GLUTATHION A JEHO ENZYMOVÝ SYSTÉM

metabolismus

GLUTATHION A JEHO ENZYMOVÝ SYSTÉM GLUTATHIONE AND GLUTATHIONE-RELATED ENZYME SYSTEM ERIKA NÝDLOVÁ1,2, MARTINA VRBOVÁ1,2, TOMÁŠ ROUŠAR1 1

Katedra biologických a biochemických věd, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice 2 Katedra analytické chemie, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice

SOUHRN Glutathion je díky vysokým intracelulárním hladinám hlavním nitrobuněčným nebílkovinným antioxidantem, který má mnoho biologických funkcí. Tento tripeptid je nedílnou součástí fyziologické obrany organismu proti oxidačnímu stresu a toxickým látkám a jeho intracelulární přítomnost je zcela nezastupitelná pro zajištění buněčné viability. Glutathion se vyskytuje ve dvou volných formách, redukované (GSH) a oxidované (GSSG), a právě poměr těchto forem je určující pro charakterizaci oxidačního stavu buňky. Ochranu před oxidačním poškozením reaktivními formami kyslíku zajišťuje řada obranných systémů, jedním z nejvýznamnějších je systém glutathionový. Mezi enzymy podílející se na antioxidační funkci glutathionu patří například glutathion-S-transferázy, glutathionperoxidázy a glutathionreduktáza. Klíčová slova: glutathion, metabolismus glutathionu, glutathion-dependentní enzymy, oxidační stres SUMMARY Glutathione is the main non-protein intracellular antioxidant occurring at high levels and acting in a number of biological processes. Glutathione is a crucial member of physiological defense of organism against oxidative stress and toxic compounds. Its intracellular presence is a very important factor of cell viability. Glutathione exists in two free forms, reduced (GSH) and oxidized (GSSG), and the ratio of these forms characterizes oxidation state in the cell. A number of defense systems ensure protection against oxidative damage caused by reactive oxygen species; glutathione system is one of the most important defense systems. Enzymes involved in the glutathione antioxidant function are: glutathione-S-transferases, glutathione peroxidases and glutathione reductase. Key words: glutathione, glutathione metabolism, glutathione-dependent enzymes, oxidative stress

ÚVOD

GLUTATHION

Glutathion je jedním z  nejdůležitějších hydrofilních intracelulárních nebílkovinných antioxidantů. Tento tripeptid se ve vysokých koncentracích vyskytuje v hepatocytech, renálních tubulárních buňkách, erytrocytech či buňkách oční čočky. Glutathion se může vyskytovat volný, nebo vázaný na proteiny či jiné biomolekuly, se kterými vytváří smíšené disulfidy. Díky této schopnosti může zabránit oxidaci proteinů během oxidačního stresu, popřípadě změnit jejich funkci a aktivitu. Volný existuje zejména ve své redukované podobě jako thiol – GSH nebo ve formě oxidované jako disulfid – GSSG. Jediným enzymem, který je schopný zpětně redukovat glutathiondisulfid, je glutathionreduktáza. Antioxidační funkce glutathionu spočívají ve schopnosti přímé reakce s reaktivními formami kyslíku či dusíku. Může být také využíván jako substrát v  reakcích katalyzovaných glutathion-dependentními enzymy. Glutathion je zároveň nezbytný při mnoha biotransformačních reakcích, díky přítomnosti -SH skupiny ve  své struktuře může glutathion reagovat s mnoha elektrofilními sloučeninami, a to buď přímo, nebo za katalýzy glutathion-S-transferáz.

Glutathion (γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycin) je hlavní nebílkovinný thiol účastnící se antioxidační obrany buněk. Chemicky se jedná o tripeptid složený z kyseliny L-glutamové, L-cysteinu a glycinu. Jedná se o jednu z nejrozšířenějších nízkomolekulárních thiolových sloučenin o molekulové hmostnosti 307 g/mol. Vyskytuje se u rostlin, savců, hub a některých prokaryot. Tento tripeptid je produkován ve všech buňkách lidského těla. Nejvíce je produkován v hepatocytech, kde se jeho intracelulární hladina pohybuje okolo 10 mmol/l. Vysoké koncentrace se také nalézají v renálních buňkách, slezině, erytrocytech, leukocytech či buňkách oční čočky. Zatímco se jeho intracelulární koncentrace pohybují v  rozmezí 1–10  mmol/l, extracelulárně dosahuje pouze koncentrací mikromolárních (2–20 μmol/l). Specifickou extracelulární tekutinou je žluč, kde jeho hladiny dosahují i hodnot přesahujících 10 mmol/l (Iwasaki et al., 2009; Meister, 1988; Wu et al., 2004). Eukaryotické buňky mají tři hlavní rezervoáry glutathionu. Téměř 90 % buněčného glutathionu se nachází v  cytosolu, 10 % v  mitochondriích a malé procento v endoplazmatickém retikulu či peroxizomech (Lu, 2009).

