GLUKOKORTIKOIDOK AKUT, NEM GENOMIKUS HATÁSAI A BRONCHIÁLIS KERINGÉS VASZKULÁRIS SIMAIZOMSEJTJEIRE
Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Dr. Horváth Gábor Semmelweis Egyetem Budapest Általános Orvostudományi Kar Pulmonológiai Klinika
Témavezető: Dr. Vastag Endre, egyetemi tanár
Budapest, 2004
1. ÖSSZEFOGLALÓ A bronchiális keringés idegi szabályozásáért döntő mértékben szimpatikus idegi mechanizmusok felelősek. A légúti szimpatikus idegekből felszabaduló noradrenalin (NE) a posztszinaptikus α-adrenoreceptorokat aktiválva eredményez bronchiális vazokonstrikciót. Ezen transzmitter szignál szabályozásában a posztszinaptikus sejtek glukokortikoid (GS)-szenzitív, extraneuronális katekolamin felvétele kitüntetett jelentőséggel rendelkezik. Az extraneuronális katekolamin felvétel GS-okkal történő akut gátlása növelheti az NE koncentrációt az extracelluláris térben, és ezért felelős lehet az inhalációs szteroidok alkalmazásával kapcsolatosan az elmúlt években leírt akut bronchiális vazokonstriktoros hatásért. Ezért kísérleteinkben az extraneuronális NE felvételt vizsgáltuk sejt és molekuláris biológiai technikák felhasználásával. Kísérleteinkben kimutattuk, hogy a vaszkuláris simaizomsejtek NE felvételét egy specializált sejtmembrán transzport mechanizmus végzi, amelyért funkcionális és génexpressziós vizsgálataink eredményei alapján - az extraneuronális monoamin transzporter (EMT) a felelős. Vizsgálataink megerősítették, hogy a GS-ok akutan, nem genomikus módon gátolják az EMT-t. Állatkísérleteinkben kimutattuk, hogy a vaszkuláris simaizomsejtek NE felvétele és NE transzporter mRNS expressziója lecsökken szisztémás ovalbumin (OVA) szenzitizáció során (atópia modell). Ez a hatás felelős lehet az atópiás-asztmás betegeknél inhalációs GS és α-adrenerg agonista alkalmazása során jelentkező, megnövekedett bronchiális vazokonstriktoros válaszkészségért. További kísérleteink igazolták az EMT mRNS expresszióját és funkcióját frissen izolált humán bronchiális artéria simaizomsejtekben is. A humán sejteknél megállapítottuk, hogy a GS-ok nem genomikus módon, feltehetőleg specifikus sejtmembrán K+-csatornák aktiválásán keresztül gátolják az EMT-t. Végül kimutattuk, hogy a terápiás jelentőségű GS-ok (metilprednizolon, budezonid) szintén akutan gátolják az NE felvételt. Ez az akut farmakológiai hatás növelheti az extracelluláris tér NE koncentrációját, amely vazokonstrikcióra és a véráramlás csökkenésére vezet a bronchiális keringésben. Kísérleteink rámutattak az inhalációs szteroidok egy új, nem genomikus támadáspontjára, bár az NE felvétel akut gátlása és a bronchiális vazokonstrikció közötti öszefüggés még nem bizonyított egyértelműen. Az inhalációs szteroidok akut légúti hatásai biológiai és klinikai jelentőséggel bírnak, és kísérleteink a lehetséges celluláris mechanizmusok megismeréséhez járulnak hozzá.
