GENETIKA Oktatási segédanyag a Génsebész és Kertészmérnök hallgatók számára Összeállította: dr. Mara Gyöngyvér 2015, Csíkszereda

GENETIKA Oktatási segédanyag a Génsebész és Kertészmérnök hallgatók számára Összeállította: dr. Mara Gyöngyvér

2015, Csíkszereda

1

1. BEVEZETÉS A GENETIKÁBA A XXI. SZÁZADI ISMERETEK TÜKRÉBEN 6,7 dia

1.1. A genetika tágya A genetika az öröklődés tudománya, amely a görög genno (nemzeni, életet adni) jelentésű szóból származik. A genetika annak a biológiai információnak a tanulmányozásával foglalkozik, amelyet az élő szervezetek a legegszerűbb baktériumoktól a többsejtű szervezetekig: tárolnak, megkettőznek, továbbadnak és felhasználnak azaz kifejezik a növekedési, szaporodási és túlélési folyamatok során. Egy élőlényen belül, a genetikai információt kromoszómák hordozzák, ahol ez az információ a DNS-ben van kódolva. A gének kódolják azt az információt, mely a fehérjék szintéziséhez szükséges.

8,9 dia 1.2. A DNS, a genetikai információ alapmolekulája Az evolúció eredményeképpen, körülbelül 4 milliárd évvel ezelőtt alakultak ki azon folyamatok amelyek alkalmasak a biológiai információ a tárolására, replikációjára, génkifejeződésére valamint a változatosság kialakulására. A lineáris DNS (dezoxiribonunkeinsav) molekula a biológiai információ hordozó molekula, amelynek szekvenciáját G, C, A, T jelöljük. A jelölés a G (guanin), C (citozin), A (adenin) és T (timin) nitrogén bázisoktól származik, amelyek a DNS szerkezetében található nukleotidok építőkövei (1.ábra).

1.ábra. A DNS építőkövei a nukleotidok (foszfát csoport, cukor és nitrogénbázis) 2

A DNS molekula gerincét a foszfodiészter kötések eredményeként egy váltakozó cukor-foszfát molekula lánc alkotja, melyben a dezoxiribóz 5’ és 3’ C atomjai vesznek részt (lásd 2 ábra, a DNS lánc irányítottsága). Tehát az egyik szálon a dezoxiribóz 5’ C atomján lévő foszfát csoport (-PO4-) áll szabadon (nem kapcsolódik hozzá dezoxiribóz), a másik szálon pedig a pentóz 3’ C atomján lévő hidroxil (-OH) csoport szabad (nem kapcsolódik hozzá foszfát). A két szál eltérő irányultságát, eltérő orientációjú nyilakkal szokták ábrázolni. A DNS molekula kettős hélix szerkezetét a két egymással ellentétesen párhuzamos (antiparalell) gerinc alkotja, amely kialakulása az adenin-timin és a guanin-citozin komplementaritásnak köszönhető. Ezek a komplementer nitrogénbázisok hidrogén kötéssel kapcsolódnak egymáshoz, úgy hogy az adenin és timin között két hidrogén kötés, míg a guanin és citozin között három hidrogén kötés alakul ki.

2.ábra. A DNS kettős hélix szerkezete

A DNS-ben kódolt szakaszokat, amelyek fehérjék kialakulásáért felelősek azokat géneknek nevezzük. A DNS az élő szervezetekben, a sejtekben kromoszómának nevezett struktúrába csomagolva található meg az élő szervezetben, amelyek lehetővé teszik a DNS tárolását, megkettőződését, kifejeződését és evolúcióját egyaránt. Egy élő szervezet sejtében található kromoszómák összessége a szervezet genomját alkotja. Például az ember esetében 23 pár (24 különböző) kromoszómát különböztethetünk meg amely megközelítőleg 3*109 bázispár információt tartalmaz és körülbelül 20-30.000 gént.

10,11 dia 1.3. Fehérjék, az életfolyamatok funkcionális molekulái

3

Az élő szervezetek az idő folyamán a fizika, kémia és a genetikai információ következtében képesek például a szaporodásra. Ugyanakkor sok élő szervezet olyan struktúrák kialakítására is képes, amelyek idővel jelentős változáson mennek keresztül, gondoljunk a metamorfózisra, amikor egy rovarlárva imágóvá alakul. Egy másik sajátosság, amely az élő szervezetekre jellemző a mozgásképesség, amelynek köszönhetően az állatok képesek aktív helyzetváltoztató mozgásra (úszás, repülés, szaladás) míg a növények helyváltoztató mozgásra. Sőt, az élőlények a környezethez való alkalmazkodás képességével is rendelkeznek, valamint a környezettel anyag és energiacserét folytatnak. Az anyag és energiacsere eredménye, hogy képesek növekedni és fejlődni, hiszen a szervezetbe bejutott molekulákat beépítik a szervezetükbe. Azokat a kémiai és fizikai reakciókat, amelyek ezeket az átalakulásokat lehetővé teszik, metabolizmusként ismerjük. Az élő szervezetek előbb felsorolt tulajdonságai mind a fehérjéknek köszönhetőek (pl. a mozgás: aktin és miozin). A fehérjék nagy polimer molekulák, amelyek több száz és ezer aminosav alegységből épülnek fel és hosszú láncot alkotnak, amelyek felcsavarodva egy specifikus háromdimenziós struktúrát alakítanak ki. A háromdimenziós fehérjeszerkezetek adják a fehérjék funkcionális diverzitását (transzport fehérje, összehúzó fehérje, enzimatikus fehérje stb.) amely az élő szervezetek komplex működését és alkalmazkodóképességét teszik lehetővé. Például a hemoglobin (transzport fehérje) struktúrája és formája teszi lehetővé azt a funkciót, amelyet ellát: az oxigén szállítását és szövetekhez juttatását. Az aktin és miozin összehúzó fehérjék szerkezetüknek köszönhetően elcsúsznak egymás felületén így az izmok összehúzódását eredményezik. A kimotripszin és az elasztáz enzimek más fehérjék bontását eredményezik. Tehát a legtöbb életfolyamatot meghatározó tulajdonság a fehérjéknek köszönhető, amelyeket a szervezet a DNS-ben tárolt információ alapján szintetizál. A fehérjéket 20 különböző aminosav alkotja. A DNS-ben található információ, a genetikai kódnak a segítségével meghatározza a fehérje lánc aminosav szekvenciáját. A genetikai kód egy olyan szótár, amely segítségével a DNS-ben kódolt nukleotid sorrend átíródik aminosav sorrendé. A kód tehát azt határozza meg, hogy a DNS vagy RNS láncában egymás után következő nukleotid-hármasok alapján milyen sorrendben épülnek be az aminosavak a fehérjébe annak szintézise során. A nukleotidok hármasával (triplet) egy kodont adnak, és egy kodon egy aminosavat határoz meg. A tripleteknek megfelelő aminosavak a genetikai kódszótárban lelhetők fel.

13,14 dia 1.4. Molekuláris egységesség és hasonlóság az élővilágban • DNS, RNS A nukleinsavak építőkövei nagyon hasonlóak, hiszen mind a DNS (dezoxiribonukleinsav) mind pedig az RNS (ribonukleinsav) szerkezetét egy pentóz cukor képezi, négy nitrogénbázis és a pentóz cukrokat foszfát köti össze (foszfodiészter kötés). A nitrogénbázisok tekintetében a DNS és RNS szerkezete között az a különbség, hogy a T (timin) helyett U (uracil) található az RNS-ben. Az RNS a DNS-hez hasonló módon tárolás, megkettőződés, mutáció és információ kifejezés képességével is rendelkezik, míg a fehérjékhez hasonló módon képes háromdimenziós molekulákat kialakítani és katalitikus folyamatokban résztvenni. 4

• Genetikai kód univerzális Az élő szervezetek közös ősi eredetét alátámasztó tények a DNS szekvenciájukban vannak. Minden élő szervezet ugyanazt a genetikai kódot (vannak kis eltérések) használják a DNS-ben kódolt információ fehérjékké való átírásánál. A négy nukleotid hármassával kombinálva (triplet) egy kodont alkot amely a genetikai kódszótárban egy aminosavnak felel meg. Az összesen 64 lehetséges triplet (3 stop kodon) határozza meg a fehérjék szerkezetét alkotó 20 aminosavat. • Gének hasonlósága Az élő szervezetek közötti rokonsági kapcsolatot a különböző fajok hasonló funkciójú génjeinek vizsgálata is bizonyítja. Nagy a hasonlóság például a baktériumok, élesztőgombák, férgek, legyek, egér és az ember egyes fehérjéit meghatározó génjei között. Ilyen például a mitokondrium Citokróm C fehérjéjét meghatározó gén, amely fehérje a mitokondrium által végzett sejtszintű élettani folyamatban a sejtlégzésben játszik szerepet. Sőt, még azt is megfigyelték, hogy egy adott fajtól származó gének funkcionálisak lehetnek egy más faj szervezetében. Például a humán sejtosztódás szabályozásában szereppel bíró gének jól működtek az élesztősejtekben, lehetővé téve a sejtosztódást.

15,16 dia 1.5. Modern genetikai technikák 1.5.1. Génszekvencia meghatározás Számos esetben szükséges a DNS-molekula bázissorrendjének meghatározása (DNS-szekvenálás). A szekvenálásnak két módszerét használják: a Sanger féle módszert és az automatizált módszert. A láncterminációs DNS-szekvenálás vagy Sanger módszer: Az eljárás során a szekvenálni kívánt kettőszálú DNS szálait magas hőmérsékleten denaturálják, majd a szétváló szálak közül az egyikhez az 5’-irányba leolvasni kívánt szakasz elé komplementer, rövid egyszálú DNS-szálat (primert v. oligonukleotidot) párosítanak. Ezután négy párhuzamos szekvenáló reakciót állítanak össze. Minden reakcióelegybe kerül templát DNS és szekvenáló primer, polimeráz enzim és azonos mennyiségben négyféle dezoxinukleotid-trifoszfát (dNTP). A négy párhuzamos reakció mindegyikéhez négy különféle didezoxinukleotid-trifoszfát (ddNTP) molekula közül egyfélét kevernek. A ddNTP-k ribóz gyűrűjének –szemben a dNTP-molekulákkal – 3’-szénatomjához az -OH csoport helyett -H atom kapcsolódik, ezért nem tud foszfodiészter kötést kialakítani. Például, ha ddATP-t (didezoxiadenin-trifoszfát) adunk a reakcióelegyhez, a következő folyamat megy végbe: a polimeráz enzim a primer 3’-végétől indulva megkezdi a komplementer DNS-szál szintézisét, felhasználva egyaránt a dNTP- és ddATP-molekulákat. A leolvasni kívánt DNS-szakaszban található timin bázisokkal szemben (amelyek komplementere az adenin) a szintetizálódó új szálba dATP vagy ddATP épülhet be (a két nukleotid koncentrációjának arányától függő valószínűségekkel). Amennyiben dATP épül be, a szálszintézis folytatódik; viszont ha ddATP épül be, az új szál szintézise leáll a reaktív 3’-OHcsoport hiánya miatt. A reakció során tehát különböző hosszúságú új DNS-szakaszok keletkeznek, amelyek hossza tükrözi a timin bázisok távolságát illetve pozícióját a primer 5’ végétől. A ddGTP-vel,

5

ddCTP-vel illetve ddTTP-vel végzett párhuzamos reakciók esetében a szintetizált szálak hossza rendre a citozin, guanin és adenin bázisok pozíciójától függ (3 ábra). A négy különböző szekvenáló reakció során keletkező új DNS-láncokat méret szerint poliakrilamid gélen választjuk el. A DNS láncok méreteinek ismeretében a templát DNS-szál bázissorrendjét meg lehet határozni. A poliakrilamid gélelektroforézis az agaróz gélektroforézishez hasonlóan szintén a negatív töltéssel rendelkező DNS-molekulák elektromos térben zajló, az anód felé irányuló vándorlását használja ki.

3.ábra. Sanger féle szekvenálási eljárás Automatizált szekvenálás: Az automatizált szekvenálás során a szekvenáló reakcióhoz használt ddNTP molekulákhoz fluoreszcens festéket kapcsolnak. A fluoreszcens festékek (fluorofórok), amennyiben a festékre jellemző megfelelő hullámhosszú fénnyel kerülnek megvilágításra, gerjesztett állapotba kerülnek, majd visszatérve alapállapotba fényt bocsátanak ki. A négy különböző ddNTP-hez négy egymástól különböző fluorofórt kapcsolnak. E módszer feleslegessé teszi, hogy négy párhuzamos szekvenáló reakciót kelljen futtatnunk. A mintákhoz egyszerre adják hozzá a négy jelölt ddNTP-molekulát. A polimeráz reakció lezajlása után a mintát egy gél zsebbe töltik. A gélelektroforézis után a gélt olyan leolvasóba teszik, mely képes mind a négy fluorofór

6

különálló detektálására. A gél aljától a teteje felé haladva a templát DNS-szál bázissorrendje meghatározható annak ismeretében, hogy az adott csíkban mely fluorofórt detektáltuk. A fluoreszcens ddNTP-k használata lehetővé tette a szekvenálás folyamatának teljes automatizálását. A szekvenálási reakcióban létrejövő DNS-láncokat kapilláris gélelektroforézissel választják el. A futtatni kívánt mintát a kapillárisba töltik, majd a kapilláris végeire elektromos feszültséget kapcsolnak, így a DNS az anód felé fog vándorolni. A vándorlás közben érvényesül a gélmátrix szűrőhatása, így a kisméretű molekulák haladnak a leggyorsabban. A kapilláris anód felőli végén folyamatosan történik a négyféle dideoxinukleotidhoz kötött fluoreszcencia-jel detektálása, amelyet számítógép rögzít. A folyamatos detektálás eredménye egy kromatogram lesz, melyen időben láthatjuk, hogy adott időpillanatban mely fluorofór haladt át a detektor előtt, így meghatározhatjuk a templát DNS szekvenciáját (4 ábra).

