GÉNPOLIMORFIZMUS ÉS DIPEPTIDIL PEPTIDÁZ IV (DPP IV, CD26) VIZSGÁLATOK PRIMER BILIARIS CIRRHOSISBAN ÉS HEPATIKUS OSTEOPATHIABAN
DOKTORI ÉRTEKEZÉS
DR. LAKATOS PÉTER Témavezető: Dr. Szalay Ferenc
SEMMELWEIS EGYETEM Általános Orvostudományi Kar I.sz. Belgyógyászati Klinika 2001, Budapest
Tartalomjegyzék 1. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................... 4 2. SUMMARY................................................................................................................. 6 3. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................... 7 4. BEVEZETÉS .............................................................................................................. 9 5. CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................... 10 6. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.................................................................................... 12 6.1. Primer biliaris cirrhosis ........................................................................................ 12 6.1.1. Epidemiológia................................................................................................... 12 6.1.2. A primer biliaris cirrhosis patogenezise ........................................................... 13 6.1.3. A klinikai kép, laboratóriumi eltérések és társuló betegségek ......................... 21 6.1.4. A primer biliaris cirrhosis terápiája .................................................................. 24 6.2. Hepatikus osteopathia primer biliaris cirrhosisban........................................... 27 7. MÓDSZEREK .......................................................................................................... 30 7.1. Genetikai vizsgáló eljárások (polimorfizmus vizsgálatok)................................. 30 7.1.1. D vitamin receptor gén BSM I ......................................................................... 30 7.1.2. Ösztrogén receptor alfa gén Xba I illetve Pvu II .............................................. 31 7.1.3. Interleukin 1-receptor antagonista gén ............................................................. 31 7.2. Osteodenzitometriai módszerek ........................................................................... 32 7.3. Vizelet keresztkötés meghatározás (piridinolin/kreatinin, deoxipiridinolin/kreatinin)........................................................................................... 32 7.4. Plazma endothelin-1 meghatározás ..................................................................... 33 7.5. Dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) meghatározás ................................................. 33 7.6. AMA, D vitamin meghatározás és rutin laboratóriumi vizsgálatok................. 34 8. EREDMÉNYEK ....................................................................................................... 35 8.1. Hepatikus osteopathia vizsgálata PBC-ben......................................................... 35 8.1.1. Genetikai tényezők szerepe az osteoporosis kialakulásában, kapcsolatuk az alapbetegséggel (polimorfizmus vizsgálatok primer biliaris cirrhosisban: D vitamin receptor gén BSM I, ösztrogén receptor alfa gén Xba I és Pvu II, interleukin-1receptor antagonista gén)............................................................................................ 35
2
8.1.2. A hepatikus osteopathia természetes lefolyása (A csont ásványianyag-tartalom utánkövetéses vizsgálata Ca és D-vitamin szupplementációban részesülő postmenopausás PBC-s betegekben) .......................................................................... 41 8.1.3. Plazma endothelin-1 vizsgálata PBC-ben......................................................... 48 8.1.4 A hepatikus osteopathia természetes lefolyása, patomechanizmusa, genetikai rizikótényezők. Diszkusszió ....................................................................................... 51 8.2. DPP IV: szerepe a gyulladásban és fibrózisban. Indikátor, prognosztikus marker? ......................................................................................................................... 56 8.2.1. DPP IV aktivitás PBC-ben ............................................................................... 56 8.2.2. DPP IV aktivitás krónikus C hepatitisben, a responder status szerepe ............ 58 8.2.3. DPP IV aktivitás kísérletes májcirrhosisban .................................................... 62 8.2.4. A DPP IV aktivitás és a májbetegségek lehetséges kapcsolata. Diszkusszió... 65 9. FŐBB ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ....................................................... 69 10. MELLÉKLET......................................................................................................... 71 11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS................................................................................ 72 12. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................ 73 12.1. Saját publikációk jegyzéke ................................................................................. 73 12.2. Felhasznált irodalom ........................................................................................... 75
3
1. Összefoglalás Kutatócsoportunk a krónikus májbetegségek patogenezisével, szövődményeivel és kezelési lehetőségeivel foglalkozik. A krónikus májbetegségek, így a primer biliaris cirrhosis (PBC), gyakori szövődménye a hepatikus osteopathia. Magas morbiditással és mortalitással jár. Az osteoporosis (OP) kialakulásában egyre fontosabbnak tűnik genetikai tényezők szerepe. Vizsgálni kívántuk ezért, hogy a PBC-ben megfigyelhető OP összefüggésbe hozható-e genetikai tényezőkkel. PCR módszerrel vizsgáltuk az postmenopausás OP kialakulásában fontosnak tartott D vitamin receptor (VDR) gén Bsm I, interleukin-1 receptor antagonista gén (IL-1RN) VNTR és ösztrogén receptor alfa (ER-α) gén XbaI, PvuII polimorfizmusokat PBC-ben. Megvizsgáltuk, hogy kapcsolatba hozhatók-e az OP megjelenésével, illetve az alapbetegséggel. Vizsgáltuk az OP gyakoriságát, természetes lefolyását Ca és D vitamin szupplementációban részesülő magyar PBC-s nőbetegekben. Tanulmányoztuk továbbá, hogy az in vitro az osteoblastok proliferációját fokozó és az osteoclastok aktivitását gátló endothelin-1 (ET1) szint változik-e PBC-ben, illetve hogy kimutatható-e összefüggés a plazma ET-1 szint és a csont-ásványianyag tartalom (BMD) között. Összefoglalva, az OP előfordulása postmenopausás PBC-s nőbetegekben, a nemzetközi adatokhoz hasonlóan gyakori volt (40-50%). Az irodalomban ellentmondó adatok voltak ismertek a VDR génről PBC-ben. Mi gyakoribbnak találtuk a magyar betegekben a BsmI BB genotípust és B allélt. Elsőként számoltunk be arról, hogy az ER-a XbaI Xx és a PvuII Pp genotípusok gyakoribbak PBC-ben, míg a betegek IL-1RN VNTR polimorfizmusa a magyar betegekben nem különbözött a kontroll csoporttól. Nem találtunk kapcsolatot a vizsgált polimorfizmusok és BMD között, így nem valószínű, hogy legalábbis a magyar PBC-s betegekben, ezeknek a polimorfizmusoknak jelentős szerepe van az OP kialakulásában PBC-ben. Vizsgálataink és az irodalmi adatok alapján felmerül annak a lehetősége, hogy az ER-α PvuII, XbaI és a VDR BsmI polimorfizmusoknak, esetleg kapcsolt géneknek szerepe lehet a PBC patogenezisében. Vizsgálataink szerint az OP kialakulásában a fokozott csontresorptiónak jelentős szerepe van. A munka másik részében egy a T-sejt aktivációban, és a cytokinek hasításában is fontos szerin exopeptidáz, a dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) szerepét vizsgáltuk különböző etiológiájú májbetegségekben. Mivel a legnagyobb mennyiségben az epeutak expresszálnak DPP IV-et, és a PBC a kis epeutak sérülésével jár, vizsgálni kívántuk a szérum DPP IV aktivitást PBC-ben. Vizsgáltuk továbbá az aktivitást kezelt és 4
kezeletlen krónikus C hepatitises (CHC) betegekben és kísérletes cirrhosis modellben. Megvizsgáltuk, hogy kapcsolatba hozható-e a betegség progressziójával, a cirrhosis kialakulásával. Eredményeink azt mutatták, hogy különböző etiológiájú krónikus májbetegségekben (PBC, CHC), illetve kísérletes májcirrhosisban a DPP IV aktivitás cholastasis
nélkül
is
emelkedett.
Az
emelkedés
kapcsolatot
mutat
a
nekroinflammatórikus enzimekkel (ASAT, ALAT), úgy tűnik, hogy indikátora a májkárosodás súlyosságának.
5
2. Summary Our Hepatology Research Team at the 1st Department of Medicine of Semmelweis University is especially interested in the pathogenesis, complications and treatment of chronic liver diseases. Hepatic osteopathy is a common complication in chronic liver diseases, particularly in primary biliary cirrhosis (PBC). Genetic factors have been implicated in the pathogenesis of OP. Vitamin D receptor (VDR) gene, estrogen receptoralpha (ER-α) gene, and IL-1-receptor-antagonist gene (IL-1RN) are all attractive candidates for osteoporosis susceptibility. Therefore, we investigated the polymorphisms of the above genes in Hungarian PBC patients. Furthermore we aimed to study the natural history of metabolic bone disease, and the incidence of osteoporosis (OP) in Ca and vitamin D supplemented Hungarian female PBC patients. Since endothelin-1 (ET-1) has been found to stimulate osteoblasts and inhibit osteoclasts, in vitro, we also investigated the plasma ET-1 activity in PBC. OP was present in 40-50 % of the patients. There is conflicting data on VDR in PBC. We found an overrepresentation of the BB genotype and B allele in Hungarian PBC patients. This is the first study to our knowledge to report on the ER-α XbaI and PvuII polymorphisms in PBC patients. An overrepresentation of the ER-α Pp and Xx genotypes were found in Hungarian PBC patients, while there was no difference in the IL-1RN VNTR polymorphism between PBC patients and controls. As none of the polymorphisms was associated with BMD, it is unlikely that these polymorphisms are essential in the prediction of lover BMD in PBC, at least not in Hungarian patients. Further studies are needed to determine whether ER-α PvuII, XbaI, VDR BsmI or linked polymorphisms might be involved in the pathogenesis of PBC. According to our results bone resorption plays an important role in the pathogenesis of OP in PBC. In the other part of our work we examined the serum dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) activity in various chronic liver diseases. DPP IV is a cell surface serine exopeptidase, thought to be important in T-cell activation and in the cleavage of cytokines. It is mainly expressed on brush border membranes e.g. bile canaliculi, and the destruction of small bile ducts is characteristic for PBC. For that we sought to study serum DPP IV activity in PBC. We also measured the activity in chronic hepatitis C (CHC) and in experimental liver cirrhosis and investigated whether the activity reflects the severity of the disease. In conclusion serum DPP IV activity was elevated in PBC, CHC and in experimental cirrhosis even without the presence of cholestasis. A correlation was found between the DPP IV activity and the necro-inflammatory enzymes (ASAT, ALAT), and it seems to be an indicator for chronic liver injury.
6
3. Rövidítések jegyzéke ALAT – alanin-aminotranszferáz ALP – alkalikus foszfatáz AMA – anti-mitokondriális antitest ANA – anti-nukleáris antitest ASAT – aszpartát-aminotranszferáz BCOADC – branched chain 2-oxosav-dehidrogenáz komplex BMC – bone mineral content, csont tartalom BMD – bone mineral density, csont sűrűség D-pyr/c – deoxipiridinolin/kreatinin hányados DPP IV – dipeptidil peptidáz IV ECM – extracelluláris matrix ER-α – ösztrogén receptor alfa ET-1 – endothelin-1 FAP – fibroblast aktivációs protein FN – bal femur nyak GGT– gamma-glutamil-transzferáz GVH – graft versus host HSC – hepatic stellate cell, stellata sejt IFN – interferon IL – interleukin IL-1Ra – interleukin-1 receptor antagonista protein IL-1RN – interleukin-1 receptor antagonista gén L2-4 – lumbalis gerinc OGDC – 2-oxoglutarát komplex OLT – orthotopic liver transplantation OP – osteoporosis PBC – primer biliaris cirrhosis PCR – polymerase chain reaction PDC – piruvát-dehidrogenáz komplex pyr/c – piridinolin/kreatinin hányados RANTES – regulated on activation, normal T cell expressed and secreted SD – standard deviáció
7
SEM – standard hiba, standard deviáció és az esetszám négyzetgyökének hányadosa TCR – T-sejt receptor Th – T-helper TNF – tumor nekrózis faktor UDCA – ursodeoxikolsav VDR – D vitamin receptor VNTR – variable number tandem repeat 1,25- (OH)2-D3 – 1,25 dihidroxi D3 vitamin 25-OH D vitamin – 25 hidroxi D3 vitamin
8
4. Bevezetés A krónikus májbetegségek okozta halálozás világszerte komoly népegészségügyi problémát jelent. Különösen igaz ez Magyarországon, ahol –elsősorban az alkoholfogyasztási szokások miatt– a májcirrhosis évente 7-8000 egyén haláláért tehető felelőssé. A cirrhosisos betegek száma ezt messze meghaladja. Kiemelten fontos ezért, hogy a krónikus májbetegségek patogenezisét, a kórlefolyást, a megelőzés és a kezelés lehetőségeit minél jobban megismerjük. A primer biliaris cirrhosis (PBC) ismeretlen eredetű, progresszív, cholestasissal járó májbetegség, mely az évek során cirrhosishoz, májelégtelenséghez vezet. A PBC a krónikus májbetegségek modelljének tekinthető. A betegség kialakulásában és a progresszióban szerepet játszó tényezők megismerése és tanulmányozása segítséget jelenthet a cirrhosis patogenezisének, és a különböző etiológiájú krónikus májbetegségek kialakulásának és progressziójának pontosabb megértésében, és új terápiás támadáspontok kialakításában. A hepatikus osteopathia, ezen belül az osteoporosis kialakulása ismert szövődmény. A gyakoribb csonttörés miatt fokozott morbiditással és mortalitással jár, a kérdés anyagi vonzata sem elhanyagolható. A folyamat patogenezisét, a prevenció és a kezelés lehetőségeit kutató vizsgálatok ezért nagy gyakorlati jelentőséggel bírnak.
9
5. Célkitűzések •
Kutatócsoportunk a Semmelweis Egyetem I.sz. Belgyógyászati Klinikáján a krónikus
májbetegségek
patogenezisével,
szövődményeivel
és
kezelési
lehetőségeivel foglalkozik. Kiemelt érdeklődési területeink közé tartozik többek között a primer biliaris cirrhosis, krónikus C hepatitis és a hepatikus osteopathia patogenezise, a kezelés lehetőségeinek kutatása. •
A krónikus májbetegségek gyakori, jelentős morbiditással járó szövődménye a hepatikus osteopathia. Az utóbbi években az osteoporosis kialakulásában egyre fontosabbnak tűnik genetikai tényezők szerepe. Munkánkban ezért célul tűztük ki a PBC és a PBC-hez társuló hepatikus osteopathia genetikai hátterének pontosabb feltérképezését. Az irodalomban ellentmondó adatok ismertek a D vitamin receptor (VDR) gén szerepéről a PBC-ben megfigyelhető osteoporosis kialakulásában. Ezenkívül vizsgáltuk a postmenopausás osteoporosis kialakulásában szerepet játszó interleukin-1 receptor antagonista gén (IL-1RN) VNTR és ösztrogén receptor alfa (ER-α) gén XbaI, PvuII polimorfizmusok eloszlását magyar PBC-s nőbetegekben.
•
Választ kerestünk arra a kérdésre, hogy a vizsgált polimorfizmusok kapcsolatba hozhatók-e a hepatikus osteoporosis megjelenésével, illetve az alapbetegséggel.
•
Célul tűztük ki a hepatikus osteopathia természetes lefolyásának, progressziójának vizsgálatát
kalcium
és
D
vitamin
szupplementációban
részesülő
PBC-s
nőbetegekben normális szérum kalcium és 25-OH-D3 szint mellett. •
Vizsgáltuk továbbá, hogy az osteoblastok proliferációját fokozó és az osteoclastok aktivitását gátló endothelin-1 (ET-1) szint változik-e krónikus májbetegekben, illetve hogy az ET-1 szint és a csontok ásványianyag-tartalma között van-e jelentős összefüggés.
10
•
A dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) egy szerin exopeptidáz. A molekula korábbi vizsgálatok alapján fontos szerepet játszik a cytokinek hasításában, a T-sejtek aktivációjában és a fibrózisban. Aberráns DPP IV expressziót írtak le humán hepatocellularis carcinomaban és máj cirrhosisban, de nem volt adat a DPP IV szerepéről egyéb májbetegségekben. PBC-ben jellegzetes a kis epeutak destrukciója. Mivel az epeutak nagy mennyiségben expresszálnak DPP IV-et, feltételezhető, hogy ebben a betegségben változik a szérum DPP IV aktivitás. Munkánkban ezért célul tűztük ki, hogy megvizsgáljuk a DPP IV aktivitást PBC-ben. Megvizsgáltuk, hogy kapcsolatba hozható-e a betegség progressziójával, segítséget jelenthet-e a betegség stádiumának pontosabb megállapításában.
•
Állatkísérletes cirrhosis modellben vizsgálni kívántuk, hogy a DPP IV aktivitás kapcsolatba hozható-e a cirrhosis megjelenésével, a folyamat progressziójával.
•
A krónikus C hepatitis szintén a máj károsodásával járó folyamat, világszerte komoly népegészségügyi probléma. Ezért célul tűztük ki annak vizsgálatát, hogy a DPP IV aktivitás kapcsolatba hozható-e a krónikus C hepatitis fertőzéssel, illetve, hogy változik-e a DPP IV aktivitás interferon terápia hatására.
11
6. Irodalmi áttekintés 6.1. Primer biliaris cirrhosis A primer biliaris cirrhosis (PBC) egy krónikus, ismeretlen eredetű, progresszív, cholestasissal járó májbetegség, mely az évek során cirrhosishoz, májelégtelenséghez vezet. Az élet fenntartásának egyetlen esélye ilyenkor egészséges máj transzplantációja. Az esetek döntő többségében az érintettek középkorú nők (95 %-ban). A betegség első leírása Addison és Gull nevéhez fűződik1. Hanot 1876-ban xanthomás betegeket vizsgálva a betegséget “hypertophiás cirrhosis”-nak nevezte el. A PBC elnevezés eredetileg a Dauphinee és Sinclair szerzőpárostól származik, majd az orvosi köztudatba az elnevezés Ahrens és mtsai2 1950-es közlése után épült be és szilárdult meg. Bár a diagnózis nem könnyű, az utóbbi évtizedekben egyre gyakrabban kerül felismerésre. Köszönhető ez a könnyen hozzáférhető laboratóriumi vizsgálatoknak, beleértve a betegségre jellegzetesnek tartott anti-mitokondriális antitest (AMA) kimutatását. A tipikus beteg középkorú nő, fáradtságról, viszketésről panaszkodik. Ennek hiányában ismeretlen eredetű hepatomegália illetve emelkedett szérum alkalikus foszfatáz érték keltheti fel a betegség gyanúját. Az alkalikus foszfatáz (ALP), a γglutamil transzferáz (GGT) értékek az aminotranszferáz (ASAT, ALAT) értékeknél jobban megemelkednek (cholestasisra jellemző minta), AMA pozitivitás 90-95 %-ban mutatható ki. Fontos differenciáldiagnosztikai feltétel az extrahepatikus cholestasis kizárása, az epeutak szabad átjárhatóságának bizonyítása (ultrahanggal, CT-vel, ERCP / MRCP-vel vagy percutan cholangio-pancreatographiaval). A diagnózis végső soron májbiopsziával állítható fel. Jellegzetes elváltozás a kis intrahepatikus epeutak destrukciója, a portális mező krónikus gyulladása, előrehaladott esetben a máj kötőszövetes átalakulása. A szövettani kép a diagnózis felállításán kívül alkalmas a betegség stádiumának megállapítására, a prognózis pontosabb becslését teszi lehetővé. 6.1.1. Epidemiológia A betegség icidenciája és prevalenciája nagy földrajzi variabilitást mutat. (1. táblázat). Pontos prevalencia nem határozható meg, átlagosan 30-80 / millió lakosra
12
számíthatunk. Az incidenciára vonatkozó adatok is meglehetősen változatosak: 2-14 / millió lakos / év. Szerző Inoue és mtsai Watson és mtsai Witt-Sullivan és mtsai Remmel és mtsai Erikson és mtsa Löfgren és mtsai Hamlyn és mtsai Myszor és mtsa Boberg és mtsai Kim és mtsai
Vizsgálat helye Japán Ausztrália Kanada Észtország Svédország Svédország Anglia Anglia Norvégia USA
Időpont 1995 1993 1990 1992 1984 1985 1983 1989 1995 2000
Incidencia 3,4 - 4,2 3,26 2,3 13,7 14 10 16,2 27
Prevalencia 20 19,1 22,39 27 92 128 144 154 146 402
1. táblázat A PBC incidenciája és prevalenciája a világ különböző országaiban 1000000 lakosra vonatkoztatva 3,4 Leggyakrabban az észak-európai országokban (elsősorban Svédországban) valamint Angliában észlelték, ugyanakkor japán és ausztrál kutatók meglehetősen alacsony incidencia és prevalencia értékekről számoltak be. Az utóbbi években növekvő incidenciáról és prevalenciáról számolnak be. 6.1.2. A primer biliaris cirrhosis patogenezise 6.1.2.1. Genetikai tényezők A betegség kialakulásában családvizsgálatok alapján felmerült genetikai faktorok predisponáló szerepe. Gyakoribb előfordulást figyeltek meg családtagokban. Megjelent a betegség testvérekben, gyermekekben. Egyes adatok szerint egy érintett személy esetén, 6 % eséllyel lehet számítani a betegség kialakulásra további családtagokban5. A beteg hozzátartozóiban gyakrabban mutatható ki a T-sejt reguláció zavara, ugyanakkor az AMA előfordulása nem gyakori az egészséges családtagok között. A HLA rendszer kapcsolata a PBC-vel az eddigi vizsgálatok alapján nem tisztázott. A HLA II. osztályba tartozó antigének közül felvetették a HLA DR8 és HLA DR8-DQB1*0402, német kutatók a HLA–DPB1*0301, valamint japán szerzők a HLA– DRB1*0803 lehetséges kapcsolatát a betegséggel67. A HLA III. osztályba tartozó
13
lokuszok közül a C4B2 és a C4A*QO fokozott előfordulását figyelték meg. Japán szerzők a HLA-DR8 pozitív PBC-s betegekben a piruvát-dehidrogenáz komplex elleni antitestek fokozott előfordulását figyelték meg, a HLA-DR8 negatív betegek csoportjával összehasonlítva8. Az utóbbi években a technika robbanásszerű fejlődésének köszönhetően, genetikai ismereteink jelentősen bővültek. Számos, a funkciója alapján a betegség kialakulásában fontosnak tűnő gént vizsgáltak. Így kapcsolatot találtak a CTLA-4 gén 1. exon, a TNF-α *308, , az IL-1B polimorfizmusa és a betegség kialakulásának lehetősége között9,10. A VDR BsmI génpolimorfizmusról ellentmondásos adatok ismertek, míg az apolipoprotein E epsilon4 allélja inkább a betegség prognózisával mutatott kapcsolatot11. 6.1.2.2. A T-sejt aktiváció zavara A betegségben a humorális és a celluláris immunitás komplex zavara figyelhető meg. Humorális immunitás zavarára utal, hogy a betegek jelentős részénél emelkedett, fokozottan immunreaktív szérum IgM szint figyelhető meg12. Egyes betegekben alacsony molekulasúlyú IgM monomer mutatható ki, képtelenek IgM pentamer szintetizálására. Nem történik meg a váltás IgM-ről IgG-re. A magas szérum IgM szint bizonyos esetekben immunkomplexként viselkedik, spontán aktiválja a klasszikus úton a C3 komplement faktort (C3b és C3c). Számos autoantitest mutatható ki PBC-s betegek véréből13: így antimitokondriális antitest (AMA), anti-nukleáris antitest (ANA), a nukleáris membránnal reagáló antitest (gp210), antithyreoidea antitest, thrombocyta-ellenes (GP Ib/IX és GP IIb/IIIa elleni) antitest, anti-SS-A antitest, calreticulin elleni antitest, sp100 (nukleáris dot) ellenes antitest. Kimutatható hiszton elleni, centromer elleni és a biliaris epitheliumban jelen lévő karboanhidráz II ellenes antitest is. Ez utóbbi gyakoribb asciteses betegekben14. Az antitestek IgM, IgG vagy IgA típusúak lehetnek. Antimitokondriális antitestek a PBC-s betegek 90-95 %-ában mutathatók ki (2.táblázat). Bizonyítékok vannak arra is, hogy AMA pozitívitást mutató tünetmentes egyének egy részében idővel PBC alakul ki15. Jelenlétük azonban megfigyelhető más betegségekben is (3. táblázat).
14
Antitest/antigén Az antigén Antigénje “rendszer” legnagyobb mennyiségben M2 Szív 2-oxo dehidrogenáz M4 Máj szulfit-oxidázhoz kapcsolódik M8 Vese nem ismert M9 Máj glikogén foszforiláz
Membránokkal való kapcsolata
Klinikai jelentősége
BM KM
Diagnosztikus marker Prognosztikus marker
KM/mikroszoma Prognosztikus marker KM/citoplasma Diagnosztikus marker, enyhébb megjelenésű PBC-vel jár együtt antiM2 negatív betegekben
2.táblázat A különböző PBC-ben kimutatható antigén / antitest rendszerek jellemzői (BM - belső membrán, KM – külső membrán) 16
Fertőző betegségek
Gyógyszerindukálta betegségek Kollagén betegségek
Antitest típusa anti-M1, szifilisz II.