2. BEVEZETÉS A légutak vérellátását döntő mértékben a bronchiális keringés biztosítja. A bronchiális keringés jelentőséggel bír a légzőtraktuson keresztül történő hő- és vízvesztésben, a lokálisan képződő és felszabaduló biológiailag aktív anyagok transzportjában, a gyulladásos sejtek légúti betegségekben (pl. asztma és krónikus bronchitisz) bekövetkező légúti akkumulációjában és feltehetőleg hozzájárul a légúti átmérő szabályozásához is. Mindezek mellett a bronchiális keringés végzi az inhalációs gyógyszerek légutakból, illetve a szisztémás alkalmazott készítmények légutakhoz történő transzportját is. A bronchiális keringés a szisztémás keringés része és szimpatikus mechanizmusok biztosítják a véráramlás idegi szabályozását. A bronchiális ereket ellátó szimpatikus idegekből NE szabadul fel, amely a légúti vaszkuláris simaizomsejtek α1-adrenoreceptorait aktiválva vált ki vazokonstrikciót. Mindezeket az elmúlt évek klinikai vizsgálatai is megerősítették, amelyek arra is rámutattak, hogy az inhalációs GS-ok akut (már 20 percen belül is jelentkező) bronchiális vazokonstrikciót okoznak. A GS-indukálta vazokonstrikció gyors fellépése és α1-antagonistával előidézhető gátlása nem magyarázható a szteroidok klasszikusan ismert, génexpressziót befolyásoló (genomikus) hatásmechanizmusával, és egy új, nem genomikus szteroid mechanizmus szabályozó szerepére utal. A GS-indukálta bronchiális vazokonstrikció feltételezhető mechanizmusának megismerése érdekében, sejt és molekuláris biológiai technikákkal végzett kísérleteinkben a vaszkuláris simaizomsejtek NE felvételét és NE transzporter expresszióját, valamint az NE felvétel GS-okkal kiváltható akut gátlását vizsgáltuk. Az NE celluláris felvételének neuronális (“reuptake” vagy “uptake1”) és nem neuronális (extraneuronális vagy “uptake2”) mechanizmusai döntő jelentőséggel bírnak az NE kezdeti, funkcionális inaktiválásában mivel az NE-t metabolizálni képes enzimek kizárólag intracellulárisan helyezkednek el. Korábbi megfigyelések szerint a GS-ok gátolják az extraneuronális NE felvételt, amely a szimpatikus idegekből felszabaduló NE eltávolításának legfőbb mechanizmusa a légutakban. Az NE felvétel gátlása elnyújthatja a helyileg felszabaduló NE (és esetleg más transzportálható katekolamin) jelenlétét az extracelluláris térben és a posztszinaptikus α1-adrenoreceptorok fokozott aktiválásához vezet. Ez a GS hatás felerősítheti az NE-indukálta vaszkuláris simazizom-kontrakciót és a véráramlás gyors csökkenését eredményezheti a bronchiális keringésben. 3
3. CÉLKITŰZÉSEK Kísérleteinkben a vaszkuláris simaizomsejtek NE felvételét és ennek atópiás állapotban bekövetkező változását vizsgáltuk. Hipotézisünk a következő volt: (a) a vaszkuláris simaizomsejtek NE felvételéért egy specializált membrán transzporter (EMT) felelős és (b) atópiában az EMT funkciója korlátozódik, amely az α1adrenoreceptorok által közvetített vazokonstriktoros válasz felerősödését eredményezi. Célkitűzéseink a következők voltak: 1.
A vaszkuláris simaizmok EMT mRNS expressziójának, NE felvételének és az NE felvétel GS-szenzitivitásának vizsgálata nyúl aortából frissen izolált simaizomsejteken.
2.
Az asztmásoknál leírt kettős, mind GS, mind α1-agonista inhalációjára jelentkező, emelkedett bronchiális vazokonstriktoros válaszkészséget az EMT korlátozott funkciója okozhatja, mivel egyrészt az EMT mediálhatja a GS-ok hatását, másrészt az EMT lehet felelős az adrenerg agonisták funkcionális inaktiválásáért is. Ezért azt vizsgáltuk, hogy nyulak szisztémás OVA szenzitizációja befolyásolja-e a vaszkuláris simaizomsejtek NE felvételét és EMT mRNS expresszióját. (Asztmás egyénekből származó bronchiális artériák nem álltak rendelkezésre hipotézisünk direkt módon történő vizsgálatához.)
3.
