01/2008:1635
GLUCAGONUM HUMANUM Humán glükagon
C153H225N43O49S
Mr 3483
DEFINÍCIÓ A humán glükagon 29 aminosavból álló polipeptid; szerkezete megegyezik az emberi hasnyálmirígy α-sejtjei által termelt – a májban lévő glikogén lebomlását gyorsító, és ezáltal a vércukorszintet emelő – hormon szerkezetével. Tartalom: 92,5–105,0% (vízmentes anyagra). ELŐÁLLÍTÁS A humán glükagont rekombináns DNS (rDNS) technológián alapuló módszerrel nyerik. A termék kifejlesztése során bizonyítani kell, hogy a gyártási folyamat eredményeképpen nyert termék biológiai aktivitása – megfelelő, validált biológiai értékmeghatározással megállapítva – legalább 1 NE/mg. Gazdasejt eredetű fehérje. A követelményt az illetékes hatóság állapítja meg. Gazdasejt eredetű és vektor eredetű DNS. A követelményt az illetékes hatóság állapítja meg. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér por.
Oldékonyság: vízben és a legtöbb szerves oldószerben gyakorlatilag nem oldódik; híg ásványi savak és híg lúgok oldják. AZONOSÍTÁS A.
Peptidtérkép-vizsgálat. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval 5 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldat 200 μl-ét 800 μl R 0,1 M ammóniumkarbonát–tompítóoldattal (pH 10,3) elegyítjük (hígított törzsoldat). R peptidtérkép-vizsgálatra szánt α-kimotripszinből R 0,1 M ammóniumkarbonát–tompítóoldattal (pH 10,3) 2 mg/ml töménységű oldatot készítünk, és ezen oldat 25 μl-ét a hígított törzsoldathoz mérjük. Az így nyert oldatot lezárt üvegcsében 2 órán át 37 oC-on tartjuk. Ezután az üvegcsét kiemeljük a temperáló közegből, és a reakciót 120 μl R tömény ecetsav azonnali hozzáadásával leállítjuk. Összehasonlító oldat. CRS humán glükagonból R 0,1 M ammónium-karbonát tompítóoldat (pH 10,3) felhasználásával 1 mg/ml töménységű oldatot készítünk (hígított törzsoldat). A továbbiakban a vizsgálati oldat készítésére előírtak szerint járunk el. Oszlop: −
méretei: l = 0,05 m, Ø = 4 mm;
−
állófázis: R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagél (5 μm).
Mozgófázis: – A-mozgófázis: 500 μl R trifluorecetsav és 1000 ml R víz elegye; – B-mozgófázis: 500 μl R trifluorecetsavat 600 ml R vízmentes etanollal elegyítünk, és az elegyhez 400 ml R vizet adunk. Idő (perc)
A-mozgófázis (%V/V)
B-mozgófázis (%V/V)
0 - 35
100 → 53
0 → 47
35 - 45
53 → 0
47 → 100
45 - 46
0 → 100
100 → 0
46 -75
100
0
Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 215 nm-en. Egyensúly beállítása: az A-mozgófázissal, legalább 15 percen át. Injektálás: 20 μl. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatográfiás profilja feleljen meg az összehasonlító oldat kromatográfiás profiljának. B.
A tartalmi meghatározás során nyert kromatogramokat értékeljük. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs retenciós ideje egyezzék meg az összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs retenciós idejével.
VIZSGÁLATOK Dezamidált glükagon. Folyadékkromatográfia (2.2.29): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval 1,0 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. A vizsgálandó anyagból 0,1 M sósavval 1,0 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldatot 2 órára 60 oC-os szárítószekrénybe helyezzük. A bomlás lezajlása után a pH-t 1 M nátrium-hidroxid–oldattal haladéktalanul 2,5-re állítjuk be. Oszlop: −
anyaga: üveg;
− méretei: l = 0,05 m, Ø = 5 mm; − állófázis: R2 anioncserélő gyanta.