Klinikum sikeres antibiotiukum terápiát követően eltűnik anti-M5, akut myocarditis (60%- az antitest titer csökkenése ban), dilatatív cardiomyopathia remissziót jelez, perzisztálása (30%-ban) krónikus folyamatot anti-M3, venocuran indukálta gyógyszer elhagyására a titer pseudolupus csökken
Antigénje Cardiolipin (BMM) Sarcosine dehidrogenáz (BMM) Nem ismert (KMM)
anti-M6, iproniazid indukálta hepatitis anti-M5a, ANA + vagy – kollagén betegségek anti-M5b, ANA + vagy – kollagén betegségek
Nem ismert (KMM) Nem ismert (BMM) Nem ismert (KMM)
gyógyszer elhagyására a titer csökken
3. táblázat Anti-mitokondriális antitestek előfordulása más betegségekben (BMM-belső mitokondriális membrán, KMM- külső mitokondriális membrán) Az esetek mintegy 5 %-ában AMA nem mutatható ki, ilyenkor viszont majdnem mindig jelen van valamilyen anti-nukleáris antitest (ANA). Az ilyen esetek mintegy felében karboanhidráz II ellenes antitest is kimutatható14. Megváltozik a különböző cytokinek produkciója is17. A megfigyelések szerint az IL-10, IFN-γ, IL-2, IL-4 expressziója csökken, ezzel ellentétesen az IL-5, IL-6 szintje emelkedik PBC-ben18. A PBC stádiumainak előrehaladásával egyes interleukinok (IL-2, IL-4, IL-8, IFN, TNF) expressziójának fokozódását tapasztalták, míg egy másik autoimmun betegségben, primer szklerotizáló cholangitisben (PSC) éppen fordítva, a stádiumok előrehaladásával ezen IL-ek szintje csökkent (alkoholos májbetegségben az IL-8 szintjének emelkedését tapasztalták).
15
Celluláris immunfolyamatok zavarára utal, hogy a perifériás T sejtek számának csökkenését lehetett kimutatni19. A sejtszám csökkenésének valószínű oka a T sejteknek a portális mezőbe való kiáramlása. Ugyanakkor a γ/δ T sejtek számának emelkedését mutatták ki mind a perifériás vérben, mind - ami még érdekesebb - PBC-s betegek májszövetének portális tereiben20. A betegség korai stádiumában sem az MHC I és II molekulák, sem a T-sejtek aktivációjához szükséges kostimuláló BB1/B7 megjelenése nem mutatható ki, a specifikus T-sejtek aktivációja elmarad. Lehetséges tehát, hogy a korai stádiumokban éppen ezeknek a γ/δ sejteknek van döntő szerepe a kis epeutak destrukciójában. A CD4+ naiv T sejtek számának csökkenését lehetett kimutatni. A perifériás vérben a T-helper1 (Th1) és T-helper2 (Th2) limfociták eloszlása azonos. Érdekes lehet, hogy Harada és mtsai. PBC-s betegek májszövetében, in situ mRNS hibridizációs vizsgálattal a Th1-re jellemző cytokin profilt mutattak ki21. Megfigyelhető a perifériális T sejtek diszfunkciója is. A sejtek gyengén reagálnak IL-2-re, mitogén stimulációra szintén gyenge a válasz, csökkent mennyiségben szekretálnak limfotoxinokat, TNF-t, INF-γ-t. Ugyanakkor mind a perifériás, mind a májból származó T sejtek piruvát-dehidrogenáz komplex E2 és X alegységei hatására aktiválódnak, de aktiválódás mutatható ki más epeúti epithelialissejt antigén hatására is (pl. a B1 biliaris antigén). 6.1.2.3. A PBC patogenezise Az eddigi nagyszámú vizsgálat ellenére a PBC patogenezise lényegében nem ismert. Az elképzelések szerint: 1, Virális, bakteriális vagy mesterséges faktorok kiváltó (trigger) hatására indulnak be az immunfolyamatok. Molekuláris mimikri útján az immunsejtek keresztreakciót adnak saját fehérjékkel. A második lépésben immár a triggertől függetlenül a fokozódó autoimmunitás okozza a betegség kialakulását és progresszióját. 2, Más elképzelés szerint a biliaris epithelium megváltozott antigén expressziója az elsődleges. Itt elsősorban a PDC-E2 korai, fokozott kifejeződését kell megemlítenünk. 3, Felmerült a fetalis mikrochimerizmus lehetséges kóroki szerepe is. Az ilyen irányú vizsgálatok eredményei azonban nem támogatják ezt a lehetőséget22.
16
Külön is említést érdemel a legfőbb mitokondriális antigén, a piruvátdehidrogenáz komplex (PDC). Számos vizsgálat bizonyította, hogy a PDC, mely azonos az M2 antigénnel, jelentős szerepet játszhat a PBC patogenezisében. A komplex négy alegységből épül fel (öt különböző antimitokondriális antitesttel reagáló epitop), melyek a megfelelő M2 antitesttípussal lépnek reakcióba. A fő antigének a PDC-E2, a PDC-E3BP, a branched chain 2-oxosav-dehidrogenáz komplex-E2 (BCOADC-E2) és a 2-oxoglutarát komplex-E2 (OGDC-E2) alegységei. Már a PBC igen korai stádiumában ki lehet mutatni a PDC overexpresszióját a biliaris epithel sejteken, ami nem jár az adott sejtekben a mitokondriumok számának megnövekedésével23. A PDC-E2 illetve E3BP (E3 binding protein, vagy protein X) overexpresszió független a beteg AMA státuszától: mind AMA pozitív mind AMA negatív betegben kimutatható. A feltételezések szerint az enzim mitokondriumba irányuló transzportja szenved hibát, ez vezet az akkumulációjához, aberráns expressziójához.
külső lipoil
belső lipoil
E1/E3 kötő
régió
régió
régió
katalitikus/E2 kötő régió
aminosav régiók
1-98
128-229
266-311
128
331-560
163
176
SYPPHMQVLPALSPTMTMGTVQRWEKKVGEKLSEGDLLAEI ETD K ATI
1.ábra A PDC-E2 alegység szerkezete, a nyilak a T-sejtek számára esszenciális epitopot mutatják Kimutatták, hogy a PBC-s betegekből származó, T-sejt klónok a humán PDCE2 azonos régióját ismerik fel, nevezetesen a belső 163-176 aminosav (AS) régiót (ez egyébként csaknem egybeesik a B-sejtek által felismert régióval: 165-184 AS)24.
17
Vannak adatok arra is, hogy a tolerancia eredetileg nem az E2 antigénnel szemben, hanem a PDC-E3BP-vel szemben szűnik meg25. A T-sejt epitop kialakításáért végső soron a 170-173 AS között megfigyelhető ExDK szekvenciát teszik felelőssé26. Ezt támasztja alá, hogy a PDC-E2 163-176 AS-ra specifikus T-sejtek keresztreakciót mutatnak a PDC-E2 36-49 AS-val illetve az OGDCE2 100-113 AS-val. Ezek a peptidek szintén tartalmazzák a fent említett szekvenciát. Egyetlen sejtklón sem adott keresztreakciót azonban azokkal a saját peptidekkel (glikogén-foszforiláz-β, HLA-DRα), melyek jelentős homológiát mutatnak a humán PDC-E2 163-176 AS régiójával, ugyanakkor ExDK szekvenciával nem rendelkeznek. A molekula különös jelentőségét az adja, hogy igen konzervatív. Az eukarióta sejtekből származó PDC-k jelentős homológiát mutatnak egymással, megteremtve ezzel a molekuláris mimikri elvi lehetőségét. Ismert, hogy autoimmun folyamat jöhet létre, amikor mikrobák ellen termelt antitestek illetve T-sejtek keresztreakciót adnak saját fehérjékkel. A molekuláris mimikri, mint lehetőség a PBC-vel kapcsolatban is felvetődött. PBC-s betegekből származó immunkompetens sejtek keresztreakciót mutattak az E. coli PDC-E2 régiójával, mely szintén rendelkeznek ezzel a bizonyos ExDK szekvenciával, bizonyítva ezzel a molekuláris mimikri lehetőségét a T-sejtek szintjén24. A Mycobacterium (M.) gordonae és M. bovis-szal kapcsolatban a tanulmányok hasonló eredményre jutottak is27. A M. bovis 65 kD-os heat shock proteinje szintén keresztreakciót adott az AMA-kal, sőt érdekes módon M. tuberculosisos betegekben is kimutatható volt PDC-E2 elleni antitestek termelése. Anti PDC-E2 antitestek a tünetmentes, „egészséges” populációban is kimutathatók. A tanulmányok szerint ugyanakkor, az ilyen egyének legalább is egy részében idővel PBC alakul ki15. Irodalmi adatok szerint keresztreakció figyelhető meg az AMA-k és számos további mikroba között is (pl. Yersinia enterocolica, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus és Salmonella mirabilis)27. A vizsgálatok szerint a PBC-s betegek széruma képes gátolni más fajokból származó PDC-t is. Leginkább az emlősökből származó PDC-t gátolja, közepesen hat a Saccharomyces cervisiae PDC-re, míg alig gátolja az E. coli PDC-t28. Utóbbi megfigyelés az E. colival kapcsolatos molekuláris mimikri lehetősége ellen szól. Érdekes megfigyelés, hogy PBC-s betegek májszövetében majdnem az összes esetben sikerült Helicobacter spp. DNS-t kimutatni (főleg H. pylori-t, és nem az epére 18
rezisztens H. bilist vagy H. hepaticust), míg kontroll egyének májszövetében egyetlen esetben sem29. Beszámoltak bizonyos retrovirális ágensek lehetséges szerepéről is30. PBC-s betegek széruma fokozottan reagált a HIV p24 gag proteinnel, és a human intracisternal A-type particle (HIAP) endogén retrovírussal. Lehetséges persze molekuláris mimikri xenobiotikumokkal szemben is. Egy a közelmúltban megjelent publikációban in vitro PBC-s betegek széruma keresztreakciót adott halidált illetve metilhalidált peptidekkel31. Korai stádiumban sem az MHC II, sem a kostimulátor BB1/B7 (B7-1, B7-2) molekulák expressziója nem fokozódik32. A specifikus T-sejt így aktiváció elmarad. A PDC-E2 korai overexpressziója ugyanakkor jelen van23. Egyes adatok szerint az IL-1 és az IFNγ fokozza a PDC-E2/E3BP expressziót és az MHC II kifejeződést biliaris epithel sejteken33. Továbbá a portális terekben az antigén felismeréshez MHC jelenlétét nem igénylő γ/δ T sejtek számának megnövekedése, illetve a MUC1 apomucinra reagáló citotoxikus T sejtek (CD8+) jelenléte figyelhető meg20. Ezeknek a sejteknek a kezdeti léziók kialakulásában jelentős szerepe lehet. A folyamat progressziójához – nem specifikus módon – már a kezdeti stádiumokban is hozzájárulhat a betegségben megfigyelt fokozott lipid peroxidáció, fokozott oxidatív stressz és a fokozott apoptózis34,35. Érdekes, hogy in vitro cytokinek hatására MHC II kifejeződést mutató humán biliaris epithel sejtek képtelenek voltak CD4 pozitív T sejtek aktiválására36. Az MHC II kifejeződés inkább a gyulladásos folyamat következményének látszik. Mindezek a megfigyelések arra utalnak, hogy –legalábbis a betegség korai stádiumában (amíg nem jelennek meg az epithel sejtek felszínén a kostimulátor BB1/B7 molekulák)– a biliaris epithelium nem játszik jelentős szerepet a T-sejtek specifikus aktiválásában. Nem tudjuk azonban, hogy létezik-e preimmunitás a mitokondriális antigénekkel szemben. Ebben a koncepcióban az anerg autoreaktív T-sejteket a dendritikus sejtek, vagy ami még valószínűbb, az alapvetően nem antigén prezentáló funkciójú B-sejtek aktiválnák.
19
B-sejt autoantitest
EPEÚTI SÉRÜLÉS
T-sejt inflammáció cytotoxicitkus hatás
autoantigének
Molekuláris mimikri
MHC II
endogén vs. exogén Antigén prezentáló sejt
Környezet fertőző ágensek xenobiotikum
2. ábra A primer biliaris cirrhosis feltételezett patogenezise. A bakteriális, virális vagy mesterséges peptidek az immunrendszerrel kapcsolatba kerülve specifikus immunválaszt hoznak létre. Amennyiben az így bejutó antigének keresztreakciót mutatnak saját molekulákkal molekuláris mimikri jöhet létre. A tolerancia megszűntével a saját molekulák az immunrendszer számára antigénként szolgálhatnak, és immáron a trigger nélkül is fenntartják az immunreakciót. Az is lehet, hogy más fajokból származó, a humán fehérjékkel keresztreakciót adó antigének felismerése, majd a saját megfelelő epitopok idegenként való felismerése és így antigénként való prezentálása vezet az autoreaktív T sejtek aktiválódásához, a saját fehérjékkel szembeni tolerancia megszűnéséhez. Lehetséges, hogy a folyamatos bakteriális inzultusnak kitett, a bél lamina propria-jában található B1-sejtek (IgM termelő differenciálatlan B-sejtek) teszik meg az első lépést az autoimmun folyamat 20
elindításában37. Ez megmagyarázná, hogy miért jelentkezik következetesen IgM szint emelkedés PBC-s betegekben, illetve azt is, hogy miért perzisztál a magas IgM szint májtranszplantáció után. Lehetséges persze, hogy ez utóbbi a nyirokcsomókban jelen lévő, a mitokondriális antigénre már érzékeny antigén-prezentáló sejtklónok működésének következménye. Megfigyelték továbbá, hogy a biliaris epithelsejtek és a májsejtek között elhelyezkedő tight junction-ok szerkezete megváltozik38. Ez a paracelluláris permeabilitás megnövekedéséhez vezet, ami módot ad az epesavaknak és különböző antigéneknek az epeutak lumenéből a portális térbe való fokozott beáramlására, így befolyással lehet az immunfolyamatokra.
6.1.3. A klinikai kép, laboratóriumi eltérések és társuló betegségek A PBC jellegzetesen a 30-65 éves korosztály megbetegedése, de beszámoltak 22 és 93 éves korban diagnosztizált esetekről is39. A betegek több mint 90%-a nő, a női predominancia oka nem ismert. Gyakran tünetmentes állapotban kerül felismerésre: a betegek többsége elsőnek nem specifikus tünetekről számol be. Viszketés és gyengeség a leggyakrabban jelentkező tünet, gyengeségről a betegek 3 / 4-e viszketésről, a betegek több mint fele panaszkodik. Az aszimptomatikus betegek csoportjában megjelenő első tüneteket a 4. táblázat szemlélteti: % Klinikai jellemzők Nők aránya Gyengeség Pruritus Hepatomegália Társult autoimmun megbetegedés Splenomegália Hiperpigmentáció Granulómák Xanthomák Xanthalesmák
90-95 70-75 45-60 40-50 15-25 10-15 8-20 15-30 2-8 2-4
% Laboratóriumi eltérések AMA + AMA + (>500) ALP >2 x normál Bilirubin >25 µM Albumin <30 g/l
85-95 20- 30 90-95 5-20 0-3
4. táblázat Az egyes tünetek százalékos előfordulása PBC-s betegekben a diagnózis felállításakor A PBC-s betegekben megfigyelhető viszketés oka nem ismert. Felvetődött az epesavak retenciójának a szerepe. Nem bizonyítható összefüggés a szérum epesav szint
21
és a viszketés között, bár egy amerikai vizsgálatban összefüggést találtak a gyengeség és a pruritus szubjektív súlyossága, illetve az ASAT, az IgG, az ALP és a szérum bilirubin szintek között, ursodeoxikolsav terápia mellett. Gyakran megfigyelhetők excoriációk. A sárgaságtól függetlenül hiperpigmentáció, xanthomák, xanthalesmák lehetnek jelen. A lép és a máj tapinthatósága a betegség progressziójával párhuzamosan egyre gyakrabban figyelhető meg. Jelentkezhet szájszárazság, könnyelválasztási zavar. Beszámoltak a jobb felső hasi kvadráns területére lokalizált diszkomfort érzésről, és néha már az első észleléskor az előrehaladott betegség tüneteivel, mint oesophagus varicositás, hepaticus encephalopathia találjuk szembe magunkat. Irodalmi ritkaságként a késői stádiumban leírtak a réz akkumulációja miatt jelentkező Kayser-Fleischer gyűrűt is40. Az akut cystitis és az aszimptomatikus bakteriuria is gyakrabban fordul elő PBC-s betegekben. A leggyakoribb laboratóriumi eltérés a máj eredetű ALP izoenzim szérumszintjének
jelentős megemelkedése (lásd 4. táblázat). Az ALP -vel
párhuzamosan a γGT és az 5’-nukleotidáz enzimek szérum szintjének emelkedése tapasztalható. A ASAT és a ALAT legtöbbször csak kis mértékben emelkedettek a betegség kezdetekor. A szérum bilirubin szintnek kitüntetett szerepe van, a primer biliaris cirrhosis prognózisát becslő modellek alappillére (Mayo modell)41. A szérum lipidek igen jelentős emelkedése figyelhető meg. A szérum cholesterin akár az 1000 mg/dl-es szintet is meghaladhatja, főleg a xanthomás betegekben. A kezdeti stádiumban a VLDL és LDL emelkedését messze felülmúlja a HDL szint megemelkedése, ez lehet a magyarázata, hogy a magas szérum cholesterin szint ellenére sem az arteriosclerosis, sem az ebből eredő halálozás nem gyakoribb PBC-ben. Hozzájárul ehhez a koronária-betegségre rizikófaktort jelentő lipoprotein a (Lp a) szérumszintjének a betegségben megfigyelhető csökkenése is. A betegség előrehaladott stádiumában az LDL-koleszterin szint jelentős emelkedése és a HDLkoleszterin szint jelentős csökkenése figyelhető meg, illetve megjelenik egy abnormális, a cholestasisra jellemző lipidfrakció, a lipoprotein-X (LP-X) is. Az IgM szint rendszerint magas, nem specifikus eltérés, de jelenléte támogatja a PBC diagnózisát. Beszámoltak a PBC-vel kapcsolatban IgA deficienciáról is.
22
Eltérés lehet a szérum epesavak, a coeruloplasmin, a réz, az α2-makroglobulin, az α1-antitripszin és a cink szérum szintjében, és elsősorban a cirrhosissal összefüggésben az albumin csökken. Szövődmények A kórlefolyást az alapbetegség progressziója, a krónikus intrahepatikus cholestasis következtében kialakult jelenségek és a máj parenchymalis elégtelenségének kialakulási üteme együtt határozzák meg. A késői szövődmények nem specifikusak a PBC-re, tulajdonképpen a cirrhosis, a májelégtelenség tüneteivel kell számolnunk. A portális hipertenzió hamarabb jelentkezik, már a szövettanilag igazolt cirrhotikus stádium megjelenése előtt gyakori. A stádiumok előrehaladtával fokozódik a cholestasis. A lép és gyakrabban a máj a betegség progressziójával párhuzamosan egyre gyakrabban tapintható. Megfigyelhető az icterusos betegekben gyakori steatorrhoea. Ehhez a zsírban oldódó vitaminok malabszorpciója társul, ez azonban csak ritkán ér el olyan fokot, hogy A, K vagy E vitaminok orális bevitele indokolt lenne. Gyakori, bár az UDCA kezelés általánossá válása óta egyre ritkább az osteoporosis kialakulása. Előrehaladott stádiumokban gyakori az oesophagus varicositas és a varixvérzés.
Jelentkezhet
ascites,
hepatikus
encephalopathia
és
a
hypalbuminaemiaval összefüggésben oedema. Terminálisan gyakori a súlyos bakteriális – általában Gram negatív – fertőzés. Társult betegségek A PBC számos autoimmun kórképpel társulhat. Az u.n sicca szindróma42 elemei a betegek felében, háromnegyedében kimutathatók, a tünetek súlyossága, és gyakorisága a betegség lefolyása során nő. Nem ritka a keratoconjunctivitis. A leggyakoribb társult autoimmun betegség a Sjögren szindróma, amely akár a betegek 10-20 %-ában jelen lehet3 . Gyakori a Hashimoto thyroiditis is (5-20 %), a betegek közel 1/3-ában thyreoglobulin ellenes antitest mutatható ki. SLE, rheumatoid arthritis társulását az esetek 3-6 %-ában észlelték3. Scleroderma, Raynaud szindróma a betegek
1-4%-ban
lehet
jelen.
Előfordulhat
IgM
asszociált
membranosus
glomerulonephritis, fokális glomerulonephritis és renális tubuláris acidosis is. Leírták 23
anaemia perniciosa, hemolitikus anaemia, autoimmun thrombocytopenia, coeliakia, colitis ulcerosa, polymyositis, dermatitis herpetiformis, valamint a sarcoidosistól nehezen elkülöníthető interstitiális fibrosis társulását is43,44,45,46. 6.1.4. A primer biliaris cirrhosis terápiája A széleskörű kutatások és klinikai próbálkozások ellenére nem rendelkezünk megfelelő oki kezeléssel, egyetlen eddig ismert gyógyszer sem képes önmagában a betegség gyógyítására47. A terápiás próbálkozásokat három csoportba oszthatjuk: (1) a betegség specifikus, “oki” terápiája, (2) preventív terápia és (3) tüneti kezelés. Végső megoldásként -és ez az eddig ismert egyetlen gyógymód, ami a beteg tényleges gyógyulásához vezet- a májtranszplantációt kell megemlítenünk. Lényeges előrelépés, hogy az újabb közlemények alapján a kezelt betegek várható életkilátásai alig rosszabbak az átlagpopulációhoz képest48. Specifikus, “oki” terápia A betegség kiváltó oka pontosan nem ismert, így a szó szorosan vett értelmében oki terápiáról nem beszélhetünk. A primer biliaris cirrhosis kezelésében új korszakot nyitott az ursodeoxikolsav (UDCA) kezelés bevezetése. Nagy multicentrikus nemzetközi tanulmányok alapján az UDCA kezelés nemcsak a specifikus laboratóriumi eltéréseket és az életminőséget javítja, hanem a gyulladásos folyamatra illetve a szövettani eltérésekre is kedvező hatással van, lassítja a betegség lefolyását és megnöveli a transzplantációra való alkalmasság idejét is49. A napi dózisa 13-15 mg / tskg. Az UDCA choloretikus epesav, terápiás hatása nemcsak az intrahepatikus epesavak transzportjának és biliaris kiválasztásának a fokozásának köszönhető, hanem –ami talán még jelentősebb– az UDCA helyettesíti a májra sokkal toxikusabb hidrofób epesavakat, így csökkenti a pangó epe hepatotoxicitását50. Májsejteken direkt membránstabilizáló hatását is megfigyelték. Egyes adatok szerint immunmoduláns, antiapoptotikus hatása is van51. Kísérletesen csökkenti a lipid peroxidációt és a heat-shock protein expressziót PBC-s betegekben52,53. Próbálkoztak egy hidrofilebb epesavval, a tauro-ursodeoxikolsavval is. Az előzetes eredmények szerint hatékonyabb az UDCA-nál51. Egy másik tanulmány a
24
még jobbnak találta a koleszterin és foszfolipid szekréció stimulálása szempontjából a tauro-hiodeoxikolsavat, amellett hogy a molekula egyáltalán nem volt toxikus a májra54. Az UDCA-ra nem vagy gyengén reagáló betegekben próbálkozások történtek különböző kombinált UDCA alapú kezelésekkel. Prednisolon terápia a májfunkciókat kedvezően befolyásolta55. Alkalmazását mellékhatásai limitálják, az osteoporosist is súlyosbítja. UDCA-val kis dózisú kortikoszteroidot együtt adva kedvező eredményekről számoltak be. Biztatóbb eredményekről számolhatunk be a budesoniddal kapcsolatban, bár a tanulmányok eredményei egyelőre ellentmondóak56. A colchicin és methotrexát terápia UDCA-val kombinálva hatástalan volt, vagy csupán minimális javulást eredményezett57. Ugyanígy eredménytelen volt a cyclosporin-A, azathioprin, chlorambucil, D-penicillinamin és sylimarin terápia is. A közelmúltban egy kis esetszámú tanulmányban bezafibrát adása kedvezőnek bizonyult58. A transzplantáció (OLT-orthotopic liver transplantation) jelentősége PBC-ben A jelenleg rendelkezésre álló egyetlen, a betegség tényleges gyógyulását jelentő terápiás beavatkozás a transzplantáció. Fontos kérdés a túlélés. Az elmúlt évtizedben jelentős fejlődés figyelhető meg. A módszer biztonságos, a túlélés lényegesen jobb, mint az a transzplantáció nélkül várható lenne. Az 1980-as évek végén az 1, és 5 éves túlélés 71 ill. 66 %-os volt, 2001-ben 83, 78 és 67 %-os 1, 5 és 10 éves túlélésről számolhattak be a
kiforrottabb
műtéti
technikának
és
effektívebb
gyógyszeres
kezelésnek
köszönhetően59. Fontos kérdés, hogy visszatér-e a betegség a transzplantáció után. A kérdés megválaszolása nem könnyű, vannak adatok, amelyek a PBC-re specifikus eltérések és így a betegség visszatérése mellett szólnak, ugyanakkor tény, hogy a graft versus host (GVH) betegségben jelen lévő elváltozások nagyfokú hasonlóságot mutatnak a PBC-s léziókkal. Igencsak nehezen -néha egyáltalán nem- dönthető el teljes bizonyossággal, hogy adott esetben a rejekció részeként figyeljük-e meg a “vanishing bile duct” szindrómát, vagy a homológia miatt nagyon hasonló PBC visszatértével állunk-e szemben60. 25
Tüneti terápia A betegségben megfigyelhető pruritus oka nem ismert61. Felvetették az epesavak oki szerepét, de az erre vonatkozó klinikai megfigyelések ellentmondásosak. Tény azonban, hogy a cholestyramin, egy epesav kötő gyanta volt az első gyógyszer, amely enyhített a betegek kínzó viszketésén. Felvetődött az endogén opioidok szerepe is, az opiátantagonista naloxon egyes adatok szerint hatásosnak tűnt a pruritus kezelésében. De történtek próbálkozások fenobarbitállal, flumecinollal és rifampicinnel is. Az UDCA is megfigyelték kedvező hatását a pruritusra. Próbálkoztak továbbá fototerápiával, illetve a késői stádiumokban, a nem reagáló esetekben plazmaferezissel. A PBC-s betegek által gyakran panaszolt tünet a fáradtság61. Swain és Maric a cholestatikus patkányokon végzett kísérleteiben a corticotrop-releasing hormon szekréciójának csökkenését, és ezzel párhuzamosan az állatok viselkedésének a megváltozását észlelte62. Így felvetődik, hogy a corticotrop-releasing hormon szekréciójának
stimulációjával
a
betegek
fáradékonysága
enyhíthető
lenne.