202

DMEV • ROČNÍK 17 • 2014 • ČÍSLO 4

metabolismus

a)

b)

Obr. 1: Chemická struktura glutathionu: (a) GSH – redukovaná forma; (b) GSSG – oxidovaná forma

Glutathion se může vyskytovat ve dvou volných formách (obr. 1) – redukovaný jako thiol (GSH) nebo oxidovaný jako disulfid (GSSG). Glutathiondisulfid vzniká spojením dvou molekul GSH pomocí disulfidického můstku. Poměr volných forem glutathionu je velmi důležitým indikátorem oxidačního stresu v  organismu. Tento poměr je v buňkách velmi přísně regulován. Za fyziologických podmínek je v buňkách přítomna až z 99 % jeho redukovaná forma (Lu, 2009). Vysoký poměr GSH/GSSG, který je za fyziologického stavu vyšší než 100 : 1, je primárně udržován dvěma biochemickými procesy. Velmi důležitá je samotná syntéza GSH de novo a vedle toho také redukce GSSG na 2 molekuly GSH pomocí enzymu glutathionreduktázy, která využívá NADPH jako svůj kofaktor. Naopak během  určitých patologických procesů, které mohou v organismu probíhat, je poměr těchto forem snížen na 10 : 1, nebo dokonce 1 : 1 (Iwasaki et al., 2009). Mezi tyto procesy můžeme zařadit zánětlivá onemocnění, maligní nádory, infarkt myokardu, syndrom dechové tísně, Parkinsonovu chorobu či srpkovitou anemii atd. (Pastore et al., 2003; Ritter et al., 1999; Zhao et al., 2009). Syntéza glutathionu Syntéza GSH je součástí -glutamylového cyklu. Ten byl poprvé popsán Altonem a Meisterem v roce 1970 jako cyklus, v němž GSH slouží jako trvalý zdroj cysteinu (Orlowski a Meister, 1970). Glutathion je syntetizován v cytosolu prakticky všech buněk, přičemž hlavním místem jeho biosyntézy v lidském těle jsou játra. Játra však využijí z jeho syntézy jen malé množství. Přes sinusoidální membránu hepatocytu je většina glutathionu sekretována do  krevní plazmy, ze které je vychytáván ostatními orgány. Hlavními konzumenty plazmatického GSH jsou buňky ledvin, plic a střeva (DeLeve a Kaplowitz, 1991; Meister, 1988; Rousar et al., 2005). Vlastní syntéza GSH z  glutamátu, cysteinu a  glycinu sestává ze dvou postupných reakcí, které jsou katalyzovány DMEV • ROČNÍK 17 • 2014 • ČÍSLO 4

γ-glutamylcysteinsyntetázou (GCS) (rovnice 1) a glutathionsyntetázou (GS) (rovnice 2). Energie potřebná pro obě reakce je získána hydrolýzou ATP (Meister, 1988; Wang a Ballatori, 1998). Na  buněčné homeostáze glutathionu se podílí zejména rychlost syntézy GSH, jeho využití a  uvolnění z  buňky. Rychlost biosyntézy v  buňkách a  tkáních celého těla je kontrolována mnoha faktory. Mezi nejdůležitější patří dostupnost substrátů – zejména cysteinu a aktivita GCS, která bývá označována jako enzym limitující rychlost syntézy GSH (Franklin et al., 2009).