Mozgófázis: −
A-mozgófázis: 1000 ml R trometamol–hidroklorid–tompítóoldat (pH 8,3) és 1000 ml R vízmentes etanol elegye;
−
B-mozgófázis: 29,2 g R nátrium-kloridot 1000 ml R trometamol–hidroklorid– tompítóoldatban (pH 8,3) oldunk; az oldathoz 1000 ml R vízmentes etanolt elegyítünk. Idő (perc) 0-4
A-mozgófázis (%V/V) 100
B-mozgófázis (%V/V) 0
4 – 30
100 → 78
0 → 22
30 – 34
78 → 45
22 → 55
34 – 38
45 → 20
55 → 80
38 – 40
20 → 100
80 → 0
40 – 60
100
0
Áramlási sebesség: 0,6 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 230 nm-en. Egyensúly beállítása: az A-mozgófázissal, legalább 15 percig. Injektálás: 60 μl. Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás-ellenőrző oldat: −
retenciós idő: glükagon kb. 10 perc; a négy dezamidált forma 15 – 40 perc;
−
csúcsfelbontás: alapvonalelválás a négy dezamidált forma és a glükagon között.
Követelmény: −
a négy dezamidált forma: együttes mennyiségük legfeljebb 0,5%, a 15 és 40 perc között eluálódó csúcsokból számolva.
Rokon fehérjék. Folyadékkromatográfia (2.2.29): a normalizációs eljárást alkalmazzuk.
2,8 M karbamid–oldat. 16,8 g R karbamidot 100 ml R vízben oldunk.. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval 0,5 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldatot 2-8 oC-on tartjuk. Összehasonlító oldat. Egy üvegcse CRS humán glükagonból 0,01 M sósavval 0,5 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldatot 2-8 oC-on tartjuk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. 10 mg vizsgálandó anyagot 20 ml 2,8 M karbamid–oldatban oldunk. Az oldatot 2 órán át 50 oC-on tartjuk. Lehűtés után az oldat pH-ját 1 M sósavval 2,2-re állítjuk be. Az oldatot 2-8 oC-on tartjuk, és 2 órán belül felhasználjuk, vagy –15 oC alatt tároljuk, és felhasználás előtt felolvasztjuk, majd 0,22 μm-es szűrőn megszűrjük. Oszlop: −
méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;
−
állófázis: 30 nm pórusméretű, R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm);
−
hőmérséklet: 45 oC.
Mozgófázis: −
A-mozgófázis: 13,6 g R kálium-dihidrogén-foszfátot 400 ml R vízben oldunk. Az oldathoz, miután pH-ját R tömény foszforsavval 2,5-re állítottuk be (2.2.3), 100 ml R kromatográfiás célra szánt acetonitrilt elegyítünk;
−
B-mozgófázis: R kromatográfiás célra szánt acetonitril – R víz (40+60 V/V); Idő (perc) 0 - 23
A-mozgófázis (%V/V) 57
B-mozgófázis (%V/V) 43
23 – 29
57 → 10
43 → 90
29 – 30
10
90
30 – 31
10 → 57
90 → 43
31 – 75
57
43
Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc.
Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. Injektálás: 50 μl; vizsgálati oldat és csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. Relatív retenció a glükagonra (retenciós ideje kb. 20 perc) vonatkoztatva: karbamoilglükagon kb. 1,1. Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás-ellenőrző oldat: –
csúcsfelbontás: legalább 2,0, a glükagon és a karbamoilglükagon között.
Követelmény: –
összes szennyező: legfeljebb 2,5%.
Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 10%. Az anyag 50 mg-ját vizsgáljuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 10 NE/mg. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29), a „Rokon fehérjék” vizsgálatban előírtak szerint, a következő módosítással. Injektálás: vizsgálati oldat és összehasonlító oldat. A humán glükagon C153H225N43O49S-tartalmát a CRS humán glükagon deklarált C153H225N43O49S-tartalma alapján számoljuk ki. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban, fénytől védve, –15 oC alatti hőmérsékleten.
