Česká zemědělská univerzita v Praze Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra genetiky a šlechtění
Genetická diverzita ex situ a in situ genetických zdrojů vybraných léčivých rostlin Disertační práce
Doktorand: Ing. Šárka Vašíčková Školitel: Doc. Dr. Ing. Pavel Vejl Školitel specialista: Ing. Karel Dušek, CSc.
2011
Ráda bych touto cestou poděkovala mému školiteli Doc. Dr. Ing. Pavlu Vejlovi a školiteli specialistovi Ing. Karlu Duškovi, Csc. za rady a tvůrčí myšlenky, které vedly k získání výsledků a vypracování disertační práce. Dále bych chtěla poděkovat kolektivu Katedry genetiky a šlechtění za připomínky, náměty k zamyšlení a praktickou pomoc. Poděkování patří také pracovníkům genové banky při Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v.v.i, Oddělení speciálních a polních plodin v Olomouci za jejich přátelský přístup, cenné informace a získání biologického materiálu. Dále děkuji členům Katedry rostlinné výroby a Katedry pedologie a ochrany půd za pomoc při stanovení obsahu silic u jednotlivých genotypů druhu Thymus pulegioides L. V neposlední řadě bych ráda poděkovala Mgr. Ing. Pavlu Trávníčkovi z Botanického ústavu AV ČR, v.v.i. v Průhonicích za umoţnění analýz vybraných genotypů metodou průtokové cytometrie. Výsledky byly získány s podporou projektu výzkumu a vývoje projektu FRVŠ 2232/06 „Inovace vybavení genetické laboratoře pro výuku předmětů zaměřených na aplikaci molekulární
genetiky
a
biotechnologií
v
zemědělství“;
výzkumného
záměru
MSM6046070901 „Setrvalé zemědělství, kvalita zemědělské produkce, krajinné a přírodní zdroje“ a interního grantu 21190/1312/3135 Molekulární charakteristika a in vitro kultivace rodů Thymus a Plantago.
Obsah 1
Úvod ......................................................................................................................................... 1
2
Literární přehled ....................................................................................................................... 2 2.1
Vybrané rostlinné druhy .................................................................................................... 2
2.1.1
2.1.1.1
Plantago media L. – jitrocel prostřední ............................................................. 3
2.1.1.2
Plantago major L. – jitrocel větší ...................................................................... 4
2.1.1.3
Plantago lanceolata L. – jitrocel kopinatý ........................................................ 5
2.1.2 2.2
Rod Plantago ............................................................................................................. 2
Rod Thymus ............................................................................................................... 8
Polymorfismus a detekce variability ............................................................................... 11
2.2.1
Polyploidie ............................................................................................................... 11
2.2.2
Gynodioecie ............................................................................................................. 14
2.3
Uchování genetických zdrojů .......................................................................................... 15
2.4
In vitro kultivace ............................................................................................................. 16
2.4.1
Mikropagace rostlinného materiálu neboli in vitro klonování ................................ 16
2.4.2
Variabilita regenerovaných rostlin .......................................................................... 17
2.4.3
Fytohormony ........................................................................................................... 19
2.4.3.1
Auxiny.............................................................................................................. 19
2.4.3.2
Cytokininy........................................................................................................ 20
2.4.3.3
Gibereliny ........................................................................................................ 20
2.4.3.4
Ostatní fytohormony ........................................................................................ 21
2.4.4
Kultivační média...................................................................................................... 21
2.4.4.1
Médium ............................................................................................................ 21
2.4.4.2
Cukerná sloţka ................................................................................................. 21
2.4.4.3
Vitamíny a další organické sloučeniny ............................................................ 22
2.4.4.4
Zpevňující nosič ............................................................................................... 22
2.4.5
Efekt vitrifikace ....................................................................................................... 23
2.4.6
Světelný a teplotní reţim kultivace ......................................................................... 24
2.5
Genetické analýzy ........................................................................................................... 25
2.5.1
Výběr vhodných molekulárních markerů ................................................................ 25
2.5.1.1 2.5.2
Vícelokusové analýzy versus jednolokusové ................................................... 25
Charakteristika pouţitých molekulárních metod ..................................................... 26
2.5.2.1
Restrikční štěpení jaderné ribozomální DNA .................................................. 26
Princip štěpení .................................................................................................................... 26 Ribozomální DNA ............................................................................................................. 27 Detekce variability ribozomální DNA ............................................................................... 29 2.5.2.2
Detekce polymorfismů mikrosatelitních lokusů .............................................. 31
2.5.2.3
Struktura a distribuce mikrosatelitních lokusů................................................. 31
Vyuţití mikrosatelitních lokusů v rostlinné biologii.......................................................... 31 Dostupnost mikrosatelitních lokusů ................................................................................... 32 Vznik polymorfismů mikrosatelitních lokusů .................................................................... 32 2.5.2.4
Statistické vyhodnocení variability mikrosatelitních lokusů ........................... 34
2.5.2.5
Moţné problémy při bioinformatickém vyhodnocení dat................................ 35
2.5.2.6
RAPD ............................................................................................................... 37
2.5.2.7
Princip RAPD metody ..................................................................................... 37
2.5.2.8
Statistické vyhodnocení RAPD zón ................................................................. 37
Omezení RAPD analýz ...................................................................................................... 38 Pouţití RAPD metody........................................................................................................ 38 2.6
Chemické analýzy ........................................................................................................... 40
2.6.1
Stanovení sloţení silice u druhu Thymus pulegioides L. ......................................... 40
3
Cíle práce ............................................................................................................................... 44
4
Metodika ................................................................................................................................ 47 4.1
Rostlinný materiál ........................................................................................................... 47
4.1.1
Rod Plantago ........................................................................................................... 47
4.1.1.1 4.1.2 4.2
Popis lokalit ..................................................................................................... 49
Rod Thymus ............................................................................................................. 53
In vitro kultivace ............................................................................................................. 56
4.2.1
Rod Plantago ........................................................................................................... 56
4.2.1.1
Kultivace druhu Plantago lanceolata in vitro.................................................. 56
4.2.1.2
Mikropropagace metodou listových segmentů ................................................ 57
4.2.1.3
Optimalizace média pro regeneraci.................................................................. 58
Statistické vyhodnocení dat ........................................................................................................ 59 4.2.1.4 4.2.2
4.3
Detekce stupně ploidie ..................................................................................... 59
Rod Thymus ............................................................................................................. 61
4.2.2.1
Kultivace v Erlenmayerově baňce ................................................................... 61
4.2.2.2
Kultivace ve skleněných nádobách .................................................................. 61
4.2.2.3
Kultivace ve skleněných zkumavkách ............................................................. 61
Genetické analýzy rodů Thymus a Plantago ................................................................... 62
4.3.1
Izolace DNA, hodnocení kvality a kvantity získané DNA ...................................... 62
4.3.2
Restrikční štěpení ribozomální DNA ...................................................................... 62
4.3.2.1
Charakteristiky regionů .................................................................................... 62
4.3.2.2
Amplifikace a štěpení ...................................................................................... 63
4.3.2.3
Sekvenační analýza ITS regionů ...................................................................... 67
4.3.2.4
Statistické hodnocení ....................................................................................... 68
4.3.3
Analýzy polymorfismů mikrosatelitních sekvencí .................................................. 70
4.3.3.1 Rod Plantago ......................................................................................................... 70 4.3.3.2 Rod Thymus............................................................................................................ 73
4.3.4
4.4
4.3.4.1
Hodnocení genových zdrojů druhu Thymus pulegioides L. ............................. 77
4.3.4.2
Hodnocení genových zdrojů druhu Plantago media........................................ 80
4.3.4.3
Variabilita druhu Plantago lanceolata............................................................. 82
Chemické analýzy ........................................................................................................... 84
4.4.1 5
RAPD analýzy ......................................................................................................... 77
Chemické sloţení silice druhu Thymus pulegioides L. ............................................ 84
Výsledky a jejich diskuze....................................................................................................... 86 5.1 In vitro kultivace ................................................................................................................. 86 5.1.1
5.1.1.1
Kultivace druhu Plantago lanceolata in vitro.................................................. 86
5.1.1.2
Mikropropagace metodou listových segmentů ................................................ 86
5.1.1.3
Optimalizace média pro regeneraci.................................................................. 89
5.1.1.4
Detekce stupně ploidie ..................................................................................... 97
5.1.2
5.2
Rod Plantago ........................................................................................................... 86
Rod Thymus ............................................................................................................. 99
5.1.2.1
Kultivace v Erlenmayerově baňce ................................................................... 99
5.1.2.2
Kultivace ve skleněných nádobách .................................................................. 99
5.1.2.3
Regenerace ve skleněných zkumavkách ........................................................ 100
Genetické analýzy ......................................................................................................... 102
5.2.1 Restrikční štěpení markerů hodnotících variabilitu ribozomální DNA rodů Thymus a Plantago ............................................................................................................................ 102 5.2.1.1
Region ITS ..................................................................................................... 102
5.2.1.2
Region 5S ....................................................................................................... 108
5.2.1.3
Region HM..................................................................................................... 112
5.2.2
5.2.2.1
Rod Plantago ................................................................................................. 117
5.2.2.2
Rod Thymus ................................................................................................... 130
5.2.3
5.3
Mikrosatelitní analýzy ........................................................................................... 117
RAPD analýzy ....................................................................................................... 144
5.2.3.1
Rod Thymus ................................................................................................... 144
5.2.3.2
Rod Plantago ................................................................................................. 147
Chemické analýzy obsahových látek druhu Thymus pulegioides L. ............................. 155 5.3.1.1
Výskyt chemotypů ......................................................................................... 155
5.3.1.2
Variabilita populací ........................................................................................ 157
5.3.1.3
Zastoupení dominantního monoterpenu u jednotlivých chemotypů .............. 158
5.3.1.4
Porovnání chemických a genetických analýz ................................................ 162
6
Závěr .................................................................................................................................... 179
7
Přehled citovaných zdrojů .................................................................................................... 183
8
Přílohy .................................................................................................................................. 211
1 Úvod Uchováváním
selektovaných
genových
zdrojů
přiznáváme
zodpovědnost
za narušování biodiverzity, které je jedním ze zásadních témat současnosti. Výzvou při uchovávání genetických zdrojů je zachování genetické čistoty druhů společně s udrţením variability ekosystémů a populací za adekvátních ekonomicky únosných podmínek. Při uchovávání zástupců populací v polních kolekcích genových bank je brán zřetel na omezené prostorové moţnosti spojené s nutností izolace cizosprašných populací druhů náchylných k hybridizaci. Alternativním řešením můţe být dlouhodobá kultivace v in vitro podmínkách, která zaručuje uchování genetické výbavy jedinců ve stabilní podobě. Tento způsob uchovávání je vhodný zejména pro zachování druhů snadno podléhajících mezidruhové hybridizaci společně s konzervací vícenásobných hybridních genotypů. Mezi rostliny se zmíněnými vlastnostmi patří druhy rodu Thymus. Technikou mikropropagace in vitro lze díky vysokému mnoţitelskému koeficientu při mikropropagaci rychle namnoţit vybrané genotypy a pouţít je při obnově lokalit. U léčivých rostlin, jejichţ význam v posledních letech s rozvojem biotechnologií roste, lze vyuţít mikropropagaci k produkci zástupců s vhodnými vlastnostmi. Rizikem při mnoţení rostlin v in vitro podmínkách je vznik somaklonální variablility, která je z hlediska klonového mnoţení neţádoucí. Hodnocením genetické variability genových zdrojů lze vybrat populace vhodné k uchování a zlepšit tak efektivitu vyuţití prostoru genobank. Genové zdroje léčivých druhů rostlin v České republice spravuje VÚRV, v.v.i. Oddělení zelenin a speciálních plodin v Olomouci. Ve spolupráci s tímto ústavem byly vybrány rody Plantago a Thymus, které jsou zajímavé z hlediska farmaceutického, botanického i genetického, a jejichţ genetická variabilita v udrţovaných kolekcích nebyla doposud posuzována. Zvládnutí technik in vitro kultivace a detekce genetické variability je významné nejen v procesu uchování genových zdrojů, ale rovněţ v oboru šlechtění a biotechnologií. Genetickou variabilitu lze díky neustálému rozvoji molekulární biologie detekovat stále přesněji, avšak všechny metody detekce dědičné proměnlivosti mají svá specifická omezení a zároveň existují oblasti DNA s různou vypovídací hodnotou. Při stanovení variability populace a interpretaci získaných molekulárních dat je potřeba věnovat těmto limitujícím faktorům pozornost.
1
2 Literární přehled 2.1 Vybrané rostlinné druhy Pro hodnocení genetické proměnlivosti uchovávaných genetických zdrojů v porovnání s přirozenými populacemi byly ve spolupráci s genovou bankou v Olomouci vybrány rody Plantago a Thymus, které jsou zajímavé z hlediska farmaceutického, botanického i genetického. Zařazení do systému rostlin uvádí Tabulka 1. Oba rody patří do angiospermických rostlin říše Plantae. Tabulka 1.
Zařazení vybraných rodů dle Kubáta et al. (2002)
Oddělení Třída Řád Čeleď Rod
Magnoliophyta Magnoliopsyda (Dicotyledonae) Plantagineles Plantaginaceae Plantago
Magnoliophyta Magnoliopsyda (Dicotyledonae) Lamiales Lamiaceae Thymus
2.1.1 Rod Plantago Celkem se v tomto rodu vyskytuje asi 250-300 druhů rozšířených po celém světě a k ekonomicky zajímavým druhům patří především asijské druhy Plantago psyllium, P. indica a P. ovata, jejichţ semena se díky vysokému obsahu slizu vyuţívají při onemocnění respiračních orgánů a trávicího traktu (Kuiper a Bos, 1992). V Evropě se zpracovávají listy druhu P. lanceolata při výrobě léků proti kašli. Kromě okrajového vyuţití rostlin jako zelenin a doplňků stravy, byl tento rod objektem lékařských studií. Cytotoxický efekt methanolových výtaţků ze sedmi druhů jitrocelů na třech lidských nádorových liniích (NCI, USA) sledovali Gálvez et al. (2003), kteří potvrdili inhibiční efekt flavonoidů na proliferaci nádorových buněk. V České republice se vyskytuje 9 druhů a mezi druhy s největší četností výskytu patří jeden druh částečně samosprašný (P. major L.) a dva druhy cizosprašné (P. lanceolata L. a P. media L.) (Slavík et al., 2000).
2
2.1.1.1 Plantago media L. – jitrocel prostřední Botanická charakteristika Plantago media je převáţně cizosprašný anemogamní protogynický druh, vyskytující se na půdách s vysokou zásobou vápníku. Je velmi variabilní téměř ve všech znacích, zejména ve tvaru, postavení a velikosti listů. Slavík et al. (2000) u nás rozlišují dva poddruhy, ssp. media – jitrocel prostřední pravý, který má přízemní růţici k zemi přitisklou a klasy 2-6 cm dlouhé a ssp. longifolia (G. F. W. MEYER) WITTE – jitrocel prostřední dlouholistý, jehoţ listy přízemní růţice jsou vystoupavé aţ přímé, mají klasy 6 – 12 cm dlouhé.
© Petr Sedlák, Olomouc 2009
Obrázek 1.
Plantago media ssp. longifolia z polní kolekce genové banky v Olomouci
Poznatky dosavadních genetických analýz Tento druh s karyotypem 2n = 12 je zajímavý z evolučního hlediska, kdy Van Dijk a Van Delden (1990) sledovali variabilitu diploidních a tetraploidních populací a vzájemných kříţenců alozymovou analýzou a došli k závěru, ţe u tohoto druhu dochází k autoploidii. Autopolyploidii potvrdili také Van Dijk a Bakx-Shotman (1997), jejichţ fylogenetická studie naznačuje, ţe tetraploidi vznikli na třech geograficky odlišných místech. Hexaploidní rostliny byly pomocí průtokové cytometrie nalezeny v populacích genových rezerv botanické zahrady Kew Gardens ve Velké Británii (Ishikawa et al., 2009). 3
2.1.1.2 Plantago major L. – jitrocel větší Botanická charakteristika Jitrocel větší patří mezi druhy částečně samosprašné s karyotypem 2n = 12. Van Dijk a Van Delden (1981) stanovili analýzou alozymových lokusů frekvenci cizosprášení na 16,5 %, zatímco Wolff (1990) udává míru cizosprášení mezi 0 a 8 %. Slavík et al. (2000) popisuje na našem území dva poddruhy. Mohutné rostliny často s čepelí na bází srdčitou, 5-9(-11) ţilnou s adaxiální stranou většinou lysou patří do skupiny ssp. major – jitrocel větší pravý. Rostliny drobnější s čepelí na bázi klínovitě zúţenou, 3(-5) ţilnou s adaxiální stranou chlupatou nesou označení ssp. winteri (WIRTGEN) W. LUDWIG – jitrocel větší slaniskový. Řada autorů (Van Dijk, 1984; Wolff, 1997) však u tohoto druhu rozlišuje jiné poddruhy ssp. major a ssp. pleiosperma. Výskyt druhu P. major ssp. major je vázaný na místa narušená disturbancí, např. cesty a pastviny. Poddruh pleiosperma s všeobecně niţším rozšířením se vyskytuje na vlhkých písčitých aţ jílovitých půdách. Slavík et al. (2000) upozorňuje na častou záměnu některých poddruhů P. major s druhem Plantago uliginosa F. W. SCHMIDT jitrocel chudokvětý, od kterého se však zřetelně liší niţším počtem semen v tobolkách.
© Šárka Vašíčková, Praha Suchdol 2010
Obrázek 2.
Plantago major ssp. major v zatravněných plochách v areálu ČZU
4
Poznatky dosavadních genetických analýz Velmi nízkou rozlišovací schopnost poddruhů ssp. major a ssp. pleiosperma prokázala alozymová analýza 27 lokusů a naopak velký rozdíl mezi poddruhy detekovali minisatelitní analýzou a rovněţ štěpením chloroplastové DNA pomocí devíti enzymů Wolff a MorganRichards (1997), kteří rovněţ navrhli RAPD primery pro odlišení těchto poddruhů. Metodou RAPD byla detekována proměnlivost rezistence k ozónu u populací druhů P. major a P. intermedia (Wolff et al., 2000). Pět mikrosatelitních lokusů pro tento druh identifikovali Squirrell a Wolff (2001). 2.1.1.3 Plantago lanceolata L. – jitrocel kopinatý Botanická charakteristika Jitrocel kopinatý je gynodioický cizosprašný druh s karyotypem 2n = 12, u kterého bylo popsáno velké mnoţství variet, z nichţ některé byly hodnoceny i jako subspecie (Slavík et al., 2000). Z nejnápadnějších odchylek je moţno uvést např. rostliny nízkého vzrůstu s úzkými listy a stvolem krátkým, zakončeným krátkým, aţ kulovitým klasem, často celé ještě roztroušeně aţ hustě odstále chlupaté. Tyto typy nacházíme na suchých stanovištích a jsou většinou označovány jako var. sphaerostachya nebo i jako subs. sphaerostachya. Zejména ve vyšších polohách se vyskytují rostliny var. nigricans a var. alpestris s nápadně černě zbarvenými listeny. Černý klas je jiţ z dálky dobře viditelný a někdy jsou tyto variety zaměňovány s P. atrata. Plantago lanceolata var. dubia. (= ssp. lanuginosa) je význačná nápadně vlnatě chlupatými listy, především v dolní části. Nápadně mohutné rostliny, habituálně podobné druhu P. altissima (a s ním velmi často zaměňované), náleţí var. sylvatica. Mezi jednotlivými taxony jsou však přechody, a proto jsou jednotlivé odchylky ponechány jako variety, i kdyţ další studie mohou toto hodnocení změnit.
5
© Pavel Vejl, Vinařická horka 2010
Obrázek 3.
Plantago lanceolata na dně etážového lomu ve Vinařické hoře
Význam z hlediska vyuţití Druh Plantago lanceolata je pro svůj obsah specifických slizů a glykosidů jednou z významných léčivých farmaceuticky vyuţívaných rostlin (Castleman, 2004). Oficiální drogou je dle Českého lékopisu 2009 list jitrocele kopinatého (Plantaginis lanceolatae folium). Jedná se o usušený list a stvol druhu Plantago lanceolata L. a musí obsahovat nejméně 1,5 % celkových derivátů kyseliny ortho-dihydroxyskořicové. Za hlavní účinnou látku je povaţován glykosid aukubin, který má antibiotický a tlumivý účinek na centrální nervovou soustavu (Jirásek a Starý, 1986). Droga je uţívána při nemocech dýchacích cest jako mírné expektorans a mucilaginosum (Traxl, 1992). Sliz jitrocele se skládá ze směsi arabogalaktanů, galaktanů a polygalakturonů obsahujících rhamnózu, arabinózu a galaktózu. Další vyuţití má při zánětech sliznice ústní dutiny. V lidovém léčitelství se vyuţívá baktericidního působení při hojení ran a povrchových zánětech pokoţky (Castleman, 2004). Jitrocel kopinatý patří v České republice mezi tradiční léčivé rostliny pěstované na malých plochách. Rozsah jeho pěstování je určován především poptávkou farmaceutických firem. Údaje o pěstovaných léčivých, aromatických a kořeninových rostlinách jsou zveřejňovány Českým statistickým úřadem. Tyto údaje jsou však nedostatečné pro vytvoření situačních a výhledových zpráv u ekonomicky méně významných druhů. Mendelova univerzita v Brně se pokusila upřesnit plochy pěstovaných léčivých rostlin. Podle šetření u semenářských firem, které se zabývají prodejem osiva, byly odhadnuty pěstitelské plochy nad rámec údajů ČSÚ. Výsledek šetření, který byl zveřejněn ve výhledové
6
a situační zprávě Ministerstva zemědělství pro Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny v roce 2008 je uveden v Tabulce 2. Tabulka 2. Prodané osivo a osetá plocha jitrocele kopinatého v ČR v letech 2003 – 2007
2003/2004 [g] [ha] 712700 47,51
2004/2005 [g] [ha] 84875 5,66
2005/2006 [g] [ha] 2255 0,15
2006/2007 [g] [ha] 26515 1,77
Ve šlechtitelské stanici v Libochovicích byly Traxlem vyšlechtěny dvě odrůdy jitrocele kopinatého, odrůda ´Svatojánský´, registrovaná v roce 1952 a odrůda ´Libor´, registrovaná v roce 1988 (Traxl, 1992). V současnosti je ve Státní odrůdové knize uvedena pouze odrůda ´Libor´, která vznikala individáláním výběrem potomků osmi rostlin odrůdy Svatojánský, které byly kolchicinovány na počátku šlechtění v roce 1968 (Šašecí a Traxl, 1987). Genotypy byly vybírány s ohledem na větší listovou plochou. Odrůda ´Libor´ je tetraploidní a udrţovateli jsou AGROGEN spol. s r.o. a SEVA - FLORA s. r.o. Poznatky dosavadních genetických analýz Pro druh Plantago lanceolata L. vyvinuli 5 mikrosatelitních markerů Hale a Wolff (2003), kteří porovnávali variabilitu populací z USA a Velké Británie. Variabilitu tří mikrosatelitních lokusů přirozené populace z kladenska v ČR hodnotili Čílová et al. (2009). Potomky kříţení lučního a pastvinného ekotypu zkoumal alozymovou analýzou Wolff (1991b). Metodu RAPD pro stanovení genetických podobností jednotlivých rostlin pouţili Vašíčková et al. (2009a), kteří stanovili vnitrodruhovou variabilitu na základě Diceho podobnostních koeficientů pouţitím 4 RAPD primerů na 59,29 %. Poznatky dosavadních in vitro kultivací Obsah glykosidů in vitro rostoucích kalusů a rostlin regenerovaných z listových segmentů zkoumali Budzianowska et al. (2004), kteří nalezené glykosidy klasifikovali do devíti skupin, z nichţ tzv. lancetosidy byly v přírodě detekovány poprvé. Sloţením glykosidů transformovaných a netransformovaných kultur jitrocele kopinatého se zabývali Fons et al. (1999). Regenerací prýtů z hypokotylů a kotyledonů při pouţití odlišných koncentrací BAP a IBA se zabývali Khawar et al. (2005).
7
2.1.2 Rod Thymus Rod Thymus je z hlediska počtu druhů osmým nejvýznamnějším rodem čeledi Lamiaceae a taxonomicky se řadí do podčeledi Nepetoideae, tribu Mentheae (Vernet et al., 1986). Zahrnuje přes 200 druhů, které jsou hojně rozšířeny především na starém kontinentě a po pobřeţí Grónska (Morales, 1997). Předpokládaným místem vzniku je Středozemí, kde se jiţ od počátku třetihor začalo vymezovat 8 následujících sekcí: Micantes, Mastichina, Piperella, Teucrioides, Pseudothymbra, Thymus, Hyphodromi a Serpyllum (Stahl-Biskup a Sáez, 2002). Sekce Serpyllum je skupinou nejstarší, zahrnuje 124 druhů, je nejvíce variabilní z hlediska počtu chromozomů a zahrnuje rovněţ většinu druhů vyskytujících se na území České republiky. Na našem území jsou hojně zastoupeny zejména druhy Thymus vulgaris L. (tymián obecný), Thymus pulegioides L. (mateřídouška vejčitá), Thymus alpestris Tausch ex A. J. Kerner (mateřídouška alpinská), Thymus serpyllum L. emend. Miller (mateřídouška úzkolistá) a Thymus praecox Opiz. (mateřídouška časná) (Dostál, 1989).
© Šárka Vašíčková, Olomouc 2009
Obrázek 4.
Polní kolekce rodu Thymus v genobance v Olomouci
Botanická charakteristika Mateřídoušky jsou rostliny gynodioické, alogamní, entomogamní (Slavík et al., 2000). Středoevropské druhy rodu Thymus jsou si značně morfologicky podobné. Vzhledem k tomu, ţe v přírodě dochází ke spontánnímu kříţení mezi druhy a anatomické rozlišovací znaky jsou i v rámci druhů velice variabilní, taxonomie rodu je obtíţná. Čáp (1979) zmiňuje, ţe v oblastech, kde se stýkají dva nebo více druhů mateřídoušek, dochází velmi často ke kříţení
8
a rozpoznávání hybridů ztěţuje jejich fertilita a zpětné kříţení. Hlavní rozpoznávací znaky druhů jsou shrnuty v Tabulce 3. Význam z hlediska vyuţití Druhy rodu Thymus patří díky obsahu silic mezi léčivé rostliny (Echeverrigaray et al., 2001; Smolik et al., 2009) s antimikrobiálními účinky (Dorman a Deans, 2000). Dle Českého Lékopisu 2009 se povaţuje za drogu usušená kvetoucí nať druhu Thymus serpyllum L. emend. Miller (Serpylli herba) nebo usušené celé listy a květy druhu Thymus vulgaris L. oddělené od stonku (Thymi herba). Mateřídouška patří mezi sběrové drogy a vykupují se všechny druhy u nás volně rostoucí, nikoli pouze druh Thymus serpyllum L. emend. Miller (Mikešová, 2011, pers. comm.). Z dalších látek droga obsahuje zejména apigenin, luteolin, flavonoidy, triterpeny, sacharidy a bifenyly (Bruneton, 1999).
9
Tabulka 3.
Hlavní rozpoznávací znaky rodu Thymus (Čáp, 1979)
Holotrichní odění Goniotrichní odění Alelotrichní odění Kamtodromní ţilnatina Brachydromní ţilnatina Pseudobrachydrnomní ţ. Sympodiální větvení Monopodiální větvení Hlávkovité květenství Rozpadavé květenství Ploidie (2n)
T. serpyllum
T. pulegioides
(m. úzkolistá)
(m. vejčitá)
x
x vzácně
x x x
T. pannonicus T. praecox T. glabrescens (m. panonská)
(m. časná)
(m. olysalá)
x
x
x
T. alpestris
T. pulcherrimus ssp. sudeticus
(m. alpínská)
(m. ozdobná sudetská)
(x) x x
x
x
x x
x x
x
x
x x 24
x 28
x 56
10
x x 28, 54
x
x
x x
28, 56
28
30
2.2 Polymorfismus a detekce variability Jedinci téhoţ pohlaví a téhoţ stáří se v rámci populace liší v celé řadě kvantitativních a kvalitativních znaků. Část tohoto polymorfismu je nedědičné povahy, která vzniká jako odpověď jedince na vlivy vnějšího prostředí. Proměnlivost genetického rázu vzniká při segregaci alel do gamet v průběhu meióze a rekombinováním alel v důsledku crossing-overu (McClintock, 1984). Studiem rozmnoţovacího systému rodů Thymus a Plantago ve spojení s detekcí variability se zabývala řada autorů (Van Damme a Van Delden, 1982; Gouyon et al., 1986; Manicacci et al., 1998; Landergott et al., 2006). Sekvenční změny DNA způsobují také mutace, které se v různých částech genomu u různých organismů probíhají odlišnou rychlostí (Bear et al., 2007a). Vhodnými metodami pro zachycení sekvenčních změn je restrikční štěpení PCR fragmentů a sekvenování (Metzker, 2010; Belhassen et al., 1993; Ishikawa et al., 2009). Z pohledu evoluce má na variabilitu populace kromě mutací vliv také přirozený výběr, selekční tlak, genetický drift, genetický draft a genový tok (Flegr, 2006).
2.2.1 Polyploidie Změna počtu chromozomů v buňce je jedním z nejdůleţitějších zdrojů proměnlivosti organismů v evolučním procesu a široce se vyuţívá ve šlechtění rostlin (Kováč, 1995). Polyploidie vznikající v důsledku zmnoţení celých chromozomových sad bez následného rozdělení buněčného jádra byla nalezena u vyšších rostlin ve vysokém stupni a je převáţně ireverzibilního charakteru (Lewis, 1980). Odhady míry výskytu polyploidie u rostlin se liší v závislosti na definici základního čísla chromozomů daného druhu (x), avšak předpokládá se, ţe 70 % druhů krytosemenných rostlin prošlo během své evoluce minimálně jednou polyploidizací (Levin, 2002). Dalším předpokladem je, ţe se polyploidie podílí u 2 – 4 % krytosemenných rostlin na speciaci druhů (Otto a Whitton, 2000). Polyploidie se vyskytuje ve dvou základních formách. Při alloploidii dochází ke zmnoţení dvou a více rozdílných chromozomových sad (kaţdá z nich pochází od jiného, nejčastěji příbuzného druhu) a právě ta má velký význam při divergenci druhů. Můţe při ní docházet k překonání bariéry mezidruhového kříţení, protoţe v meióze dochází k párování homologních chromozomů a vznikají funkční gamety s fertilním potomstvem. Zároveň vznikem nového polyploidního druhu dochází k vytvoření nové reprodukční bariéry (Flegr, 2006). Nový tetraploidní druh se volně nekříţí s původním diploidním druhem, neboť 11
by vznikali sterilní triploidní potomci. Silná reprodukční bariéra souvisí s defektním endospermem u triploidních hybridů (Kuiper a Bos, 1992). Při alloploidii dochází k disomické dědičnosti, kdy je segregace podobná rozchodu nehomologních párů chromozomů u diploidů (Landergott et al., 2006). Alloploidie byla v přirozených populacích vyhodnocena jako převládající nad autoploidií (Levin, 2002), k jejímuţ vzniku dochází zdvojením chromozomové sady individua v rámci jednoho druhu. Autopolyploidi formují při meióze místo bivalentů multivalenty a dochází k náhodné segregaci jednotlivých homologních chromosomů i sesterských chromatid. Výsledkem je vznik nesouměrných gamet a sníţení fertility potomstva (Gottschalk, 1976). Polysomickou dědičnost u tetraploidního druhu T. praecox analýzou mikrosatelitních lokusů studovali Landergott et al. (2006). Výskyt alloploidie v rodě Plantago potvrdili sekvenční analýzou jaderného genu SUC1 Ishikawa et al. (2009) a autopolyploidizace tetraploidních populací P. media nalezených v Holandsku byla potvrzena Van Dijkem et al. (1992). Polyploidní rostliny jsou za určitých ekologických, klimatických a geografických podmínek zvýhodněny ve srovnání s diploidními. Patrně i díky tomu, ţe od kaţdého genu mohou mít více variant, bývají odolnější vůči nepříznivým vlivům a jsou schopni přeţít na místech s extrémními podmínkami (Flegr, 2006). U polyploidních populací Arabidopsis thaliana L. byla kromě větší ekologické adaptability, pozorována také pozdější a delší doba kvetení související s duplikací genů FLC potlačující kvetení (Michaelsa a Amasinoa, 1999). Dalšími pozorovanými vlastnostmi polyploidů jsou sníţená intenzita dýchání, vyšší obsah vody, minerálních látek (El-Morsy et al., 2009), enzymů a celkové zvětšení rostlinných orgánů (Masterson, 1994). Důvodem je sníţení vlivu recesivních alel v nadbytečném počtu genů (Comai, 2005) a zvýšení heterozygotnosti nejen jednotlivých lokusů, ale celého genomu (Udall a Wendel, 2006). Miller a Venable (2000) u 20 druhů z 12 rodů zjistili, ţe by vznik polyploidů mohl souviset se vznikem dvoudomosti. Při vzniku polyploidie dochází ke kombinaci cizosprášení se samosprášením, coţ přináší důsledky v podobě příbuzenského kříţení. V populacích takových druhů vznikne zřejmě intenzivní tlak na odstranění neţádoucího vlivu inbreedingu, aţ dojde právě k oddělení pohlaví (Mihulka, 2001). Schopnost samosprášení jako důsledek polyploidizace přináší výhody i nevýhody, kdy na jedné straně je zvyšována adaptabilita populace na dané lokalitě, ale na druhé straně se sniţuje genetická variabilita postupnou homozygotizací (Soltis a Soltis, 2000).
12
Nevýhody polyploidie shrnuje Comai (2005) a patří mezi ně problémy spojené s komplikovanou replikací velkého genomu a nutností regulace exprese nadbytečné genetické informace, sloţitá meióza a mitóza, častější ztráty chromozomů či sterilní potomstvo. Pro detekci ploidie se v posledních letech stala nedílnou součástí celé řady biologických disciplín metoda průtokové cytometrie. Pomocí ní je moţné nejen třídit buňky, ale i například jednotlivé chromosomy, stanovit obsah DNA či RNA v jedné buňce nebo sledovat průběh buněčného cyklu (Doleţel et al., 2007). Obsah jaderné DNA v G1 fázi buněčného cyklu, které lze detekovat nastavením cytometru, je odrazem její ploidní urovně. Pro správné stanovení ploidie je nezbytné pouţívat standardy (materiál se známým počtem chromozómů nebo určenou velikostí genomu) a na základě poměru intenzity fluorescence zkoumaného materiálu a standardu můţeme usuzovat na vlastnosti neznámého objektu (Suda, 2005).
13
2.2.2 Gynodioecie Společný výskyt samičích rostlin s hermafroditními jedinci v populaci je jev známý u přibliţně 7,5 % evropských krytosemenných rostlinných druhů (Richards, 1997). Tento smíšený rozmnoţovací systém přináší efektivní kombinaci jedinců zajišťujících rostoucí genetickou variabilitu v podobě samičích rostlin (označované MS – male sterile) s jedinci schopnými udrţovat výskyt osvědčených linií v podobě samosprašných hermafroditních rostlin (H). Gynodioecie spojuje moţnost regulace heterozygotnosti s adaptabilitou k odlišným podmínkám prostředí (Gouyon a Vernet, 1982). U většiny gynodioických druhů je vznik pohlaví jedince řízen kombinací mitochondriálních genů zapříčiňujících samčí sterilitu (CMS) s jadernými geny pro obnovení samčí fertility (Ehlers et al., 2005). Dominantní gen CMS blokuje rozvoj funkčních prašníků. Hermafroditi mají tento gen v recesivní podobě nebo mají v jádře alespoň jednu dominantní alelu genu Rf (restorer of fertility), která samčí funkce znovu obnoví (Budar a Pelletier, 2001). Belhassen et al. (1991) referují o moţném výskytu velkého mnoţství dominantních a recesivních genů obnovujících fertilitu v epistatických vztazích u druhu T. vulgaris. Gynodioecie byla u druhu Thymus vulgaris podrobněji sledována jiţ v letech 1978, kdy byla potvrzena odlišná míra výskytu MS a H rostlin v závislosti na stanovišti (Dommée et al., 1978). V nestálých podmínkách (pastviny a stará pole) je podíl MS rostlin vysoký, zatímco na stabilnějších stanovištích, např. kamenných ochozech, je četnost MS rostlin mnohem niţší, čímţ se zvyšuje podíl autogamie. Hermafroditní rostliny tvoří menší počet semen niţší kvality. Gouyon et al. (1986) popsal souvislosti výskytu převládajícího počtu hermafroditních rostlin s výskytem fenolových chemotypů, zatímco u populací s vysokým výskytem samičích rostlin převládají ostatní ne-fenolické typy, tj. linaloolový, thujanolový a α-terpineolový. Dále se výskytem gynodioecie u třech druhů rodu Thymus zabývali Manicacci et al. (1998), kteří stanovili závislost výskytu samičích rostlin (MS) nejen na lokalitě, ale také druhu. Průměrný výskyt MS rostlin byl stanoven u druhu Thymus zygis na 51 %, T. mastichina na 72 % a T. vulgaris na 63 %. U rodu Plantago se gynodioecie vyskytuje u druhů P. lanceolata, P. cornopus a P. maritima (Kuiper a Bos, 1992). U druhu Plantago lanceolata byl u odlišných populací výskyt samičích rostlin nalezen v rozmezí 1 – 25 % (Van Damme a Van Delden, 1982).
14
2.3 Uchování genetických zdrojů Česká republika přiznala odpovědnost za vlastní genetické zdroje v roce 1994, podpisem Konvence o biologické diverzitě v rámci enviromentálního programu OSN, podle které se ochrana biodiverzity uskutečňuje na dvou úrovních – in situ a ex situ. Za ochranu genetických zdrojů ex situ, kterou má zabezpečit Národní program konzervace a využití genofondu rostlin (číslo E – 79/01 – 3160 - 0200, MZe ČR) jsou u nás zodpovědné genové banky. V oblasti léčivých, aromatických a kořeninových rostlin se touto činností zabývá Oddělení zelenin a speciálních plodin Olomouc, které je součástí Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i., v Praze - Ruzyni (Dušek et al., 2005). Způsoby uchování ex situ v genových bankách shrnul Dotlačil (1998), který zmiňuje metody uchovávání vysušených semen, ultralehkých semen, kryoprezervace, kultivace rostlin v polních genových bankách, metody zpomaleného růstu in vitro a konzervaci pylu. Při uchovávání genetických zdrojů v polních kolekcích je určitý stupeň genetické změny nevyhnutelný, neboť ke sniţování genetické variability dochází jiţ samotným výběrem rostlin při převádění do prostor genobank. Na odlišný vliv čtyř evolučních faktorů ovlivňujících variabilitu populací – mutace, selekce, migrace a náhodný genetický drift – v závislosti na velikosti populace upozorňuje Barrett et al. (1991). Uchovávání populací v polních kolekcích je náročnější prostorově i ekonomicky u druhů cizosprašných, opylovaných hmyzem (Richards, 2001). Na problematiku sniţování variability při ex situ konzervaci a genový tok při nedostatečné prostorové izolaci upozorňují Heywood a Iriondo (2003). Slavík et al. (2000) uvádí, ţe k přenosu pylu u druhů rodu Plantago dochází pomocí větru a větrosnubný způsob opylení se všeobecně předpokládal také u druhu Plantago lanceolata, ale pokus Stellmana (1978) prokázal hmyzosnubný přenos pylu. Tok pylu (0,2 – 1,5 m) a semen (0,08 – 0,51 m) u druhu P. lanceolata sledovali Kuiper a Bos (1992), kteří měřili proud vzduchu na pastvinách a loukách v umělých tunelech. Komplikovanému rozmnoţovacímu systému gynodioického druhu T. vulgaris se věnovali Tarayre et al. (1997), kteří detekovali čtrnáctkrát větší genový tok pro pyl neţ semena. Uchovávání léčivých rostlin in vitro poskytující spolehlivou bariéru kříţení je vhodné v rámci zachování charakteru vysoce heterozygotních jedinců vytrvalých rostlin (Cousins a Adelberg, 2007). Při převádění do in vitro kultur můţe rovněţ docházet k poklesu genetické variability selekcí, neboť růst a vývoj rostlin v in vitro podmínkách je ovlivněn především genotypem (Novák, 1990; Pramanik a Raychaudhuri, 1997; Sestras et al., 2007).