L−Glu + L−Cys + ATP

GCS ⎯⎯ ⎯→ γ −L−Glu−L−Cys + ADP + Pi

γ −L−Glu−L−Cys + Gly + ATP

G S GS

⎯⎯→ ⎯ GSH + ADP + Pi

(1) (2)

-glutamylový cyklus -glutamylový cyklus (obr. 2) je cyklus šesti enzymaticky katalyzovaných reakcí, které zodpovídají za  syntézu a  degradaci glutathionu. -glutamylový cyklus také zabezpečuje transport některých aminokyselin přes buněčnou membránu z  extracelulární tekutiny do  buněk (Orlowski a  Meister, 1970; Pastore et al., 2003). Intracelulární GSH je přenesen do  extracelulárního prostoru, kde je na  vnější straně membrány pomocí -glutamyltranspeptidázy jeho -glutamylová složka přenesena na  určitou aminokyselinu, např. na cystin či různé neutrální aminokyseliny. Odtržením -glutamylové skupiny z GSH vzniká cysteinylglycin, který je štěpen dipeptidázami na glycin a cystein. γ-glutamylované aminokyseliny jsou transportovány zpět do  buňky, kde jsou -glutamylcyklotransferázou převedeny na  původní

203

metabolismus

Obr. 2: -glutamylový cyklus: (a) -glutamylcysteinsyntetáza, (b)  glutathionsyntetáza, (c) -glutamyltranspeptidáza, (d)-glutamylcyklotransferáza, (e) oxoprolináza, (f ) dipeptidáza

aminokyseliny a  5-oxoprolin. 5-oxoprolináza katalyzuje konverzi 5-oxoprolinu na  glutamát, který může být využit k syntéze GSH. Reakce katalyzovaná 5-oxoprolinázou je nejpomalejším krokem celého cyklu (Deneke a Fanburg, 1989; Meister, 1988; Pastore et al., 2003).

s  glutathionem buď spontánně, nebo za  katalýzy glutathion-S-transferáz (Forman et al., 2009; Lu, 2009; Meister, 1988; Wang a  Ballatori, 1998). Přehled nejvýznamnějších funkcí glutathionu je uveden v tabulce 1.

ENZYMY Nejdůležitější funkce glutathionu Glutathion vykonává v organismu řadu metabolicky a fyziologicky důležitých funkcí. Jeho funkce jsou úzce spojeny s  jeho jedinečnou strukturou. Jak již bylo řečeno, GSH je důležitý hydrofilní intracelulární antioxidant, který se podílí na ochraně organismu před oxidačním poškozením volnými radikály a reaktivními kyslíkovými sloučeninami. Glutathion také udržuje sulfhydrylové skupiny bílkovin v  redukované podobě, aby byla zachována jejich fyziologická funkce. Prostřednictvím přímé konjugace detoxikuje cizorodé látky, které jsou nakonec vylučovány močí nebo stolicí ve  formě sloučenin kyseliny merkapturové. Mezi cizorodé látky detoxikované pomocí GSH patří například brombenzen, formaldehyd nebo acetaminofen. Mezi endogenní substráty lze zahrnout estrogen, melanin, prostaglandiny nebo leukotrieny. Všechny tyto sloučeniny jsou elektrofilní a  tvoří konjugáty Tab. 1: Přehled funkcí glutathionu Přímá reakce s reaktivními formami kyslíku Regenerace vitaminu A a C Zásobárna a transportní forma cysteinu Udržování -SH skupin proteinů v redukované formě Detoxikace xenobiotik anebo jejich metabolitů Účast na metabolismu prostaglandinů a leukotrienů Regulace buněčného cyklu Modulace buněčných procesů (syntéza DNA, syntéza proteinů) Aktivace T-lymfocytů a polymorfonukleárních leukocytů

204

GLUTATHIONOVÉHO METABOLISMU

Na  metabolismu glutathionu se podílí řada enzymů (obr. 3). Lze je rozdělit na enzymy, které hladinu GSH zvyšují, nebo naopak snižují. Mezi enzymy zvyšující hladinu GSH patří -glutamylcysteinsyntetáza, glutathionsyntetáza a glutathionreduktáza. Enzymy, které hladinu glutathionu snižují, jsou glutathionperoxidázy, glutathion-S-transferázy a -glutamyltranspeptidáza. -glutamylcysteinsyntetáza -glutamylcysteinsyntetáza je prvním enzymem biosyntézy glutathionu vyžadujícím pro svou správnou funkci přítomnost Mg2+ nebo Mn2+ iontů (Meister, 1988). Jedná se o  heterodimerickou sloučeninu skládající se ze dvou podjednotek, které jsou spojeny disulfidickým můstkem. Katalytická podjednotka, nazývaná také jako těžká podjednotka, se označuje GCSc (Mr = 73 kDa). GCSc obsahuje aktivní místo odpovědné za ATP-dependentní tvorbu vazby mezi aminoskupinou cysteinu a  -karboxylovou skupinou kyseliny glutamové (Franklin et al., 2009). Druhá podjednotka nazývaná jako regulační či lehká podjednotka GCSm (Mr = 31 kDa) snižuje afinitu vlastního enzymu ke kyselině glutamové a GSH, čímž snižuje citlivost těžké podjednotky ke zpětnovazebné inhibici GSH (Anderson, 1998; Noctor et al., 2002; Seelig a Meister, 1984). Na zvyšování transkripce či aktivity GCS se mohou podílet zánětlivé cytokiny, oxidační stres, nádorová onemocnění, inzulin nebo nedostatek GSH. Naopak nedostatek proteinů z potravy či hyperglykemie mohou aktivitu snižovat. GCS je DMEV • ROČNÍK 17 • 2014 • ČÍSLO 4