Kísérletesen, cholestatikus állatokban a “fáradtságot”, az aktivitáscsökkenést szerotonin receptor antagonista adásával sikerült kivédeni63. Lehetséges, hogy ezeknek a molekuláknak a jövőben a humán terápiában is szerepe lehet.
26
6.2. Hepatikus osteopathia primer biliaris cirrhosisban Irodalmi adatok szerint PBC-ban gyakori szövődmény az osteoporosis (OP), amely az életkortól függetlenül és a hiperbilirubinaemia klinikai jelei nélkül is kialakulhat64. A hepatikus osteopathián eredetileg a kezeletlen betegekben megfigyelhető osteomalácia és OP együttesét értettük, azaz osteoporomaláciát. A PBC-ben megfigyelhető csont ásványianyag csökkenés a mai álláspontunk szerint nem osteomalácia, hanem OP. A korábban gyakorinak tartott osteomalácia az UDCA kezelés bevezetése óta ritkán mutatható ki65. A különböző tanulmányokban a betegek 20-40 %-ában diagnosztizáltak OP-t. Újabb felmérések szerint kb. 10-20 %-os előfordulást észleltek, valószínűleg a korai diagnózisnak és talán a kezelésnek is köszönhetően, kétségtelen ugyanakkor, hogy ezek a betegek fiatalabbak voltak66,67. A PBC-ben kialakuló hepatogen OP patomechanizmusa pontos részleteit tekintve nem ismert. Krónikus májbetegségekben a csontok épségére számos tényező van kedvezőtlen hatással, mint például a hiányos táplálkozás, a malabszorpció, a hormonális tényezők megváltozása vagy az immobilizáció. Korábbi tanulmányok alapján felvetődött, hogy a cholestaticus körülmények miatt a bélből hiányzó epesavak, illetve az emiatt fennálló kalcium és D vitamin malabszorpció, és másodlagos hiperparathyreosis okozná a szkeletális rendszer elváltozásait,68,69. Az irodalomban a tanulmányok nagy részében a megfelelő kalcium és D-vitamin bevitel mellett normális szérum kalcium és D-vitamin szinteket találtak70,71. Vizsgálták az osteocalcin szempontjából fontos K vitamin hiány lehetséges szerepét is, és megállapították, hogy sok betegben már a K vitamin hiány megjelenése előtt diagnosztizálható az OP. Megfigyelték a csont-remodelling megváltozását is. A vizsgálatok szerint precirrhotikus stádiumú betegekre elsősorban a csontépítés csökkenése, az alacsony csontturnover jellemző. A tanulmányok egy része a nem megfelelő osteoblast funkcióra helyezi a hangsúlyt72. Mások a fokozott csontturnover73,74 elsődlegességét hangoztatják. Ez fokozott csontképzéssel és resorpcióval jár.
27
A csökkent csontképzés szerepére utal, hogy munkacsoportunk egyik előző tanulmányában az osteoblast funkciót jelző osteocalcin szérumszintjét nem-alkoholos idült májbetegekben és PBC-s betegekben súlyos cholestasis esetén alacsonyabbnak találta75. Egyre több adat utal arra, hogy a cytokinek befolyásolják a csontanyagcserét. A proinflammatorikus cytokinek közül az IL-1 β, a TNF-α és az IL-6 fokozzák az osteoclastok aktiválását és osztódását, ezúton az OP irányába hatnak76,77. Ezzel összhangban van, hogy PBC-s betegekben emelkedett szérum IL-6 és TNF-α szintről számoltak be78. Nem ismert azonban, hogy lokálisan milyen a cytokinek koncentrációja és hatása. A kérdés bonyolultságát mutatja, hogy OP-s betegekből és kontroll személyekből származó osteoblast sejtek in vitro cytokin produkciójában nem találtak különbséget79. Még sok vizsgálat szükséges ahhoz, hogy a cytokinek szerepét pontosan tisztázni lehessen az OP kialakulásában. A májbetegség közvetett vagy közvetlen szerepére utal, hogy az OP gyakorisága a vizsgálatok szerint összefüggést mutat a betegség fennállásának idejével illetve a májbetegség stádiumával. In vitro vizsgálatokban a nem konjugált hiperbilirubinaemia gátolja az osteoblastok osztódását80. A cholestasis súlyosságát mutató bilirubinnak az OP patogenezisében játszott szerepéről ellentmondó közlések ismertek81,82. Egyes vizsgálatok szerint a májszövet károsodására utaló szérum transzamináz szintek és az OP kialakulásának valószínűsége között összefüggés van. Fontos kérdés, hogy a PBC-s betegekben előforduló OP mennyiben tartható az alapbetegség következményének és mennyiben lehet szó az idiopathias vagy menopausás OP-val való véletlenszerű együttes előfordulásról. További kérdés, hogy a májbetegség minden betegben vagy csak az OP-ra hajlamos betegekben fokozza-e a csontvesztés mértékét. Az OP kialakulásában egyre fontosabbnak tűnik örökletes, genetikai tényezők szerepe. A postmenopausás OP genetikai hátterének vizsgálata az utóbbi évek kutatásainak egyik slágertémája. Számtalan „candidate” gén lehetséges szerepét vizsgálták. PBC-ben eddig az OP-val kapcsolatban a D-vitamin receptor (VDR) és a
28
kollagén Iα1 gének szerepét vizsgálták. Egy amerikai tanulmányban a baT VDR haplotípus az OP kialakulásának veszélyét növelte81. Ezt az eredményt azonban a későbbi tanulmányokban nem sikerült megerősíteni. Egy magyar tanulmányban a BB allél esetén tendenciaszerűen alacsonyabb csontdenzitásértékeket mértek, míg spanyol adatok szerint a VDR gén polimorfizmusa nem volt kapcsolatban az OP valószínűségével82,83. Ez utóbbi vizsgálatban a kollagén Iα1 gén s allélje csökkent csont-ásványianyag tartalommal járt együtt. Az osteoporosis kezelése PBC-ben A PBC-ben bázisterápiának számít az ursodeoxikolsav kezelés. A gyógyszer nem csak a laboratóriumi adatokat és az életminőséget javítja, hanem lassítja a betegség progresszióját is47. Közvetett módon az OP kialakulását is lassíthatja, erre utal, hogy az újabb vizsgálatokban PBC-ben az OP gyakorisága csökken. Az osteomalácia meggyógyítható, de az OP nem. A terápia és a prevenció alappillére a D-vitamin és a kalcium szérumszintjének monitorozása és a szükség szerinti pótlás84. Újabb tanulmányok alapján aktív D vitamin metabolitok eredményesek voltak a post-transzplantációs OP terápiájában is. Calcitonin, illetve fluorid terápiának semmilyen kedvező hatása nem volt. Ösztrogének
adása
a
mellékhatások
(közöttük
a
cholestasis)
miatt
ellentmondásos, több vizsgálatban adásuk kedvező volt PBC-s betegekben85. A hatásmechanizmus talán részben az IL-6 termelés gátlásán keresztül valósul meg, más elképzelések szerint fontosabb az osteoclastok IL-1-re adott válaszának gátlása86. A mai ismereteink alapján a már kialakult OP kezelésében leginkább a biszfoszfonátok alkalmazhatók. Egy kétéves utánkövetéses vizsgálatban az etidronát hatásosnak bizonyult a további csontvesztés megelőzése szempontjából87. Az alendronát a tanulmányok alapján még hatékonyabbnak tűnik84. Sikerrel alkalmazták e szereket szteroid terápia mellett és transzplantáció után is.
29
7. Módszerek 7.1. Genetikai vizsgáló eljárások (polimorfizmus vizsgálatok) A DNS-t perifériás EDTA-val antikoagulált vérből DNS kit segítségével izoláltuk a gyártó által megadott módon (Promega, Wizard, Genomic DNA Purification Kit, Madison, WI, USA). Az összes PCR reakcióhoz Hybaid Express thermocycler-t (Teddington, Middlesex, UK) használtunk. Az amplifikáció után a PCR produktumokat 2 %-os agaróz gélen szeparáltuk 120 V-on, 30 percig. Ezt követően ethidium bromid festést alkalmaztunk.
7.1.1. D vitamin receptor gén BSM I A D vitamin receptor gén BsmI polimorfizmusát korábban leírt módszer szerint azonosítottuk88 (primer VitDs: 5′ CAA CCA AGA CTA CAA GTA CCG CGT 3’ VitDa :5’:AAC CAG CGG GAA GAG GTC AAG GG 3’). A PCR reakcióhoz 40 µL a végső térfogatban 4 µL 10-szeres Mg mentes puffert, 1 µL dNTP-t (10mM), 4 µL 25 mM MgCl2-t, 10 µL DNS-t, 1-1 µL primer (Ds, Da :50 µM végkoncentrációban) és 19 µL 2D PCR water-t használtunk. Hot start után 8µL PCR water-t, 1µL 10-szeres Mg mentes puffert és 9,6 µL Taq polimerázt (Promega, Madison, USA) adtunk hozzá a reakcióhoz. A DNS-t 95°C-on 3 percig denaturáltuk (hold 85°C). Az amplifikáció három lépésben történt. Először 1 ciklusban (8 ciklus – 72°C 3 percig, 94°C 30 másodpercig; majd 72°C 1 perc 45 másodpercig, 94°C 30 másodpercig, 71°C 1perc 45 másodpercig, 94°C 30 másodpercig, 40°C 1perc 45 másodpercig, 94°C 30 másodpercig, 69°C 1 perc 45 másodpercig, 94°C 30 másodpercig, 68°C 1 perc 45 másodpercig, 94°C 30 másodpercig), ezután 23 ciklusban (68°C 1 perc 45 másodpercig, 94°C 30 másodpercig), végül 8 ciklusban (72°C 3 percig, 94°C 30 másodpercig). A végső extenziót 72°C-on 15 percig végeztük. A DNS-t BsmI restrikciós enzimmel emésztettük 65°C-on 90 percig (BsmI, Hybaid, Teddington, UK). Az alléleket a nemzetközi nomenklatúrának megfelelően a BsmI restrikciós hely hiánya, B allél (825 bp) illetve jelenlétét, b allél (650 + 175 bp) alapján neveztük el. Minden BB genotípust ismételt emésztésnek vetettünk alá, hogy a bb, Bb genotípusok biztonsággal elkülöníthetők legyenek.
30
7.1.2. Ösztrogén receptor alfa gén Xba I illetve Pvu II Az ösztrogén receptor alfa gén XbaI és PvuII polimorfizmus meghatározása PCR reakcióval történt. A meghatározáshoz forward: 5’ CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TCC 3’ és reverz: 5’ TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA 3’ primereket használtuk. A PCR-hoz 40 µL végső térfogatban 4 µL 10-szeres Mg mentes puffert, 1 µL dNTP-t (10mM), 4 µL 25 mM MgCl2-t, 10 µL DNS-t, 1-1 µL primert (R,F :50 µM végső koncentráció) és 19 µL 2D PCR water-t használtunk. Hot start után 8µL PCR water-t , 1µL 10-szeres Mg mentes puffert és 9,6 µL Taq polimerázt (Promega, Madison, USA) adtunk hozzá a reakcióhoz. A DNS-t 95°C-on 3 percig denaturáltuk (hold 85°C), majd a DNS-t 35 ciklusban (94°C 30 másodpercig, 62°C 20 másodpercig és 72°C 90 másodpercig) amplifikáltuk. A végső extenziót 72°C-on 6 percig végeztük. Az emésztéshez a PvuII, XbaI (Hybaid, Teddington, UK) enzimeket használtuk 37°C-on 90 percig. A következő genotípusokat azonosítottuk a restrikciós hely hiánya illetve jelenléte alapján: PP, Pp, pp (PvuII) és XX, Xx, xx (XbaI), a nagy betű a restrikciós hely hiányát mutatja.
7.1.3. Interleukin 1-receptor antagonista gén Az interleukin 1 receptor antagonista gén 86bp-os tandem repeat polimorfizmusát korábbiakban ismertetett módszer szerint végeztük89. A primerek, forward: 5′ CTC AGC AAC ACT CCT AT 3’ és reverz: 5’ TCC TGG TCT GCA GGT AA 3’. A PCR-hoz 20 µ L végső térfogatban 2 µL 10-szeres Mg mentes puffert, 0,4 µL dNTP-t (10mM), 1,5 µL 25 mM MgCl2 -t, 3 µL DNS-t, 1-1 µL primer-t (50 µM végső koncentráció), 0,2 µL Taq polimerázt (Promega, Madison, USA) és 10,9 µL 2D PCR water-t használtunk. A DNS-t 95°C 5 percig denaturáltuk, majd az amplifikáció következett 5 ciklusban (95°C, 30 másodpercig, 60°C, 120 másodpercig, 72°C, 60 másodpercig), és 25 ciklusban (95°C, 30 másodpercig, 60°C, 60 másodpercig, 72°C, 60 másodpercig). A végső extenziót 72°C-on 5 percig végeztük. Az alléleket a nemzetközi nomenklatúra szerint neveztük el: allele 1 (A1), 410 bp- 86bp négyszer; allele 2 (A2), 240 bp- 86bp kétszer; allele 3 (A3), 500 bp86 bp ötször; allele 4 (A4), 325 bp- 86 bp háromszor; allele 5 (A5), 595 bp- 86bp hatszor ismétlődik. 31
7.2. Osteodenzitometriai módszerek A csont ásványianyag-tartalom meghatározására évente került sor. A lumbalis gerinc (L2-4) és a bal femur nyak (FN) denzitását (BMD, g/cm2) kettős röntgenfoton abszorpciometriával határoztuk meg (XR26, Norland illetve DPX-L, Lunar Corp., Madison, WI, USA), a radius harmadolópontjának ásványianyag-tartalmát (BMC, g/cm) egyes-foton abszorpciometriával (NK364, Gamma) mértük. Az eredményeket t scoreban (mért BMD különbsége a nemben illesztett fiatal felnőtt egészséges populációhoz képest standard deviációban kifejezve) és z scoreban (mért BMD különbsége a korban és nemben illesztett egészséges populációhoz képest standard deviációban kifejezve) adtuk meg. Az osteoporosis diagnózisát a World Health Organization (WHO) kritériumai szerint állapítottuk meg (t score <-2,5), míg osteopeniának a –1-nél kisebb, de -2,5-nél nagyobb t scoret tartottuk90.
7.3. Vizelet keresztkötés meghatározás (piridinolin/kreatinin, deoxipiridinolin/kreatinin) A
vizelet
piridinolin/kreatinin
(pyr/c)
és
deoxipiridinolin/kreatinin
(D-pyr/c)
meghatározást HPLC-vel végeztünk (Bio-Rad HPLC system, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Németország). A mérésekhez reggeli első vizelet szükséges. A mintagyűjtés során a betegeket megkértük, hogy reggel 7 és 10 óra között gyűjtsék vizeletüket. A keresztkötéssel párhuzamosan a vizelet kreatinin mennyiségét is meghatározzuk, az eredményeket ezután keresztkötés és kreatinin hányadosként adjuk meg. Ez az érték nagyon jól jellemzi a 24 órás vizelet keresztkötés ürítést. A meghatározás rövid menete a következő: először 150 µl vizeletmintát pipettáztunk össze 150 µl 12N HCl-lel. Majd a mintákat 16 órán keresztül 100 °C-on hidrolizáltuk. Ugyanígy jártunk el a kontroll és standard mintákkal is. Ezután a mintákat a gyártó által megadott módon előkészíttettük (Wash/Conditioning Reagent, Elution Reagent, BioRad). A HPLC során az alábbi beállításokat használtuk. A columnar heather hőmérsékletét 60 °C-ra állítottuk, a fluoreszcens detektor excitációs hullámhosszát 295 az emissziós hullámhosszát 400 nm-re állítottuk be, míg a Mobil Phase pumpa átfolyási sebességét 0,5ml/percre. A pyr/c és D-pyr/c hányados meghatározásának előnye, hogy
32
mivel a piridinolin (1,r’) kizárólag a csontból származhat, így a számított értékből a csontspecifikus kollagén metabolizmusra lehet következtetni. A májbetegség, a fibrosis és cirrhosis miatt megváltozott kollagén anyagcsere eltérés nem zavarja a módszert.
7.4. Plazma endothelin-1 meghatározás Az ET-1 szintet reggel 8 és 10 óra között éhgyomorra levett, alvadásában EDTA-val gátolt vérmintákban RIA módszer segítségével határoztuk meg. A meghatározás menete: a plazma mintákat az assay előtt extraháltuk. 2 ml plazmát és 3 ml extrakciós oldatot (aceton : 1 M HCL : víz – 40 : 1 : 5) összekevertünk. 20 percig centrifugáltuk 3000 rpm-mel 2-8 °C között. A felülúszót prolipropilén csőbe leöntöttük. A mintákat nitrogén alatt beszárítottuk. A csapadékot 250 µl assay pufferban feloldottuk és ezt használtuk a meghatározáshoz. A RIA-hoz nyúlban termelt poliklonális antitestet (Peninsula Lab. Belmont, CA, USA) használtunk. Standardként a Sigma-Aldrich Co. ET-1-e szolgált. Intraassay CV: 4,2%, interassay CV: 8,1%. Az eredményt pg / ml-ben adtuk meg.
7.5. Dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) meghatározás 91 A DPP IV aktivitás meghatározása Rákoczi és mtsai. módszerének szérum mintákhoz
módosított változatával történt. A méréseket 96 lyukú microplate segítségével végeztük. 15 µl szérumot és 185 µl 4 mmol/l szubsztrátot (Gly-Pro-p-nitroanilid [Gly-Pro-PNA], Bachem, Torrance, USA) tartalmazó puffert (0,1 % Triton-X100 Ca2+ / Mg2+ mentes PBS-ben, pH 6.95) pipettáztunk a lemez minden egyes tartályába. Az enzimaktivitást fotometriás leolvasó (Multiskan Plus MK II, Labsystem, Finnország) segítségével határoztuk meg 405 nm-en, 25 °C -on, 30 percig. Az enzim aktivitást a kinetikus mérésekből számoltuk és U/l-ben fejeztük ki (1U= 1 µmol/perc Gly-Pro-PNA hidrolízis).
33
7.6. AMA, D vitamin meghatározás és rutin laboratóriumi vizsgálatok Az AMA M2 meghatározás immunfluoreszcens módszerrel történt. A 25-OH-D3 szintet házi RIA módszerrel határoztuk meg (60-180 nmol/l normál tartomány), míg az 1,25OH-D3 szintet Gamma-B 1,25-dihydroxy Vitamin D RIA Kit-tel (IDS, Bolton, UK). Az aszpartát-aminotranszferáz (ASAT), alanin-aminotranszferáz (ALAT), gamma-glutamil-transzferáz
(GGT),
alkalikus
foszfatáz
(ALP)
aktivitást
(enzimaktivitások U/L), szérum bilirubin (µmol/L), albumin (g/L) kálcium (mmol/L), foszfor (mmol/L) koncentrációt Olympus AU600 (Shizouka, Japán) készülékkel 37 °Con mértük. A normál referencia tartományok a nemzetközileg elfogadott normál tartományt jelentik.