15
2.4 In vitro kultivace Metody kultivace in vitro mají v zemědělství celou řadu vyuţití jako například ozdravování rostlinného materiálu napadeného virózami, vznik nových odrůd mutačním šlechtěním (Radin a Carlson, 1978), vznik hybridů fúzí protoplastů (Krishnamurthi, 1976) a šlechtění rezistentních odrůd (Jansky, 2000). Velmi vyuţívanou technikou in vitro je mikropropagace, která umoţňuje vzhledem k vysokým koeficientům mnoţení zkrátit šlechtitelský cyklus a rychle namnoţit nově vyšlechtěné odrůdy (Kováč, 1995) či rychle namnoţit vybrané genotypy k produkci metabolitů. Mnoţení indukcí mnohočetných prýtů (metodu “multishoot”) pouţili při záchraně ohroţených populací jitrocelů – P. algarbiensis a P. almogravensis v jiţním Portugalsku Gonçalves et al. (2009), kdy segmentací stonku dojde k regeneraci adventivních pupenů a z jednoho segmentu vznikalo aţ 9 nových výhonů. Klonové mnoţení materiálu má své opodstatnění u komplexních hybridů s vysokým stupněm heterozygotnosti a u rostlin s problematickým navozením generativního stádia růstu tj. některých polyploidů, vzdálených hybridů, sterilních linií, mutantů a podobně (Novák, 1990). Pro kultivaci léčivých rostlin in vitro jsou pouţívány zejména in vitro postupy pro uchování genových zdrojů (Cousins a Adelberg, 2007) a mikropropagaci druhů s vysokým obsahem bioaktivních látek (Rout et al., 2000). Vyuţití in vitro kultivace léčivých rostlin, které v posledních letech roste s rozvojem biotechnologií, shrnují Tripathi a Tripathi (2003).
2.4.1 Mikropagace rostlinného materiálu neboli in vitro klonování Klonové mnoţení materiálů in vitro se vyuţívá k získání velkého počtu geneticky identických jedinců z částí rostlin, tzv. explantátů. První definice pochází od Bauera (1939): „Za explantát je povaţován kaţdý fragment ţivého pletiva, celý orgán nebo komplex orgánů, který je vytrţený z korelačních vztahů k celku a je pěstován v umělých podmínkách“. V závislosti na druhu explantátu se pouţívá dvou základních technik in vitro mnoţení s odlišnou genetickou stabilitou. Jedná se o regeneraci rostlin z kultivovaných meristémů a diferenciaci rostlin de novo procesem somatické embryogeneze či organogeneze (Pierik, 1997). Za geneticky stabilní integrovaný systém, ve kterém probíhá přísná kontrola syntézy DNA a mitózy, se povaţují meristematické buňky apikálního meristému s jedním aţ dvěma páry listových primordií. Frekvence mutací u rostlin odvozených z meristémové kultury nepřevyšuje frekvenci mutací v klonovém potomstvu vzniklém při mnoţení tradičním způsobem vegetativního klonování (Novák 1990). 16
Při regeneraci rostlin cestou somatické embryogeneze (SE) se jako primární explantát pouţívá plně diferencovaný bipolární zárodek obsahující kořenový a stonkový meristém či nezralé embryo do fáze diferenciace děloh. Stabilita genotypu je zachována při přímé SE tj. bez fáze kalusu. S určitým rizikem vzniku genetické variability je moţné mnoţit rostlinný materiál cestou somatické embryogeneze v kalusových, protoplastových nebo suspenzních kulturách (Chaturvedi et al., 2007). Při organogenezi dochází k indukci regenerace adventivních pupenů z unipolární struktury. Tento proces můţe být rovněţ přímý či probíhat přes fázi kalusu (nepřímá organogeneze). Při nepřímé organogenezi vzniká nová rostlina z několika buněk (i o různém karyologickém stavu) a existuje zde moţnost vzniku chimér a mixoploidních pletiv (SeguíSimarro a Nuez, 2006). Tento způsob regenerace zcela nezabezpečuje genetickou identitu regenerovaných rostlin. Při nepřímé somatické embryogenezi a organogenezi se vyuţívá totipotence rostlinné somatické buňky, tj. schopnosti regenerovat z jediné buňky nesoucí kompletní genetickou informaci v celistvou rostlinu (Mitalipov a Wolf, 2009). Tato specifická vlastnost rostlinné buňky
je
provázena
schopností
přechodu
diferenciovaných
buněk
a
pletiv
do nediferencovaného stavu, charakterizovaného intenzivním buněčným dělením s následnou cytodiferenciací a regenerací orgánů, resp. celých rostlin. Díky schopnosti vytvářet závalové nediferencované pletivo - kalus a z jeho kompetentních buněk regenerovat, lze k mnoţení in vitro pouţít segmentaci orgánů, které běţně k mnoţení neslouţí – listy, kořeny, stonky. Mikropropagaci metodou listových segmentů se u jitrocele kopinatého zabývali Budzianowska et al. (2004). Mikropropagací druhů rodu Thymus metodou “multishoot” se zabývali Sáez et al. (1994), Shetty et al. (1996a, 1996b), Mendes a Romano (1999), Fraternale et al. (2003), a Daneshvar–Royandezagh et al. (2009).
2.4.2 Variabilita regenerovaných rostlin Fenotypové odchylky vznikající u rostlin po kultivaci in vitro pozorovali Larkin a Scowcroft (1981), kteří pro variabilitu u rostlin regenerovaných in vitro a jejich potomstev navrhli termín somaklonální variabilita. Pod tímto pojmem dnes rozumíme jakékoli cytologické abnormality, časté fenotypové změny kvalitativních a kvantitativních znaků, ale také změny sekvencí, aktivaci genů a genové utichání (Kaeppler et al., 2000). Cytogenetické změny, ke kterým dochází při kultivaci in vitro, jsou z hlediska klonového mnoţení neţádoucí. Pro šlechtění kulturních rostlin však představují potencionální nekonvenční nástroj indukce genetické variability a záměrné selekce (Baer et al., 2007b) 17
např. pro získání lepší nutriční kvality zásobních bílkovin nebo rezistence vůči chorobám, herbicidům a stresovým faktorům prostředí. Příčinou genetických změn můţe být preexistence odchylek ve výchozím materiálu či stresová reakce při kultivaci. Výskyt změn ploidie, přestavby chromozomů a změn v sekvenci DNA je spojený s přechodem pletiv z diferencovaného do dediferencovaného stavu a opětné regenerace jedné buňky či shluku v intaktní rostlinu. Vznik heterogenní populace buněk se nejčastěji popisuje procesem endomitózy (Punnett, 1953) a endoreduplikace (Joubés a Chevalier, 2000).
Zatímco endoreduplikace
je charakterizována
několikanásobným
opakováním S-fáze bez fáze mitotické a jejím důsledkem je vznik polyténních chromozomů, při endomitóze dochází ke zmnoţení sádky chromozomů a jejich rozdělení uvnitř jaderné membrány a vznikají tak polyploidní jádra. Rozdíl je patrný z Obrázku 5. K polyploidizaci dochází buď endomitózou, při které vznikají polyploidi nebo endopolyploidií, kdy nedochází k rozdělení v centromeře.
Obrázek 5.
Endopolyploidie a endomitóza dle Comai (2005)
Nárůst obsahu DNA (4C, 8C, 16C) v závislosti na stoupajícím počtu pasáţí kalusů u druhu Plantago ovata potvrdili Pramanik a Raychaudhuri (1997). Tuto variabilitu počtu chromozomů u regenerovaných rostlin získaných nepřímou embryogenezí a organogenezí lze detekovat barvením a počítáním chromozomů (Johnson et al., 1987; Hang a Bretziger, 1993; González et al., 1996), metodami RAPD a RFLP (Olhoft a Phillips, 1999) či dnes nejvíce pouţívanou metodou průtokovou cytometrií. Tato metoda je zaloţená na moţnosti zaznamenávání intenzity fluorescence jednotlivých částic či buněk v proudu tekutiny (Saphiro, 2003). Pro zjištění ploidie a obsahu DNA zájmových rodů této disertační práce vyuţili průtokovou cytometrii Mewes et al. (2008), Makowczyńska et al. (2008) a Mahdavi a Karimzadeh (2010). 18
2.4.3 Fytohormony Exogenní faktory kultivačního prostředí, především kombinace růstových regulátorů, souvisí s kompetencí buněk reagovat na auxinové a cytokininové signály. Uběhlo přes půl století od doby, kdy Skoog a Miller (1957) navrhli schéma, podle kterého vysoký poměr koncentrací cytokininu k auxinu stimuluje diferenciaci pupenů, zatímco opačný poměr je příznivý pro iniciaci kořenů. Díky rozvoji molekulárních metod a technologií jsou dnes známy principy regulace exprese genů souvisejících s přechodem kompetentní buňky k determinaci podle sloţky růstového média. Schopnost buňky reagovat závisí na řízení down-regulovaných genů především pro peroxidázy a proteiny asociované s membránami (chloroplastovou, mitochondriální, ER, Golgiho aparátem) a na regulaci přepisování genů pro transkripční faktory (Che et al., 2006). Yokoyama et al. (2007) popsali transdukci cytokininového signálu na molekulární úrovni u druhu Arabidopsis thaliana. Princip působení auxinů a spouštění procesů navozujících organogenezi přes uvolnění represe auxin-responsivních genů popisují Benjamins a Scheres (2008). Vlivem auxinů, cytokininů a giberelinů na kalogenezi a indukci růstu nadzemních částí a kořenů u experimentálních kultur různých druhů rodu Plantago se zabývala řada autorů (Dijkstra a Kuiper, 1989; Mederos et al., 1997; Makowczynska a AndrzejewskaGolec, 2003). In vitro kultivací léčivého druhu Thymus serpyllum L. emend. Miller se doposud nikdo nezabýval. Saéz et al. (1994) se zabývali mikropropagací druhu T. piperella, Shetty et al. (1996a) pouţili druh T. vulgaris a Mendes a Romano (1999) stejně jako Fraternale et al. (2003) kultivovali druh Thymus mastichina. 2.4.3.1 Auxiny Auxin je nejdéle známým rostlinným hormonem. F. W. Went roku 1928 izoloval z koleoptilního vrcholu látku, která difundovala do agaru a stimulovala růst (Šebánek et al., 1983). Jediným známým přirozeným auxinem byla kyselina indolyl-3-octová (IAA), kterou identifikovali Kögl et al. (1933). Díky zavedení nových citlivých analytických metod byly však v rostlinách nalezeny kyselina indolyl-3-máselná (IBA), 4-chlor IAA a kyselina fenyloctová (PAA), které byly dříve povaţovány za látky syntetické (Říha, 2003). Hlavní fyziologické účinky auxinů shrnul Hess (1983). Jedná se zejména o stimulaci prodluţovacího růstu a s ním související regulaci tropismů, stimulaci tvorby kořenů, regulaci 19
apikální dominance, stimulaci dělení buněk, inhibici opadu listů a plodů a regulaci aktivity enzymů. Mezi auxiny pouţívané v tkáňových kulturách patří především IAA, IBA, 2,4-D a NAA. Přítomnost auxinů v kultivačním médiu je nutná pro indukci kalusu. V tomto směru působí téměř univerzálně 2,4-D, která vyvolává tvorbu kalusu i u druhů či explantátů, u kterých jsou ostatní růstové regulátory neúčinné (Minocha, 1987). 2.4.3.2 Cytokininy Objev cytokininů jako samostatné skupiny rostlinných hormonů vyznačujících se stimulačním působením na buněčné dělení vycházel z poznatků Gotlieba Haberlandta, který zjistil, ţe z floému difundují látky indukující meristemizaci parenchymatického pletiva bramborových hlíz (Procházka et al., 1998). Později byl systematickým testováním různých biologických materiálů vytipován bohatý zdroj cytokininu (autoklávovaná DNA rybího spermatu), ze kterého byla profesory Skoogem a Strongem izolována a identifikována látka 6furfurylaminopurin, nazvaná kinetin (Miller et al., 1956). První rostlinný přirozený cytokinin byl identifikován v nezralém endospermu kukuřice a nazván zeatin (Letham a Palni, 1983). Mimo stimulace buněčného dělení mají cytokininy mnoho dalších biologických účinků. Důleţité jsou například stimulace větvení stonků a odnoţování rostlin při potlačení apikální dominance, zpomalení stárnutí rostlinných pletiv a orgánů, stimulace diferenciace plastidů a zvýšení rezistence rostlin vůči extrémním podmínkám prostředí. Cytokininy však na tyto procesy nepůsobí samy, ale v interakci, respektive kooperaci s dalšími fytohormony (Procházka et al., 1998). V kulturách in vitro se nejčastěji pouţívá spolu s kinetinem a zeatinem BAP (Benett et al., 1994). 2.4.3.3 Gibereliny Většina explantátů giberelin pro svůj růst v médiu nevyţaduje, ale v některých případech lze aplikací giberelinu stimulovat dlouţivý růst explantátu, případně zrušit endogenní dormanci semen. Z dostupných giberelinů je v explantátových kulturách vyuţíván především kyselina giberelová GA3, poprvé objevená v rýţových plantáţích v Japonsku v roce 1935 jako vedlejší metabolický produkt patogenní houby Gibberella fujikuroi (Borrow et al., 2006). GA3 můţe být do média přidávána pro stimulaci růstu buněčných kultur, ke stimulaci růstu kalusu nebo stimulaci růstu zakrslých rostlin. K tomu, aby se projevil stimulační účinek giberelinu, je však 20
nutná přítomnost auxinu ať jiţ nativního v rostlinném explantátu nebo exogenního v ţivném médiu (Kováč, 1995). 2.4.3.4 Ostatní fytohormony Mezi další látky označované za růstové fytohormony patří ethylén, kyselina abscisová (ABA), brassinosteroidy a kyselina jasmonová (Procházka et al., 1998). Jejich pouţitím pro kultivaci a mikropropagaci rodů Thymus a Plantago se doposud nikdo nezabýval.
2.4.4 Kultivační média Součástí ţivného média jsou organické a anorganické látky poskytující výţivu a další vhodné podmínky organismům nebo jejich částem kultivovaných in vitro a inertní zpevňující nosič. 2.4.4.1 Médium Základem média je voda a v ní rozpuštěné minerální ţiviny (mikro- a makroprvky) v přijatelné formě. V závislosti na účelu kultivace se běţně pouţívají média, která popsali Murashige a Skoog (1962) (MS), White (1963), Gamborg et al. (1968) (B5) a Schenk a Hildebrandt (1972) (SH). Pro kultivaci tkáňových kultur se nejčastěji pouţívá MS médium, které bylo vyvinuto z Whiteova média a původně slouţilo pro kultivaci tabákových kalusů (Murashige a Skoog, 1962). Pro kultivaci druhů rodu Plantago pouţili MS médium např. Fons et al. (1999), Budzianowska et al. (2004), Khawar et al. (2005), a Gonçalves et al. (2009). Také pro kultivaci druhů rodu Thymus pouţila řada autorů MS médium (Fraternale et al., 2003; Daneshvar-Royandezagh et al., 2009; Ozudogru et al., 2011), zatímco Sáez et al. (1994) a Mendes a Romano (1999) pouţili modifikované MS médium se sníţeným obsahem amonného kationtu, přibliţně poloviční koncentrací KNO3, MgSO4 a FeNaEDTA. 2.4.4.2 Cukerná sloţka Rostlinné explantáty nejsou schopny účinně fotosyntetizovat a mají blokovány některé další důleţité anabolické funkce. Jako zdroj energie pro metabolické procesy bývá zpravidla pouţívána sacharóza, glukóza, fruktóza nebo jiné cukry, např. manitol (Šebánek et al., 1991). Vliv odlišných cukrů (sacharózy, glukózy, fruktózy a škrobu) v koncentracích 1 - 9 % při in vitro kultivaci pšenice a řepky sledovali Voráčková et al. (1998), kteří zaznamenali lepší růst in vitro kultur u obou druhů v médiu se sacharózou. 21
Sacharózu při in vitro kultivaci rodu Plantago pouţívají autoři ve variabilních mnoţstvích od 2 g.l-1 (Gonçalves et al., 2009) aţ po 30 g.l-1 (Mederos a Méndez, 1991). Glukózu o koncentraci 50 g.l-1 aplikovali Mederos et al. (1997). Při mikropropagaci druhů rodu Thymus pouţili sacharózu o koncentraci 20 g.l-1 Saéz (1994) a Fraternale (2003) a 30 g.l-1 pouţil Ozudogru et al. (2011). 2.4.4.3 Vitamíny a další organické sloučeniny Vitamíny jsou pro rostlinu nezbytné jako katalyzátory řady metabolických procesů, proto mohou být pro rostlinné buňky a pletiva kultivovaná in vitro limitujícím faktorem jejich růstu. Mezi vitamíny a další organické sloučeniny obvykle uţívané v ţivných médiích patří thiamin, kyselina nikotinová, pyridoxin a cukerný alkohol myo-inositol (Murashige a Skoog, 1962; Schenk a Hildebrandt, 1972). 2.4.4.4 Zpevňující nosič Součástí kultivačního média bývá rovněţ inertní ztuţující sloţka pouţívaná k upevnění explantátu v médiu. Mezi běţně pouţívané zpevňující látky patří agar, phytagel (gerlite) a isubgol (Babbar a Jain, 1998). Nejvíce rozšířené je pouţití polysacharidu agar, který pro rod Plantago pouţili Fons et al. (1999) a Gonçalves et al. (2009) v koncentraci 10 g.l-1 a Mederos et al. (1997) v koncentraci 8 g.l-1. Poslední zmíněnou koncentraci aplikovali také Fraternale et al. (2003) při mikropropagaci druhu Thymus mastichina. Agar se skládá z agarózy a agaropektinu, a přestoţe obě sloţky vychází z galaktózy, agaropektin obsahuje vedlejší kyselé skupiny jako je síran nebo pyruvát (Phillips a Williams, 2000). Komerčně se získává z červených mořských řas z pobřeţí východní Asie a Kalifornie. Alternativou
agaru
můţe
být
polysacharid
phytagel
produkovaný
bakterií
Sphingomonas elodea, který se skládá z D-glukózy, L-rhamnózy a D-glukuronové kyseliny. Pouţívá se zejména pro kultivaci termofilních bakterií, neboť vydrţí teplotu 120 °C. Phytagel má měkčí konzistenci a předpokládá se tudíţ, ţe difundování ţivin je jednodušší, stejně tak jako prorůstání nových rostlinných struktur. Pro dosaţení shodného tuhnoucího efektu se pouţívá poloviční mnoţství phytagelu oproti agaru, phytagel rychleji tuhne. Optimální pH a koncentrace ztuţující látky je druhově
specifické a záleţí na účelu kultivace
(Ebrahim a Ibrahim, 2000). Phytagel pouţili pro kultivaci rodu T. vulgaris a T. longicaulis v mnoţství 3 g.l-1 Ozudogru et al. (2011), kteří tak docílili polotekutého skupenství MS média. 22
2.4.5 Efekt vitrifikace Rostliny kultivované in vitro mohou vykazovat abnormální růst projevující se ztloustlými stonky i listy sklovitého vzhledu. Vitrifikované rostliny mají omezenou cévní soustavu, obsahují mnoho vakuol, nemají vyvinutý palisádový parenchym a velké mezibuněčné prostory jsou naplněné vodou (Pierik, 1997). V důsledku těchto změn má rostlina nefunkční průduchy, defektní kutikulu a pletiva, stává se velmi křehkou, jakákoli další manipulace s ní je velice obtíţná a rostliny po převedení na nová média často zasychají (Ziv, 1991). Kataeva et al. (1991) pozorovali vitrifikaci při vysoké vzdušné vlhkosti v kultivačních nádobách a při kultivaci na médiích s přídavkem BA. Gribble et al. (2003) provedli experiment, při kterém dokázali, ţe změna struktury rostlin je indukována nasyceným vzdušným prostředím.
© Šárka Vašíčková, Praha Suchdol 2010
Obrázek 6.
Vitrifikovaná rostlina druhu Thymus serpyllum L. emend. Miller
Při kultivaci rostlin čeledi Lamiaceae zaznamenala tento jev řada autorů (Shetty et al., 1996a; Toma et al., 2004; Uchendu a Reed, 2008). Shetty et al. (1996a) dokázali eliminovat efekt vitrifikace pouţitím bakterií rodu Pseudomonas sp. při in vitro mnoţení druhu Origanum vulgare. Kmen bakterií produkoval glykosid mukoid, který na sebe vázal přebytečnou vodu z pletiv a oregáno tak bylo moţné bezproblémově mnoţit. Sníţení hyperhydricity při in vitro kultivaci druhu Helianthus annuus L. dosáhli Mayor et al. (2003) přídavkem dusičnanu stříbrného. Souvislost vitrifikace s obsahem cytokininů v médiu při kultivaci artyčoku popisuje Debergh (2006), který navýšením koncentrace agaru omezil dostupnost kinetinu v médiu. Vztah mezi koncentrací různých cytokininů a amonného iontu v souvislosti s indukcí hyperhydricity zkoumali Ivanova a Van Staden (2008), kteří prokázali 23
vznik vitrifikace při vysoké koncentraci NH4+ a cytokininů v médiu. Větší výskyt hyperhydricity při in vitro kultivaci výhonů Pyrus pyrifolia byl prokázán při pouţití TDZ (1fenyl-3-(1,2,3-thiadiazol močovina) a CPPU N-(2-chlor-4-pyridyl)-N9-fenylmočovina) neţ u explantátů na médiích s BAP a kinetinem (Kadota a Niimi, 2003). Pierik (1997) zmiňuje rovněţ způsob kultivace, resp. světelný a teplotní reţim jako faktor ovlivňující výskyt vitrifikovaných pletiv a vliv spodního chlazení na zmenšený výskyt hyperhydricity při různých koncentracích agaru zaznamenali při mikropropagaci karafiátu Saher et al. (2005). Vitrifikované pupeny a výhonky regenerující z organogenních kalusů pozorovali u druhu Plantago camtschatica Link. na MS médiu s 2,685 μM IAA a 0,888 μM BAP Makowczynska a Andrzejewska-Golec (2008). K zabránění tohoto neţádoucího stavu při kultivaci druhu P. ovata doporučují Barna a Wakhlu (1988) pouţít ½ MS médium. Eliminovat hyperhydricitu pomocí bakterií Pseudomonas ssp. při hledání a in vitro mnoţení klonů druhu Thymus vulgaris s vysokým obsahem polyfenolických látek se podařilo týmu Kalidase Shettyho (Shetty et al., 1996a). Tento způsob kultivace byl úspěšně aplikován také při kultivaci jiných léčivých rostlin z čeledě Lamiaceae (Shetty et al. 1996b; Eguchi et al., 1996; Al-Amier et al., 1999; Skała a Wysokińska, 2004).
2.4.6 Světelný a teplotní reţim kultivace Světlo a teplota jsou esenciální faktory ovlivňující biochemické a fyziologické procesy v rostlině. Vyšší optimální teploty pro růst tkáňových kultur neţ u rostlin neporušených pozoroval De Capite (1955), který provedl experiment s tkáňovými kulturami třech botanických druhů - Helianthus annuus, Parthenocissus tricuspidata a Daucus carota. Světelné a teplotní podmínky kultivace je potřeba zvolit s ohledem na účel kultivace a druh explantátu. Obvykle se pouţívá působení teplotní periody 25 °C ve dne a 15 °C během noci, při které se zvyšuje regenerační kapacita explantátů (Šebánek et al., 1991). Běţná fotoperioda je 16 h den a 8 h noc. Teplotu 25 °C a 16 h fotoperiodu pro kultivaci rodu Plantago pouţili Budzianowska et al., (2004), Saker a Kawashity (1998) a Mederos a Méndez (1991). Autoři uvádí variabilní hodnoty míry osvětlení, které se liší v závislosti na druhu a poţadovaném procesu. Pro rod Thymus byla pouţita teplota v rozmezí od 24 °C (Daneshvar-Royandezagh et al., 2009) do 27 °C (Fraternale et al., 2003) a ozářenost se pohybovala v rozmezí od 40 µmol.m-2.s-1 (Sáez et al., 1994) do 65 µmol.m-2.s-1 (Fraternale et al., 2003). Všichni autoři pouţili fotoperiodu 16 h světlo / 8 h tma. 24
2.5 Genetické analýzy 2.5.1 Výběr vhodných molekulárních markerů Genetické markery jsou jednoduše dědičné vlastnosti s odlišitelnými úrovněmi pro kaţdého jedince. Typický zástupce diploidního organismu můţe mít dvě úrovně (alely) v kaţdém lokusu. Genetických markerů existuje velké mnoţství a v kombinaci s jednotlivými metodami mají různé informační hodnoty (Semagn et al., 2006). Výběr vhodných genetických analýz je rozhodující pro úspěšnou aplikaci molekulární genetiky a závisí především na účelu analýzy, na typu analyzované DNA a na moţnostech zpracování výstupů z odlišných genetických analýz. Sunnucks (2000) popisuje tři úrovně molekulárních změn, které poskytují informaci o odlišných úrovních populační biologie. První jsou hodnocení genotypická, běţně zastoupená vícelokusovým hodnocením jedince. U pohlavně se rozmnoţujících druhů se tato seskupení v kaţdé generaci populace mění, a proto má pouţití těchto markerů uplatnění při hodnocení procesů jako např. identifikace jednotlivce, rodičovství a vnitrodruhová variabilita. Na druhé úrovni mohou mikrosatelity, mtDNA a jiné jednolokusové markery také analyzovat jednotlivé geny s jistou frekvencí a geografickou distribucí. Frekvence alel a haplotypů jsou populační charakteristiky, které mohou být ovlivněny genetickým driftem, efektem zakladatele populace, genovým tokem a selekcí. Tyto markery jsou efektivní pro hodnocení genetického toku a zachycení historie populace. Třetí moţná molekulární změna, tentokrát pomalejší, je tvorba nových alel procesem mutace. Analýza evolučních vztahů je informativní pro dlouho trvající procesy fylogeografie, speciace a hlubší taxonomické fylogenetické procesy. Tyto analýzy se týkají sekvencí mtDNA nebo jaderné DNA, které se vyvíjejí na základě míry mutací selekce (Sunnucks, 2000). 2.5.1.1 Vícelokusové analýzy versus jednolokusové Vícelokusové analýzy jsou vhodné pro genetické mapování a analýzu kvantitativních znaků. Vícelokusové DNA analýzy (RAPD, AFLP) jsou relativně technicky nenáročné, ale mají celou řadu nedostatků. Nejvíce limitující je reprodukovatelnost výsledků. Vzhledem k citlivosti těchto metod na kvalitu a kvantitu DNA, koncentraci jednotlivých sloţek PCR reakce a typ termocykleru, lze tyto výsledky prezentovat pouze jako relativní, kdy porovnáváme komplexní dvojice vzorů (Wolff et al., 1993). Mezi další nevýhody patří skutečnost, ţe fragmenty stejné délky nemusí být sekvenčně identické a to zejména 25
pro polyploidní druhy (Semagn et al., 2006). Posledním omezujícím faktorem těchto analýz je dominantní dědičnost, kdy je DNA fragment hodnocen jen jako přítomný/nepřítomný naproti kodominantní dědičnosti, kde je identifikována kaţdá ze dvou alel lokusu jedince. Vícelokusové markery mají menší vypovídací hodnotu neţ jednolokusové multialelické markery, nicméně velmi efektivně mohou být vyuţity při studiu haploidních kultur (Ennos, 2001) a určování vnitrodruhové a mezidruhové variability (Flegr, 2005; Vašíčková et al., 2009a). Výhody a nevýhody tří metod pouţívaných k detekci genetické variability jsou shrnuty v Tabulce 4 dle Jarne a Lagoda (1996). Tabulka 4.
Výhody a nevýhody odlišných genetických metod
Vlastnosti Kodominance Selekční neutralita Ontogenetická závislost Počet detekovatelných lokusů Počet analyzovaných alel v lokusu Informace o struktuře a mutacích
Alozymy Ano Nevěrohodná Ano 10 - 50 1-5 Pochybná
RAPD Ne Ano Ne 10 - 100 2 Pochybná
Mikrosatelity Ano Ano Ne 5 - 20 5 - 20 Dostupná
2.5.2 Charakteristika pouţitých molekulárních metod 2.5.2.1 Restrikční štěpení jaderné ribozomální DNA Princip štěpení K zachycení rozdílů sekvence DNA mezi jedinci či druhy se dnes běţně vyuţívá sekvenování (Metzker, 2010), ale odlišnosti v posloupnosti nukleotidů je rovněţ moţné detekovat restrikčními endonukleázami (Dhar et al., 2006). Tyto bakteriální enzymy chránící bakterie před napadením virem jsou schopné štěpit DNA ve specifické sekvenci - restrikčním místě (Kessler a Manta, 1990). Detailně bylo studováno přes 3000 endonukleáz a více neţ 600 z nich je komerčně dostupných (Roberts et al., 2007). Jakmile dojde v daném motivu k nukleotidové záměně, není restrikční místo enzymem rozpoznáno a ke štěpení molekuly DNA nedojde. Délkový polymorfismus štěpených fragmentů je zachycen při elektroforetické separaci.
26
Ribozomální DNA Ribozomální RNA společně s ribozomálními proteiny tvoří strukturu velké a malé podjednotky ribozomů. Geny pro tuto RNA jsou kódovány v oblasti organizátoru jadérka (Gustafson et al., 1988), ale byla nalezena i další místa výskytu (centromery a telomery) variabilní u jedinců v délce opakování i lokalizaci na chromozomech (Andronico et al., 1985). Geny pro rRNA se tandemově opakují, řádově ve stovkách aţ tisících kopií a tento velký počet kopií je zodpovědný za intenzivní PCR amplifikaci (Brandstätter et al., 2003). S odlišnou délkou jednotlivých ribozomálních RNA, regiony mezi nimi a počtem proteinů podílejících se na stavbě ribozomů, souvisí celková velikost ribozomálních podjednotek. Nejvíce patrné rozdíly mezi prokaryoty a eukaryoty uvádí Tabulka 5. Tabulka 5.
Velikosti podjednotek ribozómů dle Cammack et al. (2006) Ribozomální RNA - ribozomální podjednotky Prokaryota (70S) Velká (50S) 5S, 23S Malá (30S) 16S Eukaryota (80S) Velká (60S) 5S, 5.8S, 25 - 28S Malá (40S) 17 - 18S
Prudký nárůst vzniku fylogenetických studií zaloţených na analýzách rDNA v devadesátých letech 20. století, o kterém referují např. Hwang a Kim (1999), byl zapříčiněn zejména sekvenční konzervovaností těchto oblastí, která umoţnila pouţití univerzálních markerů pro analýzy široké škály organismů. Konzervativní sekvence 18S-, 5,8S- a 28S rRNA se pouţívají jako místa annealingu primerů a variabilní sekvence ITS1 a ITS2, NTS1 a NTS2 k detekci polymorfismů na úrovni rodové i druhové (Baldwin, 1992). Zatímco kódující regiony jsou druhově konzervativní, NTS prokazují mezidruhovou i vnitrodruhovou variabilitu (Dhar et al., 2006). Grafické znázornění přepisovaných a nepřepisovaných regionů (NTS) je uvedeno na Obrázku 7.
27
Tandemově se opakující jednotka DNA kódující ribozomální RNA se skládá z přepisované transkripční jednotky 18S-5,8S-28S, která obsahuje dva vnitřní přepisované regiony – ITS1 a ITS2. Transkribován je také 5S úsek DNA, který je obklopen vnitřními nepřepisovanými regiony NTS1 a NTS2. Obrázek byl vytvořen na základě návrhu dvou autorů - Baldwin (1992) a Sahin et al. (2007).
Obrázek 7.
Konzervativní a variabilní sekvence ribozomální DNA
Nepřepisované regiony (non transcribed spacery) NTS1 a NTS2, bývají také označovány IGS1 a IGS2, intergenic spacer regions, neboli regiony mezi geny. Sekundární strukturu 5S ribozomální RNA, která je konzervativní součástí velké podjednotky ribozomu popsali Barciszewska et al. (2001). Kódující úsek 5S DNA je dlouhý asi 120 bp a hlavní funkcí 5S RNA je stabilizace ribozomu. Proměnlivost velikosti úseku 5S rDNA u sedmi druhů rodu Thymus sledovali Smolik et al. (2009). Do evolučních souvislostí zapojili analýzu konzervativních kódujících úseků ribozomální DNA Hillis a Dixton (1991), kteří zjistili, ţe sekvence jaderné DNA pro malou podjednotku ribozomu (18S) jsou vhodné pro objasnění rozdílů vzniklých v prekambriu. Rozdíly v sekvenci pro jadernou DNA velké podjednotky detekují prvohorní a druhohorní rozdíly a sekvence obou podjednotek organel (mitochondriích a chloroplastech) jsou vhodné pro detekci rozdílů vzniklých v kenozoiku. Rozdíly v délce a sloţení proměnlivých ITS regionů i konzervatismus 5,8S rRNA u různých organismů potvrzuje Tabulka 6, kterou vytvořili Nazar et al. (1987). Poměr nukleotidů G/C hraje důleţitou roli v sekundární struktuře přepisovaných RNA, kdy vodíkové můstky stabilizují jednovláknové molekuly a vznikají tzv. stem-loop struktury, které mohou rovněţ slouţit jako rozlišovací znaky jednotlivých organismů (Venkateswarlu a Nazar, 1991). Průměrný obsah CG párů ITS regionů se u různých druhů jitrocelů pohybuje v rozmezí 51,5 – 56,5 % a velikost 5,8S rRNA je 165 bp (Dhar et al., 2006).
28
Tabulka 6.
Porovnání délky a složení rRNA odlišných organismů dle Nazar et al. (1987)
Organismus Thermomyces lanuginosus Saccharomyces carlbergensis Saccharomyces pombe Xenopus leavis Mespilia globulus Mus musculus Rattus rattus
ITS1 Délka C+G (bp) (%) 208 65,4 355 36,1 419 19,3 557 84,2 368 70,9 999 70,4 1066 74,7
5,8S rRNA Délka C+G (bp) (%) 157 47,5 158 46,2 158 44,9 162 59,9 159 59,7 156 59,0 156 57,7
ITS2 Délka C+G (bp) (%) 170 68,2 234 38,9 300 21,0 262 88,2 338 74,6 1089 74,7 764 79,7
Detekce variability ribozomální DNA Alvarez a Wendel (2003) definují řadu výhod i úskalí při detekci variability rDNA. Upozorňují na nutnost nezahrnovat paralogní geny vzniklé genovou duplikací či homeologní geny vzniklé polyploidizací, ale ortologní geny vzniklé společným vývojem spřaţenou evolucí (concreted evolution). Při spřaţené evoluci ovšem dochází na základě nerovnoměrného crossing-overu a genové konverze k homogenizaci sekvencí tandemově se opakujících genů, a proto doporučují Ishikawa et al. (2009) k fylogenetickým studiím pouţívat geny, které jedinec získá od kaţdého rodiče v jedné kopii. Zavádějící výsledky mohou vznikat také působením pseudogenů v různém stupni inaktivace a působením homoplazie, jejíţ výskyt je prokazatelně vyšší u ITS regionů neţ u jiných sekvencí DNA (Andreasen et al., 1999). Na pomalejší míru evoluce u genů s velkým počtem kopií (cpDNA a rDNA), v porovnání s větší detekovatelnou variabilitou a vypovídací hodnotou genů s nízkým počtem opakování, při vyhodnocování příbuzenských vztahů upozorňují Small et al. (2004). Restrikční štěpení jaderné DNA pro ribozomální RNA není při genetických studiích rodů Thymus a Plantago vyuţíváno ve vysoké míře. Délkový polymorfismus 5S regionu štěpeného dvěma enzymy a 45S (18S-5,8S-25S) regionu štěpeného třemi enzymy v kombinaci s metodou Southern blotting pro 7 druhů rodu Plantago provedli Dhar et al. (2006). Tento indicko-americký tým rovněţ pomocí metody FISH lokalizoval geny pro 5S a 45S RNA na chromozomech u sedmi druhů jitrocele. Druhy P. lanceolata a P. major mají společně s druhem P. arenaria obě genové rodiny na dvou chromozomech, zatímco u zbývajících druhů (P. ovata, P. lagopus, P. rugelii a P. rhodosperma) se vţdy alespoň jedna rodina vyskytuje pouze v jedné kopii (Dhar et al., 2006). Další analýzy ribozomální DNA byly provedeny na základě porovnání sekvencí. 29
Na základě fylogenetické studie 57 druhů nalezli Rønsted et al. (2002) čtyři podrody Psyllium, Coronopus, Plantago a Littorella. Druhy P. major a P. media byly analýzou ITS regionů rDNA a chloroplastové trnL-F sekvence zařazeny do subg. Plantago, zatímco druh P. lanceolata do podrodu Psyllium. Divergence těchto podrodů pravděpodobně proběhla před 5,47 miliony let, coţ upřesnilo hrubý odhad Millera (1981), který na základě analýzy pylu stanovil rozšíření tohoto rodu na dobu před 5-11 miliony let. Odlišnosti sekvencí ITS regionů pouţili Sahin et al. (2007) k identifikaci původu sušené jitrocelové natě prodávané jako oficiální drogu na japonském a čínském trhu.