metabolismus

Obr. 3: Glutathionový metabolismus: (Cys – cystein, Glu – glutamát, Gly – glycin, Glu-Cys – -glutamylcystein, Cys-Gly – cysteinylglycin, GCS – -glutamylcysteinsyntetáza, GS – glutathionsyntetáza, GGT – -glutamyltranspeptidáza, GPx – glutathionperoxidáza, GST – glutathion-S-transferáza, GR – glutathionreduktáza, GRx – glutaredoxin, KAT – kataláza, PSSG – glutathionylovaný protein, PSH – redukovaný protein, ROOH – organický hydroperoxid, ROH – alkylalkohol, X – xenobiotikum, MRP – Multidrug Resistance Protein)

fyziologicky regulována zpětnovazebnou kompetitivní inhibicí GSH, která je způsobená jeho vazbou na  glutamátové místo enzymu. Aktivitu tohoto enzymu také velmi výrazně ovlivňuje dostupnost cysteinu (Wu et al., 2004). Glutathionsyntetáza Glutathionsyntetáza je druhým enzymem syntézy glutathionu. Jedná se o homodimerický enzym, který je složen ze dvou identických podjednotek. Molekulová hmotnost tohoto enzymu je 108 kDa. Tento enzym a stejně tak jeho přesné regulační mechanismy však nejsou dosud plně prostudované. Je známo, že aktivita tohoto enzymu není regulována vznikajícím glutathionem, a  proto k  hlavní regulaci syntézy GSH dochází při vzniku -glutamylcysteinu. Nicméně její nedostatek se může projevit nižší hladinou GSH, která může u lidí vést k vážným metabolickým důsledkům. Nahromaděný -glutamylcystein může být přeměňován na 5-oxoprolin způsobující vážnou metabolickou acidózu, hemolytické anemie nebo jeho zvýšená hladina může vést k poškození centrálního nervového systému (Lu, 1999). Glutathionperoxidázy Glutathionperoxidázy (GPx) patří do  skupiny oxidoreduktáz (Wilde et al., 2014). Patří také mezi selenoproteiny, což jsou biomolekuly obsahující selen například ve  formě selenocysteinu. Selen je velmi důležitý pro jejich katalytickou aktivitu. Dosud bylo u  savců identifikováno celkem 8 odlišných izoenzymů (GPx1-8), které se liší jak tkáňovou DMEV • ROČNÍK 17 • 2014 • ČÍSLO 4

specifitou, tak také lokalizací exprese, stupněm polymerace, funkcí nebo strukturou. První čtyři izoenzymy jsou Se-dependentní enzymy, na  rozdíl od  izoenzymu 5, který atom selenu ve své struktuře neobsahuje. Molekulová hmotnost jedné podjednotky GPx je přibližně 20 kDa, přičemž se jako monomer v buňce vyskytuje pouze izoenzym GPx5. Izoenzymy GPx1-3 se vyskytují ve formě tetramerů (Brigelius-Flohe a Maiorino, 2013). Glutathionperoxidázy primárně katalyzují reakci mezi GSH a H2O2 (Mills, 1957). Navíc ale také zajišťují redukci lipidových peroxidů, alkoxylových radikálů nebo hydroperoxidů  cholesterolu. Glutathionperoxidázová aktivita se vyskytuje v cytoplazmě (70 %), část se nachází v mitochondriích (20 %) a v jádře (10 %). Nejvyšší aktivita GPx byla nalezena v játrech, krvi a plicích, nejnižší pak v mozku a oční čočce (Lu, 1999; Townsend et al., 2003; Wilde et al., 2014). Glutathionperoxidázy chrání buněčné membrány před účinky oxidačního stresu a zajišťují tím fyziologický průběh buněčného metabolismu. Při nedostatku selenu v organismu může dojít k poklesu aktivity GPx a tím k poškození buněčných membrán, které nejsou chráněny před lipoperoxidací. Na  ochraně organismu proti oxidačnímu poškození se kromě Se-dependentních glutathionperoxidáz podílejí také jiné enzymy. Jedná se o  enzymy glutathion-S-transferázy, které katalyzují detoxikaci řady xenobiotik. Glutathionperoxidázová aktivita těchto enzymů se kvůli odlišení od  GPx označuje jako Se-independentní (Brigelius-Flohe a  Maiorino, 2013; Deponte, 2013).