34
8. Eredmények 8.1. Hepatikus osteopathia vizsgálata PBC-ben 8.1.1. Genetikai tényezők szerepe az osteoporosis kialakulásában, kapcsolatuk az alapbetegséggel (polimorfizmus vizsgálatok primer biliaris cirrhosisban: D vitamin receptor gén BSM I, ösztrogén receptor alfa gén Xba I és Pvu II, interleukin-1-receptor antagonista gén) Régóta ismert, hogy a csont-ásványianyag tartalom (BMD) legalább is részben genetikailag meghatározott. Epidemiológiai vizsgálatok alapján genetikai faktorok akár 70-80 %-ban meghatározhatják a BMD variabilitását92. Ikervizsgálatok alapján a BMD poligénes szabályozása valószínűsíthető. Számos lehetséges u.n. „candidate” gén szerepét vizsgálták. Először Morrison és mtsai88 számoltak be a D-vitamin receptor (VDR) génpolimorfizmus és a BMD kapcsolatáról. A B allél csökkent BMD-vel járt együtt. Ezt az eredeti megfigyelést számos vizsgálat megerősítette93,94, egyes tanulmányok azonban nem találták a kapcsolatot95. Az is ismert, hogy VDR polimorfizmusának szerepe lehet a hormonpótló terápia szkeletális rendszerre kifejtett hatására96. Primer biliaris cirrhosisban eddig egy tanulmány talált kapcsolatot a VDR b polimorfizmusa és az osteoporosis (OP) között, két további tanulmányban a gén BB illetve Bb polimorfizmusa és a betegség között találtak a kapcsolatot81,82,83. A tanulmányok egymásnak ellentmondó eredményei megerősítik azt az elképzelést, hogy a genetikai tényezőket földrajzi illetve rasszbeli különbségek jelentősen befolyásolhatják. Az ösztrogén receptor alfa (ER-α) gén szerepét a postmenopausás OP kialakulásában szintén számos tanulmány vizsgálta97,98,99. A gén Pvu II, Xba I illetve (TA)n promoter repeat polimorfizmusai fontosnak tűnnek a BMD szabályozása szempontjából. Japán postmenopausás nőkben a gén PvuII polimorfizmusa és a gerinc BMD között szoros kapcsolatot mutattak ki97. Px haplotípus csökkent BMD-vel volt kapcsolatban. Kaukázusi eredet esetén az összefüggés nem volt ilyen egyértelmű, ellentmondásos közlések ismertek a Px haplotípus és a PP genotípus szerepéről98,99,100. További érdekes megfigyelés, hogy állatkísérletben ER-α knockout egerekben 20-25 %kal alacsonyabb BMD-t lehetett mérni a „vad” típushoz képest101. PBC-ben mindeddig nem vizsgálták az ER-α gén szerepét. Az interleukin-1 receptor antagonista (IL-1Ra) génje a 2q13 kromoszómán helyezkedik el. Az IL-1α és β kompetitív antagonistája. Kísérletes modellben teljesen
35
képes gátolni az IL-1 csontresorpciót fokozó hatását102. OP-s nőbetegekben magasabb IL-1/IL-1Ra arányt figyeltek meg az egészséges kontrollhoz képest. A közelmúltban az is ismertté vált, hogy kapcsolat mutatható ki az IL-1 receptor antagonista gén (IL-1RN) variable number tandem repeat polimorfizmusa (VNTR) és a gerinc csontásványianyagtartalmának csökkenése között103,104. Továbbá kapcsolatot találtak az A2 polimorfizmus gyakorisága és egyes autoimmun betegségek között105,106. Egy közlemény ismert PBC-ben. A gén A1 polimorfizmusa gyakoribb volt PBC-s betegekben107. Tanulmányunkban célul tűztük ki a VDR gén BsmI, ER-α gén PvuII és XbaI illetve az IL-1RN VNTR polimorfizmusok vizsgálatát magyar PBC-s nőbetegekben. Vizsgáltuk továbbá, hogy kimutatható-e kapcsolat a betegek klinikai-laboratóriumi paraméterei
és
a
BMD
között,
továbbá
hogy
kimutatható-e
kapcsolat
a
génpolimorfizmusok és a betegség illetve a BMD között. Betegek: 33 magyar PBC-s nőbeteget vontunk be a vizsgálatba (életkor 54,7 ± 11,7 év). A diagnózis a jellegzetes klinikai tüneteken és laboratóriumi eltéréseken, az extrahepatikus epeelfolyási akadály kizárásán, az antimitokondrialis antitest (AMA M2) pozitivitáson, valamint a hisztológiai leleten alapult. A betegek klinikai adatait a 5. táblázatban foglaltuk össze. A betegség kezdetének az első dokumentált laboratóriumi eltérés időpontját tekintettük. A betegség tartamának a kezdettől a BMD meghatározásig eltelt időt tekintettük. A betegek a bázisterápiának számító ursodeoxikolsav (UDCA) kezelés mellett egységesen napi 1000 mg kalciumot és egyénileg napi 1000-3000 NEnek megfelelő D3 vitamint kaptak tabletta formájában. A betegek 83 % (27/33) a menopausában volt. 82 korban illesztett egészséges nem osteoporotikus nő alkotta a kontroll csoportot (életkor 54,1 ± 4,7év, menopausa: 71/82, 86 %). Minden betegben meghatároztuk a VDR BsmI, ER-α PvuII és XbaI illetve az IL-1RN VNTR genotípusokat illetve a BMD-t. A betegekben meghatároztuk a májenzimeket, az albumint, a szérum bilirubint és a 25–OH–D3 vitamin szintet. OP-t diagnosztizáltunk, ha a WHO által megállapított t-score kritérium (t-score<-2,5) bármely mért helyen (gerinc vagy femur) fennállt. Statisztikai analízis: Shapiro Wilk’s tesztet végeztünk a normalitás vizsgálatára. Az OP-s és a nem OP-s betegek klinikai és laboratóriumi adatait d-teszttel hasonlítottuk össze. A genotípus illetve allél frekvenciákat a betegek és a kontroll csoport között chi-próbával hasonlítottuk össze. A laboratóriumi adatok és a BMD összehasonlítására Spearmann SRO-t végeztünk, míg a BMD és a genotípusok közötti kapcsolatot ANOVA segítségével vizsgáltuk. A statisztikai analízist a Statistica for Windows 5.0 (StatSoft Inc., OK, USA)program segítségével végeztük. 36
Eredmények: OP-t 14 betegben (42,4 %) diagnosztizáltunk. Az OP-s betegek idősebbek voltak (58 vs. 52 év, p<0,01), a májbetegség fennállása is hosszabb volt (9,5 vs. 5,4 év, p=0,01). Az OP esetén gyakoribb volt a csonttörés (6/14 vs. 1/19, p<0,01). A femur és a gerinc BMD értékek a betegekben egymással jól korreláltak (r=0,88, p<0,001), ugyanakkor a laboratóriumi paraméterek (bilirubin, ASAT, ALAT, ALP, GGT) és a BMD között nem találtunk kapcsolatot. A VDR Bsm I, ER-α PvuII és XbaI genotípusokat a 7. táblázatban foglaltuk össze, míg az IL-1RN genotípusokat a 8. táblázat tartalmazza. A VDR BsmI genotípusok a kontrollokban megegyeztek az ismert irodalmi adatokkal bb: 21,9%, Bb: 50 %, BB: 28,1 % (allél frekvencia B: 46,9 %, b: 53,1 %). PBC-s betegekben a BB genotípust gyakoribbnak találtuk a kontrollhoz képest (pBB= 0,01, illetve pBallél= 0,001). A B allél a PBC-s betegek 74,2 %-ában fordult elő. Az ösztrogén receptor alfa gén PvuII (p= 0,03) és XbaI (p= 0,003) polimorfizmusok előfordulása szintén különbözött a betegekben és a kontroll csoportban. PBC-ben gyakoribb volt a PvuII Pp és XbaI Xx genotípusok jelenléte. Az IL-1RN VNTR polimorfizmusa nem különbözött a PBC-s betegek és a kontroll csoport között, tendenciaszerűen gyakoribb volt az A1 allél a betegek között. A4 illetve A5 alléleket sem a betegekben sem a kontrollokban nem találtunk. Nem találtunk továbbá kapcsolatot a csont ásványianyag-tartalom (BMD, z és t score) és a génpolimorfizmusok között. A VDR gén BsmI B allélja esetén a betegekben a BMD tendenciaszerűen alacsonyabb volt. Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy gyakoribbnak találtuk a VDR BsmI BB genotípust és B allélt PBC-s betegekben. Elsőként számoltunk be ER-α gén XbaI, PvuII polimorfizmusokról PBC-ben. Gyakoribbnak találtuk az XbaI Xx és a PvuII Pp genotípusokat a magyar betegekben, míg a betegek IL-1RN VNTR polimorfizmusa nem különbözött a kontroll csoporttól. Nem találtunk kapcsolatot a vizsgált polimorfizmusok és a csont ásványianyag-tartalom között, így nem valószínű, hogy ezeknek a polimorfizmusoknak jelentős szerepe van a BMD meghatározásában PBC-ben. További vizsgálatok szükségesek annak eldöntésére, hogy az ER-α PvuII, XbaI és VDR BsmI génpolimorfizmusoknak esetleg kapcsolt géneknek szerepe lehet-e a betegség patogenezisében.
37
összesen
osteoporosis
osteoporosis nélkül
N
33
14
19
54,7 ± 11,7
58 ± 10*
52 ± 12*
Betegség fennállása (év)
7,8 ± 5,7
9,5 ± 5,1*
5,4 ± 3,3*
szérum bilirubin (µmol/l)
31,4 ± 75,6
49,1 ± 112,8
18,5 ± 23,7
ASAT (U/l)
41,2 ± 23,9
44,9 ± 27,0
38,5 ± 21,7
ALAT (U/l)
42,3 ± 26,6
45,6 ± 33,6
39,9 ± 20,5
GGT (U/l)
166,6 ± 146,6
162,7 ± 181,8
169,6 ± 117,9
ALP (U/l)
496,2 ± 227,3
517,7 ± 214,8
480,4 ± 240,6
Albumin (g/L)
43,4 ± 4,2
42,8 ± 4,5
44,0 ± 4,2
Ca (mmol/l)
2,44 ± 0,14
2,45 ± 0,14
2,43 ± 0,14
P (mmol/l)
1,11 ± 0,14
1,12 ± 0,14
1,11 ± 0,14
25-OH-D3 vitamin (nmol/l)
151,5 ± 61,6
131,5 ± 40,2
183,6 ± 72,5
életkor (év)
5. táblázat A PBC-s betegek klinikai és laboratóriumi adatai (értékek: átlag ± SD, *p=0.01 – osteoporosis vs. osteoporosis nélkül)
PBC kontroll
TS
TM
BMD L2-4
z-score
t-score
BMD FN
z-score
t-score
62,1 ±
160,4 ±
0,937 ±
-0,681 ±
-2,014 ±
0,789±
-0,530 ±
-1,720 ±
13,9
5,7
0,261
1,676
2,387
0,227
1,679
2,202
69,7 ±
161,0 ±
1,085 ±
-0,160 ±
-0,952 ±
0,901 ±
0,046 ±
-0,665 ±
12,29*
6,4
0,129*
0,129
1,068*
0,134*
1,082#
0,134*
6. táblázat A gerinc (L2-4) és a bal femur nyak (FN) ásványianyag tartalma PBC-os betegekben és a kontroll csoportban (átlag ± SD, testsúly (TS): kg, testmagasság (TM): cm, BMD g/cm2, *p<0,01,#p=0,04 PBC vs. kontroll)
38
PBC
kontroll
/n (%)/
/n (%)/
BB
19 (57,5%)
23 (28,1%)
Bb
11 (33,3%)
41 (50,0%)
p=0,01
bb
3 (9,1 %)
18 (21,9%)
(chi2=9,19)
PP
6 (18,2 %)
26 (31,7%)
Pp
25 (75,6 %)
40 (48,8%)
p=0,03
pp
2 (6,2 %)
16 (19,5 %)
(chi2=7,29)
XX
3 (9,1 %)
15 (18,3%)
Xx
30 (90,9%)
49 (59,8%)
p=0,003
xx
0
18 (21,9%)
(chi2=11,84)
P
VDR BsmI
ER-α PvuII
ER-α XbaI
7. táblázat A D vitamin receptor (VDR) gén BsmI és az ösztrogén receptor alfa (ER-α) gén PvuII és XbaI polimorfizmusa PBC-s betegekben és kontroll egyénekben (chi-próba )
Genotípus /n (%)/ A1A1 PBC
A1A2
A2A2
20 (60,6%) 10 (30,2 %) 2 (6,1%) 1 (3,1%)
Kontroll 41 (50,0%) 28 (34,1%) 5 (6%) p
A1A3 7 (8,5%)
NS
Allél frekvencia /n (%)/ A2A3
A3A3
A1
A2
0
0
52 (78,8%) 13 (19,7%) 1 (1,5%)
1 (1,4%)
0
117 (71,3%) 39 (23,8%) 8 (4,9%) NS
8. táblázat Interleukin-1 receptor antagonista gén (IL-1RN) VNTR polimorfizmusa PBCben és a kontroll csoportban (NS: nem szignifikáns, chi-próba)
39
A3
1,5 1 0,5
BB Bb bb
0 -0,5 -1 -1,5
BMD
Z-score
BMD
L2-4
Z-score FN
3. ábra A D vitamin receptor (VDR) gén BsmI polimorfizmus és a csont-ásványianyag tartalom (BMD) kapcsolata PBC-s betegekben (gerinc: L2-4, bal femur nyak: FN, p= nem szignifikáns, Spearmann korreláció)
40
8.1.2. A hepatikus osteopathia természetes lefolyása (A csont ásványianyagtartalom utánkövetéses vizsgálata Ca és D-vitamin szupplementációban részesülő postmenopausás PBC-s betegekben) A primer biliaris cirrhosis (PBC) egy krónikus, az intrahepatikus kis epeutak progresszív gyulladásával, cholestasissal járó ismeretlen eredetű májbetegség, amely az esetek többségében középkorú nőket érint. A betegség gyakori szövődménye az osteoporosis (OP), amely az életkortól függetlenül, fogamzóképes korban is és a hiperbilirubinaemia nélkül is kialakulhat64. Az OP a PBC-vel járó morbiditás jelentős hányadáért felelős, míg a korábban gyakorinak tartott osteomalácia ritkán mutatható ki68,108. Krónikus májbetegségekben a csontok épségére számos tényező van kedvezőtlen hatással, mint például a hiányos táplálkozás, a hormonális tényezők megváltozása, az immobilizáció. Felvetették, hogy a cholestasis miatt a bélből hiányzó epesavak, illetve az emiatt fennálló kalcium és D vitamin malabszorpció és/vagy a másodlagos hiperparathyreosis okozná részben a szkeletális rendszer elváltozásait69. Az intenzív kutatások ellenére a PBC-ben kialakuló OP patomechanizmusa részleteiben nem tisztázott. Ellentmondásos közlések ismertek a csontújdonképzés szerepéről, fokozott, illetve csökkent csontturnoverről (csontképzés és resorptió) egyaránt beszámoltak108. Az osteomalácia meggyógyítható, azonban mindeddig nem ismert egyetlen olyan kezelési séma sem, amely a betegséggel együtt járó OP kialakulását biztosan meggátolná. Aktív D-vitamin kezelés, kalcium pótlás, ösztrogén és etidronát, sőt a betegségben bázisterápiának számító ursodeoxikolsav (UDCA) a klinikai és kísérletes vizsgálatok szerint többé-kevésbé kedvező hatással van az OP-ra. A kezelés a folyamatot különböző mértékben lassította109,110. Ebben a munkánkban a metabolikus eredetű csontvesztés súlyosságát és progresszióját vizsgálatuk kálcium és D vitamin szupplementációban részesülő postmenopausás PBC-s nőbetegekben. Vizsgáltuk a csontresorpció mértékére utaló vizelet piridinolin/kreatinin (pyr/c) és deoxipiridinolin/kreatinin (D-pyr/c) hányadost. Kerestük, hogy kimutatható-e kapcsolat a csontturnover sebessége és a csont ásványianyag-tartalom vesztés mértéke között.
41
Betegek: Tizenhét postmenopausás PBC-s nőbeteget (életkor: 41-84 év, átlag: 53 év, stádium II-IV) átlagosan 6,3 évig követtünk. A diagnózis itt is a jellegzetes klinikai tüneteken és laboratóriumi eltéréseken, az extrahepatikus epeelfolyási akadály kizárásán, az antimitokondrialis antitest (AMA M2) pozitivitáson, valamint a hisztológiai leleten alapult. A betegek klinikai adatait a 9. és a 10. táblázatok tartalmazzák. A betegek a bázisterápiának számító ursodeoxikolsav kezelés mellett egységesen napi 1000 mg kalciumot és egyénileg napi 1000-3000 NE-nek megfelelő D3 vitamint kaptak tabletta formájában. A 25-OH-D3 vitamin szintjét átlagosan 3 havonta monitoroztuk, és szükség esetén a dózist módosítottuk. Amennyiben a betegek kezdeti 25-OH-D3 vitamin szintje a normálisnál jelentősen alacsonyabb volt egyszeri 50 000 NE szubsztitúcióban részesültek. A szérum kalcium az utánkövetés során minden betegben a normális tartományban volt. Az OP megelőzését célzó másfajta kezelést a betegek nem kaptak. Statisztikai módszerek: Shapiro Wilk’s W tesztet alkalmaztunk a normalitás vizsgálatára. A különböző varianciájú csoportokra a D-próbát és a Pearson korrelációt alkalmaztunk az eredmények értékelése során. Eredmények: A csont ásványianyag-tartalom változását az 4., 5., és 6. ábrák mutatják. Az utánkövetés kezdetén 7 (41%), az utánkövetéses periódus végén 9/17 (53%) betegben volt igazolható OP jelenléte a densitásérték alapján (t-score<-2,5). Az átlagosan 6,3 éves utánkövetés során a BMD a lumbális gerincen (0,885 ± 0,26 vs. 0,839 ± 0,29, p=0,04) és a bal femur nyakon (0,725 ± 0,16 vs. 0,686 ± 0,19, n.s., p=0,07) illetve a BMC a radius harmadolópontján (0,703 ± 0,14 vs. 0,630 ± 0,16, p<0,0001) mérve csökkent. A PBC-s betegek csontdenzitás értékei csökkentek voltak a korban és nemben illesztett egészséges populációhoz képest. A kezdetben is OP-s betegek (kezdeti t-score<-2,5) körében az éves százalékos csontvesztés értéke kissé fokozott volt a kezdetben nem osteoporotikus betegekhez képest, a különbség azonban nem volt szignifikáns (12. táblázat). Fordított összefüggés volt kimutatható a csigolyákon és a femur nyakon mért BMD, a radius BMC értékek és a betegség fennállási ideje között (p<0,01 minden esetben). A tizenhét betegből öt betegben fordult elő legalább egy csonttörés. Nem
találtunk
kapcsolatot
májbetegség
súlyosságát
mutató
biokémiai
paraméterek (szérum bilirubin, ASAT, ALAT, GGT, ALP, albumin, prothrombin) és a csont ásványianyag-tartalom között.
42
A követés végén meghatározott, vizelet piridinolin/kreatinin (pyr/c) és deoxipiridinolin/kreatinin (D-pyr/c) értékek tendenciaszerűen magasabbak voltak a kezdetben is OP-s csoportban, a különbség azonban nem volt szignifikáns. Pearson korrelációval kapcsolat volt kimutatható a csontvesztés éves százalékos mértéke és a vizelet pyr/c illetve D-pyr/c értékek között (pyr/c: rL2-4=-0,8, pL2-4=0,03, rFN=-0,86, pFN=0,001, rRadius=-0,72, pRadius=0,01, D-pyr/c: rL2-4=-0,87, pL2-4 <0,001, rFN=-0,84, pFN=0,001, rradius=-0,77, pradius=0,006) (lásd 12. táblázat). Az OP előfordulását PBC-ben a különböző szerzők 24-43%-nak találták, hasonló gyakorisággal fordul elő csonttörés is. Ez a gyakoriság 2-4-szer nagyobb, mint az azonos korú és nemű populációban várható lenne81,108. Az előfordulás gyakorisága jelentősen eltért attól függően, hogy milyen betegeket vizsgáltak. A régebbi közlésekben általában nagyobb volt a III-IV. stádiumú betegek aránya, ami azt jelenti, hogy a betegségük hosszabb ideje állt fenn. Ez lehet az egyik magyarázata annak, hogy az osteoporosist gyakoribbnak és súlyosabbnak találták. A diagnosztika fejlődésének és a betegségről alkotott ismertek szélesebb körben való elterjedésének köszönhetően a PBC ma már sokkal hamarabb kerül felismerésre. Az általunk vizsgált betegcsoportban is több volt a kevésbé súlyos, II-III. stádiumú beteg, és viszonylag kevés a már kialakult cirrhosis (IV. stádium). Ezért is figyelemreméltó az OP viszonylag gyakori előfordulása. A
jobb
összehasonlíthatóság
céljából
ebben
a
munkában
csak
a
postmenopausában lévő PBC-s nőbetegek adatait elemeztük. Az általunk vizsgált betegek 43%-ában talált csökkent BMD arány megegyezik a nemzetközi irodalomban közölt adatokkal, és jóval nagyobb, mint a nem májbeteg, csak postmenopausás átlagos populációban. Az átlagosan hat éves utánkövetés végén az arány még magasabb (53%). Ugyanakkor az is ismert, hogy a BMD csökkenésének mértéke nincs mindig közvetlen összefüggésben az OP klinikai jeleivel, a csonttörések gyakoriságával. Megfigyelésünk szerint a csontvesztés éves mértéke is tendenciaszerűen azokban a betegekben volt nagyobb, akik már a vizsgálat kezdetén osteoporotikusak voltak.
43
Összefoglalva: az osteoporosis előfordulása az általunk vizsgált postmenopausás PBC-s nőbetegekben, a nemzetközi adatokhoz hasonlóan, gyakori volt. A csontvesztés
éves
mértéke,
a
piridinolin/kreatinin
(pyr/c)
és
deoxipiridinolin/kreatinin (D-pyr/c) hányadosok tendenciaszerűen elsősorban azokban a betegekben volt fokozott, akikben már a vizsgálat kezdetén OP volt kimutatható. Ezekben a betegekben a májbetegség többnyire előrehaladottabb stádiumban volt. Ilyen betegekben a kalcium és D-vitamin kezelés mellett a postmenopausás OP kezelésében bevált gyógyszerek adása indokolt. PBC-s betegek adatai Betegek száma Serum bilirubin (µmol/l) ASAT (U/l) ALAT (U/l) GGT (U/l) ALP (U/l) Ca (mmol/l)
Kezdetben osteoporosis volt jelen (A-csoport) 17 7 34,9 ± 42,7 49,0 ± 59,5 92,0 ± 41,7 101,1 ± 44,7 108,2 ± 65,6 134,5 ± 75,3 512,2 ± 391,9 639,8 ± 400,1 1227,8 ± 714,4 1695,1 ± 687,6 2,26 ± 0,10 2,27 ± 0,11
Kezdetben osteoporosis nem volt jelen (B-csoport) 10 22,9 ± 18,3 84,3 ± 40,8 85,7 ± 51,1 402,9 ± 378,8 827,4 ± 470,6 2,25 ± 0,09
9.táblázat A PBC-s betegek klinikai és laboratóriumi adatai az utánkövetés kezdetén, az ursodeoxikolsav terápia megkezdése előtt. Az értékek átlag ± SD-ben vannak megadva.
Betegek száma Életkor (év) Betegség fennállásának ideje (év) Serum bilirubin (µmol/l) Direkt bilirubin (µmol/l) ASAT (U/l) ALAT (U/l) GGT (U/l) ALP (U/l) Ca (mmol/l) 25-OH-D3 vitamin (nmol/l)
PBC-s Kezdetben betegek adatai osteoporosis volt jelen (A-csoport) 17 7 60 ± 10 65 ± 10 11,0 ± 4,9 16 ± 3,8 37,1 ± 72,8 56,7 ± 106,6 15,1 ± 36,5 25,7 ± 53,4 39,2 ± 24,8 45,7 ± 33,8 35,6 ± 27,2 43,1 ± 39,0 190,3 ± 193,1 237,4 ± 243,5 596,9 ± 548,9 853,1 ± 742,2 2,34 ± 0,14 2,34 ± 0,11 188,1±116,6 181,1±154,3 (53-358) (85-358)
Kezdetben osteoporosis nem volt jelen (B-csoport) 10 57 ± 9 8 ± 1,8 21,8 ± 28,6 6,8 ± 13,6 34,2 ± 15,1 29,8 ± 12,6 153,6 ± 148,2 397,7 ± 223,3 2,35 ± 0,18 193,6±87,0 (53-306)
10. táblázat A PBC-s betegek klinikai és laboratóriumi adatai az utánkövetés végén. (értékek: átlag ± SD, 25-OH-D3 vitamin normál tartomány: 60-180 nmol/l).
44
1,6
1,4
L2-4 BMD (g/cm2)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0 35
45
55
életkor (év)
65
75
85
4.ábra A lumbalis L2-4 gerinc csont-denzitásának változása postmenopausás primer biliaris cirrhosisos nőbetegekben az életkor függvényében (vonalak a korban és nemben illesztett egészséges kontrollokban mérhető BMD értékeket mutatják) 1,2
Bal femur nyak BMD (g/cm2)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0 35
45
55
65
75
85
életkor (év)
5. ábra A bal femur nyak csont-denzitásának változása postmenopausás primer biliaris cirrhosisos nőbetegekben az életkor függvényében (vonalak a korban és nemben illesztett egészséges kontrollokban mérhető BMD értékeket mutatják)
45
1,2
Radius BMC (g/cm)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0 35
45
55
65
75
85
életkor (év)
6. ábra A radius harmadolópont csont tartalmának változása postmenopausás primer biliaris cirrhosisos nőbetegekben az életkor függvényében (a vonallal összekötött jelek egyazon beteg különböző életkorban mért adatait jelölik)
46
L2-4 BMD BMD z score z score t score t score elején végén elején végén elején végén Kezdeben 0,64 ± 0,56 ± -2,07 ± -2,44 ± -4,63 ± -5,38 ± osteoporosis 0,06 0,13 1,07 1,69 0,66 1,48 Kezdetben nincs 1,05 ± 1,02 ± 0,88 ± 0,71 ± -0,69 ± -1,13 ± osteoporosis 0,19 0,21 1,57 1,33 1,60 1,50 p >0,0001 >0,0001 0,0003 0,002 >0,0001 >0,0001 Femur BMD BMD z score z score t score t score elején végén elején végén elején végén Kezdeben 0,57 ± 0,52 ± -2,10 ± -2,20 ± -4,04 ± -4,47 ± osteoporosis 0,07 0,13 0,85 1,35 0,64 1,26 Kezdetben nincs 0,84 ± 0,80 ± -0,37 ± -0,23 ± -1,37 ± -1,61 ± osteoporosis 0,09 0,14 0,44 0,66 0,95 1,25 p >0,0001 0,0007 0,001 0,008 >0,0001 >0,0001 Radius BMD BMD z score z score elején végén elején végén Kezdeben 0,57 ± 0,49 ± -1,38 ± -2,68 ± osteoporosis 0,07 0,09 1,17 1,94 Kezdetben nincs 0,79 ± 0,72 ± -0,38 ± -0,28 ± osteoporosis 0,10 0,12 0,59 1,11 p 0,0001 0,0007 0,01 0,01 11. táblázat L2-4 gerinc, bal femur nyak BMD (g/cm2, átlag ± SD) z és t score illetve Radius BMC és z score a kezdetben osteoporosisos (t-score <-2,5) és nem osteoporosisos postmenopausás PBC-s betegekben az utánkövetés kezdetén és az utánkövetéses periódus végén (p=p-érték)
Kezdeben osteoporosis Kezdetben nincs osteoporosis p érték
N
Életkor
Stádium
pyr/c
D-pyr /c
7
65 ± 10
3,3
10
57 ± 9
2,6
173 ± 126 106 ± 48,5
45,2 ± 49,3 18,3 ± 6,6
0,16
0,08
L2-4 %-os éves BMD csökkenés -1,7 ± 2,6
Femur %-os éves BMD csökkenés -1,5 ± 2,6
Radius %-os éves BMC csökkenés -2,1 ± 1,8
-0,02 ± 0,08
-0,5 ± 2,5
-1,6 ± 1,4
n.s.
n.s.
n.s.