4. ábra. Automatizált szekvenlási eljárás 1.5.2. DNS chip technika A DNS chip egy nagyon új molekuláris technika, amely során a funkcionális genomikában génexpressziós változásokat, vagy akár a teljes genomot átfogó genetikai különbségeket lehet a módszerrel analizálni. A DNS chip egy kisméretű szilárd hordozó, amely a felületén rögzített DNS mintákat tartalmaz, amelyek 20-5000 nukleotid hosszúságúak. A DNS chip egy fajra jellemző (pl. ember) DNS mintákat tartalmaz, amelyek az adott fajra jellemző géneknek megfelelő oligonukleotidokból áll. A DNS chipre a vizsgálni kívánt mintát rájuttatjuk, és a DNS-DNS hibridizáció elvén a komplementer szakaszok összekapcsolódnak. A fluoreszcensen jelölt mintát majd mikroszkóp segítségével detektáljuk. A DNS chip technika használható tehát expressziós összehasonlító vizsgálatra, ami fontos lehet a rákkutatásban. Ha meg akarjuk ismerni, hogy milyen gének működnek egy szervezetben, akkor a 7

génekről átírt mRNS-t kell vizsgálni. Az mRNS-ről laboratóriumi körülmények között újra DNS írható, az így keletkezett DNS szakaszokat cDNS-nek (komplementer DNS) nevezzük. Normál illetve rákos sejtekből izolált mRNS-ekről két eltérő színű fluoreszcens jelöléssel cDNS-eket szintetizálnak. A DNS-chipen a humán génekre specifikus DNS szakaszok találhatók. Ha a két mintát összekeverés után hozzáadjuk egy DNS-chiphez, a mindkét mintában jelenlevő cDNS a két szín keverékeként (piros és zöld mintajelölés esetén sárga) detektálható, ráadásul kvantitatív módon. A vizsgálatból kiderül, hogy az adott rákos mintában milyen gének fejeződnek ki nagyobb mértékben mint az egészséges sejtekben.

5. ábra. DNS chip használata expressziós összehasonlító vizsgálatra

8

2. GENETIKAI ALAPELVEK: HOGYAN ÖRÖKLŐDNEK A TULAJDONSÁGOK

6,7 dia

2.1. Mendel kísérletének alapjai Gregor Mendel jól választotta meg a felvetett problémához a kísérleti organizmust, hiszen a borsó önbeporzó növény és így ő irányíthatta a keresztezési kísérleteit. Emellett a borsó tulajdonságainak kiválasztásában is szerencsés volt. Hét tulajdonságpár öröklődését kísérte figyelemmel, és később kiderült, hogy mind a hét tulajdonság génje más-más kromoszómán helyezkedett el. Kísérleteihez 22 borsófajtát használt, amelyek tehát a következő hét jól elkülöníthető alternatív változatokkal rendelkeztek: sárga vagy zöld magszín, gömbölyű vagy ráncos mag, zöld vagy sárga hüvelytermés, hosszú vagy rövid szár, a tengelyen egyesével sorakozó vagy a szár csúcsán csoportosuló virágok, sima vagy rücskös hüvelytermés, lila vagy fehér virágszín. Mendel a kísérleteinél homozigóta szülőkből indult ki. A homozigóta szülőkhöz a következőképpen jutott: a kiindulási egyedek utódait nemzedékről nemzedékre önbeporzással beltenyésztette. Ha egy adott tulajdonságra (például a magalakra) nézve mindig csupán a szülőkre hasonlító utódot kapott, akkor ezek homozigóták voltak. Így állított elő biztosan homozigóta gömbölyű, illetve ráncos magvú borsónövényeket, ún. tiszta származéksorokat. Kísérletei során nagy mintaszámmal dolgozott és matematikailag értelmezte az adatait.

9-15 dia

2.2. Monohibrid keresztezés Mendel olyan borsónövényeket keresztezett amelyek különböző tulajdonságokkal bírtak, pl. fehér és lilavirágú borsó növényeket, zöld és sárga magvúakat, valamint rücskös és sima maghéjú növényeket. A keresztezések során vizsgálta a tulajdonságoknak az öröklésmenetét, legalább három generáción keresztül. A szülői generciót P betűvel (P-parentes) míg az utódnemzedéket F1, F2, betűvel (F-filio) jelölte. Amikor a lila és fehér virágú borsónövény öröklésmenetét vizsgálta Mendel arra lett figyelmes, hogy a lila és fehérvirágú szülői generáció keresztezéséből az F1-ben mind lila virágú utódok jöttek létre, majd a fehér virágszín az F2-ben jelent meg újra. Ebből rájött arra, hogy a fehér virágszínért felelős örökítő tényező nem tűnt el az F1-ben, csak nem nyilvánult meg, azaz recesszív tulajdonságváltozat. Az F2-ben megfigyelt jellegek aránya 3 (lila):1 (fehér) volt. Mendel hasonló öröklődésmenetet figyelt meg hat más tulajdonságváltozat esetében, és ezen megfigyelések alapján több következtetést is megfogalmazott. Mendel következtetéseit az alábbiakban foglaljuk össze:

9

•

•

•

Az öröklés egysége a gén. Egy bizonyos tulajdonságot örökítő gén (pl. virág színe) két változatban található meg egy génhelyen, ezt nevezzük allélpárnak. Az allélok tehát a gének tulajdonságváltozatai. Ha a két tulajdonságváltozat különbözik, akkor azt a tulajdonságváltozatot amely megnyilvánul dominánsnak (P – lila), azt amelyik csak heterozigóta formába nyilvánul meg recesszívnek (p – fehér) nevezzük. Minden tulajdonság két változata található meg az élő szervezetekben, és egy egyed mindkét szülőtől örököl egy génváltozatot. A génváltozatok tehát az ivarsejtekben (gamétákban) szétválnak, és ezek véletlenszerűen egyesülnek, hiszen a meiozis során az ivarsejtekbe a homológ kromoszómák közül mindig csak az egyik kerül be. Ezt Gregor Mendel a gamétatisztaság előfeltételének nevezte. Az allélok szegregációja véletlenszerű esemény. Tehát amikor egy Pp heterozigóta egyed gamétákat hoz létre akkor 50% esély van arra, hogy a petesejtbe a P allél kerüljön.

Mai ismeretek tükrében a borsónövény magas és törpe növését, a borsó maghéjának rücskös és sima tulajdonságváltozatait illetve a cisztás fibrózis betegség kialakulását tudjuk, hogy a génváltozatok által meghatározott különböző fehérjék alakítják ki. Mendel nagyszámú keresztezést végzett homozigóta magas és törpe növények között (szülői nemzedék, P). A két növény közötti különbség oka egy növekedési hormon megléte vagy hiánya, amelynek képződését egy gén irányítja. A borsó maghéját meghatározó tulajdonságváltozatok közül az R allél (génváltozat) esetében egy olyan fehérje szintetizálódik amely a keményítőt elágazó láncúvá alakítja, így a maghéj sima lesz. A r allél esetében az enzim egy inaktív formája keletkezik, amely következtében a felhalmozott keményítő lineáris marad, míg a maghéj összeszáradását (rücskösödését) eredményezi. A cisztás fibrózis betegség esetében a normal CFTR fehérje a Cl ionok membránon való átjutását teszi lehetővé. Egy kis változás a génben amely a CFTR fehérjét kódolja egy megváltozott fehérjét eredményez, amely nem teszi lehetővé a Cl ionok membránon való áthaladását, így a cisztás fibrózis betegség kialakulását eredményezi.

16-18 dia 2.3. Dihibrid keresztezés Mi történik akkor, amikor két tulajdonság együttes öröklődését vizsgáljuk? Mendel a borsónövény maghéjának színét (sárga – domináns, zöld – recesszív) és formáját (sima – domináns, rücskös – recesszív) vizsgálta. Megfigyelte, hogy a két tulajdonság együttes öröklődésére is vonatkozik az uniformitás és a szegregáció szabálya. A tulajdonságok az F2-ben újszerűen kombinálódtak: sárga rücskös és zöld sima magvú borsók is megjelentek. A Mendel által megfigyelt fenotípusos hasadási arány: 9:3:3:1 volt, azaz 9 sárga sima héjú (mindkét tulajdonság domináns), 3 sárga rücskös (egyik tulajdonság domináns), 3 zöld rücskös és 1 zöld rücskös (mindkét tulajdonság recesszív).

10

Mendel, miután borsón végzett genetikai kísérletei statisztikailag értékelhető eredményeket adtak, megalkotta három alapvető törvényét. Az uniformitás törvénye kimondja, hogy ha homozigóta (AA, aa) szülőket keresztezünk, az utódnemzedék (F1) összes tagja genotípusában és fenotípusában is egyforma. A hasadás törvénye szerint, ha homozigóta szülőket keresztezünk, az első utódnemzedékben a szülői tulajdonságok nem módosulnak, hanem a domináns megnyílvánul, és az F2 nemzedékben változatlanul megjelennek. Tehát a tulajdonságok az F2-ben szétválnak. A független öröklődés törvénye, amelyben Mendel azt állítja, hogy a különböző tulajdonságok egymástól függetlenül öröklődnek. Ez azonban csak akkor igaz, ha a vizsgált tulajdonságokat meghatározó gének nem ugyanazon a kromoszómán, egymás közelében vannak, akkor ugyanis kapcsoltságról, kapcsolt öröklődésről beszélünk, mert ezek jellemzően együtt öröklődnek tovább.

21-23 dia

2.4. Mendeli öröklődés az embernél Az emberi tulajdonságok nagyrésze nem egyszerű Mendeli öröklésmenetet követ. Tegyül fel, hogy egy gyerek annak ellenére, hogy szülei kék szeműek, barna szemmel születik. Mivel a kék recesszív a barna szemszín változattal szemben, akkor ez azt jelenthetné, hogy a gyereknek az édesapja vagy nem igazi édesapja vagy hogy a szülök csak örökbefogadó szülők. Igen ám, de a szemszín kialakításában nem egyetlen gén vesz részt, hanem több gén kölcsönhatásának eredménye, tehát a kék szemű szülőknek születhet barna szemű gyereke. Sőt, az egygénes tulajdonságok az embernél általában olyan fehérjéket kódolnak, amelyek a szervezet elváltozását okozzák, illetve az életet veszélyeztetik. Ilyenek egygénes tulajdonságok például a progresszív szellemi leépülés és más idegrendszeri betegségek mint például a Huntington kór, illetve a cisztás fibrózis betegség (amely esetében a tüdő eltömődik illetve más légzési nehézségek léphetnek fel). Például 2009-ben 4300 egygénes humán tulajdonságot ismertek, de ezen tulajdonságok felfedezésének következtében a szám folyamatosan növekszik.

11

3. MENDELI TÖRVÉNYSZERŰSÉGEK KITERJESZTÉSE

3-10 dia

3.1. Egygénes öröklésmenet: allélkölcsönhatások Mendel a tanulmányozott növény kiválasztásakor nagyon szerencsés volt, hiszen olyan tulajdonságokat tanulmányozott amelyeket egyetlen gén határozott meg és minden génnek két változata (allélja) volt amelyek közül az egyik domináns, a másik recesszív volt. De ezek a körülmények nem vonatkoznak minden öröklődő tulajdonságra, még a borsónövény esetében sem. A genotípus és fenotípus közötti kapcsolat viszont bármilyen komplex öröklésmenetre is alkalmazható. A génváltozatok között többféle kölcsönhatástípus figyelhető meg, nem csak domináns-recesszív. Vannak olyan esetek, amikor két vagy több allélpár hatásában befolyásolja egymást. Domináns és recesszív tipusú kölcsönhatás: ilyen esetben a genotípus heterozigóta (Aa, Bb) azaz tartalmazza a gén két változatát (domináns, recesszív) és a heterozigóta valamint a domináns homozigóta fenotípusa nem különíthető el. Nem teljes dominancia (intermedier öröklődés) esetében a heterozigóta mind fenotípusában mind pedig genotípusát tekintve különbözik a homozigóta egyedektől. A két tulajdonságváltozat között olyan kölcsönhatás alakul ki, amely a két tulajdonság köztes fenotípusát alakítja ki. Pl. a fehér és piros oroszlánszáj virágok keresztezéséből az F1-ben rózsaszín virágú egyedek fejlődtek ki. A második generációban (F2) viszont a tulajdonságok szétváltak, megfigyelhetőek mind a szülői mind pedig a heterozigóta rózsaszín virágszínek. A virág színének kialakulásáért felelős A allélváltozat egy piros pigmentet termelő enzimet kódol, ha a gén mindkét tulajdonságváltozata AA akkor a virágban elegendő enzim termelődik ahhoz, hogz a virág színe piros legyen, míg a heterozigóta rózsaszín virágok esetében (Aa) az enzim mennyisége fele, ezért a virág színe halványabb lesz. Hasonló öröklésmenetet követ a hiperkoleszterinémia, amely esetben a H allélváltozat sejtmembránba ágyazott koleszterin receptort kódolja, amely a koleszterin sejtben történő hasznosítását szolgálja. A h allélváltozat nem kódol koleszterin receptort, így a heterozigóta egyedek (Hh) közepesen erős megbetegedést mutatnak, míg a homozigóta recesszív egyedek (hh) betegek. Kodomináns allélok: ebben az esetben mindkét allélváltozat megnyílvánul és a kettő közösen alakítja ki a heterozigóta egyed fenotípusát. Egyik példája a vércsoport öröklődés, ahol az AB vércsoport mint fenotípus úgy jön létre, hogy mind az A mind a B vércsoportra jellemző tulajdonságváltozat között kodomináns kölcsönhatás van. Letális allélok: vannak olyan recesszív allélok, amelyek heterozigóta formában letálisak. Többallélos öröklődés: a vércsoport öröklése. Az emberek fenotípus szerint e rendszer alapján 4 vércsoport valamelyikébe tartoznak. Ezek a csoportok: A, B, AB, 0. Az A és B betűk valójában két antigént jelölnek, az 0-s vércsoportú embereknek ezek egyike sem található meg a vörösvértesteken. Ezeknek az antigéneknek a kialakulásáért egy gén felel. Mivel a génnek három változata létezik (A, B, 0) és ezek

12

kodominánsan (A, B) illetre domináns-recesszív (A és B a O-fölött domináns) öröklődnek, az emberek genotípus szerint 6 csoportot alkotnak (hiszen a sorrend mindegy, azaz az A0 és a 0A nem külön eset). A-s fenotípus lehetséges genotípusai: AA, A0 B-s fenotípus lehetséges genotípusai: BB, B0 AB-s fenotípus lehetséges genotípusai: AB 0-s fenotípus lehetséges genotípusai: 00 A véradási szabály szerint senki nem kaphat olyan vért, amiben számára idegen antigén található, ugyanis azok antitestjei megtalálhatóak az ő vérében (azaz egy A-s ember vérében a B antigén antitestjei jelen vannak).

