GRANULASI BROMELIN DENGAN VARIASI PENGISI STARCH 1500, AVICEL PH 102, MANITOL DAN PENGIKAT HPMC MENGGUNAKAN METODE GRANULASI KERING DRY GRANULATION OF BROMELAIN WITH THE VARIATION OF STARCH 1500, AVICEL PH 102, MANITOL AS FILLER AND HPMC AS BINDER Santi Pratami Marlina, Priyo Wahyudi, Inding Gusmayadi Fakultas Farmasi dan Sains UHAMKA, Jakarta. ABSTRAK Nanas (Ananas comosus (L.) Merr) memiliki banyak manfaat, salah satunya adalah memperlancar proses pencernaan. Bagian yang digunakan dalam penelitian adalah enzim bromelin dari kulit nanas. Penelitian bertujuan untuk mendapatkan formula granul bromelin yang memiliki sifat fisik granul, kadar protein, dan aktivitas protease terbaik. Penelitian diawali dengan pembuatan sari kulit nanas, dilanjutkan pembuatan serbuk kering dengan freeze drying. Serbuk kering yang diperoleh dibuat menjadi granul bromelin dengan variasi pengisi Starch 1500, Avicel PH 102, dan manitol menggunakan metode granulasi kering. Granul bromelin yang dihasilkan dilakukan pengujian sifat fisik granul, kadar protein, dan aktivitas protease. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Starch 1500, Avicel PH 102, dan manitol dapat menghasilkan granul bromelin dengan sifat fisik yang baik, kecuali waktu alir granul yang melebihi persyaratan yaitu > 10 detik untuk tiap 100 gram granul. Didapatkan juga nilai aktivitas protease sebesar 0,02 U/ml pada tiap formula. Kata kunci: Enzim bromelin, Pengisi, Granulasi kering
ABSTRACT Pineapple (Ananas comosus (L.) Merr) has many benefits, one of them is to facilitate the digestive process. The objective of this study was to get the formula of bromelain granule which has the best physical properties of granules, protein content, and protease activity. The study began with the extracting pineapple skin, followed by drying the extract with freeze dry method. Dry powder was made into granules obtained by variation of Starch 1500, Avicel PH 102, and mannitol as filler using a dry granulation method. The granules were evaluated the physical properties of granules, protein content and protease activity. The results showed that Starch 1500, Avicel PH 102, and mannitol can be used as a filler in granulating bromelain with good physical properties, except on the granules flow time that did not meet the requirements of >10 seconds for each 100 grams of granules. Also obtained values protease activity of 0.02 U/ml in each formula. Keyword: Enzyme Bromelain, Fillers, Dry Granulation
1
menghasilkan granul dengan sifat fisik terbaik, serta dapat menjaga kadar protein dan aktivitas protease dari enzim.
PENDAHULUAN Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk mempercepat reaksi kimia dalam sistem biologi. Enzim berikatan dengan substrat dan membentuk kompleks enzim substrat, sehingga terjadi pembentukan substrat menjadi produk (Murray et al. 2000). Salah satu jenis enzim yang aplikasinya sangat luas adalah enzim protease (Nascimento dan Martins 2006). Ekstrak mentah dari tanaman nanas (Ananas comosus (L.) Merr) mengandung beberapa jenis protease, yang salah satunya adalah bromelin (Tochi et al. 2008). Bromelin dapat diperoleh