12. táblázat A kezdetben osteoporosisos (t-score <-2,5) és nem osteoporosisos postmenopausás PBC-s betegekben mért átlagos éves csontvesztés mértéke és a vizelet pyridinolin/kreatinin (pyr/c) és deoxipyridinolin/kreatinin (D-pyr/c) értékek. (n: betegek száma, pyr/c: pmol pyridinolin/ mmol kreatinin, D-pyr/c: pmol deoxypyridinolin/ mmol kreatinin, stádium: a májbetegség „átlagos” stádiuma, érték: átlag ± SD)
47
8.1.3. Plazma endothelin-1 vizsgálata PBC-ben A Semmelweis OTE I. sz. Belgyógyászati Klinikáján az endothelinek (ET), közülük is az endothelin-1 (ET-1) szerepét vizsgáltuk különböző idült májbetegségekben. A korábban EDCF-nek (endothelium-derived contracting factor) nevezett molekulát 1985ben fedezték fel, 1988-ban Yanagisawa nevezte el endothelinnek111. Ma az ET-k családjába három molekulát sorolnak: az ET-1 (számos sejt termeli), az ET-2 (vesében, illetve bélben fordul elő) és az ET-3 (agy tartalmazza nagyobb mennyiségben). Az ET-k, különösen az ET-1 a jelenleg ismert legerősebb érösszehúzó anyagok. Egy japán tanulmányban in vitro az epekanalikulusok kontrakcióját okozta. Kontrakciót okozott a stellata sejtekben és cholestasist idézett elő112. Egyes in vitro adatok szerint aktiválja a stellata sejteket és szerepe van a fibrinogenezisben. Mások szerint az aktivált stellata sejteket gátolta113, igaz hogy csak az ET B receptoron kifejtett hatást vizsgálták in vitro. Befolyásolja a csontanyagcserét, fokozzák a kollagén és más fehérjék szintézisét. In vitro az osteoblastok aktivitását és proliferacióját fokozzák, az osteoclastok aktivitását gátolják114. Az endothelinek termelésében, és kiválasztásában a máj jelentős szerepet játszik, így egyes májbetegségek az ET szint megváltozásával járhatnak. Experimentális májsérülésben a máj prepro ET-1 mRNS, és ET-1 szintjének emelkedését tapasztalták115. Vaszkulárisan dekompenzált cirrhosisban és hepatorenális szindrómában magasabb ET (ET-1, ET-3) szintről számoltak be, felvetődött szerepe a portális hipertenzió patogenezisében is116. A Semmelweis OTE I. sz. Belgyógyászati Klinikáján kezelt – összesen 58 – májbetegben határoztuk meg az ET-1 szintet. Azt vizsgáltuk, hogy változik-e az ET-1 szint különböző etiológiájú májbetegségekben, továbbá ha igen milyen szerepe lehet az ET szint változásának a különböző kórfolyamatokban. Betegek: 20 primer biliaris cirrhosisos nőbeteg (valamennyi ANA, AMA pozitív, I. stádium 1, II. stádium 8, III. stádium 7, IV. stádium 4 beteg, vaszkuláris dekompenzáció nélkül, életkor: 26-79, átlag 58: év), 21 krónikus C hepatitises beteg (CHC, nemek aránya férfi/nő: 13/8, anti-HCV és HCV-PCR pozitív, vaszkuláris dekompenzáció nélkül, életkor: 21-56, átlag: 42 év) és 17 vaszkulárisan nem dekompenzált alkoholos cirrhosisos beteg (nemek aránya: 13/4, életkor: 32-61, átlag: 45 év). Kontrollként 63 egészséges véradó mintája szolgált (átlag életkor: 46 év).
48
Eredmények: A májbetegek valamennyi vizsgált csoportjában a kontrollhoz képest szignifikánsan alacsonyabb ET-1 szinteket találtunk. A legalacsonyabb értékeket PBC-s és krónikus C hepatitises betegeknél mértük. Betegcsoportok PBC Krónikus C hepatitis Alkoholos cirrhosis Kontroll
ET-1 (átlag ± SEM) 3,6 ± 0,29 3,6 ± 0,40 4,5 ± 0,48 5,8 ± 0,10
p < 0,0005 < 0,0005 < 0,001
13. táblázat Az endothelin-1 (ET-1) szint értéke különböző májbetegségekben A betegek vascularisan kompenzált stádiumban voltak. Két vascularisan dekompenzált alkoholos cirrhosisos betegnél a kontrollhoz képest emelkedett ET-1 szinteket mértünk (9,33; 9,53). Vizsgáltuk továbbá, hogy kimutatható-e kapcsolat a csont ásványianyagtartalom és az ET-1 szint között. 15 PBC-s betegben mértük meg a csont ásványianyagtartalmat (életkor 55,2 év). Külön vizsgáltuk azokat a betegeket, akinél a betegség legalább tíz éve állt fenn (9 eset, életkor: 61,4 év), és azokat, akiknél a betegséget tíz évnél kevesebb ideje diagnosztizálták (6 eset, életkor: 44,1 év). Ez a beosztás megfelelt a korai (I-II) és késői (III-IV) stádiumok szerinti csoportosításnak. A kapott osteodenzitometriai eredményeket (BMD, z- és t-score) összehasonlítottuk a betegek plazma ET-1 és szérum bilirubin (µmol/l) illetve az ASAT, ALAT, GGT és ALP értékekkel (Pearson korreláció). életkor BMD L2-4 61,4 ± 0,779 ± 9,3 0,164
PBC I-II stádium (n=9) PBC 44,1 ± III-IV stádium 17,4# (n=6)
1,012 ± 0,252*
z score -0,686 ± 1,326
t score BMD FN -3,03 ± 0,662± 1,837 0,116
z score -1,103 ± 0,685
t score -3,010 ± 1,118
-0,076 ± 1,465
-0,838 ± 2,194
-0,774 ± 0,933
-1,432 ± 1,746*
0,843 ± 0,157*
14. táblázat A gerinc (L2-4) és a bal femur nyak (FN) csont ásványianyag-tartalma PBC-s betegekben korai és előrehaladott stádiumokban (átlag ± SD, BMD g/cm2, *p<0,05, # p<0,01, PBC I-II vs. III-IV) A gerinc L2-4 és a bal femur nyak BMD értékek egymással jól egyeztek (rL2-4= 0,87, rFN= 0,94, p<0,001). Előrehaladott stádiumú betegekben az ET-1 és az L2-4 tscore között szignifikáns kapcsolatot találtunk (r/≥10év/ = 0,68, p=0,04). Ebben a csoportban az ET-1 és az L2-4 BMD között a kapcsolat szintén szorosan megközelítette
49
a szignifikancia szintjét (r/≥10év/ =0,65, p=0,055). A bal femur nyak és az ET-1 között nem volt kimutatható szignifikáns kapcsolat. A csont ásványianyag-tartalom és a nekroenzimek illetve a szérum bilirubin értékek között szintén nem találtunk kapcsolatot.
A t-score és ET-1 közötti összefüggés az L2-4 csigolyákon ET-1 = 4,5223 + ,33958 * (t-score) korrelációs együttható: r = ,68357 5,2 4,8 4,4
ET-1
4,0 3,6 3,2 2,8 2,4 2,0
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
Regression 95% confid.
L2-4 t-score
7. ábra A lumbalis L2-4 gerinc t score és ET-1 szint közötti összefüggés előrehaladott PBC-s betegekben (stádium III-IV), legalább tíz éve fennálló betegségben Korábbi közlések szerint az ET-1-nek szerepe lehet a portális hipertenzió patogenezisében. Ebben a tanulmányban a betegek vascularisan kompenzált stádiumban voltak, két vascularisan dekompenzált betegben mi is magasabb ET-1 szintet mértünk. Lehetséges tehát, hogy az ET-1 szintek változnak a dekompenzáció kialakulásakor. A vizsgálataink óta olyan közlemény is megjelent, amelyben endothelin-A receptor antagonistával csökkenteni lehetett a májban a kollagén depozicióját kísérletes cirrhosis modellben117. Így felmerül, hogy az endothelinnek a májcirrhosis pathogenezisében is szerepe lehet. Összefoglalva:
valamennyi
vascularisan
kompenzált
stádiumú
májbeteg-
csoportban alacsonyabb ET-1 szintet találtunk. Mivel az ET-1 az osteoblastok proliferációját elősegíti, és az osteoclastokat gátolja, felvetődik annak a lehetősége, hogy a csökkent ET-1 szintnek szerepe lehet a krónikus májbetegségekben, így a primer biliaris cirrhosisban és krónikus C hepatitisben kimutatható osteoporosis kialakulásában. 50
8.1.4 A hepatikus osteopathia természetes lefolyása, patomechanizmusa, genetikai rizikótényezők. Diszkusszió Az osteoporosis (OP) gyakori komplikáció PBC-ben. Különböző tanulmányokban a betegek 20-40 %-ában diagnosztizáltak OP-t, az újabb tanulmányokban, valószínűleg a korai diagnózisnak és talán a kezelésnek is köszönhetően kb. 20 %-os előfordulásról számoltak be, igaz fiatalabb betegekben66. A mi beteganyagunkban átlagosan 10 évvel a diagnózis után az OP előfordulása 40 %-os volt. Ez lényegesen nem különbözik az azonos korú beteg-populációban a nemzetközi irodalomban megismert aránytól. A kicsit magasabb előfordulást magyarázhatja, hogy Magyarországon UDCA kezelésben a betegek csak 1992 óta részesülhetnek, így sok betegünk a diagnózis felállítása után évekig ilyen terápiát nem kapott. Tanulmányunkban –korábbi szerzőkhöz hasonlóan– az OP-s betegek idősebbek voltak, előrehaladottabb volt a májbetegségük és a betegség tartama is hosszabb volt68,69. Összefüggést találtunk továbbá az OP előfordulása és a csonttörések gyakorisága között. Az újabban diagnosztizált betegeinkben az osteoporosis előfordulása csökkenő tendenciát mutat. Megvizsgáltuk számos OP-ra hajlamosító tényező lehetséges szerepét is. Ismert elképzelés, hogy a szkeletális rendszer elváltozásait a fennálló kalcium, D és K vitamin malabszorpció, és másodlagosan kialakuló hyperparathyreosis okozná84. Ennek kivédésére az általunk vizsgált betegek kalcium és D vitamin pótlásban részesültek, mely során a szérum 25-OH-D3 vitamin szintet rendszeresen ellenőriztük, hogy mind az aluldozírozást, mind a túladagolást elkerüljük. Az irodalomban a tanulmányok nagy részében a megfelelő kalcium és D-vitamin bevitel mellett szintén normális szérum kalcium és D-vitamin szintet találtak71,118. Így volt ez a mi betegeink esetében is. Ellentmondásos közlések ismertek a csontturnoverről, fokozott, illetve csökkent csontturnoverről egyaránt beszámoltak70,72-74. A csökkent csontképzés lehetséges szerepére utal, hogy egyik előző tanulmányunkban az osteoblast funkciót jelző osteocalcin szérumszintjét súlyos cholestasis esetén alacsonyabbnak találtuk nemalkoholos idült májbetegekben és PBC-s betegekben75. Jelen vizsgálatunkban az utánkövetés kezdetén is OP-s betegekben magasabb vizelet keresztkötés pyr/c és Dpyr/c értékeket kaptunk a kezdetben nem OP-s betegekhez képest. Ez a megfigyelés a fokozott
csontresorptio
szerepét
támasztja
alá.
Az
értékek
ugyanakkor
a
postmenopausás normális tartomány felső harmadába estek. A csontturnover különbözőségére részben magyarázatot adhat továbbá az, hogy az utánkövetés kezdetén
51
már OP-s betegek átlagosan 8 évvel voltak idősebbek a vizsgálat elején nem OP-s betegeknél. Ide kapcsolódik, hogy a kompenzált stádiumú betegekben megfigyelt alacsonyabb ET-1 az osteoblastok csökkent proliferációja, illetve az osteoclastok gátlásának csökkenése révén szintén fokozott csontvesztéshez vezethet. Hiperbilirubinaemia
szerepéről
az
irodalomban
ellentmondó
közlések
64
ismertek . Saját vizsgálatunkban nem volt kimutatható kapcsolat a májbetegség biokémiai paraméterei, közöttük a szérum bilirubin és a csont ásványianyag-tartalom között. Magyarázhatja a megfigyelést, hogy a betegek kivétel nélkül ursodeoxikolsav terápiában részesültek, ami a cholestaticus paramétereket befolyásolta. A májbetegség közvetett vagy közvetlen szerepét is vizsgálták. Irodalmi közlések alapján hosszabb betegségtartam illetve előrehaladottabb stádiumú betegség esetén gyakrabban volt diagnosztizálható osteopenia illetve OP68,69. Vizsgálatunkban –a korábbi tanulmányokhoz hasonlóan– fordított összefüggés volt kimutatható a betegség fennállásának ideje és a BMD illetve BMC értékek között. Az OP-s betegekben hosszabb ideje állt fenn és előrehaladottabb volt a májbetegség, mint azokban, akikben OP nem volt. Fontos megjegyezni, hogy a betegség kezdetben sokáig tünetmentes lehet, diagnosztizálása az első tünetek megjelenése után akár évekig is elhúzódhat, így a betegség tényleges fennállásának ideje általában nem ismert. Bár direkt kapcsolatot nem sikerült kimutatnunk a biokémiai paraméterek és a BMD értékek között, a korábbi tanulmányokban és a mi vizsgálatunkban is összefüggés volt kimutatható a betegség stádiuma, fennállása és a csont ásványianyag-tartalom között. Mindezek arra utalnak, hogy részben maga a májbetegség tehető felelőssé a betegségben megfigyelhető OP kialakulásáért. Örökletes, genetikai tényezők szerepét is megvizsgáltuk. A D vitamin receptor gén korábbi vizsgálatok alapján fontos szerepet játszik az OP kialakulásában. Egészséges postmenopausás nőkben a BB genotípus illetve a B allél alacsonyabb csontsűrűséggel járt együtt88,94,96. PBC-ben ellentmondó közlések ismertek. Egy amerikai vizsgálatban bb, aa és TT genotípusok fokozott OP rizikóval jártak együtt, egy másik vizsgálatban a BB genotípus esetén tendenciaszerűen alacsonyabb BMD értékeket mértek81,83. Rodes munkacsoportja szerint a Bb genotípus előfordulása gyakoribb PBC-s betegekben, azonban tanulmányukban nem a VDR gén hanem a kollagén Iα1 gén polimorfizmusa mutatott összefüggést a csont-ásványianyag tartalommal82. Vizsgálatunkban szintén a BB genotípus gyakoribb előfordulását mutattuk ki magyar PBC-s nőbetegekben, a VDR génpolimorfizmus nem volt 52
kapcsolatba hozható a BMD-vel. Tendenciaszerűen a Bb genotípus esetén észleltük a legalacsonyabb denzitásértékeket. Irodalmi adatok alapján ismert, hogy 1,25-(OH)2-D3 vitamin immunmoduláns hatással is bír. Gátolja a T-sejt aktivációt. In vitro és in vivo is, gátolja a limfocyták IL1, IL-2, IL-6, TNF és INF-γ termelését119. Az említett cytokinek a T helper 1 sejtek kialakulásában fontos szerepet játszanak. Jelenlegi elképzelésünk szerint ezeknek a sejteknek a PBC patogenezisében fontos szerepe van140. Az is kimutatták, hogy a D vitamin képes szabályozni a kostimulátor B7.1 és B7.2 molekulák expresszióját120. Egyes közlések szerint a VDR genotípusok rizikótényezőnek számítanak különböző autoimmun betegségek szempontjából (pl. Graves betegség)121,122. Mindezek felvetik a gén lehetséges szerepét különböző autoimmun betegségek patogenezisében, a megváltozott cytokin profil, esetleg a kostimulátor molekulák megváltozott expressziója révén. Az is elképzelhető, hogy nem maga a VDR gén, hanem más a VDR génnel kapcsolatban álló gének felelősek legalábbis részben a betegség kialakulásáért. Az ösztrogén receptor-alfa (ER-α) gén az eddigi vizsgálatok alapján szintén szerepet játszik a csont ásványianyag-tartalom szabályozásában, bár a földrajzi-etnikai tényezők az eredményeket jelentősen befolyásolhatják98-100. Kobayashi illetve Albagha japán és angol menopausás nőkben kapcsolatot talált a Px haplotípus és a csökkent BMD között97,98. Tanulmányunkban a magyar PBC-s betegek döntő többsége ilyen haplotípussal rendelkezett. Kínai nőkben a PP genotípus magasabb lumbalis BMD értékekkel járt együtt97, míg amerikai és finn kutatók a PP genotípus gyakoribb előfordulása észlelték OP-ban99, azaz a BMD szabályozása genetikailag is eltérő lehet a különböző populációkban. Arra is vannak adatok, hogy az ER-α genotípusok befolyásolják a hormonpótló terápia hatásosságát99. Tanulmányunkban a betegek 75 %ában Pp genotípust találtunk, de nem volt kapcsolat a PvuII polimorfizmus és a BMD között. Mizunuma és mtsai tanulmányában az Xx genotípus esetén premenopausában magasabb BMD értékeket találtak, míg menopausa után jelenléte fokozott csontvesztéssel volt kapcsolatba hozható123. Vizsgálatunkban a PBC-s betegekben szignifikánsan gyakoribb volt az XbaI Xx genotípus jelenléte a kontrollokhoz képest. Ugyanakkor nem sikerült kapcsolatot kimutatnunk a gén XbaI polimorfizmusa és a csont ásványianyag-tartalom között. Utánkövetéses vizsgálatok szükségesek annak eldöntésére, hogy az ER-α genotípusoknak szerepe lehet-e a PBC-ben megfigyelhető osteopenia illetve OP kialakulásában.
53
Ismert, hogy a thymusban lévő és perifériás limfociták is expresszálnak ER-α-t and β-t. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy az ösztrogénnek szerepe van az immunkompetens sejtek kialakulásában, illetve működésében124. Érdekes továbbá, hogy autoimmun betegségekben (pl. szisztémás lupus erythemathosus) a T-sejteken megváltozott ER funkciót írtak le125. Niino és mtsai tanulmányában az ER-α P allél és Xx genotípus gyakoribb volt a szintén autoimmun eredetűnek tartott multiplex sclerosisos betegekben, jelenléte esetén a betegség fiatalabb korban kezdődött126. További vizsgálatok szükségesek annak eldöntésére, hogy az általunk vizsgált ER-α polimorfizmusok szerepet játszhatnak-e a PBC patogenezisében. Interleukin-1 receptor antagonista (IL-1ra) természetes anti-inflammatórikus molekula, az IL-1α és β kompetitív inhibitora. Graves betegségben, polymyositisben, szisztémás lupus erythematosusban és rheumatoid arthritisben magasabb IL-1Ra értékeket mértek127. Az IL-1RN gén A2 allélját továbbá gyakoribbnak találták különböző autoimmun betegségekben (Graves betegség, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, Henoch-Schonlein nephritis, stb.)105,106. In vitro a 2. allél jelenléte esetén csökkent IL-1/IL-1Ra arányt figyeltek meg fokozott IL-1Ra termeléssel128. Egy angol tanulmányban az A1A1 genotípus jelenlétét találták gyakoribbnak PBC-s betegekben107. Adataink szerint magyar PBC-s nőbetegekben sem az A2 allél, hanem tendenciaszerűen az A1A1 genotípus volt a gyakoribb. Irodalmi adatok alapján felmerült, hogy az IL-1RN genotípusnak szerepe lehet a fibrosis kialakulásában. Japán alkoholos cirrhosisos betegekben A1 heterozygozitás a cirrhosis fokozott veszélyével járt együtt129. PBC-ben hasonló tendenciát nem tudtak kimutatni. Tanulmányunkban az A1 heterozygota betegek 63 %-a (7/11), míg az A1 vagy A2 homozygota betegeknek csupán 36 %-a (8/22) volt előrehaladott stádiumban (III-IV). A betegek életkora és a betegség tartama nem különbözött a két csoportban. Mindezek alapján felvetődik annak a lehetősége, hogy az IL-1RN genotípusoknak szerepe lehet a betegség kialakulásában és progressziójában. Az IL-1 stimulálja a csontresorptiot. Felvetették, hogy szerepe van a postmenopausás osteoporosis kialakulásában103,104. Tendenciaszerűen magasabb IL1/IL-1Ra arányt figyeltek meg osteoporotikus egyénekben egészséges kontrollokhoz viszonyítva. A közelmúltban összefüggést írtak le az IL-1RN A2 allél jelenléte és a magasabb BMD között103, más tanulmányokban nem találtak összefüggést104. Betegeinkben az A2 allél nem volt kapcsolatban a magasabb BMD-vel illetve jelenléte
54
nem volt gyakoribb a nem OP-s betegekben. PBC-ben nem találtunk összefüggést az IL-1RN polimorfizmusok és a csont ásványianyag-tartalom között. Mindezek alapján az IL-1RN
VNTR
polimorfizmusnak
valószínűleg nincsen szerepe a PBC-ben
megfigyelhető OP kialakulásában. Összefoglalva:
az
osteoporosis
(OP)
előfordulása
az
általunk
vizsgált
postmenopausás PBC-s nőbetegekben, a nemzetközi adatokhoz hasonlóan, gyakori volt. Az OP kialakulása a betegség tartammal, a májbetegség progressziójával volt kapcsolatban. A csontvesztés éves mértéke és a csontresorptio mértékére utaló piridinolin/kreatinin (pyr/c) és deoxipiridinolin/kreatinin (D-pyr/c) hányadosok is tendenciaszerűen
ezekben
a
betegekben
voltak
fokozottak.
A
fokozott
csontresorptio szerepére utal továbbá az is, hogy kompenzált PBC-ben alacsonyabb ET-1 szintet találtunk. Mivel az ET-1 az osteoblastok proliferációját serkenti, és az osteoclastokat gátolja, felvetődik annak a lehetősége, hogy a csökkent ET-1 szintnek szerepe lehet a krónikus májbetegségekben, így a PBC-ben kimutatható OP kialakulásában. A genetikai tényezők oldaláról gyakoribbnak találtuk a VDR BsmI BB genotípust és B allélt PBC-s betegekben. Az irodalomban elsőként számoltunk be ER-α gén XbaI és PvuII polimorfizmusokról PBC-ben. Gyakoribbnak találtuk az XbaI Xx és a PvuII Pp genotípusokat a magyar betegekben, míg a betegek IL-1RN VNTR polimorfizmusa nem különbözött a kontroll csoporttól. Nem találtunk kapcsolatot a vizsgált polimorfizmusok és a csont ásványianyag-tartalom között, így nem valószínű, hogy legalábbis a magyar betegekben
PBC-s
betegekben
ezeknek
jelentős
szerepe
lenne
a
BMD
meghatározásában. Vizsgálataink és az irodalmi adatok alapján felmerül annak a lehetősége, hogy az ER-α PvuII, XbaI és a VDR BsmI génpolimorfizmusoknak, esetleg kapcsolt géneknek szerepe lehet a PBC patogenezisében.
55
8.2. DPP IV: szerepe a gyulladásban és fibrózisban. Indikátor, prognosztikus marker? 8.2.1. DPP IV aktivitás PBC-ben A dipeptidil peptidáz IV (DPP IV, EC 3.4.14.5), más néven CD26, egy 110 kDa molekulasúlyú integrál II típusú membrán szialoglikoprotein. A szerin exopeptidázok csoportjába tartozó molekula megtalálható a különböző kefeszegély membránok (pl. epe canaliculusok, vese proximalis tubulusok és glomerulusok, valamint a vékonybél 130
mikrobolyhok) epithel sejtjein, a T sejtek felületén, továbbá a reaktív fibroblastokon
.