11-12 dia 3.2. Mutáció: új allélok forrása Hogyan alakulnak ki a tulajdonságváltozatok (allélok) egy tulajdonság esetében? Az új allélok megjelenése a genetikia információ (anyag) véltoyásában keresendő, azaz a MUTÁCIÓ eredménye, amelyek spontán jelennek meg a természetben. Mihelyt a mutációk megjelennek a gemétaképző sejtekben, a nagy valószínűséggel tovább örökítődnek. Mutációt tartalmazó gaméta előfordulási gyakorisága: 1:10.000 és 1:1.000.000 között változik. Annak köszönhetően, hogy minden egyed egy gén két változatát tartalmazza, egy populációban ki lehet számolni egy tulajdonságváltozat előfordulási gyakoriságát. Azt a tulajdonságváltozatot (allélt) amelynek az allélgyakorisága nagyobb, vad típusnak nevezzük és általában egy + jellel jelöljük. A ritka allélt az adott populációban mutáns allélnak tekintjük. A házi egér esetében a szőr színt a sötét szürke (A) allél határoyya meg amely egy monomorf gén. A kutatók a sötétszürke vad allélváltozat 14 mutáns formáját írták le. Más géneknek ettől eltérő módon több génváltozata is ismert, mint például a az ember esetében a négy vércsoportot meghatározó három tulajdonságváltozat (IA, IB, i), amely mindhárom elterjedt a populációkban. Egy olyan mechanizmust amely a különféle tulajdonságváltozatok megjelenésének (polimorf gének) kedvez a paradicsomféléknél és petúniáknál figyeltek meg. Az önmegporzás ellen valamint a keresztbeporzást elősegítendő kialakult egy inkompatibilitási gén, amelynek tulajdonágváltozatai meghatározzák egy pollen elfogadását. Ha a bibére nem megfelelő allélt tartalmazó pollenszemcse kerül, akkor a pollenszemcse nem hajt pollentömlőt és nem történik meg a megporzás (S1 allél, lásd ppt). Egyes növényfajoknál amelyek hasonló szaporodási rendszerrel rendelkeznek a kutatók az inkompatibilitás gén 92 tulajdonságváltozatát is megtalálták. Mivel ez az inkimpatibilitási rendszer kedvez az új mutánsok kialakulásának, ezért ez a példa extrámnek számít a többallélos öröklődás tekintetében.

16-21 dia 3.3. Többtényezős öröklésmenet: több génes öröklődés (komplementaritás, episztázis) 13

Két domináns gén együttes hatása Egy példa az egerek szőrzetszínének öröklődésére: homozigóta szürke egereket kereszteztek ugyancsak homozigóta barna egerekkel. Az F1 nemzedékben valamennyi egyed szőrszíne szürke volt. Az F1 nemzedék egyedeinek egymás közti keresztezéséből származó F2 nemzedékben az utódok között 9/16 szürke, 3/16 fahéjszínű, 3/16 fekete és 1/16 barna szőrzetű egyedet találtak. A négyféle fenotípusból, valamint a fenotípusok arányából az a következtetés adódik, hogy a szőrzetszín kialakításában két gén 22 allélja vesz részt. A barna színű egyedek mindkét jellegre nézve homozigóta recesszívek (aabb), mivel arányuk az F2 nemzedékben 1/16. A szülői nemzedék szürke egyedei mindkét jellegre homozigóta dominánsak (AABB). Az F1 nemzedék szürke egyedei mindkét jellegre nézve heterozigóták (AaBb). Fahéjszínű szőrzet AAbb, illetve Aabb, fekete szőrzet pedig aaBB, illetve aaBb genotípus esetén alakul ki.

6. ábra. Az egerek szőrzetszínének öröklődése

Komplementaritás: Egyes esetekben két gén kölcsönhatásának eredményeképpen az F2-ben lehetséges 4 genotípus kevesebb fenotípust határoz meg, mert egyes fenotípusok kettő vagy több genotípust is magába foglalhatnak. Amikor kutatók a szagos bükköny (Lathyrus odoratus) virágának színét vizsgálták, amikor arra lettek figyelmesek, hogy a fehér és lila virágú egyedek keresztezése eredményeképpen az F1-ben az egyedek lila virágúak voltak, míg az F2-ben 9:3 lila vs. fehér virágú hasadási arányt kaptak. Tehát a két gén amely 14

a virág színét meghatározza kiegészíti egymást, mindkét gén domináns tulajdonságváltozatának jelenlétében alakul ki a lila virágszín. Ennek a komplementaritásnak a lehetséges biokémiai magyarázata abban rejlik, hogy egy színtelen pigment színessé alakítása két enzimet ígényel. Tehát csak azok az egyedek lesznek lila színűek, amelyek mindkét enzim szintézisére képesek, azaz hordozzák a A és B tulajdonságváltozatokat. A másik három genotípus csoport (A– bb, aa B–, és aa bb) egyedei nem képesek az egyik enzim szintézisére, ezért a színtelen pigmentet nem tudják átalakítani így a virág színe fehér marad. A 9:3 arány két domináns gén komplementaritásából ered, ahol a két gén A– B– domináns tulajdonságváltozata szín megjelenését, míg a többi genotípus (A– bb, aa B–, és aa bb) a szín hiányát eredményezi. Recesszív episztázis A labrador kutyafajta szőrzetszínének kialakításában két gén alléljai vesznek részt. Ha az „A” gén domináns allélja megtalálható az egyed sejtjeiben (genotípus: AA vagy Aa), akkor a szőrzet sötét színű. „B” gén domináns alléljának (BB vagy Bb) jelenlétében fekete, „B” génrecesszív alléljának (bb) jelenlétében pedig csokoládébarna. Ha az egyed „A” génre nézve homozigóta recesszív (aa), akkor a szőrzet világossárga színű, mert a hámsejtekben nem működőképes a sötét színű festékanyag előállítását katalizáló enzim. A világos szőrzetű egyedek genotípusa aaBB, aaBb és aabb lehet.

7.ábra. A labrador szőrzetszínének öröklődése

15

Homozigóta sárga színű kant pároztattak homozigóta, barna színű szukával. Az utódok kivétel nélkül fekete színűek lettek. Az F1 nemzedék egyedei között végrehajtott keresztezésekből származó kiskutyák 9/16-a fekete, 3/16-a barna és 4/16-a sárga szörzetű volt. A keresztezés eredményéből kitűnik, hogy a szülői nemzedékben a sárga bundájú kan genotípusa aaBB, a barna szukáé pedig AAbb lehetett. Az F1 nemzedék egyedei mindkét génre heterozigóták (AaBb), keresztezésükből 9:3:4 arányban származhatnak fekete, barna és sárga szőrzetű utódok. Az „A” génhomozigóta recesszív formában (aa) elnyomja a „B” génalléljainak hatását. Az ilyen típusú génkölcsönhatás a recesszív episztázis. Domináns episztázis Egy kísérletben homozigóta fekete maghéjúbabfajtát kereszteztek ugyancsak homozigóta fehér magvúval. Az F1 nemzedék valamennyi egyede fekete maghéjú lett. Ebből a kutatók először arra gondoltak, hogy a jelleg domináns – recesszív módon öröklődik. Az F1 egyedek egymás közötti keresztezésének eredménye azonban eltért a várttól: az utódok 12/16-a fekete, 3/16-a barna, 1/16-a fehér maghéjú lett. A barna fenotípus megjelenéséből, valamint a fehér maghéjú egyedek számarányából az állapítható meg, hogy a jelleg kialakításában két gén alléljai vesznek részt.

8. ábra. A bab maghéjszínének öröklődése A fehér maghéjrecesszív jelleg, az F2 nemzedékben tapasztalt arány alapján az ilyen egyedek genotípusa aabb. A szülői nemzedékben a fekete maghéjú egyedek mindkét genre homozigóta dominánsak (AABB). 16

Homozigóta recesszív egyedekkel való keresztezésük az F1 nemzedékben mindkét génreheterozigóta (AaBb), fekete maghéjú utódokat ad. A heterozigóták egymás közti keresztezéséből származó utódok közül azok, amelyekben jelen van „A” géndomináns allélja (AA vagy Aa), fekete maghéjúak. Az „A” génrehomozigóta recesszív egyedek (aa) közül a barna maghéjúakban „B” génből domináns (BB vagy Bb), a fehér maghéjúakbanrecesszív allél (bb) található. Ez a génkölcsönhatás a domináns episztázis. A maghéjszín kialakulásakor az egyik gén domináns allélja megakadályozza a másik gén alléljainak megnyilvánulását.

17

4. AZ ÖRÖKLŐDÉS KROMOSZÓMA ELMÉLETE. MITÓZIS ÉS MEIÓZIS, GAMÉTAKÉPZŐDÉS

4-11 dia 4.1. Kromoszómák a gének hordozói Az eukarióta sejtek osztódása bonyolultabb, hiszen a genetikai anyag több gént tartalmaz, amelyek nem egyetlen, hanem több kromoszómán találhatók, és ezeket egyenlően kell elosztani a két leánysejt között. A kromoszómák jól meghatározott számban fordulnak elő az eukarióta sejtekben (pl. az ember esetében 23 pár kromoszóma azaz 46 kromoszóma található). Minden kromoszóma két karral, egy röviddel és egy hosszúval rendelkezik. Az a pont ahol két kromoszóma kapcsolódik az a centromérának nevezett régió. A kromoszómák száma egy testi sejtben fajra jellemző, és minden kromoszóma, forma, méret és genetikai információ szempontjából két másolatban található meg a testi sejtekben, amelyből az egyik apai a másik meg anyai eredetű. Ezeket a kromoszómákat homológ kromoszómáknak nevezzük (lásd 9. ábra). A sejtosztódás előtt a sejt megkettőzi a genetikai anyagát, így minden kromoszóma 2 testvérkromatidából áll. Ezek genetikai szempontból egymás pontos másolatai, amelyek a sejtosztódás során kettéválnak, így a leánysejtek ugyanazt a genetikai anyagot fogják tartalmazni.

9. ábra. A homológ kromoszómák és a testvérkromatidák (Forrás: http://www.newworldencyclopedia.org/entry/Image:Chromosomes_during_mitosis.jpg) 18

Minden kromoszóma egy hosszú DNS molekulából áll, amelyen ezernyi gén található, és amely fehérje molekulák segítségével egy kondenzált, összecsomagolt formáját alkotja a genetikai anyagnak. Ezt a gyöngyfüzérhez hasonló struktúrát kromatinnak nevezzük. A kromatint nukleoszómák, azaz hiszton fehérjékből álló törzsből és a rátekeredett DNS-ből álló ismétlődő struktúrák alkotják.

10. ábra. A kromoszóma és építőköve a DNS (Forrás: http://bellespics.eu/image/5cfe4f96/)

12-17 dia 4.2. Mitózis: számtartó sejtosztódás Tágabb értelemben a mitózis az a folyamat, amelynek során egy eukarióta sejt osztódással két genetikailag egyenértékű utódsejtet hoz létre. Szűkebb értelemben a mitózis a mag osztódását (kariokinézis) jelenti, amely során a megkettőződött testvérkromatidák szétválnak. A kariokinézist a sejttest befűződéssel történő osztódása követi (citokinézis), amely során a citoplazma és annak organellumai osztódnak. A kariokinézist a mikrotubulusokból felépülő magorsó végzi, és a szétválasztás rendkívül pontos. A citokinézis a miozint és aktint tartalmazó kontraktilis gyűrű segítségével valósul meg, és előfordul az is, hogy a két utódsejt tömege eltérő. A mitózisnak 5 szakaszát különböztetjük meg: profázis, prometafázis, metafázis, anafázis és a telofázis, az utóbbit a citokinézis követ. A mitózis előtt, az interfázisban, a sejt genetikai anyaga megkettőződik, tehát a sejtek két kromatidás állapotba kerülnek, és a centriólumot (sejtközpont) tartalmazó centroszómák is megkettőződnek.