dari tanaman nanas baik dari kulit, buah, maupun batang (Herdyastuti 2006). Kandungan enzim bromelin yang ditemukan pada nanas bagian daging buah sebesar 0,080%, kulit 0,075%, dan bonggol 0,060% (Murniati 2006). Kegunaan bromelin dalam dunia kesehatan diantaranya untuk memperlancar proses pencernaan, menyembuhkan artritis, sembelit, infeksi saluran pernafasan, angina, dan trauma (Wirakusumah 1999). Formula enzim masih jarang ditemukan, karena sifat enzim yang tidak stabil terhadap lingkungan dan aktivitasnya yang dipengaruhi oleh suhu, pH, serta konsentrasi (Poedjiadi 1994). Penelitian Azzahro (2012) menyatakan bahwa enzim bromelin dapat diimobilisasi dengan perbandingan 2:1 (enzim bromelin:pati jagung), serta didapatkan aktivitas optimum enzim bromelin pada suhu 45oC dan pH 7. Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini dilakukan dengan menggunakan variasi pengisi Starch 1500, Avicel PH 102, manitol, dan pengikat HPMC secara granulasi kering. Granulasi kering digunakan apabila zat aktif tidak mungkin digranulasi basah karena tidak stabil atau peka terhadap pemanasan dan kelembapan (Lachman et al. 1994). Pada formula tersebut akan dilakukan pengujian terhadap sifat fisik granul, pengukuran kadar protein, dan aktivitas protease enzim. Variasi dilakukan untuk mengetahui jenis pengisi mana yang dapat
METODOLOGI A. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit nanas, Starch 1500, Avicel PH 102, manitol, Hydroxy Propyl Methyl Cellulose (HPMC), primogel, magnesium stearat, talk, Coomasie Brilliant Blue G250 (CBBG), Bovine Serum Albumin (BSA), asam fosfat 85%, KH2PO4 0,2 M, NaOH 0,2 N, asam trikloroasetat 10%, tirosin, kasein, etanol 70% dan 96%, dan akuades. B. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : ekstraktor khusus nanas, sentrifuge, freeze dryer (Buchi 190), neraca analitik, lumpang dan alu, mesin cetak tablet manual single punch (Korsch), pengayak nomor 18, granule flow tester, tapped density, pengayak bertingkat, moisture balance, spektrofotometer UV-Vis, termometer, botol semprot, dan peralatan gelas lainnya. C. Prosedur Penelitian 1. Penyiapan enzim bromelin bebas Kulit buah nanas dibersihkan dan dimasukkan kedalam ekstraktor khusus nanas, cairan sari kulit nanas yang dihasilkan ditampung. Ke dalam sari kulit nanas ditambahkan etanol 70% dengan perbandingan 1:2 (enzim:etanol). Campuran tersebut dibiarkan selama satu kali 24 jam agar enzim mengendap. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 4.000 rpm selama 15 menit. Endapan yang diperoleh dikeringkan dengan cara pengeringan beku. Diperoleh serbuk yang merupakan enzim bromelin kasar (Azzahro 2012). 2. Formula granul bromelin Formula granul yang dibuat dapat dilihat pada Tabel 1. 3. Pembuatan granul bromelin Timbang semua bahan, selanjutnya dilakukan pencampuran dari zat aktif, pengikat, pengisi, sebagian lubrikan dan 2
glidan hingga homogen. Kemudian campuran bahan tersebut dikompresi menjadi tablet yang besar dan kasar (slug), lalu dilakukan reduksi ukuran tablet dengan cara
dihancurkan menggunakan alu di atas pengayak nomor 18, kemudian ditambahkan sisa lubrikan dan glidan.