30
2.5.2.2 Detekce polymorfismů mikrosatelitních lokusů 2.5.2.3 Struktura a distribuce mikrosatelitních lokusů Mikrosatelitní DNA jsou krátké (1-5 bp), uniformě se opakující motivy nukleotidů v počtu několika desítek aţ tisíců párů bází (Litt a Luty, 1989). Také mohou být označovány jako STRs - short tandem repeats – krátké tandemové repetice, (Edwards et al., 1991), SSR simple sequence repeats – repetice jednoduchých sekvencí, (Tautz, 1989), nebo společně s minisatelitními DNA jako VNTRs - variable number of tandem repeats, (Buschiazzo a Gemmell, 2006). Mikrosatelity se vyskytují ve všech eukaryotních genomech i v genomech prokaryot (Field a Wills, 1996; Tóth et al., 2000). Ačkoliv se mikrosatelity vyskytují v genomu nejrůznějších organismů a zdá se, ţe repetitivní sekvence získaly časem určitou funkci, která přispívá k jejich udrţení v genomu, jejich biologická funkce je stále nejasná (Schmidt a Heslop-Harrison, 1996; Li et al., 2002). Nejvíce se mikrosatelitní sekvence vyskytují v nekódujících oblastech, jako jsou telomery a centromery (Metzgar et al., 2000), ale lze je nalézt také v intronech, kde mají většinou dinukleotidovou podobu. U rostlin se nejčastěji vyskytuje dinukleotidový motiv (AT)n a trinukleotidový motiv (TAT)n (Morgante a Olivieri, 1993). Tetranukleotidy nalézáme spíše v oblasti centromer (Chistiakov et al., 2005). Podstatně méně mikrosatelitních motivů bylo nalezeno i v kódující oblasti DNA (exonech), kde však trinukleotidy a hexanukleotidy neporušují čtecí rámec (Tóth et al., 2000). Vyuţití mikrosatelitních lokusů v rostlinné biologii Pouţívání mikrosatelitních markerů v posledních pěti letech prudce vzrostlo zejména díky snadné a rychlé detekci metodou PCR. Oblasti přilehlé k mikrosatelitům (tzv. flanking regions) jsou obvykle unikátní a pouţívají se jako dva oligonukleotidové primery, které ohraničují mikrosatelitní lokus (Morgante a Olivieri, 1993). Díky rovnoměrnému zastoupení repetitivních oblastí v celém genomu (Jakše et al., 2002), vysokému stupni polymorfismu (Amos a Pemberton, 1992) a kodominanci nalézají mikrosatelitní markery své uplatnění při studiu populačně-genetických parametrů. Tyto markery jsou schopné mapovat tok genů a jeho bariéry, efektivní velikost populace, variabilitu populací v rámci odchylek od Hardy-Weinbergovy rovnováhy (Berglund et al., 2006; Dunbar-Co a Wieczorek, 2011) nebo příbuzenské vztahy a paternitu (Landergott et al., 2006).
31
Dostupnost mikrosatelitních lokusů Mikrosatelitní markery lze získat prohledáváním genomových knihoven (Tautz, 1989) obsaţených v různých databázích (např. EMBL nebo GenBank), které obsahují především sekvence modelových organismů a kulturních plodin. U druhů, které doposud nebyly sekvenovány, lze markery získat de novo testováním hybridizace s oligonukleotidovou sondou a následnou sekvencí, ale jedná se o finančně i časově náročný proces. Často se proto ověřují sekvence primerů pro blízce příbuzné druhy z jiţ publikovaných prací. Jedenáct dinukleotidových mikrosatelitních markerů pro druh P. cornopus popsali Koorevaar et al. (2002). Pět polymorfních lokusů pro kaţdý z druhů P. major a P. intermedia detekovali Squirrell a Wolff (2001) a další čtyři pro P. intermedia a tři pro druh P. major detekovali Wolff et al. (2009). Pět mikrosatelitních markerů pro druh P. lanceolata uvádí Hale a Wolff (2003) a šest markerů pro druh P. martima publikovali Nilsson et al. (2006). Landergott
et
al.
(2006)
detekovali
šest
polymorfních
mikrosatelitních
lokusů
u tetraploidního druhu Thymus praecox agg. Pro zjišťování příbuzenských vztahů u 7 druhů rodu Thymus pouţili Smolik et al. (2009) sedm minisatelitních markerů. Vznik polymorfismů mikrosatelitních lokusů Polymorfismus mikrosatelitních lokusů je dán zejména rozdílem v počtu opakování základního motivu (Litt a Luty, 1989; Weber a May, 1989; Tautz, 1989). Vysoký stupeň polymorfismu je způsobený vysokou mutační rychlostí tandemově se opakujících úseků DNA, která je 10-2 - 10-6 na lokus a generaci (Sia et al., 2000), coţ je o dva aţ tři řády větší neţ bývá u alozymů (Jarne a Lagoda, 1996) a ostatních markerů (Ennos, 2001). Existují dvě základní hypotézy vzniku mutací. První mechanizmus popisují např. Streisinger et al. (1966) a Levinson a Gutman (1987) a jedná se o sklouznutí DNA polymerázy při replikaci (Polymerase slippage) znázorněné na Obrázku 8. Pokud DNA polymeráza replikuje oblast mikrosatelitní repetice, DNA řetězce po denaturaci mohou dosednout na komplementární řetězec s posunem o jednu nebo několik jednotek repetice. Důsledkem toho bude nově vzniklé vlákno DNA buď delší nebo kratší neţ vlákno templátu. Tento posun však vede pouze k malým změnám v počtu opakování jednotlivých sekvencí (Schlötterer a Tautz, 1992).
32
Původní DNA molekula je složena z 5 opakování jednoho motivu (rámečky). Sklouznutím pak vznikají dvě nové alely o délce 6 a 4 repeticí. Délka nově vzniklých repeticí závisí na vlákně, na kterém došlo k chybě polymerázy (převzato z Goldsteind a Schlötterer, 1999).
Obrázek 8. Druhá
Sklouznutí DNA polymerázy při replikaci hypotéza
vzniku
mutačního
mechanizmu
se
týká
rekombinace
mezi molekulami DNA (Smith, 1976; Jeffreys et al., 1994). Tato rekombinace probíhá buď nerovnoměrným crossing-overem nebo genovou konverzí. Nerovnoměrný crossing-over probíhá mezi homologními chromozomy při meiotickém dělení, nebo mezi sesterskými chromatidami v případech, kdy chromatidy nevytvoří správný synaptonemální komplex. Zejména u dlouhých, tandemově se opakujících sekvencí má rekombinační mechanismus problém určit správné místo rozdělení vlákna. Při crossing overu se vymění pouze část úseku jednoho chromozomu a zbývající část alely se nerekombinuje. Takto dochází k delecím na jednom vlákně a inzercím na vlákně druhém (Smith, 1976; Dover, 1982). Při genové konverzi dojde ke změně pouze jedné molekuly DNA. Rozdíl vzniku rekombinovaných molekul DNA je graficky znázorněn na Obrázku 9.
33
U crossing-overu dochází ke změně na obou homologních úsecích, u genové konverze se změna odehrává pouze na jednom vlákně DNA (převzato z creationwiki.org/Genetic_recombination).
Obrázek 9.
Rozdíl mezi genovou konverzí a crossing overem
2.5.2.4 Statistické vyhodnocení variability mikrosatelitních lokusů Pro zpracování genetických podobností alelických kombinací mikrosatelitních lokusů lze pouţít program TFPGA (Tools For Population Genetic Analyse) ver.1.3. (Miller, 1997) a Cervus 3.0. (Kalinowski et al., 2007). Oba programy poskytují informace o počtu alel v jednotlivých lokusech, stanoví jejich frekvence pro jednotlivé populace a lze vypočítat získanou a očekávanou heterozygotnost. Výhodou programu TFPGA je, ţe dokáţe zpracovat kladogramy na principu koeficientu genetické vzdálenosti dle Rogers (1972) metodou UPGMA. Výhodou tohoto algoritmu je, ţe získaná data jsou hodnocena z pohledu kodominantních mikrosatelitních markerů charakterizujících vţdy danou konkrétní populaci – botanický druh. Metoda UPGMA definuje vzdálenost mezi skupinami jako průměr vzdáleností mezi všemi páry operačních taxonomických jednotek (OTU) ve dvou skupinách. Ve fenetice nemusí být OTU vytvářena druhy stejné vývojové linie, ale druhy, které mají mezi sebou určitý stupeň fenotypové podobnosti (Flegr, 2005). Program Cervus 3.0 poskytuje kompletní statistické charakteristiky, mezi které patří pravděpodobnost výskytu nulové alely či výpočet hodnoty polymorfního informačního obsahu (PIC). Polymorfní informační obsah (PIC) je charakteristika pouţívaná především pro stanovení vypovídací hodnoty markeru pouţívaného ve vazebných analýzách, neboť uţitečnost genetických markerů pro vazebné analýzy závisí na tom, jak často se marker 34
vyskytuje v polymorfní podobě (Buchanan a Thue, 1998). Hodnoty PIC jsou zpravidla o něco menší neţ hodnoty heterozygotnosti, pokud se hodnotí dostatek nepříbuzných jedinců. PIC bere v úvahu počet alel v lokusu a frekvenci těchto alel. V důsledku toho je moţné mít mnoho alel v lokusu a malé hodnoty PIC pokud jedna nebo dvě alely dominují. V poslední době se však tato hodnota pouţívá obecně pro určení rozsahu polymorfismu markeru v daných lokusech (Grisolia et al., 2007) a čím větší hodnoty PIC jednotlivé markery nabudou, tím jsou pro detekci polymorfismu vhodnější. Pro hodnocení míry výskytu příbuzenského kříţení v populaci lze pouţít koeficient panmixie f, který se vypočte podle následujícího vzorce (Loeschcke et al., 1994).
Pokud jsou hodnoty f < 0, lze o rozmnoţovacím systému populace konstatovat, ţe není zatíţen inbreedingem. V případě, ţe jsou si heterozygotnost očekávaná (He) a získaná (Ho) rovny (f = 0), dochází v populaci k náhodnému rozmnoţování. Hodnoty f > 1 poukazují na přítomnost inbredního kříţení v populaci. 2.5.2.5 Moţné problémy při bioinformatickém vyhodnocení dat Míra sdílení molekulárně biologických znaků u dvou druhů přímo odráţí míru vzájemné příbuznosti daných druhů (Flegr, 2005). Značnou komplikaci pro vyuţívání molekulárně-taxonomických technik ve fylogenetických studiích představují homoplazie (Angers et al., 2000; Estoup et al., 2002) a výskyt nulových alel (Dakin a Avise, 2004). Homoplazie Pojem homoplazie je pouţívaný evolucionisty k popsání skutečnosti, ţe znak přítomný u dvou druhů není odvozen od stejného znaku u společných předků (Estoup et al., 2002). Za identické dle původu jsou povaţovány alely, které pochází od společných předků bez působení mutací. Přesto existují identické alely ve smyslu stejně dlouhé nebo se stejnou sekvencí, aniţ by byly identické dle původu (Angers et al., 2000). Jedná se buď o nezávislý vývin podobných homologických znaků v několika příbuzných fyletických liniích (paralelizmus), nebo o skutečnou konvergenci, tj. výskyt identického znaku u vzájemně nepříbuzných organismů (Kolibáč, 1996). Pro fylogenetiky je homoplazie neţádoucí, zatímco pro behaviorální ekologii je výskyt znaků podobného charakteru za stejných podmínek okolního prostředí zásadní pro závěry o adaptaci (Rendall a Di Fiore, 2007). 35
Nulové alely Nulové alely jsou alely, které neposkytují amplikon po PCR reakci. Dakin a Avise (2004) shrnují tři příčiny vzniku nulových alel. Příčinou neamplifikující se alely můţe být mutace DNA v místě, které je komplementární k sekvenci primeru (obvykle v úseku blízkém 3´ konci primeru). Dalším důvodem můţe být velký rozdíl v délce alel u heterozygotního jedince, kdy dojde k amplifikaci pouze kratší alely, coţ vychází z podstaty PCR reakce, kdy jsou více vzdálená anelační místa znevýhodněna a kratší úseky DNA jsou často amplifikovány s větší účinností. Poslední příčinou mohou být sekundární struktury vzniklé na templátové DNA, které neumoţní nasedání primerů. Zařazením frekvence nulové alely do statistických výpočtů se zabývali Kalinowski a Taper (2006). Polyploidní genomy Programy TFPGA (Miller, 1997) a Cervus 3.0. (Kalinowski et al., 2007) jsou určené k vyhodnocení mikrosatelitních analýz diploidních nebo haploidních organismů. Důvod pro nemoţnost vyhodnocení polyploidních sestav alel souvisí s kombinací sestav 3 alel. Nelze poznat, jedná-li se o triploidního jedince, který náhodně vznikl zkříţením diploidní a tetraploidní rostliny či tetraploidní rostlinu s jedním lokusem homozygotním (Bruvo et al., 2004; De Silva et al., 2005). Určit, který ze tří lokusů v případě tetraploidního genotypu by byl homozygotní, není reálné.
36
2.5.2.6 RAPD Náhodná amplifikace polymorfní DNA (Random Amplification of Polymorphic DNA) nevyţaduje znalosti specifických sekvencí analyzované DNA, a proto je vhodná u organismů, u kterých doposud nebyla provedena řada sekvenačních analýz. Jako alternativa k fingerprintovým metodám zaloţeným na restrikčním štěpení vznikala RAPD na počátku devadesátých let a průkopníky se stali Williams et al. (1990) a Welsh a McClelland (1991). 2.5.2.7 Princip RAPD metody Princip je zaloţen na amplifikaci fragmentů DNA za pouţití jednoho krátkého primeru o délce 8 – 12 nukleotidů, které jsou dnes běţně komerčně dostupné. V genomech o vysoké komplexitě se musí zákonitě vyskytnout řada míst, ve kterých se dvě sekvence komplementární
k
jakémukoli
náhodně
vybranému
dekanukleotidu
vyskytnou
ve vhodné vzdálenosti řádově stovek či několika málo tisíc nukleotidů od sebe na opačných řetězcích DNA (Flegr, 2005). Princip RAPD analýzy je zaloţen na testování široké sady primerů a následném výběru těch primerů, které poskytují specifické reprodukovatelné zóny (Vejl et al., 2002). Pro metodu RAPD je typická výrazně niţší „anelační“ teplota, která vychází z kratší délky primeru. Obvykle je pouţívána teplota v rozmezí 35-38 °C. Produktem amplifikace jsou různě dlouhé fragmenty rozdělené na agarózové elektroforéze, které odpovídají neznámým oblastem hodnoceného genomu (Welsh a McClelland, 1990). 2.5.2.8 Statistické vyhodnocení RAPD zón Vzájemná podobnost a příbuznost mezi organismy se často vyjadřuje graficky pomocí stromového grafu – dendrogramu. Pro grafické znázornění podobnosti lze vyhodnotit dendrogramy pomocí programu QuantityOne, který zpracovává data metodou UPGMA na základě Diceho koeficientů podobnosti. Program QuantityOne vychází při shlukování jedinců z Diceho koeficientů, které zohledňují počet zón mezi dvěma jedinci společných i rozdílných, jak je zřejmé z matematického vyjádření níţe. Matematické vyjádření výpočtu Diceho podobnostního koeficientu
S = 2m / (a + b) x 100 [%] S m a b
Diceho podobnostní koeficient [%] počet shodných zón mezi dvěma porovnávanými elektroforetickými profily (a,b) celkový počet zón elektroforetického profilu a celkový počet zón elektroforetického profilu b
37
Tyto Diceho koeficienty prezentuje program formou podobnostních matic, které vznikají porovnáváním jednotlivých vzorů RAPD profilů charakteristických pro kaţdý individuální genotyp. Dokumentačním systémem GelDoc pracuje na principu optické denzitometrie. Vzájemná podobnost je charakterizována pomocí vztahu „přítomnost nepřítomnost“ zóny bez ohledu na hodnotu její optické denzity (Vejl et al., 2002). Omezení RAPD analýz Metodě se často vytýká nízká reprodukovatelnost výsledků, neboť PCR produkt je nesmírně citlivý i na drobné změny v reakčních podmínkách (Flegr, 2005). Výsledky metody RAPD jsou závislé zejména na metodě izolace templátové DNA, na chemickém sloţení reakční směsi, na typu termocykleru a teplotním a časovém profilu (Vejl et al., 2002). Nelze porovnávat elektroforetické vzory získané na různých pracovištích a je nevhodné porovnávat elektroforetické vzory získané na stejném pracovišti v nezávislých pokusech (Tyler et al., 1997). Na druhou stranu nízká reprodukovatelnost se týká pouze výsledků PCR, nikoli výsledků vlastních fylogenetických studií. Jestliţe se stejným souborem vzorků provedeme RAPD-analýzu na dvou různých pracovištích, získáme v případě dostatku dat i na základě rozdílných elektroforeogramů téměř identické matice genetických vzdáleností, a tedy i téměř stejné fylogenetické stromy (Flegr, 2005). Mezi další nevýhody patří dominantní charakter markerů postihujících vţdy jen jednu alelu a hodnocení zaloţené na identifikaci přítomnosti/nepřítomnosti zóny, které není tolik precizní jako hodnocení kodominantních markerů, které detekují alely zděděné od obou rodičů a dokáţí odlišit heterozygota od homozygotů (Sunnucks, 2000). Komplikaci při reprodukování výsledků představuje fakt, ţe dva fragmenty putující na gelu stejnou rychlostí (komigrují), nelze automaticky brát jako důkaz jejich homologie. Můţe se jednat o stejně velké fragmenty pocházející z naprosto odlišných oblastí genomu (Russell et al., 1993). Pouţití RAPD metody Přes veškerá limitující omezení je metoda RAPD hojně pouţívanou metodou, kterou lze kromě stanovení příbuzenských vztahů a vnitrodruhové variability, aplikovat k tvorbě vazebných map (Grattapaglia a Sederoff, 1994), hledání genů rezistence k chorobám (Michelmore et al., 1991), identifikaci specifických markerů (Wang et al., 1995) a charakterizaci somatických hybridů (Baird et al., 1992) nebo haploidních genotypů (Ennos, 2001). 38
Metodu RAPD je vhodné pouţít k detekci variability rodů Thymus a Plantago, protoţe mnoţství specifických primerů navrţených molekulárními biology pro tyto rody není dostačující. U analýz rodu Thymus tuto metodu doposud pouţili Pióro-Jabrucka et al. (2007) a Echeverrigaray et al. (2001). Byla tak stanovena vnitrodruhová a mezidruhová variabilita druhů T. pulegioides a T. serpyllum L. emend. Miller pomocí osmi RAPD markerů a odlišeno šest komerčních odrůd druhu Thymus vulgaris. U rodu Plantago byla metoda pouţita pro druhy P. major, (Wolff a Morgan-Richards, 1997; Morgan-Richards a Wolff, 1999; Wolff et al., 2000), P. ovata, (Das née Pal a Raychaudhuri, 2003), P. asiatica (Guo et al., 2002). Druh P. lanceolata spolu s P. major a P. ovata analyzovali Singh et al. (2009).
39
2.6 Chemické analýzy 2.6.1 Stanovení sloţení silice u druhu Thymus pulegioides L. Silice Silice (éterické oleje, olea aetherea) jsou těkavé, ve vodě nerozpustné sloţité směsi organických sloučenin obsaţených v rostlinách (Číţková et al., 2011). Z chemického hlediska se jedná o směs monoterpenů a seskviterpenů v kombinaci s alifatickými cyklickými a aromatickými sloučeninami, které kromě atomů uhlíku mají v molekule nejčastěji atomy kyslíku, popřípadě dusíku nebo síry. Právě molekuly obsahující kyslík jsou povětšinou hlavními nositeli vonných a chuťových vlastností (Vonášek et al., 1987). Silice vznikají jako sekundární metabolity a plní funkci chemické obrany proti chorobám a škůdcům, jako adaptace na abiotické faktory prostředí a posilují konkurenční schopnosti v interakci s ostatními rostlinami (Bakkali et al., 2008). Uţ od středověku měly silice široké uplatnění díky jejich antiseptickým a léčivým účinkům a v dnešní době jsou přírodní silice hojně vyuţívány farmaceutickým, potravinářským a kosmetickým průmyslem. Přestoţe mezi tradiční vyuţívané rody v naší zemi patří Chamomilla, Mentha a Salvia, silice rodu Thymus jsou hojně vyuţívány řadou farmaceutických a potravinářských společností - Megafyt, Leros, Rajec, Vincentka, Fytona, Tilia Nobilis. Aktuálně se ve výzkumu vyuţívá antibakteriálních vlastností extraktů silic různých druhů rodu Thymus a jejích jednotlivých sloţek (Juven et al., 1994; Talei a Meshkatalsadat, 2007; Solomakos et al., 2008; Kostaki et al., 2011), ale zkoumá se také jejich fungicidní (Segvić Klarić et al., 2007; Liu et al., 2009; Sokovic et al., 2009) a insekticidní účinek (Park et al., 2005). Sloţení silice a chemotypy Jednotlivé sloţky tymiánové silice a schéma biochemických pochodů vzniku monoterpenů určujících chemotyp rostliny v roce 1971 navrhl Passet a genetické pozadí v roce 1986 objasnil Vernet (Stahl-Biskup a Sáez, 2002). Biosyntetické dráhy šesti základních monoterpenů jsou znázorněny na Obrázku 10. Vernet et al. (1986) rovněţ při hybridizačních pokusech poukázali na odlišnou segregaci při samosprášení a cizosprášení rostlin s geraniolovým chemotypem a upozornil na existenci dvou lokusů kódujících geraniolový chemotyp, zatímco genetická kontrola chemotypů T, C, L, U a A je realizována jedním párem alel. 40
Obrázek 10. Biosyntetická dráha a genetická kontrola monoterpenů druhu Thymus vulgaris (upraveno dle Thompson et al., 2003).
41
Sedmý chemotyp pro druh Thymus vulgaris L., a sice 1,8-cineol chemotyp, podrobně definovali Keefover-Ring et al. (2009), přestoţe Kaloustian et al. (2005) referuje o borneolovém a p-cymenovém chemotypu nalezeném ve střední Francii jiţ v roce 2005 a 1,8-cineolový chemotyp byl zaznamenán ve Španělsku (Torras et al., 2007). V roce 2000 byl v Litvě u druhu Thymus pulegioides L. nalezen další chemotyp, který obsahoval 50 – 70 % α-terpenyl acetátu (Mockute a Bernotiene, 2000) a poslední chemotyp, určený jednou převládající sloučeninou, byl objeven v Dánsku s chemickou látkou cis-sabinen hydrát (Groendahl et al., 2008). Někteří autoři pouţívají rozdělení rostlin téhoţ druhu do chemotypů zaloţené na kombinaci sloţek silice s nejvyšším obsahem (Loţiene a Venskutonis, 2005; Torras et al., 2007) a přiřazují jim typickou charakteristickou vůni. Přestoţe bylo nalezeno několik dalších chemotypů, návaznost na genetické pozadí u nich doposud nebyla řešena. Objektem zkoumání s dlouhou tradicí je rod Thymus ve Francii. Nejblíţe našemu území zkoumal polymorfismus esenciálních olejů druhu T. pulegioides Mártonfi (1992), který detekoval na východním Slovensku 5 následujících chemotypů: thymolový, karvakrolový, linaloolový, fenchonový a geranial/geraniolový. Na našem území doposud nebyl proveden výzkum zachycující chemickou variabilitu mateřídoušek ani tymiánů. Sloţení silice je závislé na podmínkách prostředí, kdy má vliv především sloţení půdy, struktura populace, vlhkost a teplota (Mártonfi et al., 1994; Thompson et al., 2003). Gouyon et al. (1986) popisují korelaci půdního typu s výskytem fenolických a nefenolických chemotypů. Fenolické chemotypy se vyskytují na sušších, více kamenitých půdách, zatímco ostatní chemotypy jsou častější na půdách hlubších a vlhčích. α-terpineolový chemotyp se vyskytuje na nejvlhčích půdách. Druhou nalezenou korelací byla absence fenolických chemotypů, především karvakrolového, v oblastech s častým výskytem teplot pod bodem mrazu. Nefenolické esenciální oleje se vypařují při niţších teplotách neţ fenolické silice (Goyon et al., 1986), proto je moţné, ţe jsou méně odolné k vysokým teplotám vzhledem k toxickému efektu vypařujících se silic. Izolace a detekce sloţek silice K izolaci tymiánových a mateřídouškových silic se běţně pouţívá destilace s vodní parou (Martonfi et al., 1994; Mockute a Bernotiene, 2000; Loţiene a Venskutonis, 2005; Torras et al., 2007) či extrakční metody (Groendahl et al., 2008; Michet et al., 2008; Keefover-Ring et al. 2009). Výhody a nevýhody těchto metod přehledně shrnuje Scheffer (1993). Destilace vodní parou patří mezi metody finančně nenáročné, avšak časová náročnost 42
a poţadavky na mnoţství materiálu jsou zde značné (řádově desítky gramů). Při extrakci do kapalného organického rozpouštědla se běţně pouţívá rostlinný materiál v řádu mg (Tel et al., 2010), coţ je při hodnocení jednotlivých zástupců populací genových zdrojů limitujícím kritériem. Kvalitativní sloţení silice je moţné detekovat GC + MS (Stahl-Biskup a Sáez, 2002). Identifikace jednotlivých sloţek je zaloţená na principu porovnání hmotnostního spektra a relativních retenčních indexů se standardy v databázi Národního institutu standardů a technologické knihovny USA (NIST05) a s autentickými standardy. Statistické hodnocení závislosti chemotypu na genotypu Hledáním odpovědí na otázku pouţití sloţení sekundárních metabolitů jako taxonomických markerů či závislostí vztahu mezi genetickými RAPD markery a chemickými vlastnostmi se u léčivých rostlin čeledi Lamiaceae zabývali např. Fracaro et al. (2005), Böszöményi et al. (2009) či Vieira et al. (2001). Polymorfismus chemických látek mateřídoušek popisují Slavík et al. (2000) spíše jako odraz běţné vnitrodruhové variability neţ projev taxonomického rozrůznění, které by bylo moţné vyuţít pro třídění druhů. Přítomnost několika chemotypů v populacích druhu T. pulegioides byla ověřena např. autory Mártonfi (1992), Mockute a Bernotiene (2000) či Groendahl et al. (2008). Korelací chemických a genetických vlastností u druhu Thymus vulgaris se zabýval Echeverrigaray et al. (2001), kteří porovnáním skupin formovaných klastrovou analýzou vycházející z chemického sloţení a RAPD zón, vysledoval na základě Pearsonova korelačního koeficientu těsnou míru závislosti. Porovnání závislosti podobnostních matic lze provést pomocí Mantelova testu (Mantel, 1967). Mantelův test pouţili Matesanz et al. (2011) pro objasnění korelace mezi prostorovým rozmístěním a genetickou variabilitou ISSR markerů druhů Thymus vulgaris a Thymus loscosii a závislost genového toku na vzdálenosti mezi populacemi druhu T. vulgaris ověřovali Tyrayre a Thompson (1997). Za účelem porovnání chemické a genetické variability léčivých druhů rostlin pouţili tento test Bottin et al. (2007) a Tonk et al. (2007). Za účelem navrţení RAPD zón či mikrosatelitních alel, které se vyskytují společně s dominantní látkou určující chemotyp, lze pouţít asociační analýzu, kterou zkoumáme závislost kvalitativních znaků nabývajících dvou alternativních hodnot. Z asociační tabulky lze určit průběh závislosti a změřit sílu závislosti zatímco kontingenční analýzou získáme pouze těsnost závislosti. Velikost Pearsonova koeficientu kontingence záleţí na rozsahu souboru a očekávané a skutečné četnosti (Rasch et al., 1999). 43
3 Cíle práce Cíle disertační práce vycházejí z ověření několika vědeckých hypotéz. Tyto hypotézy se dotýkají moţnosti uchování genových zdrojů rodů Plantago a Thymus včetně rizik spojených se změnami genomu. Následující hypotézy se rovněţ vztahují ke stanovení vnitrodruhové a vnitropopulační variability vybraných druhů léčivých rostlin pomocí molekulárních markerů. Mezi tyto hypotézy patří: 1. Uchovávání genových zdrojů se uskutečňuje na dvou úrovních – in situ a ex situ. Při uchovávání populací ex situ často dochází k omezení vnitrodruhové variability, avšak uchovávání in situ je finančně a organizačně náročné a je potřeba při uchovávání biodiverzity hledat kompromisy. 2. Explantátové kultury se jeví jako výhodná technika uchování a mnoţení genových zdrojů, která minimalizuje prostorové náklady na uchovávání v polních podmínkách. Podmínkou pro vyuţití explantátových kultur v oblasti uchování genových zdrojů je však genetická stabilita materiálu během procesu konzervace. 3. Během
mnoţení rostlin v in vitro prostředí, které vyuţívá regeneraci
z dediferencovaných struktur – kalusů, můţe docházet ke genetickým změnám, které jsou označovány jako somaklonální variabilita. Míra somaklonální variability je závislá na strategii regenerace i na botanickém taxonu. 4. Molekulární markery hodnotící polymorfismy nukleových kyselin jsou vhodným nástrojem pro posouzení
stupně variability včetně hypoteticky vzniklé
somaklonální variability. 5. Mikrosatelitní lokusy se nachází především v nekódující část genomu. Hypoteticky lze předpokládat, ţe somaklonální variabilita můţe ovlivnit i počet repeticí jednotlivých mikrosatelitních motivů. 6. Druhy čeledi Lamiaceae jsou při in vitro kultivaci vlivem vysoké vzdušné vlhkosti náchylné na vitrifikaci rostlin, které jsou vzhledem k obtíţné manipulaci a problematickému převádění do in vivo kultur neţádoucí. Specifickými podmínkami kultivace lze tento efekt omezit. 7. U druhů rodu Thymus lze sledovat chemický polymorfismus zaloţený na obsahu dominantního monoterpenu silice určující chemotyp rostliny. Hodnocení chemického sloţení silic je vhodné pro charakteristiku genových zdrojů.
44
8. Jednotlivé chemotypy jsou geneticky podmíněné a biosyntetická dráha vzniku monoterpenů je řízena epistatickou dominancí neznámé série genů. Porovnáním variability chemických a genetických analýz lze vyhodnotit závislost chemotypu na genotypu. 9. Šlechtitelská dokumentace vzniku odrůdy Libor druhu Plantago lanceolata zanikla společně se šlechtitelským ústavem v Libochovicích a zachycení genetické variability molekulárními markery můţe poskytnout současným udrţovatelům odrůdy základní informace. 10. Metoda RAPD je povaţována za jednu z moţností posouzení variability anonymních sekvencí genomu. Podmínkou pro její aplikaci v populačních studiích je
schopnost
detekovat
polymorfismy za
současného
vysokého
stupně
reprodukovatelnosti výsledků. 11. DNA kódující ribozomální RNA obsahuje vysoce konzervativní úseky vhodné pro navrţení specifických primerů a rovněţ úseky variabilní vhodné k detekci mezidruhové a vnitrodruhové variability. 12. Jako alternativní metodu pro sekvenování mohou k zachycení sekvenčního polymorfismu slouţit restrikční endonukleázy. 13. Polyploidie je u krytosemenných rostlin velmi rozšířený jev, který se podílí na speciaci druhů. V zemědělství je často vyuţívána pro poskytování větších výnosů či vyšší odolnosti vůči nepříznivým abiotickým a biotickým faktorům. 14. Polymorfní mikrosatelitní lokusy jsou vyuţívanými genetickými markery v populačních studiích umoţňujícími zachytit polyploidii a odchylky populací od rovnováţného stavu panmiktické populace definované Hardy – Weinbergovým zákonem. 15. Na sloţení a frekvenci alel v populacích má kromě způsobu rozmnoţování druhu vliv selekce, mutace, genetický drift a genetický draft.
45
Konkrétní cíle disertační práce, které jsou zaměřeny na potvrzení nebo vyvrácení výše uvedených hypotéz, jsou uvedeny v následujících bodech: Výběr zástupců léčivých rostlin uchovávaných v genové bance, které slouţí jako vhodné genetické modely k detekci variability. Optimalizace metody izolace DNA u vybraných druhů, která bude splňovat všechny parametry kvality i kvantity nezbytné pro molekulární analýzy zaloţené na principu PCR. Výběr molekulárních metod, které dokáţí zachytit vnitrodruhovou variabilitu vybraných druhů rodů Thymus a Plantago, a detekovat teoreticky moţně vzniklou somaklonální variabilitu. Optimalizace kultivačních podmínek in vitro pro vybrané druhy rodu Thymus tak, aby byl omezen výskyt vitrifikace. Stanovení míry výskytu somaklonální variability při mikropropagaci druhu Plantago lanceolata nepřímou organogenezí z listových segmentů. Posouzení variability mezi mateřskými rostlinami a mezi vzniklými regeneranty s cílem detekovat teoreticky moţně vzniklou somaklonální variabilitu analýzou mikrosatelitních lokusů a metodou RAPD. Statistické vyhodnocení úspěšnosti regenerace rostlin diploidní a tetraploidní populace a určení optimální koncentrace fytohormonů. Detekce chemické variability genových zdrojů druhu Thymus pulegioides L. Posouzení závislosti chemické a genetické variability, detekce lokusů určujících chemotyp. Detekce vnitrodruhové a mezidruhové variability na základě navrţených primerů pro amplifikaci sekvencí pro ribozomální RNA. Výběr vhodných RAPD markerů detekující mezidruhovou a vnitrodruhovou variabilitu vybraných druhů rodů Thymus a Plantago a posouzení reprodukovatelnost této metody. Hodnocení genetické variability odrůdy Libor druhu Plantago lanceolata. Stanovení základních populačně-genetických parametrů na základě hodnocení mikrosatelitních markerů. Statisticky vyhodnotit genetické vzdálenosti jednotlivých populací. 46
4 Metodika 4.1 Rostlinný materiál 4.1.1 Rod Plantago Rostlinný materiál pro genetické analýzy a in vitro kultivace 3 druhů jitrocele (P. major, P. media a P. lanceolata) byl získán ze 17 lokalit v České republice, jejichţ původ je zřejmý z Obrázku 11. Do hodnocení byla zahrnuta jedna francouzská lokalita ze severního pobřeţí Bretaně.
Obrázek 11.
Lokality původu hodnocených zástupců rodu Plantago v ČR
Následující Tabulka 7 uvádí polohu a nadmořskou výšku lokalit, označení, počty analyzovaných zástupců populací a shrnuje také provedené experimenty. Označení IV znamená, ţe u zástupců těchto populací byla testována in vitro kultivace, zkratkou MP je vyjádřeno testování mikropagace metodou organogeneze z listových segmentů, pod zkratkou SSR se rozumí mikrosatelitní analýzy, RAPD označuje náhodnou amplifikaci polymorfní DNA a ITS označuje analýzy spojené s amplifikací jaderné ribozomální DNA.
47
Tabulka 7.
Názvy, označení, zeměpisné charakteristiky lokalit původu a způsoby analýzy
Plantago lanceolata L.
Plantago major L.
Plantago media L.
rostlinného materiálu rodu Plantago Lokalita
GPS souřadnice
Jizerské hory Libíč Jizerské hory Rydvaltický vršek Moravský Kras Vilémovice sad Moravský Kras Sad u hájovny Moravský Kras Křtiny Morvský Kras Vilémovice louky Moravský Kras Hádecká planina Bílé Karpaty Březová Bílé Karpaty Brumov Šumava - Velký Bor Markvartice Planta naturalis
50°37´47.5´´S 14°58´53.3´´V 50°40´21.2´´ S 15°07´11.3´´ V 49°21´57.7´´ S 16°44´27.2´´ V 49°19´5.6´´ S 16°44´36.3´´ V 49°17´49.4´´ S 16°44´38.7´´ V 49°22´13.21´´ S 16°45´06.38´´ V 49°13´10.5´´ S 16°40´31.7´´ V 48°56´06.1´´ S 17°44´38.0´´ V 49°03´24.3´´ S 18°01´48.1´´ V 49°06´09.8´´ S 13°25´48.5´´ V 50°25'45.84´´ S 15°11'52.12´´ V
Vinařice - dno etáţového lomu Pchery - souvrať pole Praha Suchdol areál ČZU
50°11´28´´ S 14°05´07.64´´ V 50°11´12.69´´ S 14°05´41.44´´ V 50°07´53.73´´ S 14°22´44´´ V
Ţalešice - odrůda Libor Markvartice – osivo Planta naturalis Valtice SevaFlora, drůda Libor Vinařice - TTP Francie – Porsguen
Provedené analýzy
N.V. (m)
Označení
N
302
A
15
543
B
15
474
C
15
466
E
15
460
F
14
RAPD
545
M
15
RAPD
407
K
15
RAPD
440
H
15
303
I
15
860
J
15
358
IVM
10
386
R
49
SSR
363
U
49
SSR
282
X
49
SSR
49°07´00.58´´ S 16°35´06´´ V
200
L
120
MP, SSR, RAPD
50°25'45.84´´ S 15°11'52.12´´ V
358
P
35
MP, SSR, RAPD
180
IV1
12
MP, IV, SSR
316
IV2
10
MP, IV
3
IVF
19
MP, IV
48°45´08.30´´ S 16°44´12.91´´ V 50°10´47´´ S 14°04´48´´ V 48°34´16´´ S 4°41´51´´ Z
N.V. (m) – nadmořská výška lokality; N – počet analyzovaných jedinců.
48
štěpení ITS1, RAPD štěpení ITS1, RAPD štěpení ITS1, RAPD štěpení ITS1, RAPD
štěpení ITS1, RAPD štěpení ITS1, RAPD štěpení ITS1, RAPD MP, IV, SSR, RAPD
4.1.1.1 Popis lokalit Plantago major Za účelem studia vnitropopulačních a mezipopulačních charakteristik byl v roce 2010 odebrán rostlinný materiál druhu – P. major ssp. major na třech lokalitách. Jedná se o dvě lokality ze sousedících katastrálních území okresu Kladno a lokalitu v Praze na Suchdole. Populace se od sebe liší dobou existence a mírou narušování antropogenními vlivy. Populace s označením R byla odebrána z člověkem minimálně narušované, přibliţně 400m2 velké, lokality na dně opuštěného jámového etáţového lomu přírodní památky Vinařická hora u Kladna, jehoţ fotodokumentace je uvedená na Obrázku 12. Těţba čediče zde probíhala od 19. století do 80. let 20. století. Vegetace na podloţí nezpevněného tufitu a čedičové suti je od ostatních porostů oddělena kolmou 25 metrů vysokou skalní bariérou. V tabulkách a grafech je tato lokalita popisována jako Vinařice - lom.
© Pavel Vejl, Vinařická hora 2010
Obrázek 12.
Opuštěný etážový lom přírodní památky Vinařická hora
Populace z lokality U vzdálených 710 m od lokality „Vinařice - lom“, pochází ze souvratě pole v katastrálním území obce Pchery zdokumentované na Obrázku 13. Příslušná zemědělsky obhospodařovaná půda byla v roce 2008 ošetřena totálním herbicidem Roundup. Na lokalitě, která je v textu označována „Pchery – souvrať pole“ se předpokládá vznik vegetace ze semen z půdní zásoby v kombinaci s náletem.
49
© Pavel Vejl, Pchery 2010
Obrázek 13.
Souvrať pole v katastrálním území obce Pchery
Rostlinný materiál populace X byl odebrán z lokality v areálu ČZU v Praze na Suchdole a představuje ekosystém pravidelně narušovaný sečením. Tato lokalita označovaná Suchdol – trávník je od předchozích vzdálená přibliţně 20 km.
© Šárka Vašíčková, Praha – Suchdol, 2010
Obrázek 14.
Suchdol- trávník udržovaný pravidelným sečením
Plantago lanceolata L. Kolekce s pracovním označením IV2 vznikla sběrem semen v roce 2007 z dvakrát ročně sečeného trvalého travního porostu v katastrálním území obce Vinařice, okres Kladno. Tato populace je od populace Vinařice – lom vzdálena 680 m a od populace Pchery – souvrať pole 1340 m. Semena francouzských genotypů jitrocele kopinatého, ze kterých vznikla populace IVF byla získána sběrem na severním pobřeţí Bretaně poblíţ obce Porsguen v roce 2007. 50
Plantago media L. Soubory rostlin z lokalit A, B, C, E, F, H, I, J, M a K vznikly v roce 2008 odběrem rostlinného materiálu z polní kolekce jitrocele prostředního udrţované na pracovišti VÚRV, v.v.i., Oddělení zelenin a speciálních plodin v Olomouci.
© Petr Sedlák, Olomouc 2008
Obrázek 15.