A DPP IV-et a limfociták közül elsősorban a CD4+ sejtek expresszálják. Szerepe van a T-sejtek aktivációjában, kostimulátor/stimulátor funkciót lát el. Számos növekedési faktor és cytokin tartalmaz prolint vagy alanint az utolsó előtti pozícióban, és valószínűleg a DPP IV/CD26 kostimulátoros funkciója kapcsolatban áll annak enzimatikus aktivitásával131. Mindezek alapján felvetődik, hogy a molekulának regulációs szerepe is van. Megfigyelték továbbá, hogy a szolubilis DPP IV is képes az antigén indukálta immunválasz fokozására132. Megváltozott DPP IV expressziót írtak le humán hepatocellularis carcinomaban,
máj cirrhosisban, de nem volt adat a DPP IV szerepéről egyéb májbetegségekben133. A PBC-ben jellegzetes a kis epeutak destrukciója. Mivel az epeutak nagy mennyiségben expresszálnak DPP IV-et, feltételezhető volt, hogy ebben a betegségben változik a szérum DPP IV aktivitás. Ezért különböző stádiumú PBC-s betegekben vizsgáltuk a szérum DPP IV aktivitást. Betegek: A DPP IV aktivitást 24 PBC-s nőbeteg szérumában mértük meg (életkor: 29-82 év, átlag: 57 év). A diagnózis it isa jellegzetes klinikai tüneteken, a laboratóriumi adatokon, az antimitochondrialis antitest (AMA) pozitivitáson és a májbiopszián alapult. Valamennyi beteg AMA pozitív volt. A Ludwig beosztás szerint 7 beteg a II., 11 beteg a III., 6 beteg pedig a IV. stádiumba volt sorolható. 42 egészséges véradó nő szérum mintája szolgált kontrollként (életkor: 19-61 év, átlag: 28 év). A vérmintát a cubitalis vénából vettük, az enzim-meghatározásig a szérumokat –20 °C-on tároltuk. Eredmények: A kontroll csoportban a szérum DPP IV aktivitás 12,05 ± SEM 0,39 U/l volt, míg a PBC-s betegekben az enzimaktivitás szignifikánsan emelkedett (21,40 ± 1,81 U/l, p= 0,000034, d-próba). A betegség progressziójával párhuzamosan az
56
enzimaktivitás emelkedése volt kimutatható (II. stádium: 17,20 ± 3,05, III. stádium: 19,80 ± 1,32 és IV. stádium 29,20 ± 4,87). A IV. stádiumban talált értékek szignifikánsan magasabbak mind a kontrollhoz (p<0,01), mind a II. stádiumhoz viszonyítva (p<0,039, ANOVA Scheffe post hoc teszt). betegcsoportok
n
szérum DPP
medián
tartomány
p
IV aktivitás kontroll
42
12,05 ± 0,39
11,7
5,7-16,1
-
PBC II. stádium
7
17,20 ± 3,05
14,1
8,7-32,2
n.s.
PBC III. stádium
11
19,80 ± 1,32
20,65
9,4-23,9
0,0001
PBC IV. stádium
6
29,20 ± 4,87
31,39
12,1- 46,3
0,017
15. táblázat Szérum dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) aktivitás primer biliáris cirrhosisban (PBC, Ludwig osztályozás szerint, enzim aktivitás: U/l, értékek: átlag ± SEM, n: betegek száma, p: p-érték a kontrollhoz képest)
A májenzim értékeket (ASAT, ALAT, GGT, ALP), valamint a szérum bilirubin koncentrációkat a 16. táblázat tartalmazza. Pozitív összefüggés volt kimutatható a DPP IV aktivitás és az ASAT, ALAT, GGT és ALP értékek között (rASAT= 0,634, pASAT= 0,0009, rALAT= 0,684, pALAT= 0,0003, rGGT= 0,663, pGGT=0,0004, rALP=0,571, pALP=0,0035, Pearson-korreláció), míg nem találtunk kapcsolatot az enzim aktivitás és a szérum bilirubin koncentráció között. stádium
n
bilirubin
ASAT
ALAT
GGT
ALP
II
7
11,6 ± 1,03
43,9 ± 7,9
55,3 ± 12,6 193,1 ± 73,9
556,4 ± 170,6
III
11
18,2 ± 4,2
44,4 ± 6,8
40,6 ± 7,3
444,1 ± 48,0
IV
6
96,3 ± 58,6
82,3 ± 13,9 101,2 ± 14,9 670,8 ±145,8 1362,7 ± 320,9
125,7 ± 35,9
16. táblázat Enzim aktivitás és szérum összbilirubin koncentráció átlagértékek II-IV. stádiumú PBC-s betegekben (Szérum bilirubin koncentráció: µmol/l. Enzim aktivitások: U/l. Értékek: átlag ± SEM. n: betegek száma. ASAT: aszpartát-aminotranszferáz, ALAT: alaninaminotranszferáz, GGT: gamma-glutamil-transzferáz, ALP: alkalikus foszfatáz)
Tanulmányunkban szignifikánsan emelkedett DPP IV aktivitást észleltünk a PBCs betegek szérumában. A legnagyobb értékeket előrehaladott stádiumú betegekben figyeltük meg. Összefüggést találtunk a betegség stádiumai és a DPP IV szint között. Ez arra utal, hogy az enzimaktivitás valószínűleg nem specifikus módon indikátora lehet a betegség progressziójának.
57
8.2.2. DPP IV aktivitás krónikus C hepatitisben, a responder status szerepe Cholestasissal járó megbetegedésekben134 illetve PBC-ben emelkedett szérum DPP IV szintet figyeltünk meg. Japán kutatók humán hepatoma sejteken HCV transzfekcióval a DPP IV (CD26) expressziójának a fokozódását idézték elő135. Továbbá in vitro, humán hepatoma és HepG2 sejteken a CD26 anti-CD26-tal történő stimulációja apoptózishoz vezetett136. Mindezek a megfigyelések támogatták annak a lehetőségét, hogy a molekula szerepet játszik a különböző etiológiájú májkárosodások létrejöttében. Következő tanulmányunkban ezért célul tűztük ki, hogy krónikus C hepatitises betegekben vizsgáljuk meg a szérum DPP IV aktivitást. Mértük a szérum DPP IV aktivitást interferon terápiára reagálókban (responder) illetve non-responderekben betegekben is. Betegek: 144 krónikus C hepatitises betegben (férfi/nő: 52/92, életkor: 21-75 év, átlag: 47 (SD 10) év). Hetvennégy beteg korábban interferon (IFN) terápiában részesült. 46 beteg non-responder, 28 IFN responder volt. Ekkor az interferon kezelés indikációja Magyarországon legalább hat hónapja ALAT>100U/L, harmadik generációs RT-PCR vizsgálattal HCV pozitivitás és szövettanilag bizonyított aktív hepatitis volt. A betegek között nem volt a vizsgálat időpontjában IFN kezelésben részesülő beteg. 60 egészséges véradó mintája szolgált kontrollként. Eredmények: A szérum DPP IV aktivitás szignifikánsan magasabb volt a krónikus C hepatitises csoportban a kontrollhoz képest (átlag ± SD= 20,89 ± 9,60 vs. 12,39 ± 2,76, p<0,0000005, Mann-Whitney U teszt). A szérum DPP IV aktivitás nonparametrikus eloszlást mutatott. Nem volt különbség a szérum DPP IV aktivitásban az IFN responderek (13,69 ± 4,21) és a kontroll csoport között. Ugyanakkor a non-responderekben (23,28 ± 9,57; p<0,0000005) és az u.n. naive HCV hepatitises betegekben (22,20 ± 9,89; p<0,0000005, n=70) a DPP IV aktivitás szignifikánsan magasabb volt a kontrollhoz képest. E két utóbbi csoport között nem volt különbség. A responder betegekben ugyanakkor szignifikánsan alacsonyabb DPP IV aktivitást mértünk mind a nonresponderekhez (p<0,0001) mind a naive betegekhez (p<0,0001) képest.
58
DPP IV (U/l)
kontroll (n=60)
naive HCV-s IFN nonIFN betegek responderek responderek (n=70) (n=46) (n=28)
8.ábra DPP IV aktivitás egészséges kontrollokban és krónikus C hepatitises betegekben (IFN: interferon) ROC
analízis
segítségével
meghatároztuk,
hogy
a
DPP
IV
milyen
szenzitivitással és specificitással képes azonosítani a krónikus C hepatitises betegeket (maximalizáltuk a szenzitivitás és specificitás értékek négyzetösszegét). A legjobb cutpoint-ot 16 U/L DPP IV aktivitásnál kaptuk. Krónikus C hepatitis Szenzitivitás Specificitás
87/116 = 75 % 54/60 = 90 %
IFN responder status azonosítása 35/46 = 76 % 21/28 = 75 %
17. táblázat Szérum DPP IV aktivitás vizsgálata krónikus C hepatitises betegekben. Krónikus C hepatitises és IFN responderek azonosítása (cut-point16 U/L) a szérum DPP IV aktivitás segítségével 59
Spreamann korrelációval pozitív összefüggést mutattunk ki a DPP IV aktivitás és az ASAT (r=0,44, p<0,0000005), ALAT (r=0,44, p<0,0000005) és a GGT (r=0,41, p<0,0000005) között, míg nem találtunk kapcsolatot az enzim aktivitás és ALP illetve a szérum bilirubin koncentráció változása között. A munka második részében 23 responder illetve részleges responder krónikus C hepatitises betegben mértük meg a DPP IV szintet 12 hónapos interferon terápia előtt és után (férfi/nő: 11/12, életkor: 25-58 év, átlag: 47 év). 60 egészséges véradó mintája szolgált kontrollként. A betegek klinikai adatait IFN terápia előtt és után a 18. és a 19. táblázatok tartalmazzák. Interferon terápia előtt szignifikánsan magasabb DPP IV aktivitást mértünk a krónikus C hepatitises betegekben (20,7 SD ± 10,1) a kontrollhoz (12,39 ± 2,76, p<0,001, d-próba) képest.
Szérum bilirubin (µmol/l) ASAT (U/l) ALAT (U/l) GGT (U/l) ALP (U/l) Albumin (g/dl) HCV-PCR (quantiplex)
IFN előtt 11,7 ± 3,5 80,6 ± 40,6 142,4 ± 103,5 119,7 ± 165,7 185,5 ± 86,6 39,2 ± 6,2 3,6 ± 5
IFN után 10,9 ± 3,5 29,5 ± 14,2 35,5 ± 26,5 62,3 ± 66,3 152 ± 59,3 40,0 ± 6,5 neg
18. táblázat A komplett responder betegek klinikai adatai interferon (IFN) terápia előtt és után (PCR és enzim negatív, n=13).
Szérum bilirubin (µmol/l) ASAT (U/l) ALAT (U/l) GGT (U/l) ALP (U/l) Albumin (g/dl) HCV-PCR (quantiplex)
IFN előtt 18,6 ± 9,3 51,5 ± 19,4 87,2 ± 47,3 52,0 ± 14,1 185,1 ± 45,4 46,2 ± 12,4 12,3 ± 11,1
IFN után 15,9 ± 7,5 43,6 ± 15,7 56,8 ± 15,7 63,6 ± 67,8 165,2 ± 26,1 39,4 ± 5,5 1,9 ± 1,6
19. táblázat A részleges responder betegek klinikai adatai interferon (IFN) terápia előtt és után (n=10).
60
24
szérum DPP IV aktivitás (U/l)
22
20
18
16
14
12
PCR-negatív, komlett responder PCR-pozitív, enzimatikus responder
IFN terápia előtt
IFN terápia után
8. ábra. Szérum DPP IV aktivitás krónikus C hepatitises betegekben 12 hónapos interferon (IFN) terápia előtt és után Komplett responderekben, akikben a szérum transzaminázok a normális tartományba csökkentek és a HCV PCR is negatív lett a szérum DPP IV aktivitás szignifikánsan, a kontroll csoportban mérhető szintre csökkent (IFN előtt: 21,0 ± 10,9, IFN után: 14,4 ± 4,6, p=0,035, t-próba). Részleges responderekben az aktivitás szintén csökkent, a változás itt nem volt szignifikáns (IFN előtt: 20,4 ± 9,5, IFN után: 16,1 ± 6,2). Lásd 19. táblázat. Krónikus C hepatitises betegekben cholestasis nélkül is magasabb DPP IV aktivitást észleltünk a kontroll csoporthoz képest, ugyanígy magasabb volt az enzim aktivitás a non-responder betegekben a responderekhez képest, illetve responderekben IFN terápia hatására a magasabb enzimaktivitás normalizálódott. Mindezek alapján krónikus C hepatitisben a szérum DPP IV aktivitás a máj gyulladásos folyamatának indikátora lehet. Az aktivitás mérése segítséget jelenthet az interferon terápia sikerének a megítélésében. 61
8.2.3. DPP IV aktivitás kísérletes májcirrhosisban Számos közlemény vizsgálta a DPP IV lehetséges szerepét a fibrózis kialakulásában. A molekula valószínűleg fontos szerepet játszik a fibroblastok aktiválódásában és proliferációjában. Scanlan és mtsai.137 kimutatták, hogy a DPP IV azonos a fibroblast aktivációs protein-β-val. További megfigyelések szerint szerepe van a hepatocytaextracelluláris matrix kapcsolatok kialakulásában is. A fibrózis kialakulásért a mai ismereteink szerint az aktivált stellata sejteket tesszük elsődlegesen felelőssé, további szerepe lehet nekroinflammatorikus szignáloknak. Így fontosnak tűnik, hogy cirrhosisban az aktivált stellata (HSC) sejtek által expresszált fibroblast aktivációs protein (FAP) szintén rendelkezik DPP IV és gelatináz aktivitással138. Megváltozott DPP IV expresszióról számoltak be májcirrhosisban és humán hepatocelluláris carcinomában.
Előző
vizsgálatainkban
különböző
etiológiájú
krónikus
májbetegségekben és egy időközben megjelent tanulmányban134 cholestasisban is magasabb
DPP
IV
aktivitásról
számoltak
be.
Mindezek
alapján
ebben
a
tanulmányunkban célul tűztük ki a DPP IV aktivitás mérését kísérletes májcirrhosisban. Vizsgáltuk továbbá, hogy a szérum enzimaktivitás kapcsolatba hozható-e a cirrhosissal. Kísérletes protokoll: Fischer-344 hím patkányokban hoztunk létre májcirrhosist dietil-nitrózamin, fenobarbitál és CCl4 adásával korábban ismertetett protokoll szerint (Zalatnai et al,139). A cirrhosis indukálására az állatok (n:22) az első napon 0,2 mg / kg dietil-nitrózamint kaptak 0,9 N NaCl oldószerben ip. injekció formájában. A 15. naptól kezdve az állatok heti három alkalommal intragastriálisan, napraforgóolajban oldva 0,5 ml/kg CCL4-et kaptak, illetve az ivóvízben 0,05 %-os fenobarbitált. Kontrollként 9 állat csak fenobarbitál kezelésben részesült, illetve 9 normál rágcsálótápon (Biofarm CRTL/N) kívül mást nem kapott. Az állatokat a 8. héten leöltük, hogy a májtumor kialakulását elkerüljük. Eredmények: Az állatok klinikai és laboratóriumi adatait a 20. táblázat tartalmazza. A cirrhosisos csoportban a májkárosodásra jellemző makroszkópos és mikroszkópos eltéréseket és a májenzimek emelkedését figyeltük meg. Vascularis dekompenzáció (ascites, oedema) nem volt megfigyelhető, hisztológiailag minden állatban cirrhosis volt kimutatható (lásd melléklet). Malignitást nem észleltünk. A szérum aktivitásokat átlag ± standard deviációban (SD) adtuk meg. A kontroll csoportban a DPP IV aktivitás 10,9 ± 0,9 U/l (9,6-12,2) volt, fenobarbitál kezelés ezt nem befolyásolta (11 ± 4, tartomány: 2,3-16,5). Cirrhosisban jelentősen emelkedett 62
értékeket (39,2 ± 3,7, tartomány: 31,4-45,6) észleltünk mindkét kontroll csoporthoz képest (p<0,000002, d-próba, Bonferroni korrekcióval). Pozitív korrelációt tudtunk kimutatni a DPP IV aktivitás és a májenzimek között (rASAT= 0,73, pASAT= 0,0001, rALAT= 0,69, pALAT= 0,0004, Pearson korreláció, semilogaritmikus transzformációval), lásd 9. ábra.
kontroll (n:9)
fenobarbitál (n:9)
cirrhosis (n:22)
Testsúly (g)
291,7 ± 14
300,6 ± 28,8
237,5 ± 28,4
Máj tömege (g)
9,8 ± 0,7
12,7 ± 1,6
11,4 ± 2,6
Lép tömege(g)
0,63 ± 0,04
0,61 ± 0,05
1,43 ± 0.,6
Herék tömege (g)
2,83 ± 0,17
2,88 ± 0,37
2,13 ± 0,38
Szérum bilirubin (µmol/l)
2,2 ± 0,5
2,6 ± 2,2
11,4 ± 4,3
ASAT (U/l)
152,8 ± 36,7
138,4 ± 24,6
1094,8 ± 427,3
ALAT (U/l)
92,9 ± 18,6
96,0 ± 8,2
718,7 ± 268,4
ALP (U/l)
642,6 ± 217,7
825,9 ± 79,5
1888,4 ± 269,6
Albumin (g/l)
38,0 ± 1,2
41,0 ± 0,9
33,5 ± 2,4
DPP IV (U/l)
10,9 ± 0,9
11,0 ± 4,0
39,2 ± 3,7
19. táblázat. Az állatok klinikai és laboratóriumi adatai a leöléskor (átlag ±SD) Összegezve: kísérletes májcirrhosisban emelkedett DPP IV aktivitást észleltünk. Az enzimaktivitás korrelált az ASAT illetve az ALAT aktivitással. A DPP IV aktivitás a májkárosodás indikátora lehet. Felvetődik annak a lehetősége, hogy a molekula cirrhosisban szerepet játszik a májban megfigyelhető szerkezeti változásokban.
63
3,4 3,3
log10 (ASAT)
3,2 3,1 3 2,9 2,8 2,7 2,6 30
35
40 DPP IV (U/l)
45
50
40 DPP IV (U/l)
45
50
3,3 3,2
log10 (ALAT)
3,1 3 2,9 2,8 2,7 2,6 30
35
9. ábra A szérum DPP IV aktivitás kapcsolata ASAT-tal és ALAT-tal kísérletes májcirrhosisban
64
8.2.4. A DPP IV aktivitás és a májbetegségek lehetséges kapcsolata. Diszkusszió. Tanulmányainkban a DPP IV aktivitás a cholestasis klinikai és laboratóriumi jelei nélkül is emelkedett volt különböző etiológiájú krónikus májbetegségekben (PBC, krónikus C hepatitis) és kísérletes májcirrhosisban. Az enzimaktivitás kapcsolatot mutatott a folyamat progressziójával, a májkárosodás mértékével. Az emelkedett enzimaktivitás eredetének számos magyarázata lehetséges. (1) A májban a krónikus gyulladásos folyamatok során jelentős mennyiségű limfocita figyelhető meg. A szérum DPP IV aktivitás legalábbis részben származhat a CD4 pozitív limfocitákból, a felületi DPP IV enzimatikus hasítása útján. PBC-ben a léziók környezetéből azonosított limfociták döntő többsége CD4+ sejt, melyek között a Th1 (T-helper-1) sejtek dominanciáját figyelték meg140. Kimutatták továbbá a membránhoz kötött DPP IV up-regulációját a T-sejt aktiváció során141. Krónikus C hepatitisben a helyzet kicsit más. Itt több a CD8+ sejt, ezek kevésbé mutatnak CD26 expressziót. Intrahepatikusan megfigyelhető ugyanakkor a hepatitis C specifikus CD4+ sejtklón expanziója is142. Mivel a szolubilis DPP IV képes az immunválasz fokozására, a sejtmembránból hasítás útján felszabaduló aktív DPP IV-nek valószínűleg szerepe lehet a krónikus gyulladás fenntartásában132. (2) Ismert, hogy a kis epeutak nagy mennyiségben expresszálnak DPP IV-et, illetve a hepatociták megváltozott DPP IV expressziót mutatnak cirrhosisban. Míg a normál májszövetben kizárólagosan az epe canalicularis oldalon figyelhető meg expresszió, addig cirrhosisban a proliferáló epeutak és hepatociták bazolaterális oldala is fokozott expressziót mutat. Mivel a PBC a kis epeutak destrukciójával jár, ezek károsodása az enzimaktivitás fokozódásához vezethet. Ugyanígy a hepatociták károsodása szintén az aktivitás fokozódását eredményezheti. Ez a lehetőség még fontosabbnak tűnik hepatitis C fertőzésben. HCV fertőzött hepatocitákban a CD26 expresszió fokozódását figyelték meg, in vitro135. Továbbá szintén kísérletesen humán hepatoma sejtek anti-CD26 antitesttel való stimulációja apoptózist indukált143. Lehetséges, hogy a hepatitis C infekció fokozott CD26 expressziót indukál, ami a májsejtek (specifikus és nem specifikus immunválasz illetve apoptózis miatti) pusztulása után a szérum DPP IV aktivitás fokozódásához vezethet. A nekroenzimekkel
(ASAT,
ALAT)
kapcsolatban
mindhárom
tanulmányunkban
megfigyelt szoros korreláció támogatta ezt a lehetőséget. (3) Lehetséges, hogy az
65
aktivitás részben a fibroblastokból származik. Ezeknek a sejteknek a pusztulása ugyancsak hozzájárulhat az emelkedett szérum DPP IV aktivitáshoz, különösen az előrehaladott fibrotikus illetve cirrhotikus stádiumban. (4) Az is lehetséges, hogy a csökkent clearance felelős a szérum aktivitás változásáért. A
DPP
IV/CD26
egy
T-sejt
aktivációban
résztvevő
ektoenzim,
kostimulátor/stimulátor funkcióval. A mechanizmus pontos részletei még nem tisztázottak. T-sejt receptor (TCR)/CD3 komplex jelenléte feltétlenül szükségesnek látszik a folyamathoz. Kimutatták, hogy a DPP IV membránhoz kötött tirozin foszfatázhoz CD45 kapcsolódik, az azonban még vitatott, hogy az enzimaktivitás vagy az adenozin deaminázhoz való kapcsolódása szükséges-e a teljes aktivációhoz131,144. Számos növekedési faktor és cytokin tartalmaz prolint vagy alanint az utolsó előtti pozícióban, és valószínűleg a DPP IV/CD26 kostimulátoros funkciója kapcsolatban áll annak enzimatikus aktivitásával. Kimutatták, hogy a DPP IV szerepet játszik a RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) kemokinek hasításában és aktivációjában, így lehetséges hogy a DPP IV a biológiailag aktív peptidek lokális extracelluláris koncentrációjának a szabályozásában is szerepet játszik145. A cirrhosishoz vezető különböző etiológiájú nekroinflammatórikus folyamatokban számos cytokin és egyéb szabályozó peptid érintett, amelyek specifikus aktivációt illetve inaktivációt igényelnek. Lehetséges, hogy ezek regulációjában a DPP IV is szerepet játszik. Továbbá a szolubilis DPP IV, részben talán a megváltozott cytokin profil révén, képes az antigén indukálta immunválasz fokozására132. Ezek a folyamatok a regeneráció mellett fontos szerepet játszhatnak a krónikus gyulladás fenntartásában is. Lássunk egy példát: a PBC autoimmun betegség, az immunrendszer megnövekedett aktivációjával és autoantitestek jelenlétével. Korai jel PBC-ben az epe canaliculusok felületén a piruvát-dehidrogenáz komplex E2 alegységének (PDC-E2) a fokozott expressziója, mely a biliaris epithel sejteket az autoreaktív folyamat elsődleges célpontjává teszi. Lehetséges, hogy szolubilis DPP IV, amely az epe canaliculusokból és a limfocitákból származik, elősegíti az autoreaktív folyamatot, további epeutak pusztulásához és ezáltal a betegség progressziójához vezetve. A közelmúltban mutatták ki állatkísérletben, hogy az irreverzibilis DPP IV inhibitor prodipin védő hatás gyakorol az allograft túlélésére146. A PBC-ben megfigyelhető hisztopatológiai eltérések számos 66
vonatkozásban
hasonlóak
a
rejekciós
vagy
graft-versus-host
betegségben
megfigyeltekkel. Feltételezve, hogy a DPP IV-nek az immunfolyamatokban elősegítő szerepe van, a jövőben ezekben a betegségekben DPP IV inhibitoroknak vagy monoklonális antitesteknek terápiás értéke is lehet. Fontos megemlíteni a DPP IV lehetséges szerepét a fibrózis kialakulásában is. Kimutatták, hogy a DPP IV szerepet játszik a májsejteknek az extracelluláris matrixszal (ECM) való interakciójában, továbbá a sejteknek a kollagénhez való kötődésében137. A fibrogenezis során az ECM remodellingje figyelhető meg. Jelen ismereteink szerint az ECM megváltozásáért elsősorban az aktivált hepatikus stellata sejteket tesszük felelőssé, a folyamatot természetesen más nekroinflammatórikus szignálok is befolyásolják147. Májcirrhosisban a stellata sejteken fokozott fibroblast aktivációs protein (FAP) expressziót mutattak ki148. Az enzim homológiát mutat a DPP IV-vel, szöveti eloszlása azonban jelentősen eltér, elsősorban reaktív mesenchymalis sejtek expresszálják. A stellata sejt által expresszált FAP szintén rendelkezik DPP IV és gelatináz aktivitással149, így cirrhosisban hozzájárulhat az extracellularis matrix megváltozásához. Nem ismert, hogy szolubilis formában a molekula megőrzi-e enzimatikus aktivitását. Scanlan és mtsai.137 kimutatták, hogy a DPP IV azonos a fibroblast aktivációs protein-β-val. Ez a molekula valószínűleg fontos szerepet játszik a fibroblastok aktiválódásában és proliferációjában150. Ugyanakkor adatok vannak arra, hogy a DPP IV nem játszik lényeges szerepet a máj regenerációs folyamataiban, legalább is parciális hepatektomia után151. Az ECM remodelling komplex folyamat, számos fehérje (pl. kollagén, laminin, stb.) szekrécióját, illetve specifikus proteáz/proteáz inhibitor rendszerek általi degradációját felöleli. Egy tanulmány arról is beszámolt, hogy a DPP IV-nek endopeptidáz aktivitása is van (denaturált fibrilláris kollagén specificitással)149, így lehetséges, hogy a kollagén metabolizmusban is szerepe van. Mindezek alapján elképzelhető, hogy a DPP IV nekroinflammatórikus szignálként részt vesz az ECM remodellingjében, a megváltozott cytokin profil, a biológiailag aktív fehérjék hasítása, fokozott fibroblast aktiváció, sejt-kollagén kapcsolatok megváltozása révén szerepet játszhat a fibrózis kialakulásában.