205

metabolismus Glutathion-S-transferázy Cytosolové glutathion-S-transferázy (GST) představují superrodinu proteinů, které mohou být děleny do několika tříd s vysoce specifickými a zároveň překrývajícími se funkcemi. Tyto enzymy katalyzují nukleofilní reakci glutathionu s nepolárními sloučeninami, které ve své struktuře obsahují atom síry nebo elektrofilní uhlík či dusík. Přispívají tak k metabolismu endogenních látek, ale i léčiv, insekticidů, pesticidů, chemoterapeutik a mnoha dalších xenobiotik (Hayes et al., 2005; Townsend et al., 2003; Yin et al., 2013). Je tedy zřejmé, že glutathion-S-transferázová aktivita je v biologických systémech velmi důležitá. Existují čtyři strukturně odlišné rodiny enzymů, a  to cytosolové GST, mitochondriální GST třídy kappa, MAPEG enzymy a fosfomycin-rezistentní proteiny. Všechny glutathion-S-transferázy jsou intracelulární enzymy tvořené dvěma podjednotkami, které jsou buď homodimerické, nebo heterodimerické (Board a Menon, 2013; Hayes et al., 2005). Cytosolová glutathion-S-transferázová superrodina se vyskytuje ve  všech buněčných formách života a  zároveň představuje největší rodinu transferáz. Savčí cytosolové GST jsou dimery, které obsahují ve své struktuře podjednotky o  velikosti 22–29 kDa. Dosud bylo identifikováno sedm savčích tříd cytosolových enzymů – alfa, mí, pí, sigma, théta, zeta a  omega. Tato rodina se stala pro  biomedicínský výzkum velmi důležitá, protože právě tyto enzymy hrají nezbytnou roli v metabolismu mnoha xenobiotik a léčiv (Board a Menon, 2013). Kappa třída glutathion-S-transferáz jsou rozpustné enzymy s některými substrátovými specifiky, které jsou podobné cytosolové rodině. Enzymy třídy kappa jsou ale exprimovány pouze v mitochondriích a peroxizomech. Přítomnost kappa glutathion-S-transferáz v těchto dvou organelách naznačuje, že se mohou podílet na β-oxidaci mastných kyselin. Jejich výskyt v cytoplazmě nebyl dosud prokázán (Board a Menon, 2013; Hayes et al., 2005). MAPEG proteiny (Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism) jsou třetí rodinou s glutathion-S-transferázovou aktivitou. Evoluční původ se  zdá být zcela odlišný od původu cytosolových GST. Tyto GST jsou membránově vázané. Nejhojněji se vyskytují v játrech, bylo však prokázáno, že jsou také exprimovány v plicích, střevech, varlatech nebo nadledvinách. Popsány byly celkem čtyři MAPEG podskupiny (I–IV), které se podílejí na metabolismu eikosanoidů, a vyznačují se prozánětlivou a detoxikační aktivitou (Hayes et al., 2005; Sheehan et al., 2001). Nejmladší skupinou enzymů řazených mezi GST jsou prokaryotické fosfomycin-rezistentní proteiny. Ty představují další rodinu rozpustných proteinů, které katalyzují glutathion-S-transferázové reakce. Fosfomycin je širokospektré antibiotikum, které je produkováno určitými druhy bakterií rodu Streptomyces. Jsou známy tři podobné, ale mechanicky odlišné fosfomycin-rezistentní proteiny, které katalyzují otevření oxiranového kruhu antibiotika. Jedná se o proteiny A, B a X (Board a Menon, 2013). -glutamyltranspeptidáza -glutamyltranspeptidáza je enzym, který se vyskytuje na  membránách většiny buněk, a  to na  jejich extracelulární straně. Mezi tkáně s  největší aktivitou tohoto enzymu