Polní kolekce jitrocele prostředního z genobanky v Olomouci
Tato kolekce vznikala postupně v rámci sběrových expedic v roce 2006 při řešení projektů NAZV: "Mapování, konzervace a monitorování genofondu mizejících krajových forem kulturních rostlin a jejich planých příbuzných druhů". Z kaţdé lokality bylo kromě semenného materiálu odebráno a přemístěno vţdy minimálně 15 rostlin, které byly po dobu tří let udrţovány v polní kolekci genobanky. Lokality byly vybírány ve spolupráci s CHKO a s ohledem na výskyt 6 druhů léčivých rostlin - šalvěje luční, šalvěje přeslenité, třezalky tečkované, bukvice lékařské, řepíku lékařského a jitrocele prostředního, které byly vyuţity pro tvorbu regionálních směsí při zakládání květnatých luk. Z okolí oblasti CHKO Šumava bylo vytipováno 7 lokalit, ale druh P. media se vyskytoval pouze na jediné, ve Velkém Boru. V roce 2008 proběhl odběr rostlinného materiálu pro genetické analýzy. U některých populací (např. F – MK, Křtiny) došlo ke sníţení počtu udrţovaných jedinců vyzimováním či uschnutím a bylo moţné analyzovat pouze 14 jedinců. V roce 2008 byla odebrána semena rostlin, která jsou uchovávána metodou vysušených semen v genobance VÚRV v Ruzyni. Vzájemné vzdálenosti původních lokalit jsou uvedeny v Tabulce 8.
51
Tabulka 8.
Vzdálenost původních lokalit druhu Plantago media L. (km)
Lokality A B C E F M K H 10,81 B 188 185 C 193 190 5,19 E 195 193 8,23 2,52 F 189 185 0,94 5,72 7,86 M 198 196 16,17 11,87 9,71 17,42 K 273 269 87 84 83 87 84 H 280 275 99 98 97 99 100 25,22 I 202 212 242 242,31 241 243 236 316 J
I
336
Vzdálenost lokalit rodu Plantago Vnásledující Tabulce 9, která uvádí vzdálenosti ostatních lokalit, jsou lokality druhu P. media rozděleny do 4 oblastí dle CHKO. Do jedné skupiny byly rovněţ sloučeny lokality okresu Kladno. Jako výchozí body pro měření vzdáleností byla zvolena místa, která byla v daných skupinách od jednotlivých lokalit stejně vzdálena. Tabulka 9.
Vzdálenost lokalit pro všechny druhy rodu Plantago (km)
Lokality 1 Prorsguen (FR) 2 Praha Suchdol 3 Valtice 4 Ţelešice 5 Markvartice 6 Kladno 7 Bílé Karpaty 8 Moravský Kras 9 Jizerské Hory 10 Šumava
Označení lokalit IVF X, IV1 L P, IVM U, R, IV2 H, I C, E, F, M, K A, B J
1
2
3
1390 1366 1554 1450 1571 1633 1565 1440 1328
228 193 67 20 283 192 76 132
43 217 249 90 60 243 245
52
4
5
6
7
8
9
175 215 82 95 248 300 25 163 212 90 203 28 85 273 186 230 195 128 326 240 207
4.1.2 Rod Thymus Pro genetická hodnocení byl pouţit rostlinný materiál, jehoţ původ a označení uvádí Tabulka 10 a Obrázek 16. Zástupci jednotlivých druhů byli odebráni z kolekce rodu Thymus, která je udrţovaná na pracovišti VÚRV, v.v.i., Oddělení zelenin a speciálních plodin Olomouc. Pro in vitro kultivaci byla pouţita semena druhu T. serpyllum L. emend. Miller (SEMO s.r.o., ČR) a pro testování mikropropagace byla pouţita semena 4 druhů T. serpyllum, T. praecox, T. glabrescens a T. pulegioides (Planta naturalis, ČR). Tabulka 10.
Původ a označení analyzovaného rostlinného materiálu rodu Thymus
Název
Číslo vzorku
Lokalita
Thymus valesciacus (2n = ?) Thymus pulegioides L. ssp. chamaedrys ( Fries) Gusul. (2n = 28) Thymus serpyllum ag.
0-6
T. serpyllum x T.pannonicus T.praecox Opiz (2n = 54) T.pulegioides L. (2n = 28) T.pulegioides L. (2n = 28) T.pulegioides L. (2n = 28) T.serpyllum L. emend. Miller (2n = 24) T. pulegioides L. (2n = 28)
22 - 24
MU, Lednice na Moravě - Osivo získáno od holandské firmy Mark Plaza MU, Lednice na Moravě- Osivo získáno ze Střediska léčivých rostlin Lékařské fakulty Masarykovy univerzity na Kraví Hoře v Brně MU, Lednice na Moravě, kříţenci T.pulegioides x T. praecox x T. pannonicus MU, osivo získáno sběrem v obci Vinařice
25,26 32 33,34 36-41 27-29
MU, Lednice na Moravě Sběr – Krušné hory 1998, Vysoká Pec Sběr – Krušné hory 1998, Měděnec Sběr – Krušné hory 1998, Horní Blatná Sběr – Krušné hory 1998, Suchá
T.pulegioides L. (2n = 28)
31
T.pulegioides L. (2n = 28) T. pulegioides L. (2n = 28) Thymus pulcherrimus ssp. sudeticus (Lyka) P. A. Schmidt (2n = 30) T. pulegioides L. (2n = 28)
30 44 45
T. pulegioides L. (2n = 28)
7 - 14 15 - 21
35
46,47 48
Sběr – Krušné hory 1998, Doupovské vrchy, Zakšov Sběr – Beskydy 1999, Vsetínské vrchy, Ochmelovské louky Sběr – Beskydy 1999, Vsetínské vrchy, Okruhlá Sběr – Beskydy 1999, Vsetínské vrchy, Zákopčí Sběr – Jeseníky 2000, Velká kotlina Sběr – Beskydy 1999, Moravskoslezské Beskydy, Mionší Sběr – Beskydy 1999, Moravskoslezské Beskydy, Horní Rozpité
53
Obrázek 16.
Původní lokality hodnocených zástupců rodu Thymus
Tabulka 11.
Vzdálenost lokalit hodnocených zástupců rodu Thymus (km)
Lokalita 1 B - Ochmelovské Vrchy 2 B - Okruhlá
1
2
3,43
3 B - Mionší
46,64
43,39
4 B - Zákopčí
12,14
8,77
35,84
5 B - Horní Rozpité
18,67
15,44
32,48
7,07
6 JH - Velká kotlina
99,42
98,84
115,29
96,94
7 Markvartice
241,48
242,1
267,27 243,06 240,96 153,43
8 DH - Zakšov
377,47 378,92 410,67 381,78 381,54 301,76 153,96
9 KH - Vysoká Pec
357,29 358,37 387,24 359,74
122,16
42,34
10 KH - Suchá 11 KH - Horní Blatná 12 KH - Měděnec 13 Brno - Kraví Hora 14 Lednice na Moravě
387,05 388,45 419,16 391,04 390,27 309,08 159,04
14,93
40,16
356,58 357,69 432,64 404,21 403,74 322,74 172,31 24,823
52,26
13,43
378,85
28,5
11,8
380,1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
93,14
358,6
274,4
410,39 382,53 381,68 299,57 148,62
19,69
23,98
110,56 113,15 154,63 119,39 122,26 105,38 169,46 280,89 267,24 292,29 304,98
285,63
111,4
323,28
114,65 158,01 122,77 127,86 142,16 215,38 316,49 306,83 328,75 341,24
B – CHKO Beskydy, JH – Jizerské hory, DH – Doupovské hory, KH – Krušné hory
54
47,45
Při studiu taxonomické literatury zaměřené na druh Thymus valesciacus nebyly u tohoto druhu získány ţádné botanické ani cytogenetické informace, kromě jediného internetového odkazu (http://www.marktplaza.nl/Thymus-valesciacus-1757703.php). Jedná se o nabídkový katalog holandské zahradnické firmy Mark Plaza, která se zabývá distribucí okrasných rostlin včetně skalniček a léčivých rostlin. Populace označena Thymus serpyllum ag. vznikla z původního osiva Thymus serpyllum firmy Planta Naturalis, které pravděpodobně kvůli nedostatečné prostorové izolaci při uchovávání ve sbírkách Mendelovy univerzity prorostlo druhem T. pulegioides. Porost hodnocený botanikem Jaroslavem Čápem při převodu materiálu do prostor genobanky tvořil z 90 % druh T. pulegioides a jeho kříţenci s T. praecox a T. pannonicus.
55
4.2 In vitro kultivace Veškerá manipulace se sterilním materiálem probíhala v laminárním boxu GELAIRE TC 48, který byl po dobu 20 min před prací sterilován UV zářením. Pracovní pomůcky (pinzety, nůţky, pipety atd.) a kultivační média byla sterilována 20 minut ve 120 °C při tlaku 100 kPa. Roztoky fytohormonů byly přidány do jiţ sterilizovaného média pro zachování jejich maximální biologické aktivity. Sterilita roztoků byla zajištěna filtrací přes jednorázové sterilní filtry MiniSart 0,20 µm (Sartorius, Německo). Rostliny byly kultivovány v kultivačních boxech Sanyo (Sanyo Electric Co., Ltd., Japonsko) při fotoperiodě 16 h při teplotě 23 °C ve světelné fázi a 8 h v temnostní fázi při teplotě 18 °C. Není-li uvedeno jinak, bylo základním kultivačním médiem 1x MS médium (Murashige a Skoog, 1962) doplněné o 30 g.l-1 sacharózy a 8 g.l-1 agaru (Serva electrophoresis, Německo). Do médií pro kultivaci explantátů byl přidán 0,5% polyvinlylpyrolidon PVP 10 (Duchefa, Holandsko). Veškerá kultivační média měla před sterilizací upravené pH 1M roztokem NaOH na hodnotu 5,8. Povrchová sterilizace semen Osivo bylo sterilizováno ve 2 ml polypropylenových zkumavkách následujícím způsobem: 1. působení 70% ethanolu s 50 µl Tweenu 20 (Lachema, Holandsko) (5 minut) 2. působení 40% roztoku Sava s 50 µl Tweenu 20 (5 minut) 3. opláchnutí semen sterilní destilovanou vodou (2x) 4. opláchnutí semen sterilním 0,25% roztokem Previcuru (AgroBio, ČR) (3x)
4.2.1 Rod Plantago 4.2.1.1 Kultivace druhu Plantago lanceolata in vitro Rostliny byly kultivovány ve skleněných kultivačních nádobách o objemu 150 ml s plastovými
uzávěry
s průduchy
nebo
v
plastových
kontejnerech
o
rozměrech
9,5 x 9,5 x 10 cm rovněţ opatřené prodyšným uzávěrem. V kaţdé kultivační skleněné nádobě bylo 50 ml 1 x MS média, v kontejnerech 100 ml média. K zaloţení experimentů bylo pouţito osiva jitrocele kopinatého odrůdy ´Libor´ distribuované firmou Seva-flora (ČR) – IV1. Převádění rostlin z in vitro do in vivo kultur, probíhalo přes semisterilní fázi aklimatizace v plastových kontejnerech v perlitu. K tvorbě nových kořenů a obnovení funkce 56
průduchů docházelo přibliţně po týdnu. Rostliny byly po této době přesazeny do substrátu pro pelargonie (Agro CS, ČR) a převedeny do klimatizované skleníkové kóje bez umělého přisvětlení s řízenou denní teplotou 24 °C a noční teplotou 18 °C. Pokus 1 – typ sacharidu U 16 genotypů IV1 (Tabulka 7) byl sledován vliv cukru při kultivaci na MS médiu s přídavkem glukózy (18 g.l-1) a sacharózy (30 g.l-1) (Mederos a Méndez, 1991). Sterilizovaná semena byla hromadně vyseta do 150 ml skleněných nádob obsahujících 50 ml 1 x MS média doplněného o 8 g.l-1 agaru a daný cukr. Po dvou týdnech byly rostliny rozesazeny do nových kultivačních nádob. Kultivace rostlin ve sklěněných nádobách probíhala 6 týdnů. Pokus 2 – typ ztuţující látky U 10 genotypů IV1 (Tabulka 7) byl sledován vliv ztuţující látky při kultivaci na 1 x MS médiu s přídavkem glukózy (18 g.l-1). Sterilizovaná semena byla hromadně vyseta do 150 ml skleněných nádob obsahujících 50 ml 1 x MS média doplněného o 8 g.l -1 agaru či 2,5 g.l-1 Phytagelu (Sigma, USA). Po dvou týdnech byly rostliny rozesazeny do nových kultivačních nádob. Kultivace rostlin probíhala ve skleněných nádobách po dobu 6 týdnů. 4.2.1.2 Mikropropagace metodou listových segmentů Regenerace v Petriho miskách Sterilizovaná semena byla po jednom nasazena do 10 ml skleněných zkumavek na 4 ml MS média s glukózou (18 g.l-1) (pH 5,8), agarem (8 g.l-1) a PVP (Duchefa, Holandsko) (5 g.l-1). Pro experimenty bylo pouţito 12 genotypů odrůdy Libor (IV1), deset genotypů francouzské přirozené populace IVF, tři genotypy populace IV2, sedm genotypů populace L a čtyři genotypy populace P. Segmentace listových čepelí byla prováděna vţdy minimálně ve dvou opakováních. Po čtyřech týdnech byly rostliny přesazeny do kultivačních skleněných nádob o objemu 150 ml obsahujících 50 ml MS média s glukózou (18 g.l-1) a agarem (8 g.l-1). Kultivace probíhala za stejných podmínek jako u vysetých semen přibliţně dva týdny. Segmentace a regenerace proběhla dle Budzianowska et al. (2004). Listové segmenty o velikosti přibliţně 1 cm2 byly kultivovány v počtu 10 ks ve skleněných sterilizovaných Petriho miskách o průměru 12 cm s 30 ml 1x MS média, 2,5 g.l-1 Phytagelu a 18 g.l-1 glukózy. Koncentrace fytohormonů pro navození nepřímé organogeneze uvádí Budzianowska et al., (2004). 57
Regenerace ve skleněných kultivačních nádobách Do zkumavek se 4 ml 1x MS média s 8 g.l-1 agaru a 18 g.l-1 glukózy byl proveden výsev 55 povrchově sterilizovaných semen do 10 ml skleněných zkumavek. Byla vyseta semena osiva Libor (L) a semena osiva Planta naturalis (P). Při nulovém výskytu kontaminací vyklíčilo 49 semen odrůdy Libor a 31 semen populace P. Segmentace byla provedena u 30 rostlin odrůdy Libor a všech vzešlých rostlin populace P. Po deseti týdnech kultivace bylo vybráno 7 nejlépe regenerujících genotypů L a 4 genotypy P, a na získaných regenerantech byl hodnocen výskyt somaklonální variability. Donorové rostliny byly se 100% úspěšností aklimatizovány a ve spolupráci s Botanickým ústavem AV ČR v Průhonicích byla ověřena ploidie mateřských genotypů metodou průtokové cytometrie (Suda a Trávníček, 2006). 4.2.1.3 Optimalizace média pro regeneraci V rámci tohoto experimentu bylo testováno devět kombinací koncentrací IAA (0,5 mg.l-1, 2 mg.l-1 a 4 mg.l-1) a kinetinu (0,5 mg.l-1, 2 mg.l-1 a 4 mg.l-1) (Duchefa, Holandsko). Základ pro toto médium tvořilo MS médium s glukózou (18 g.l1) a agarem (8 g.l-1). Segmentace a regenerace proběhla dle Budzianowska et al. (2004). Jeden list byl rozdělen na osm segmentů přibliţné velikosti 1 cm2. Pro regeneraci byly pouţity stejné kultivační nádoby a podmínky jako pro kultivaci donorových rostlin. Optimalizace sloţení média byla provedena u čtyř náhodně vybraných rostlin odrůdy Libor a čtyř náhodně vybraných rostlin populace P. Po deseti týdnech kultivace explantátů byl stanoven počet regenerantů vzniklý z jednotlivých segmentů u všech variant experimentu.
58
Statistické vyhodnocení dat Pro vyhodnocení výsledků experimentu byla zvolena metoda analýzy rozptylu dvojného třídění. Podrobnější vyhodnocení bylo provedeno Tukey-Kramerovým testem. Vlastnímu výpočtu analýzy rozptylu předcházelo testování normality reziduí a homogenity rozptylů v porovnávaných třídách. Pro zpracování dat byl pouţit statistický software NCSS 2002 (Number Cruncher Statistical Systems, USA). Významnost rozdílu mezi průměrnými počty regenerantů na jeden listový segment u populace Libor a populace P byla hodnocena t-testem dvou nezávislých proměnných, který byl statisticky vyhodnocen programem Statistica CZ 8.0 (StatSoft, USA). 4.2.1.4 Detekce stupně ploidie Pro ověření stupně ploidie byla vyuţita analýza velikosti jader průtokovou cytometrií ve spolupráci s Botanickým ústavem AV ČR, v.v.i. v Průhonicích. Touto metodou bylo analyzováno 7 mateřských genotypů odrůdy Libor a 4 mateřské genotypy populace P (Planta naturlais), na kterých byla ověřována metda mikropropagace listovými segmenty, a ze kterých pocházely regenerované rostliny pro detekci výskytu somaklonální variability. Jako srovnávací standard byla pouţita diploidní rostlina sedmikráska obecná (Bellis perenis) z důvodů nízkého obsahu jader v G2 fázi buněčného cyklu, coţ zajišťuje správnou interpretaci výsledků analýzy. Vzorky pro vlastní analýzu byly připraveny modifikovanou metodou dle Otto (1990) skládající se z několika bodů: 1. Příprava barvícího pufru přidáním 1 ml zásobního roztoku fluorochromu DAPI a 50 µl β – merkaptoethanolu do 25 ml pufru Otto II. Zásobní roztok β – merkaptoethanolu má koncentraci 2 µl.ml-1 a slouţí k zabránění oxidace polyfenolických látek. 2. Nařezání mladých nepoškozených listů o velikosti 1 cm2 analyzovaného genotypu společně s dvojnásobným mnoţstvím listů srovnávacího standardu rostliny Bellis perenis novou ţiletkou v Petriho misce obsahující 500 µl pufru Otto I chlazeného v ledové lázni. 3. Promíchání a přefiltrování vzniklé suspenze přes nylonové síto o průměru ok 42 µm. 4. Inkubace vzorku při laboratorní teplotě po dobu 5 min.
59
5. Přidání 1 ml pufru Otto II obohaceného o fluorochrom (viz. 1. bod postupu) a dobře promíchat. 6. Inkubace ve tmě při pokojové teplotě po dobu 5 min. 7. Analýza obsahu DNA izolovaných jader ve vzorku pomocí průtokového cytometru Partec PAS (Německo). Pufr Otto I měl sloţení 0,1 M monohydrát kyseliny citrónové a 0,5% Tween 20, byl filtrován přes 0,22 µm filtr a uchováván při teplotě 4 °C. Pufr Otto I se skládal z 0,4 M Na2HPO4. 12 H2O, byl filtrován přes 0,22 µm filtr, uchováván při teplotě 4 °C a před kaţdým pouţitím bylo třeba ho znovu přefiltrovat. Chemický název fluorochromu DAPI je 4-6- diamidin-2-phenylindol (C16H15N5). Jedná se o modré fluorescenční barvivo, které tvoří komlexy s molekulami DNA vazbou na A – T páry. Zásobní roztok DAPI barviva měl koncentraci 0,1 mg.ml-1, byl filtrován se přes 0,22 µm filtr a uchovávána při -20 °C ve zkumavkách o objemu 1 ml (Otto, 1990; Gichner et al., 2006). Z výsledků analýz průtokovou cytometrií byl stanoven stupeň ploidie.
60
4.2.2 Rod Thymus 4.2.2.1 Kultivace v Erlenmayerově baňce Povrchově sterilizovaná semena druhu Thymus serpyllum L. emend. Miller od firmy SEMO s.r.o. byla vyseta na 30 ml sterilního 1x MS média bez fytohormonů, s přídavkem 30 g.l-1 sacharózy a 8 g.l-1 agaru do Erlenmayerových baněk o objemu 150 ml s aluminiovým uzávěrem. Rostliny byly udrţovány po dobu dvou měsíců v kultivačním boxu. 4.2.2.2 Kultivace ve skleněných nádobách Povrchově sterilizovaná semena v přibliţném počtu 100 ks čtyř druhů mateřídoušek T. serpyllum (T1), T. praecox (T2), T. glabrescens (T3) a T. pulegioides (T4) byla vyseta do skleněných nádob o objemu 150 ml na 30 ml 1x MS média s přídavkem a 8 g.l-1 agaru. Jiţ při výsevech byl ověřován vliv cukerné sloţky v médiu – monosacharid glukóza (18 g.l-1) a disacharid sacharóza (30 g.l-1). Po 3 týdnech kultivace v kultivačním boxu byla stanovena klíčivost pro jednotlivé druhy vyseté ve dvou opakováních. U jednotlivých druhů byl sledován výskyt hyperhydricity. 4.2.2.3 Kultivace ve skleněných zkumavkách Povrchově sterilizovaná semena dvou druhů mateřídoušek - T. serpyllum (T1), T. pulegioides (T4) byla vyseta do skleněných nádob o objemu 150 ml na 30 ml 1x MS média s přídavkem a 8 g.l-1 agaru. Po třech týdnech kultivace, o velikosti délek prýtů přibliţně 1,5 cm bylo 30 genotypů od kaţdého druhu převedeno na nové médium do 10 ml skleněných zkumavek se 4 ml média 1x MS s 30 g.l-1 sacharózy a 8 g.l-1 agaru. Po dobu 4 týdnů kultivace byl ověřován výskyt vitrifikace.
61
4.3 Genetické analýzy rodů Thymus a Plantago 4.3.1 Izolace DNA, hodnocení kvality a kvantity získané DNA Izolace byla provedena pomocí izolační sady DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Německo) ze 100 mg rostlinného materiálu. Při izolaci byl dodrţen přesný postup, který uvádí firma Qiagen. Z důvodu vysokého obsahu látek inhibujících amplifikaci DNA byl postup u rodu Thymus modifikován dle Landergotta et al. (2006). Mnoţství a čistota izolované DNA byla spektrofotometricky ověřena pomocí NanoDrop1000 (ThermoScientific, USA).
4.3.2 Restrikční štěpení ribozomální DNA 4.3.2.1 Charakteristiky regionů Za účelem studia variability jaderné ribozomální DNA byly vybrány tři oblasti DNA pro ribozomální RNA, které byly označeny IS, 5S a HM. Primery byly navrţeny na základě uveřejněných sekvencí pro jadernou ribozomální DNA u rodu Plantago (Rønsted et al., 2002; Dhar et al., 2006; Sahin et al., 2007). Sekvence primerů byly stanoveny pomocí programu Primer3 verze 0.4.0 (Rozen a Skaletsky, 2000) na základě sekvencí AY684361, EU918345, EU918346, EU918347, EU918348, EU918349 uveřejněných v databázi GenBank volně dostupné na internetové adrese http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Velikost amplikonů a sekvence primerů jsou uvedeny v Tabulce 12. Vymezení úseků DNA, které lze navrţenými primery amplifikovat, jsou znázorněny na Obrázku 17. Tyto primery byly rovněţ aplikovány na druhy rodu Thymus.
Převzato na základě návrhu autorů Baldwin (1992) a Sahin et al. (2007).
Obrázek 17.
Schéma motivu ribozomální DNA a místa nasedání navržených primerů
62
Sekvence nukleotidů regionů 5S a ITS byla v programem Blast porovnána se všemi sekvencemi v databázi GenBank a byla stanovena míra homologie. Amplikony byly štěpeny 32 restrikčními endonukleázami. Seznam enzymů s jejich restrikčními místy je uvedený v Tabulce 2 v kapitole 6 Přílohy. Tabulka 12.
Sekvence primerů amplifikujících úseky DNA pro ribozomální RNA
Primer
Sekvence (5´- 3´)
5SF 5SR ISF ISR HMF HMR
ACCGGATCCCATCAGAACTC AGTCTCRGCGCATTCTATTC TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGT TTCTTCTCCCCGCTTATTGA GCTGGAGCAATCCACTCTTC CACATCCCCAAAACCACAC
Velikost amplikonů (bp) 336 687 149
Štěpení IS a 5S amplikonů probíhalo vţdy na dvou vzorcích od kaţdého druhu – T. valesciacus, T. pulegioides, T. praecox, T. serpyllum, P. major, P. media a P. lanceolata a pouze pro druh T. pulcherrimus byl kvůli nedostatku rostlinného materiálu testován jeden zástupce. Druhová specifita štěpení byla ověřována vţdy pro dva zástupce příslušných druhů, neboť po vyhodnocení experimentu se čtyřmi enzymy (RsaI, Hin1I, AluI a DpnII), kdy byl štěpen ITS amplikon deseti zástupců druhu P. major kolekce R a deseti zástupců druhu P. lanceolata kolekce L, byly nalezeny shodné elektroforetické vzory. Skutečnost, ţe štěpení je druhově specifické byla potvrzena také experimentem s pěti genotypy jednotlivých druhů, při štěpení ITS regionu 3 enzymy (SsiI, MnII, HinfI), které dokázaly odlišit jednotlivé druhy rodu Plantago mezi sebou. U druhu P. lanceolata a P. media byly pouţity genotypy ze vzdálených lokalit (T1, IVF4, L1, P1, W1 a A1, C1, F1, H1, J1 – Tabulka 7). 4.3.2.2 Amplifikace a štěpení Testování amplifikace regionů navrţených markerů probíhalo v termocykleru DNA Engine (Bio-Rad, USA) v následujících krocích: 1x 95 °C 3 minuty, 30 x 94 °C 30 s – teplotní gradient 30 s - 72 °C 45 s a 1x 72 °C 10 minut. Rozmezí anelačních teplot bylo zvoleno s ohledem na Tm navrhovaných primerů. Velmi silná amplifikace regionu IS je zřejmá z Obrázku 18, který představuje ukázky teplotního gradientu pro dva zástupce populace R druhu P. major. Pro druhy P. media a P. lanceolata byly získány obdobné elektroforeogramy. 63
Obrázek 18.
Teplotní gradient při amplifikaci IS regionu druhu Plantago major
Teploty vyhodnocené jako optimální pro amplifikaci specifických regionů jsou pro jednotlivé rody uvedeny v Tabulce 13. Tabulka 13.
Optimální teploty annealingu pro amplifikaci regionů rn DNA
Plantago Thymus
Anelační teploty (°C) Region IS Region 5S Region HM 62,0 58,0 53,0 62,5 56,5 -
Regiony IS a HM byly amplifikovány silně a specificky jiţ v počátečních testech s druhy rodu Plantago, ale průběh PCR reakce regionu 5S bylo nutné optimalizovat, protoţe u druhů P. major a P. media se po amplifikaci vyskytoval nespecifický fragment veliký přibliţně 600 bp a druh P. lanceolata neposkytoval ţádný nebo velmi slabý produkt ve velikosti 336 bp. Reakční směs pro amplifikaci regionů obsahovala vţdy 50 ng DNA, 0,5 U Taq polymerázy (Fermentas, Litva) a 6 ng F a R primeru. Za účelem optimalizace amplifikace byly testovány odlišné koncentrace (1 mM, 1,5 mM a 2 mM) a formy hořčíku (MgCl2 a MgSO4) v kombinaci s látkami narušujícími sekundární struktury vznikající na molekule DNA – dimethyl sulfoxid (Sigma, USA) a tetramethylamonimum oxalát (Top Bio, ČR). Pro zvýšení specifičnosti amplifikace 5S regionu rodu Plantago byla provedena touch down PCR v termocykleru C1000TM Thermal Cycler (BioRad, USA) v těchto krocích: 1x 94 °C 3 minuty, 5 x 94 °C 30 s – 67 °C a v kaţdém dalším cyklu o 1 °C niţší 30 s - 72 °C 45 s a následovalo 35x 94 °C 30 s – 62 °C 30 s a 72 °C 45 s a závěrečná extenze při 72 °C 10 minut. Nespecifické amplifikace se nepodařilo odstranit ani pouţitím touch-down PCR (Obrázek 19). U druhu P. major byl pouţit vzorek R5, u druhu P. media vzorek B7 a u druhu P. lanceolata L3.
64
Obrázek 19.
Optimalizace amplifikace 5S regionu při použití touch-down PCR
Při amplifikaci 5S regionu rodu Plantago a všech regionů rodu Thymus bylo přidáno 5 µg BSA. Koncentrace ostatních sloţek v reakci pro amplifikace IS a HM regionů rodu Plantago byla následující: 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08%, Nonidet P40 a 0,2 mM dNTP Pro rod Thymus byly při amplifikaci 5S a IS regionu pouţity následující koncentrace sloţek: 1,5 mM MgSO4, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08%, Nonidet P40, 0,2 mM dNTP a 6,5% dimethyl sulfoxid (Sigma, USA). Nejvíce zřetelná zóna o velkosti 336 bp byla pro všechny druhy rodu Plantago nalezena při pouţití následující koncentrace jednotlivých komponent: 1,5 mM MgSO4, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08%, Nonidet P40, 0,2 mM dNTP a 4mM tetramethyl amonium oxalát (Top Bio, ČR). Nespecifický fragment veliký přes 600 bp byl při restrikčních analýzách sledován, k jeho štěpení danými enzymy nedocházelo. Štěpení 5 l PCR produktu 0,3U enzymu probíhalo v reakční směsi příslušného pufru dodávaného výrobcem enzymu po dobu 12 h v příslušné teplotě uvedené v Tabulce 2 v kapitole 8 Přílohy. Elektroforetická separace na 2% agarózovém gelu probíhala 60 minut v 1x TBE pufru při napětí 120V. Pro druh Plantago media bylo v databázi GenBank uveřejněno 5 haplotypů s odlišnou sekvencí ITS1 regionu (HM regionu), z tohoto důvodu byl HM region sledován pouze u druhu Plantago media. V následujících kompletních sekvencích ITS1 regionů pro jednotlivé haplotypy jsou podtrţena místa nasedání navrţených primerů a barevně zvýrazněny restrikční místa enzymů. Haplotyp I (EU918345) tgtcgatatctaaaaagtagacctgtgaacacgtgtttaacatgaacgatgtctcgtcgggctggagcaatccactcttcggggcaccgt gcttgcccggtgcttgcacttggtgggctaacgaaacccggcgcagcaagcgccaaggaaaacaaaatggaagcgttactcctcttg actcccgttcgcggtgtggttttggggatgtgatgtatcttgaaag
Haplotyp II (EU918346) tgtcgatatctaaaaagtagacctgtgaacacgtgwttaacatgaacgatgtctcgtcgggctggagcaatccactcttcgggacaccg tgcttgcccggtgcttgcacttggtgggctaacgaaacccggcgcagcaagcgccaaggaaaacaaaatggaagcgttactcctctta actcccgttcgcggtgtggttttggggatgtgatgtatcttgaaag 65
Haplotyp III (EU918347) tgtcgatatctaaaaagtagacctgtgaacacgtgwttaacatgaacgatgtctcgtcgggctggagcaatccactcttcggggcaccg tgcttgcccggtgcttgcacttggtgggctaacgaaacccggcgcagcaagcgccaaggaaaacaaaatggaagcgttactcctctta actcccgttcgcggtgtggttttggggatgtgatgtatcttgaaag
Haplotyp IV (EU918348) tgtcgatatctaaaaagtagacctgtgaacacgtgwttaacatgaacgatgtctcgtcgggctggagcaatccactcttcgggvcaccg tgcttgcccggtgcttgcacttggtgggctaacgaaacccggcgcagcaagcgccaaggaaaacaaaatggaagcgttactcctcttv aactcccgttcgcggtgtggttttggggatgtgatgtatcttgaaag
Haplotyp V (EU918349) Tgtcgatatctaaaaagtagacctgtgaacacgtgtttaacatgaacgatgtctcgtcgggctggagcaatccactcttcgggacaccgt gcttgcccggtgcttgcacttggtgggctaacgaaacccggcgcagcaagcgccaaggaaaacaaaatggaagcgttactcctcttg actcccgttcgcggtgtggttttggggatgtgatgtatcttgaaag Po porovnání sekvencí byl navrţen systém rozlišení čtyř haplotypů pomocí dvou restrikčních enyzmů – BanI a Tru1I. Enzym BanI štěpí molekuly DNA v místě 5´-G/GYRCC-3´, které se nachází u haplotypů I, III a IV. Písmenem Y se označuje báze cytosin nebo thymin a R představuje adenin nebo guanin. U haplotypu IV značí písmeno V moţnou pravděpodobnost výskytu nukleových bází A, C, G. Enzym Tru1I dokáţe rozštěpit DNA v místě 5´-T/TAA-3´ nalezené v sekvencích haplotypů II, III a IV. Tabulka 14 udává, v jaké pozici dochází u daných haplotypů ke štěpení. Tabulka 14.
Rozlišení haplotypů Plantago media podle ITS1 regionu
Haplotyp I II III IV V
Enzym BanI Tru1I 23 neštěpí neštěpí 115 23 115 23 115 neštěpí neštěpí
Na základě vyhodnocování elektroforetických zón vzniklých štěpením regionu dvěma enzymy zvlášť, byly stanoveny jednotlivé přítomné haplotypy pro jedince sedmi populací s označením štěpení ITS1 v Tabulce 7. Postup při odlišování jedinců v populaci je popsán pro populaci J z CHKO Šumava. Vyhodnocování elekroforeoramů probíhalo tak, ţe byli nejdříve hodnoceni jedinci po štěpení enzymem BanI, který rozlišil genotypy do dvou 66
kategorií – II/V a I/III/IV. Pokud tento enzym HM region nerozštěpil, jak tomu bylo u populace J na Obrázku 20, jednalo se o přítomnost haplotypů II nebo V.
Obrázek 20.
Štěpení HM regionu jedinců populace J enzymem BanI
Pomocí enzymu Tru1I byla detekována přítomnost haplotypu V. Vzhledem k diploidnímu genotypu a přítomnosti dvou fragmentů o velikosti 100 bp a 150 bp, které jsou vidět na Obrázku 21, byla jako výsledná kombinace haplotypů této populaci přiřazena heterozygotní kombinace II, V.
Obrázek 21.
Štěpení HM regionu jedinců populace J enzymem Tru1I
4.3.2.3 Sekvenační analýza ITS regionů Sekvenační analýzy byly provedeny pro rod Plantago. Za účelem ověření sekvence PCR fragmentů IS regionů byly obousměrně sekvenovány 2 genotypy druhů P. lanceolata a P. major pocházející ze dna etáţového lomu Vinařická horka (Tabulka 7). U druhu P. media bylo sekvenováno 13 genotypů, které reprezentovaly jednotlivé nalezené sestavy haplotypů na základě restričkního štěpení HM regionu. Analyzováni byli tři zástupci kategorií I/I (C14, C10, C7), II/V (A6, J2, I4) a III/IV/I (I7, I8, C1) a dva zástupci zbylých kategorií II/II (H1, B1) a V/V (H2, E4). Sterilně vyříznuté amplikony o poţadované velikosti byly čištěny s vyuţitím sady MiniElute PCR Purification Kit (Qiagen) dle popisu výrobce. Konečný objem PCR fragmentů byl 20
l, kaţdý vzorek byl vyhodnocen z hlediska mnoţství DNA a její čistoty pomocí
spektrofotometru NanoDrop1000 (Thermo Scientific, USA). Příprava sekvenační reakce 67
Pro sekvenaci byla pouţita sekvenační sada BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Reakční směs o objemu 20 purifikované DNA, 3,2 pmolů primeru, 2
l obsahovala 20 ng
l Terminator Ready Reaction Mix a
4 l 5x Sequencing buffer (Applied Biosystems). Podmínky amplifikace sekvenační reakce Amplifikace probíhala v termocykleru C1000 (BioRad) při následujících podmínkách: 1x 96 °C – 60 s a 25x 96 °C – 10 s, 50 °C – 5 s, 60 °C – 240 s. Následovalo ochlazení amplikonů na 4 °C. Pro amplifikaci byla nastavena rychlost změny teploty mezi jednotlivými cykly 1 °C.s-1. Čištění amplifikační reakce K sekvenační reakci o objemu 20 (c = 20 ng.ml-1, Fermentas), 2
l byl přidán 1
l 3M octanu sodného a 50
l roztoku glykogenu l 96% nedenaturovaného
ethanolu. Po promíchání byly vzorky ponechány 15 minut při laboratorní teplotě a následně odstředěny při rychlosti 13 200 ot.min-1 po dobu 30 minut. Supernatant byl sterilní pipetou odstraněn a k sedimentu bylo přidáno 250 l 70% nedenaturovaného ethanolu. Následovalo odstředění při shodné rychlosti po dobu 15 minut. Krok promývání ethanolem byl opakován a po odsátí supernatantu byly sedimenty vysušeny ve vyhřívaném bloku při 50 °C po dobu 45 minut. Sediment byl rozpuštěn v 15 l formamidu určeném pro kapilární elektroforézu (Applied Biosystems). Sekvenace PCR fragmentů pomocí ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Pro sekvenaci byl pouţit sekvenační modul KB_310_POP6_BDTv3_50std.mob. Separace probíhala v plymeru POP6 (Applied Biosystems) v kapiláře se čtecí délkou 50 cm. Byla pouţita délka nástřiku 30 s, napětí při nástřiku 2,5 kV a během separace 12,2 kV, teplota separace 50 °C a doba separace 120 minut. Získaná data byla následně vyhodnocena pomocí programu DNA Sequencing Analysis Software Version 5.1. for Windows XP and 2000 Platforms (Applied Biosystems) a BioEdit Sequence Alignment Editor Version 7.0.9.0 (Hall, 1999). 4.3.2.4 Statistické hodnocení Při statistickém hodnocení štěpení HM regionu byly haplotypy III a IV sloučeny do jedné skupiny. Variabilita uvnitř populací a mezi populacemi i mezi oblastmi byla hodnocena po vypočítání frekvencí zastoupení jednotlivých haplotypů. Následným pouţitím 68
programu TFPGA haplotypy hodnoceny jako alely a metodou UPGMA bylo 7 populací seřazeno do dendrogramu a to na základě Rogersových koeficientů genetické vzdálenosti jednotlivých lokalit i příslušných CHKO oblastí (Rogers, 1972).
69
4.3.3 Analýzy polymorfismů mikrosatelitních sekvencí Veškeré amplifikace mikrosatelitní DNA probíhaly ve dvou opakováních. Byly detekovány a označeny alely pro jednotlivé populace a pomocí referenčních vzorků obsahujících kompletní sadu alel z populace byl zjištěn celkový počet vyskytujících se alel pro analyzovaný soubor rostlin. 4.3.3.1 Rod Plantago Hodnocení variability druhu Plantago major ssp. major Pouţitý rostlinný materiál Ze tří lokalit středních Čech (R, U, X) bylo hodnoceno vţdy 49 zástupců samosprašného druhu Plantago major ssp. major. Lokality R, U, X jsou definovány v kapitole 4.1.1.1. Amplifikace mikrosatelitních lokusů Za účelem detekce variability byla optimalizována amplifikace 4 mikrosatelitních markerů, které pro tento druh vyvinuli Squirrell a Wolff (2001). Sekvence markerů Pm3, Pm5, Pm6 a JPm11 jsou uvedeny v Tabulce 15. Tabulka 15. Sekvence markerů mikrosatelitních lokusů optimalizovaných pro druh P. major Sekvence mikrosatelitních markerů (5´- 3´) F: CTTCTCCAAGACGCAACC R: CTGGTTCTAGTTTGGTATCACG F: TGTAATAGTTGTTTGTAGGTTAT Pm5 R: TTGTGAATCGTACATCAAT F: ATATGAATTAGCCAACAAA Pm6 R: CCAGCTCCAAGTCAAAGTA JPm11 F: ATGGCATGAGTGGACCAGAT R: AAAAGCTGGGCACCTACAAA Lokus Pm3
Reakční směs PCR reakce obsahovala 50 ng genomické DNA, 0,5 U Taq polymerázy (Fermentas, Litva), 5
g hovězího albuminu BSA (Sigma, USA) a 3 ng R a F primerů.