19

4.2.1. Profázis A profázis során változások állnak be mind a sejtmagban mind a citoplazmában. A sejtmaghártya feloldódik és a kromoszómák összeszerelődnek. Minden megkettőződött kromoszóma két testvérkromatidából áll, amelyek a centromer régióban kapcsolódnak össze. A centromer régióban speciális fehérjék találhatóak, amelyek egy-egy korongszerű képletbe, a kinetochorba csoportosulnak (11. ábra). Ez az a hely a kromoszómán, ahová a magorsó mikrotubulusai be tudnak kötődni. Centromer régió hiányában a kromoszóma nem tud a szállítóapparátushoz kötődni, ezért véletlenszerűen sodródik egyik vagy másik utódsejtbe. A profázis során a citoplazmában az osztódási orsó vagy magorsó kezd összeszerelődni, a két centroszóma eltávolodik és kialakulnak közöttük a magorsó fonalak (mikrotubulusok).

11. ábra. A kromoszóma centromer régiója, kinetochor (Forrás: http://iws.collin.edu/biopage/faculty/mcculloch/1406/outlines/chapter%2011/chap11.htm)

4.2.2. Prometafázis A prometafázis során a kromoszómák és a szállítókészülék összekapcsolódnak. Ebben a szakaszban a pólusokon a két sejtközpont (centroszóma) körül véglegesen kialakul a magorsó vagy osztódási mikrotubuláris rendszere, mely kinetochor és nem kinetochor mikrotubulusokból áll. A kinetochor mikrotubulusok a kromoszómákat kapcsolják a pólusokhoz. A nem kinetochor mikrotubulusok nem kapcsolódnak kromoszómához, a magorsó felezősíkjában végeikkel egymásba csúsznak (lásd 12. ábra). Prometafázisban a kromoszómák a két pólus között véletlenszerűen mozognak, amíg minden kinetochorhoz hozzákötődik néhány mikrotubulus. Ha a kromatidákon levő egyik kinetochor kapcsolatot

20

létesít valamelyik pólussal, a másik csak az ellentétes pólushoz tud kötődni, így a két kromatida ellentétes pólushoz kötődik. Az osztódási orsó mikrotubulusokból szerveződik. A sejt citoszkeletonját (sejtváz) alkotó mikrotubulusok lebomlanak és az osztódás kezdeti fázisában az osztódási orsó kialakításában vesznek részt. A mikrotubulusok összeszerelődése a centroszómában kezdődik, amelyet mikrotubulus szervező központnak is neveznek.

12. ábra. Az osztódási orsó (Forrás: http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/library/onlinebio/BioBookglossC.html)

4.2.3. Metafázis A metafázisban a centroszómák a sejt két ellentétes pólusán helyezkednek el. A kromoszómák a két pólus közötti felezővonal síkjában (ekvatoriális sík) sorakoznak fel. Ennek alapja, hogy a kromoszómákra a két pólus felől ható ellentétes erők a felezővonalban egyenlítődnek ki. A metafázisban egy ellenőrzőpont működik, a sejt csak akkor lép át anafázisba, ha az összes kromoszóma elfoglalta helyét az ekvatoriális síkban. 4.2.4. Anafázis Az anafázis a kromatidák szétválásával kezdődik, amikor a kromoszómák centromer régiói szétválnak. A mozgást a kinetochor mikrotubulusok lebomlása (a polimerizált fehérjék elbomlása) hozza létre, miközben a kapcsolat a pólus és a kromoszóma között nem szűnik meg. A kromoszómák kb. 1 mikron/perc sebességgel vándorolnak az ellentétes pólusok felé. Ugyanakkor a két pólus is távolodik egymástól, amely a sejt megnyúlását eredményezi.

21

4.2.5. Telofázis A telofázis során a nem kinetochor mikrrotubulusoknak köszönhetően a sejt tovább nyúlik. A leánysejtek új maghártyája a szülői sejt maghártyájából alakul ki, valamint az endomembrán rendszer más membránjaiból. Mintha a profázis és prometafázis ellentétes folyamatának lennénk tanúi, újra kialakulnak a sejtmagvacskák, a két sejtpólus közelébe érő kromoszómák fellazulnak, széttekerednek és a magorsó is kezd szétszerelődni. Már az anafázis során megkezdődik és a telofázisban befejeződik a citokinézis. Mikroszkóposan megfigyelhető a sejt középvonalának befűződése. 4.2.6. Citokinézis A citokinézis, azaz a két új leánysejt kialakulása, az állati és növényi sejtek esetében különböző módon megy végbe. Az állati sejtekben a sejthártya alatt található – aktin és miozinból álló –fonalak gyűrűszerű struktúrája hozza létre a kontraktilis gyűrűt, amely segítségével megtörténik a sejt befűződése. A növényi sejtek sejthártyáján kívül egy cellulóz sejtfal található. Ennek következtében nem kontraktilis gyűrű alakul ki, hanem a sejtfal kialakulása zárja a sejtosztódást. A sejtfal kialakulásának első lépése a membránnal körülvett vezikulák kialakulása, majd a telofázis során kialakul a középlemeznek nevezett struktúra. A sejtosztódás időzítése és gyakorisága a növényi és állati szervezet normális növekedése során nagyon fontos. Egyfajta rendszerességet figyelhetünk meg bizonyos specializálódott sejtek osztódásában.

19-27 dia

4.3. Meiózis: számfelező sejtosztódás Az ivarosan szaporodó fajokra jellemző, hogy a diploid (2n, n=kromoszómaszám) egyedek életciklusuk bizonyos szakaszában haploid (n) gamétákat hoznak létre. A diploid sejtek két példányban tartalmazzák a kromoszómákat, míg a haploidok egy példányban. Tehát egy diploid humán sejt 46, egy haploid pedig 23 kromoszómát tartalmaz. A gaméták az ivarszervekben alakulnak ki a meiózisnak nevezett folyamatban, mely két módosult sejtosztódásból áll. Általában kétféle, méretében, tulajdonságaiban eltérő gaméta képződik: hím egyedekben kis, mozgékony spermiumok, nőstényekben sok tartalék anyagot tartalmazó, nagyméretű, mozgásra képtelen petesejtek. A petesejt és a spermium összeolvadása hozza létre a zigótát, amely diploid, és amelyből osztódások sorozata új szervezetet hoz létre. Az ivaros szaporodás elterjedését az élővilágban a vele járó előnyök magyarázzák: a meiózis és a megtermékenyítés lehetővé teszi, hogy az utódok szüleiktől új génkombinációkat örököljenek, ami növeli a változatosságot és az alkalmazkodás lehetőségeit. A meiózis két módosult sejtosztódásból áll, amelynek eredményeként egy diploid (2n) sejtből 4 haploid (n) sejt jön létre. Az osztódás fázisai, a kromoszómákat mozgató mechanizmusok a mitózishoz hasonlóak. A meiózisba lépő sejt az osztódását megelőzően ugyanazon a folyamatokon megy keresztül, mint a mitózist végző sejt: az S-fázisban DNS tartalma megkettőződik, kromoszómaszáma 2n, tehát

22

minden kromoszóma kétkromatidás. A mitózissal ellentétben a meiózis során két egymásutáni sejtosztódás játszódik le. 4.3.1. Meiózis I: a homológ kromoszómák szétválása Minden diploid sejt a kromoszómáinak két változatát tartalmazza, a homológ kromoszómákat. A meiózist megelőzően az interfázisban a sejt genetikai anyaga megkettőződik, így minden sejt tartalmaz minden kromoszómáról egy-egy másolatot, azaz testvérkromatidát. Ezáltal úgy a mitózis mind a meiózis kezdetekor az osztódó sejtek két megkettőződött homológ kromoszómát tartalmaznak. A meiózis I-ben a homológ kromoszómák szétválása történik, a fázisai hasonlítanak a mitózisnál tanultakhoz: profázis I, metafázis I, anafázis I, telofázis I és citokinézis. A meiózis profázisa hosszabb és komplexebb, mint a mitózis esetében. A profázis I-ben a kromoszómák összeszerelődnek, a megkettőződött homológ kromoszómák párba rendeződnek, ezáltal tetrádok alakulnak ki. Több helyen a kromoszóma hossza mentén a homológ kromoszómák kromatidjai összecsavarodnak (kiazmák alakulnak ki), így a kromatidák között génkicserélődés megy végbe (crossingover, lásd 13. ábra).

13. ábra. Homológ kromoszóma párok és a génkicserélődés (Forrás: http://smabiology.blogspot.com/2008_11_01_archive.html) A metafázis I-ben a homológ kromoszómapárok a sejt középső síkjába rendeződnek, minden kromoszómához az osztódási orsó egy-egy fehérjefonala kapcsolódik. Az anafázis I-ben a homológ kromoszómapárok tagjai elválnak egymástól és a sejt ellentétes pólusai felé mozognak. A kromoszómapárok tagjainak szétválása véletlenszerű, tehát nem tudható, hogy melyikük vándorol az egyik, és melyikük a másik pólusra. A telofázis I és a citokinézis során kialakul a két sejtmaghártya és kettéválik a citoplazma is. Az első osztódási fázis végével az utódsejtek haploidok (n), de kromoszómák kétkromatidások lesznek, azaz tartalmaznak még egy-egy másolatot. 23

4.3.2. Meiózis II: a testvérkromatidák szétválása Ahogy a meiózis I lezárul a sejtek a következő sejtosztódási fázisba lépnek, anélkül, hogy a genetikai anyag még egyszer megkettőződne. A második sejtosztódási fázisban lényegében mitózis zajlik, az első osztódás során képződött mindkét sejtben. A folyamat során a kromoszómák kromatidái válnak szét. A II-ik profázisban ismét kialakulnak a kromoszómák és lebomlik a maghártya, a metafázis II-ben pedig a kromoszómák a sejt középsíkjába rendeződnek. A II. anafázisban a kromoszómák kromatidái elválnak egymástól, míg a telofázis és citokinézis során egykromatidássá alakult kromoszómák széttekerednek, kialakul az utódsejtekben a sejtmaghártya, és kettéválik a citoplazma. Így a meiózis II végére a kezdeti diploid sejtből négy haploid sejt keletkezik.

30-33 dia 4.4. A kromoszómaelmélet igazolása Sutton volt az első aki megfogalmazta a kromoszómaelméletet, felhasználva Bovery elméleti és gyakorlati eredményeit. 1903-ban publikálta eredményeit, amelyek a következőket foglalta magába:      

Minden sejt a kromoszómák 2 változatát tartalmazza és így minden génnek két változatát, A kromoszómák, Mendel örökletes tényezőihez hasonlóan változatlanul átörökítődnek egyik generációról a másikra, Mezózis során a homológ kromoszómák párba rendeződnek, majd a gamétaképzés során szétválnak, mint Mendel alléljai, Az egyes kromoszómapárok apai és anyai változatai a sejt két pólusa felé vándorolnak ahogy Mendel allálváltozatai is. Jellemző rájuk a független öröklődés, Megtermékenyítés során a kromoszómák egyesülnek, Az utód sejtekben: fele kromoszómakészlet anyai, fele pedig apai eredetű.