A humán bronchiális artéria simaizomsejtek NE felvételének megismeréséhez az NE felvétel farmakológiai karakterisztikáját, az NE transzporterek mRNS expresszióját, a klinikai jelentőségű GS-ok NE felvételre gyakorolt gátló hatását, valamint a GS-ok nem genomikus hatásának mechanizmusát vizsgáltuk.
Kísérleteinkben a bronchiális véráramlás szabályozásában döntő szerepet játszó noradrenerg szignálmechanizmus és a GS-ok eddigiekben le nem írt kölcsönhatását vizsgáltuk. Feltételezhető, hogy ez a transzmitter-hormon interakció jelentőséggel bírhat a szisztémás keringési rendszer egyéb régióiban is.
4
4. MÓDSZEREK 4.1. Nyúl szenzitizáció (atópia modell) Kísérleteinkhez nőstény New Zealand albínó nyulakat (3-4 kg testsúlyú) használtunk fel a University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee által jóváhagyott protokoll szerint. A nyulak szisztémás szenzitizációját 8 hét alatt, OVA ismételt szubkutan injekcióival végeztünk. A kontrollok fiziológiás sóoldatot kaptak OVA helyett. 4.2. Humán bronchiális artériák Kísérleteinkhez a University of Miami Life Alliance Organ Recovery Agencynél transzplantációra előkészített, de végül át nem ültetett donor tüdőket használtunk az Institutional Review Board jóváhagyásával. A bronchiális artériákat sztereomikroszkóp alatt boncoltuk ki. A szövetminta egy darabját 4%-os formaldehidben fixáltuk és hematoxin-eosinnel megfestettük annak érdekében, hogy a minta artéria jellegét igazoljuk. Az artéria további részét a kötőszövettől megtisztítottuk, majd sejtizolálásra és RNS kivonásra használtuk fel. 4.3. A vaszkuláris simaizomsejtek izolációja A simaizomsejtek izolálásáhaz a nyúl aorta és humán bronchiális artéria izomcsíkokat folyamatosan oxigenizált, 1.5 mg/ml papaint és 2 mM DTT-t tartalmazó inkubációs oldatba helyeztük és 37°C-on 30 percig rázogattuk. Ezt követően az izomcsíkokat 1.5 mg/ml F típusú kollagenázt és 1 mg/ml I-S típusú hialuronidázt tartalmazó inkubációs oldattal kezeltük 37°C-on 30 percig. 4.4. Nyúl EMT mRNS azonosítása homológia alapú RT-PCR alkalmazásával A primerek tervezését a humán (GenBank-I azonosító szám: AJ001417), az egér (GenBank-I azonosító szám: AF078750) és a patkány (GenBank-I azonosító szám: AF055286) EMT cDNS-ek összehasonlításával azonosított, nagyfokú hasonlóságot mutató szekvenciák alapján végeztük. A PCR amplifikációt (35 ciklus) a következő primerekkel végztük: 5’-ctg ggt ggt ccc tga gtc tcc-3’ (forward) and 5’-tcc cag gcg cat gac aag tcc-3’ (reverse). Az RT-PCR termék elektroforézist és gélextrakciót követő szekvencia meghatározását a University of Miami DNA Core Laboratory végezte.