Koncentrace ostatních komponent reakce, která probíhala v objemu 12, 5 µl, bylo následující: 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 1,5 mM MgSO4, 0,2 mM dNTP
70
a 0,2 mM tetramethylamonium oxalát (TopBio, ČR). Optimální anelační teplota kaţdého primeru byla zjišťována pomocí teplotního gradientu. Amplifikace proběhla v termocykleru DNA Engine (Bio-Rad, USA) a teplotní profily PCR reakce byly následující: Pro lokus Pm3 – 1 x 95 °C 3 minuty, 28 x 94 °C 30 s - 60 °C 40 s - 72 °C 40 s a 1 x 72 °C 10 minut. Pro lokus Pm5 - 1x 95 °C 3 minuty, 30 x 94 °C 30 s - 52 °C 40 s - 72 °C 40 s a 1 x 72 °C 10 minut. Pro lokus Pm6 - 1x 95 °C 3 minuty, 30 x 94 °C 30 s - 44 °C 40 s - 72 °C 40 s a 1 x 72 °C 10 minut. Pro lokus JPm11 - 1x 95 °C 3 minuty, 30 x 94 °C 30 s - 59 °C 40 s - 72 °C 40 s a 1 x 72 °C 10 minut. Separace mikrosatelitních markerů Amplifikované vzorky byly smíchány (1:1) s denaturačním roztokem dle Benbouza et al. (2006), denaturovány 5 min. při 94 °C a po denaturaci ponechány 30 minut na ledu. Pro rozlišení jednotlivých alel byla pouţita separace vzorků na vertikální elektroforetické cele Sequi – Gene II (Bio-Rad, USA). Příprava polyakrylamidové elektroforézy sestává z těchto kroků: 1.
Příprava skel Sklo separační cely bylo po odstranění hrubých nečistot čištěno 1 ml SigmaCote
(Sigma, USA). Volné sklo očištěné 97% ethanolem bylo ošetřeno roztokem 1 ml 97% ethanolu, 5 µl kyseliny octové a 3 µl 3-methacryloxypropyletrimethoxysilan (Serva, Německo). 2.
Příprava gelu (100 ml) Do 100 ml 6% gelového roztoku dle Benbouza et al. (2006) bylo přidáno 50 µl
katalyzátoru TEMED (Roth, Německo) a 833 µl 10% APS (Serva, Německo). Hodinu po polymerizaci gelu byla cela naplněna ohřátým roztokem 0,5x TBE pufru. Vzorky byly nanášeny při konstantní teplotě v separační cele 50 °C. Zásobní gelový roztok obsahoval 75 ml 45% roztoku polyakrylamidu a bisakrylamidu (19:1), 50 ml 10x TBE a 210 g močoviny a do 500 ml byl doplněn destilovanou H2O. 3.
Separace vzorků Separace vzorků probíhala 3,5 h při konstantním výkonu 70 W.
71
4.
Barvení gelu Volné sklo s gelem bylo ponořeno do 2 l fixačního roztoku, ve kterém se 5 minut
inkubovalo. Fixační roztok obsahoval 100 ml 98% ethanolu a 5 ml 0,5% kyseliny octové v 1 l destilované H2O. Poté následovala 7 minutová inkubace ve 2 l barvicího roztoku s 1,5 ml 37% formaldehydu. Barvící roztok obsahoval 1,5 g Ag NO3 v 1 l destilované H2O. Po řádném opláchnutí skla destilovanou vodou byl gel ponořen do 2 l vyvíjecího roztoku s 3 ml 37% formaldehydu a inkubován 5 minut. Vyvíjecí roztok obsahoval 15 g NaOH v 1 l destilované H2O. Oplachování skla s gelem ve fixačním roztoku trvalo 3 – 5 minut. Statistické vyhodnocení variability mikrosatelitních lokusů Pro zpracování genetických podobností alelických kombinací mikrosatelitních lokusů byl pouţit program TFPGA a Cervus 3.0. Vzájemná podobnost detekovaných genotypů byla stanovena na základě podobnostního koeficientu podle Rogers (1972). Program Cervus 3.0 (Kalinowski et al., 2007) byl vyuţit k detekci pravděpodobnosti výskytu nulové alely či výpočtu hodnoty polymorfního informačního indexu (PIC). Hodnocení variability druhu P. lanceolata Pouţitý rostlinný materiál Bylo hodnoceno 25 zástupců tetraploidní odrůdy Libor (L) dodané šlechtitelskou stanicí Ţelešice. Dále byly hodnoceny polymorfní lokusy regenerovaných rostlin z in vitro pokusů populací L a P popsaných v Tabulce 7. Amplifikace mikrosatelitních lokusů U druhu Plantago lanceolata byly analyzovány tři mikrosatelitní lokusy Pll1, Pll8 a Pll11, které navrhli Hale a Wolff (2003). Sekvence primerů k jejich amplifikaci jsou uvedené v Tabulce 16. Tabulka 16.
Sekvence markerů mikrosatelitních lokusů pro druh P. lanceolata Lokus Pll1 Pll8 Pll11
Sekvence markerů (5´-3´) F: GATCAGAATGAATAACCTTCG R: CAATCCAGAGGACCAAATGC F: TGATGCATGTGACCCTGACT R: GATGGGGCTGAGTTTGAGAG F: TGGATTCTGATGTCAGCTCAAC R: TTCCCAACATTAATCGAGAGG 72
Optimalizovaná PCR amplifikace probíhající v reakční směsi o objemu 12,5
l
obsahovala 50 ng genomické DNA, 0,7 U Taq polymerázy (Fermentas, Litva), 5 g hovězího albuminu BSA (Sigma, USA) a 3 ng od kaţdého z dvojice primerů. Koncentrace ostatních komponent reakce byla následující: 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 1,5mM MgSO4, 0,2 mM dNTP a 0,2 mM tetramethylamonium oxalát (TopBio, ČR). Amplifikace lokusů proběhla v termocykleru DNA Engine (Bio-Rad, USA) v těchto krocích: 1x 95 °C 360 s, 29x (94 °C 30 s, 59 °C 40 s, 72 °C 40 s) a 1x 72 °C 600 s. Separace mikrosatelitních lokusů Separace amplikonů probíhala výše popsaným způsobem pro druh Plantago major. Statistické vyhodnocení variability Vzhledem k polyploidním detekovaným sestavám u odrůdy Libor nebyly vypočteny frekvence alel ani heterozygotnost pro jednotlivé markery pomocí statistických programů Cervus 3.0 a TFPGA, které nedokáţí pracovat s polyploidní sestavou alel. 4.3.3.2 Rod Thymus Separace amplikonů a statistické vyhodnocení variaiblity probíhalo způsobem popsaným v předchozí kapitole pro druhy rodu Plantago. Hodnocení genových zdrojů odlišných druhů rodu Thymus Pouţitý rostlinný materiál Bylo hodnoceno 37 zástupců 6 druhů, resp. poddruhů polní kolekce genových zdrojů rodu Thymus, jejichţ původ uvádí Tabulka 10 a Obrázek 16. Amplifikace mikrosatelitních lokusů Variabilita zástupců kolekce genetických zdrojů rodu Thymus byla testována pomocí tří mikrosatelitních markerů detekovaných Landergottem et al. (2006) pro druh Thymus praecox Opiz. Byla hodnocena variabilita lokusů D347, D257, E089. Optimalizovaná PCR amplifikace probíhala v reakční směsi o objemu 12,5
l
obsahovala 50 ng genomické DNA, 0,5 U Taq polymerázy (Fermentas, Litva) a 5
g
hovězího albuminu BSA (Sigma, USA). Koncentrace ostatních komponent reakce bylo 73
následující: 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 0,16 mM dNTP a 0,2 mM tetramethylamonium oxalát (TopBio, ČR). Koncentrace MgCl2 a primerů uvádí Tabulka 17. Tabulka 17.
Koncentrace MgCl2 a primerů Komponenty PCR reakce MgCl2 (mM) F primer ( M) R primer ( M )
Mikrosatelitní marker E089 D257 D347 1,5 1,5 1,8 0,7 0,6 1,1 0,2 0,2 0,7
Amplifikace proběhla v termocykleru DNA Engine (Bio-Rad, USA) v těchto krocích: 1x 95 °C 3 minuty, 35x 94 °C 30 s - 57,5 °C 85 s pro lokus D257, 51 °C 85 s pro lokus D347 a 46 °C 65 s pro E089 - 40 s 72 °C a 1x 72 °C 10 minut. Optimální anelační teplota kaţdého primeru byla zjišťována pomocí teplotního gradientu. Pro rozlišení jednotlivých alel byla pouţita separace fragmentů zmíněná výše pro rod Plantago. Separace mikrosatelitních lokusů Separace amplikonů probíhalo způsobem popsaným u druhu Plantago major. Statistické vyhodnocení variaiblity Jedinci, u kterých byl detekován zmnoţený počet chromozomů byly ze statistického vyhodnocení programem TFPGA vyloučeni. Pro ostatní zástupce jednotlivých druhů, resp. poddruhů byly vypočteny frekvence alel v mikrosatelitních lokusech a rovněţ byl sestaven dendrogram vyjadřující genetické vzdálenosti alelických sestav mikrosatelitních lokusů E089, D257 a D347 u hodnocených zástupců rodu Thymus. Variabilní počet rostlin u jednotlivých hodnocených druhů rodu Thymus byl vyuţit pro sledování závislosti počtu detekovaných alel a počtem jedinců v populaci pomocí regresní a korelační analýzy.
74
Hodnocení genových zdrojů druhu Thymus pulegioides L. Pouţitý rostlinný materiál U zástupců šesti populací druhu Thymus pulegioides L. přenesených v letech 1998 a 1999 z NPR do polní kolekce genobanky v Olomouci (3529 Ochmelovské vrchy, 3530 Okruhlá, 3532 Mionší a 3525 Měděnec, 3526 Horní Blatná, 3535 Vysoká Pec) bylo hodnoceno pět mikrosatelitních lokusů. V rámci kaţdé populace – tří z Krušných hor a tří z Beskyd – bylo hodnoceno 16 jedinců. Amplifikace mikrosatelitních lokusů Byla hodnocena variabilita lokusů E070, E089, D346, D347a D257 (Landergott et al., 2006). Optimalizovaná PCR amplifikace probíhala v reakční směsi o objemu 12,5
l
obsahovala 50 ng genomické DNA, 0,5 U Taq polymerázy (Fermentas, Litva) a 5
g
hovězího albuminu BSA (Sigma, USA). Koncentrace ostatních komponent reakce bylo následující: 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 0,16 mM dNTP a 0,2 mM tetramethylamonium oxalát (TopBio, ČR). Pro amplifikaci mikrosatelitních lokusů E089 a D346 byl pouţit MgSO4, zatímco pro zbývající lokusy MgCl2. Koncentrace MgCl2/MgSO4 a primerů uvádí Tabulka 18. Tabulka 18.
Koncentrace hořčíku a primerů
Komponenty PCR reakce MgCl2 /MgSO4 (mM) F primer ( M) R primer ( M )
Mikrosatelitní marker E089 D346 D347 D257 1 2 1 1,50 0,70 0,60 0,90 0,60 0,20 0,90 0,56 0,20
E070 0,75 0,40 0,90
Amplifikace proběhla v termocykleru DNA Engine (Bio-Rad, USA) v těchto krocích: 1 x 95 °C 3 minuty, 34 x 94 °C 35 s - 46 °C 65s pro lokus E070, 46 °C 75 s pro E089, 51 °C 65 s pro lokus D346, 51 °C 85 s pro lokus D347 a 57,5 °C 85 s pro lokus D257 - 72 °C 10s pro lokus E070, 7 s pro E089, 14 s pro lokusy D346 a D347 a 6 s pro D257 a 1 x 72 °C 10 minut. Optimální anelační teplota kaţdého primeru byla zjišťována pomocí teplotního gradientu. Pro rozlišení jednotlivých alel byla pouţita separace vzorků zmíněná výše pro rod Plantago.
75
Separace mikrosatelitních lokusů Separace amplikonů probíhala způsobem popsaným pro druh Plantago major. Statistické vyhodnocení variaiblity Genotypy, které poskytovaly větší počet alel neţ dvě byly ze statistického vyhodnocení programem TFPGA a Cervus 3.0 vyloučeny. Pro ostatní zástupce jednotlivých druhů byly těmito programy vypočteny frekvence alel a populačně genetické parametry.
76
4.3.4 RAPD analýzy 4.3.4.1 Hodnocení genových zdrojů druhu Thymus pulegioides L. Pouţitý rostlinný materiál Bylo hodnoceno 96 rostlin druhu Thymus pulegioides, které pocházely ze 6 populací genových zdrojů uchovávaných v polní kolekci genové banky v Olomouci původem z CHKO Beskydy – 3529 Ochmelovské vrchy, 3530 Okruhlá, 3532 Mionší a z Krušných hor – 3525 Měděnec, 3526 Horní Blatná, 3535 Vysoká Pec. Hodnoceno bylo 16 jedinců z kaţdé populace. Výběr RAPD markerů RAPD markery byly vybírány s ohledem na počet a specifitu poskytovaných polymorfních zón. Byly testovány RAPD markery, které pro tento rod pouţili Echeverrigaray et al. (2001) a Pióro-Jabrucka et al. (2007) a další markery řady Operon (USA) – kompletní řady OPM a OPE a vybraní zástupci řad OPC, OPD, OPF, OPG, OPH, OPI OPN, OPO a OPP. Z celkového mnoţství 64 desetinukleotidových markerů bylo pro zachycení mezipopulační variability a odlišení chemotypů vybráno 5 následujících RAPD markerů: OPA17, OPD2, OPM4, OPN11 a OPP14. Podmínky amplifikace Optimalizace anelačních teplot jednotlivých markerů proběhla pomocí teplotních gradientů a rovněţ byl testován optimální počet cyklů. Amplifikace RAPD markerů probíhala v termocykleru T-gradient (Biometra, Německo) v těchto krocích: 1x 94 °C 180 s, 35x (94 °C 20 s - tanelační °C 45 s - 72 °C 105 s) a 1x 72 °C 360 s. Anelační teplota byla optimalizována pro markery OPA17, OPD2, OPM4, OPN11 na 37,5 °C, zatímco marker OPP14 poskytoval zřetelnější RAPD profily při teplotě 36,6 °C. Optimalizovaná PCR amplifikace probíhala v reakční směsi o objemu 12,5
l
obsahovala 2 ng genomické DNA, 0,5 U Taq polymerázy (Fermentas, Litva) a 5 g hovězího albuminu BSA (Sigma, USA), 15 ng primeru. Koncentrace ostatních komponent reakce bylo následující: 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 280 M dNTP a 6% DMSO. Byl pouţit 2,5 mM Mg Cl2 pro markery OPA17, OPD2, OPM4, a OPP14, zatímco pro marker OPN11 byl pouţit 2,5 mM Mg SO4. Separace RAPD zón 77
Elektroforetická separace RAPD markerů byla provedena pomocí elektroforézy Sub Cell (Bio Rad, USA). Doba separace na 1,5% agarózovém gelu s přídavkem ethidium bromidu (Sigma, USA) v 1 x TBE pufru byla 150 minut při konstatním napětí 120 V. Detekce RAPD zón Optimalizované RAPD analýzy probíhaly ve třech opakováních a do statistického hodnocení byly zahrnuty RAPD zóny, které se vyskytovaly ve všech třech opakováních. Vizualizace separovaných fragmentů byla provedena pomocí dokumentačního systému GelDoc (BioRad, USA) a úprava a archivace fotografií gelů byla zajištěna softwarem QuantityOne (BioRad, USA). Statistické vyhodnocení RAPD zón Na základě vyhodnocení RAPD profilů byly sestavena podobnostní matice udávající míru podobnosti mezi jednotlivými genotypy. Byly vypočteny průměrné Diceho podobnostní koeficienty pro jednotlivé populace a rozdělení dat bylo ověřeno Kolmogorov-Smirnovým a Saphiro-Wilkovým testem na hladině významnosti α = 0,05 v programu Statistica09. Grafické znázornění rozdělení populací je patrné z Obrázku 22 a těsnost korelace průměrných Diceho koeficientů pro jednotlivé populace s křivkou normálního rozdělení uvádí Tabulka 19.
Obrázek 22.
Výsledky testování normality rozdělení dat
78
Tabulka 19.
Výsledky testů normálního rozdělení
TEST NORMALITY Saphiro-Wilkův Kolmogorov Smirnovův
Horní Blatná W 0,97779 0,98979 p 0,04438 0,5162 d 0,08862 0,06433 p > 0,20 > 0,20 Měděnec
Vysoká Ochmelovské Okruhlá Mionší Pec vrchy 0,97333 0,99438 0,93757 0,98752 0,01737 0,91571 0,00003 0,34113 0,06437 0,04807 0,15456 0,05919 > 0,20 > 0,20 < 0,01 > 0,20
Ze zjištěných hodnot vyplývá, ţe populace Měděnec, Okruhlá a Vysoká Pec nemají normální rozdělení, neboť je hodnota p detekována Saphiro-Wilkovým testem < 0,05. Porovnání hodnot průměrných Diceho podobnostních koeficientů pro jednotlivé populace bylo vzhledem k nesplnění poţadavků normality a homogenity rozptylů hodnoceno dvouvýběrovým t-testem pro nezávislé soubory v programu STATISTICA9. Byla testována významnost rozdílu mezi dvěma výběrovými průměry na hladině významnosti α = 0,05.
79
4.3.4.2 Hodnocení genových zdrojů druhu Plantago media Pouţitý rostlinný materiál Bylo analyzováno 149 genotypů druhu Plantago media ssp. longifolia, z deseti populací z okolí čtyř CHKO podrobně popsaných v kapitole Metodika 4.1.1.1. Z kaţdé populace bylo hodnoceno 15 jedinců, pouze u populace Křtiny z Moravského Krasu bylo hodnoceno 14 jedinců. Výběr RAPD markerů Za účelem objevení variabiliních druhově charakteristických elektroforetických vzorů byly testovány RAPD-primery řady Operon (USA) a primery publikované Wolff a MorganRichards (1998), Wolff et al. (2000) a Das née Pal et Raychaudhuri (2003) publikované pro příbuzné druhy rodu Plantago. Pro podrobnější analýzu druhu Plantago media byly pouţity primery OPA11, OPA17 a OPM5 poskytující zřetelné polymorfní zóny. Ukázka elektroforetických vzorů při hledání vhodných primerů je pro tři genotypy populace Březová z Bílých Karpat uvedena na Obrázku 23.
Obrázek 23.
Testovací analýza dvaceti RAPD primerů pro druh Plantago media L.
80
Podmínky amplifikace Optimalizace anelačních teplot jednotlivých markerů proběhla pomocí teplotních gradientů a rovněţ byl testován optimální počet cyklů. Amplifikace proběhla v termocykleru DNA Engine (Bio-Rad, USA) v těchto krocích: 1x 95 °C 3 minuty, 35 x 94 °C 30 s – 35,8 °C 85 s - 40 s 72 °C a 1x 72 °C 10 minut. Optimalizovaná PCR amplifikace probíhala v reakční směsi o objemu 12,5
l a
obsahovala 2 ng DNA, 0,5 U Taq polymerasa (Fermentas), 15 ng primer. Koncentrace ostatních komponent byla následující: 2,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08%, Nonidet P40, 280 μM dNTP a 4% DMSO. Separace, detekce RAPD zón a statistické vyhodnocení probíhaly postupem popsaným výše pro druh Thymus pulegioides L.
81
4.3.4.3 Variabilita druhu Plantago lanceolata Detekce polymorfismů odrůdy Libor Pouţitý rostlinný materiál Genetická variabilita odrůdy Libor ze šlechtitelské stanice Ţelešice byla testována na 25 jedincích. Výběr RAPD markerů Z 32 testovaných markerů byly vybrány čtyři zástupci desetinukleotidových markerů Operon (USA) poskytující zřetelné a specificky amplifikující RAPD zóny - OPA17, OPI4, OPN12, OPM12. Ukázka elektroforeogramu z optimalizace amplifikace tří genotypů odrůdy Libor deseti markery je znázorěna na Obrázku 24.
Obrázek 24.
Test amplifikace RAPD markerů pro druh Plantago lanceolata (odrůda Libor)
Podmínky amplifikace Optimalizace anelačních teplot jednotlivých markerů proběhla pomocí teplotních gradientů a rovněţ byl testován optimální počet cyklů. Amplifikace RAPD markerů proběhla v termocykleru T-gradient (Biometra, Německo) v těchto krocích: 1x 94 °C 180 s, 40x (94 °C 20 s - 36,5 °C 45 s - 72 °C 105 s) a 1x 72 °C 360 s. Optimalizovaná PCR amplifikace probíhala v reakční směsi o objemu 12,5
l
obsahovala 2ng DNA, 0,5 U Taq polymerasa (Fermentas, Litva), 15 ng primer. Koncentrace ostatních komponent byla následující: 2,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 280 μM dNTP. Separace, detekce RAPD zón a statistické vyhodnocení probíhaly postupem popsaným výše pro druh T. pulegioides. 82
Detekce polymorfismu regenerovaných rostlin Pouţitý rostlinný materiál V prvním experimentu bylo hodnoceno 32 regenerantů pocházejících ze tří genotypů osiva odrůdy Libor zakoupených od společnosti Seva-Flora s.r.o. (řada 14). V dalším experimentu bylo analyzováno 105 regenerantů původem ze sedmi matek osiva odrůdy Libor, které poskytla šlechtitelská stanice Ţelešice (L) a 35 regenerovaných rostlin ze čtyř mateřských genotypů osiva jitrocele kopinatého dodaného společností Planta naturalis (P). Výběr RAPD markerů Pro analýzy v prním experimentu bylo vybráno 10 RAPD markerů (Operon, USA) poskytujících polymorfní profily – OPA11, OPA17, OPD2, OPH13, OPM5, OPM12, OPN11, OPN12, OPP9 a OPP17. Třemi RAPD markery - OPA11, OPA17 a OPM12 - bylo hodnoceno 140 regenerovaných rostlin v druhém experimentu. Podmínky amplifikace Amplifikace RAPD markerů proběhla v termocykleru T-gradient (Biometra, Německo) v těchto krocích: 1x 94 °C 180 s, 40x (94 °C 20 s - 36,5 °C 45 s - 72 °C 105 s) a 1x 72 °C 360 s. Optimalizovaná PCR amplifikace probíhala v reakční směsi o objemu 12,5
l
obsahovala 2ng DNA, 0,5 U Taq polymerasa (Fermentas, Litva), 15 ng primer. Koncentrace ostatních komponent byla následující: 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 280 μM dNTP. Separace, detekce RAPD zón a statistické vyhodnocení probíhalo postupem popsaným výše pro druh T. pulegioides.
83
4.4 Chemické analýzy 4.4.1 Chemické sloţení silice druhu Thymus pulegioides L. Materiál Stanovení chemického sloţení silice bylo provedeno u zástupců šesti populací druhu Thymus pulegioides L. přenesených v letech 1998 a 1999 z NPR do polní kolekce genobanky v Olomouci. V rámci kaţdé populace bylo hodnoceno 16 jedinců, 3 populace pocházely z CHKO Beskydy – 3529 Ochmelovské vrchy, 3530 Okruhlá, 3532 Mionší a 3 byly původem z Krušných hor – 3525 Měděnec, 3526 Horní Blatná, 3535 Vysoká Pec. Příprava vzorku V 500 µL hexanu (Bárta a Cihlář s.r.o., ČR) bylo extrahováno 30 mg rozdrceného usušeného rostlinného materiálu po dobu 20 min na vortexu a 10 minut v ultrazvukové lázni. Po 10 minutové centrifugaci při 1600 ot.min-1 byl supernatant přenesen do skleněných vialek a ihned podroben GC-MS analýze. Veškeré chemické analýzy probíhaly ve třech opakováních. Detekce sloţek silice K indentifikaci jednotlivých sloţek silice byl pouţit plynový chromatograf s hmotnostním detektorem typu - iontová past Varian 450-240 (Varian, Santa Clara, CA, USA). Byla pouţita VF-5MS kolona (Varian, Santa Clara, CA, USA) o průměru 0,25 mm, délce 30 m a tloušťce vrstvy 0,25 µm. Hmotnostní spektra byla získána elektronovou ionizací při 70 eV. K nástřiku 1 µL vzorku docházelo při teplotě 250 °C, v reţimu split 1:50. Počáteční teplota kolony byla 50 °C, dále zvyšována po 3 °C/min do 250 °C a na této hodnotě byla udrţována konstantně po dobu 10 min. Identifikace
jednotlivých
sloţek
silice
byla
provedena
porovnáním
jejich
hmotnostního spektra a relativních retenčních indexů se standardy v databázi Národního institutu standardů a technologické knihovny USA (NIST05) a s následujícími autentickými standardy (Sigma-Aldrich, ČR): α-pinen, β-pinen, δ-3-caren, para-cymen, limonen, terpinen4-ol, thymol, karvakrol, β-elemen, β-karyofylen, eugenol. Relativní podíly jednotlivých sloţek silice byly hodnoceny pomocí plynového chromatografu s plameno-ionizačním detektorem - Agilent 6890 GC-FID (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) s RTX-5 kolonou (Restek, Bellefonte) o průměru 84
0,18 mm, délce 20 m a tloušťce vrstvy 0,2 µm. Ostatní parametry metody byly stejné jako u předchozí GC-MS metody. Nosným plynem byl dusík o čistotě 99,999 % a za konstantního průtoku 1 mL/min. Teplota při nástřiku a v detektoru byla 250 °C. Relativní podíly byly vypočítány vydělením jednotlivé plochy píků celkovou plochou všech píků. Hodnocení výskytu chemotypů Pro všechny detekované látky byly vypočítány průměry pro obsahy jednotlivých sloţek silice ze třech opakování měření. Na hmotnostním spektrometru byly identifikovány pouze látky, které se vyskytovaly v obsahu větším neţ 1 %. Na základě převládajícího obsahu sloţek silice, které se vyskytovaly alespoň u 95 % rostlin nebo v koncentracích větších neţ 5 %, proběhlo zařazování rostlin do skupin chemotypů. Porovnání chemických a genetických analýz Koeficienty podobnosti vycházející z chemických, mikrosatelitních a RAPD analýz byly vypočteny na základě stejného algoritmu Diceho podobnostních koeficientů. Molekulární a chemické vzdáleností matice byly korelovány Mantelovým testem v programu Fstat 2.9.3.2. (Goudet, 2002). Pro zjištění míry závislosti výskytu jednotlivých zón určujících daný chemotyp s jednotlivými zónami RAPD markerů a mikrosatelitními alelami byly vypočteny koeficienty asociace a kontingence dle Pearsona. Výsledky jsou interpretovány z hlediska podstaty genetické vazby, která vychází z hypotézy, ţe amplifikovaná RAPD zóna je buď přímo součástí genu, nebo je na daný gen těsně geneticky vázaná. Při hodnocení závislosti společného výskytu látky a zóny, které jsou v genové vazbě, se vychází z minimální pravděpodobnosti rekombinací mezi přítomností RAPD zóny, resp. alely a chemické látky.
85
5 Výsledky a jejich diskuze 5.1 In vitro kultivace 5.1.1 Rod Plantago 5.1.1.1 Kultivace druhu Plantago lanceolata in vitro Ze dvou experimentů (typ sacharidu, ztuţující látky) s druhem P. lanceolata vyplývá, ţe z testovaných variant je nejvíce vhodné 1 x MS médium s 8 g.l-1 agaru a 18 g.l-1 glukózy. U rostlin kultivovaných na médiích s glukózou byl pozorován počátek tvorby bočních výhonů přibliţně o týden dříve, neţ u variant se sacharózou, kterou řada autorů pro in vitro kultivaci tohoto rodu běţně pouţívá (Sarihan et al., 2005; Gonçalves et al., 2009). Glukózu o koncentraci 50 g.l-1 pouţili pro mikropropagaci druhu Plantago major L. Mederos et al. (1997) a zde testované mnoţství 18 g.l-1 bylo pouţito pro získání shodné koncentrace cukru v médiu při pouţití 30 g.l-1 sacharózy. Přestoţe phytagel byl v řadě pokusů s různými ztuţujícími látkami hodnocen jako nejlepší (Arregui et al., 2003; Kaçar et al., 2010), při kultivaci jitrocele kopinatého média s phytagelem po přibliţně měsíční kultivaci zkapalněla. Tekutá média neposkytovala rostlině dostatečný vzdušný komfort, a proto byl phytagel nahrazen agarem, který ke kultivaci jitrocele pouţili Mederos et al. (1997), Fons et al. (1999) a Gonçalves et al. (2009). Phytagel byl ale pouţit v pokusech pro navození organogeneze z listových segmentů, vzhledem k jeho měkké struktuře působící menší odpor při prorůstání nových orgánů a rychlejšímu difundování ţivin a fytohormonů (Sansberro et al., 2001). 5.1.1.2 Mikropropagace metodou listových segmentů Regenerace v Petriho miskách Petriho misky byly pouţity z důvodu větší kultivační plochy. Na jedné misce bylo moţné kultivovat aţ dvojnásobný počet listových segmentů neţ v jedné skleněné kultivační nádobě o objemu 150 ml. Po 4 – 7 dnech kultivace bylo na řezných plochách segmentů listů pozorováno formování závalového pletiva - kalusu. K podobným závěrům při regeneraci rostlin z listových segmentů ovsa dospěli také Chen et al., (1995). V tomto shluku nediferencovaných buněk vznikají meristematická centra, která se stávají základem pro novou rostlinu (Novák, 1990). Přibliţně po 14 dnech bylo moţné pozorovat první regenerované prýty či kořeny, zdokumentované na Obrázku 25 a Obrázku 26.
86
© Šárka Vašíčková, Praha Suchdol 2008
© Šárka Vašíčková, Praha Suchdol 2008
Obrázek 25.
Obrázek 26.
Regenerující kořen
Regenerující prýt
Rychlost tvorby nového orgánu závisí na poměru endogenních hladin fytohormonů a koncentraci fytohormonů pouţitých v médiu. Přechod G1/S či G2/M souvisí s kompetencí buňky spojené s aktivací genů účastnících se přenosu cytokininového a auxinového signálu (Rediga et al., 1996). O urychlení organogeneze při zvýšené teplotě referují Decout et al. (1994). Získání regenerantů prvního stupně R1, ze kterého lze provést další segmentaci, trvá přibliţně 2 měsíce. Z in vitro mikropropagace metodou listových segmentů probíhající na Petriho miskách bylo ze 7 mateřských genotypů získáno 69 regenerantů prvního stupně, počty získaných regenerantů z jednotlivých genotypů uvádí Tabulka 20. Pro genetické analýzy bylo vybráno 32 genotypů řady 14. Tabulka 20.
Přehled počtu získaných regenerovaných rostlin v zastoupení genotypů
odlišného původu Počet rostlin 6 16 10 13 5 8 11
Genotyp
Označení
14/5 14/6 14/8 C1 B4 17/8 17/16
IV1 IV1 IV1 IVF IVF IV2 IV2
Původ populace Seva-Flora, Seva-Flora, osivo Seva-Flora, osivo Francie, sběr osivo Francie, sběr Pchery, sběr Pchery, sběr
Listové segmenty není vhodné kultivovat déle neţ dva měsíce, neboť po dosaţení velikosti 1cm se regeneranti dotýkají kultivační nádoby a dochází ke kontaminacím. Při tomto postupu docházelo ke kontaminaci u 64 % kultivačních nádob. Z tohoto důvodu byly další experimenty prováděny ve skleněných nádobách o objemu 150 ml.
87
Regenerace ve skleněných nádobách Změnou kultivační nádoby bylo dosaţeno prodlouţení období mezi pasáţemi přibliţně o tři týdny a sníţením kontaminací poklesl o 60 % oproti regeneraci v Petriho miskách. Z in vitro regenerace probíhající ve 150 ml skleněných nádobách bylo získáno 88 regenerovaných rostlin tetraploidní odrůdy Libor pocházejících ze 7 mateřských genotypů a 28 regenerovaných rostlin diploidního osiva Planta naturalis pocházejících ze 4 mateřských genotypů. Přesné počty regenerovaných rostlin jsou uvedeny s označením matek v Tabulce 21. Tabulka 21.
Počet regenerovaných rostlin jednotlivých genotypů odrůdy Libor a osiva
Planta naturalis Genotyp L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 P1 P2 P3 P4
Počet rostlin 15 11 13 15 10 16 8 4 5 7 12
Původ populace Agrogen, osivo Libor Agrogen, osivo Libor Agrogen, osivo Libor Agrogen, osivo Libor Agrogen, osivo Libor Agrogen, osivo Libor Agrogen, osivo Libor Planta naturalis, osivo Planta naturalis, osivo Planta naturalis, osivo Planta naturalis, osivo
Rozdíl mezi osivem je zřejmý jiţ z klíčivosti, kdy odrůda Libor dosahovala hodnot 89,09 % a osivo Planta naturalis 56,36 %. Také průměrný počet získaných regenerantů na jeden mateřský genotyp je o 5 regenerovaných rostlin s hodnotou 13,3 vyšší u osiva L neţ u osiva P. Tento rozdíl lze vysvětlovat odlišnou ploidií obou osiv. Větší vitalita tetraploidů v porovnání s diploidy, kterou např. při in vitro kultivaci u druhu Salvia miltiorrhiza Bge. sledovali Gao et al. (1996), se neprojevovala pouze u explantátů, ale byla pozorována v průběhu celého pokusu. Tetraploidní osivo prokázalo vyšší klíčivost, rostliny rychleji rostly, lépe regenerovaly a při aklimatizaci a převodu do nesterilních podmínek pěstování prokázaly vyšší adaptabilitu.
88
5.1.1.3 Optimalizace média pro regeneraci Porovnáváno bylo devět variant kultivačních médií, kdy byly vzájemně kombinovány tři různé koncentrace auxinů a cytokininů ve čtyřech opakováních pro dvě populace rostlin – odrůdu Libor (L) a populaci Planta naturalis (P). Rozsah koncentrací fytohormonů (0,5 mg.l-1, 2 mg.l-1 a 4 mg.l-1) byl u těchto růstových regulátorů zvolen s ohledem na jejich fytotoxicitu při pouţití ve vyšších dávkách (Caboche et al., 1983; Paponov et al., 2008). Po deseti týdnech kultivace explantátů byl stanoven počet regenerantů vzniklý z jednotlivých segmentů u všech variant experimentu. Z těchto dat byly vypočteny průměrné počty regenerantů na jeden segment, které uvádí Tabulka 22 a 23. Tabulka 22.
Počet vzniklých regenerovaných rostlin u odrůdy Libor v závislosti na odlišné
koncentraci IAA a kinetinu Rostlina
Koncentrace IAA
0,5 mg.l
Tabulka 23.
-1
2 mg.l-1
4 mg.l-1
R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4
Koncentrace kinetinu 0,5 mg.l-1 2 mg.l-1 4 mg.l-1 13 11 7 15 21 18 17 29 17 16 10 21
19 16 10 29 41 33 31 49 35 32 24 39
24 21 15 28 36 32 28 47 31 28 19 31
Počet vzniklých regenerovaných rostlin u populace Planta naturalis
v závislosti na odlišné koncentraci IAA a kinetinu Rostlina
Koncentrace IAA
0,5 mg.l
-1
2 mg.l-1
4 mg.l-1
R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4
Koncentrace kinetinu 0,5 mg.l-1 2 mg.l-1 4 mg.l-1 2 1 3 6 3 2 3 7 2 4 8 9
89
2 2 4 12 14 13 14 17 5 4 7 14
4 6 5 8 10 9 10 15 5 4 6 12
Následující Tabulka 24 uvádí průměrné počty získaných regenerovaných rostlin z jednoho segmentu pro jednotlivé pouţité koncentrace fytohormonů zvlášť i dohromady. Tabulka 24.
Průměrné počty získaných regenerovaných rostlin u jednotlivých faktorů –
odrůdy Libor a osiva Planta naturalis (P) Faktor
Četnost Průměr Sm. odch. Průměr Sm. odch. Odrůda Libor Planta naturalis (P)
A: auxin 1 12 2,166 2,3 2 12 3,979 1,3 3 12 3,156 1,2 B: cytokinin 1 12 2,031 2,3 2 12 3,729 1 3 12 3,542 1 AB: auxin,cytokinin 1,1 4 1,438 1,2 4 2,313 1,3 4 2,750 2,1 4 2,656 2,2 4 4,813 2,3 4 4,469 3,1 4 2,000 3,2 4 4,062 3,3 4 3,406 1,2,3
0,229 0,229 0,229
0,573 2 1,219 1 0,833
0,114 0,114 0,114
0,229 0,229 0,229
0,521 2,3 1,125 1 0,979 1
0,114 0,114 0,114
0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396 0,396
0,375 0,625 0,719 0,469 1,813 1,375 0,719 0,938 0,844
0,197 0,197 0,197 0,197 0,197 0,197 0,197 0,197 0,197
- statisticky významný rozdíl (p<0,05) od ostatních skupin detekovaný Tukey-Kramerovým testem
Statistické vyhodnocení výsledků Cochranův test potvrdil u obou faktorů (auxin, cytokin) homogenitu rozptylů. Výsledky analýzy rozptylu dvojného třídění jsou shrnuty v Tabulce 25. Jednotlivé skupiny s označením A, B a AB přestavují koncentrace pouţitých fytohormonů (1 = 0,5 mg.l-1, 2 = 2 mg.l-1, 3 = 4 mg.l-1).
90
Tabulka 25.
Počítačový výstup analýzy rozptylu vlivu koncentrace auxinů, cytokininů a
jejich kombinace u odrůdy Libor a rostlin Planta naturalis na průměrný počet vzniklých regenerovaných rostlin na jeden listový segment Zdroj variability
N
SS
Rozptyl F-test
p
Odrůda Libor A: Auxin B: Cytokinin AB Mezi skupinami (Reziduální) Celkový (Upravená)
2 2 4 27 35
19,77 20,80 2,39 16,97 59,93
9,88 10,40 0,60 0,63
15,72 0,000030* 16,54 0,000020* 0,95 0,449266
1,27 1,19 0,43 0,16
8,14 7,66 2,76
Planta naturalis A: Auxin B: Cytokinin AB Mezi skupinami (Reziduální) Celkový (Upravená)
2 2 4 27 35
2,53 2,39 1,72 4,20 10,84
0,001714* 0,002315* 0,047822*
* Faktor je průkazný na hladině významnosti α = 0,05; N – stupně volnosti; SS – součet čtverců
Unvitř skupin A a B byly detekovány statisticky průkazné diference mezi průměrnými hodnotami v rámci faktoru Auxin i v rámci faktoru Cytokinin u obou typů osiva. U osiva odrůdy Libor nebyl prokázán statisticky významný rozdíl mezi průměrnými počty regenerovaných rostlin při pouţití odlišných koncentrací obou fytohormonů (p<0,05), zatímco interakce mezi faktory u osiva populace P byly na zvolené hladině významnosti statisticky průkazné. Výsledek detekovaný o odrůdy Libor se neshoduje se všeobecně uznávanou teorií o vzájemné interakci zmíněných fytohormonů (Skoog a Miller, 1957; Che et al., 2006), coţ je zřejmě způsobeno koncepcí pokusu, ve kterém byl zaloţen malý počet opakování v jednotlivých podtřídách.