Thomas Hunt Morgan szkeptikus volt a gén és kromoszómaelmélet tekintetében. Az ecetmuslicán (Drosophila melanogaster) végzett kutatásai viszont igazolták, hogy a kromoszómák Mendel „örökletes tényezőinek”, a géneknek a helyei. Minden kromoszóma a gének nagy csoportját tartalmazza, az ecetmuslicának több mint 1000 génje 4 pár kromoszómán található. Tehát nem a tulajdonságok, hanem a kromoszómák kombinálódnak szabadon. Morgan további kísérletei során megfigyelte, hogy az ivari jelleghez is kötődhetnek gének. Például amikor a fehér szemű hím egyedet vörös szemű nősténnyel kereztezte, az F1 generációban minden egyednek vörös szeme volt. Arra a következtetésre jutott, hogy a vörös szemszín a domináns. Az F2-ben arra lett figyelmes, hogy csak a hím egyedek esetében jelenik meg a fehér szemszín. Az összes nőstény és a hímek fele vörös szemű volt. Valahogy tehát a szemszín öröklése az ecetmuslica esetében nemhez kötött volt. Ebből és más kísérletekből következtetett arra, hogy a szem színét meghatározó gén X kromoszómához kötötten öröklődik. Azokat a géneket amelyek ivari kromoszómákon helyezkednek el ivarhoz kötött géneknek nevezzük. 24

5. LINKAGE, REKOMBINÁCIÓ ÉS A GÉNEK KROMOSZÓMATÉRKÉPEZÉSE

3-10 dia

5.1. Gének kapcsoltsága és rekombináció Gének kapcsoltsága: Az emberi genomot véve alapul elmondhatjuk, hogy a megközelítőleg 20,000 humán gén a 23 pár kromoszómán helyezkedik el, tehát a legtöbb humán kromoszóma gének százait/ezreit tartalmazzák. Ez jellemzi a humán X kromoszómát is, amely esetében 739 fehérje kódoló gént írt le 2005-ben egy bioinformatikus kutatócsoport. Ez a szám természetesen a molekuláris genetikai módszerek fejlődésével növekszik. Ha azok a gének, amelyek különböző kromoszómán vannak függetlenül öröklődnek, hogyan öröklődnek az egy kromoszómán található gének? Ha az ecetmuslica X kromoszómához kötött génjeit vizsgáljuk, például a szem színt és a testszínt, akkor erről a két génről elmondhatjuk, hogy szinténiás gének, hiszen egy kromoszómán találhatóak. Az ecetmuscica esetében a szem szín vad tulajdonságváltozata a piros (w+, piros, vad, domináns) míg a mutáns tulajdonságváltozata a fehér (w, fehér), míg a test szín esetében a vad tulajdonságváltozat az y+ (barna, vad, domináns), és a mutáns az y (sárga) Ha egy mutáns fehér szemű, vad barna testű nőstényt (wy+/ wy+) kereszteztek egy vad típusú piros szemű, mutáns sárga testű hímmel (w+y/Y), akkor az F1 generációban azt figyelték meg, hogy vad típusú piros szemű és vad típusú barna testű nőstények (wy+/w+y) és vad típusú barna testű, mutáns típusú fehér szemű hímek (wy+/Y) születtek. Ha az előbb említett tulajdonságok egyástól függetlenül öröklődnének, akkor az F1 nőstényeknek 4 féle gamétájuk (gének négyféle kombinációja) alakulhatna ki, azaz: wy+, w+y, w+y+ és wy egyforma gyakorisággal (1:1:1:1). Ha ez így menne végbe, akkor a gaméták fele szülői kombinációt tartalmazna, másik fele pedig a tulajdonságváltozatok újszerű kombinációját (rekombináns típus). Az F2 generáció 9026 hím egyedet eredményezett (hím a nősténytől kapja az X kromoszómáját, azaz a két vizsgált tulajdonságot is), de a hímek esetében a várt 1:1:1:1 aránytól nagyon távoli értékeket kaptak. Megfigyelték, hogy a hímek nagyrésze a szülői tulajdonság kombinációkat mutatta (8897, 99%), míg alig 1%-nál volt megfigyelhető a tulajdonságváltozatok újszerű kombinációja. Két gént akkor tekintünk kapcsoltnak, ha az F2 generációban a szülői tulajdonságváltozatok kombinációja magassabb mint az újszerű kombináció (rekombináns típus). A gének kapcsoltsági foka változhat. Pl. ecetmuslica: szem szín és a szárny formájának öröklésmenete (X kromoszómához kötött gének). Vörös szemű, normál szárnyú nőstényt (w+m+/w+m+) * fehér szemű, csökevényes szárnyú hímmel (wm/Y) kereszteztek, és következőket figyelték meg: az F1 generációban vörös szemű, normál szárnyú hím egyedek jelentek meg, míg az F2 generációban a hímek esetében: 67,2% szülői típus (w+m+ és wm), 32,8% rekombináns (wm+ és w+m) volt. A gének kapcsoltsága nem cask ivari kromoszómákhoz kötött génekre, hanem autoszomális génekre is jellemző. Az ecetmuslica esetében autoszómához kötött testszín és szárny formát vizsgáltak (testszín: barna b+, fekete b valamint a szárny forma : egyenes c+, görbe c). A tesztelő keresztezés során 25

megfigyelték, hogy a rekombinánsok előfordulási gyakorisága 23% volt. Mivel a szülői tulajdonságváltozatok előfordulása magasabb volt mint a rekombináns tulajdonságváltozatok előfordulása, ezért a két gént genetikailag kapcsoltnak tekintjük, jelen esetben egy autoszómához. Rekombináció Az hogy a gének fizikailag kromoszómákhoz kötöttek, ezért együtt/kapcsoltan öröklődnek eléggé egyszerű elképzelni. De a rekombináns változatok különböző gyakorisággal való előfordulását már nehezebb megérteni. Létezik egy olyan fizikai folyamat amelyben a kromoszómák részt vesznek és amely a rekombináns változatokat eredményezi? 1909-ben Frans Janssens mikroszkóp alatt figyelte meg a meiótikus osztódás során kialakuló kiazmákat. A kiazmák azok a régiók, ahol a homológ kromoszómák közötti kölcsönös információcsere megy végbe, azaz a crossing-over (a tulajdonságok újszerűen kombinálódnak).

11-17 dia

5.2. Kromoszómatérképezés Különböző gének között különböző kapcsoltsági ráta figyelhető meg, hiszen a gének a kromoszómákon sorban helyezkednek el. Ha két gén közelebb helyezkedik el egy kromoszómán, kissebb a valószínűsége hogy a crossing over során elválasztódnak egymástól. Ha két gén egymástól távol van a kromoszómán, az esélye, hogy a crossing-over szétválassza, sokkal nagyobb. A rekombinációk gyakorisága tehát a gének egymáshoz viszonyított helyét jelzik. Ezt az összefüggést Morgan tanítványa Alfred Sturtevant fejleszti tovább, és javasolja, hogy a rekombinációs frekvenciát (RF) használják a gének egymástól való távolságának kifejezésére=centimorgan (cM)=térkép egység (m.u.).

14. ábra. A w, z, m gének kromoszómatérképe

26

Az ecetmuslica X kromoszómához kötött génjei közötti w, z, m genetikai távolság meghatározása. Ha ez a három gén a kromoszómán lineárisan helyezkedik el, akkor az egyik középen, míg a másik kettő szélen kell legyen. A legnagyobb genetikai távolság tehát a két szélen levő gént határozza meg egymástól, és a másik két genetikai távolság összegével megközelítőleg megegyező. Tehát a w gén az y és az m gén között helyezkedik el. Tehát a rekombinánsok előfordulási gyakorisága alapján meghatározható a kromoszómán lineárisan elhegyezkedő gének egymáshoz viszonyított helyei (14 ábra).

27

6. A GÉNEK ÉS AZOK SZEREPE: DNS MINT ÖRÖKÍTŐ ANYAG, DNS REPLIKÁCIÓJA

4-10 dia

6.1. DNS mint örökítő anyag A múlt század első felében nem volt ismert tény, hogy hol helyezkedik el az örökítő anyag a sejten belül, és azy sem ismerték, hogy milyen molekula töltheti be a genetikai funkciót. Nyilvánvalónak tűnt, hogy az örökítő anyagnak valamilyen bonyolult szerkezetű makromolekulának kell lennie, hiszen csak egy ilyen molekula képes biztosítani azt a fenotípusos komplexitást, amit pl. egy emberi test képvisel. 1890-ben kimutatták, hogy a genetikai anyag a sejtmagban van. A későbbi vizsgálatok konkrétabban is megjelölték ezt a helyet, eszerint az örökítő anyag a kromoszómákban található: Theodor Boveri (1902) kimutatta, hogy a kromoszómák szegregációja (szétválása) a meiózis során az a folyamat, amely a Mendeli törvények genetikai alapját képezi. Mivel a kromoszómák két komponensből állnak, fehérjékből és DNSből, ezért ezt a két makromolekulát gyanították, hogy sz örökítő molekula. Eleinte a fehérjékre gyanakodtak, mert ezek a molekulák eléggé bonyolultak ahhoz, hogy a genetikai információt tárolják. Ebben az időben a DNS szerkezetét ugyanis túl egyszerűnek, monotonnak hitték. Griffith baktérium kísérletei: Frederick Griffith (1928) tüdőgyulladást okozó S.pneumoniae baktériummal végzett kísérleteket. Griffith kérdése az volt, hogy egy fertőzőképes baktérium képes-e átadni a virulenciáját egy nem virulens baktériumnak. A kísérleteket a virulens S (sima) és az avirulens R-típusú (durva) törzsekkel végezte. Az Stípusú baktériumokat egy poliszacharid kapszula borítja kívülről, ez eredményezi a simának tűnő felszínüket. A kapszula az S-típusú baktérium számára védelmet biztosít a gazdaállat immunrendszerével szemben, ezért az ilyen kórokozó letális (pusztulással járó) fertőzést okoz a kísérleti egerekben. Az Rtípusú baktériumokat nem borítja kapszula, ezért az immunrendszer elpusztítja ezeket. Ha S-típusú baktériumokat hővel inaktiválunk, azok nyilvánvalóan nem lesznek képesek többé megfertőzni az egereket. Griffith meglepő megfigyelése az volt, hogy ha hővel elölt S-típusú baktériumokat élő nemvirulens R típusú baktériumokkal kevert össze, s e koktéllal egereket fertőzött, akkor a kísérleti állatok elpusztultak, s a vérükből élő S-típusú baktériumokat lehetett izolálni. Magyarul, az elölt virulens (S) baktériumból valamilyen anyag átvitte a virulens sajátságot az élő avirulens R-típusú sejtekbe, s ezáltal virulensekké alakította át (transzformálta) az eredendően avirulens baktériumokat. Azt a kérdést, hogy mi ez a transzformáló anyag, Griffith idejében nem lehetett megválaszolni, mivel ehhez a vizsgálathoz szükséges technológiák nem álltak még rendelkezésre. Avery: Griffith módosított kísérlete: Hővel elölt S törzset tartalmazó sejtmentes kivonatokat kezeltek különféle enzimekkel: lipidbontó (lipáz), fehérjebontó (proteáz), RNS-bontó (ribonukleáz = RNáz) és DNS-bontó (dezoxiribonukleáz = DNáz) enzimekkel. Ezt követően a kezelt mintákat hozzáadták élő R-típusú baktériumokhoz, s azt vizsgálták, hogy melyik mintában szűnik meg a transzformáló hatás. Avery-ék azt tapasztalták, hogy kizárólag a DNS-bontó enzimekkel kezelt minták nem voltak képesek az avirulens R baktériumokat virulens S törzsekké transzformálni. A kutatók levonták a helyes következtetést: a DNS az örökítő anyag. Ma már 28

ismert, hogy a sikeres transzformációhoz a baktérium poliszacharid kapszuláját előállító egyik enzim génjének kell átkerülnie az inaktivált S törzsből az élő avirulens R törzsbe. Averyék kísérlete nagyon fontos lépés lehetett volna az örökítőanyag mibenlétének tisztázásában, ha felfigyelt volna rá a tudományos társadalom. De nem ez történt, így ezek az eredmények visszhang nélkül maradtak. Hershey-Chase kísérlet: bakteriofágok: A DNS örökítőanyag voltának igazolásában végül a Hershey és Chase bakteriofágokat használó (baktériumok vírusai) kísérlet győzte meg a tudóstársadalmat. A kutatók ötlete az volt, hogy a fág azon komponensének kell lennie az örökítőanyagnak, amelyik bejut a baktérium sejtbe, ahol átveszi a sejt irányítását, melynek eredményeként sok fág részecske képződik (200 db/sejt). Azért esett a választás a T2 fágra, mert a vírusoknak viszonylag egyszerű a szerkezetük: egy kisméretű DNS molekulából és néhány fehérje típusból állnak. A sejtbe jutó komponens kimutatásához radioaktív izotópokkal jelölték meg a makromolekulákat: a fehérjéket a kén 35-ös radioizotópjával (S35), a DNS-t pedig a foszfor 32-es radioizotópjával (P32). A fertőzés után egy rövid idővel jól összerázták a mintát, hogy a sejtbe be nem jutott fág részecskéket eltávolítsák a baktériumok felszínéről, majd centrifugálással elválasztották a baktérium sejteket (ezek az üledékbe kerültek) a felülúszótól, mely a táplevest és a baktériumsejtekbe be nem jutott fág részecskéket tartalmazta. A kutatók azt az eredményt kapták, hogy a radioaktív foszfor az üledékben, míg a radioaktív kén a felülúszóban helyezkedett el, melyből levonták a következtetést, hogy a DNS az örökítő anyag.

