is van elnyelési csúcsa, de 418 nm-en kapunk jól detektálható, maximumos görbét. (12)
13. ábra: Bodzaminta Al-komplexének teljes UV- VIS spektruma 22
A Lambert-Beer törvény alapján l=1 cm-es küvettában, ε= 500-nál kiszámolható a minta összes flavonoidkoncentrációja.
14. ábra: 418 nm-en jól detektálható flavonoid Al-komplexének spektrumrészlete 3.4.3.2. FRAP szabadgyökfogó-kapacitás mérésének mintaelőkészítése A kalibrációhoz FeSO4*7H2O oldatot készítettem 0,0280 g FeSO4*7H2O és 100 ml ioncserélt vízből. Vak mintaként 3 ml FRAP reagenst alkalmaztam. A FRAP oldatot 50 ml acetát pufferből, és 5-5 ml 2,4,6-tripiridil-S-triazinból (TPTZ) és vasklorid oldatból állítottam össze. Az acetát puffert 3,1039 g nátrium-acetátból és 16 ml ecetsavból állítottam össze, és 1 literes lombikba jelig töltöttem ioncserélt vízzel. A TPTZ oldatot 0,1557 g 2,4,6-tripiridil-S-triazinból és 0,2 ml HCl-ból készítettem 50 ml ioncserélt víz hozzáadásával. A vasklorid oldatot 0,2532 g FeCl3*6H2O és 100 ml ioncserélt víz elegyítésével készítettem. A 7. táblázat a kalibráló sor beméréseit tartalmazza.
23
7. táblázat: A kalibráló sor összemérése FeSO4*7 H2O
H2O (µl)
FRAP (ml)
(µl)
c [FeSO4] (µM)
10
90
3
3,25
40
60
3
12,99
60
40
3
19,49
90
10
3
29,24
Az így összeállított oldatokat a mérés előtt 5 percig állni hagytam a küvettában, hogy a reakció végbemenjen. A méréshez a 3.2.pontnál leírt vizes kivonatot használtam. A küvettákba a FRAP oldószerből 3 ml-t, míg a leszűrt forrázatból 10 µl-t mértem össze és 5 perc várakozási idő után az így elkészült mintákat is lemértem 593 nm-en. A mérést követően meghatároztuk a kalibrációs egyenest, mely az alábbiak szerint alakult. Az egyenes egyenletéből ezt követően kiszámolhatóvá váltak a fekete bodza vasredukáló-képességének értékei, mely eredményeket a 4.4.2. fejezetben mutatok be.
24
15. ábra: Szabadgyökfogó-kapacitás kalibráló egyenese
3.5. Statisztikai számítások Az ICP-OES módszer validálásához és a mérési eredmények korrekt megadásához alapvető statisztikai számításokra volt szükség, mely számolások az 8. táblázatban összefoglalva megtalálhatóak.
25
8. táblázat: ICP-OES-re történő módszerfejlesztéshez szükséges számítások 1. átlag
2. tapasztalati szórás
3. visszanyerés 4. relatív standard deviáció 5. érzékenység 6. kimutatási határ 7. reziduális
26
4. Eredmények és értékelésük 4.1. ICP-OES mérési módszer validálása Minőségbiztosítási szempontból rendkívül fontos, hogy az általunk használt módszer megbízható, pontos és szelektív legyen, mivel ezáltal az általunk szolgáltatott eredmények hitelesek lesznek. A validálás azt a tevékenységet jelenti, mellyel az általunk elvégzett rendszerezett vizsgálat segítségével bizonyíthatjuk, hogy a módszer teljesítményjellemzőit az általunk alkalmazott analitikai módszer megfelelő mértékben kielégítik-e. A teljesítményjellemzők vagy validálási paraméterek olyan kísérletileg meghatározott paraméterek, melyekkel igazoljuk, hogy az alkalmazott analitikai módszer alkalmas az adott feladatra. (13) Az általam meghatározott teljesítményjellemzők az alábbiak:
szelektivitás
linearitás
torzítatlanság
ismételhetőség
kimutatási határ (LOD)
meghatározási határ (LOQ)
lineáris mérési tartomány
4.1.1.Szelektivitás Az analitikai módszer szelektivitása a módszer azon képessége, hogy a keresett komponenst vagy komponenseket pontosan és specifikusan mérje olyan más komponensek jelenlétében, amelyek a mintában jelen lehetnek. ICP-OES esetén érdemes megnézni, hogy az általunk készítendő módszerben alkalmazott mérési vonalaknál található-e más vonal általi zavarás. A műszer felbontóképessége
0,5
Å,
ezért
olyan
27
vonalakat
választottam
ezen
felbontóképességen belül, melyek egyike sem szenved zavarást. A választott vonalak a 9. számú táblázatban megtekinthetőek. 9. táblázat: A validálás során kiválasztott elemek, valamint azok detektálhatósági hullámhossza és jellege
Elem
Hullámhossz (nm)
Vonal típusa atom (1) ion (2)
Al As B Ca Cu Fe Hg K Mg Mn Na Ni P Pb S Sr Zn
394,401 189,042 249,677 430,253 324,754 239,562 194,227 769,896 182,793 294,921 589,592 341,476 215,408 220,353 180,731 460,733 213,856
1 1 1 1 1 2 2 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1
4.1.3. Linearitás Egy analitikai módszer linearitása az a tulajdonsága, hogy egy adott mérési tartományban olyan eredményeket kapunk, amelyek közvetlenül, vagy egy jól definiált matematikai műveletet elvégezve a minta keresett komponenseinek koncentrációjával arányosságot mutat. Az ICP-OES kalibrációs görbéi ideális körülmények között a legtöbb esetben lineárisnak tekinthetőek, azonban egyes elemek vonalainál mutathat egyenestől való eltérést. Az elhajlásokat sok esetben a nagy koncentrációban detektálandó elemek okozzák.
28
Ebből kifolyólag ennél a technikánál lehet eltérő korrekciós függvényeket alkalmazni, mellyel a regressziós görbén jobb illesztés érhető el. A készülékben van lehetőség első-, valamint másodfokú közelítő függvények alkalmazására is. Abban az esetben, amennyiben más közelítő függvényt alkalmazunk, indokolt lehet a kalibráció jóságának vizsgálata, melyet például a reziduálisok vizuális értékelésével, valamint további statisztikai módszerekkel, mint például az F-próba vagy a t-próba alkalmazásával érhetünk el. A 16. ábrán a 215,408 nm-en detektálható foszfor vonalának kalibrációs görbéjét ábrázoltam. A rendszeralkalmassági mérésekben, a linearitás vizsgálata során a vakon kívül további minimum 5 pont alapján értékelhető a kalibrációs görbe. Vizuálisan értékelve látható, hogy a kalibrációs görbe linearitást mutat az elemkoncentrációk, valamint a beütési értékek között. Nem minden vonal esetén tudtam biztosítani a minimum 5 kalibrációs pontot, mivel alacsony koncentrációk esetén nehéz biztosítani ilyen sokféle koncentrációs értéket.
16. ábra: A foszfor 215,408 nm-en detektálható vonalának kalibrációs egyenese
Linearitás jellemzésére gyakorta felhasználjuk a reziduálisok eloszlásának vizsgálatát, mivel önmagában R2 értékének megadása nem mindig elégséges.