206

patří ty, které se podílejí na  vstřebávání látek nebo na  jejich vylučování, tj. játra, ledviny, tenké střevo apod. Její nejvyšší aktivita se nachází na  cholangiocytech. Přítomnost γ-glutamyltranspeptidázy byla prokázána také v  různých tělních tekutinách, jako jsou sliny, sérum, žluč nebo moč. U mužů se vyskytuje také v prostatě nebo seminálních váčcích (Sener a Yardimci, 2005). Molekulová hmotnost tohoto enzymu je kolem 68 kDa. Tento enzym se podílí například na ochraně buněčných membrán před oxidačním poškozením, na  metabolismu mediátorů zánětu, karcinogenů nebo xenobiotik. Nejvýznamnější funkce -glutamyltranspeptidázy je transport glutamylové skupiny z  -glutamylovaných peptidů na  jiné peptidy, aminokyseliny nebo kyseliny. Mezi sloučeniny, kterým může být tato skupina odebrána, patří například glutathion nebo jeho konjugáty (Del Corso et al., 2006; Noctor et al., 2002; Sener a Yardimci, 2005; Szmigielski et al., 1965). Glutathionreduktáza Zásadním krokem v objevení glutathionreduktázy byl rok 1935, ve kterém Meldrum a Tarr zjistili, že GSSG byl redukován krví potkana, a demonstrovali funkci kofaktoru TPNH (redukovaný trifosfopyridinnukleotid), což byl původní název pro NADPH (Meldrum a  Tarr, 1935). Glutathionreduktáza (GR) však byla identifikována až v roce 1951 v pšeničných klíčcích a semenech hrachu a charakterizována jako enzym, jehož primární funkcí je redukce GSSG na GSH (Mapson a Isherwood, 1963). Později byla GR nalezena ve většině aerobních forem života, od bakterií až po savčí buňky (Carlberg a Mannervik, 1975; Ulusu et al., 2005; Ulusu a Tandogan, 2007). Krystalová struktura GR byla poprvé popsána Schulzem et al. (1978), kteří ke svému pokusu použili GR z lidských erytrocytů (Schulz et al., 1978). Přesná aminokyselinová sekvence byla zjištěna až o 3 roky později a bylo popsáno celkem pět domén – domény vázající FAD a NADPH, centrální a vazebná doména a N-terminální doména (Thieme et al., 1981). Glutathionreduktáza je členem skupiny dimerických flavoenzymů, které katalyzují přenos elektronů mezi pyridinnukleotidy a  disulfidovými/dithiolovými sloučeninami. Do této skupiny patří rovněž lipoamiddehydrogenáza, merkuroreduktáza a  thioredoxinreduktáza. Všechny tyto enzymy jsou z 20–30 % sekvenčně totožné, mají stejnou terciální a kvartérní strukturu či katalytický mechanismus a obsahují flavinadenindinukleotid (FAD) ve  své struktuře. Výjimku z této skupiny tvoří thioredoxinreduktáza, která má odlišnou kvartérní strukturu (Williams et al., 2000). Glutathionreduktáza je lokalizována především v  cytosolu, v  matrix mitochondrií a  v  chloroplastech (Tandogan a Ulusu, 2007). Jedná se o homodimerický protein, jenž se skládá ze dvou identických podjednotek, které jsou navzájem spojené disulfidickou vazbou. Každá podjednotka má molekulovou hmotnost okolo 55 kDa (Carlberg a  Mannervik, 1975; Deponte, 2013; Tandogan a Ulusu, 2006). Glutathionreduktáza se podílí na metabolismu glutathionu tím, že katalyzuje NADPH-dependentní redukci jeho oxidované formy na formu redukovanou (obr. 4). Glutathionreduktáza je tedy nezbytná pro redox cyklus glutathionu, který udržuje vysoký poměr GSH/GSSG. NADPH, který glutathionreduktáza využívá jako kofaktor, je generován převážně v pentózovém cyklu (Ho et al., 2007). DMEV • ROČNÍK 17 • 2014 • ČÍSLO 4

metabolismus

Obr. 4: Princip redukce glutathiondisulfidu (GR – glutathionreduktáza)