Tabel 1. Formula granul bromelin Nama Bahan Fase Dalam : Enzim bromelin Starch 1500 Avicel PH 102 Manitol HPMC Primogel Fase Luar : Mg stearat Talk
F1 (g)
F2 (g)
F3 (g)
80 30,4 0 0 4,8 4,8
80 0 30,4 0 4,8 4,8
80 0 0 30,4 4,8 4,8
Pengikat Penghancur
0,6 1,2
0,6 1,2
0,6 1,2
Lubrikan Glidan
Fungsi Zat aktif Pengisi
bobot granul yang tertinggal pada masingmasing ayakan ditimbang. 4). Kompresibilitas (Siregar dan Wikarsa 2008) Sejumlah granul dimasukkan ke dalam gelas ukur 100 ml, diukur sampai tinggi 100 ml. Granul dimampatkan sebanyak 500 kali ketukan dengan menggunakan alat uji tap density, volume uji sebelum dan sesudah dimampatkan dicatat. 5). Susut pengeringan (Depkes 1979) Pada uji ini digunakan alat moisture balance. Prosedurnya yaitu dimasukkan ± 2,0 g granul dalam pinggan berlapis aluminium foil yang telah ditara terlebih dahulu kemudian diukur kadar susut pengeringannya pada suhu 105°C hingga alat dengan sendirinya berbunyi dan muncul angka %MC pada display, maka akan didapat persen kandungan lembab. b. Uji kadar protein enzim bromelin bebas dan granul bromelin (Bradford 1976) Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford dan digunakan BSA sebagai protein standar. Sebanyak 7,0 ml sampel ditambahkan 3,0 ml
4. Pengujian granul bromelin a. Evaluasi sediaan granul bromelin 1). Organoleptis Uji organoleptis pada sediaan granul meliputi warna, aroma, dan rasa. Dilakukan dengan cara melihat warna granul, mencium aroma granul, dan merasakan rasa dari granul. 2). Sifat alir (Lachman 1994) Ditimbang sejumlah 50,0 g granul, dimasukkan perlahan-lahan ke dalam corong yang bagian bawahnya dapat dibuka dan ditutup, kemudiaan kertas milimeter blok diletakkan pada bagian bawah corong. Bagian bawah corong dibuka dan granul dibiarkan mengalir keluar dan tertampung di atas kertas milimeter blok. Selagi granul mengalir keluar, dihitung waktu yang dibutuhkan granul untuk mengalir bebas. 3). Distribusi ukuran partikel (Ansel 1989) Ditimbang berat kosong satu seri ayakan bertingkat lalu sebanyak 100,0 gram granul yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam ayakan bertingkat dengan nomor ayakan 20, 24, 30, 40, 60 dan penampung (pan), digoyangkan secara mekanik pada frekuensi 30 Hz selama 25 menit, kemudian 3
reagen Bradford lalu divortex kemudian diinkubasi selama 10 menit. Larutan diukur absorbansinya dengan alat Spectrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 596,5 nm. Data absorbansi yang diperoleh kemudian dikonversikan pada persamaan garis dari kurva standar BSA yang telah dibuat sehingga didapatkan kadar protein yang terkandung di dalam sampel. c. Uji aktivitas protease enzim bromelin bebas dan granul bromelin (Murachi 1970) Ke dalam 3 tabung reaksi kosong, dimasukkan sebanyak 3,0 ml kasein 1%, direaksikan dengan 0,5 ml larutan enzim bromelin bebas 1000 µg/ml (yang mengandung 100 µg enzim bromelin) dan 8,0 ml larutan dapar fosfat pH 7, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 45°C. Ke dalam 6 tabung reaksi kosong lainnya dari tiap-tiap formula, dimasukkan sebanyak 3,0 ml 1% kasein, direaksikan dengan 1,0 ml larutan granul bromelin 1000 µg/ml yang mengandung 100 µg enzim bromelin dan 8,0 ml larutan dapar fosfat pH 7, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 45°C. Setelah diinkubasi, ke dalam semua tabung reaksi ditambahkan 3,0 ml larutan 10% asam trikloroasetat, dan diinkubasikan kembali pada suhu 40°C selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 3,0 ml larutan spike tirosin, dikocok sampai homogen. Protein yang terkoagulasi dipisahkan dengan penyaringan menggunakan kertas saring, dilakukan pengukuran absorbansi filtrat pada λ 275,6 nm. Untuk pengukuran blanko, digunakan enzim yang telah diinaktifkan aktivitasnya dengan penambahan 10% asam trikloroasetat. Satuan aktivitas dinyatakan dalam 1,0 mg tirosin yang dihasilkan per ml enzim dalam 10 menit pada kondisi percobaan. Untuk mengetahui jumlah tirosin yang dihasilkan digunakan kurva standar tirosin.