5
4.5. EMT mRNS mérése duplex RT-PCR alkalmazásával Duplex RT-PCT-t alkalmaztunk az EMT cDNS és gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) cDNS együttes amplifikációjához, mely utóbbit mint a minták belső standardját alkalmaztuk. A duplex RT-PCR amplifikációt (18-28 ciklus) a következő primerekkel végeztük: 5’-ctg ggt ggt ccc tga gtc tcc-3’ (EMT, forward), 5’-tcc cag gcg cat gac aag tcc-3’ (EMT, reverse), 5’-taa tac gac tca cta tag gac ttc aac agt gcc acc cac-3’ (GAPDH, forward), and 5’-att tag gtg aca cta tag att cat gac aag gta ggg ctc c-3’ (GAPDH, reverse). Az RT-PCR termék mennyiségét elektroforézist és SYBR Gold nukleinsav gélfestékkel történt festést követően AlphaImager 3300 alkalmazásával határoztuk meg. A PCR lineáris tartományát (az amplifikáció exponenciális fázisát) a ciklusszám és a szignálintenzitás logaritmusának ábrázolásával határoztuk meg. A lineáris amplifikációs tartományban végeztük el az EMT normalizálását a GAPDH szignállal. 4.6. NE felvétel mérése sejtszintű, fluoreszcensz technikával A NE felvétel méréséhez az intracelluláris NE-t szukróz-kálium foszfátglioxánsav (SPG) technika segítségével tettük láthatóvá. Ezt az eredetileg szövettani metszetekre kifejlesztett módszert mi adaptáltuk izolált simaizomsejteken történő alkalmazásra. Röviden, a simaizomsejteket tartalmazó metszeteket SPG oldattal (0.2 M szukróz, 236 mM KH2PO4, 1% glioxánsav, 7.4-es pH) kezeltük. A specifikus fluoreszcencia méréséhez Nikon Eclipse E600FN mikroszkópot, Lambda DG-4 fényforrást, hűtött CCD digitalizáló kamerát és “Isee” képanalizáló programot használtunk. A sejteket differenciál-interferenciakontraszt mikroszkópiával azonosítottuk. Az SPG fluoreszcencia (intracelluláris NE koncentráció) méréséhez a sejtek specifikus emisszióját mértük. A sejteket minden metszet esetében 5, egymástól jól elkülönülő régióból választottuk ki. A sejtek fluoreszcencia értékét az azonos izommintából származó, de NE-vel nem kezelt, kontroll sejtek háttér-fluoreszcenciájával korrigáltuk. A sejtek normalizált fluoreszcenciája alapján számoltuk ki a sejtek NE felvételét. Mivel korábbi kísérleteink azt igazolták, hogy a specifikus SPG fluoreszcencia és az intracelluláris NE koncentráció között egy széles koncentráció tartományban lineáris összefüggés van, kísérleteink eredményeinél csak a közvetlenül mért fluoreszcencia értékeket tüntettük fel, NE koncentrációra történő átszámolás nélkül.
6
5. EREDMÉNYEK 5.1. Nyúl aorta simaizomsejtek NE felvétele Kísérleteink első részében nyúl aortát használtunk az EMT expresszió és a szteroid szenzitív NE felvétel vizsgálatához (mivel humán bronchiális artériák csak korlátozott számban álltak rendelkezésünkre). Az NE felvétel méréséhez izolált simaizomsejtekre általunk adaptált, szemikvantitatív, SPG fluoreszcens technikát alkalmaztunk. Kimutattuk, hogy a nyúl aorta simaizom expresszálja az EMT mRNS 265 bp nagyságú fragmentumát (ez a szekvencia AF294824 azonosító szám alatt regisztrálásra került a GenBank-ban) és szteroidok, úgy mint kortikoszteron, hidrokortizon és 17β-ösztradiol (1 µM koncentrációban) akutan, 20 percen belül gátolják az aorta simaizomsejtek NE felvételét. O-metil-izoprenalin szintén gátolta az NE felvételt, míg dezipramin hatástalannak bizonyult 1 µM-os koncentrációban, mely inhibítor karakterisztika az EMT-re utal. A kortikoszteron NE felvételre gyakorolt akut gátló hatását sem cikloheximid (fehérjeszintézis gátló), sem aktinomicin D (transzkripció gátló) nem befolyásolta, míg a BSA-hoz kötött, és ezáltál sejtmembrán-impermeábilissá tett kortikoszteron szintén hatásos maradt. Ezek az eredmények azt támasztják alá, hogy a nyúl aorta simaizomsejtek NE felvétele szteroidokkal gátolható és valószínűleg EMT által mediált. Ez a gyors, sejtmembrán-mediálta celluláris mechanizmus felelős lehet a GS-ok okozta bronchiális vazokonstrikcióért. 