29
17.ábra: A magnézium 182,793 nm detektálható vonalán a linearitás vizsgálata
A 17. ábrán szereplő grafikonon az általam mért, valamint névleges koncentrációk közötti összefüggést jelenítettem meg. Az egyenes egyenletéből könnyen kiszámolható , vagyis a számított koncentráció. Ezt követően a reziduálisokat a 3.5. fejezetben leírt 7. számú képlet segítségével lehet megadni, melyeket ezt követően a névleges koncentrációk függvényében ábrázolunk.
18. ábra: A magnézium 182,793 nm-es vonalán a reziduálisok eloszlásának ábrázolása
A grafikonból látszódik, hogy a három mérés során kapott reziduálisok véletlenszerű eloszlást mutatnak, vagyis a kalibráció nincs módszeres hibával terhelve. A további vonalakra vonatkoztatott kalibrációs egyenesek a 2., míg a reziduálisok számolásából származó eredmények a 3. számú mellékletben találhatóak meg. A reziduálisok
30
értékeit a mellékletben egy mérésre vonatkoztatva adtam meg. Azon vonalak esetén, ahol a reziduálisok a magasabb koncentrációkban nagy szórást mutattak, 1/y-nal, vagyis a műszer által szolgáltatott jel értékének reciprokával súlyoztuk a regressziós egyeneseket. A felvett regressziós egyenesek korrelációs koefficiens értékei minden vonal esetén 0,99 felettiek.
4.1.3.Torzítatlanság vizsgálata A torzítatlanság vagy pontosság a kapott érték és a valódi érték egyezésének mértéke.
A
pontosság
többféleképp
is
vizsgálható.
Megfelelő
hiteles
referenciaanyagot, vagy modell mintát elemzünk a módszerrel és összevetjük az elemzési eredményt a deklarált értékkel. Ha megfelelő hiteles vagy tanúsított referenciaanyag nem áll rendelkezésre, a torzítatlanság becslése úgy is elvégezhető, hogy a mintához az elemzés megfelelő fázisában hozzáadjuk a vizsgált komponens ismert mennyiségét (addicionálás, „spike”). Az adott módszerrel meghatározzuk a hozzáadott anyag koncentrációját, és azt összehasonlítjuk az ismert valódi koncentrációval (a visszanyerést százalékos alakban adjuk meg). A visszanyerés vizsgálat érvénye korlátozott, a helyesség meghatározására csak a módszernek a hozzáadást követő szakaszára alkalmas, korlátozásokkal. A torzítatlanság ellenőrzését a feltárt levélmintákhoz ismert koncentrációban, ismert mennyiségben hozzáadott 33 elemet tartalmazó multielemes (Mu 33) standard, továbbá Ca-Mg tartalmú és S-P oldattal végeztem. A méréshez szükséges oldatok elkészítése az alábbiak szerint történt. (10.táblázat)
31
10. táblázat: Standard addíció mérés során összemért oldatok Standard
Standard
Ioncserélt
koncentráció
mennyisége
víz
(mg/l)
(ml)
(ml)
Mu 33
2
1
Ca-Mg
500
0,5
S-P
100
0,5
Mu 33
2
2,5
Ca-Mg
1000
0,5
S-P
200
0,5
Mu 33
10
0,5
Ca-Mg
1000
1
S-P
200
1
Mu 33
10
1
Ca-Mg
1000
1,5
S-P
500
0,5
Mu 33
10
1,5
Ca-Mg
1000
2
S-P
500
1
Hozzáadott std.
T1
T2
T3
T4
T5
Minta
Végtérfogat
(ml)
(ml)
3
5
10
1,5
5
10
2,5
5
10
2
5
10
0,5
5
10
A mintákhoz hozzáadott ismert mennyiségű standardok végső koncentrációja a vizsgált oldatban a következő volt (11. táblázat) A mérést követően a kiindulási oldat koncentrációinak levonásával megkaptuk a mért standard oldatok koncentrációit, melyet a 12. táblázatban összegeztem. A számított és mért eredmények összevetéséből kiszámoltam az egyes elemekre vonatkozó visszanyerési értékeket. (13. táblázat)
32
11. táblázat: Standardok koncentrációi az addíciós vizsgálat alatt Mérés sorszáma
Ismert mennyiségű standard koncentrációja Mu33
Ca-Mg
S-P
(mg/l)
(mg/l)
(mg/l)
T1
0,2
25
5
T2
0,25
50
10
T3
0,5
100
20
T4
1
150
25
T5
1,5
200
50
33
12. táblázat: Torzítatlanság vizsgálata során mért koncentrációk a kiindulási oldat koncentrációjának levonása után Mért koncentráció (mg/l)
Elem T1
T2
T3
T4
T5
Al
0,202
0,292
0,522
1,14
1,52
B
0,190
0,280
0,510
1,19
1,51
Ca
25,3
48,3
103
151
203
Cu
0,164
0,227
0,506
1,03
1,49
Fe
0,185
0,299
0,489
1,03
1,49
Mg
26,2
49,5
102
151
203
Mn
0,160
0,290
0,514
1,06
1,54
Na
0,174
0,274
0,518
1,13
1,51
Ni
0,170
0,332
0,415
1,20
1,47
P
5,04
10,8
21,7
24,9
50,0
Pb
<1,12
<1,12
<1,12
1,42
1,43
S
5,03
9,84
19,8
25,0
51,2
Sr
0,211
0,342
0,471
1,06
1,42
Zn
0,208
0,318
0,459
1,14
1,58
34
13. táblázat: Torzítatlanság mérése során kapott visszanyerések az egyes elemekre vonatkozóan Visszanyerés (%)
Elem T1
T2
T3
T4
T5
Al
101,0
116,8
104,4
114,0
101,0
B
95,0
112,0
102,0
119,0
100,7
Ca
101,2
96,7
102,6
100,4
101,3
Cu
82,1
90,8
101,2
102,5
99,9
Fe
92,4
119,8
97,8
103,2
99,5
Mg
104,8
98,9
101,6
100,5
101,4
Mn
80,2
115,9
102,8
106,0
102,7
Na
87,2
109,5
103,7
113,0
100,9
Ni
85,2
132,8
83,0
119,0
97,7
P
100,9
108,4
108,6
99,7
100,0
Pb
-
-
-
142,3
95,2
S
100,6
98,4
99,1
100,1
102,4
Sr
105,5
136,7
94,3
105,8
94,7
Zn
104,0
127,2
91,7
113,6
105,5
Az eredményekből az látható, hogy a standard addícióval elvégzett torzítatlanság vizsgálat során nem sikerült elérni az elemek többségénél 95-105%-os visszanyerést, ezért
hitelesített
referencia
anyagminta
használata
is
indokolt,
hogy
megbizonyosodjunk az egyes elemek visszanyeréséről.
4.1.5. Referenciaanyag visszanyerése A visszanyerést ezt követően egy hitelesített referencia anyagmintára vonatkozva is meghatároztam, mivel a standard addícióval történő torzítatlanság vizsgálat nem volt megfelelő. (14) A számolás során szintén a 3.5. fejezetben leírt 3. számú képletet használtam fel. Az eredményeket a 14. táblázat tartalmazza.