Podrobné vyhodnocení analýzy rozptylu Tukey-Kramerovým testem Statisticky průkazný rozdíl (p<0,05) byl detekovaný pro skupiny uvedené v Tabulce 22. Zatímco průměrné počty regenerovaných rostlin se mezi sebou lišily u všech skupin koncentrací auxinu u odrůdy Libor, u populace P byl detekován rozdíl pouze mezi počty regenerovaných rostlin vzniklých v kultivačním médiu s nejniţším (0,5 mg.l-1) a středním (2 mg.l-1) pouţitým přídavkem auxinu. Na základě průměrných počtů regenerovaných rostlin v závislosti na obsahu cytokininu v médiu byl detekován statisticky průkazný rozdíl (p<0,05) mezi médii s nejniţší koncentrací 91
cytokininu
(0,5
mg.l-1)
a
dvěma
zbývajícími
variantami
médií,
a
to
shodně
u diploidní i tetraploidní populace.
Hodnocení schopnosti regenerace osiva P a L Nejvyšší průměrný počet regenerovaných rostlin z jednoho listového segmentu odrůdy Libor dosahoval hodnot 4,81, zatímco u rostlin z osiva Planta naturalis bylo průměrně z jednoho listového segmentu získáno 1,81 regenerovaných rostlin. Tento výsledek pravděpodobně souvisí s odlišným karyotypem obou populací. Tetraploidní populace Libor dosahovala oproti diploidní populaci P ve všech variantách experimentu výrazně vyšších počtů regenerantů. Průměrnou regenerační schopnost testovaných populací u jednotlivých variant experimentu dokumentuje Obrázek 27. Obrázek 27.
Průměrné počty regenerovaných rostlin na jeden listový segment populací
Libor a Planta naturalis při kultivaci na médiích s odlišnou kombinací fytohromonů
Libor
P
Průměrný počet reg. na segment
5 4 3 2 1 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
Varianta experimentu
Varianty experimentu: 1 – IAA 0,5 mg.l-1 , kinetin 0,5 mg.l-1 ; 2 – IAA 0,5 mg.l-1 , kinetin 2 mg.l-1 ; 3 – IAA 0,5 mg.l-1 , kinetin ; 4 mg.l-1 4 – IAA 2 mg.l-1 , kinetin 0,5 mg.l-1 ; 5 – IAA 2 mg.l-1 , kinetin 2 mg.l-1 ; 6 – IAA 2 mg.l1 , kinetin 4 mg.l-1 ; 7 – IAA 4 mg.l-1 , kinetin 0,5 mg.l-1 ; 8 – IAA 4 mg.l-1 , kinetin 2 mg.l-1 ; 9 – IAA 4 mg.l-1 , kinetin 4 mg.l-1
Na základě výsledků t-testu byl rozdíl mezi průměrnými počty regenerantů na jeden listový segment populace Libor (2,82±1,17) a polulace P (0,88±0,56) statisticky významný (p<0,05). Větší vitalita rostlin odrůdy Libor ve srovnání s populací P se však neprojevila pouze u explantátů, ale byla pozorována v průběhu celého pokusu – při klíčení, schopnosti 92
regenerace a rychlosti růstu. Osivo odrůdy Libor prokazovalo vyšší klíčivost, rostliny rychleji rostly, lépe regenerovaly a při aklimatizaci a převodu do nesterilních podmínek pěstování prokázaly vyšší adaptabilitu. U populace Libor některé donorové rostliny regenerovaly z kořenů jiţ v průběhu kultivace na základním médiu. Zmíněná regenerační schopnost se po segmentaci projevila pouze u explantátů z těchto rostlin, coţ potvrdilo, ţe pro úspěšnost mikropropagace je jedním z rozhodujících faktorů právě genotyp (Murashige, 1974; George a Sherrington, 1984). Jak je patrné z následujících Obrázků 28 a 29, u diploidní i tetraploidní populace docházelo ke vzniku nejvyššího počtu regenerovaných rostlin při koncentraci růstových regulátorů skupin 2,2, které odpovídá látkové koncentraci 11,42 μM IAA a 9,29 μM kinetin. Tato koncentrace byla stanovena za optimální rovněţ pro regeneraci rostlin v experimentech Budzianowska et al. (2004), kteří stanovili průměrnou hodnotu počtu regenerovaných rostlin z jednoho listového segmentu na 4,38. Na základě porovnání průměrných hodnot získaných regenerovaných rostlin lze předpokládat, ţe rostlinný materiál z genové banky v Poznani byl rovněţ tetraploidní. Explantáty pocházející z rostlin populací P i L tvořily na kultivačním médiu, vyhodnoceném jako optimální pro regeneraci listy, kořeny i kalus, coţ bylo pozorováno rovněţ v experimentech polských vědců (Budzianowska et al., 2004) a pravděpodobně se jedná o ovlivnění procesu regenerace endogenní hladinou fytohormonů v listových segmentech, které se ve spodní a horní části listů značně liší (Kof et al., 2002). U variant medií obsahujících vysoké koncentrace auxinů a nízké koncentrace cytokininů docházelo k regeneraci kořenů a u některých segmentů byla potlačena tvorba prýtů. Tyto segmenty po přibliţně 4 týdenní kultivaci nekrotizovaly. Bylo tím potvrzeno základní morfologické schéma Skooga a Millera (1957), podle kterého je vysoký poměr auxinů k cytokininům příznivý zejména pro iniciaci kořenů.
93
Obrázek 28. Vliv koncentrací auxinů a cytokininů na průměrný počet regenerantů vzniklých z jednoho listového segmentu u odrůdy Libor
Průměrný počet regenerovaných rostlin 4,9
4,2-4,9
4,2
3,5-4,2 2,8-3,5
3,5
2,1-2,8
2,8
1,4-2,1
2,1
0,7-1,4
1,4
4
0-0,7
0,7
2
0
0,5 2
0,5 4
Obsah kinetinu (mg.l-1)
Obsah IAA (mg.l-1)
Obrázek 29. Vliv koncentrací auxinů a cytokininů na průměrný počet regenerantů vzniklých z jednoho listového segmentu u populace P
Průměrný počet regenerovaných rostlin 2
1,6-2 1,2-1,6
1,6
0,8-1,2 1,2
0,4-0,8
0,8
0-0,4
4
0,4
2
0
0,5 2
0,5 4
Obsah kinetinu (mg.l-1)
Obsah IAA (mg.l-1)
5.1.1.4 Detekce stupně ploidie Výsledky stanovení stupně ploidie metodou průtokové cytometrie byly získány ve spolupráci s Botanickým ústavem AV ČR, v.v.i. v Průhonicích a jsou uvedeny v tabulce 35. Cytometrická vyšetření rostlin potvrdila tetraploidii odrůdy Libor. U těchto zástupců byl detekován dvojnásobný index vypočtený z porovnání relativní intenzity fluorescence vzorku a standardu. Index standardní diploidní rostliny Bellis perenis se shodoval s indexy rostlin Planta Naturalis, z čehoţ lze usuzovat na diploidních charakter osiva, které tato společnost poskytuje. Kvalitu měření odráţí tzv. variační koeficient (CV) vrcholu (píku). Pokud má hodnotu přibliţně 3 %, lze s jistotou detekovat rozdíl v obsahu jaderné DNA a sice s přesností 6% (Suda, 2004). Z Tabulky 26 je patrné, ţe měření obsahu DNA bylo kvalitní. Tabulka 26.
Výsledky stanovení stupně ploidie metodou průtokové cytometrie
na základě porovnání relativní fluorescence (Index) standardu (S1 a S2) a genotypů (P1-4 a L1-8) a kvalita měření metody (CV) Vzorek P1 P2 P3 P4 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L8 S1 S2
Index 0,650 0,649 0,648 0,649 1,315 1,307 1,319 1,315 1,303 1,370 1,319 0,645 0,641
CV Bellis 2,72 2,27 2,87 2,31 3,20 1,53 2,29 2,36 2,42 2,35 2,77 2,01 2,36
CV Plantago 3,40 2,78 3,33 2,71 2,77 1,62 2,73 2,03 2,87 2,27 2,52 2,63 2,71
Výstup cytologického vyšetření z průtokového cytometru Partec PAS (Německo) představuje Obrázek 30, na kterém je zřetelný rozdíl mezi intenzitou fluorescence jader populace Planta Naturalis a odrůdy Libor.
97
S – standard (Bellis perenis L.) P – Planta naturalis L – odrůda Libor
Obrázek 30.
Výsledné histogramy relativních intenzit fluorescence u jader odrůd Planta
Naturalis a Libor
98
5.1.2 Rod Thymus 5.1.2.1 Kultivace v Erlenmayerově baňce Při kultivaci rostlin druhu Thymus serpyllum L. emend. Miller v Erlenmayerových baňkách o objemu 150 ml s aluminiovým uzávěrem byl u všech 15 genotypů v průběhu dvouměsíční kultivace na 1x MS médiu bez fytohormonů, s přídavkem 30 g.l-1 sacharózy a 8 g.l-1 sledován efekt vitrifikace. Tento způsob je pro druh Thymus serpyllum L. emend. Miller nevhodný. Ukázku vitrifikované rostliny druhu Thymus serpyllum L. emend. Miller uvádí Obrázek 31.
© Petr Sedlák, Praha Suchdol 2008
Obrázek 31.
Vitrifikovaný zástupce rodu T. serpyllum při kultivaci v Erlenmayerově baňce
Vitrifikace byla pozorována při in vitro kultivaci mnoha druhů čeledi Lamiaceae (Shetty et al., 1996a; Hussein et al., 1999; Skała a Wysokińska, 2004). Vzhledem k tomu, ţe tento při in vitro kultivacích neţádoucí jev vzniká v reakci na podněty související s fyziologickými procesy příjmu a výdeje vody rostlinou (Kevers et al., 1984; Delarue et al., 1997), který je ovlivňován celou řadou faktorů (obsah minerálních látek, teplota, obsah fytohormonů), lze předpokládat odlišný výskyt hyperhydricity u jednotlivých druhů. Nejsnáze dostupným řešením pro změnu vysoké vzdušné vlhkosti způsobující vznik vitrifikovaných pletiv v rostlinách (Gribble et al., 2003), je změna kultivační nádoby. 5.1.2.2 Kultivace ve skleněných nádobách Ve skleněných 150 ml nádobách s prodyšným uzávěrem se vyskytovala vitrifikace u druhu T. pulegioides, ale u druhu T. serpyllum nikoli. Sníţení výskytu vitrifikovaných rostlin změnou kultivační nádoby bylo druhově specifické a kultivace ve skleněných 99
nádobách nevyhovuje pravděpodobně ani druhu T. praecox, u kterého však byl sledován pouze malý počet genotypů (Tabulka 10). Různý výskyt hyperhydricity u odlišných druhů zaznamenal také Gaspar et al. (1995), kteří detekovali odlišné sloţení enzymů v pletivech 13 druhů rostlin jako odlišný způsob reakce na aktivní formy kyslíku po vystavení rostlin stresům v in vitro prostředí. U tří ze čtyř druhů osiv mateřídoušek Planta naturalis byla po třech týdnech kultivace hodnocena klíčivost osiv, které jsou uvedeny v Tabulce 27. Osivo druhu T. glabrescens (T3) neklíčilo. Nejniţší klíčivost byla pozorována u semen druhu T. praecox (T2), jehoţ osivo obsahovalo příměsi rodu Stelaria. Porovnání klíčivosti a čistoty osiva druhů T. pulegioides a T. praecox je zdokumentovaný na Obrázku 32. Procentuální zastoupení klíčivosti na médiích s odlišnou cukernou sloţkou se výrazně nelišilo a ani při sledování růstu rostlin nebyl pozorován výrazný rozdíl na médiích s glukózou a sacharózou. V souladu s autory Sáez et al. (1994), Shetty et al. (1996a), Mendes a Romano (1999) a Fraternale et al. (2003), kteří pouţívali při kultivaci zástupců rodu Thymus, byla pro další experimenty pouţita sacharóza. Tabulka 27.
Vliv obsahu cukru v kultivačním médiu na klíčivost osiv mateřídoušek
Botanický druh
Označení
Thymus serpyllum L. emend Miller Thymus praecox Opiz. Thymus pulegioides L.
T1 T2 T4
Klíčivost (%) MS + Glukóza MS + Sacharóza 62 58 3 7 32 35
© Šárka Vašíčková, Praha Suchdol 2008
Obrázek 32. Porovnání klíčivosti a čistoty osiva druhů T. pulegioides L. a T. praecox Opiz. 5.1.2.3 Regenerace ve skleněných zkumavkách Přímý výsev do skleněných zkumavek tak, aby vţdy klíčilo jedno semeno ve zkumavce je vzhledem k velikosti semen mateřídoušek nereálný. Proto byly rostliny vysety společně do sklenic a poté přesazeny. Velikost zhruba 1,5 cm po třech týdnech 100
kultivace je vhodná jak pro snadnou manipulaci s rostlinným materiálem, tak pro úspěšné uchycení a růst v novém médiu. Situace při kultivaci rostlin ve skleněných zkumavkách byla v porovnání s předchozím experimentem přesně opačná. Tento způsob vyhovoval 93 % druhu T. pulegioides L., ale jak je zřejmé z Obrázku 33, u druhu T. serpyllum docházelo k vitrifikaci a to u všech 30 genotypů.
© Šárka Vašíčková, Praha Suchdol 2008
Obrázek 33.
Čtyřtýdenní rostliny T. pulegioides (T4) a T. serpyllum (T1) kultivované
ve zkumavkách Shetty et al. (1996a) navrhují pro sníţení hyperhydricity při in vitro kultivaci tymiánu a oregána vyuţití bakterií Pseudomonas sp., protoţe jeden specifický kmen produkuje extracelulární polysacharid mukoid schopný na sebe vázat přebytečnou vodu. Vysokou vzdušnou vlhkost způsobující vitrifikaci lze ovlivnit řadou dalších opatření, jako např. uvedenou změnou kultivační nádoby, přestoţe je vţdy nutné zahrnout také náchylnost jednotlivých genotypů uvnitř druhu, o které se zmiňují např. Beruto et al. (2004) a Picoli et al. (2008). Přestoţe získání mukoidu vyţaduje vybavení mikrobiologické laboratoře, jedná se pravděpodobně o nejspolehlivější neselektivní způsob kultivace, vhodný pro in vitro udrţování genových zdrojů.
101
5.2 Genetické analýzy 5.2.1 Restrikční štěpení markerů hodnotících variabilitu ribozomální DNA rodů Thymus a Plantago 5.2.1.1 Region ITS IS primery navrţené pro rod Plantago amplifikující úsek 687 bp byly rovněţ vyuţity pro rod Thymus, kde pro všechny druhy vymezovaly úsek velký přibliţně 750 bp. Štěpením PCR amplikonu IS bylo moţné rozlišit jedince pouze na mezidruhové úrovni a to jen u rodu Plantago, u rodu Thymus nikoli. Aplikace primerů navrţených pro jinou čeleď, řád či třídu je pro markerování ribozomální DNA běţné (Smolik et al., 2009) a umoţňuje to vysoký stupeň konzervativnosti kódujících sekvencí (Baldwin et al., 1992). Analýza homologie sekvence nukleotidů ITS regionu, ze které se vycházelo při navrhování primerů v databázi Genbank, byla provedena programem Blast. Výsledky nejvíce si podobných sekvencí uvádí Tabulka 28, která potvrzuje jiţ zmíněnou konzervativnost v rámci rodu Plantago.
102
Tabulka 28. Homologie sekvencí ITS regionu porovnávané v databázi GenBank GenBank kód
Popis sekvence
Homologie
AY101865.1
Plantago media 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence
100 %
AJ548964.1 AY101875.1 AJ548977.1 AY101873.1 AY101862.1 AY101858.1 AJ548978.1 AJ548970.1 AJ548968.1 AJ548979.1 AJ548976.1 AJ548966.1 AY101874.1 AJ548969.1 AY101863.1 AY101861.1 AJ548967.1 AB281166.1 GQ396669.1 AY101870.1 AY101868.1 AB281167.1 AJ548971.1 AY101860.1
Plantago media 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, 28S rRNA gen, ITS1 ITS2 Plantago uniglumis 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago asiatica částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2 Plantago myosuros 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago asiatica 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago reniformis 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago reniformis částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2, Plantago tasmanica částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2 Plantago daltonii částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2, Plantago sparsiflora částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2, Plantago rhodosperma částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2, Plantago euryphylla částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2, specimen voucher Craven & Craven #10157 Plantago australis 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago paradoxa částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2, specimen voucher Burns D #2136 Plantago rugelii 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago major 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago hispida částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2, specimen voucher Craven & Brubaker #10146 Plantago hostifolia gens for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA, částečná sekvence kompletní sekvence Plantago asiatica var. densiuscula 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago stauntonii 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago debilis 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence Plantago erosa gens for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA, částečná sekvence kompletní sekvence Plantago camtschatica částečná sekvence 18S rRNA gen, 5.8S rRNA gen, částečná sekvence 28S rRNA gen, ITS1 ITS2, Plantago palmata 18S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; vnitřní přepisovaný region 1, 5.8S ribozomální RNA gen, vnitřní přepisovaný region 2, kompletní sekvence; 28S ribozomální RNA gen, částečná sekvence
103
99 % 96 % 96 % 96 % 96 % 96 % 96 % 96 % 96 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 96 % 95 % 96 % 95 % 95 % 95 % 96 % 95 % 95 %
Rod Plantago Rozlišení enzymů, které dokáţí rozštěpit ITS region a případně odlišit druhy P. major, P. media a P. lanceolata shrnuje Obrázek 34. Testováno bylo 31 restriktáz.
Obrázek 34.
Rozlišení enzymů podle způsobu štěpení ITS regionu u rodu Plantago
Enzymy byly roztříděny do kategorií podle schopnosti rozlišit jednotlivé druhy. Ukázka štěpení různými enzymy a vznik jednotlivých kategorií je uveden na Obrázku 35. Byly nalezeny tři enzymy (SsiI, MnII, HinfI), které spolehlivě dokázaly odlišit všechny zkoumané druhy - P. major (Ma), P. media (Me) a P. lanceolata (La). Získání specifických elektroforetických vzorů pro jednotlivé druhy bylo ověřeno analýzou zástupců odlišných populací, kdy bylo od kaţdého druhu vybráno tři aţ pět vzorků. Enzymy SduI a Hin1II štěpí shodně druhy P. media a P. major, odlišně pak druh P. lanceolata. Enzym BsuRI štěpí ITS region pouze u druhu P. lanceolata, enzymy BsmAI a Tru1I štěpí region pouze u druhu P. media a restriktáza BanI pouze druh P. major. Nízký sekvenční polymorfismus, o kterém se zmiňuje také Dhar et al. (2006), byl mezi jednotlivými druhy prokázán dohromady 20 enzymy. Početnou skupinu tvořili enzymy, které štěpili ITS region u všech druhů na shodných pozicích – AccI, AluI, DdeI, DpnII, HhaI, Hin1I, Hin6I, HpaII, KpnI a TaqI. Třetina pouţitých enzymů zmiňovaný region neštěpila u ţádného druhu - BsrBI, DraI, EcoR47III, EcoRI, EheI, HindIII, PvuII, RsaI, SmaI a XbaI.
104
Obrázek 35.
Štěpení fragmentu ITS pro druhy rodu Plantago
Sekvenační analýzy U rodu Plantago byla ověřena sekvence nukleotidů IS regionu dvou zástupců kaţdého druhu. Při porovnání získaných sekvencí pro druh P. lanceolata s publikovanou sekvencí AY101898 pro tento druh (Rønsted et al., 2002) byly nalezeny tři záměny nukleotidů ve vzdálenostech 520, 579 a 631 bp sekvence AY101898. Výsledky porovnání v programu BioEdit jsou graficky znázorněny na Obrázku 36 a 37.
Obrázek 36.
Nukleotidové záměny v sekvencích druhu Plantago lanceolata
Obrázek 37.
Nukleotidové záměny v sekvencích druhu Plantago lanceolata 105
Pro druh P. major byla po porovnání chromatogramů obousměrné detekována jedna sekvenční změna v pozici 680 a jedna duplikace adeninu ve vzdálenosti 427 bp sekvence publikované Rønsted et al. (2002). Nalezená bodová mutace ve vzdálenosti 680 bp a inserce se shodují se sekvencí haplotypu M2, který detekoval Sahin et al. (2007) pro ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 region (AB281165, AB296071). Sekvence haplotypu M1 se shoduje se sekvencí AY101861 (Rønsted et al., 2002). DNA haplotypu M2 však obsahuje ve vzdálenosti 641 bp thymin, zatímco haplotyp M1 má v této pozici cytosin. Z Obrázku 38 je patrné, ţe sekvence hodnocené v této disertační práci jsou kombinací obou detekovaných haplotypů (cytosin ve vzdálenosti 641 a adenin ve vzdálenosti 680 bp) a vzhledem k tomu, ţe na chromatogramech nebyla detekována heterozygotní sestava v podobě překrývajících se píků ve stejné pozici, lze ho tudíţ povaţovat za nový haplotyp M3. Toto zjištění je nutné ověřit ligací IS regionu do plazmidu, neboť při PCR amplifikaci je namnoţeno mnoho kopií tohoto genu, zatímco při sekvenaci rekombinovaných bakteriálních plazmidů máme jistotu, ţe dochází k mnoţení pouze jediné molekuly DNA (Lodish et al., 2000).
Obrázek 38.
Porovnání sekvencí ITS regionu druhu Plantago major
106
U druhu P. media byla kromě dvou variabilních míst ve vzdálenosti 175 bp a 286 bp nalezena jedna záměna nukleotidu, a sice ve vzdálenosti 552 bp sekvence AY101865 (Rønsted et al., 2002), znázorněné na Obrázku 39. Podrobné hodnocení sekvencí ve vzdálenostech 175 a 286 bp, na kterých je zaloţené hodnocení haplotypů pomocí restrikčního štěpení, je uvedeno v kapitole 5.2.1.3 HM region.
Obrázek 39.
Bodová mutace v ITS regionu druhu P. media
Rod Thymus Na základě štěpení IS regionu 5 druhů rodu Thymus – T. valesciacus (V), T. pulegioides (PG), T. praecox (PX), T. serpyllum (S) a T. pulcherrimus (PR) byly získány tři kategorie enzymů. První skupina pěti enzymů (HhaI, Hin1I, Hin6I, HPaII, SsiI), zahrnuje ty, které dokázaly segment rozštěpit odlišně, ale vzory zón získaných štěpením nebyly druhově specifické, neboť neposkytly shodné profily u více vzorků jednoho druhu. Příklad štěpení enzymem HpaII uvádí Obrázek 40 společně s ukázkou shodného štěpení pro všechny druhy enzymem SmaI.
107
Obrázek 40.
Elektroforeogram zachycující zóny vzniklé po štěpení fragmentu ITS u zástupců
odlišných druhů rodu Thymus enzymy SmaI a HPaII. Jedenáct restriktáz poskytovalo shodné zóny po štěpení pro všechny druhy (BsrBI, BsuRI, DpnII, HindIII, HinfI, KpnI, MnII, PvuII, SduI, SmaI, TaqI) a zbylých 15 enzymů ITS region nerozštěpilo vůbec. Variabilita ITS regionů detekovaných zástupců rodu Plantago se tedy jeví jako méně variabiliní v porovnání s druhy rodu Thymus, u kterých nebylo moţné ţádným z 31 restrikčních enzymu vysledovat druhově specifické vzory. Vysoká variabilita detekovaná v tomto rodě na mnoha úrovních – např. v počtu chromozomů (Stahl-Biskup a Sáez, 2002) či v oblastech obklopujících mikrosatelintní regiony (Landergott et al., 2006) byla experimenty v této disertační práci prokázána rovněţ v genech pro ribozomální RNA – ITS1regionu, 5,8S regionu a ITS2 regionu. 5.2.1.2 Region 5S Sekvence nukleotidů 336 bp velkého úseku DNA byla porovnána v programu Blast se všemi sekvencemi v databázi GenBank. Výsledky podobnosti sekvencí nukleotidů jsou uvedeny v Tabulce 29. Největší homologie (99 – 98 %) byla nalezena pro ostatní druhy rodu Plantago – P. rhodosperma a P. arenaria. Při 97% homologii však k druhům Plantago rugelii a Plantago ovata byla přiřazena sekvence druhu Actinidia chinensis a 96% homologie byla potvrzena také u taxonomicky vzdálených botanických druhů odlišných čeledí Camellia sinensis (Theaceae) a Byblis filifolia (Byblidaceae) společně s druhem P. lanceolata. Tato skutečnost potvrzuje vysokou konzervovanost 5S DNA sekvence pro ribozomální RNA, která je v říši rostlin tvořena 120 bp konzervativní sekvencí a 100 – 700 bp dlouhou sekvencí variabilní (Sastri et al., 1992).
108
Tabulka 29.
Homologie sekvencí 5S regionu porovnávané v databázi GenBank
GenBank kód AY684361.1 AY684360.1 AF464933.1 AY684363.1 AY684364.1 AY684362.1 AF464934.1 AF394581.1 AF394580.1 GU810494.1 AY101390.1 Z25804.1 AY304710.1 AY304586.1 AM482271.2 AM434093.1 AY312448.1 AY304742.1 AY304734.1 AY304732.1 AY304731.1 AY304730.1 AY304728.1 AY304714.1 AY304647.1 AY304642.1 AY896875.1 AY896871.1 AY896867.1 AY884258.1
Popis sekvence Plantago major 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Plantago lanceolata 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Plantago lagopus 5S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; a nepřepisovaný region, částečná sekvence Plantago rhodosperma 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Plantago arenaria 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Plantago rugelii 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Plantago ovata 5S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; a nepřepisovaný region, částečná sekvence Actinidia chinensis 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, kompletní sekvence Actinidia eriantha 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, kompletní sekvence Byblis filifolia 5S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; a 5S ribozomální RNA nepřepisovaný region genomická sekvence Camellia sinensis 5S ribozomální RNA gen, částečná sekvence; 5S ribozomální RNA gen, kompletní sekvence; a 5S ribozomální RNA gen, částečná sekvence
Homologie 100 % 96 % 94 % 99 % 98 % 97 % 97 % 97 % 96 % 96 % 96 %
B.vulgaris gen pro 5S rRNA Brassaiopsis moumingensis klon 8E 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Aralia kingdon-wardii 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence
95 %
Vitis vinifera VV78X190976.19, celá genomová shotgun sekvence
95 % 95 % 89 % 95 %
Vitis vinifera, celá genomová sekvence, VV78X250675.8, klon ENTAV 115 Amsonia kearneyana klon Ake-10 microsatellite sekvence Panax sinensis 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Oplopanax horridus 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Metapanax davidii 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Metapanax davidii 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Kalopanax septemlobus 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Hedera sinensis klon 32 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Dendropanax dentigerus 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Brassaiopsis hispida 5031 klon 8 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Brassaiopsis hispida 5031 klon 3 5S ribozomální RNA gen a nepřepisovaný region, částečná sekvence Vigna riukiuensis klon C10 5S ribozomální RNA gen, kompletní sekvence Vigna nakashimae klon C3 5S ribozomální RNA gen, kompletní sekvence Vigna umbellata var. gracilis 5S ribozomální RNA gen, kompletní sekvence Vigna angularis var. angularis 5S ribozomální RNA gen, kompletní sekvence
109
95 % 95 %
95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 % 95 %
Přítomnost amplikonu velkého 336 bp zahrnujícího 5S DNA a NTS2 (Obrázek 7) byla potvrzena u druhů rodu Thymus a druhů Plantago major a P. media. Obrázek 41 znázorňuje porovnání velikosti 5S regionu u druhu Plantago lanceolata, kde byl primery 5SF a 5SR amplifikován úsek přibliţně o 20 nukleotidů delší. Smolik et al. (2009) detekovali variabilitu v regionu za základě amplifikace 5S DNA a NTS1 a mezi šesti druhy rodu Thymus detekovali polymorfní zóny o velikosti 430 bp, 740 bp a 780 bp. Po amplifikaci úseku 5S DNA primery navrţenými v této disertační práci byl na gelové elektroforéze detekován výskyt dvou polymorfních zón. Amplikon o přibliţné velikosti 650 bp se vyskytoval u všech analyzovaných druhů. Nespecifické amplifikace se nepodařilo během optimalizace amplifikace odstranit. Detekci více zón odlišné velikosti potvrzují také Dhar et al. (2006), kteří po sekvenaci označili nespecifické amplifikace za zdvojené a ztrojené kopie základní opakující se jednotky 5S DNA.
Obrázek 41.
Amplifikace 5S regionu rodu Plantago
Zatímco pro amplifikaci rodu Thymus bylo dosaţeno optimální amplifikace fragmentů při pouţití kombinace MgSO4 a dimethylsulfoxidu v PCR reakci, pro rod Plantago se jeví jako vhodnější kombinace MgCl2 a tetramethylamonimum oxalátu. Koncentrace sloţek optimalizované PCR reakce jsou uvedeny v kapitole 4.2.3. DNA kódující 5S RNA, která je součástí velké ribozomální podjednotky, se u druhů rodu Thymus jevila jako více konzervativní neţ u rodu Plantago. Z 31 restrikčních enzymů 77,5 % 5S region druhů rodu Thymus neštěpilo vůbec a zbylých 7 enzymů (DpnII, Hin1II, MnII, SduI, SsiI, TaqI Tru1I) štěpilo všechny druhy ve stejných pozicích. U rodu Plantago bylo 77,5 % zastoupení enzymů neposkytujících štěpené fragmenty. Sedm enzymů dokázalo odlišit druh Plantago lanceolata a to tak, ţe buď štěpily shodně druhy P. major a P. media a druh P. lanceolata nikoli (EcoRI, HinfI, MnII, RsaI) nebo štěpily druh P. lanceolata jinak, neţ oba zbylé druhy (Tru1I, SduI, DpnII). Odlišení druhu P. lanceolata pravděpodobně 110
souvisí s evolucí jednotlivých druhů. Podle studie Rønsted et al. (2001) patří na základě analýzy chloroplastové DNA druhy P. major a P. media do shodné vývojové větve podrodu Plantago a druh P. lanceolata do podrodu Psyllium. Byly nalezeny dva enzymy – TaqI a SsiI, které po štěpení dokázaly poskytnout odlišné elektroforetické profily u všech druhů.
Obrázek 42.
Štěpení 5S regionu druhů rodu Plantago
111
5.2.1.3 Region HM Amplifikace 149 bp velkého HM regionu, který je součástí ITS1 regionu, proběhla u všech zkoumaných jedinců genových zdrojů druhu P. media specificky bez vedlejších produktů. Jednotlivým genotypům byly na základě výsledků restrikčního štěpení dvěma enzymy přiřazeny kombinace haplotypů, které publikoval Palermo et al. (2010). Označení haplotyp nebo-li haploidní genotyp se běţně pouţívá pro pohlavní buňky či haploidní rasy mikroskopických hub, ale v poslední době se tento pojem rozšířil a pouţívá se také pro jednotlivé varianty nalezených sekvencí (Sahin et al., 2007; Palermo et al., 2010). Jedinec diploidní má tedy dvě varianty haplotypu, jejichţ kvalita můţe být odlišná a jedince lze poté označit za heterozygotního. Následující Tabulka 30 shrnuje výskyt detekovaných haplotypů. Tabulka 30.
Sestavy haplotypů zástupců vybraných populací druhu Plantago media
detekovaných pomocí štěpení HM regionu restrikčními enzymy BanI a Tru1I Genotyp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Populace H Populace I Bílé Karpaty II, II III/IV, I V,V III/IV, I V,V II, V V,V II, V II, II II, V V,V II, V V,V III/IV, I V,V III/IV, I II, II II, V V,V III/IV, I V,V II, V V,V III/IV, I V,V III/IV, I V,V III/IV, I V,V III/IV, I
Populace E Populace C Populace B Populace A Populace J Moravský Kras Jizerské hory Šumava II, V III/IV, I II, II II, V II, V II, V II, II II, V II, V II, V II, V II, II II, V II, V II, V V, V II, II II, II II, V II, V V, V I, I II, II II, V II, V II, V V,V II, II II, V II, V II, V I, I II, II II, V II, V II, V II,V II, II II, V II, V II, V II,V II, II II, V II, V II, V I, I II, II II, V II, V II, II II,V II, II II, V II, V V, V II,V II, II II, V II, V II, II III/IV, I II, II II, V II, V II, V I, I II, II II, V II, V II, V II, II II, II II, V II, V
Ve třech populacích (A, I, J) nebyli nalezeni ţádní homozygotní jedinci a naopak v jedné populaci (H) se nevyskytoval ţádný heterozygot. Míra heterozygotnosti však v tomto případě nemá vypovídací hodnotu, jak je zřejmé z porovnání genotypově uniformích 100% heterozygotních populací A a J a homozygotní populace H. V obou populacích se vyskytují haplotypy II a V, ale u populací A a J je mohou do potomstva předávat všichni jedinci, zatímco v populaci H existují potenciální rodiče, kteří mohou předávat vţdy jen jednu variantu haplotypu. Z hlediska hodnocení genetické diverzity je nutné zohledňovat rovněţ frekvence jednotlivých haplotypů. Tyto hodnoty zvlášť pro kaţdou populaci a pro jednotlivé lokality zobrazují Obrázky 43 a 45.
112
Obrázek 43.
Hodnocení zastoupení haplotypů 7 populací druhu Plantago media
Z Obrázku 43 je zřejmé vysoké zastoupení haplotypů II a V, které se v různé míře vyskytovaly ve všech populacích. Naopak haplotypy I a III/IV byly nalezeny pouze u dvou populací a to u lokalit Bílé Karpaty – Brumov (I) a Moravský Kras (C) - Vilémovice sad. Tyto populace lze označit za vysoce variabilní, neboť u nich byly nalezeny všechny haplotypy. Velké uniformity dosahovaly populace B z Jizerských hor a H z Bílých Karpat, ve kterých převládaly homozygotní sestavy haplotypů. Genetická vzdálenost jednotlivých populací je zřejmá z Obrázku 44. Na základě Rogersových koeficientů genetické vzdálenosti vypočtených programem TFPGA nebyla potvrzena vyšší vzájemná podobnost populací ze stejných oblastí.
Obrázek 44.
Dendrogram vyjadřující genetické vzdálenosti jednotlivých populací
113
Obrázek 45.
Zastoupení haplotypů druhu Plantago media v jednotlivých CHKO
Haplotyp V byl nalezen ve všech oblastech ve vyrovnaném mnoţství a lze ho označit za obecně rozšířený. Haplotyp II se projevuje variabilní mírou výskytu. Tyto dva haplotypy se při hodnocení objevovaly s největší četností. U populací z okolí Jizerských hor je velmi rozšířen a v relativně malé frekvenci s hodnotou 0,2 se vyskytuje v Bílých Karpatech. Skutečnost, ţe populace z lokality Šumava byla genotypově uniformní, můţe souviset s počtem hodnocených jedinců (Tablka 23). V rámci projektu NAZV: "Mapování, konzervace a monitorování genofondu mizejících krajových forem kulturních rostlin a jejich planých příbuzných druhů" bylo z okolí oblasti CHKO Šumava vytipováno 7 lokalit, ale druh P. media se vyskytoval pouze na jediné, ve Velkém Boru (Dušková, 2008, pers. comm). Z dendrogramu na Obrázku 46 je patrné, ţe si nejvíce podobní byli jedinci z oblasti Moravského Krasu a Šumavy. Rogersův koeficient genetické vzdálenosti vychází z podobnosti frekvencí jednotlivých haplotypů. Populace z oblasti Šumavy s 50% zastoupením haplotypu II a 50% zastoupením haplotypu V, je nejbliţší frekvenci výskytu haplotypu II (0,42) a V (0,38) v oblasti Moravského Krasu. Největší genetickou vzdálenost od všech zbylých oblastí vykazovala oblast Bílé Karpaty.
Obrázek 46.
Dendrogram vyjadřující genetické vzdálenosti jednotlivých oblastí 114
Sekvenační analýzy Ověření restrikčního třídícího systému bylo provedeno pomocí sekvenování. Pomocí restrikčního štěpení bylo moţné roztřídit genotypy do čtyř kategorií, protoţe enzymy BanI a Tru1I štěpí sekvenci haplotypů III a IV ve stejných pozicích. Na Obrázku 47 jsou znázorněny výsledky sekvenačních analýz HM regionu genotypů zařazených do kategorie III/IV, I. Na základě sekvencí směsné kategorie III/IV, I bylo prokázáno, ţe zkoumaní jedinci I7, I8 a C1 mají sekvenci haplotypu IV. Tyto výsledky potvrdily niţší schopnost detekce variability restrikční metodou, avšak vzhledem k finanční náročnosti sekvenačních analýz, poskytují s jistými omezeními vhodný alternativní nástroj pro zachycení diverzity v populacích.
Obrázek 47.
Porovnání sekvencí HM regionů genotypů kategorie III/IV, I
Roztřídění jedinců mezi haplotypy II a V pomocí štěpení enzymů BanI a Tru1I bylo sekvenací ověřeno u všech testovaných vzorků. Heterozygotní sestava II/V byla při sekvenaci potvrzena výskytem překrývajících se píků. O přítomnosti obou haplotypů svědčí označení R na Obrázku 48, které vyjadřuje kombinaci adeninu a guaninu ve stejné pozici v sekvenci.
115
Obrázek 48.
Heterozygotní sestava haplotypu II/V
HM region je součástí ITS1 regionu. Mezidruhová variabilita ITS regionu byla prokázána v různé míře pouze 1/3 pouţitých enzymů, coţ by mohlo vést k závěrům, ţe polymorfismus tohoto regionu je u druhů rodu Plantago nízký. Při podrobnější analýze HM regionu u druhu P. media byla však dvěma enzymy detekována vnitropopulační i mezipopulační variabilita a je tedy zřejmé, ţe hodnocení polymorfismu je závislé jak na velikosti analyzované populace, tak na kombinaci pouţitých enzymů. Sekvenační analýzy v tomto případě poskytují spolehlivější a přesnější výsledky, přestoţe hodnocení heterozygotních sestav bývá komplikováno rozlišením pozadí (Andrade a Manolakos, 2003).
116
5.2.2 Mikrosatelitní analýzy 5.2.2.1 Rod Plantago Plantago major ssp. major Pomocí čtyř dinukleotidových mikrosatelitních lokusů (Tabulka 31) bylo při hodnocení tří populací středních Čech (R, U, X) detekováno 43 mikrosatelitních alel. V lokusu Pm6 bylo nalezeno 19 polymorfních alel, mikrosatelitní lokus JPm11 poskytoval 11 polymorfních alel, v lokusu Pm3 bylo mezi 147 genotypy jitrocele většího nalezeno 7 alel a lokus Pm5 byl charakterizován pomocí 6 odlišných alel. Vhodnost pouţití tandemových repetic pro markerování byla ověřena programem SERV (Sequence-vased Estimation of Repeat Variability). VARscore opakujícícho se motivu koreluje s variabilitou repetice a markery pro hodnocení polymorfismu jsou vhodné, vyskytuje-li se VARscore v rozmezí 1 aţ 3 (Legendre et al., 2007). Vzhledem k tomu, ţe druh P. major nepatří mezi běţně analyzované genetické modely a seznam mikrosatelitních lokusů je velmi omezený, byly pouţity i tři lokusy s VARscore pod hranicí 1. Tabulka 31.