5.2. NE felvétel OVA szenzitizált nyulakban Kísérleteink második részében azt vizsgáltuk, hogyan befolyásolja a szisztémás OVA szenzitizáció a nyúl aorta simaizomsejtek NE felvételét és NE transzporter mRNS expresszióját. Az NE felvételt 25.9 ± 4.5%-kal (átlag ± SEM) alacsonyabbnal találtuk a szenzitizált nyulakban a kontrollokhoz képest (P < 0.05; n = 6 mindkét csoportban). Tekintettel arra, hogy az OVA szenzitizált állatokban megjelenő szérum faktorok felelősek lehetnek a csökkent NE felvételért, megvizsgáltuk, hogy a szenzitizált állatok széruma milyen hatással bír a kontrollokból származó aorta simaizomsejtek NE felvételére. Megállapítottuk, hogy a szenzitizált állatok széruma nem befolyásolja szignifikánsan a normál állatokból származó simaizomsejtek NE felvételét, mely arra utal, hogy szenzitizáció során megjelenő szérum faktorok nem gátolják az EMT transzport funkcióját. 7
Az EMT mRNS expresszióját multiplex RT-PCR segítségével mértük aorta simaizomban. (Előzetes vizsgálatainkkal megállapítottuk, hogy az EMT mRNS expressziója alacsonyabb annál, hogy RNAse Protection Assay vagy Northern Blot alkalmazásával mérhető legyen.) Az EMT mRNS expressziója 61.1 ± 16.4%-kal volt alacsonyabb az OVA szenzitizált állatok esetében mint a kontrollokban. Ezek az adatok azt támasztják alá, hogy atópiás nyulak esetében a aorta simaizomsejtek NE felvétele lecsökken és ez csökkent NE transzporter mRNS expresszióval társul. 5.3. A humán bronchiális artéria simaizomsejtek NE felvétele Kísérleteink harmadik részében frissen izolált, humán bronchiális artéria simaizomsejtek NE felvételét tanulmányoztuk. Megvizsgáltuk a bronchiális artéria simaizomzat NE transzporter mRNS expresszióját és az NE felvétel farmakológiai karakterisztikáját. RT-PCR alkalmazásával végzett vizsgálataink kimutatták az EMT és az organikus kation transzporter 1 (OCT-1) mRNS expresszióját. Az RT-PCR analízis nem mutatta egyéb NE transzporter - úgy mint a neuronális NE transzporter (NET) és OCT-2 - mRNS expresszióját. A frissen izolált bronchiális artéria simaizomsejtek NE felvétele idő- és koncentrációfüggőnek bizonyult a fluoreszcensz technikával végzett méréseink szerint. A transzport Km értéke 240 µM volt. Kortikoszteron és O-metilizoprenalin akutan gátolta az NE felvételt, míg dezipramin hatástalannak bizonyult az alkalmazott 1 µM-os koncentrációban. Ez az inhibítor karakterisztika az EMTre utal. További kísérleteinkben budezonid 0.89 µM-os, míg metilprednizolon 5.56 µM-os IC50 értékkel gátolta az NE felvételt. Kortikoszteron gátló hatása reverzibilisnek bizonyult és nem volt gátolható RU486-al (GS receptor gátló), actinomicin D-vel és cikloheximiddel. BSA-hoz kapcsolt és ezáltal setjmembránimpermeábilissá tett kortikoszteron szintén gátolta az NE felvételt. A nagy konduktanciájú Ca2+-aktiválta K+ (BK) csatornákat gátló iberiotoxin nem befolyásolta az NE felvételt, de felfüggesztette a kortikoszteron gátló hatását az NE felvételre. Ezek az eredmények az igazolják, hogy bár a humán bronchiális artéria simaizomsejtek mind az EMT-t, mind az OCT-1 mRNS-ét expresszálják, a szteroidokkal akutan gátolható NE felvételért döntően az EMT felelős. Emellett feltehető, hogy sejtmembránra lokalizálódó BK csatornák mediálják a szteroidok EMT-re kifejtett akut gátló hatását.