11-23 dia 6.2. A DNS szerkezetének felfedezése Milyen a szerkezete és hogyan működik a DNS? Ismert volt, hogy a dezoxiribonukleotidok a négy bázis (A, T, G, C) egyikéből egy dezoxiribózból és egy foszfát csoportból állnak (a ribonukleotidokban a dezoxiribóz helyett ribóz, a T helyett pedig U = uracil) van. A ribózból és egy bázisból álló molekulát nukleozidnak nevezzük (adenozin, guanozin, citidin és uridin), a dezoxiribózt és bázis tartalmazó molekulák pedig a dezoxiribonukleozidok (dezoxiadenozin, dezoxiguanozin, dezoxicitidin és dezoxitimidin). A fenti molekulák foszforilált formáit pedig nukleotidoknak, vagy nukleozid monofoszfátoknak (az RNS-t alkotják), ill dezoxinukleotidoknak, vagy dezoxiribonuleozid monofoszfátoknak (a DNS alkotói) nevezzük. Két foszfát esetében ribonukleozid difoszfát, három foszfát csoport esetében pedig nukleozid trifoszfát a molekulák neve (pl. adeniozintrifoszfát, dezoxicitidin-difoszfát, stb.). Megjegyzés: egy DNS (vagy RNS) szakasz hosszúságát rendszerint bázisokban duplaszálú molekula esetében bázispárokban (bp) adják meg. Chargaff szabály: megfigyelte, hogy az A bázis mindig egyforma arányban fordul elő a T-vel, csakúgy, mint a G a C-vel, ami egyben azt is jelenti, hogy a purinok és a pirimidinek aránya egyenlő. A DNS szerkezetének felderítésében egy döntő felfedezés az volt, hogy a nukleotidok egymással foszfodiészter kötéssel kapcsolódva polimereket képeznek. Ez a felfedezés Alexander Todd nevéhez fűződik. A foszfodiészter kötések eredményeként a DNS szál gerincét egy váltakozó cukor-foszfát molekula lánc alkotja, melyben a dezoxiribóz 5’ és 3’ C atomjai vesznek részt. Röntgenkrisztallográfiás kíésrletek: Rosalind Franklin nevéhez fűződnek, ő próbálkozott a DNS szerkezetének meghatározásával az ún. Röntgen-diffrakció módszerét használva. A Röntgen kép alapján 29

a DNS szabályos szerkezetűnek tűnt, periodikus ismétlődődéseket tartalmazó molekula szerkezettel. Franklin azonban ezekből az adatokból nem tudott felépíteni egy háromdimenziós struktúrát. A DNS szerkezetének feltárásához egy újszerű megközelítés, a modellépítés vezetett el. Watson és Crick: a DNS egy kettős spirál. A Watson és Crick által javasolt, s helyesnek is bizonyult, modell szerint: a DNS egy kettős spirál amelyben a két foszfodiészter kötések által összetartott cukorfoszfát szál csavarodik egymás körül. A két cukorfoszfát láncot bázispárok kötik össze, melyeket H-hidak tartanak egyben. A bázispárosodás a komplementaritás elve alapján történik, ami annyit jelent, hogy az A egy T bázissal (2 H-kötés), a G pedig egy C bázissal (3 H-kötés) kapcsolódik. Látható, hogy egy purinnal szemben mindig egy pirimidin áll, ezért a két cukorfoszfát lánc egymástól való távolsága állandó. A két DNS szál antiparallel („fordított”) orientációjú. Ez azt eredményezi, hogy a polinukleotid lánc mindkét végén a két DNS szál eltérő orientációjú: az egyik szálon a dezoxiribóz 5’ C atomján lévő foszfát csoport (PO4) áll szabadon (nem kapcsolódik hozzá dezoxiribóz), a másik szálon pedig a pentóz 3’ C atomján lévő hidroxil (-OH) csoport szabad (nem kapcsolódik hozzá foszfát). A két DNS szálat többféleképpen szokás nevezni. Kódoló (= értelmes) szál tartalmazza az aminosavak kódolásához szükséges információkat, tehát a szekvenciája megegyezik a mRNS-ével, figyelembe véve a TU bázis különbséget a DNS és az RNS között. A másik szálat komplementer (templát) szálnak nevezzük. Tehát, az mRNS a komplementer DNS szálról íródik át, templátként használva azt.

27-34 dia

6.3. DNS replikációja Szemikonzervatív DNS replikáció: A Watson-Crick-féle DNS modell azt sugallta, hogy a DNS replikáció ún. szemikonzervatív („félig konzervatív”) módon zajlik, ami annyit jelent, hogy első generációban képződött DNS egyik szála az eredeti szülői DNS szál, a másik pedig újonnan képződik, mégpedig a szülői szálat használva mintaként. Ezt a hipotézist azonban be kellett bizonyítani, amely kísérletet Meselson és Stahl végezte. Első lépésben felállították a három elméletileg lehetséges replikációs modellt: (1) szemikonzervatív; (2) konzervatív (a szülői DNS szálai együtt maradnak, s az utód DNS mindkét szála újonnan képződik); (3) diszperzív (szétszórt; az utód DNS mindkét szála tartalmaz új és szülői DNS szakaszokat is). Meselson és Stahl módszere az ún. sűrűség gradiens ultracentrifugáláson alapult. E technika lényege a következő: a centrifuga csőben - pl. szacharóz oldatból - egy sűrűség gradienst képzünk (a cső tetején alacsony, az alján pedig magas az oldat sűrűsége), majd hozzáadjuk a szétválasztandó anyagokat, melyek sűrűsége eltérő. A centrifugálást követően, a sűrű anyagok a cső aljához, a kevésbé sűrűek pedig a cső szájához közel fognak elhelyezkedni. A nitrogén normál (könnyű) 14-es (N14) formája mellett létezik egy nehezebb, nem-radioaktív 15-ös molekulasúlyú (nehéz) nitrogén izotóp is (N15). Ha baktériumokat nehéz N-t tartalmazó táplevesben nevelünk, annak izolált DNS-e - az ultracentrifugálást követően - a centrifugacsőben alább fog elhelyezkedni, mint a könnyű táptalajon nevelt baktériumból származó DNS. Meselsonék első lépésként az előzőleg hosszú ideig nehéz N-t tartalmazó táplevesben nevelt baktériumokat (Escherichia coli = bélbaktérium) könnyű N-t tartalmazó táplevesbe helyeztek (ez azt eredményezte, hogy a baktériumok DNS-e nehéz nitrogénből állt). Ezt követően időzítették a 30

mintavételeket az osztódáshoz szükséges idő szerint: egyetlen osztódás 20 percig tart, két osztódás 40 percig, és így tovább. A kutatók izolálták, majd lecentrifugálták az így kapott DNS-eket, s a következő eredményeket kapták: 20 perc után (1. osztódás) az izolált DNS a könnyű és nehéz DNS csíkja között helyezkedett el; 40 perc után két csíkot kaptak: egy köztes csíkot és egy könnyű DNS-nek megfelelő csíkot; 60 perc után a könnyű DNS sávja vastagabb lett, mint a nehézé. Ez a kísérlet kitűnő bizonyítékként szolgált a DNS szemikonzervatív replikációs módjának igazolására. Replikáció: A szemikonzervatív modell szerint a szülői DNS egyik szála templátként szolgál az új DNS szál szintéziséhez. A szintézis mindig 5’-3’ irányban zajlik. A láncnövekedéshez az energiát dezoxiribonukleotid trifoszfátokról (dNTP) lehasadó pirofoszfát (két foszfát) szolgáltatja. A dNTP-k szintéziséhez ezért a sejtnek előzetesen energiát kell befektetnie. A DNS szintézisét végző enzim a DNS polimeráz-III molekula, amely csak akkor képes elindítani a szintézist, ha egy rövid egyszálú RNS szakasz (primer) előzőleg elhelyezkedik a DNS szálon. A primer lényegében kijelöli a pol-III számára a DNS azon szakaszát, ahol a replikáció elkezdődhet. Az RNS szálat a primáz nevű enzim képezi a DNS szálat használva templátként annak szintéziséhez. A DNS szintéziséhez számos fehérje szükségeltetik, melyek együtt az ún. replikációs komplexet alkotják. A helikáz enzim feladata a DNS szálak kitekerése, az ún. egyszálú DNS szerkezetet stabilizáló fehérjék pedig a két szülői szálat tartják elválasztva a replikáció folyamán. Mivel az új láncok szintézise 5’-3’ irányban halad, a két szál szintézise különböző módon megy végbe. A DNS replikációja során a vezető szálon a szintézis folyamatosan haladhat, míg a követő szálon szakaszos. A követő szál szintézisének állandóan újra kell kezdődnie, hiszen itt a templát DNS csak akkor hozzáférhető a DNS polimeráz enzim számára, ha a másik szálon már előrehaladt a szintézis. Ennek eredményeként a követő DNS szálon nem folyamatos a DNS lánc növekedése, hanem kisebb DNS darabok jönnek létre, melyeket Okazaki fragmentumoknak nevezünk. Az Okazaki fragmentumok RNS primerjeit (amit a primáz enzim szintetizál) a DNS polimeráz I enzim folyamatosan eltávolítja és DNS szakaszokat szintetizál helyette. A DNS szakaszok közötti foszfodiészter kötés kialakítását a DNS ligáz enzim végzi.

31

7. A GÉNEK ÉS AZOK SZEREPE. A GÉNEK MŰKÖDÉSE: TRANSZKRIPCIÓ, TRANSZLÁCIÓ. GÉNEXSZPRESSZÓ 4-12 dia

7.1. Genetikai kód A genetikai kód a DNS fehérjévé való leolvasására vonatkozó szabály. Egy aminosavat 3 bázis határoz meg, amiket tripleteknek, vagy bázishármasoknak nevezünk; pl. az ATG a metionint, vagy a TTT a fenilalanint. Az mRNS-eken lévő bázishármasokat kodonoknak nevezzük. A kodonok megegyeznek a kóddal, csak T helyett U található; így a metonint AUG, a fenilanalint az UUU triplet határozza meg. A kódszótár tripletjeinek megnevezéséhez az RNS bázisokat használják. A transzfer RNS-en lévő kodonokkal komplementer bázishármasokat anti-kodonoknak nevezzük. A genetikai kód jellemzői:  A genetikai kód tripletekből áll.  A genetikai kód redundáns vagy degenerált. Ez azt jelenti, hogy „több mint ami szükséges”. A 4 bázisból 64-féle (43) triplet kombinációt képezhetünk. Ha ezekből levonjuk a 3 stop kódot (TAA, TAG, TGA), akkor is 61 különböző variáció marad, míg aminosavakból csupán 20-féle létezik. Ez a kombinatorikai helyzet úgy oldódik meg, hogy a legtöbb aminosavat több mint egy bázishármas határozza meg: pl. a leucint 6, a glicint 4, a ciszteint 2, míg a triptofánt vagy a lánckezdő metionint csak 1. A redundancia azt jelenti tehát, hogy sok aminosavat több mint egy bázis triplet határoz meg. A redundanciából következik, hogy bizonyos bázisok megváltozása egy tripletben nem eredményez aminosav cserét. Ezek a cserélhető bázisok leggyakrabban a tripletek 3. pozíciójában találhatók. A genetikai kód redundanciáját az biztosítja, hogy egy aminosavat több, különböző antikodont tartalmazó, tRNS is szállíthat egy adott kodonhoz. A redundancia fogalmát gyakran keverik az ún. „lötyögés”-el (wobble effect), amit Francis Crick fedezett fel. A lötyögés azt jelenti, hogy bizonyos esetekben egy tRNS antikodonja nem csupán egy, hanem 2, esetleg 3 különböző kodonhoz is képes kapcsolódni a mRNS-en. Ennek oka az, hogy 5’ irányból nézve az antikodon 1. bázisa képes nem-specifikus módon is kapcsolódni a kodon 3. bázisához. Más szavakkal, nincs szükség 61 tRNS-re az összes kodon felismeréséhez, körülbelül a fele is elég. A lötyögés azért nem okoz variabilitást egy fehérje aminosav sorrendjében, mert egy tRNS olyan kodonokat ismer fel, amelyek ugyanazt az aminosavat kódolják.  A genetikai kód vesszőmentes és nem átfedő, ami azt jelenti, hogy a tripletek nem határolódnak el semmilyen jellel egymástól. Más szavakkal, pl. ha beszúrunk egy bázist a DNS-be, akkor nem csupán egyetlen triplet válik értelmetlenné, hanem az új bázistól 3’ irányban lévő összes triplet értelme megváltozik. Más szavakkal, a genetikai kód vesszőmentessége azt jelenti, hogy a génekben nincsenek kitüntetett jelek arra vonatkozóan, hogy egy triplet hol kezdődik (kivéve start kodon: AUG). A genetikai kód nem-átfedő sajátsága azt jelenti, hogy a transzláció során egy 32



adott bázis csak egyetlen aminosav meghatározásában vesz részt. Más szavakkal, egy adott bázishoz nem kapcsolódhat két különböző tRNS molekula a transzláció során. A genetikai kód univerzális, ami annyit jelent, hogy ugyanaz a triplet ugyanazt az aminosavat határozza meg a Föld összes élőlényében. Az univerzalitás alóli kivétel van, hiszen néhány organizmusnál (néhány egysejtű, mitokondrium és a kloroplasztisz) egy vagy két triplet más aminosavat vagy stop kodont kódol, de a többi a kód többi része változatlan.

A genetikai kód triplet voltának felismerése: Francis Crick és Sydney Brenner fejtették meg 1961-ben, hogy azmRNS-en hány nukleotid egység határoz meg egy aminosavat. Egy adott fágnak különböző variánsait állították elő. Ezekben a variánsokban rendre ugyanaz a gén hordozott mutációt, de mindegyik típusban a gén más pontján következett be a mutáció. Ráadásul speciális kémiai mutagenezis eljárásokat alkalmaztak, amelyekkel az egyik eljárás szerint elsősorban inszerciót, vagyis egy extra nukleotid beépülését érték el, míg egy másikkal deléciót, vagyis egy nukleotid kiesését. A kísérletek eredményeként kiderült, hogy amikor deléciós mutánst inszercióssal rekombináltak, akkor az esetek egy részében génen belüli komplementáció történt: a dupla-mutáns vadtípusú tulajdonságú lett. (A komplementáció, mint genetikai kifejezés ebben a konkrét esetben azt jelenti, hogy a kettős mutáns az eredeti fenotípust mutatja, tehát a második mutáció eltörli az első hatását. A két mutáció mintegy egymást kiegészítve, komplementálva, kialakítja az eredeti állapotot.) Ha azonban két delécióst kombináltak egymással, akkor ilyen eredményt soha nem kaptak, és ugyanez volt igaz arra az esetre is, ha két inszercióst kombináltak egymással. Ezek sem mutattak vadtípusú eredményt. Három inszerciós együttes fertőzése ugyanakkor néha vadtípusúhoz hasonló triplamutánst eredményezett, és ugyanezt kapták, amikor három deléciós fággal fertőztek.