35
14. táblázat: Referencia anyagminta visszanyerése a validálás során Elem
Mért értékegység
Al** As* B** Ca Cu Fe K Mg Mn Na Ni P Pb S* Sr Zn
mg/l mg/l mg/l % mg/l mg/l % % mg/l mg/l mg/l % mg/l % mg/l mg/l
Hitelesítő lapon szereplő érték 330 0,262 30 1,75 11,7 355 1,87 0,352 34,2 474 2,54 0,303 1,84 0,343 78,7 33,2
Kapott érték
R (%)
313 <1,23 45,6 1,73 12,0 338 1,86 0,348 32,3 475 2,47 0,282 2,20 0,344 79,5 33,8
94,9 n.a 152,0 98,9 102,6 95,2 99,5 98,9 94,4 100,2 97 93,0 119,6 102,0 101,0 101,8
A táblázatban *-al jelölt elemek informatív jelleggel lettek meghatározva, a **-al jelölt elemek szintén informatív jelleggel kerültek meghatározásra, azonban ezek esetén nem szerepeltettek szórás értéket. A visszanyerésből látszódik, hogy a legtöbb minta esetén jó visszanyerési értékeket kapunk a hitelesítő laphoz viszonyítva. A bór esetén tapasztaltunk eltérő értéket, azonban ennél az elemnél számolnunk kell az erre az elemre jellemző memóriaeffektussal, továbbá a feltárási módszerből származó szennyeződéssel.
4.1.6. Ismételhetőség A módszerfejlesztés során a precizitás olyan teljesítményjellemző, ahol a független vizsgálati eredmények közötti egyezés mértékét vizsgáljuk meg. A precizitás vizsgálatán belüli további felbontást adhatunk meg. Egyrészt vizsgálhatjuk az ismételhetőséget, ahol a minta elemzését adott módszerrel, műszerrel, adott analitikus végzi el, rövid időintervallum alatt egymást követő mérésekkel. A precizitás másik fajtája pedig a reprodukálhatóság, melyet körmérések
36
által,
különböző
műszerekkel,
eltérő
analitikusok
mérései
által
hosszú
időintervallumra nézve vizsgálnak. Az ismételhetőséget 1 napon belül háromszori ismétléssel (I1, I2, I3 minták), bemérésenként 3-3 párhuzamos mérésével végeztem el virág mintán, melyek eredményét a 15. táblázat tartalmazza. 15. táblázat: Egy napon belül háromszori mérés ismételhetősége Elem Al As B Ca Cu Fe Hg K Mg Mn Na Ni P Pb S Sr Zn
I1 (mg/l) 74,2 <1,23 23,20 6800 13,1 132 <0,787 24600 5670 41,9 36,3 0,16 5070 1,77 2680 11,7 33,2
I2 (mg/l) 64,7 <1,23 21,71 6200 11,8 119 <0,787 18400 5390 38,5 18,8 0,15 4760 1,25 2660 10,6 29,7
I3 (mg/l) 70,5 <1,23 22,87 6500 12,5 126 <0,787 20500 5650 40,5 27,8 0,15 4970 1,67 2730 11,2 31,5
átlag (mg/l) 69,8 22,59 6500 12,5 125 21100 5570 40,3 27,6 0,15 4930 1,56 2690 11,2 31,4
szórás (mg/l) 4,8 0,78 300 0,7 7 3200 150 1,7 8,7 0,01 160 0,28 40 0,5 1,7
RSD (%) 8,00 3,46 4,62 5,36 6,25 15,06 2,77 4,25 6,85 3,77 3,19 3,27 1,37 4,82 5,48
Az RSD (3.3. fejezet 4. számú képlet) értékein látszik, hogy a legtöbb elem esetén a szórások eltérése az átlag értékekhez viszonyítva 5% vagy az alatti érték. Azon elemek esetén, ahol ez az érték 5% fölé esett, a további mérés ismétléseivel ez a teljesítményjellemző még pontosabban megadható, valamint ezáltal a kapott ismételhetőség is pontosabban meghatározható.
4.1.7. Kimutatási határ meghatározás A kimutatási határ a vizsgált komponensnek az a legkisebb koncentrációja egy mintában, amely a leírt kísérleti körülmények között még detektálható, de nem szükséges annak mérése. A kimutatási határ megállapításával csak a vizsgált
37
komponensek koncentrációját vizsgálják, hogy egy bizonyos érték felett vagy alatt vannak-e. A kimutatási határ adott jel/zaj viszonyhoz köthető. Ebben az esetben nem haladhatja meg a J/Z érték a 3-at. A kimutatási határkoncentrációk számolásához szükségünk van az egyes vonalak érzékenységének kiszámolására (3.5. fejezet 5. képlet), valamint a vak jelek szórására. Az LOD értékét (cL) ezt követően a 3.5. fejezetben leírt 6. képlet segítségével kapjuk meg. Azokban az esetekben, ahol a kalibrációs egyenes közelítő függvénnyel lett meghatározva, a vonalak érzékenységét azon kezdeti tartományon vizsgáljuk, ahol még ezen függvények még lineárisnak tekinthetőek. Az egyes elemekhez tartozó kimutatási határértékek a 4. számú mellékletben találhatóak meg.
4.1.8. Meghatározási határ mérése A mennyiségi mérési határ alacsony koncentrációjú vegyületek meghatározásának paramétere a mintában. A mennyiségi határ a keresett komponens azon legkisebb koncentrációja, amely az előírt vizsgálati körülmények között még elfogadható szórással és pontossággal meghatározható. A meghatározási határ a kimutatási határból becsülhető. Meghatározási határként általában a kimutatási határérték 10-szeresét szokták alapul venni. (16. táblázat)
4.1.9. Range (Mérési tartományok meghatározása) A mérési tartományokat az egyes elemek esetén a meghatározási határ és a műszer mérési kapacitása határozza meg, valamint a kalibrációban legnagyobb koncentrációban alkalmazott standard koncentrációja. Ügyelnünk kell, hogy a vizsgált mintánk elemkoncentrációi e közé az értékek közé essenek. (16. táblázat)
38
16. táblázat: Egyes elemekhez tartozó LOQ, valamint mérési tartomány értékek Elem Al As B Ca Cu Fe Hg K Mg Mn Na Ni P Pb S Sr Zn
Meghatározási határok (mg/l) 0,091 0,246 0,107 0,216 0,115 0,284 0,157 0,243 3,04 0,012 0,375 0,032 0,055 0,225 0,012 0,0008 0,014
Mérési tartomány (mg/l) 0,091-20 0,246-2 0,107-5 0,216-1000 0,115-5 0,284-20 0,157-2 0,243-1000 3,04-500 0,012-5 0,375-20 0,032-5 0,055-1000 0,225-5 0,012-1000 0,0008-5 0,014-5
4.1.10. Mintaelőkészítések összehasonlítása A 3.3. fejezetben bemutattam háromféle mintaelőkészítési módszert, melyek a következők voltak: főzőpohárban történő, blokkroncsolóval, illetve mikrohullámmal történő feltárás. A módszervalidálásban fontosnak tartottam összevetni a három feltárási módszert, mely közül a számomra legalkalmasabbat a validálás során alkalmazhatok. Az összevetést referencia anyaggal történő méréssel végeztem, melyek eredményét az alábbi táblázat tartalmazza (17. táblázat).