Kulit nanas yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit dari buah nanas yang telah memiliki tingkat kematangan 80%. Kulit nanas yang terkumpul diperoleh dari UKM Subang, Jawa Barat. B. Hasil Evaluasi Granul Bromelin Evaluasi granul terdiri dari uji organoleptis, uji sifat alir, distribusi ukuran partikel, kompresibilitas dan susut pengeringan. Tujuannya adalah untuk mengetahui kualitas granul pada masingmasing formula dalam kaitannya dengan persyaratan granul yang baik dan memenuhi persyaratan. Hasil uji organoleptis granul dari semua formula memiliki kesamaan yaitu berwarna hijau. Pada formula 1 dan 3 berwarna hijau tua, sedangkan formula 2 berwarna hijau agak putih. Rasa yang dihasilkan pada formula 1 dan 2 yaitu agak manis, sedangkan pada formula 3 dihasilkan rasa yang manis. Dari evaluasi sudut diam diperoleh hasil, bahwa ketiga formula mempunyai sudut diam yang masih memenuhi persyaratan yang ditentukan yaitu kurang dari 30o. Pada pengujian waktu alir ketiga formula memberikan waktu alir yang kurang baik, karena waktu alir yang dihasilkan tidak masuk dalam persyaratan yang ditetapkan yaitu lebih dari 10 detik. Hal ini kemungkinan dipengaruhi dari kelembaban enzim bromelin bebas. Berdasarkan hasil evaluasi yang didapat, bahwa nilai kompresibilitas dari ketiga formula granul enzim bromelin memiliki indeks pengetapan kurang dari 20% yang artinya masuk dalam persyaratan yang telah ditetapkan. Dari hasil evaluasi didapatkan susut pengeringan melebihi batas yang dipersyaratkan, yaitu 3-5% (Voigt 1989). Hal ini dikarenakan dari kelembaban yang dimiliki enzim bromelin bebas. Uji distribusi ukuran partikel dilakukan dengan menggunakan metode pengayakan, alat yang digunakan adalah ayakan bertingkat. Berdasarkan grafik di atas penyebaran ukuran partikel berbeda tiap formula. Pada grafik formula 1 menunjukkan persentase granul tertinggal paling banyak pada mesh
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Isolasi Kulit Nanas 4
nomor 20, paling sedikit pada pan dan seimbang pada mesh nomor 24 dan 60. Pada formula 2 menunjukkan persentase granul tertinggal paling banyak pada mesh nomor 30, paling sedikit pada mesh pan dan seimbang
pada mesh nomor 20 dan 40. Pada formula 3 menunjukkan persentase granul tertinggal paling banyak pada mesh nomor 40, paling sedikit pada mesh nomor pan dan seimbang pada mesh nomor 30 dan 60.
Tabel 2. Hasil isolasi dari kulit nanas No 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Jenis
Hasil
Kulit nanas Sari kulit nanas Pengendapan dengan sentrifugasi Serbuk kering enzim bromelin Susut pengeringan Rendemen
450 kg 150 l 25 l 6,2180 kg 11,4067 % 1,3818 %
Tabel 3. Hasil evaluasi granul bromelin No.
1.
2.
3. 4.