15. ábra: Az inszerció, illetve a deléció eltolja a leolvasási keretet Mindebből Crick és Brenner a genetikai kóddal kapcsolatban az alábbiakra következtettek: a kódban szerepel egy kezdőpont, ami kijelöli, hogy honnan kell kiolvasni a nukleinsavból az információt. Ebből a pontból elindulva a kiolvasás szisztematikus rendben, sorban halad. A kódolási eljárásban nincs fizikai központozás, ami önmagában kijelölné az olvasási keretet, tehát a kódolási eljárás vesszőmentes. A 33

meghatározott kezdőpont, a szisztematikus haladás és a központozás hiánya miatt egy inszerció vagy egy deléció eltolja a leolvasási keretet. A tripla deléciós illetve a tripla inszerciós mutánsok esete alapján arra jutottak, hogy a kódolási eljárás három nukleotid egységeken, tehát tripleteken alapul. A 15. ábrán látható, hogy amennyiben egy inszerció, vagy deléció történik, úgy azt követően a leolvasási keret eltolódása miatt teljesen más információ olvasódik le, mint eredetileg. Ha azonban egymáshoz közel következik be egy inszerció és egy deléció, akkor csak a mutációk közvetlen közelében változik meg a leolvasandó információ, azt követően megmarad az eredeti rend. Amennyiben határozott jelek mutatnák a kódolt szövegekben a kódoló egységek határát (központozás), úgy egy inszerció vagy deléció csak egyetlen egységet érintene. Arra egyébként már korábban Gamow is felhívta a figyelmet, hogy a 20-féle aminosav 4-féle DNS nukleotidon alapuló egyszerű kódolásához legalább 3 nukleotid egység kell, hiszen két egység csak 42=16, eltérő jelsort jelent. Mivel a 3 egység viszont már 43=64 eltérő jelsort jelent, a kód „degenerált” (másképpen kifejezve redundáns), egy aminosavra átlagosan több mint 3 triplet jut. A genetikai kód megfejtése: A genetikai kód megfejtése A genetikai kód megfejtéséhez két különböző technikát alkalmaztak. Nierenberg egy in vitro fehérjeszintetizáló rendszerhez egyféle bázist tartalmazó nukleotidokat adott, melynek eredményeként egyféle aminosavat tartalmazó polipeptidek keletkeztek: pl. az U bázis esetében poli-fenilalanin (UUU), az A bázis esetében poli-lizin (AAA), a C bázis esetében pedig poli-prolin (CCC). Megjegyzés: a G bázissal technikai okok miatt nem tudtak dolgozni. Ez a rendszer azonban nem működött kevert bázisú nukleotidokkal, mert túl sok volt a variáció. Khorana egy másféle megközelítéssel oldotta meg a problémát: 3 bázisból álló ribonukleotidokat szintetizált, amelyek hozzákapcsolódtak a riboszómákhoz, majd ezt követően a tRNS-eken lévő antikodonokhoz. Ezután a kutató az oldatot egy szűrőn átpréselte. Az összes aminosavat tartalmazó tRNS átfolyt a szűrő pórusain, kivéve a riboszómával kapcsoltak (a kapcsolódást a mesterséges triplet tette lehetővé). Khorana különféle aminosavakat jelölt meg radioaktívan, s egyszerűen párba állította a szűrőpapíron fennmaradt aminosavakat a hozzáadott tripletekkel. Nierenberg és Khorana 1968-ban Nobel díjat kaptak a genetikai kód megfejtéséért.

13-18 dia

7.2. Transzkripció és splicing A DNS-ben tárolt információ kifejeződése, más néven a génexpresszió első lépéseként a DNS-ben dezoxiribonukleotidok sorrendjeként tárolt információ RNS molekulákba íródik át. Ez a folyamat a transzkripció (átírás). A név találó, mert valóban egyfajta átírásról van szó, ahol egyik betűtípusról áttérünk egy másikra. Az így keletkező RNS átiratban az információ továbbra is nukleotid bázisok lineáris sorrendjeként van jelen, bár itt a cukor dezoxiribóz helyett ribóz, és az egyik bázis, a timin helyett itt uracil szerepel.

34

A DNS komplementer vagy templát száláról történik az mRNS átírása. A folyamat kulcsenzime az RNS polimeráz. Az RNS polimeráz egy holoenzim, amely több alegységből épül fel és több funkció ellátására is képes. Iniciáció: A transzláció iniciációs fázisában az RNS polimeráz enzim a DNS szálhoz kötődik, elcsúszik a DNS szálon addig amíg a promoter régióhoz nem ér (a gén előtt -35 és -10 bp távolságra található a TATA box-nak is nevezett régió). A promoter régió felismerését követően az RNS polimeráz enzimről leválik a σ faktor, így az enzim aktiválódik. Az RNS polimeráz enzim a mRNS szintézise mellett a : hidrogén hidak felhasítását és a DNS molekula kicsavarását is végzi. Elongáció: Az elongáció során az aktivált RNS polimeráz (RNS polimerázról levált a σ faktor) elkezdi az mRNS szintézisét. Mindez a transzkripciós hólyagban megy végben, ahol a DNS kettős hélixe köyötti hydrogen híd kötéseket az RNS polimeráz felszakította, így az RNS polimeráz számára hozzaférhető a komplementer avagy a templát szál. A templát szálról lemásolt mRNS a vezető szállal megegyező lesz, különbség csak annyi, hogy a DNS szerkezetében előforduló T helyett az mRNS U fog tartalmazni. Termináció: Az mRSN szintézise addig folytatódik, amíg a keletkezett mRNS szekvenciáján két rövid komplementer szakasz is nem íródik át, amely egymással egy kettős szálú struktúrát alakít ki, amely hajtűre emlékeztet. Az RNS hajtű kialakulását követően az RNS polimeráz elengedi a DNS szálat és a transzkripció vagy átírás befejeződik. Splicing vagy az mRNS érése: 1970 években megfigyelték, hogy mRNS és DNS szakaszok összehasonlítása során az eukariótáknál különbségek mutatkoznak. Extém példája a humán disztrofin génje, amely 2,5 millió bp-ból áll míg az ebből átíródott mRNS 14,000 b hosszúságú volt. A humán disztrofin génje tehát nem kódoló szakaszokat is tartalmaz, azaz intronokat. Azokat a szakaszokat amelyek kifejeződnk exonnak, azokat a szakaszokat amelyek nem fejeződnek ki és az exonok között helyezkednek el beékelődött régiónak vagy intronnak nevezzük. A humán disztrofin ezetében 80 introni ismerünk, amelyek kb. 35 kb méretűek és egyik 400 kb méretű. Az eukarióta szervezetek esetében az mRNS a transzláció után módosul, ezt a folyamatot az mRNS érésének vagy splicingnak nevezzük. A módosulás során a gén nem kódoló szakaszai az intronok kivágódnak, így a keletkezett érett mRNS rövidebb lesz mint az elsődleges transzkript. Az mRNS érése során lehetőség van arra is, hogy az elsődleges transzkriptból különféle érett mRNS-t kapjunk, azaz olyam mRNS-et amelyekből különböző fehérje lesz. Ezt a folyamatot alternatív splicingnak nevezzük.

20-26 dia 7.3. Transzláció A transzláció vagy a fehérjeszintézis a citoplazmában avagy az endoplazmatikus retikulumban megy végbe. A fehérjeszitézis helyszíne a riboszómák. A transzláció során a nukleotid nyelven megírt mRNS 35

lefordítódik aminosav nyelvre. Ehhez a kódszótárt a genetikai kód szolgáltatja. Az a struktúra amely mind nukleotid mind pedig aminosav nyelvet ismeri az a tRNS (transzfer RNS), és amely a fordírást végzi. A tRNS 74-95 nukleotid hosszúságú, amely lóhere alakban felcsavarodott szerkezetet mutat. A tRNS tartalmaz egy antikodon régiót valamint egy aminosav kötő helyet. A tRNS-et annak függvényében jelöljük, hogy milyen aminosavat hordoz, így a licint tartalmazó tRNS-t tRNSGly jelöléssel létjuk el. A tRNS antikodonja által meghatározott aminosavat az aminoacil tRNS szintetáz enzim kapcsolja a tRNSre. Az élő szervezetekben általában kevesebb tRNS figyelhető meg mint amennyi lehetséges kodon van. Például az E. coli esetében 79 különböző tRNS-t figyeltek meg, amelyből 42 féle különböző antikodont tartalmazőt (79-42=19, tehát kodon nincs képviselve). Itt meg kell említeni a Crick által megfogalmazott „lötyögés” (wobble) törvényét, hogy az utolsó nukleotid nem kulcsfontosságú a genetikai kódban (pl. GGU, GGC, GGA és GGG a glicint kódolja, a GUU, GUC, GUA és GUG a valint). A fehérjeszintézis másik kulcsfontosságú struktúráját a riboszómák képezik, amelyek 2 alegységből épülnek fe. Biokémiailag RNS és fehérje építi fel (pl. E.coli-ban 3 féle rRNS és 52 féle fehérje). A riboszómákban különböző részek különíthetők el, különböző funkcióval, mint a A (aminoacil), P (peptidil) és E (exit) kötőhelyek. Az A kötőhelyre érkezik a tRNS amely a kodonnak megfelelő aminosavat hordozza, majd a P kötőhelyen található tRNS által hozott aminosavval peptid kötést alakít ki. A peptidkötés kialakulása után a P kötőhelyről a tRNS átcsúszik az E kötőhelyre, és távozik. Iniciáció: Az iniciáció során a riboszóma kia elegysége és az mRNS összekapcsolódnak az iniciációs kodon és a Shine-Dalgarno szekvenciának nevezett régiójában. Az iniciációs kodonnak megfelelő iniciációs tRNS amely metionint vagy formil metionint tartalmaz bekapcsolódik a riboszóma kis alegységéhez, majd a riboszóma nagy alegysége is kapcsolódik, akialakítva a transzlációs struktúrát. Elongáció: Az elongáció során az elongációs faktor fehérjék játszanak szerepet a megfelelő tRNS aminoacil (A) kötőhelyre való érkezésében. A P-peptidil kötőhelyen található aminosav és az aminoacil kötéhelyre érkezett aminosav között kialakul a peptid kötés. A transzláció során az mRNS 5’-3’ irányban olvasódik le. A transzláció sebessége 2-15 AS/sec, azaz 300 AS álló fehérje 20 sec.-2,5 min. Termináció: Nincs a stop kodonoknak megfelelő tRNS a szervezetben. Így amikor a transzláció az mRNS-ben található stop kodonhoz ér (UAG, UAA, UGA) az elengedő faktornak nevezett fehérjék (release factor) hatására a transzláció befejeződik.

29-33 dia

7.4. Génszabályozás: prokarióta génexpresszió szabályozása A bakteriális gének jó része közös szabályozás alatt álló egységekbe, ún. operonokba szerveződik. Koordináltan szabályozódnak például egy anyagcsere útvonal enzimei (lásd Trp-operon), egy tápanyag hasznosításához szükséges fehérjéket (lásd laktóz-operon) vagy a riboszómális proteineket kódoló gének. Egy operon felépítését a 16. ábra mutatja be. Az operon tehát egy transzkripciós egység.

36

16. ábra: A bakteriális operonok általános szerkezete A lac-operon működése: A kólibaktérium fő tápanyaga a glükóz, azonban annak hiányában más szénforrásból, így többek között tejcukorból is tud energiát nyerni. A tejcukor (laktóz) hasznosításához azonban szükséges legalább két olyan fehérje, amelynek génjei nem fejeződnek ki állandóan. Ez a két fehérje a laktóz hidrolízisét végző enzim, a β-galaktozidáz (génje a lacZ) és a tejcukor felvételét végző galaktozid-permeáz (más néven laktóz-permeáz, egy facilitált transzportot végző integráns membránfehérje, génje a lacY). A laktóz hasznosítást koordináltan szabályozó laktóz-operon (röviden lac-operon) tartalmaz egy harmadik „szerkezeti gént” is (lacA), ami egy transzacetiláz enzimet kódol, ami nem esszenciális a laktóz hasznosításhoz. A lacI gén terméke, a lac-represszor fehérje gátolja a három szerkezeti gén átírását, mivel kötődik a lacoperátor régióhoz (lásd 17. ábra). A lacI gén közvetlenül a lac-operon előtt helyezkedik el, de nem része az operonnak. A lac-represszor igen nagy affinitással kötődik az operátor régióhoz, ami azt is jelenti, hogy a baktériumsejtben már néhány represszor molekula elegendő az operátor régió lekötésére. Amennyiben megjelenik a kólibaktérium tápközegében a tejcukor, abból valamennyi bekerül a sejtbe, mivel néhány kópia laktóz-permeáz átíródik a represszió alatt álló lac-operonról is.

17. ábra: A laktóz-operon működési vázlata 37

A sejten belül a szintén néhány példányban jelen levő β-galaktozidáz enzim a laktózt allolaktózzá alakítja. Az allolaktóz induktorként kötődik a lac-represszorhoz, befolyásolja a molekula konformációját (térszerkezetét), aminek az eredményeképpen a represszor leválik az operátorról, az RNS-polimeráz kötődik a promóterhez és a lac-operon génjei átíródnak. A most már sok példányban megjelenő laktózpermeáz felveszi a környezetből a tejcukrot, a β-galaktozidáz pedig hidrolizálja azt. Amint lecsökken a tejcukor szintje, lecsökken az induktor koncentrációja is, az allolaktóz disszociál a lac-represszorról, az visszaköt az operátorhoz, s ezzel helyreáll az eredeti gátolt állapot, a szabályozó kör bezárult. A Trp-operon működése: Az E. coli mind a húsz fehérjealkotó aminosav szintézisére képes. Ha egy aminosavból elegendő áll a sejt rendelékezésére, az adott operont specifikus represszora gátlás alatt tartja; amikor fogytán az aminosav, a gátlás alól az operont fel kell szabadítani. Ebben az esetben tehát a végtermék felhalmozódása "kapcsolja ki" a bioszintézist végző enzimeket. Ezek a bioszintetikus utakat szabályozó operonok esetében az adott aminosav szabályozza az operon represszorát, ami csak a jelenlétében (pozitív szignál) kötődik az operátor régióhoz.