39
17. táblázat: Mintaelőkészítések összehasonlítása
Elem Al As B Ca Cu Fe Hg K Mg Mn Na Ni P Pb S Sr Zn
blokkroncsolós feltárás (mg/kg) 323±19 <1,23
főzőpoharas feltárás (mg/kg) 306 ± 3 <1,23
mikrohullámú technika (mg/kg) 320±11 <1,23
39,7±4,2 17300±3600 12,0±2,4 338±45 <0,787
32,8± 7,4 15300 ± 3800 15,7± 1,8 333 ± 14 <0,787
31,4±2,9 17400±3400 12,1±2,2 340±36 <0,787
18700±300 3500±400 32,3±2,3 475±13 2,47±0,11 2830±170 2,20±0,50 3450±70 79,5±2,8 33,8±4,1
20800 ± 300 4000 ± 400 25,9 ± 0,7 496 ± 11 2,54 ± 0,34 2990 ± 200 2,56±0,76 2080 ± 90 72,5 ± 0,4 22,7 ± 4,3
18700±200 3500±400 31,9±2,2 480±11 2,49±0,10 2850±160 2,13±0,43 3450±70 82,3±2,9 33,6±3,8
Az eredményekből az tükröződik vissza, hogy néhány elemet leszámítva nem látható
nagymértékű
eltérés
a
kapott
elemkoncentrációkban.
Mindhárom
mintafeltárási módszernek megvan a maga előnye, illetve hátránya. A főzőpohárral történő feltárás során egy egyszerű, olcsó módszerről beszélhetünk, azonban a roncsolási idő jelentősen megnőtt, mivel a hőmérsékletprofil nem volt megfelelő, valamint az ez által szolgáltatott eredmények jelentős eltérést mutattak a másik két technikához képest, így elvetettük azt, hogy főzőpohárban tárjuk fel a továbbiakban a mintáinkat. Két további módszer közül kellett választani. A zárt rendszerű roncsolás azért lenne előnyösebb, mivel jó fűtési profillal rendelkezik, viszonylag jól szabályozható és relatíve gyors módszernek tekinthető, mivel a mintákat körülbelül 1 óra alatt el lehetett roncsolni. Hátránya viszont, hogy a bemérések nagyon limitáltak, nem tudunk egyszerre sok mintát kezelni, valamint a rendszer elindítását követően kevés lehetőségünk van a folyamatba történő beavatkozásra. Másrészről a blokkroncsolóval
40
és a főzőpoharas feltárással szemben néhány elem esetén ennél a technikánál kisebb elemkoncentrációkat mértünk. Ezért van az, hogy a módszer validálásához, valamint további méréseinkhez is a harmadik, vagyis a blokkroncsolóval történő feltárást alkalmaztuk. Noha ennek a berendezésnek is megvannak a maga hátrányai, mint például a nyitott rendszer végett nem rendelkezik tökéletes fűtési profillal, valamint a feltárási időtartam többszöröse (6-8 óra) a mikrohullámú mérésnél alkalmazottnak, nagy savfelhasználás végett magasabb vakértéket kaphatunk, mégis a blokkroncsoló előnyeit kihasználva adekvát eredményeket kaphatunk. Ezen előnyök közé tartozik, hogy nyitott rendszer lévén bármikor beavatkozhatunk a folyamatba, további savat adagolhatunk a mintákhoz. További előnye a módszer kapacitása, valamint az egyes alkatrészek relatíve olcsón beszerezhetőek hozzá, ezáltal költséghatékony a módszer.
4.2. Bodza drog ICP vizsgálatai 4.2.1. Bodzaminták elemtartalom vizsgálata ICP-OES-sel A teljesítményjellemzők vizsgálatát követően meghatároztam a fekete bodza elemtartalmát. Az irodalmi áttekintésben említettem, hogy a fekete bodzának rengeteg féle alkalmazása volt, ezért a növény minden részét felhasználták a gyökerektől a virágokig. Célkitűzésem között szerepelt tehát a növény számos részének savas feltárása, valamint ezt követően a növényi részek elemtartalmának vizsgálata. Négy növényi résszel foglalkoztam, köztük a szárral, levéllel, virággal, illetve bogyójával. A vizsgálati eredményeket a 18. táblázatban foglaltam össze.
41
18. táblázat: Elemtartalom meghatározás eredményei négy növényi részre Elem
Al
Virág
Levél
Szár
Bogyó
(mg/kg)
(mg/kg)
(mg/kg)
(mg/kg)
77,8±1,2
163±42
20,6±5,3
k. h. a.
<1,23
<1,23
<1,23
<1,23
As B Ca Cu Fe
22,9±3,6
113±13
14,8±2,9
k. h. a.
7000±100
23900±1300
7090±80
830±90
8,75±0,05
4,34±0,43
1,47±0,07
1,66±0,21
144±9
243±64
62,1±9,3
21,0±0,4
<0,787
<0,787
<0,787
<0,787
Hg K Mg Mn Na Ni P Pb S Sr Zn
21300±500
26800±2000
8400±200
5200±400
4700±200
13500±1200
1360±30
496±25
40,8±1,2 52,4±11,6 0,165±0,10 4270±50
46,8±3,6 82,3±24,4 0,34±0,03 2480±80
13,5±5,4 293±35 5,16±0,33 710±7
5,71±0,37 39,2±1,6 2,33±0,13 860±60
1,40±0,24
2,84±0,76
<1,12
<1,12
2250±100
2220±60
495±19
358±14
8,27±0,24 32,2±1,2
80,63±1,30 32,2±14,2
<0,004 7,94±0,03
<0,004 4,06±0,41
A táblázatból az alábbi következtetéseket vonhatjuk le. Az eredményekből az látható, hogy az egyes növényi részek elemtartalma jelentősen eltér, azonban az átlagos növényi elemtartalomhoz képest csak néhány elem esetén beszélhetünk kiugró értékről. A bór, amely a reproduktív szervek kialakulásáért és megtermékenyülésért felelős általában ezekben a szervekben halmozódik fel, mint ahogy látszik is a virágban viszonylag magas koncentrációértékeket tapasztalhatunk, azonban érdekes módon a levélben ennek az elemnek a mennyisége többszöröse mind a növényben tapasztalt, mind pedig az átlagos növényi koncentrációk tekintetében, melyre magyarázat lehet
42
az, hogy bőséges bórellátás esetén az elem képes elraktározódni a levelekben is. (16)(17)
Szintén eltérés tapasztalható a vas esetén. A vasnak a növény levelében mért koncentrációja átlépte az irodalomban leírt átlagos növényi koncentrációértékeket. (17)(18)
Ezek az elemek fontosak a növényi fotoszintézisben, valamint oxidációs és redukciós folyamatokban, melyek legtöbb esetben a levélben zajlanak le. Toxikus fémek esetén, mint például az arzén, higany, a növényben mért koncentrációk a mérési tartományon kívül estek, ezért ezek pontos koncentrációját nem tudtuk meghatározni. Ólom esetén elmondható, hogy megengedett érték alatt, vagyis 3 mg/kg-es koncentráció alatt mértünk.