ZÁVĚR Nejdůležitějším intracelulárním nebílkovinným thiolem v lidském těle je glutathion. Glutathion se vyskytuje ve dvou volných formách – redukované (GSH) a  oxidované (GSSG). V  buňce je poměr koncentrací redukované a  oxidované formy za  fyziologických podmínek 100 : 1. Při oxidačním stresu dochází k  poklesu koncentrace redukované formy glutathionu a naopak ke zvýšení hladiny formy oxidované. Jediný enzym, který katalyzuje zpětnou redukci GSSG, je glutathionreduktáza. Glutathion je v  buňce syntetizován postupně reakcí L-cysteinu s  L-glutamátem a  následně s  glycinem. Do  této syntézy jsou zapojeny enzymy -glutamylcysteinsyntetáza a glutathionsyntetáza. Glutathion v organismu vykonává řadu biologických procesů. Jeho významná role spočívá v detoxikačních reakcích, při ochraně buněk před škodlivými účinky xenobiotik nebo extracelulárně či intracelulárně produkovaných ROS. Zapojen je také do  redukčních a  konjugačních reakcí a  přispívá k odstraňování peroxidů a xenobiotik pomocí katalytického působení glutathion-S-transferáz a  glutathionperoxidáz. Glutathion je tedy pro náš organismus nepostradatelnou látkou, která má řadu nenahraditelných funkcí. Seznam použitých zkratek: Cys – cystein; FAD – flavinadenindinukleotid; Glu – glutamát; Gly – glycin; -Glu-Cys – -glutamylcystein; Cys-Gly – cysteinylglycin; GCS – -glutamylcysteinsyntetáza; GGT – -glutamyltranspeptidáza; GPx – glutathionperoxidáza; GR – glutathionreduktáza; GS – glutathionsyntetáza; GSH – glutathion; GSSG – glutathiondisulfid; GST – glutathion-S-transferáza; H2O2 – peroxid vodíku; KAT – kataláza; MAPEG – Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism; MRP – Multidrug Resistance-associated Protein; NADP+ – nikotinamidadenindinukleotidfosfát; NADPH – redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát; Se – selen; -SH – sulfhydrylová skupina

DMEV • ROČNÍK 17 • 2014 • ČÍSLO 4

LITERATURA 1. Anderson ME. Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chem-Biol Interact 1998;112:1–14. 2. Board PG, Menon D. Glutathione transferases, regulators of cellular metabolism and physiology. Biochim Biophys Acta 2013; 830:3267–3288. 3. Brigelius-Flohe R, Maiorino M. Glutathione peroxidases. Biochim Biophys Acta 2013;1830:3289–3303. 4. Carlberg I, Mannervik B. Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver. J Biol Chem 1975;250:5475–5480. 5. Del Corso A, Cappiello M, Buono F, Moschini R, Paolicchi A, Mura U. Colorimetric coupled enzyme assay for gamma-glutamyltransferase activity using glutathione as substrate. J Biochem Bioph Meth 2006;67:123–130. 6. DeLeve LD, Kaplowitz N. Glutathione metabolism and its role in hepatotoxicity. Pharmacol Ther 1991; 52:287–305. 7. Deneke SM, Fanburg BL. Regulation of cellular glutathione. Am J Physiol 1989;257:L163–173. 8. Deponte M. Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes. Bba-Gen Subjects 2013;1830:3217–3266. 9. Forman HJ, Zhang H, Rinna A. Glutathione: overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis. Mol Aspects Med 2009;30:1–12. 10. Franklin CC, Backos DS, Mohar I, White CC, Forman HJ, Kavanagh TJ. Structure, function, and post-translational regulation of the catalytic and modifier subunits of glutamate cysteine ligase. Mol Aspects Med 2009;30:86–98. 11. Hayes JD, Flanagan JU, Jowsey IR. Glutathione transferases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2005;45:51–88. 12. Ho HY, Cheng ML, Chiu DTY. Glucose-6-phosphate dehydrogenase – from oxidative stress to cellular functions and degenerative diseases. Redox Rep 2007;12:109–118. 13. Iwasaki Y, Saito Y, Nakano Y, Mochizuki K, Sakata O, Ito R, Saito K, Nakazawa H. Chromatographic and mass spectrometric analysis of glutathione in biological samples. J Chromatogr B 2009;877:3309–3317. 14. Lu SC. Regulation of hepatic glutathione synthesis: current concepts and controversies. Faseb J 1999;13:1169–1183.