38

8. MOLEKULÁRIS TECHNIKÁK

2-4 dia

8.1. DNS fragmentáció: restrikciós enzimek A restrikciós endonukleázok baktériumokban, archeákban, és egyes vírusokban megtalálható enzimek, amelyek a restrikciós-modifikációs rendszer komponensei, azaz az idegen DNS elleni védelmet biztosít azáltal, hogy az idegen DNS-t feldarabolja. A restrikciós endonukleázok (vagy röviden restrikciós enzimek) specifikus helyeket ismernek fel a DNS molekulán, majd a DNS mindkét szálát átvágva képesek azt elhasítani (foszfodiészter kötéseket hidrolizálnak). Elnevezésük úgy történik, hogy az enzim rövid nevét a baktérium latin nevéből kapja, így az EcoRI enzim neve is: az Escherichia coliRY13 törzséből származik, a szám pedig azt jelzi, hogy hányadikként izolálták. A restrikciós enzimek felismerőhelye általában 4-8 bázispárhosszúságú, és jellemzően palindrom szekvencia. A palindrom kifejezés azt jelenti, hogy a DNS bázissorrendje előre és hátrafelé olvasva (a két, komplementer láncra vonatkoztatva) ugyanaz. Például a KpnI nevű enzim felismerő helye az 5’-GGTACC3’ szekvencia. Ennek a komplementer párja 3’→5’ irányban CCATGG, ami visszafelé olvasva éppen GGTACC.

18.ábra.Ragadós és tompa végek. A restrikciós enzimek hasításának terméke lehet ragadós végű (KpnI) vagy tompa végű (SmaI) DNS. A ragadós véget produkáló restrikciós enzimeket különböző eredetű DNS-szálak egymáshoz illesztésére lehet felhasználni, így főleg a génklónozási (nem összetévesztendő a teljes szervezet klónozásával) és 39

génsebészeti kísérletekben. Erre a célra speciális plazmidvektorokat (plazmidok a baktériumokban található gyűrű alakú és kettős szálú DNS-molekulák) fejlesztettek ki, melyeken több, gyakran használt enzim felismerőhelye is megtalálható. Mind a plazmidot, mind az átvivendő DNS-szakaszt restrikciós enzimmel kezelik, összekeverés után felmelegítéssel elválasztják egymástól a szálakat, majd visszahűtés után (miután a kétszálú DNS-konformáció helyreállt) ligáz enzimmel összekötik az endonukleáz által elvágott szálat. 5-6 dia

8.2. Gén vagy DNS klónozás A génsebészet olyan in vitro módszereket, technikát foglal magába, mely a génkészlet nagymértékű megváltoztatását, célzott keveredését teszi lehetővé. A genetikai információt az egyik élőlényből (állat, növény, mikroorganizmus) mesterségesen visszük át egy másik organizmusba. A hibrid DNS molekulákat szokás rekombináns DNS-nek nevezni. A klónozás során a klónozandó gént egy vektor (plazmid) segítségével egy mikroorganizmusba juttatják, majd a gént kifejezik. Ilyen módon készül ma az inzulin. Az inzulin génjét egy plazmidba juttatják, a plazmidot baktériumsejtbe, majd a baktériumokat tenyésztik és a gén működését beindítják, és inzulin termelődik. A DNS-klónozás lépései a következők:  A klónozandó gént tartalmazó DNS előállítása A klónozandó gént restrikciós endonukleázok segítségével vágjuk ki a genomból. A gén kivágására ugyanazt a restrikciós enzimet használjuk, amellyel a plazmidot is feltárjuk.  A megfelelő vektor kiválasztása és a vektor hasítása A vektor leggyakrabban plazmid vagy fág. A plazmid egy cirkuláris szerkezetű (nincs szabad vég), kis mólsúlyú DNS, amelynek önreplikációs képessége van. Egy sejtben lehet egyetlen plazmid, de lehet több 100 is. A plazmid akkor válik jól használható vektorrá, ha van replikációs origója, vannak szelekcióra alkalmas un. marker gének rajta (például antibiotikum reziszterncia), és minél többféle restrikciós enzim hasítási hely található rajta, egy enzimhasítási helyből csak egy legyen.  A célgén vektorhoz kötése Ugyanazzal a restrikciós enzimmel hasított klónozandó DNS és plazmid végei tehát komplementerek egymással. Így a klónozandó DNS-t és a plazmidot ligáz enzimmel kezeljük, és megtörténik a célgén inszerciója a vektorba.  A célgén mikroorganizmusba juttatása A plazmidokat ezután a baktáriumsejtbe juttatjuk. A baktériumsejtek membránját fel kell lazítani ahhoz, hogy a kisméretű plazmidok át tudjanak jutni ezen. Membrán fellazítására alkalmazhatunk vegyi eljárást (CaCl2 kezelés) vagy fizikai eljárást (elektroporálás, elektromos impulzus hatására).  A célgént tartalmazó mikroorganizmusok kiválasztása A plazmidot tartalmazó mikroorganizmusokat kiválaszthatjuk a plazmid által tartalmazott marker gének alapján. Ha a marker génünk valamely antibiotikum rezisztencia, akkor antibiotikum tartalmú táptalajon

40

neveljük a baktériumokat. Az antibiotikum tartalmú táptalajon csak azok a baktériumok lesznek képesek növekedni, amelyek tartalmazzák az antibiotikum rezisztenciát tartalmazó plazmidot és így a célgént is.

7-8 dia

8.3. Polimeráz láncreakció A PCR alapja, hogy DNS-polimeráz enzimet használva laboratóriumban, tehát in vitro körülmények közt lehetséges specifikus DNS molekulák sokszorosítása. A PCR eljárás során egy ciklusban három fázist különböztetünk meg. Denaturálás: a kettős szálú DNS szétválasztását biztosítja. Oligonukleotidok bekötődése: szintetikus, rövid DNS oligonukleotidok tapadása (bázispárosodással) a templát szálhoz, amelyek a DNS-polimeráz számára primerként szolgálnak. Lánchosszabítás: a cél DNS szintetizálása aktivált monomerek (dNTP-k) beépítésével.

17. ábra: A PCR első három ciklusának sematikus ábrázolása. (Magyarázat: piros, a többszörözni kívánt célszekvencia; kék, a teljes DNS szekvencia; fekete, primerek; zöld, újonnan szintetizált DNS.)

41

Denaturálás: A DNS replikáció első fázisában a kettőshélixnek szét kell válnia, hogy az egyes szálak templátként tudjanak szolgálni a polimerizáció során. Ez a folyamat a sejten belül enzimatikusan megy végbe, a kettőshélix széttekerésében motorfehérjék, DNS-helikázok vesznek részt. A helikázok ATP felhasználásával a kémiai energiát mechanikai munkává alakítják át, azaz a DNS szálon végighaladva a bázisok közötti H-kötéseket szétbontják. A PCR során a DNS két szálának szétválasztása nem enzimatikusan, hanem termodinamikai úton történik - magas hőmérséklet hatására a bázisokat összetartó hidrogénkötések felszakadnak. A másodlagos kötések széteséséhez szükséges hőmérséklet függ az adott DNS hosszától - minél több bázispárt tartalmaz a polimer, annál magasabb hőfok szükséges a teljes felbomlásához. A PCR első fázisában, a denaturáció során 92-98°C közötti hőmérsékletet használunk. Ez a hőmérséklet tartomány elegendő ahhoz, hogy a DNS templát hosszától (és komplexitásától) függetlenül teljes mértékben szétválasszuk a két szálat. Oligonukleotidok bekötődése: Az PCR második fázisában történik a roved DNS oligonukleotidok templáthoz tapadása. Mivel a denaturációhoz használt magas hőmérséklet megakadályozná a DNS primerek megfelelő helyre való tapadását, ebben a fázisban a hőmérsékletet le kell csökkenteni. A megfelelő tapadáshoz szükséges hőmérséklet függ az adott primerek hosszától és szekvenciájától, tehát a reakció során ennek függvényében állítjuk be a bekötődési hőmérsékletet. A gyakorlatban tapasztalt ideális hőmérséklet tartomány a DNS primerek kötődésére 55-65°C között van. Lánchosszabbítás (extenzió) A DNS lánc szintézise, a polimerizáció vagy lánchosszabbítás (extenzió) a DNS-polimeráz elsődleges feladata. A DNS-polimeráz enzim a templát szálra szintetizált primerekből kiindulva, azok 3’ OHcsoportjára képes a következő dNTP-t a templátnak megfelelően beépíteni. A polimeráz enzimeknek a megfelelő működéséhez optimális hőmérséklet szükséges, ami 70-80°C között van. A módszer mindhárom fázisában fontos a megfelelő időintervallum beállítása (elég idő kell mind a teljes kettős szálú DNS szétnyílásához, mind a primerek megfelelő helyre való letapadáshoz), de főként a polimerizációs fázisban kell odafigyelni, mivel minél hosszabb DNS szakaszt akarunk felerősíteni, annál több időre van szüksége az enzimnek. A PCR reakció összetevői: PCR templát A kívánt célszekvencia felerősítéséhez szükséges templát DNS számos forrásból származhat. A molekuláris biológiai alapkutatás során számtalan célból végezhetünk PCR reakciót, például taxonómiai azonosításhoz. A mikrobiológia ennek a módszernek a segítségével képes különböző forrásból származó mintákban előforduló baktériumokat nagy pontossággal azonosítani. Az orvosi diagnosztikában például a páciensből származó mintákból felerősített PCR termék segítségével lehet megmondani, hogy a fertőzést milyen kórokozó okozhatta (legyen az akár egysejtű eukarióta, akár baktérium, akár vírus). Az igazságügyi orvostanban a DNS-t minta alapján lehet egy apasági perben a biológiai apát, egy bűnügyben pedig az elkövetőt (amennyiben DNS-t tartalmazó biológia mintát hagy hátra a tett színhelyén) azonosítani. DNS polimeráz enzim

42

Magas hőmérsékletet elviselő, röviden hőstabil DNS-polimeráz enzimre van szükség, hiszen a PCR reakció során magas hőmérsékleti értékeket kell kibírjon az enzim. Így a polimeráz enzimet(et) leggyakrabban hőforrásokban élő baktériumokból, mélytengeri, vagy óceánaljzaton élő hipertermofil ősbaktériumokból izolálják. PCR primerek A PCR során történő DNS sokszorosításhoz szintetikus (dezoxi)oligonukleotid primereket használunk. A reakcióhoz egy ún. "forward" (5’-) és egy "reverse" (3’-) primer szükséges. Az első a felerősíteni kívánt DNS szakasz 5’-végén a komplementer szálhoz fog bekötődni, míg az utóbbi az átírandó DNS szakasz 3’végével komplementer. A két oligonukleotid behatárolja tehát a sokszorosítani kívánt szekvenciát. dNTP A reakcióhoz szükséges még mind a négy fajta dezoxiribonukleotid (dNTP), egyenlő arányban. A dNTP-k egyfelől a DNS szintéziséhez szükséges aktivált monomerek, másrészt energiaforrásként szolgálnak a DNS-polimeráz motor funkciójához (a polimeráz végighalad a templáton, tehát nem csak kémiai, hanem mechanikai munkát is végez). Egyéb PCR összetevők Az egyes DNS-polimerázok helyes működéséhez az adott enzimhez optimális puffert kell használni, amit általában a megvásárolt enzimhez adnak. A DNS-polimerázokhoz kapható különböző pufferoldatokban általában Tris-HCl és valamilyen só, például NaCl, KCl található. A DNS-polimerázok helyes működéséhez az enzimnek szüksége van valamilyen kétértékű kationra. A legideálisabb a Mg2+.

43

Felhasznált anyagok Boldogkői Zsolt: Genetika előadás. http://web.med.u-szeged.hu/mdbio/hun/anyagok/20132014/I.felev/smge/2/1.%202.pdf Hartwell, L., H., Hood, L, Goldberg, M.L., Reynolds, A.E., Silver, L.M. Genetics: from genes to genomes, 4th Ed. 2011, McGraw-Hill Publisher. Kovács Mihály: Biokémia alapjai. 10.fejezet. Géntechnológia. http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/biokemia/ch10.html Mara Gyöngyvér: Általános biológia jegyzet. Cermi Kiadó Jászvásár, 2014. Nyitray László: Biokémia alapjai. 19.fejezet. Géntechnológia alapjai. http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/biokemia_alapjai/ch19.html Nyitray László: Biokémia alapjai. 18 fejezet: Génexpressió szabályozása. http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/biokemia_alapjai/ch18.html Pál Gábor: Biokémia alapjai. 15 fejezet: A genetikai kód feltörése. http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/biokemia_alapjai/ch15.html ***http://tudasbazis.sulinet.hu/hu/termeszettudomanyok/biologia/biologia-12evfolyam/genetika/tobb-gen-altal-meghatarozott-tulajdonsagok-oroklodese

44