4.2.2. Elemtartalom meghatározása ICP-MS módszerrel Az ICP-MS az ICP-OES-hez viszonyítva egy friss módszer, ezért nagyobb érzékenységgel bír, melyek az eredményekből is jól látszódnak. Az arzén esetén, ahol az előző módszerben kimutatási határ alatti eredményeket kaptunk, az ICP-MS jó eredményeket szolgáltatott. A kapott elemkoncentráció értékeket, melyeket a bodza virág és levél esetén kaptam a 19. táblázat tartalmazza. Az eredményekből az figyelhető meg, hogy főként a mikroelemek esetén kaptunk eredményt. Mivel az ICP-MS módszer érzékenyebb, ezért a vizsgálat során megnéztem, hogy az ICP-MS által kapott eredményekhez viszonyítva milyen eltéréseket mutatnak az ICP-OES eredmények.
43
19. táblázat: Az ICP-MS-ből származó elemmeghatározás eredményei és az ICPOES mérés eredményeinek eltérése abszolút értékben
Elem
Virág
neve
(mg/kg)
Al
89,1±3,8
As
0,21±0,02
B
17,9±0,4
Cd
Eltérés mértéke (%) 12,7 -
Levél (mg/kg) 185±3 0,41±0,02 106±6
Eltérés (%) 13,8 -
0,03±0,003
27,7 -
0,06±0,02
5,8 -
Co
0,38±0,08
-
0,36±0,09
-
Cu
7,72±0,21
13,3
4,20±0,35
3,2
Fe
134±4
7,8
213±1
Hg
k.h.a.
-
k.h.a.
4,5 -
Mn
41,9±0,6
2,7
41,7±0,6
10,9
Mo
1,03±0,03
-
5,49±0,004
-
Na
49,1±6,6
6,8
62,5±1,0
24,0
Ni
0,15±0,35
10,0
0,35±0,02
2,9
Pb
1,77±0,11
20,9
2,13±2,31
25,0
Sr
11,2±0,01
26,4
80,8±1,2
0,3
Ti
10,1±0,5
-
51,2±3,1
-
Zn
35,5±4,5
9,2
21,6±4,0
32,8
A makroelemekre az ICP-MS-el történő elemmeghatározás során nem kaptunk értékelhető eredményt. Ennek oka, hogy a fő elemekre a kvadrupól tömeganalizátort alkalmazó ICP-MS készülékek nehezen vagy egyáltalán nem tudnak értékelhető eredményt adni, valamint a foszfor, kén és kálcium esetén további adduktok is képződhetnek, melyek szintén növelik a módszer zavarását és így ezáltal nehezítik az értékelést. Másik problémát jelenthet, hogy az összes ionkoncentráció a módszer esetén nem haladhatja meg a 0,1-0,2 %-ot, melyet csak a minták hígításával lehet elérni, azonban
44
a makroelemek koncentrációja a hígítást követően a mérési tartományon kívül esett még így is, ezért nem adott számunkra eredményt. Az eredményeket összevetve az ICP-OES méréssel azt láthatjuk, hogy bár nem tudjuk biztosítani az azonos mérési eredményeket, a két növényi rész elemkoncentrációi közötti eltérés arányait mind a két esetben megtapasztaljuk. Vagyis ICP-MS esetén is azt láthatjuk, hogy a mikroelemtartalom magasabb a levélben, mint a virágban. Az eredményekből az is látszik, hogy az ICP-MS az ICP-OES-hez viszonyítva jelentősen érzékenyebb mérési módszer. Az ICP-MS esetén is fontos, hogy a mennyiségi méréseknél a detektor válasz és a kapott
mérési
koncentrációk
között
lineáris
összefüggést
kapjunk,
ezért
szemléltetésképpen betettem az ICP-MS vasionnál kapott kalibrációs egyenesét (19. ábra).
19. ábra: Az m=57 g/mol tömegszámú Fe-nál kapott kalibrációs egyenes
4.3. Bodza vizes kivonatának vizsgálata 4.3.1.Bodza elemtartalmának kioldódása teába Az elkészített növényi drogokra vonatkoztatva szükségesnek találtam a növény vizes kivonatának vizsgálatát is, mivel ezáltal az egyes elemek kioldódódásáról kapunk információt. A 10 perces forrázatokat a kihűlésüket követően szintén ICP-
45
OES-sel vizsgáltam meg. A kapott eredményeket összehasonlítottam a korábban drogra kapott értékekkel, ezáltal megkaptam, hogy az egyes elemek tekintetében milyen
százalékos
kioldódást
tapasztalhatunk,
melyet
a
20.
táblázatban
szerepeltettem. Minta hiányában, a továbbiakban két növényi résszel, a virággal, valamint a levéllel foglalkoztam.(19) 20. táblázat: Kioldódási vizsgálat eredménye növényi drogra vonatkoztatva Virágtea Elem
Al Ca Cu Fe K Mg Mn P S Sr Zn
koncentráció
Levéltea koncentráció
(mg/l)
(mg/l)
0,13±0,02 30,6±2,7 0,03±0,01 0,11±0,02 401±24 90,3±15,3 0,40±0,03 41,0±7,6 37,8±8,63 0,04±0,01 0,35±0,06
0,32±0,01 45,3±6,2 0,06±0,02 0,58±0,13 520±21 223±45 0,86±0,04 40,9±8,2 37,6±6,3 0,15±0,03 0,47±0,05
Virág
Levél
kioldódás
kioldódás
mértéke
mértéke
(%)
(%)
11,6 22,0 17,1 3,8 93,8 96,0 49,0 48,0 84,1 24,2 54,3
9,8 9,5 69,1 11,9 96,9 82,8 91,9 82,6 84,8 9,3 73,1
Az eredményekből két következtetést is levonhatunk. Egyrészt, hogy a virágból készült tea során a droghoz viszonyítva hatékonyabb az elemek kioldódása a teákba, mint a levélből készült teák esetén. Ez alól három elem kivételt képez: a réz, a vas, valamint a mangán. Másfelől pedig érdekes eredményt szolgáltatnak a kalcium, valamint a magnézium kioldódásából származó értékek. Az emberben a Ca-Mg arány 4:1-hez, melynek komoly élettani szerepe van. A túlzott kalciumadagolás a szervezetben gyökös folyamatokat indít el, melynek során további kalcium szabadul fel a szervezetből ionos formában, ami még tovább rontja az elemegyensúlyt, azonban magnézium adagolással az egyensúly helyreállítható. Növények esetében ez az arány általában ~1,5-2:1 arányú. A kioldódás során viszont azt tapasztaljuk, hogy a magnézium a virág teája esetén négyszer hatékonyabban
46
oldódik ki, mint a kalcium, ami a szabadgyökös folyamatok gátlása szempontjából fontos lehet.