Parameter Uji Uji Organoleptis : a. Warna b. Aroma c. Rasa Sifat Alir : a. Sudut Diam (°) b. Waktu Alir (detik) Kompresibilitas (%) Susut Pengeringan (%)
Formula 2
1
3
Syarat
Hijau tua Bau khas Agak manis
Hijau agak putih Bau khas Agak manis
Hijau tua Bau khas Manis
28,7700 12,67
28,9410 13
28,3999 13,11
≤ 30 < 10
5,1111
4,8333
5,8333
< 20
7,8028
5,9800
8,0878
3-5
5
Gambar 3. Grafik distribusi ukuran partikel granul bromelin Uji normalitas pada evaluasi granul bromelin menunjukkan nilai signifikasi sudut diam 0,109 > 0,05 dan kompresibilitas 0,138 > 0,05 yang artinya data tersebut terdistribusi normal, sedangkan nilai signifikasi waktu alir terdistribusi tidak normal yaitu 0,023 < 0,05 sehingga perlu dilakukan uji Kruskal-Wallis. Hasil uji homogenitas pada sudut diam didapatkan nilai signifikasi 0,2 > 0,05 dan kompresibilitas 0,068 > 0,05 menunjukkan bahwa data tersebut mempunyai varian yang sama (homogen). Berdasarkan Perhitungan statistik ANOVA satu arah menunjukkan bahwa tidak adanya perbedaan yang bermakna pada sudut diam dengan nilai signifikasi (0,081 > 0,05) dan adanya perbedaan bermakna pada kompresibilitas dengan nilai signifikasi (0,015 < 0,05) yaitu, Avicel PH 102 terhadap manitol. Data dari waktu alir yang tidak normal diuji dengan Kruskal-Wallis, dan hasil Asymp. sig menunjukkan tidak adanya perbedaan yang bermakna, yaitu 0,476 > 0,05. C. Hasil Uji Kadar Protein Enzim Bromelin Bebas dan Granul Bromelin Berdasarkan data tersebut dapat dilihat bahwa kadar protein pada granul bromelin mengalami penurunan, hal ini mungkin diakibatkan karena adanya proses adsorbsi fisik (carrier binding) oleh bahan pengisi pada saat digranulasi. Dari ketiga formula granul bromelin, granul dengan pengisi
Avicel PH 102 memiliki persentase kadar protein tertinggi dibanding dengan pengisi lainnya, yaitu hanya mengalami penyusutan ± 8%. Hal ini mungkin dikarenakan ikatan yang terjadi antara protein dengan Avicel PH 102 tidak merusak struktur protein, sehingga Avicel PH 102 dapat melindungi jumlah protein dalam enzim bromelin dengan baik dibanding Starch 1500 dan manitol. Data hasil pengujian kadar protein juga diuji secara statistika menggunakan ANOVA satu arah (One Way ANOVA) dengan uji normalitas sebagai uji pendahuluan. Dari hasil uji normalitas didapatkan hasil bahwa data pengujian kadar protein normal dengan signifikansi 0,2 > 0,05. Selanjutnya dilakukan uji homogenitas, hasil signifikasi menunjukkan kadar protein mempunyai varian yang sama (homogen) dengan nilai 0,502 > 0,05. Kemudian dilakukan uji ANOVA, untuk mengetahui apakah ketiga formula memiliki perbedaan atau tidak. Hasil analisa menunjukkan bahwa adanya perbedaan yang bermakna pada tiap formula, dengan nilai signifikasi 0,016 < 0,05. Pengujian selanjutnya dilakukan uji Tukey HSD untuk mengetahui letak perbedaan bermakna antara ketiga formula. Hasil uji Tukey HSD menunjukkan adanya perbedaan bermakna pada semua kadar protein, kecuali kadar protein Starch 1500 terhadap manitol.
6
Gambar 6. Grafik perbandingan hasil uji kadar protein enzim bromelin bebas dan granul bromelin
Gambar 7. Grafik perbandingan hasil uji aktivitas protease enzim bromelin bebas dan granul bromelin Selanjutnya dilakukan uji homogenitas, hasil signifikasi menunjukkan aktivitas protease mempunyai varian yang sama (homogen) dengan nilai 0,159 > 0,05. Kemudian dilakukan uji ANOVA yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna dari aktivitas protease antar granul dengan Asymp. sig 0,024 < 0,05. Kemudian dilakukan uji Tukey HSD dan menunjukkan adanya perbedaan pada semua aktivitas, kecuali pada aktivitas Starch 1500 terhadap manitol dan aktivitas Avicel PH 102 terhadap manitol.