67
További vizsgálatok szükségesek annak eldöntésére, hogy a mért magasabb szérum DPP IV aktivitás csupán indikátora-e a májkárosodásnak, vagy szerepe van a folyamat fenntartásában, a fibrózis kialakulásában. A második lehetőséget támogatja, hogy az állatkísérletben DPP IV inhibitor a graft versus host betegség kialakulását képes volt meggátolni, növelte az allograft túlélését146. Összegezve: eredményeink azt mutatták, hogy különböző etiológiájú krónikus májbetegségekben (PBC, krónikus C hepatitis) illetve kísérletes májcirrhosisban a szérum DPP IV aktivitás cholestasis nélkül is emelkedett. Az emelkedés kapcsolatot mutat a nekroinflammatórikus enzimekkel, és úgy tűnik, hogy indikátora lehet a májkárosodás súlyosságának. Feltételezhetjük, hogy a szolubilis DPP IV-nek a máj gyulladásos folyamatában elősegítő szerepe lehet, és szerepet tölthet be a krónikus sejtkárosodás létrejöttében, a fibrózis kialakulásában.
68
9. Főbb új tudományos eredmények 1, Munkámban különböző genetikai faktorok lehetséges szerepét vizsgáltam a PBC illetve a PBC-hez társuló osteoporosis patogenezisében. Az irodalomban elsőként számoltam be az ösztrogén receptor alfa (ER-α) XbaI, PvuII génpolimorfizmusokról PBC-ben. Gyakoribbnak találtam az XbaI Xx és a PvuII Pp genotípusokat a magyar betegekben. 2, Az irodalomban ellentétes közlések ismertek a D vitamin receptor gén polimorfizmusról PBC-ben. Gyakoribbnak találtam a D vitamin receptor BsmI BB genotípust és B allélt PBC-ben, ezzel megerősítettem, hogy Közép-Európának ebben a régiójában ez a polimorfizmus a gyakori. 3, Ezidáig egy angol közlés volt ismert az interleukin-1 receptor antagonista gén (IL1RN)
VNTR
polimorfizmusáról
PBC-ben.
Az
általam
vizsgált
magyar
betegpopulációban a gén polimorfizmusa nem különbözött a kontroll populációban megfigyelt eloszlástól, tendenciaszerűen az A1 genotípus volt gyakoribb. 4, Vizsgálataim alapján úgy tűnik, hogy az IL-1RN gén polimorfizmusa kapcsolatba hozható a PBC lefolyásával, az A1 heterozygota betegekben a PBC progressziója gyorsabb volt. 5, Az ösztrogén receptor alfa és IL-1RN gén polimorfizmusok és a csont-ásványianyag tartalom között nem találtam kapcsolatot, ugyanígy nem volt kapcsolat a korábban is vizsgált VDR BsmI polimorfizmusa és a csont ásványianyag-tartalom között sem. Mindezek alapján nem valószínű, hogy – legalábbis a magyar betegekben – ezeknek a génpolimorfizmusoknak jelentős szerepe lenne a BMD meghatározásában PBC-ben. 5, Adataim szerint postmenopausás PBC-s nőbetegekben az osteoporosis gyakorisága mind utánkövetéses, mind keresztmetszeti vizsgálatban a világirodalmi adatokhoz hasonlóan gyakori, a betegek 40 – 50 %-ában kimutatható. Az osteoporosis kialakulása a betegségtartammal, a májbetegség progressziójával volt kapcsolatban.
69
6, Kompenzált stádiumú PBC-s betegekben alacsonyabb endothelin-1 (ET-1) szintet találtam. 7, Összefüggést mutattam ki az ET-1 szint és a csont ásványianyag tartalma között. Mivel az ET-1 az osteoblastokat aktiválja, és az osteoclastokat gátolja, felvetődik annak a lehetősége, hogy a csökkent ET-1 szintnek szerepe lehet az osteoporosis kialakulásában PBC-ben. 8, Megvizsgáltam a szérum DPP IV aktivitást különböző etiológiájú krónikus májbetegségekben.
PBC-ben,
krónikus
C
hepatitis-ben
illetve
kísérletes
májcirrhosisban magasabb szérum DPP IV aktivitást figyeltem meg cholestasis jelenléte nélkül is. 9,
A
szérum
DPP
IV
aktivitás
emelkedése
kapcsolatot
mutatott
a
nekroinflammatórikus enzimekkel, PBC-ben a betegség stádiumaival. Krónikus C hepatitisben a DPP IV aktivitás alkalmas volt az interferon terápiára responder és a non-responder betegek elkülönítésére. Úgy tűnik, hogy a szérum DPP IV aktivitás indikátora lehet a májkárosodás súlyosságának.
70
10. Melléklet
Melléklet 1. ábra (A) A boncolásnál talált makroszkópos kép: 1. egészséges máj (és testisek), 2. fenobarbitál kezelés hatása a májra 3. cirrhotikus máj (és testisek), (B) Fenobarbitál kezelés hatására a hepatociták mérsékelten megnyagyobbodtak, a citoplasma homogén, halvány (H&E, 1:250), (C) Cirrhosis a DEN, CCl4 és fenobarbitál kezelt állatokban (picrosirius red / polarizáció, 1:40), (D) A cirrhotikus májban aktív gyulladásos folyamat volt megfigyelhető, a kötőszövet nagy számú limfocitát tartalmaz (H&E, 1:250)
71
11. Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt szeretnék hálás köszönetet mondani mesteremnek Dr. Szalay Ferencnek az I. sz. Belgyógyászati Klinika egyetemi tanárának, aki mindenben támogatott. Egy széles látókörű, nyitott kutatót ismerhettem meg Benne, sugárzott belőle a betegek és a belgyógyászat iránti őszinte odaadás és tisztelet. Ő volt az, akit a nap bármelyik percében zavarhattam, bármilyen problémával, kérésem mindig meghallgatásra talált. Köszönöm Neki, hogy megtisztelt bizalmával, hogy tanítványává fogadott, és hogy Tőle tanultam meg a betegek szeretetét, és a gondos belgyógyászati látásmód alapjait is. Kritikája, segítő megjegyzései, lankadhatatlan figyelme, állandó bíztatása, barátsága munkám során végig elkísért. Hálával tartozom Dr. Papp János egyetemi tanárnak, aki harmadéves medikus korom óta figyelemmel kíséri pályámat. Ő volt az, akinek a példája végérvényesem megszilárdította bennem a belgyógyászat iránti elkötelezettséget. Köszönöm Neki barátságát, és hogy láthattam mellette a belgyógyász-gastroenterológusok munkás hétköznapjait. Kitartása, munkabírása, emberi méltósága mindig lenyűgözött. Köszönöm, hogy mindig kiállt mellettem, hogy tanított és az endoscopos csapatának tagjává fogadott. Külön köszönöm Dr. de Chatel Rudolf egyetemi tanárnak, a Semmelweis Egyetem I.sz. Belgyógyászati Klinika igazgatójának, hogy kutatómunkámhoz és a belgyógyászat elsajátításához minden segítséget megadott. Őszintén köszönöm Dr. Lakatos Péter egyetemi docensnek, hogy nemzetközi színvonalú kutatólaborjába befogadott, kritikus észrevételeivel, tanácsaival nagy segítségemre volt az értekezés elkészítésében. Munkatársként is magával ragadott racionalitása, dinamizmusa és örökös tenni akarása. Köszönetet mondok Dr. Zalatnai Attila a Semmelweis Egyetem I.sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet egyetemi docensnék az állatkísérletek kivitelezésében nyújtott segítségéért és a morfometriai és a szövettani vizsgálatok elvégzéséért. Nagyon köszönöm Dr. Selmeci Lászlónak a Semmelweis Egyetem Szív- és Érsebészeti Klinika egyetemi tanárnak a DPP IV mérések elvégzésében nyújtott segítségét. Hálás vagyok Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanárnak, hogy doktori programjában kutatásaimhoz keretet biztosított. Szeretnék köszönetet mondani minden kollégámnak, külön is kiemelve Dr. Firneisz Gábornak egykori diákkörös és jelenlegi PhD-s társamnak és az endoscopos csapatnak (Dr. Fuszek Péter és Dr. Kisfalvi Krisztina). Köszönöm a bizalmat, a türelmüket, a tanítást és a sok segítséget, amit Tőlük kaptam, és azt hogy elfogadtak munkatársuknak. Köszönetet mondok minden laboratóriumi asszisztensnek, akik munkájukkal hozzájárultak a vizsgálatok elvégzéséhez. És végül, de egyáltalán nem utolsó sorban szeretnék köszönetet mondani családomnak. Drága Édesapám, Tőled kaptam az orvosi pálya szeretetét, köszönöm hogy „kollégaként” is sokat tanítottál, hogy emberként és orvosként is egyengetted utamat. Drága Édesanyám, köszönöm, hogy mindig konzekvensen neveltél, hogy szilárd alapot kaptam Tőled az élethez. Köszönöm, hogy megteremtetted nekünk a biztos meleg családi hátteret. Drága Testvérem, Nagypapám és Nagymamám, köszönöm nektek, hogy egy csodálatos családban élhetek, köszönöm a szomorú és a boldog pillanatokat. És legfőképpen köszönöm a szereteteket.
72
12. Irodalomjegyzék 12.1. Saját publikációk jegyzéke Az értekezéshez közvetlenül kapcsolódó saját publikációk jegyzéke absztraktok nélkül Közlemények I. Lakatos PL, Firneisz G, Lakatos P, Horváth Cs, Szalay F. A csont-ásványianyag tartalom utánkövetéses vizsgálata postmenopausás primer biliaris cirrhosisos nőbetegekben. Orvosi Hetilap 2001;142;503-8. II. G Firneisz, PL Lakatos, Hungarian Viral Hepatitis Study Group, F Szalay. Serum dipeptidyl peptidase IV (CD26, E.C.3.4.14.5.) activity in chronic hepatitis C. Scand J Gastroenterol 2001;36:877-80. IF:1,842 III. PL Lakatos, G Firneisz, D Borcsiczky, A Zalatnai, L Selmeci, F Szalay. Serum dipeptidyl peptidase IV (CD26, E.C.3.4.14.5.) activity in experimental liver cirrhosis. Eur J Clin Invest 2000;30:793-7. IF:2,071 IV. Lakatos PL, Firneisz G, Rákóczy Gy, Selmeci L, Szalay F. Emelkedett szérum dipeptydil-peptidáz IV (CD26, EC 3.4.14.5) aktivitás primer biliaris cirrhosisban. MBA 2000;53:24-9. V. Lakatos PL, Firneisz G, Rákóczy Gy, Selmeci L, Szalay F. Elevated serum dipeptidyl peptidase IV (CD26, E.C.3.4.14.5.) activity in patients with primary biliary cirrhosis. J Hepatol 1999;30:740. IF:3,705 Az értekezéshez közvetlenül nem kapcsolódó saját publikációk jegyzéke absztraktok nélkül Könyvrészlet VI. Lakatos PL. Gastrointestinalis genetika. in Gastro Update 2001, ed: Metzger Péter, Papp János, Melánia Kiadói kft., Budapest, 2001 pp 283-299. VII. Lakatos PL. A Helicobacter pylori fertőzés. in Gastro Update 1999, ed. Papp János, Melánia Kiadói kft., Budapest, 1999, pp. 61-76. Közlemények VIII. Lakatos PL, Lakatos L, Pár A, Papp J. Gastrointestinalis genetika és génterápiás lehetőségek a nyelőcső, a gyomor, a colon és a pancreas betegségeiben. Orvosi Hetilap (publikációra elfogadva) IX. Pár A, Szalay F, Lakatos PL, Nagy Z, Mózsik G. Genetikai a hepatológiában. Orvosi Hetilap (publikációra elfogadva) X. Pár A, Lakatos PL, Abonyi M, Szalay F, Mózsik G. A géntherapia lehetőségei májbetegségekben. Orvosi Hetilap (publikációra elfogadva) XI. Firneisz G, Lakatos PL, Szalay F, Polli C, Glant TT, Ferenci P.Common mutations of ATP7B in Wilson disease patietns from Hungary. Am J Med Genet (publikációra elfogadva) IF:2,479 XII. Lakatos L, Lakatos PL. A Helicobacter pylori fertőzés és a peptikus fekélybetegség. Komplementer Medicina 2000;4(8):19-22. XIII. Firneisz G, Komoly S, Halász P, Lakatos PL, Szalay F. Hypersomnia mint a Wilson-kór első tünete. MBA 2000;53:283-5. XIV. Lakatos PL, Lakatos L, Papp J. A Helicobacter pylori fertőzés és a gyomorrák. Orvosi Hetilap 1999;140:2499-2506. 73
XV. Lakatos PL, Lakatos L, Papp J. A Helicobacter pylori fertőzés patofiziológiája. Orvosi Hetilap 1999;140:1723-30. XVI. Szalay F, Lakatos PL. A Helicobacter pylori és a gyomorrák. Praxis 1999;8(4):19-24. XVII. Szalay F, Lakatos PL. A Helicobacter pylori infekció és a gyomorrák. Praxis 1999;8(suppl): 57-62. Az értekezéshez közvetlenül kapcsolódó absztrakt formában megjelent publikációk XVIII. Lakatos PL, Bajnok E, Lakatos P, Szalay F. Vitamin D receptor BsmI, IL-1 receptor antagonist gene VNTR and estrogen gene ER-PuvII and XbaI polymorphism in Hungarian patients with primary biliary cirrhosis. Gut 2001; 49 (suppl III.): 1990. Előadás, 9th United European Gastroenterology Week, Amszterdam, 2001.október 6-10. XIX. Lakatos PL, Bajnok E, Lakatos P, Szalay F. Vitamin D receptor BsmI, IL-1 receptor antagonist gene VNTR and estrogen gene ER-PuvII and XbaI polymorphism in Hungarian patients with primary biliary cirrhosis. Z Gastroenterol 2001;39:403,95., Magyar Gastroenterológiai Társaság 43. Nagygyűlése, Balatonaliga 2001. Június 5-9. XX. Lakatos PL, Firneisz G, Lakatos P, Horváth Cs, Szalay F. A csont ásványianyagtartalmának utánkövetéses vizsgálata posztmenopauzális primer biliaris cirrhosisos nőbetegekben. Ca és csont 2000;3(suppl1):s9, Előadás, Magyar Osteoporosis és Osteoarthrológiai Társaság IX. Nagygyűlése, Balatonfüred, 2000. Június 8-10. XXI. F Szalay, PL Lakatos, G Firneisz, P Lakatos, Cs Horváth. Urinary pyrolidine/creatinine, deoxypirolidine /creatinine ratio and bone mineral density follow up in postmenopausal primary biliary cirrhosis. Z Gastroenterol 2000;38:425,109., Magyar Gastroenterológiai Társaság 42. Nagygyűlése, Balatonaliga 2000. Június 6-10. XXII. PL Lakatos, G Firneisz, F Szalay. Serum dipeptidyl peptidase IV (DPP IV,CD26) activity in INF-responder patients with chronic hepatitis C. Z Gastroenterol 2000;38:413,64., Magyar Gastroenterológiai Társaság 42. Nagygyűlése, Balatonaliga 2000. Június 6-10. XXIII. PL Lakatos, G Firneisz, A Zalatnai, L Selmeci, F Szalay Serum dipeptidyl peptidase IV (CD26, E.C.3.4.14.5.) activity in experimental liver cirrhosis. Z Gastroenterol 1999;37:430/106., Magyar Gastroenterológiai Társaság 41. Nagygyűlése, Balatonaliga 1999. Június 8-12. XXIV. G. Firneisz, P.L. Lakatos, M. Horányi, J. Gervain, the Hungarian Interferon Study Group, F. Szalay. Altered serum dipeptidyl peptidase IV (DPP IV, CD26) activity in hepatitis C. Difference between responders and non-responders to interferon therapy. Gut 1999;95(suppl V):A155/P0329., 7th United European Gastroenterology Week, Roma, 1999. Szeptember 13-17. XXV. Szalay F, Lakatos PL, Firneisz G, Zalatnai A, Selmeci L. Elevated serum dipeptidyl peptidase IV (CD26, E.C.3.4.14.5.) activity in experimental liver cirrhosis. Gastroenterology 1999;116,1280,L0445., Amerikai Gastroenterológiai Társaság 100. Nagygyűlés, Orlando 1999. Május 16-19. XXVI. Szalay, P. Lakatos, P. Lakatos Jr, Plasma endothelin-1 and bone mineral density in primary biliary cirrhosis. Z Gastroenterol 1997, 35: 402, 139. Előadás, Magyar Gastroenterológiai Társaság 39. Nagygyűlése, Balatonaliga 1997. Június 3-7. XXVII. C. Szalay F, Lakatos P, Lakatos P Jr Plasma endothelin-1 in primary biliary cirrhosis and chronic hepatitis, Gastroenterology, 1997, 112(4): A1392., Amerikai Gastroenterológiai Társaság 97. Nagygyűlés, Washington 1997. Május 11-14. XXVIII. Szalay F, Lakatos P, Lakatos P Jr, Plazma endothelin-1 szint primer biliáris cirrhosisban, krónikus C hepatitisben és egyéb májbetegségekben. MBA; 1996, XLIX (suppl 2); 201, Előadás, Magyar Belgyógyász Társaság XXXVI. Nagygyűlés, Budapest, 1996. November 21-23.
74
12.2. Felhasznált irodalom 1
Addison T, Gull W: On a certain affection of the skin- vitiligoidea- alfa plana beta tuberosa. Guy’s Hosp Rep 1851; 7 (Ser 2): 265-76. 2 Ahrens EH, Payne MA, Kunkel HG és mtsai: Primary biliary cirrhosis. Medicine (Baltimore) 1950; 29: 299-364. 3 Inoue K, Hirohara J, Nakano T és mtsai: Prediction of prognosis of primary biliary cirrhosis in Japan. Liver 1995; 15: 70-7. 4 Kim WR, Lindor KD, Locke GR, és mtsai. Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 2000;119;1631-6. 5 Parikh-Pathel A, Gold EB, Worman H, és mtsai. Risk factor for primary biliary cirrhosis in a cohort of patients from united states. Hepatology 2001;33:16-21. 6 Onishi S, Sakamaki T, Maeda T és mtsai: DNA typing of HLA class II genes: DRB1*0803 increases the susceptibility of japanese to primary biliary cirrhosis. J Hepatol 1994; 21: 1053-60. 7 Mella JG, Roschmann E, Maier KP és mtsa: Association of primary biliary cirrhosis with the allele HLA-DPB1*0301 in a German population. Hepatology 1995; 21: 398402. 8 Tsuji K, Watanabe Y, Aisaka Y és mtsai: Detection of anti-pyruvate dehydrogenase complex antibody in primary biliary cirrhosis by an enzyme-linked immunosorbent assay. Gastroenterology 1997; 112: A1403(absztrakt) 9 Gordon MA, Oppenheim E, Camp NJ, és mtsai. Primary biliary cirrhosis shows association aith genetic polymorphism of tumour necrosis factor alpha promoter region. J Hepatol 1999;31:366-8. 10 Agarwal K, Jones DE, Daly AK, és mtsai. CTLA-4 gene polymorphism confers susceptibility to primary biliary cirrhosis. J Hepatol 2000;32:538-41. 11 Corpechot C, Benlian P, Barbu V, és mtsai. Apolipoprotein E polymorphism, a marker of disease severity in primary biliary cirrhosis? J Hepatol 2001;35:324-8. 12 Lingreen S, Erikson S: IgM in primary biliary cirrhosis: physochemical and complement activating properities. J Lab Clin Med 1982; 99: 636-45. 13 Yeaman SJ, Kirby JA, Jones DE. Autoreactive responses to pyruvate dehydogenase complex in the pathogenesis of primary biliary cirrhosis. Immunol Rev 2000;174:23849. 14 Comay D, Cauch-Dudek K, Hemphill D, és mtsai. Are antibodies to carbonic anhydrase II specific for antimitochondrial antibody-negative primari biliary cirrhosis. Dig Dis Sci 2000;45:2018-21. 15 Kisand KE, Metskula K, Kisand KV, és mtsai. Follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 2001;36:248-54. 16 Berg PA, Klein R: Mitochondrial antigen/antibody system in primary biliary cirrhosis: revisited. Liver 1995; 15: 281-92. 17 Nagano T, Yamamoto K, Matsumoto S, és mtsai. Cytokine profile in the liver of primary biliary cirrhosis. J Clin Immunol 1999;19:422-7. 18 Büki B, Rásky K, Szalay F. Plazma interleukin-6 vizsgálata idült májbetegségekben. MBA 1994;47:169-71. 19 Niehues T, Gulwani-Akolkar B, Goldman IS és mtsai: Marked T-cell decrease in peripherial blood of patients with primary biliary cirrhosis. Autoimmunity 1994; 18: 267-73. 20 Martins EBG, Graham AK, Chapman RW és mtsa: Elevation of γ/δT lymphocytes in peripherial blood and livers in patients with primary biliary cirrhosis. Hepatology 1996; 75
23: 988-93. 21 Harada K, Van de Water J, Leung PSC és mtsai: In situ nuclein acid hybridization of cytokines in primary biliary cirrhosis: Predominance of the Th1 subset. Hepatology 1997; 25: 791-6. 22 Invernizzi P, de Andreis C, Sirchia SM, és mtsai. Blood fetal microchimerism in primary biliary cirrhosis. Clin Exp Immunol 2000;122:418-22. 23 Tsuneyama K, Van de Water J, Leung PSC és mtsai: Abnormal Expression of the E2 component of the pyruvate dehydrogenase complex on the luminal surface of biliary epithelium occurs before major histoconpability complex class II and BB1/B7 expression. Hepatology 1995; 21: 1031-7. 24 Shimoda S, Nakamura M, Shigematsu H, és mtsai. Mimicry peptides of human PDCE2 163-176 peptide, the immunodominant T-cell epitope of primary biliary cirrhosis. Hepatology 2000;1212-16. 25 Palmer JM, Jones DE, Quinn J, és mtsai. Characterization of the autoantibody responses to recombinant E3 binding protein (protein X) of the pyruvate dehydrogenase in primary biliary cirrhosis. Hepatology 1999;30:21-26. 26 Van de Water J, Ishibashi H, Coppel RL, és mtsa. Molecular mimicry and primary biliary cirrhosis: premises not promises. Hepatology 2001;33:771-775. 27 Haydon GH, Neuberger J. PBC: an infectious disease? Gut 2000;47:586-88. 28 Teoh KL, Mackay IR, Rowley MJ és mtsa: Enzyme inhibitory antibodies to pyruvate dehidrogenase complex in primary biliary cirrhosis differ for mammalian, yeast and bacterial enzymes: implication for molecular mimicry. Hepatology 1994; 19: 1029-33. 29 Nilsson OH, Taneera J, Castedal M és mtsai. Identification of Helicobacter pylori and other Helicobacter species by PCR hybridization, and partial DNA squenning in humane liver samples from patients with primary sclerosing cholangitis and primary biliary cirrhosis. J Clin Microbiol 2000;38:1072-76. 30 Mason AL, Xu L, Guo L és mtsai: Patients with primary biliary cirrhosis and other idiopathic liver diseases have serum reactivity to retroviral proteins. Hepatology 1997; 26(Suppl): 558A, 1719(absztrakt) 31 Long SA, Quan C, Van de Watrer J, és mtsai. Immunoreactivity of organic mimetopes of the E2 component of pyruvate dehydrogenase: connecting xenobiotics with primary biliary cirrhosis. J Immunol 2001;167:2956-63. 32 Leon MP, Kirby JA, Gibbs P és mtsai:Immunogenicity of biliary epithelial cells: study of the expression of B7 molecules. J Hepatol 1995; 22: 591-595. 33 Sadamoto T, Neuberger JM, Joplin R: Effect of pro-inflammatory cytokines on human biliary epithelial cells(BEC): interleucin 1 upregulates pyruvate dehydrogenase E2/X (PDC-E2/X). Hepatol 1997; 26(Suppl): 444A, 1264(absztrakt) 34 Kawamura K, Kobayashi Y, Kageyama F, és mtsai. Enchanced hepatic lipid peroxydation in patients with primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol 2000;95:3596-601. 35 Rust C, Gores GJ: Apoptosis and liver disease. Am J Med 2000;278:G354-66. 36 Leon MP, Basseninde MF, Willson JL és mtsai: Immunogenicity of biliary epithelium: investigation of antigen presentation to CD4+ Tcells. Hepatology 1996; 24: 561-7. 37 Murakami M, Honjo T: Involvement of B1 cells in mucosal immunity and autoimmunity. Immunology Today 1995; 16: 534-9. 38 Sakisaka S, Kawaduchi T, Taniguchi E és mtsai: Alteration in thight junctions differ between parimary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis. Hepatology 2001;33:1460-68.