4.3.2. Táplálkozástani szempontból fontos értékek meghatározása Az RDA-t (Reccommended Dietary Allowance) vagy magyar fordításban napi ajánlott szükségleti értéket 1950-ben az Amerikai Táplálkozástani intézet meghatározta és standardizálta az egyes vitaminokra és ásványi anyagokra vonatkozóan. Ez az érték nagyon fontos, mivel mind élettani, valamint táplálkozástani szempontból is fontos tájékoztatnunk a fogyasztókat arról, hogy mennyi a napi szükséglet. Amerikai mintára később a többi ország, köztük Magyarország is megadta a maga RDA értékeit, melyek az Európai Unió szabályozása alá esik és az ország éghajlatához, adottságaihoz lett igazítva. Az RDA értékek sok biológiai és biokémiai paramétertől függenek. Az eltérő értékeket okozhatják az életkor és a nemek közötti különbségek, de a fizikai aktivitás, valamint az eltérő táplálkozás is. Magyarországon az OÉTI vagy Országos Élelmiszer-és Táplálkozástudományi Intézet foglalkozik ezzel a témakörrel, valamint az RDA értékeket a Magyar Élelmiszerkönyv 1-1-90/496 számú előírása alapján határozták meg.(20) Az általam mért eredmények nem térnek ki a vitaminokra, csupán a lehetséges ásványi anyag beviteli mennyiségeket vizsgáltam a virágból készített tea által, ezért az OÉTI táblázatából csak ezeket az értékeket vettem ki. (21. táblázat)
47
21. táblázat: RDA értékek és összehasonlítása a fekete bodzateához OÉTI által meghatározott RDA érték (mg/nap) 2000 800 700 375 14 10 1 2
Elem neve K Ca P Mg Fe Zn Cu Mn
Általam mért koncentrációk a bodzateában (mg/l) 401±24 30,6±2,7 41,0±7,6 90,3±15,3 0,11±0,02 0,35±0,06 0,03±0,01 0,4±0,03
1 liter tea által bevitt mennyiség az RDA érték %-ában 20 3,8 5,6 24,1 0,7 3,5 3 20
A táblázatban szereplő adatok közül három érdekes eredményt vehetünk észre. Fontos tudni, hogy az RDA értékeket 70 kg átlagos tömegű felnőttre vonatkoztatva adják meg. Az általam mért mennyiségek 1 liter tea elfogyasztása esetén várható értékek, mely mennyiség terápiás célokra alkalmazandó. Az RDA értékek esetén 15%-os limit van meghatározva arra vonatkozólag, hogy egy adott elem jó elemforrásnak tekinthető-e. A fekete bodza esetén három elem esetén beszélhetünk erről. A kálium, a magnézium, illetve a mangán. A kálium, valamint a magnézium egyaránt a makroelemek közé tartozik, ezért ezekből nagy mennyiséget kell bejuttatni az emberi szervezetbe.
A
kálium
szerepe
az
emberi
szervezetben
a
sejtek
transzportfolyamataiban, például hidrogén átvitel esetén nélkülözhetetlen, míg a magnéziumnak az izom és idegrendszeri folyamatokban van fontos szerepe. A mangán már a mikroelemek közé tartozik, de a szerepe az emberi szervezetben nem elhanyagolandó, mivel nagy jelentősége van a szabadgyökös folyamatokban, mint például a SOD, azaz szuperoxid-dizmutáz enzim felépítésében. (21) Azt állapíthatjuk meg ezáltal, hogy napi szinten 1 liter fekete bodzából készített tea jó kálium-, magnézium-, valamint mangánforrásnak tekinthető.
48
4.4.Spektrofotometriás mérések 4.4.1. Összes flavonoidtartalom meghatározása A fekete bodza egyes növényi részeiben mért flavonoidkoncentráció eredményei az alábbi táblázatban kerültek összefoglalásra (22. táblázat). 22. táblázat: Az egyes növényi részek flavonoidtartalma Flavonoidkoncentráció
Minta
(%)
száraz virág
1,92 ± 0,13
száraz levél
2,31 ± 0,18
száraz szár
0,112 ± 0,002
száraz bogyó
0,118 ± 0,004
Az eredményekből az látható, hogy az összes növényi rész közül a levelek flavonoidtartalma a legmagasabb, azonban a virág (melyet legtöbbször fogyasztunk) eredménye sem marad el sokkal.
4.4.2. Szabadgyökfogó-kapacitás meghatározása A metodikában meghatározott egyenes egyenletébe behelyettesítve megkaphatjuk a mintákra vonatkozó vasredukáló-képességet. A kapott eredményeket, melyekbe beleszámoltam a hígítás mértékét, a 23. táblázat tartalmazza. A kapott eredmények alapján elmondhatjuk, hogy hasonlóan a flavonoid mérésénél tapasztaltaknál itt is a levélminta szabadgyökfogó-képessége bizonyult a legjobbnak, míg a legkisebb a szár vasredukáló-képessége volt.
49
23. táblázat: A növényi részek szabadgyökfogó-kapacitása Szabadgyökfogó-kapacitás
Minta
(µM) száraz virág
6590 ±434
száraz levél
8428 ±635
száraz szár
1689 ±92
száraz bogyó
7256 ±491
Azt várnánk, hogy a magasabb flavonoidtartalommal nő a növény szabadgyök fogó kapacitása is, azonban a virág és a bogyó esetén ez az összefüggés nem áll fenn.
50
5. Összefoglalás A fekete bodza, mint népi orvoslásra felhasznált növény számos érdekességet rejt magában. A vizsgálataim célkitűzése nagyon sokrétű volt és széles terjedelemben próbálta összefonni a bioanalitikát, a szervetlen biokémiát, valamint a hagyományos értelemben vett műszeres analitikát, illetve a minőségbiztosítást. Az eredményeket összegezve rá kell jönnünk, hogy mennyire komplex és nehéz ezen témakörök között kapcsolatot kialakítani és mennyire sokrétű és időigényes ezen folyamatok végrehajtása. Nélkülözhetetlen
táplálkozástani
szempontból
is
ekkora
részletességgel
megvizsgálnunk a növényt, mivel a nem megfelelő és nem kellő részletességgel elvégzett mérések miatt később komoly károsodást is okozhatunk az emberi szervezetre. A validálás során a célom volt a lehető legtöbb teljesítményjellemző meghatározása, mivel idő hiányában a teljes módszerfejlesztés nem volt lehetséges. A módszervalidálásnál a szelektivitás vizsgálata során megvizsgáltam az egyes detektálható vonalak esetleges zavarásait, majd ezt követően a méréshez szükséges érzékenységgel rendelkező és zavarásmentes vonalakat kiválasztottam. A linearitás vizsgálata során megkaptam a kalibrációs egyeneseket az egyes vonalakra, majd ezt követően a kalibrációra vonatkozó kimutatási és meghatározási határokat, valamint a lineáris mérési tartományt is megkaptam. A torzítatlanság vizsgálatakor kétféle technikával is megnéztem, hogy az egyes vonalak esetén milyen visszanyerésekre számíthatok. Egyrészt standard addíciós módszerrel, valamint mivel ezen eredmények nem biztosítottak számomra megfelelő eredményt, hitelesített referenciaanyaggal történő méréssel is megnéztem, hogy milyenek a visszanyerések. Pár elemet leszámítva ezen értékek megfelelőnek bizonyultak. Precizitás vizsgálatán belül az ismételhetőségi méréseim is azt mutatják, hogy a legtöbb elem esetén 5%-os hibahatáron belül lehet mérni, azonban ahol ez az érték
51