Charakteristiky mikrosatelitních lokusů pro druh Plantago media Lokus PM3 PM5 PM6 JPM11
Velikost (bp) 120 202 93 198
Motiv (CT)18 (CT)22 (GA)11 (CA)24
VARscore 1,04375 0,89408 0,95467 0,83569
Lokality Vinařícká hora – lom (R), Pchery – souvrať pole (U) a Suchdol ČZU – sekaný trávník (X) byly vybrány s ohledem na odlišnou úroveň antropogenního vlivu a na odlišnou historii vzniku populací. Dno etáţového lomu představuje lokalitu, kde probíhá přirozený výběr. Populaci na souvrati pole ošetřeným herbicidem lze povaţovat za populaci, u které došlo k prudkému poklesu jedinců a je očekáváno sníţení genetické diverzity. U populace na Suchdole, kde dochází k pravidelné selekci genotypů náchylných ke kosení, jsou podpořeny genotypy s krátkou dobou kvetení a odolné sešlapu. Mikrosatelitní lokusy jsou povaţovány za selekčně neutrální (Selkoe a Toonen, 2006), přestoţe byl sledován jejich vliv na regulaci genové aktiviy a organizaci chromatinu (Li et al., 2002) nebo dědičné choroby u lidí způsobené mutací v repetitivním lokusu (Ranum a Day, 2002). Selekční neutralita mikrosatelitního lokusu můţe být ovlivněna genetickým draftem pokud mikrosatelit sousedí s místem, které selekci podléhá a dojde k tzv. svezení 117
(hitchhiking) (Mäkinen et al., 2008). Pokud však vycházíme ze selekční neutrality těchto markerů, mají mikrosatelitní data vypovídací hodnotu o populačně genetických procesech probíhajících v jednotlivých populacích jako jsou tok genů a jeho bariéry, efektivní velikost populace a variabilita populací v rámci odchylek od Hardy-Weinbergovy rovnováhy (Berglund et al., 2006; Dunbar-Co a Wieczorek, 2011). Statistické vyhodnocení bylo provedeno programem TFPGA v kombinaci s programem Cervus 3.0, který dokáţe rovněţ vypočítat polymorfní informační index a frekvenci výskytu nulové alely. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 32, která zahrnuje základní populačně genetické parametry pro všechny tři populace z odlišných lokalit. Tabulka 32.
Populačně genetické parametry pro druh Plantago major
Lokalita Lokus Vinařice lom (R) Pchery souvrať pole (U) Suchdol sekaný trávník (X)
Pm3 Pm5 Pm6 JPm11 Pm3 Pm5 Pm6 JPm11 Pm3 Pm5 Pm6 JPm11
Počet detekovaných alel
Zjištěná heterozygotnost
Očekávaná heterozygotnost
(H0)
(HE)
7 6 17 11 3 4 5 4 4 3 8 5
0,244 0,244 0,387 0,755 0,224 0,166 0,142 0,836 0,551 0,326 0,673 0,530
0,749 0,686 0,755 0,780 0,237 0,314 0,260 0,647 0,507 0,483 0,720 0,693
PIC
Frekvence výskytu nulové alely
Panmiktický index (f)
0,700 0,644 0,730 0,744 0,215 0,295 0,247 0,569 0,461 0,396 0,680 0,633
0,499 0,445 0,311 0,014 0,015 0,353 0,354 -0,134 -0,032 0,186 0,027 0,139
0,673 0,643 0,487 0,032 0,053 0,470 0,452 -0,293 -0,086 0,324 0,065 0,235
Počet polymorfních mikrosatelitních alel a heterozygotnost Největší počet alel ve všech lokusech byl získán u populace pocházející z lučního porostu dna etáţového lomu ve Vinařicích (R). Počet polymorfních alel na této lokalitě byl u 30 jedinců hodnocen také v experimentu Čílové et al. (2009), kdy bylo v lokusu Pm5 detekováno stejné mnoţství alel, v lokusu Pm3 o jednu více a v lokusu Pm11 o 2 alely méně. V této populaci bylo analýzou čtyř mikrosatelitních lokusů celkem detekováno 41 alel. Přibliţně poloviční počet alel (20) byl těmito markery nalezen v populaci rostlin pocházejících ze Suchdola (X) a nejniţší počet – 16 alel bylo zaznamenáno v roční populaci, vzniklé z půdní zásoby a náletu ze souvratě pole u obce Pchery (U). Obrázek 49 znázorňuje analýzu mikrosatelitního lokusu JPm11 u 49 vzorků populace ze dna etáţového lomu památky Vinařická hora (R). 118
Obrázek 49.
Ukázka výstupu analýzy mikrosatelitního lokusu JPm11 na populaci R
Z hlediska počtu alel byla nejvyšší míra polymorfismu detekována v lokusu PM6. Ukázku referenčních vzorků pro správné přiřazení jednotlivých alel v rámci populací, a tím pádem také veškerý počet získaných alel pro daný lokus, představuje Obrázek 50.
Obrázek 50.
Přehled sestavy detekovaných alel pro lokus PM6 ve všech populacích
Při hodnocení rozloţení alel v jednotlivých lokusech, které je zřejmé z Obrázků 51 – 54 a z Tabulky 33, se jeví jako nejvariabilnější lokus JPm11. V tomto lokusu byla u populace U ze souvratě pole zjištěna nejvyšší hodnota heterozygotnosti, a sice 83,67 %. Také pro populaci ze sousedícího katastrálního území obce Vinařice (R) byl tento lokus s podílem heterozygotů 75,51 % nejvíce variabilním. U populace X ze Suchdola byl největší podíl heterozygotů nalezen pro lokus Pm6. V lokusu JPm11 bylo u této populace nalezeno 53,06 % heterozygotů, coţ je pro tuto populaci druhá největší heterozygotnost, která však byla o 14 aţ 38 % větší neţ heterozygotnosti lokusu Pm6 v populacích z lomu u Vinařic. 119
Z tohoto hodnocení vyplývá, ţe lokus s největším počtem alel nemusí být hodnocen jako nejvíce variabilní. Počet detekovaných alel je závislý na počtu hodnocených jedinců (Kikuchi a Isagi, 2002) a variabilita populace záleţí nejen na počtu detekovaných alel, ale na jejich rozloţení a kombinaci v genomech jedinců analyzované populace (Cole, 2005). Nejméně variabilním lokusem byl lokus Pm5, u kterého byl nalezený nejmenší počet detekovaných alel i nejmenší podíl heterozygotních jedinců, který se pohyboval v intervalu od 17 do 32 %. Frekvence výskytu nulové alely Záporná hodnota frekvence nulové alely je vypočtena tehdy, pokud je zjištěný podíl heterozygotů větší neţ očekávaný. V tomto experimentu byl získaný podíl heterozygotů (HO) větší neţ očekávaný (HE) v lokusu JPm11 u populace U a Pm3 populace X. Největší pravděpodobnost výskytu nulové alely byla vypočtena pro lokusy Pm3 a Pm5 u populace R. Nejmenší pravděpodobnosti výskytu nulové alely se vyskytují u lokusů populace X ze Suchdola. Jako nejvíce náchylný lokus pro výskyt nulové alely pro všechny populace jeví lokus Pm5. Polymorfní informační index (PIC) Hodnoty tohoto indexu statisticky hodnotící informativnost markeru se pohybovaly v rozmezí 0,21 - 0,744. Z průměrných hodnot nalezených pro jednotlivé lokusy JPm11 (0,649), Pm6 (0,552), Pm5 (0,445) a Pm3 (0,459) vyplývá, ţe za nejvíce informativní lze označit lokus JPm11. Hodnocení rovnováhy v populacích Nejmenší rozdíly hodnot heterozygotnosti očekávané (HE) a heterozygotnosti získané (HO), ze kterých získáme přehled o stavu H-W rovnováhy v populaci, byly nalezeny u populace ze sečeného trávníku na Suchdole (X). Tato populace i přes evidentní podporu genotypů adaptovaných na pravidelné sečení trávníku se nejvíce blíţí panmiktické populaci, coţ potvrzuje selekční neutralitu mikrosatelitních markerů (Selkoe a Toonen, 2006). U populace ze dna lomu ve Vinařicích (R) byl detekován malý rozdíl heterozygotností pouze v lokusu JPm11. Ke stejným výsledkům dospěli také Čílová et al. (2009). Velké rozdíly se projevily mezi hodnotou očekávanou u zbylých mikrosatelitních lokusů - Pm3, Pm5 a Pm6, která byla několikanásobně větší neţ získaná. Niţší hodnoty získané heterozygotnosti oproti očekávané mohou být způsobeny výskytem nulových alel (Freeland, 2005), jejichţ největší pravděpodobnost výskytu byla v polovině lokusů detekována právě u této populace. 120
Niţší frekvence získané heterozygotnosti v lokusech Pm5 a Pm6 u populace ze souvrati pole v obci Pchery lze vysvětlit tzv. efektem zakladatele populace, kdy dojde k zaloţení nové populace malým počtem jedinců, kteří s sebou přináší pouze omezenou část genetické variability původní populace (Mayr, 1963). Frekvence polymorfních mikrosatelitních alel u jednotlivých populací Heterogenita rozloţení alel v populaci je graficky znázorněná v následujících grafech, které uvádí frekvenci alel detekovaných u mikrosatelitních lokusů Pm3, Pm5, Pm6 a JPm11.
Obrázek 51.
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu Pm3
Obrázek 52.
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu Pm5
121
Obrázek 53.
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu Pm6
Obrázek 54.
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu JPm11
Z Obrázků 47 (Pm3) a 50 (JPm11) je patrný rozdíl mezi rozloţením alel u populací ze sousedících katastrálních území okresu Kladeno (R, U) a ze Suchdola (X). V lokusu Pm3 byla nejvíce se vyskytující alelou alela č. 2, na rozdíl od suchdolské populace, ve které se nejčastěji objevovala alela 3. Populaci X rovněţ odlišuje výskyt dvou alel - 6 a 17 v lokusu Pm6, které se ve zbylých populacích nevyskytují. Tento fakt vysvětluje rozdíl mezi celkovým počtem detekovaných alel 19 a počtem alel u populace R se 17 alelami. Výskyt odlišných alel je způsoben individuálním vývojem prostorově izolovaných populacích, ve kterých nedochází ke genovému toku. V lokusu JPm11 byla u všech populací nejčastější alela č. 8, ale jak v populaci X, tak v populaci Pchery – souvrať pole je vidět velké zastoupení ještě jedné alely 122
s vysokou četností, a sice alely 7 u populace X a alely 3 u populace U. V tomto lokusu jsou populace nejvíce odlišné. Vysoká proměnlivost alel v populaci R i malá četnost alel v populaci U je zřejmá ze všech čtyř grafů. Z hlediska počtu a frekvence jednotlivých alel v populaci se jeví jednoznačně nejvíce variabilní populace z bývalého lomu ve Vinařicích a nejméně polymorfní roční populace z okraje pole sousedícího katastrálního území obce Pchery. Frekvence alel v populacích poskytuje důleţitou informaci o historii populace a výsledky tohoto experimentu naznačují, ţe v populaci jitrocelů větších na okraji pole v obci Pchery mohlo v minulosti dojít k tzv. průchodu hrdlem láhve a fixaci určitých alel při zmenšení populace (Leberg, 2002). Homozygotní sestavy polymorfních mikrosatelitních alel u jednotlivých populací Programem TFPGA byla pro kaţdý lokus a populaci zjištěna nejčastěji se vyskytující homozygotní sestava alel získaná a podle Hardy-Weinbergova zákona očekávaná. Z Tabulky 33 vyplývá, ţe v lokusech Pm5, Pm6 a JPm11 byla zjištěna u všech populací největší četnost shodných alel a vzhledem k rychlosti mutageneze lze usuzovat, ţe se jedná o původní alely, které byly přítomny u vzniku druhu. Homozygotní sestava odpovídající alelické kombinaci 5/5 v lokusu P5m byla zjištěna u 38,77 % hodnocených rostlin v populaci R, 75,51 % rostlin v populaci U a 48,98 % v populaci X. V lokusu Pm6 se podíl homozygotů s alelickou sestavou 12/12 vyskytoval v rozmezí 22,44 % (populaceR) aţ 81,63 % (populace U) a relativně vyrovnaného procentuálního zastoupení homozygotní sestavy alel s kombinací 8/8 poskytoval lokus JPm11 s hodnotami od 16,32 % do 24,49 %. Tabulka 33. Populace Vinařice lom Pchery souvrať pole Suchdol trávník
Homozygotní sestavy alel lokusů Pm3, Pm5, Pm6, Pm11 Lokus
Nejvíce četný homozygotní genotyp
Zjištěný počet homozygotů (%)
Očekávaný počet homozygotů (%)
Frekvence alely v populaci (%)
Pm3 Pm5 Pm6 JPm11 Pm3 Pm5 Pm6 JPm11 Pm3 Pm5 Pm6 JPm11
3/3 5/5 12/12 8/8 2/2 5/5 12/12 8/8 3/3 5/5 12/12 8/8
26,53 38,77 32,65 16,32 75,51 75,51 81,63 16,32 44,89 48,98 22,44 24,49
13,48 23 21,08 14,24 75,22 67,06 73,47 20,16 45,35 42,65 22,04 17,51
36,73 47,96 45,92 37,76 37,76 82,29 85,71 44,90 67,35 65,31 46,94 41,84
123
Z dendrogramu na Obrázku 55 znázorňujícím genetickou vzdálenost třech populací vyplývá, ţe si geneticky méně vzdálené byly populace Vinařice - lom (R) a populace ze sekaného trávníku na Suchdole (X), neţ obě populace pocházející z Kladenska. Důvodem velké odlišnosti populace z okraje pole ve Vinařicích od obou zbylých je zřejmý jiţ z frekvence jednotlivých alel, které se především v lokusu Pm3 a Pm6 u populace U od zbylých populací velmi liší. Další potvrzením odlišného sloţení alel je patrné z Tabulky 27 shrnující nejčastěji se vyskytující homozygotní sestavu alel. Odlišnost sloţení alel v jednotlivých lokusech byla pravděpodobně zapříčiněná jiţ zmíněným efektem zakladatele populace, kdy došlo ke sníţení počtu jedinců v populaci herbicidem Roundup, který byl v bezprostřední blízkosti lokality aplikován v roce 2008.
Obrázek 55.
Dendrogram
vyjadřující
genetické
vzdálenosti
alelických
mikrosatelitních lokusů Pm3, Pm5, Pm6 a JPm11 u druhu Plantago major
124
sestav
Plantago lanceolata Třemi mikrosatelitními lokusy bylo hodnoceno 25 zástupců odrůdy Libor (populace L v Tabulce 7) a bylo detekováno 29 alel. Vlastnosti mikrosatelitních lokusů uvádí Tabulka 34. Program SERV nedokáţe odhadnout VARscore u sloţených mikrosatelitů. Tabulka 34.
Charakteristiky mikrosatelitních lokusů pro druh Plantago lanceolata Lokus Pll1 Pll8 Pll11
Velikost (bp) 158 – 180 171 – 203 182 – 270
Motiv (TA)4 A(GC)6(AC)10 (CT)17 (TC)15
VARscore 1,07347 1,10324
Odrůda Libor patří mezi tetraploidní odrůdy, coţ bylo potvrzeno detekcí více neţ dvou alel u 60 % genotypů. Statistické programy pro zpracování výstupů z mikrosatelitních analýz nedokáţí pracovat s polyploidním genomem (De Silva et al., 2005). Důvodem pro nemoţnost vyhodnocení jsou zřejmé z kombinace sestav 3 alel, u kterých nelze poznat, jedná-li se o triploidního jedince, který náhodně vznikl zkříţením diploidní a tetraploidní rostliny či tetraploidní rostlinu s jedním lokusem homozygotním. Určit, který ze tří lokusů v případě tetraploidního genotypu by byl homozygotní, není reálné. Variabilita odrůdy vyplývá z Tabulky 35, ve které jsou uvedeny sestavy alel pro jednotlivé mikrosatelitní lokusy. Nejvariabilnějším lokusem z hlediska počtu alel byl s 16 nalezenými alelami lokus Pll11. V tomto lokusu bylo nalezeno pět jedinců se třemi detekovanými alelami a jeden jedinec se čtyřmi. Byli detekováni tři homozygotní jedinci a dohromady byly objeveny dvě alely – 5 a 13 v homozygotní sestavě. V lokusu Pll8 bylo detekováno devět alel. Alelu č. 7 lze označit jako nejvíce rozšířenou a u 32 % hodnocených rostlin byla jedinou alelou v homozygotní sestavě. Nebyl nalezen ţádný jedinec se čtyřmi odlišnými alelami, ale tři jedinci s kombinací 3 alel. Nejméně polymorfním lokusem byl lokus Pll1, ve kterém byly nalezeny pouze čtyři alely. Odrůda Libor se jeví v tomto lokusu velmi vyrovnaně, kdy všichni jedinci aţ na jediného heterozygota byli vţdy alespoň v jedné alele homozygotní. Odlišnost vzorku č. L71 dokazuje Obrázek 56.
125
Obrázek 56.
Detekce alelických sestav odrůdy Libor v lokusu Pll1
Tabulka 35.
Sestava nalezených kombinací alel zástupců odrůdy Libor v lokusu Pll11 Genotyp L51 L52 L53 L54 L55 L56 L57 L58 L59 L60 L61 L62 L63 L64 L65 L66 L67 L68 L69 L70 L71 L72 L73 L74 L75
Pll11 4/9/13 4/8/11/15 5/14 4/8 10/12 5/13 5/8 5/13 5/13 5 7/9/14 5/14 5/13 10/13 13 5/13 5/16 13 3/6 3/7 1/13 11/13/14 7/13 3/14/15 2/5/7
Pll8 3/7 4/7 2/3/6 7 3/7 3/8 7 7 3/7 5/8 3/8/9 7 1/4/8 3/7 7 7 7 7 3/7 3/7 3/7 3/7 5/7 3/7 4/7
Pll1 3/4 3/4 3/4 3/4 3/4 3/4 3/4 3/4 3/4 1/3/4 1/3/4 1/3/4 1/3/4 1/3/4 1/3/4 1/3/4 1/3/4 1/3/4 3/4 3/4 1/2/3/4 3/4 3/4 3/4 3/4
Počty jednotlivých alel byly obdobné jako v experimentu s rostlinami regenerovanými in vitro. Vysoká variabilita odrůdy Libor ve dvou lokusech můţe být vysvětlena cizosprašností druhu Plantago lanceolata. Jedná se o odrůdu typu populace, kdy v kaţdé generaci vznikají nové genotypy. Hale a Wolff (2003) při studiu 17 rostlin zaznamenali v lokusu Pll11 pouze 10 alel, coţ však můţe souviset s tetraploidním cytogenetickým 126
základem odrůdy a počtem hodnocených jedinců (Leberg, 2002). Téměř stejná variabilita v přirozené populaci 30 rostlin z lomu ve Vinařicích, u které se předpokládá diploidní sada chromozomů, byla nalezena v pokusech Čílové et al. (2009), kteří detekovali u druhu Plantago lanceolata L. v lokusu Pll1 4 alely, v lokusu Pll8 13 alel a v lokusu Pll11 20 alel. Hodnocení genetické variability regenerovaných rostlin Analýzou tří mikrosatelitních lokusů Pll1, Pll8 a Pll11 bylo mezi 88 regenerovanými rostlinami
odrůdy
Libor
(L)
pocházejících
ze
sedmi
mateřských
genotypů
a
28 regenerovanými rostlinami osiva Planta naturalis (P) ze čtyř mateřských genotypů bylo nalezeno 8 genotypů, které se v daném lokusu lišily od mateřské rostliny. V lokusu Pll1 byly mezi jedenácti mateřskými rostlinami a jejich regeneranty nalezeny 4 alely, v lokusu Pll8 bylo nalezeno 8 alel a v lokusu Pll11 bylo detekováno 17 polymorfních alel. Regenerované rostliny se v lokusech Pll1 a Pll8 shodovaly v alelických sestavách s mateřskými, které jsou uvedené v Tabulkách 36 a 37. Na Obrázku 57 jsou zvýrazněné alely detekované v lokusu Pll8. Tabulka 36. Sestavy alel mateřských genotypů v lokusu Pll1 Lokus Pll1 Rostlina L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 P1 P2 P3 P4 Alelická sestava 2/4 2/3 2/3/4 3/4 2/3 2/4 2/4 3/4 1/3 3/3 3/3 Tabulka 37. Sestavy alel mateřských genotyů v lokusu Pll8 Lokus Pll8 Rostlina L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 P1 P2 P3 P4 Alelická sestava 3/6/8 2/6 2/6 2/8 3/7 2/5/8 3/6 1/1 2/2 1/1 4/4
Obrázek 57. Detekce alel mikrosatelitního lokusu Pll8 u mateřských genotypů
127
Z Tabulky 38, ve které jsou uvedeny genotypy, u kterých byla detekována jiná sestava alel neţ u mateřských rostlin, je patrné, ţe všechny změny genotypů proběhly v lokusu Pll11. Tabulky 39 a 40 uvádí konkrétní sestavy detekovaných alel v lokusu Pll11. V tomto lokusu byla u odrůdy Libor nalezena somaklonální variabilita u 7,95 % regenerovaných rostlin, zatímco mezi diploidními regenerovanými rostlinami se tento jev vyskytoval u 3,57 %. Mikrosatelitní lokus Pll11 lze tudíţ označit jako vhodný marker pro hodnocení somaklonální variability. Změna stability genomu v mikrosatelitních sekvencích při in vitro mnoţení v rodě Plantago doposud nebyla sledována, ale u ostatních druhů dospěli autoři k obdobným závěrům. Odlišné bylo pouze mnoţství aplikovaných mikrosatelitních lokusů, kdy byla detekována somaklonální variabilita jedním či dvěma mikrosatelitními markery z 10, resp. 25 testovaných markerů (Rahman a Rajora, 2001; Ryu et al., 2007). Rahman a Rajora (2001) detekovali somaklonální variabilitu u 7,76 % jedinců druhu Populus tremuloides Michx. vzniklých in vitro mikropropagací z vegetativních pupenů a u Ryu et al. (2007) zaznamenali odlišné alely u 12 % rostlin Capsicum annuum L. regenerovaných z děloţních explantátů. Tabulka 38. Přehled regenerantů lišících se od mateřské rostliny Matka L1 L2 L3 L4 L5 L6 L8 P1 P2 P3 P4
Pll 1 -
Pll 8 -
Pll 11 L1/2 L3/4; L3/7 L4/14 L5/2 L6/1; L6/13 P2/2 -
Tabulka 39. Alelické sestavy mateřských genotypů v lokusu Pll11
Rostlina Alelická
Lokus Pll11 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 P1 P2 P3 P4 6/13 5/11 8/13/16 4/13 6/10 7/14 7/12 1/6 2/15 1/17 16/17
sestava Tabulka 40. Alelické sestavy genotypů regenerovaných rostlin lišících se od mateřských Lokus Pll11 Rostlina L1/2 L3/4 L3/7 L4/14 L5/2 L6/1 L6/13 P2/2 Alelická sestava 6/12 8/12/16 8/16 4/14 6/9 7/15 5/14 3/15 128
Z genotypů mateřských rostlin tetraploidní odrůdy Libor bylo v lokusu Pll1 charakterizováno 90 % jedinců dvěma alelami, v lokusu Pll8 82 %. U zbylých jedinců byly detekovány v obou lokusech tři alely. U jedinců s vyhodnocenými třemi alelami je předpokládán výskyt jedné alely v homozygotní sestavě. U diploidního osiva Planta naturalis jsou jedinci s jednou alelou povaţováni za homozygoty se dvěma shodnými alelami (např. genotyp P4 v lokusu Pll11 se sestavou 3/3). Lokus Pll11postihující polymorfismus regenerovaných rostlin poskytoval 17 alel. Z Tabulek 39 a 40 vyplývá, ţe u 4 regenerovaných rostlin - L1/2, L3/4, L5/2 a L6/13 došlo k prodlouţení mikrosatelitního motivu. Ve třech případech, u genotypů – L4/14, L6/1 a P2/2 došlo naopak ke zkrácení repetice. Genotyp L3/7 vykazoval pouze dvě alely na rozdíl od tří alel u rostliny mateřské a všech ostatních regenerantů.
Obrázek 58.
Ukázka alely regenerovaného genotypu L4/14 v lokusu Pll11 zkrácené
o jedno opakování mikrosatelitního motivu (TC)
Obrázek 59.
Ukázka sestavy alel regenerovaných rostlin genotypu L6 v lokusu Pll11
129
5.2.2.2 Rod Thymus Hodnocení genových zdrojů odlišných druhů rodu Thymus Třemi mikrosatelitními markery E089, D257 a D347 bylo detekováno 36 alel u 37 zástupců 6 druhů, resp. poddruhů polní kolekce genových zdrojů rodu Thymus. Alely lokusu E089 byly označeny A1-A7, alely lokusu D257 nesly označení B1-B14 a alely lokusu D347 C1-C15. Tabulka 41.
Popis mikrosatelitních lokusů pro rod Thymus Lokus E089 D257 D347
Velikost (bp) 124 – 142 73 – 142 104 - 163
Motiv (GAA) (AG) (GA)(GAA)
Frekvence jedinců s diploidními a polyploidními sestavami alel hodnocených lokusů U 34 rostlin (n=37) byla zjištěna přítomnost vţdy pouze dvou alel u všech mikrosatelitních lokusů E089, D257 a D347. U tří jedinců byl zjištěn výskyt alespoň jednoho lokusu s vyšším počtem alel neţ 2. Jedná se o následující genotypy: Thymus valesciacus (A2A7 B6B8B12B14 C8C15) Thymus pulegioides L. (A4A5A7 B8B13 C3C9C13C14) Thymus pulegioides L. (A5A7 B1B6B14 C4C9C10C12). Je patrné, ţe ke zvýšení počtu alel došlo pouze u 8,1 % hodnocených rostlin a to pouze u dvou populací. Výskyt tří, respektive čtyř variabilních alel alespoň pro jeden genotyp je charakteristický pro všechny tři hodnocené mikrosatelitní lokusy. U druhu Thymus valesciacus se nepodařilo zjistit bliţší informace o jeho karyotypu. Z provedených molekulárních analýz vyplývá, ţe u jednoho jedince (vzorek č. 3) zřejmě došlo k alloploidii – lokus D257 je zde prezentován čtyřmi B alelami. Thymus pulegioides L. je diploidní druh (2n = 28). U dvou jedinců (vzorky č. 36 a 47) byly zjištěny polyploidní počty a to rovnou ve dvou mikrosatelitních lokusech E089 a D347 respektive D257 a D347. Z porovnání alelických sestav v lokusu D347 (vţdy 4 různé alely) u dvou zástupců Thymus pulegioides L. vyplývá moţná hypotéza, ţe tito jedinci vznikli na základě alloploidie a jedná se tudíţ o tetraploidní genotypy. V lokusu E089 respektive D257 se u těchto genotypů vyskytují vţdy tři odlišné alely. Přítomnost tří odlišných alel by teoreticky nasvědčovala moţnému triploidnímu genotypu. Tuto hypotézu je však moţné spolehlivě vyloučit jiţ zmiňovanou analýzou lokusu D347, který je vţdy charakteristický čtyřmi různými alelami. Přítomnost 130
pouze tří alel u lokusů D257, respektive E089 si lze vysvětlit tím, ţe jeden z lokusů je přítomen v homozygotní sestavě a jedná se tudíţ rovněţ o tetraploidní genotyp. Provedené genetické analýzy jednoznačně nepotvrdily předpoklad, ţe Thymus praecox Opiz. s karyotypem somatické buňky obsahujícím 54 chromozómů je alloploidním druhem. Původní hypotéza o výskytu alel u tohoto druhu byla taková, ţe v lokusech by se teoreticky měly vyskytovat čtyři různé alely. Pro analýzu byly pouţity pouze dvě rostliny. Ani u jedné z nich se nepodařilo detekovat více neţ dvě alely v lokusu. Tetraploidní charakter materiálu však nelze vyloučit z důvodů teoreticky moţných homozygotních sestav polyploidních lokusů. Ani jeden z programů TFPGA a Cervus 3.0. nedokáţe hodnotit polyploidní genotypy. Nelze tudíţ ani jednoznačně vypočítat frekvence jednotlivých alel a proto byli zástupci s detekovaným vyšším počtem alel ze statistického hodnocení vyřazeni. Frekvence polymorfních mikrosatelitních alel u jednotlivých populací Na následujících grafech je uveden přehled polymorfních alel, které byly detekovány u mikrosatelitních lokusů E089, D257 a D347.
Frekvence alel v lokusu E089 (%) 50
T. pulcherriumus subsp. sudeticus
Obrázek 60.
A2
A3
3,57
A1
16,67
50
25
T. praecox
T. valesciacus
71,43 33,33
T. serpyllum
T. pulegioides subsp. chamaedrys
7,14
7,14
T. pulegioides
50
75
12,5 6,25 8,33
25
A4
81,25 8,33
A5
16,67
41,67
A6
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu E089
131
A7
10,71
Frekvence alel v lokusu D257 (%)
10,71
10,71
3,57
16,67
16,67 25
50
6,25 6,25 6,25
12,5
12,5
12,5
6,25
25
8,33
16,67
16,67
16,67
16,67
T. valesciacus
12,5
6,25 6,25 6,25 6,25
T. pulegioides subsp. chamaedrys
14,29
16,67
16,67
25
T. praecox
10,71
7,14
7,14
10,71
33,33
T. serpyllum
Obrázek 61.
3,57
14,29
7,14
T. pulegioides
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
B13
B14
50
50
T. pulcherriumus subsp. sudeticus
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu D257
Frekvence alel v lokusu D347 (%) T. pulcherriumus subsp. sudeticus
25
C7
C8
18,75
18,75
33,33
C9
C10
C11
C12
12,5
6,25
16,67
14,29
25
8,33
C6
3,57 3,57
25
C5
12,5
12,5
C4
8,33
C3
18,75 8,33
Obrázek 62.
C2
10,71 33,33
50
T. pulegioides subsp. chamaedrys
C1
14,29
16,67
T. praecox
T. valesciacus
50
50
T. serpyllum
7,14
7,14 3,57 3,57 3,57 3,57
T. pulegioides
50
25
C13
C14
C15
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu D347
Trinukleotidový mikrosatelit E089 se 7 odlišnými alelami prokazoval jednoznačně nejniţší variabilitu. Pro dinukleotidový lokus D257 bylo detekováno 14 polymorfních alel. Nejvyšší stupeň variability prokázal mikrosatelitní D347 s počtem 15 alel.
132
Frekvence jedinců s homozygotní sestavou alel hodnocených mikrosatelitních lokusů Homozygotní sestava alel v lokusu E089 byla zjištěna u 38,24 % všech hodnocených rostlin. Všechny homozygotní sestavy odpovídaly alelické kombinaci A5A5. Homozygotní sestavy byly zjištěny u následujících druhů: Thymus pulegioides L. subs. chamaedrys (Fries) Gusul., Thymus pulegioides L. a Thymus serpyllum L. emend. Miller. Homozygotní sestava alel v lokusu D257 byla detekována u 5,88 % všech hodnocených rostlin. Polovina homozygotů vykazovala alelickou kombinaci B5B5 (Thymus pulegioides L.) a druhá polovina kombinaci alel B8B8 (Thymus pulegioides L. subs. chamaedrys (Fries) Gusul.). Homozygotní sestava alel v lokusu D347 byla nalezena rovněţ u 5,88 % všech hodnocených rostlin. Polovina homozygotů byla charakteristická alelickou sestavou C9C9 a druhá polovina sestavou C12C12. Homozygotní sestavy v tomto lokusu byly zjištěny pouze u botanického druhu Thymus serpyllum L. emend. Miller. Přítomnost dvou homozygotních lokusů byla zjištěna vţdy u jednoho zástupce Thymus pulegioides L. subs. chamaedrys (Fries) Gusul. (genotyp A5A5B8B8C8C13) a Thymus pulegioides L. (genotyp A5A5B8B8C11C14). Výskyt homozygotních jedinců ve dvou lokusech pouze u těchto dvou populací lze vysvětlit tím, ţe obě populace byly zastoupeny největším počtem hodnocených rostlin. Z hlediska původu lze tyto populace povaţovat za prostorově dostatečně izolované. Rostliny Thymus pulegioides L. subs. chamaedrys (Fries) Gusul. pochází z výsevu semen, který byl realizován na Lékařské fakulty Masarykovy univrzity v Brně Kraví Hoře. Druhá populace Thymus pulegioides L. byla získána sběrem v několika přirozených lokalitách v oblasti Krušných hor, Doupovských vrchů a Moravskoslezských Beskyd (Obrázek 16). Z tohoto pohledu lze vyvodit hypotézu, ţe homozygotní sestava A5A5 mikrosatelitního lokusu E089 by mohla být geneticky konzervovaná u různých poddruhů Thymus pulegioides L. Druhy, u kterých nebyla zjištěna homozygotní sestava alel u ţádného ze tří pouţitých mikrosatelitních markerů jsou následující: Thymus valesciacus a Thymus pulcherrimus subsp. sudeticus Lyka P. A. Schmidt. Tato skutečnost je zajímavá zejména z pohledu druhu Thymus valesciacus, u kterého bylo hodnoceno celkem 6 rostlin. Z Obrázků 60 - 62 vyplývá, ţe v lokusu E089 bylo detekováno 5 polymorfních alel, v lokusu D257 6 polymorfních alel a v lokusu D347 rovněţ 6 polymorfních alel. Všech 6 jedinců Thymus valesciacus bylo moţno pomocí těchto markerů vzájemně odlišit. Současně nebyla detekována ani jedna homozygotní sestava, která je charakteristická pro inbrední populace. Z těchto výsledků vyplývá fakt, ţe rostliny pocházející ze sbírek lékařské fakulty Masarykovu univerzity, nepředstavují soubor 133
klonovaných rostlin, jedná se o geneticky variabilní populaci, u které lze předpokládat pohlavní způsob rozmnoţování a šíření. Další druhem, u kterého nebyl zjištěn výskyt ţádných homozygotních alelických sestav byl Thymus pullcherimus subsp. sudeticus Lyka P. A. Schmidt. Tato skutečnost vyplývá zejména z nízkého počtu hodnocených rostlin – Tabulka 10. U druhu Thymus praecox Opiz. byly detekovány vţdy dvě alely u kaţdého lokusu, které by teoreticky mohly odpovídat heterozygotní sestavě alel. Z cytogenetických studií u tohoto druhu vyplývá, ţe se jedná o alloploidní gynodioický druh (2n = 54) a proto se lze přiklonit k hypotéze, ţe se jedná o homozygotní sestavy alel a kaţdá alela je současně v karyotypu reprezentována čtyřmi kopiemi. Genetické podobnosti mezi hodnocenými druhy rodu Thymus Pro zpracování genetických podobností alelických kombinací v mikrosatelitních lokusech E089, D257 a D347 byl pouţit program TFPGA. Postup zaloţený na vyhodnocení binární datové matice RAPD polymorfismů, který u léčivých rostlin pouţili např. Pióro-Jabrucka et al. (2007) a Vašíčková et al. (2009), umoţnil pouhý odhad genetické podobnosti na základě Diceho podobnostních koeficientů.
Obrázek 63.
Dendrogram
vyjadřující
genetické
vzdálenosti
alelických
sestav
mikrosatelitních lokusů E089, D257 a D347 u hodnocených zástupců rodu Thymus Z dendrogramu vyplývá, ţe nejmenší genetickou vzdálenost vykazovaly Thymus pulegioides L. subs. chamaedrys (Fries) Gusul. a Thymus pulegioides L. – u kterých byla hodnota koeficientu podle Rogers (1972) pouze 0,1596. Tento výsledek koreluje rovněţ s taxonomickými a cytogenetickými charakteristikami (Slavík et al., 2000). Jedná se o poddruh se shodným karyotypem (2n = 28). Další diploidní druh Thymus serpyllum L. emend. Miller (2n = 24) vykazoval oproti předchozí dvojici druhů genetickou vzdálenost 134
odpovídající koeficientu 0,3914. Největší genetickou vzdálenost od druhů s relativně nízkým počtem chromozómů (Thymus pulegioides L. subs. chamaedrys (Fries) Gusul. a Thymus pulegioides L.) vykazoval Thymus praecox Opiz. s 2n = 54 (Slavík et al., 2000). Tyto výsledky se shodují s rozdělením druhů, které na základě počtu chromozomů publikovali Mártonfi a Mártonfiová (1996), kteří řadí druh T. pulegioides do podsekce Alternantes, T. serpyllum do podsekce Serpyllum a T. praecox s T. pulcherrimus do podsekce Pseudomarginati. Statistické
hodnocení
závislosti
mezi
počtem
detekovaných
polymorfních
mikrosatelitních alel a počtem jedinců v populaci Vztah mezi velikostí populace, biodiverzitou a adaptační schopností byl zkoumán řadou autorů, např. Kaene et al. (1999). Výrazné zredukování velikosti populace obvykle okamţitě vyvolává sníţení biodiverzity a následné sníţení fitnes. Tato skutečnost se týká rovněţ kolekcí genových zdrojů původních planých druhů, které byly introdukovány z původních lokalit do sbírkových kolekcí genových bank (Chloupek, 2000). Variabilní počet rostlin u jednotlivých hodnocených druhů rodu Thymus byl vyuţit pro sledování závislosti počtu detekovaných alel a počtem jedinců v populaci. Pomocí regresní a korelační analýzy uvedené na grafu 9, bylo jednoznačně potvrzeno, ţe se vzrůstajícím počtem jedinců v populaci vzrůstá i počet alel mikrosatelitních lokusů E089, D257a D347. Zjištěná hodnota korelačního koeficientu r = 0,9709 odpovídá velmi těsné závislosti.
Obrázek 64.
Statistické hodnocení závislosti počtu detekovaných mikrosatelitních
alel na počtu analyzovaných jedinců
135
Hodnocení genových zdrojů druhu Thymus pulegioides L. Pěti mikrosatelitními markery E070, E089, D257, D346 a D347 bylo detekováno 59 alel u vybraných populací polní kolekce genových zdrojů druhu Thymus pulegioides L. Tabulka 42.
Popisné informace mikrosatelitních lokusů a počet detekovaných alel
u druh Thymus pulegioides L. Lokus E070 E089 D346 D347 D257
Velikost 125 - 155 124 - 142 82 - 146 104 - 163 73 - 142
Motiv Počet detekovaných alel (GA) 10 (GAA) 3 (AG) 8 (GA)(GAA) 20 (AG) 18
Přítomnost vţdy pouze dvou alel u všech mikrosatelitních lokusů E070, E089, D346, D347 a D257 byla zjištěna u 32 rostlin dvou populací z Beskyd (Mionší a Ochmelovské vrchy). U dalších 32 jedinců ze dvou populací z Krušných hor (Vysoká Pec a Měděnec) byly nalezeny dvě alely pro mikrosatelitní lokusy E070, E089, D347 a D257, zatímco pro lokus D346 byly zaznamenány 3 alely. U třetí krušnohorské populace (Horní Blatná) bylo mnoţství nalezených alel pro jednotlivé lokusy stejné jako u dvou předchozích, pouze u jednoho genotypu (3526/7) byly detekovány 3 alely pro lokusy E070 a E089. U populace Okruhlá z Beskyd byla zjištěna přítomnost dvou alel pro lokusy E089 a D257, zatímco u zbývajících 3 mikrosatelitních lokusů byly u všech jedinců detekovány 3 alely. Přítomnost 3 alel detekovaných více mikrosatelitními lokusy u stejných jedinců naznačují zvětšenou sadu chromozomů a z tohoto důvodu byla ve spolupráci s Botanický ústavem AV ČR, v.v.i. v Průhonicích ověřena ploidní úroveň rostlin v jednotlivých populacích. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 43. Metodou průtokové cytometrie byla stanovena odlišná ploidie populace Horní Blatná z Krušných hor, jejíţ jedinci byli na základě porovnání fluorescence obsahu jader označeni jako tetraploidní a populace Okruhlá z Beskyd byl detekován triploidní stav genomu.