8
6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton is szeretnék köszönetet mondani a Semmelweis Egyetem Budapest, Pulmonológiai Klinika és a Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of Miami School of Medicine (UM) munkatársainak, kollégáimnak értekezésem elkészítésében nyújtott segítségükért: Prof. Dr. Vastag Endre Prof. Dr. Magyar Pál Dr. Süttő Zoltán Prof. Dr. Adam Wanner (UM) Dr. Matthias Salathe (UM) Ph.D. Gregory E. Conner (UM) M.S. Aliza Torbati (UM) Dr. Rosanna Forteza (UM) Dr. Marie-Christine Nlend (UM) Dr. Philip L. Whitney (UM)
A doktori értekezés elkészítését a Magyar Pulmonológiai Alapítvány kutatói ösztöndíja (2000-2001) és az American Heart Association’s Florida/Puerto Rico Affiliate posztdoktori ösztöndíja (2001-2003) segítette.
9
7. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK Közlemények 1.
Horvath G, Torbati A, Conner GE, Salathe M, Wanner A: Systemic ovalbumin sensitization downregulates norepinephrine uptake by rabbit aortic smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol 2002; 27(6):746-51. IF = 4.17
2.
Horvath G, Lieb T, Conner GE, Salathe M, Wanner A: Steroid sensitivity of norepinephrine uptake by human bronchial arterial and rabbit aortic smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol 2001; 25(4):500-6. IF = 4.163
3.
Horvath G, Lieb T, Conner GE, Salathe M, Wanner A: Steroid sensitivity of norepinephrine uptake by human bronchial arterial and rabbit aortic smooth muscle cells. Medicina Thoracalis 2002; 3:74-82.
Könyvfejezetek 4.
Horvath G, Wanner A: Tracheobronchial circulation. In: Barnes PJ, Drazen JM, Rennard S, Thomson NC (eds). Asthma and COPD - Basic Mechanisms and Clinical Management. Academic Press: London, 2002; 177-82.
5.
Horváth G: Autonóm idegi szabályozás. In: Magyar P, Hutas I, Vastag E (eds). Pulmonológia. Második kiadás. Medicina: Budapest, 2002; 645-53.
6.
Vastag E, Komáromi T, Horváth G: Vascularis tüdőbetegségek. In: Magyar P, Vastag E (eds). Légzőszervi betegségek. Egyetemi tankönyv. (szerkesztés alatt)
Absztraktok 7.
Horvath G, Wanner A: Glucocorticoid targets in human bronchial arteries. Am J Respir Crit Care Med 2004; 169(7):A167.
8.
Horvath G, Sutto Z, Conner GE, Salathe M, Wanner A: Acute inhibition of the extraneuronal catecholamine transporter by glucocorticosteroids in human bronchial arteries. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167(7):A1006.
10
9.
Mendes ES, Horvath G, Wanner A: Measurement of fractional airway blood flow in mice. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167(7):A823.
10. Horvath G, Sutto Z, Salathe M, Conner GE, Wanner A: Nongenomic action of corticosterone on norepinephrine uptake by human bronchial arterial smooth muscle cells. Mol Biol Cell 2002; 13S:273a. 11. Horvath G, Torbati A, Conner GE, Salathe M, Wanner A: Ovalbumin sensitization downregulates norepinephrine uptake by aortic smooth muscle cells in rabbits. Am J Respir Crit Care Med 2002; 165(8):A337. 12. Horvath G, Salathe M, Conner GE, Wanner A: Extraneuronal monoamine transporter expression in rabbit lung. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163(5):A122. 13. Horvath G, Lieb T, Conner GE, Salathe M, Wanner A: Evaluation of extraneuronal norepinephrine uptake (uptake2) in isolated rabbit aortic smooth muscle cells using a single cell fluorescence method. Mol Biol Cell 2000; 11S:232a. Meghívott előadások 14. Horvath G: Molecular targets for steroids in airway vascular smooth muscle. 8th Da Vinci Society Meeting. Nimes, France; Sept 25-27, 2003. 15. Horvath G: Mechanisms of steroid-induced bronchial vasoconstriction. 7th Da Vinci Society Meeting. Stockholm, Sweden; June 19-21, 2001.
11