meghaladja az 5%-ot, további mérésekkel kell meggyőződni a módszer ismételhetőségéről. A módszerfejlesztés mellett azonban a validáláshoz számomra legalkalmasabb feltárási módszer megkeresése volt az elsődleges. A feladat nehézségét a módszerek előnyei és hátrányai jelentették. A mérések során a főzőpoharas feltárással jelentős eltérést tapasztaltam az elemtartalmak meghatározása során, ezért a másik két technika között kellett választanom. A mikrohullámú feltárással egy gyors és pontos feltárási módszert ismerhettem meg, azonban ezzel a módszerrel limitált mennyiségű mintát tudtam csak egyszerre vizsgálni. Ezzel szemben a blokkroncsólóval történő feltárási eredmények szórása átfedésben volt a mikrohullámú feltárás során kapott eredményekkel, továbbá nagyszámú mintafeltárást biztosított számomra, ezért a blokkroncsólóval történő feltárást választottam. A keletkező nitrózus gázok elvezetésével pedig biztosítjuk a biztonságos használatot. Hátránya a hosszú feltárási idő, mely akár 6-8 órát is felölelhet, de a kapott eredmények kellő mértékben megbízhatóak és pontosak voltak, ezáltal megfelelőnek tartottam a minták feltárásához. Miután az egyes teljesítményjellemzők meghatározásra kerültek, valamint kiválasztottam a számomra legmegfelelőbb mintafeltárási módszert, megvizsgáltam a növény különböző részeinek elemtartalmát. Konklúziót levonva tehát arra jutottam az elemtartalom meghatározás során, hogy az egyes elemek koncentrációja az átlagos növényi elemtartalomhoz képest nem mutat nagymértékű eltérést, azonban egyes esetekben a környezet hatására adott elemek koncentrációja nem várt módon megemelkedhetnek, mint ahogy azt a bór esetén tapasztaltam, mely jóval magasabb koncentrációban volt jelen a levélben, mint a reproduktív szervekben. A toxikus fémek vizsgálata során azt kaptam, hogy ezek koncentrációja a határérték alatt található, vagyis jelentős mennyiségben toxikus fémet nem tartalmaztak a minták. Az ICP-MS módszerrel történő elemtartalom meghatározás során arra a következtetésre jutottam, hogy a módszer főként a mikroelemekre meghatározására a legalkalmasabb és arzén esetén ezzel a módszerrel kaptam értékelhető eredményt. Az ICP-OES- és az ICP-MS-sel történő mérések
52
összehasonlítását követően azt láthatjuk, hogy az ICP-MS rendkívül érzékeny módszer, mivel a kapott elemekre meghatározott koncentrációk szórásai lényegesen kisebbek voltak, mint az optikai emissziós módszer esetén. A bodzateákba történő elemek átoldódásának mérésekor azt tapasztaltam, hogy a Ca: Mg arány, mely a növényben körülbelül 1,5-2: 1 a teákban eltolódik a magnézium irányába, mivel mindkét növényi részből készült teában a magnézium kioldódása négyszer hatékonyabb volt, mint a kalciumé. Az EU által meghatározott és az OÉTI által megadott napi ajánlott szükségleti értékekhez viszonyítva a teában tapasztalt elemkoncentrációkat vizsgálva azt az eredményt kaptuk, hogy 1 liter fekete bodzából készített tea elfogyasztása esetén jó kálium-, magnézium-, illetve mangán-forrásnak tekinthető a virágból készített tea. Az összes flavonoidtartalom mérése során az alábbi konzekvenciákat tudjuk leszűrni. Itt is, hasonlóan az elemtartalomnál tapasztaltakkal, a négyféle növényi rész közötti jelentős eltéréseket tapasztaltam. A flavonoidtartalom alapján a sorrend a következőképpen alakult: levél>virág>bogyó>szár. A szabadgyökfogó-kapacitás vizsgálatáról, melyet a FRAP módszerrel végeztem az alábbi megállapításokat tehetjük. A levélminták ezen tulajdonsága a legjelentősebb a növényben, melyet ezt követően a termés, majd a virág, végül a szár szabadgyökfogó-kapacitása követ. Ebből arra lehet következtetni, hogy a levélben zajló folyamatok által keletkezett szabad gyökök megkötése ebben a szervben a legerőteljesebb, de a bogyó szabadgyökfogó-kapacitása sem elhanyagolható ebből a szempontból.
Azt
a
következtetést
vonhatjuk
le,
hogy
a
magasabb
flavonoidtartalommal rendelkező növényi részek jobb szabadgyökfogó- kapacitással rendelkeznek,
azonban
ezt
a
növény
befolyásolhatja.
53
fémiontartalma
is
nagymértékben
6. Irodalomjegyzék (1) Kumaran A., Karunakaran R. J.: Antioxidant and free radical scavenging activity of an aqueous extract of Coleus aromaticus. Food Chemistry, 97, 109-114 (2006)
(2) Aline M., Charles E. L., Marco R., Jeanne M., Odile G. N.: Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity Food Chemistry, Volume 91, Issue 3, July 2005, Pages 571-577 (3) Dr. Bartha Dénes- Magyarország fa -és cserjefajai, Mezőgazda kiadó (4)Dr. Záray Gyula-Az elemanalitika korszerű módszerei, Akadémia könyvkiadó (5)Montaser A., Golightly D. W.: Inductively Coupled Paslmas in Analytical Atomic Spectrometry. VCH Publishers, New York (1987) (6) Houk, R. S., Fassel, V. A., Flesch, G. D., Svec, H. J., Gray, A. L., Taylor, C. E., Inductively Coupled Argon Plasma as An Ion Source for Mass-Spectrometric Detemintation of trace Elements, Anal. Chem., 52 (1980) 2283–2289.
(7) Narayana, K. R., Reddy, M. S., Chaluvadi, M. R., Krishna, D. R.: Bioflavonoids classification, pharmacologic, biochemical effects and therapeutic potential. Indian. J Pharnurcol, 33, 2001, s. 2 - 16. (8) Iris F. F. Benzie and J. J. Strain: The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of ‘‘Antioxidant Power’’: The FRAP Assay ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 239, 70–76 (1996) (9) Hungarian Pharmacopoeia VIII. (Ph. Hg. VIII.) Medicina Könyvkiadó 2004
(10) Yamasaki, S., Applification of ICP-AES to agricultural samples, Kagaku noRyoiki, Zokan, 1980, (127),187.(Div. of Agricultural Chemistry, Hokkaido National Agriculture Experimental Station, Sapposo, Japan)
54
(11) Érico Marlon de Moraes Flores, Juliano Smanioto Barin, José Neri Gottfried Paniz, João Alfredo Medeiros, and Günter Knapp,
Microwave-
Assisted Sample Combustion: A Technique for Sample Preparation in Trace Element Determination Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Maria, 97105-900 Santa Maria, RS, Brazil, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro 21949-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil, and Institute for Analytical Chemistry, Micro-
and Radiochemistry,
Graz
University of
Technology,
Technikerstrasse 4, A-8010 Graz, Austria (12) Blázovics A., Szentmihályi K., Lugasi A., Balázs A., Hagymási K., Bányai É., Then M., Rapavi E., Héthelyi É. In vitro analysis of the properties of Beiquishen tea. Nutrition 19(10), 869-875 (2003)
(13) Marin Senila, Andreja Drolc, Albin Pintar, Lacrimioara Senila, Erika Levei, Validation and measurement uncertainty evaluation of the ICP-OES method for the multi-elemental determination of essential and nonessential elements from medicinal plants and their aqueous extracts, Journal of Anal. Science 2014, 5:37, INCDO-INOE 2000, Research Institute for Analytical Instrumentation, 67 Donath, Cluj-Napoca 400293, Romania
(14) Schramel, P., and XU, L., Determination of 14 elements in botanical samples by simultaneous ICP-AES using standard RM as multielement standard, Fresenius’Z. Anal. Chem., 1983, 314, 671 Inst. for Agric. and Biol. Sci, Ohayama Univ. Kurashiki 710, Japan
(17) Kabata-Pendias A., Mukherjee A. B.: Trace Elements from Soil to Human. Springer Verlag, Heidelberg, New York, Berlin (2007)
(18) Pais I.: The significance of trace elements in agricultural production. The situation of their research in the world. Kertészeti Egyetem, Budapest (1984)
55
(19) J.L. Guil Guerrero , J.J. Giménez Martı́nez, M.E. Torija Isasa, Mineral Nutrient Composition of Edible Wild Plants Journal of Food Composition and Analysis 11, 4, Pages 322–328 (1998 (20) A Magyar Élelmiszerkönyv 1-1-90/496 számú előírása
(21) M. Atanassova, S. Georgieva, K. Ivancheva: Total phenolic and total flavonoid content, antioxidant capacity and biologial contaminant in medical herbs Journal of the University of Chemical Technology and Metallurgy, 46, 1, 81-88 (2011)
56
7. Köszönetnyilvánítás Szeretném hálámat kifejezni témavezetőmnek, Dr. Szentmihályi Klárának, a laboratóriumi kísérleteimhez nyújtott lehetőségért, továbbá a diplomadolgozatom elkészítéséhez szükséges szakmai útmutatás és türelem biztosítását, melyet felém mutatott.