76
39
Kaplan MM: Primary biliary cirrhosis. N Eng J Med 1996; 335: 1570-80. Fleming CR, Dickson ER, Hollenhorst RW és mtsai: Pigmented corneal rings in a patient with primary biliary cirrhosis. Gastroenterol 1975; 69: 220-5. 41 Dickson ER, Grambsch PM, Fleming TR és mtsai: Prognosis in primary biliary cirrhosis: model for decision making. Hepatology 1989; 10: 1-7. 42 Golding PL, Brown R, Mason AMS és mtsai: Sicca Complex in liver disease. BMJ 1970; 4: 340-2. 43 Morris JA, McIllmurry MB: Primary biliary cirrhosis and focal glomerulonephritis. Br Med J 1977; I: 1836-7. 44 Selinger S, Tsai J, Pulini M és mtsai: Autoimmune thrombocytopenia and primary biliary cirrhosis with hypoglycemia and insulin receptor autoantibodies. Ann Intern Med 1987; 107: 686-8. 45 Kingham JGC, Parker DR: The association between primary biliary cirrhosis and coeliac disease: a study of relative prevalences. Gut 1998; 42: 120-2. 46 Milosevc M, Adams P: Primary biliary cirrhosis and polymyositis. J Clin Gastroenterol 1990; 12: 332-5. 47 Poupon R, Poupon RE. Treatment of primary biliary cirrhosis. Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol 2000;14:615-28. 48 Poupon RE, Bonnand AM, Chretien Y, és mtsa. Tem-year survival in ursodeoxycholic acid-treated patients with primary biliary cirrhosis. Hepatology 1999;29:1668-71. 49 Corpechot C, Carrat F, Bonnand AM, és mtsai. The effect of ursodeoxycholic acid therapy on liver fibrosis progression in primary biliary cirrhosis. Hepatology 2000;32:1196-9. 50 Vombes B, Carthers RL, Maddrey WC, és mtsai. Biliary bile acids in primary biliary cirrhsosi: effect of ursodeoxycholic acid. Hepatology 1999;29:1649-54. 51 Benz C, Angermüller S, Otto G és mtsai. Effect of tauroursodeoxycholic acid on bile acid-induced apoptosis in primary biliary cirrhosis. Eur J Clin Invest 2000;30:203-9. 52 Ljubuncic P, Tanne Z, Bomzon A: Ursodeoxycholic acid supresses extent of lipid peroxydation in diseased liver in experimental cholestatic liver disease. Dig Dis Sci 2000;45:1921-8. 53 Sakisaka S, Koga H, Sasatomi K és mtsai. Ursodeoxycholic acid reduces expression of heath shock proteins in primary biliary cirrhosis. Liver 2000;20:78-87. 54 Loria P, Bozzoli M, Concari M és mtsai: Effect of taurohyodeoxycholic acid on biliary lipid secration in humans. Hepatology 1997; 25: 1306-14. 55 Mitchinson HC, Palmer JM, Bassendine MF és mtsai: A controlled trial of prednisolone in primary biliary cirrhosis. J Hepatol 1992; 15: 336-44. 56 Angulo P, Jorgensen RA, Keach JC, és mtsai. Oral budenosid in the treatment of patietns with primary biliary cirrhosis with a suboptimal response to ursodeoxycholis acid. Hepatology 2001;31:318-23. 57 Battezzati PM, Zuin M, Crosignani A, és mtsai. Ten-year combination treatment with colchicine and ursodeoxycholic acid for primary biliary cirrhosis: a double-blind, placebo controlled trial on symptomatic patients. Aliment Pharmacol Ther 2001;15:1427-34. 58 Miyaguchi S, Ebinuma H, Imaeda H, és mtsa. A novel treatment for refractory primary biliary cirrhosis? Hepatogastroenterology 2000;47:1518-21. 59 Liermann Garcia RF, Evangelista Garcia C, McMaster P, és mtsa. Transplantation for primary biliary cirrhosis: retrospective analysis of 4000 patients in a single center. Hepatology 2001;33:22-7. 40
77
60
Hashimoto E, Shimada M, Noguchi S, és mtsai. Disease recurrence after living liver transplantation for primary biliary cirrhosis: a clinical and histological follow-up study. Liver Transpl 2001;7:588-95. 61 Jones EA, Bergasa NV. The pathogenesis and treatment of pruritus and fatigue in patients with PBC. Eur J Gastroenterol Hepatol 1999;11:623-31. 62 Swain MG, Marik M: Defective corticotrop-releasing hormone mediated neuroendocrin and behavioral responses in cholestatic rate: implications for cholestatic liver disease-related sickness behavior. Hepatology 1995; 22; 1560-4. 63 Swain MG, Maric M: Improvement in cholestasis-associated fatigue with a serotonin receptor agonist using a novel rat model of fatigue assessment. Hepatology 1997; 25: 291-4. 64 Hay EJ. Bone disease in cholestatic liver disease. Gastroenterology 1995;108:276-83. 65 Monegal A, Navasa M, Guanabens N, és mtsai. Osteoporosis and bone mineral metabolism disorders in cirrhotic patients referred for orthotopic liver transplantation. Calcif Tissue Int 1997;60:148-54. 66 Menon KV, Angulo P, Weston S, és mtsai. Bone disease in primary biliary cirrhosis: independent indicators and rate of progression. J Hepatol 2001;35:316-323. 67 Newton J, Francis R, Prince M, és mtsai. Osteoporosis in primary biliary cirrhosis revisited. Gut 2001;49:282-7. 68 Crippin JS, Jorgensen RA, Dickson ER, és mtsa. Hepatic osteodystrophy in primary biliary cirrhosis: effects of medical treatment. Am J Gastroenterol 1994;89:47-51. 69 Mitchinson HC, Malcolm AJ, Bassendine MF, és mtsa. Metabolic bone disease in primary biliary cirrhosis at presentation. Gastroenterology 1988;94:463-70. 70 Diamond T, Stiel D, Mason R, és mtsai. Serum vitamin D metabolites are not responsible for low bone turnover osteoporosis in chronic liver disease. J Clin Endocrinol Metab 1989;69:1234-38. 71 Phillips JR, Angulo P, Petterson T, és mtsa. Fat-soluble vitamin levels in patients with primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol 2001;96:2745-50. 72 Stellon AJ, Webb A, Compston J, és mtsa. Low bone turnover state in primary biliary cirrhosis. Hepatology 1987;7:137-42. 73 Hodgson SF, Dickson ER, Eastell R, és mtsai. Rates of cancellous bone remodelling and turnover in osteopenia associated with primary biliary cirrhosis. Bone 1993;14:81927. 74 Cuthbert JA, Pak CYC, Zerwekh JE, és mtsai. Bone disease in primary biliary cirrhosis: increased bone resorption and turnover in the absence of osteoporosis or osteomalacia. Hepatology 1984;4:1-8. 75 Szalay F, Lakatos P, Németh J, és mtsai. Osteocalcin szérum szint csökkenése nemalkoholos idült májbetegekben. Orv Hetil 1991;132:1301-5. 76 Abrahamsen B, Shalhoub V, Larson EK, és mtsai. Cytokine RNA levels in transiliac bone biopsies from healthy early postmenopausal women. Bone 2000;26:137-45. 77 Verbruggen A, De Clerck S, Bridts CH, és mtsai. Flow cytometrical determination of interleukin 1beta, interleukin 6 and tumor necrosis factor alpha in monocytes of rheumatoid arthritis patients; relation with parameters of osteoporosis. Cytokine 1999;11:869-74. 78 Yamashiki M, Kosaka Y, Nishimura A, és mtsai. Analysis of serum cytokine levels in primary biliary cirrhosis patients and healthy adults. J Clin Lab Anal. 1998;12:77-82. 79 Walsh CA, Birch MA, Fraser WD, és mtsai. Cytokine expression by cultured osteoblasts from patients with osteoporotic fractures. Int J Exp Pathol 2000;81:159-63. 80 Janes CH, Dickson ER, Okazaki R, Bonde S, McDonagh AF, Riggs BL. Role of
78
hyperbilirubinaemia in the impairment of osteoblast proliferation associated with cholestatic jaundice. J Clin Invest 1995;95:2581-86. 81 Springer JE, Cole DEC, Rubin LA, és mtsai. Vitamin D-receptor genotypes as independent genetic predictors of decreased bone mineral density in primary biliary cirrhosis. Gastroenterology 2000;118:145-51. 82 Pares A, Guanabens N, Alvarez L, és mtsai. Colagen type Ialpha1 and vitamin D receptor gene polymorphisms and bone mass in primary biliary cirrhosis. Hepatology 2001;33:554-60. 83 Halmos B, Szalay F, Cserniczky T, és mtsai. Vitamin D receptor genotypes and bone mineral density in patients with primary biliary cirrhosis. Dig Dis Sci 2000;45:1091-95. 84 Wolfhagen FH, van Buuren HR, Vleggaar FP, és mtsa. Managment of osteoporosis in primary biliary cirrhosis. Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol 2000;14:629-641. 85 Olsson R, Mattsson LA, Obrant K, és mtsa. Estrogen-progesteron therapy for low bone density in primary biliary cirrhosis. Liver 1999;19:188-92. 86 Sunyer T, Lewis J, Collin-Osdoby P, és mtsa. Estrogen’s bone-protective effects may involve differential IL-1 receptor regulation in human osteoclast-like cells. J Clin Invest 1999;103:1409-18. 87 Floreani A, Zappala F, Fries W, és mtsai. A 3-year pilot study with 1,25dihydroxyvitamin D, calcium, and calcitonin for severe osteodystrophy in primary biliary cirrhosis. J Clin Gastroenterol 1997;24:239-44. 88 Morrison NA, Qi JC, Tokita A, és mtsai. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature 1994;367:706-710. 89 Tarlow JK, Blakemore AIF, Lennard A, és mtsai. Polymorphism in human IL-1 receptor antagonist gene intron 2 is caused by variable numbers of an 86-by tandem repeat. Hum Genet 1993;91:403-404. 90 Kanis JA, Melton LJ, Christiansen C, és mtsai. The diagnosis of osteoporosis. J Bone Miner Res 1994;9:1137-41. 91 Rákoczi Gy, Takács L, Jakabfi P, és mtsai. Increased urinary dipeptidyl peptidase IV activity in extrahepatic biliary atresia. Lancet 1995; 345: 864-5. 92 Pocock NA, Eisman JA, Hopper JL, és mtsai. Genetic determinants of bone mass in adults: A twin study. J Clin Invest 1987;80:700-710. 93 Cooper GS, Umbach DM. Are vitamin D receptor polymorphisms associated with bone mineral density? A meta-analysis. J Bone Miner Res 1996;12:1841-49. 94 Fleet JC, Harris SS, Wood RJ, és mtsa. The BsmI vitamin D receptor restriction fragment lenght polymorphism (BB) predicts low bone density in premenopausal black and white women. J Bone Miner Res 1995;10:985-90. 95 Garnero P, Borel O, Sornay-Rendu E, és mtsai. Vitamin D receptor gene polymorphisms are not related to bone turnover, rate of bone loss, and bone mass in postmenopausal women: the OFELY study. J Bone Miner Res 1996;11:827-34. 96 Deng HW, Li J, Li JL, és mtsai. Change of bone mass in postmenopausal Caucasian women with and without hormone replacement therapy is associated with vitamin D receptor and estrogen receptor genotypes. Hum Genet 1998;103:576-85. 97 Kobayashi S, Inoue S, Hosoi T, és mtsai. Association of bone mineral density with polymophism of the estrogen receptor gene. J Bone Miner Res 1996;11:306-11. 98 Albagha OME, McGuigan FEA, Reid DM, és mtsa. Estrogen receptor a gene polymorphisms and bone mineral density: haplotype analysis in women from United Kingdom. J Bone Miner Res 2001;16:128-134. 99 Salmén T, Heikkinen AM, Mahonen A, és mtsai. Early postmenopausal bone loss is associated with PvuII estrogen receptor gene polymorphism in Finnish women: effect of
79
hormone replacement therapy. J Bone Miner Res 2000;15:15:315-321. 100 Bagger YZ, Jorgensen HL, Heegaard AM, és mtsai. No major effect of estrogen gene polymorphisms on bone mineral density or bone loss in postmenopausal Danish women. Bone 2000;26:111-16. 101 Korach KS. Insights from the study of animals lacking functional estrogen receptor. Science 1994;266:1524-27. 102 Guise TA, Garrett R, Bonewald LF, és mtsa. Interleukin-1 receptor antagonist inhibits the hypercalcaemia mediated by interleukin-1. J Bone Miner Res 1993;8:583-7. 103 Keen RW, Woodford-Richens KL, Lanchbury JS, és mtsa. Allelic variation at the interleukin-1 receptor antagonist gene is associated with early postmenopausal bone loss in the spine. Bone 1998;23:367-71. 104 Bajnok É, Takács I, Vargha P, és mtsai. Lack of association beween interleukin-1 receptor antagonist protein gene polymorphism and bone mineral density in Hungarian Postmenopausal women. Bone 2000;27:559-62. 105 Blackmore AI, Watson PF, Weetman AP, és mtsa. Association of Graves’ disease with an allele of interleukin-1 receptor antagonist gene. J Clin Endocrinol Metab 1995;80:111-5. 106 Nemetz A, Kope A, Molnar T, és mtsai. Significant differences in interleukin-1beta and interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphisms in a Hungarian population with inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol 1999;34:175-9. 107 Donaldson P, Agarwal K, Craggs A, és mtsai. HLA and interleukin 1 gene polymorphisms in primary biliary cirrhosis: association with disease susceptibility and disease progression. Gut 2001;48:397-402. 108 Monegal A, Navasa M, Guanabens N, és mtsai. Osteoporosis and bone mineral metabolism disorders in cirrhotic patients referred for orthotopic liver transplantation. Calcif Tissue Int 1997;60:148-54. 109 Guanabens N, Pares A, Monegal A, és mtsai. Etidronate versus fluoride treatment of osteopenia in primary biliary cirrhosis: preliminary results after 2 years. Gastroenterology 1997;113:219-224. 110 Floreani A, Zappala F, Fries W, és mtsai. A 3-year pilot study with 1,25dihydroxyvitamin D, calcium, and calcitonin for severe osteodystrophy in primary biliary cirrhosis. J Clin Gastroenterol 1997;24:239-44. 111 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S és mtsai: A novel potent vasoconstricktor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature 1988; 332: 411-5. 112 Kawada N, Kuroki T, Kobyashi K és mtsai: Action of endothelins on hepatic stellate cells. J Gastroenterol 1995; 30: 731-8. 113 Mallat A, Preaux AM, Serradeil Le Gal C és mtsai: Growth inhibitory properities of endothelin-1 in activated human hepatic stellate cells: a cyclic adenosine monophosphate-mediated pathway. Inhibition of both extracellular signal-regulated kinase and c-Jun kinase and upregulation of endothelin B receptors. J Clin Invest 1998: 2771-8. 114 Tátrai A, Lakatos P, Thomson S és mtsa: Effects of endothelin-1 on signal transduction in UMR 106 osteoblastic cells. J Bone Mineral Res 1992; 7: 1201-9. 115 Gandhi CR, Sproat LA, Subbotin VM: Increased hepatic endothelin-1 levels and endothlin receptor density in cirrhotic rats. Life Sci 1996; 58: 55-62. 116 Rockey D: The cellular pathogenesis of portal hypertension: stellate cell contractility, endothelin, and nitric oxide. Hepatol 1997; 25: 2-5. 117 Cho JJ, Hocher B, Herbst H, és mtsai. An oral endothelin A receptor antagonist blocks collagen synthesis and deposition in advanced rat liver fibrosis. Gastroenterology
80
2000;118:1169-75. 118 Diamond T, Stiel D, Lunzer M, és mtsai. Osteoporosis and skeletal fractures in chronic liver disease. Gut 1990;31:82-7. 119 Lemire JM. Immunmodulatory actions of 1,25 dihydroxyvitamin D3. J Steroid Biochem Mol Biol 1995;53:599-602. 120 Clavreul A, D’Hellencourt CL, Montero-Menei C, és mtsai. Vitamin D differentially regulates B7.1 and B7.2 expression on human peripherial blood monocytes. Immunology 1998;95:272-77. 121 Ban Y, Taniyama M, Ban Y. Vitamin D receptor gene polymorphism is associated with Graves’ disease in the Japanese population. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:4639-4643. 122 Obermayer-Pietsch BM, Frühauf GE, Chararas K, és mtsai. Association of the vitamin D receptor genotype BB with low bone density in hyperthyroidism. J Bone Miner Res 2000;15:1950-55. 123 Mizunuma H, Hosoi T, Okano H, és mtsai. Estrogen receptor gene polymorphism and bone mineral density at the lumbar spine of pre- and postmenopausal women. Bone 1997;21:379-83. 124 Tornwall J, Carrey AB, Fox RI, és mtsa. Estrogen in autoimmunity: expression of estrogen receptors in thymic and autoimmune T cells. J Gend Specif Med 1999;2:33-40. 125 Rider V, Jones SR, Evans M, és mtsa. Molecular mechanisms involved in the estrogen-dependent regulation of calcineurin in systemic lupus erythematosus T cells. Clin Immunol 2000;95:124-34. 126 Niino M, Kikuchi S, Fuazawa T, és mtsai. Estrogen receptor gene polymorphism in Japanese patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci 2000;179:70-5. 127 Arend WP, Malyak M, Guthridge CJ, és mtsa. Interleukin-1 receptor antagonist: role in biology. Annu Rev Immunol 1998;16:27-35. 128 Danis VA, Millington M, Hyland VJ, és mtsa. Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) gene polymorphism. Clin Exp Immunol 1995;99:303-10. 129 Takamatsu M, Yamauchi M, Maezawa Y, és mtsai. Correlation of a polymorphism in the interleukin-1 receptor antagonist gene with hepatic fibrosis in Japanese alcoholics. Alcohol Clin Exp Res 1998;22(suppl3):s141-s144. 130 Mentzel S, Dijkman HBPM, Van Son JPHF, és mtsai. Organ distribution of aminopeptidase A and dipeptidyl peptidase IV in normal mice. J Histochem Cytochem 1996; 44: 445-61. 131 Tanaka T, Kameoka J, Yaron A, és mtsai. The costimulatory activity of the CD26 antigen requires dipeptidyl peptidase IV enzymatic activity. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 4586-90. 132 Tanaka T, Duke-Cohan JS, Kameoka J, és mtsai. Enhancement of antigen-induced T-cell proliferation by soluble CD26/dipeptidyl peptidase IV. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 3082-6. 133 Stecca BA, Nardo B, Chieco P, és mtsai. Aberrant dipeptidyl peptidase IV (DPP IV/CD26) expression in human hepatocellular carcinoma. J Hepatol 1997; 27: 337-45. 134 Perner F, Gyuris T, Rakoczy Gy, és mtsai. Dipepetidyl peptidase activity of CD26 in serum and urine as a marker of cholestasis: Experimental and clinical evidence. J Lab Clin Med 1999; 134 :56-57 135 Harada T, Kim D W, Sagawa K, és mtsai. Characterization of an established human hepatoma cell line constitutively expressing non-structural proteins of hepatitis C virus by transfection of viral cDNA. J Gen Virol 1995; 76: 1215-1221
81
136
Gaetaniello L, Fiore M, Filippo S, és mtsai. Occupancy of dipeptidyl peptidase IV activates an associated tyrosine kinase and triggers an apoptotic signal in human hepatocarcinoma cells. Hepatology 1998; 27: 934-42 137 Scanlan MJ, Mohan Raj BK, Calvo B, és mtsai. Molecular cloning of fibroblast activation protein α, a member of the serine protease family selectively expressed in stromal fibroblasts of epithelial cancers. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 5657-61. 138 Levy MT, McCaughan GW, Abott CA, és mtsai. Fibroblast activation protein: a cell surface dipeptidyl peptidase and gelatinase by stellate cells at the tissue remodelling interface in human cirrhosis. Hepatology 1999; 29: 1768–1778. 139 Zalatnai A, Lapis K. Simultaneous induction of liver cirrhosis and hepatocellular carcinomas in F-344 rats: estabilishment of a short hepatocarcinogenesis model. Exp Toxic Pathol 1994; 46: 215-222. 140 Harada K, Van De Water J, Leung PSC, és mtsai: In situ nucleic acid hybridization of cytokines in primary biliary cirrhosis: predominance of the Th1 subset. Hepatol 1997; 25: 791-6. 141 Duke-Cohan JS, Morito C, Rocker JA, és mtsa: A novel form of dipeptidyl peptidase found in human serum. J Biol Chem 1995; 270: 14107-14. 142 Minutello MA, Pileri P, Unutmaz D, és mtsai. Compartmentalization of T lymphocytes to the site of disease: intra hepatic CD4( T cells specific for the protein NS4 of hepatitis C virus in patients with chronic hepatitis C. J. Exp Med 1993; 178:1725 143 Gaetaniello L, Fiore M, Filippo S, és mtsai. Occupancy of dipeptidyl peptidase IV activates an associated tyrosine kinase and triggers an apoptotic signal in human hepatocarcinoma cells. Hepatology 1998; 27: 934-42 144 De Meester IA, Kestens LL, Vanham GL, és mtsai: Costimulation of CD4+ and CD8+ T cells through CD26: the ADA-binding epitope is not essential for complete signaling. J Leukoc Biol 1995; 58: 325-30. 145 Oravecz T, Pall M, Roderiquez G, és mtsai. Regulation of the receptor specificity and function of the chemokine RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) by dipeptidyl peptidase IV (CD26)-mediated cleavage. J Exp Med 1997; 186: 1865–1872. 146 Korom S, De Meester I, Stadlbauer THW, és mtsai: Inhibition of CD26/dipeptidyl peptidase IV activity in vivo prolongs cardiac allograft survival in rat recipients. Transplantation 1997; 63: 1495-1500. 147 Friedman SL. Molecular mechanisms of hepatic fibrosis and principles of therapy. J Gastroenterol 1997; 32: 424–430. 148 Levy MT, McCaughan GW, Abott CA, és mtsai. Fibroblast activation protein: a cell surface dipeptidyl peptidase and gelatinase by stellate cells at the tissue remodelling interface in human cirrhosis. Hepatology 1999; 29: 1768–1778. 149 Bermpohl F, Loster K, Reuter W, és mtsa. Rat dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) exhibits endopeptidase activity with specificity for denaturated fibrillar collagens. FEBS-Letter 1998;428:152–156. 150 Bauvois B. A collagen-binding glycoprotein on the surface of mouse fibroblasts is identified as dipeptidyl peptidase IV. Biochem J 1988;252:723–731. 151 Tsukigi M, Kobayashi Y, Kawasaki T, és mtsa. Identification of bile canalicular cell surface antigen HAM.4 as dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) and characterization of its role in hepatic regeneration after partial hepatectomy in rats. Dig Dis Sci 1998; 43:2591–2600.
82