D. Hasil Uji Aktivitas Protease Enzim Bromelin Bebas dan Granul Bromelin Berdasarkan data tersebut didapatkan bahwa aktivitas granul bromelin mengalami penurunan hingga setengahnya dari aktivitas protease enzim bromelin bebas. Penurunan nilai aktivitas ini mungkin disebabkan karena adanya penambahan matriks (bahan tambahan) yang menutup sisi aktif dari enzim. Pada pengujian aktivitas protease formula granul bromelin, hasil yang didapatkan sebesar 0,02 U/ml pada masing-masing formula. Hal ini menunjukkan, bahwa aktivitas protease tidak dipengaruhi oleh tingginya kadar protein dalam granul, yang pada saat pengujian didapatkan hasil presentase protein yang berbeda secara signifikan. Pada penelitian ini juga menunjukkan bahwa aktivitas protease terbaik dan kadar protein tertinggi didapat pada formula granul menggunakan pengisi Avicel PH 102. Data pengujian aktivitas protease enzim bromelin bebas dan granul bromelin juga diuji secara statistika menggunakan ANOVA satu arah (One Way ANOVA), diawali dengan uji normalitas. Hasil uji normalitas pada data aktivitas protease didapatkan nilai signifikansi 0,200 < 0,05 yang menunjukkan data tersebut normal.
SIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa Starch 1500, Avicel PH 102, dan manitol dapat menghasilkan granul bromelin dengan sifat fisik yang baik, kecuali waktu alir granul yang melebihi persyaratan yaitu > 10 detik untuk tiap 100 gram granul. Didapatkan juga nilai aktivitas protease sebesar 0,02 U/ml pada tiap formula.
DAFTAR PUSTAKA Ansel HC. 1989. Pengatar Bentuk sediaan Farmasi. Edisi keempat, Terjemahan: Farida Ibrahim. UI Press, Jakarta. Hlm. 204, 212, 269 7
Azzahro I. 2012. Uji Stabilitas Enzim Bromelin dari Kulit Nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) yang Diimobilisasi dengan Pati Jagung (Zea mays). Skripsi. FFS UHAMKA, Jakarta. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microorganisms quantities of protein in utilizing the principle of protein‐dye binding. Anal. Biochem 72:248‐254 Departemen Kesehatan RI. 1979. Farmakope Indonesia. Edisi III. Jakarta: Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Hlm. 807 Herdyastuti N. 2006. Jurnal Isolasi dan Karakterisasi Enzim Bromelin dari Batang Nanas (Ananas comusus L.merr). Universitas Negeri Surabaya. Hlm. 75-77 Lachman L, Lieberman HA, Kanig JL. 1994. Teori dan Praktek Farmasi Industri. Volume 2. Edisi Ketiga, Terjemahan : Suyatmi S. UI Press. Jakarta. Hlm. 680-687, 697, 702 Murachi T. 1970. Bromelain Enzimes, in G.E. Parimann, and L.Lorand (ad). Methods Enzymology. Vol. XIX. Academic Press, New York
Murniati, 2006. Sang Nanas Bersisik Manis di Lidah. SIC. Surabaya. Murray RK, et al. 2000. Harper’s Biochemistry 25th ed. Appleton and Lange, America. Hlm. 96-98 Nascimento WCA, and Martins MLL. 2006. Studies on Stability of Protease from Bacillus sp. And it’s Compatability with Ccomercial Detergent. Brazilia. Microbiol. 37: 307-311. Poejiadi A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. UI Press. Jakarta. Hlm. 158-166. Siregar CJP dan Wikarsa S. 2008. Teknologi farmasi Sediaan Tablet Dasardasar Praktis. Penerbit EGC. Bandung. Hlm. 151-182, 221, 223 Tochi BN, Wang Z, Ying Xu S, dan Zhang, W. 2008. Therapeutic Aplication of Pineaple Protease (Bromelain) : A Review, Pakistan J Nutr, 7 (4) : 513-520 Voigt R. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Edisi V. Terjemahan: S. Noerono. UGM Press. Yogyakarta. Hal 161, 172, 212, 202-210 Wirakusumah ES. 1999.”Buah dan sayur untuk terapi”. Cetakan V. Penebar Semangat, Jakarta. Hlm. 66, 67, 68
8