Köszönet illeti továbbá May Zoltánt, valamint Rábai Máriát, akiknek áldozatos munkájuknak, valamint odaadó segítségüknek köszönhetően betekintést nyerhettem, illetve elsajátíthattam a laboratóriumi technikák alapjait és elláttak engem további elméleti és gyakorlati tanácsokkal.
Nem utolsó sorban szeretném köszönetemet nyilvánítani Dr. Bezúr Lászlónak és Dr. Koczka Bélának, akik tanácsokkal láttak el és rengeteg segítséget nyújtottak a dolgozat elkészüléséhez.
57
8. Nyilatkozat Alulírott, Szabó Zoltán, II. éves vegyészmérnök MSc. szakos hallgató, kijelentem, hogy a diplomadolgozatban foglaltak saját munkám eredményei, és csak a hivatkozott forrásokat (szakirodalom, eszközök, stb.) használtam fel. Tudomásul veszem azt, hogy diplomadolgozatomat a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem könyvtárában, a kölcsönözhető könyvek között helyezik el
……………………………… Aláírás Budapest, 2015.
58
Mellékletek
59
1. melléklet Lucerna p-alfalfa hitelesített referenciaanyag bizonylata
60
61
62
63
64
65
2. számú melléklet: Kalibrációs egyenesek
66
67
68
69
70
71
3. számú melléklet: Reziduálisok számolása
Elem
Al
As
Ca
Cu
Fe
Hg
K
Mg
Koncentráció (mg/l) x 0 0,5 2 10 20 0 0,1 1 2 0 20 100 500 750 1000 0 0,2 0,5 1 2 5 0 0,2 0,5 1 2 10 20 0 1 2 0 200 500 1000 0 20
Mért koncentráció (mg/l) y 0,002 0,478 2,13 10,2 19,95 0,002 0,158 1,03 2,12 -0,001 19,8 99,89 509 751 994 0,003 0,182 0,475 1,03 2,03 4,92 -0,002 0,089 0,561 1,043 2,050 10,11 18,83 -0,007 0,961 2,162 0,021 198 507 989 0,001 19,97
72
Számított koncentráció (mg/l)
Reziduum (mg/l)
0 0,501 2,0046 10,02 20,05 0 0,106 1,06 2,13 0 19,99 99,98 499,9 749,9 999,8 0 0,198 0,494 0,988 1,975 4,939 0 0,19 0,478 0,956 1,912 9,56 19,12 0 1,057 2,114 0 198,9 497,2 994,3 0 20,08
-0,002 0,023 -0,127 -0,19 0,101 -0,002 -0,052 0,034 0,008 0,001 0,216 0,090 -8,813 -1,36 5,479 -0,003 0,016 0,019 -0,043 -0,056 0,024 0,002 0,102 -0,083 -0,087 -0,138 -0,550 0,295 0,007 0,096 -0,048 -0,021 1,0 -10,2 4,9 -0,001 0,103
Mn
Na
Ni
P
Pb
S
Sr
50 100 200 500 0 0,2 0,5 1 2 5 0 0,2 1 2 10 20 0 0,5 1 2 5 10 0 50 100 200 500 1000 0 0,2 0,5 1 2 5 0 50 100 200 500 1000 0 0,2 0,5
51,16 103 200 502 0,001 0,163 0,541 1,16 2,00 5,10 -0,012 0,208 0,92 2,48 11,98 21,02 0,001 0,521 1,283 2,003 4,97 10,01 0,181 52,2 105 196 503 1004 -0,003 0,134 0,474 0,92 1,95 5,07 0,282 51,1 103 199 497 1001 0,001 0,241 0,479
50,19 100,4 200,8 501,9 0 0,205 0,511 1,02 2,04 5,11 0 0,216 1,08 2,16 10,82 21,63 0 0,501 1,002 2,004 5,01 10,02 0 50,2 100,4 200,9 502,2 1004,4 0 0,201 0,502 1,005 2,009 5,023 0 49,89 99,77 199,5 498,9 997,7 0 0,201 0,503
73
-0,97 -2,2 0,7 0,3 -0,001 0,042 -0,030 -0,14 0,04 0,01 0,012 0,0083 0,16 -0,32 -1,162 0,606 -0,001 -0,020 -0,281 0,001 0,039 0,009 -0,181 -2,0 -4,2 4,9 -1,2 0,4 0,003 0,067 0,028 0,0815 0,064 -0,048 -0,282 -1,221 -2,863 0,5 1,61 -3,7 -0,001 -0,039 0,024
Zn
1 2 5 0 0,2 0,5 1 2 5
0,972 2,110 4,998 0,003 0,221 0,517 0,988 2,040 5,110
1,006 2,012 5,029 0 0,202 0,504 1,008 2,017 5,042
74
0,034 -0,098 0,031 -0,003 -0,019 -0,013 0,020 -0,023 -0,069
4. számú melléklet: Kimutatási határ értékek
Elem Hullámhossz (nm)
S (cps/mg*l-1)
Vak szórások (cps)
Korrelációs koefficiens
Al
394,401
247213
749,4
0,99979
Kimutatási határkonc. (mg/l) 0,0091
As
197,262
2557
21,0
0,99522
0,0246
B
249,773
79469
283,7
0,99868
0,0107
Ca
430,253
105922
763,6
0,99722
0,0216
Cu
324,754
669246
2567
0,99978
0,0115
Fe
239,562
216268
2045
0,99974
0,0284
Hg
194,227
14080
73,9
0,99994
0,0157
K
769,896
5912
47,8
0,99779
0,0243
Mg
182,793
830
84,0
0,99278
0,3036
Mn
294,921
435577
178,6
0,99932
0,0012
Na
589,592
2397260
29963
0,99985
0,0375
Ni
341,476
1340603
1417
0,99821
0,00317
P
215,408
38519
70,1
0,99979
0,0055
Pb
220,353
26971
202
0,99994
0,0225
S
182,034
166690
66,4
0,99925
0,0012
Sr
421,552
32328964
914
0,99869
0,0001
Zn
213,856
255767
121,9
0,99985
0,0014
75