207

metabolismus 15. Lu SC. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine 2009;30:42–59. 16. Mapson LW, Isherwood FA. Glutathione Reductase from Germinated Peas. Biochem J 1963;86:173–191. 17. Meister A. Glutathione Metabolism and Its Selective Modification. Journal of Biological Chemistry 1988;263:17205–17208. 18. Meldrum NU, Tarr HLA. The reduction of glutathione by the Warburg-Christian system. Biochem J 1935;29:108–115. 19. Mills GC. Hemoglobin catabolism. I. Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzyme which protects hemoglobin from oxidative breakdown. J Biol Chem 1957;229:189–197. 20. Noctor G, Gomez L, Vanacker H, Foyer CH. Interactions between biosynthesis, compartmentation and transport in the control of glutathione homeostasis and signalling. J Exp Bot 2002;53:1283–1304. 21. Orlowski M, Meister A. The gamma-glutamyl cycle: a possible transport system for amino acids. Proc Natl Acad Sci USA 1970;67:1248–1255. 22. Pastore A, Federici G, Bertini E, Piemonte F. Analysis of glutathione: implication in redox and detoxification. Clin Chim Acta 2003;333:19–39. 23. Ritter D, Knebel JW, Aufderheide M, Mohr U. Development of a cell culture model system for routine testing of substances inducing oxidative stress. Toxicol In Vitro 1999;13:745–751. 24. Rousar T, Cervinkova Z, Muzakova V, Kucera O, Lotkova H, Krivakova P.  Glutathione and glutathione assays. Acta Medica (Hradec Kralove) Suppl. 2005;48:15–20. 25. Seelig GF, Meister A. Gamma-glutamylcysteine synthetase. Interactions of an essential sulfhydryl group. J Biol Chem 1984;259:3534–3538. 26. Sener A, Yardimci T. Activity determination, kinetic analyses and isoenzyme identification of gamma glutamyltransferase in human neutrophils. J Biochem Mol Biol 2005;38:343–349. 27. Sheehan D, Meade G, Foley VM, Dowd CA. Structure, function and evolution of glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily. Biochem J 2001;360:1–16. 28. Schulz GE, Schirmer RH, Sachsenheimer W, Pai EF. The structure of the flavoenzyme glutathione reductase. Nature 1978;273:120–124. 29. Szmigielski S, Litwin J, Zupanska B. Histochemical Demonstration of Gamma Glutamyl Transpeptidase Activity in Bone Marrow and Blood Cells. J Clin Pathol 1965;18:244–246. 30. Tandogan B, Ulusu NN. Kinetic Mechanism and Molecular Properties of Glutathione Reductase. Fabad journal of pharmaceutical sciences 2006;31:230–237.

208

31. Tandogan B, Ulusu NN. The inhibition kinetics of yeast glutathione reductase by some metal ions. J Enzyme Inhib Med Chem 2007;22:489–495. 32. Thieme R, Pai EF, Schirmer RH, Schulz GE. Three-dimensional structure of glutathione reductase at 2 A resolution. J Mol Biol 1981;152:763–782. 33. Townsend DM, Tew KD, Tapiero H. The importance of glutathione in human disease. Biomed Pharmacother 2003;57:145–155. 34. Ulusu G, Erat M, Ciftci M, Sakiroglu H, Bakan E. Purification and characterization of glutathione reductase from sheep liver. Turk J Vet Anim Sci 2005;29:1109–1117. 35. Ulusu NN, Tandogan B. Purification and kinetic properties of glutathione reductase from bovine liver. Mol Cell Biochem 2007;303:45–51. 36. Wang W, Ballatori N. Endogenous glutathione conjugates: Occurrence and biological functions. Pharmacol Rev 1998;50:335–355. 37. Wilde F, Lemmerhirt H, Emmrich T, Bednarski PJ, Link A. Microwave-assisted synthesis and evaluation of acylhydrazones as potential inhibitors of bovine glutathione peroxidase. Mol Divers 2014;18:307–322. 38. Williams CH, Arscott LD, Muller S, Lennon BW, Ludwig ML, Wang PF, Veine DM, Becker K, Schirmer RH. Thioredoxin reductase – Two modes of catalysis have evolved. Eur J Biochem 2000;267:6110–6117. 39. Wu GY, Fang YZ, Yang S, Lupton JR, Turner ND. Glutathione metabolism and its implications for health. Journal of Nutrition 2004;134:489–492. 40. Yin L, Song J, Board PG, Yu Y, Han X, Wei JY. Characterization of selenium-containing glutathione transferase zeta1-1 with high GPX activity prepared in eukaryotic cells. J Mol Recognit 2013;26:38–45. 41. Zhao Y, Seefeldt T, Chen W, Wang XQ, Matthees D, Hu YS, Guan XM. Effects of glutathione reductase inhibition on cellular thiol redox state and related systems. Arch Biochem Biophys 2009;485:56–62.

Mgr. Erika Nýdlová Fakulta chemicko-technologická Univerzita Pardubice Studentská 95 532 10 Pardubice e-mail: [email protected]

DMEV • ROČNÍK 17 • 2014 • ČÍSLO 4