136
Tabulka 43.
Stanovení stupně ploidie metodou průtokové cytometrie na základě porovnání
relativní fluorescence (Index) standardu (S) a zástupců populací T. pulegioides a kvalita měření metody (CV) Populace KH – Měděnec KH – Horní Blatná KH – Vysoká Pec B – Ochmelovské vrchy B – Okruhlá B – Mionší S (Bellis perenis L.)
Index 0,398 0,689 0,370 0,365 0,543 0,369 0,382
CV T 5,77 2,26 5,69 2,06 2,40 4,09 2,16
CV B 3,22 2,28 1,70 1,08 1,40 2,32 2,24
určení 2x 4x 2x 2x 3x 2x 2x
KH – Krušné hory, B – Beskydy, CV T - variační koeficient vrcholu pro rostliny Thymus, CV B - variační koeficient vrcholu pro rostliny Bellis perenisL.
Přestoţe polyploidizace byla popsána u řady druhů tohoto rodu (Landergott et al., 2006; Mártonfi a Mártonfiová, 1996), druh Thymus pulegioides L. je doposud popisován jako druh diploidní (2n = 28) (Jalas, 1948; Mártonfi a Mártonfiová, 1996; Stahl-Biskup a Sáez, 2002). Sekundární základní chromozomové číslo x = 14 a x = 15 vyskytující se v tomto rodě má pravděpodobně původ v základním čísle x = 7. Velikost chromozomů (1 – 2 µm) značně komplikuje mikroskopická pozorování. Nejvíce frekventované počty chromozomů jsou 28, 30, 56 a 60 a všechny ostatní jsou důsledkem aneuploidie, která velmi ovlivnila vývoj druhů v tomto rodě (Morales, 2002). Druh Thymus pulegioides L. patří do sekce Serpyllum, která má své centrum původu na Balkánském poloostrově a k expanzi zmiňovaného druhu pravděpodobně došlo při rozšíření do Karpatské a Panonské oblasti (Mártonfi a Mártonfionvá, 1996) společně s druhy
T.
serpyllum
a
T.
pannonicus.
O
mezidruhové
hybridizaci
druhu
Thymus pulegioides L. referuje Čáp (1979), který popisuje 3 kříţence tohoto druhu a sice hybridní rostliny s tetraploidním druhem T. praecox (2n =54) a dvěma diploidiními druhy T. serpyllum (2n = 30) a T. pulcherrimus (2n = 24). Triploidní populace Okruhlá tedy mohla vzniknout hybridizací s tetraploidním druhem T. praecox, zatímco vznik tetraploidní populace Horní Blatná mohl být zapříčiněn hybridizací s druhem T. serpyllum nebo T. pulcherrimus. Rostliny populace Okruhlá i Horní Blatná nesly morfologické rozlišovací znaky druhu Thymus pulegioides L. – kamtodromní ţilnatinu na listech, sympodiální větvení a alelotrichní odění stonku, a zatímco u populace Okruhlá nebyla sledována tvorba semen, tak populace Horní Blatná je schopna se generativně mnoţit. 137
Obrázek 65.
Detekce polymorfních alel v lokusu D257 lokalit z Beskyd
Přestoţe vegetativní mnoţení se v přirozených podmínkách běţně neděje a reprodukce probíhá pomocí semen (Gouyoun et al., 1986), během meiózy se mohou tvořit multivalenty, coţ často vede k nesouměrnosti gamet a sníţení fertility (Gottschalk, 1976). Triploidní rostliny z populace Okruhlá mohly vznikat hybridizací s tetraploidním druhem T. praecox a vzhledem k sterilitě triploidních hybridů, je mnoţení vegetativní cestou pro tu to populaci jediné dostupné. Neschopnost triploidních rostlin tvořit semena souvisí také s defektním endospermem (Kuiper a Bos, 1992). K rozšíření vysoce konkurenceschopného genotypu mohlo dojít jiţ na samotné lokalitě v CHKO Beskydy a rostliny přenesených do genobanky mohly být klony. Vzhledem k polyploidnímu cytogenetickému základu nebyla do statistického hodnocení zahrnuta celá populace rostlin Okruhlá z Beskyd (3530). U populace Okruhlá byly ve všech mikrosatelitních lokusech detekovány heterozygotní sestavy alel, které byly pro
všechny
jedince
populace
shodné
(E070/5-E070/6-E070/9,
E089/2-E089/3,
D346/1-D346/4-D346/7, D347/6-D347/11-D347/13 a D257/8-D257/17). Na Obrázku 61 je znázorněná uniformita populace Okruhlá v porovnání se zbylými variabilními populacemi z Beskyd při hodnocení mikrosatelitního lokusu D257.
Jiţ v předchozích analýzách při zjišťování mezidruhové variability byly u jedné rostliny z lokality Horní Blatná zjištěny 4 různé alely naznačující tetrapliodní stav genomu. Při podrobnějších analýzách této populace byl mezi 16 jedinci byl detekován polyploidní 138
počet alel u jednoho zástupce (3526/7) ve třech lokusech a sestava alel byla následující: E070/5-E070/7-E070/9, E089/1-E089/2-E089/3, D346/1-D346/4-D346/7. Tento genotyp nebyl zahrnut do statistického hodnocení. Na Obrázku 66, který zachycuje polymorfní alely lokusu E089 u populací z Krušných hor, je zvýrazněný zmiňovaný genotyp se třemi alelami. Vzhledem k tomu, ţe u ostatních jedinců nebyl v ţádném mikrosatelitním lokusu detekován větší počet alel, bylo provedeno statistické pomocí programů Cervus 3.0 a TFPGA.
Obrázek 66.
Přehled aleického složení zástupců krušnohorských populací v lokusu E089
Pro mikrosatelitní lokus E089 se jednalo o jediný genotyp s více neţ 2 alelami, zatímco u lokusu E070 byla sestava teoreticky odpovídající triploidnímu genotypu nalezenena také pro všechny jedince populace z Okruhlé. Alely E070/5 a E070/9 jsou u těchto jedinců společné a právě jejich kombinace s další alelou, pokaţdé jinou, naznačuje náchylnost genotypu E070/5-E070/9 k hybridizaci. Tento genotyp se však vyskytoval pouze v jedné kopii v populaci Ochmelovské vrchy v Beskydech. Ve zbývajících dvou lokusech byla detekována sestava alel D347/18-D347/19 a D257/13-D257/18. Alela D347/18 nebyla detekována u ţádného jiného zástupce analyzovaného druhu. Frekvence polymorfních mikrosatelitních alel u jednotlivých populací Frekvence výskytu alel pro lokus D346 nebyla hodnocena u 4 populací, neboť se u nich objevovala uniformní sestava alel D346/1-D346/4-D346/7. Kromě populace v Okruhlé vykazovaly nízkou míru polymorfismu všechny tři populace z Krušných hor. Alela D346/7 se nevyskytovala ani v jedné z variabilních populací, u kterých byly nalezeny 2 alely, coţ potvrzuje hypotézu vzniku populace v Okruhlé alloploidií.
139
Největší počet nalezených alel v tomto lokusu byl 6 u populace Ochmelovské vrchy, ve které se vyskytoval pouze jediný homozygot a frekvence jednotlivých alel byla následující: D346/2 (3,125 %), D346/3 (12,5 %), D346/4 (12,5 %), D346/5 (34,375 %), D346/6 (34,375 %) a D346/8 (3,125 %). Mezi zástupci této populace se nacházel jeden homozygotní jedinec. Dvě alely pro kaţdý genotyp v tomto lokusu byly detekovány také u populace Mionší, ve které bylo dohromady detekováno 5 alel s frekvencemi: D346/1 (9,375 %), D346/4 (3,125 %), D346/5 (21,875 %), D346/6 (53,125 %) a D346/8 (12,5 %). Homozygotní sestava alel byla nalezena u 7 jedinců. Na následujících grafech je uveden přehled polymorfních alel, které byly detekovány u mikrosatelitních lokusů E070, E089, D257 a D347.
Frekvence alel v lokusu E070 (%) B - Mionší
15,63 21,88
25
10
46,88 36,67
43,75
E070/3
E070/4
6,25 20
43,75
E070/5
E070/6
E070/7
E070/8
6,25 3,13
Obrázek 67.
E070/2
6,67
21,88
3,33 3,33 3,33
KH - Měděnec
E070/1
37,5 40,63
16,67
25
3,13
KH - Vysoká Pec KH - Horní Blatná
28,13
3,13 3,13 3,13
B - Ochmelovské vrchy
9,38
12,5
E070/9
E070/10
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu E070
Dinukleotidový mikrosatelitní lokus E070 poskytoval 10 polymorfních alel. Z Obrázku 67 je zřejmé, ţe alela E070/4 se vyskytuje pouze v Krušných horách, zatímco E070/1 pouze v Beskydech. Naopak nejvíce rozšířenou alelou, která byla přítomna ve všech populacích, je alela E070/6. Z grafu je patrný niţší polymorfismus krušnohorské populace Měděnec, ve které se vyskytovaly pouze 3 polymorfní alely.
140
Frekvence alel v lokusu E089 (%) B - Mionší
90,63
B - Ochmelovské vrchy
78,13
3,13
KH - Vysoká Pec
9,38
KH - Horní Blatná
12,5
96,88 16,67
76,67
KH - Měděnec
6,67
100 E089/1
Obrázek 68.
9,38
E089/2
E089/3
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu E089
Nejméně polymorfním lokusem byl lokus E089, ve kterém se 61 z 80 hodnocených jedinců vyskytovala homozygotní sestava alel E089/2-E089/2. Největší variabilita byla zachycena u populací Ochmelovské vrchy a Horní Blatná. Tři nalezené alely nejsou specificky vázány na území CHKO.
Frekvence alel v lokusu D347 (%)
9,38 30 9,38
46,88
3,13
10
6,25
6,25
3,13
9,38
9,38
21,88
6,67 3,33
16,67
12,5
50
10
3,33 3,33 6,67 3,33 6,67 43,75
3,13
KH - Horní Blatná
21,88
6,25
34,38
Obrázek 69.
12,5
6,25
KH - Vysoká Pec
KH - Měděnec
25
3,13 3,13
12,5
3,13 6,25
B - Ochmelovské vrchy
21,88
6,25 3,13
B - Mionší
D347/1 D347/2 D347/3 D347/4 D347/5 D347/6 D347/7 D347/8 D347/9 D347/10 D347/11 D347/12 D347/13 D347/14 D347/15 D347/16 D347/17 D347/19 D347/20
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu D347
Pro lokus D347 bylo nalezeno 20 alel, ale v grafu je zahrnuto hodnocení pouze 19 z nich, neboť alela D347/18 se vyskytuje pouze u vyřazeného vzorku 3526/7. Populací s největším počtem polymorfních alel byla populace Ochmelovské vrchy u které bylo detekováno 13 alel. Pouze 3 polymorfní alely byly zjištěny u populace Měděnec. Alela D347/19 byla detekována pouze u populací z Krušných hor a přestoţe se alely D347/6 a D347/13 v grafu zobrazují také pouze v Krušných horách, v Beskydech byly 141
detekovány u populace Okruhlá, která není zahrnuta do grafického znázornění. Mezi alely, které byly detekovány pouze mezi zástupci populací z Beskyd patří: D347/2, D347/10, D347/12, D347/15 a D347/20.
Frekvence alel v lokusu D257 (%)
21,88
3,13
18,75
10
3,33 3,33
30 18,75
9,38
6,25
6,25
37,5 10 21,88
9,38
6,25
15,63 12,5
6,25 3,13 3,13
3,13
9,38
3,13
20
18,75
6,67 3,33
6,67
Obrázek 70.
3,13
KH - Měděnec
31,25 6,67
KH - Horní Blatná
9,38
KH - Vysoká Pec
15,63
12,5
15,63
15,63
6,25 3,13 3,13
25
6,25 3,13
B - Ochmelovské vrchy
6,25 3,13 6,25
B - Mionší
D257/1 D257/2 D257/3 D257/4 D257/5 D257/6 D257/7 D257/8 D257/9 D257/10 D257/11 D257/12 D257/13 D257/14 D257/15 D257/16 D257/17 D257/18
Frekvence alel v mikrosatelitním lokusu D257
Pro tento dinukleotidový lokus byly u všech zástupců detekovány vţdy pouze dvě alely a zároveň skladba alel jedinců v tomto lokusu poukazuje na vysokou různorodost ve všech populacích. Alely D257/2 a D257/13 lze díky jejich zastoupení v kaţdé populaci hodnotit jako alely se všeobecným rozšířením. Alely D257/3, D257/4, D257/6, D257/10, D257/15 byly přítomny pouze v lokalitách z Krušných hor a naopak pouze v Beskydech se vyskytovaly alely D257/12, D257/18. V následující Tabulce 44 je znázorněn polymorfismus mikrosatelitních lokusů vyjádřený počtem detekovaných alel v jednotlivých populacích. Přestoţe je lokalita Okruhlá vykazovala uniformitu ve všech mikrosatelitních lokusech, celkový počet alel detekovaných v Beskydech všchemi mikrosatelitními markery byl o 13 větší neţ u krušnohorských populací, kde bylo těmito markery nalezeno 40 alel. Z lokalit v Krušných horách bylo nejvíce polymorfních alel nalezeno u populace Horní Blatná a v Beskydech u lokality Ochmelovské vrchy.
142
Počet detekovaných alel v jednotlivých lokalitách
Tabulka 44.
Populace Ochmelovské vrchy Okruhlá Mionší Měděnec Horní Blatná Vysoká Pec
E070 7 3 5 3 8 5
E089 3 2 2 1 3 2
D346 6 3 5 3 3 3
D347 13 3 8 3 11 4
D257 10 2 11 9 10 6
Na vysokou variabilitu v populacích poukazují výsledky shrnuté v Tabulce 45, ze kterých vyplývá, ţe po 10 letech uchovávání genových zdrojů v polních kolekcích nedochází v populacích k inbreedingu vzhledem k panmiktickému indexu (f < 0) pro většinu lokusů (Loeschcke et al., 1994). Vyšší zjištěná heterozygotnost neţ očekáváná byla nalezena v mikrosatelitním lokusu D257 u všech zkoumaných populací. V ostatních mikrosatelitních lokusech byla detekována vţdy u jedné populace, u které byla očekávaná heterozygotnost niţší. Tabulka 45.
Základní populačně genetické parametry pro druh T. pulegioides L. Zjištěná
Lokalita Ochmelovské vrchy
Mionší
Měděnec
Horní Blatná
Vysoká Pec
Očekávaná
Frekvence
výskytu Lokus heterozygotnost heterozygotnost PIC nulové alely (H0) (HE) E070 0,875 0,754 0,685 -0,0977 E089 0,438 0,377 0,335 -0,1135 D347 0,938 0,911 0,872 -0,0336 D257 1 0,889 0,846 -0,077 E070 1 0,802 0,741 -0,1285 E089 0,188 0,175 0,155 -0,0423 D347 0,688 0,847 0,797 0,698 D257 1 0,889 0,847 -0,0793 E070 0,875 0,621 0,516 -0,1995 E089 0 0 0 D347 0,875 0,599 0,489 -0,2138 D257 1 0,861 0,813 -0,0932 E070 0,8 0,807 0,752 -0,0108 E089 0,467 0,393 0,342 -0,1232 D347 1 0,874 0,829 -0,0939 D257 0,933 0,862 0,816 -0,0583 E070 1 0,629 0,532 -0,2655 E089 0,063 0,063 0,059 -0,0075 D347 0,875 0,639 0,551 -0,1844 D257 1 0,76 0,696 -0,1689
143
Panmiktický index
f -0,16048 -0,1618 -0,02964 -0,12486 -0,24688 -0,07429 0,187721 -0,12486 -0,40902 -0,46077 -0,16144 0,008674 -0,1883 -0,14416 -0,08237 -0,58983 0 -0,36933 -0,31579
5.2.3 RAPD analýzy 5.2.3.1 Rod Thymus Kvantita a kvalita izolované DNA Výtěţnost DNA po modifikovaném postupu (Landergott et al., 2006) izolace kitem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Německo) z 30 mg vysušených listů se pohybovala v intervalu 0,1 – 1 µg. Tato výtěţnost je oproti výtěţnosti garantované výrobcem izolační sady o dva řády niţší, coţ souvisí s vysokým obsahem inhibičních látek obsaţených v silici (Li et al., 2008). Vazby flavonoidů, fenolů a polysacharidů na molekulu DNA znesnadňují izolaci a narušují následné molekulární reakce (Abu-Romman, 2011). Při izolaci docházelo k hnědnutí DNA, které je způsobeno nevratnou oxidací polyfenolů buněčnými oxidázami při lýzi buněk (Varma et al., 2007). Modifikace dle Landergotta et al. (2006) je zaloţena na přídavku polyvinylpyrolidonu (PVP), který na sebe váţe polyfenolické látky. Poměrem absorbancí A260/A280 vyhodnocující kontaminaci proteiny se pohybovala v intervalu 1,69 – 1,91, čímţ byla potvrzena čistota vyizolované DNA. Hodnocení vnitrodruhové variability Pro hodnocení variability mezi 6 populacemi bylo pouţito 5 RAPD markerů, kterými bylo detekováno 95 zón. Marker OPA17 poskytoval 15 polymorfních zón, marker OPD2 - 18, OPM4 - 21, OPN11 - 24 a markerem OPP14 bylo detekováno 17 polymorfních zón. Průměrný počet RAPD fragmentů na jeden marker je 19, coţ je hodnota téměř dvakrát vyšší neţ hodnota uváděná autory, kteří pouţili metodu RAPD k detekci variability v posledních letech (Vankatachalam et al., 2007; Verma et al., 2009; Prakash et al., 2011). Tento rozdíl je ovlivněný počtem analyzovaných genotypů, který byl ve studiích zmíněných autorů poloviční (Prakash et al., 2011) a čtvrtinový (Vankatachalam et al., 2007; Verma et al., 2009). Na základě souhrnného elektroforeogramu sloţeného z polymorfních zón všech 95 analyzovaných jedinců byly pro jednotlivé populace vypočteny průměrné Diceho koeficienty podobnosti. Sestava RAPD zón získaných amplifikací markerem OPM4 je znázorněna na Obrázku 71.
Obrázek 71.
Detekované RAPD zóny všech genotypů markerem OPM4 144
Výpočet Diceho podobnostních koeficientů v kombinaci s metodou RAPD je pro detekci vnitrodruhové a mezidruhové variability běţně pouţívaný algoritmus (Duarte et al., 1999) a pro hodnocení variability příbuzného druhu Thymus caespititius jej vyuţili Trindade et al. (2009). Průměrné hodnoty Diceho koeficientů pro analyzované populace původem z Krušných hor (KH) a Beskyd (B) uvádí Tabulka 46. Tabulka 46.
Základní
statistické
charakteristiky
při
výpočtu
průměrného
Diceho
podobnostního koeficientu genových zdrojů druhu T. pulegioides L.
3525 3526 3529 3530 3532 3535
Populace KH - Měděnec KH - Horní Blatná B - Ochmelovské vrchy B - Okruhlá B - Mionší KH - Vysoká Pec
N – počet porovnávaných dvojic; maximální detekovaná podobnost
N 120 120 120 120 120 120
65,44 59,29 60,16 95,97 66,72 70,37
Sm. odch. 8,57 9,09 11,33 4,31 9,32 7,22
Min. 45,70 35,50 27,50 84,10 45,50 46,70
Max. Rozptyl 88,90 73,47 82,00 82,55 91,50 128,35 100,00 18,61 87,70 86,90 88,10 52,20
– průměrný Diceho koeficient, Min. – minimální detekovaná podobnost, Max. –
Průměrné hodnoty Diceho podobnostních koeficientů pro druh T. pulegioides vypočtené pro jednotlivá území CHKO byl 65,03 pro populace z Krušných hor a 73,62 pro populace z Beskyd. Menší míra polymorfismu zachycená pro CHKO Beskydy byla ovlivněna populací Okruhlá. K obdobným výsledkům dospěli Pióro-Jabrucka et al. (2007), kteří metodou RAPD hodnotili variabilitu osmi populací druhu T. pulegioides a průměrná hodnota podobnosti byla vypočtena na 73,94 % při pouţití koeficientů dle Neie (Nei a Li, 1979), totoţných s Diceho koeficienty. U příbuzného druhu Thymus vulgaris detekovali Echeverrigaray et al. (2001) mezi šesti odrůdami druhu variabilitu 63,8 % vypočtenou na základě Euklidových podobnostních koeficientů. Euklidovy koeficienty podobnosti vychází pouze z elektroforetických zón, ve kterých se jedinci liší, z čehoţ vyplývají niţší hodnoty podobnosti. Nejvyšší hodnota podobnosti a tudíţ nejniţší variabilita populace byla detekována u beskydské populace Okruhlá, u které byla detekována hodnota 95,97 %. Vysoké hodnoty Diceho koeficientů podobnosti (80 % - 90 %) jsou typické pro zástupce, u kterých převládá vegetativní způsob rozmnoţování, zatímco pro druhy cizosprašné s generativním způsobem rozmnoţování, mezi které se druh T. pulegioides řadí, se průměrné hodnoty Diceho koeficientů pohybují v rozmezí 60 - 70 % (Vašíčková et al., 2009a). Za klony se povaţují rostliny, které mají hodnoty Diceho podobnostních koeficientů větší neţ 95 % (Dice, 1945). 145
Hypotéza o variabilní populaci Okruhlá vyvrácena analýzou mikrosatelitních lokusů, která potvrdila genotypovou uniformitu populace, byla vyvrácena rovněţ RAPD metodou. Dvouvýběrovým t-testem pro nezávislé soubory v programu Statistica9 byl detekován statisticky významný rozdíl na hladině významnosti α = 0,05 mezi výběrovými průměry populace Okruhlá a průměry všech ostatních populací. Tabulka 47.
Výsledky t-testu porovnávající průměry populace Okruhlá a ostatních populací
Průměr Průměry populace ostatních Okruhlá populací 93,97 65,44 Okruhlá / Měděnec 93,97 59,29 Okruhlá / Horní Blatná 93,97 60,16 Okruhlá / Ochmelovské vrchy 93,97 66,72 Okruhlá / Mionší 93,97 70,37 Okruhlá / Vysoká Pec
Populace
t
SV
p
32,58 37,77 30,56 29,06 30,73
238 238 238 238 238
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Sm. odch. Sm. odch. populace ostatních Okruhlá populací
4,31 4,31 4,31 4,31 4,31
8,57 9,09 11,33 9,32 7,22
SV – stupně volnosti, t – hodnota t-testu
Porovnání průměrných Diceho podobnostních koeficientů bylo provedeno pro všechny populace a z výsledků uvedených v Tabulce 48 vyplývá, ţe se od sebe statisticky významně nelišily populace Horní Blatná z Krušných hor a Ochmelovské vrchy z Beskyd. Obě populace v patřičných CHKO představovaly na základě hodnocení RAPD profilů nejvíce variabilní populace. Tabulka 48.
Výsledky t-testu porovnávající jednotlivé populace druhu T. pulegioides
Populace KH - Měděnec / KH - Horní Blatná KH - Měděnec / B - Ochmelovské vrchy KH - Měděnec / B - Okruhlá KH - Měděnec / B - Mionší KH - Měděnec / KH - Vysoká Pec KH - Horní Blatná / B - Ochmelovské vrchy KH - Horní Blatná / B - Okruhlá KH - Horní Blatná / B - Mionší KH - Horní Blatná / KH - Vysoká Pec B - Ochmelovské vrchy / B - Okruhlá B - Ochmelovské vrchy / B - Mionší B - Ochmelovské vrchy / KH - Vysoká Pec B - Okruhlá / B - Mionší B - Okruhlá / KH - Vysoká Pec B - Mionší / KH - Vysoká Pec - průměr první skupiny,
65,44 65,44 65,44 65,44 65,44 59,29 59,29 59,29 59,29 60,16 60,16 60,16 93,97 93,97 66,72
59,29 60,16 93,97 66,72 70,37 60,16 93,97 66,72 70,37 93,97 66,72 70,37 66,72 70,37 70,37
t 5,39 4,07 -32,58 -1,11 -4,82 -0,65 -37,77 -6,25 -10,45 -30,56 -4,90 -8,33 29,06 30,73 -3,39
- průměr druhé skupiny, SV – stupně volnosti, t – hodnota t-testu
146
SV 238 238 238 238 238 238 238 238 238 238 238 238 238 238 238
p 0,00 0,00 0,00 0,27 0,00 0,51 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
5.2.3.2 Rod Plantago Plantago media Při hodnocení genových zdrojů druhu Plantago media bylo analyzováno 15, resp. 14 zástupců deseti populací původem ze okolí čtyř území CHKO. Pomocí 3 RAPD markerů bylo detekováno 80 polymorfních zón. Největší počet amplikonů - 29 poskytoval marker OPA17, marker OPA11 poskytoval 26 RAPD zón a markerem OPM5 bylo detekováno 25 polymorfních profilů. Do hodnocení byly zahrnuty specifické RAPD zóny vetší neţ 1000 bp, které se vyskytovaly vţdy ve dvou opakováních amplifikace. Průměrné Diceho koeficienty podobnosti pro jednotlivé populace byly detekovány v rozmezí 48,67 – 66,52 % a základní popisné statistiky pro jednotlivé populace jsou shrnuty v Tabulce 49. Diceho koeficienty vypovídají o míře polymorfismu uvnitř jednotlivých populací a jejich porovnáním lze hodnotit variabilitu mezi populacemi. Tabulka 49.
Základní
statistické
charakteristiky
při
výpočtu
průměrného
Diceho
podobnostního koeficientu genových zdrojů druhu Plantago media
Populace JH - Libíč JH - Rydvaltice MK - Vilémovice sad MK - Sad u hájovny MK - Křtiny MK - Vilémovice louky MK - Hádecká planina BK - Březová BK - Brumov S - Velký Bor
Popisné statistiky Diceho podobnostních koeficientů N Min. Max. Rozptyl Sm.odch. 105 56,06 35,80 68,80 42,73 6,54 105 48,68 14,80 68,70 163,48 12,79 105 61,00 39,40 77,10 49,37 7,03 105 57,68 38,10 80,60 54,80 7,40 91 66,52 48,60 81,50 44,91 6,70 105 61,06 31,40 81,80 85,83 9,26 105 57,53 40,60 75,30 52,29 7,23 105 61,50 44,80 80,60 60,00 7,75 105 59,55 36,40 81,20 84,31 9,18 105 48,67 30,30 61,80 44,69 6,68
Průměrný Diceho koeficient pro druh Plantago media ssp. longifolia byl v rámci tohoto experimentu stanoven na 57, 71 %. Tato hodnota svědčí o velké vnitrodruhové rozmanitosti, neboť průměrné hodnoty Diceho koeficientu pro cizosprašné rostliny byla stanovena na 61,07 % (Vašíčková et al., 2009a). Vysoká pozorovaná variabilita by mohla souviset se spontánní polyploidizací druhu, o které v přirozených populacích ve Španělsku, Holandsku, Velké Británii a v Rusku referují Van Dijk a Van Delden (1990), Van Dijk a Bakx-Shotman (1997) a Ishikawa et al. (2009). U rostlin jednotlivých populací přenesených do genobanky nebyla ploidie ověřována. Van Dijk (1991) a Van Dijk et al. (1992) upozorňují na kompletně oddělenou dobu kvetení pro tetraploidní a diploidní populace. Populace v polní 147
kolekci genové banky v Olomouci kvetly společně a pravděpodobnost, ţe by na všech původních lokalitách došlo k polyploidizaci či rozšíření tetraploidních populací je velmi nízká. Lze předpokládat původní diploidní sestavy genomů těchto genových zdrojů, kdy 2n = 12 (Slavík et al., 2000). Variabilita ve velikosti listů, délce stvolů, ochlupení a zabarvení listů mezi populacemi byla vizuálně pozorována jiţ při odběru rostlinného materiálu, 2 roky po přenesení rostlin z původních lokalit. Veliká různorodost populací je pravděpodobně odrazem individuálního vývoje rostlinných společenstev na jednotlivých lokalitách, který vychází ze způsobu rozmnoţování tohoto druhu. Plantago media patří mezi rostliny striktně cizosprašné a opylování probíhá pomocí větru (Van Dijk a Bijlsma, 1994). U příbuzného druhu P. lanceolata byl stanoven tok pylu řádově na metry (Bos et al., 1986; Kuiper a Bos, 1992) a vzhledem k tomu, ţe pyl druhu P. media je cca o 25 % menší (Klimko et al., 2004), lze předpokládat, ţe opylování u tohoto druhu probíhá vţdy v rámci dané lokality. Ze vzdáleností původních lokalit uvedených v Tabulce 8 (kapitola Metodika 4.1.1.1) je patrné, ţe mezi populacemi nemohl probíhat genový tok, neboť nejméně odlehlé lokality Moravského Krasu - Vilémovice sad a Hádecká planina byly lokalizovány ve vzdálenosti 940 m a populace lze tudíţ povaţovat za vzájemně izolované. Nejniţší hodnoty Diceho podobnostního koeficientu a tedy nejvyšší míra polymorfismu byla sledována u populace z Velkého Boru na Šumavě a u populace Rydvaltice z Jizerských hor. Tyto populace lze označit za nejvíce variabilní genetické zdroje, neboť u nich byla detekována o 9 % niţší míra podobnosti neţ u průměrné hodnoty zjištěné pro tento druh. Mezi populace s mírou variability odpovídající průměrným hodnotám detekovaným pro daný druh patří populace Libíč (JH), Sad u hájovny (MK) a Hádecká planina (MK). Statisticky významný rozdíl mezi průměry jednotlivých populací byl hodnocen t-testem dvou nezávislých výběrů a výsledky shrnuje Tabulka 50. U obou výše zmíněných populací s nejvyšší mírou variability byla pozorována statisticky významná odlišnost od všech ostatních populací. Další populací, u které byl detekován statisticky významný rozdíl mezi průměry se všemi ostatními populacemi, byla populace jitrocelů prostředních z populace Křtiny z Moravského Krasu. Pro tuto populaci byla detekována 66,52% podobnost a v daném experimentu ji lze označit jako neméně variabilní. Vzhledem k tomu, se tyto hodnoty běţně vyskytují u dalších rostlinných cizosprašných druhů (Vašíčková et al., 2009a), lze i tuto populaci označit jako polymorfní genový zdroj a doporučit uchování.
148
Tabulka 50.
Výsledky t-testu dvou nezávislých výběrů populací druhu Plantago media L. Porovnávané populace
JH - Libíč vs. JH - Rydvaltice JH - Libíč vs. MK - Vilémovice sad JH - Libíč vs. MK - Sad u hájovny JH - Libíč vs. MK - Křtiny JH - Libíč vs. MK - Vilémovice louky JH - Libíč vs. MK - Hádecká planina JH - Libíč vs. BK - Březová JH - Libíč vs. BK - Brumov JH - Libíč vs. S - Velký Bor JH - Rydvaltice vs. MK - Vilémovice sad JH - Rydvaltice vs. MK - Sad u hájovny JH - Rydvaltice vs. MK - Křtiny JH - Rydvaltice vs. MK - Vilémovice louky JH - Rydvaltice vs. MK - Hádecká planina JH - Rydvaltice vs. BK - Březová JH - Rydvaltice vs. BK - Brumov JH - Rydvaltice vs. S - Velký Bor MK - Vilémovice sad vs. MK - Sad u hájovny MK - Vilémovice sad vs. MK - Křtiny MK - Vilémovice sad vs. MK - Vilémovice louky MK - Vilémovice sad vs. MK - Hádecká planina MK - Vilémovice sad vs. BK - Březová MK - Vilémovice sad vs. BK - Brumov MK - Vilémovice sad vs. S - Velký Bor MK - Sad u hájovny vs. MK - Křtiny MK - Sad u hájovny vs. MK - Vilémovice louky MK - Sad u hájovny vs. MK - Hádecká planina MK - Sad u hájovny vs. BK - Březová MK - Sad u hájovny vs. BK - Brumov MK - Sad u hájovny vs. S - Velký Bor MK - Křtiny vs. MK - Vilémovice louky MK - Křtiny vs. MK - Hádecká planina MK - Křtiny vs. BK - Březová MK - Křtiny vs. BK - Brumov MK - Křtiny vs. S - Velký Bor MK - Vilémovice louky vs. MK - Hádecká planina MK - Vilémovice louky vs. BK - Březová MK - Vilémovice louky vs. BK - Brumov MK - Vilémovice louky vs. S - Velký Bor MK - Hádecká planina vs. BK - Březová MK - Hádecká planina vs. BK - Brumov MK - Hádecká planina vs. S - Velký Bor BK - Březová vs. BK - Brumov BK - Březová vs. S - Velký Bor BK - Brumov vs. S - Velký Bor - průměr první skupiny,
56,06 56,06 56,06 56,06 56,06 56,06 56,06 56,06 56,06 48,68 48,68 48,68 48,68 48,68 48,68 48,68 48,68 61,00 61,00 61,00 61,00 61,00 61,00 61,00 57,68 57,68 57,68 57,68 57,68 57,68 66,52 66,52 66,52 66,52 66,52 61,06 61,06 61,06 61,06 57,53 57,53 57,53 61,50 61,50 59,55
48,68 61,00 57,68 66,52 61,06 57,53 61,50 59,55 48,67 61,00 57,68 66,52 61,06 57,53 61,50 59,55 48,67 57,68 66,52 61,06 57,53 61,50 59,55 48,67 66,52 61,06 57,53 61,50 59,55 48,67 61,06 57,53 61,50 59,55 48,67 57,53 61,50 59,55 48,67 61,50 59,55 48,67 59,55 48,67 48,67
t
SV
p
5,26 -5,27 -1,69 -11,05 -4,52 -1,54 -5,50 -3,17 8,09 -8,65 -6,24 -11,96 -8,03 -6,17 -8,78 -7,07 0,01 3,33 -5,61 -0,06 3,53 -0,49 1,28 13,02 -8,71 -2,92 0,15 -3,65 -1,62 9,26 4,66 8,99 4,82 5,99 18,62 3,08 -0,37 1,19 11,11 -3,84 -1,77 9,21 1,66 12,85 9,81
208 208 208 194 208 208 208 208 208 208 208 194 208 208 208 208 208 208 194 208 208 208 208 208 194 208 208 208 208 208 194 194 194 194 194 208 208 208 208 208 208 208 208 208 208
0,00 0,00 0,09 0,00 0,00 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,99 0,00 0,00 0,96 0,00 0,62 0,20 0,00 0,00 0,00 0,88 0,00 0,11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,71 0,24 0,00 0,00 0,08 0,00 0,10 0,00 0,00
- průměr druhé skupiny, SV – stupně volnosti, t – hodnota t-testu
Průměrné Diceho podobnostní koeficienty byly vyhodnoceny také pro jednotlivé CHKO a jsou uvedeny v Tabulce 51. 149
Průměrné Diceho podobnostní koeficienty pro jednotlivé CHKO
Tabulka 51.
Popisné statistiky Diceho podobnostních koeficientů N Průměr Minimum Maximum Sm.odch. platných 210 52,37 14,80 68,80 10,78 511 60,60 31,40 81,80 8,21 210 60,52 36,40 81,20 8,53 105 48,67 30,30 61,80 6,68
CHKO Jizerské Hory Moravský Kras Bílé Karpaty Šumava
Z hodnot koeficientů pro jednotlivé oblasti vyplývá, ţe populace druhu Plantago media L. jsou na území Bílých Karpat a Moravského Krasu méně polymorfní neţ populace v Jizerských horách a na Šumavě. V okolí CHKO Šumava byla hodnocena pouze populace Velký Bor, neboť byla jedinou ze sedmi lokalit vytipovaných pro hodnocení genových zdrojů na Šumavě, kde se druh P. media vyskytoval (Dušková, 2008, pers. comm.). Důvodem je pravděpodobně fakt, ţe Plantago media L. preferuje vlhčí zásadité půdy s vyšším obsahem ţivin (Slavík et al., 2000), které se na Šumavě v podobě krystalického vápencového podloţí vyskytují pouze ojediněle (Babůrek a Pošmourný, 2001). Nadmořská výška (Tabulka 7) naměřená na této lokalitě minimálně o 300 m větší, nemá na výskyt jitrocele prostředního vliv. Samfira et al. (2010) pozorovali výskyt tohoto druhu aţ ve výšce 1800 m.n.m. Pro jednotlivé CHKO byla
testována
významnost
rozdílu
mezi
dvěma
výběrovými průměry na hladině významnosti α = 0,05. Z Tabulky 52 s výsledky t-testu vyplývá, ţe populace z Moravského Krasu a Bílých Karpat dosahují shodné míry variability a jejich průměrné Diceho koeficienty se liší od populace na Šumavě a populací v Jizerských horách, které se rovněţ vzájemně statisticky průkazně lišily. Tabulka 52.
Výsledky t-testu průměrných Diceho koeficientů pro jednotlivé CHKO
Porovnávané CHKO Jizerské Hory vs. Moravský Kras Jizerské Hory vs. Bílé Karpaty Jizerské Hory vs. Šumava Moravský Kras vs. Bílé Karpaty Moravský Kras vs. Šumava Bílé Karpaty vs. Šumava - průměr první skupiny,
52,37 52,37 52,37 60,60 60,60 60,52
60,60 60,52 48,67 60,52 48,67 48,67
t -11,11 -8,59 3,22 0,11 13,97 12,45
SV 719 418 313 719 614 313
- průměr druhé skupiny, SV – stupně volnosti, t – hodnota t-testu
Plantago lanceolata
150
p 0,00 0,00 0,00 0,91 0,00 0,00
Hodnocení variability odrůdy Libor Mezi 25 zástupci bylo čtyřmi RAPD primery detekováno 120 specifických polymorfních zón. Markerem OPA17 bylo detekováno 27 zón, marker OPI4 poskytoval 37 odlišitelných RAPD fragmentů, marker OPM12 poskytoval 30 zón a 26 RAPD profilů bylo detekováno markerem OPN12. Průměrný počet 30 zón na primer je velmi vysoký v porovnání s ostatními autory hodnotícími druhy rodu Plantago metodou RAPD (Wolff a MorganRichards, 1998; Vahabi et al., 2008; Singh et al., 2009), kteří pouţívají spíše většího počtu méně polymorfních markerů. Na základě souhrnného elektroforeogramu sloţeného ze všech 120 polymorfních zón byl pro tuto odrůdu vypočten průměrný Diceho koeficient podobnosti 50,71 %. Metodu RAPD k hodnocení pěti odrůd druhu Plantago ovata pouţili Das née Pal a Raychaudhuri (2003) v kombinaci s Jacckardovým koeficientem podobnosti. Jacckardův, Diceho a dalších šest koeficientů podobnosti testovali Duarte et al. (1999), kteří označili Diceho a Jaccardův koeficient podobnosti při hodnocení RAPD dat za ekvivalentní. Podobnost odrůd druhu P. ovata se vyskytovala v rozmezí 60,5 – 85,1 %. Kromě nejvíce populárního zástupce rodu Plantago, asijského druhu P. ovata, byly touto metodou zahraničními vědci hodnoceny druhy P. major, P. intermedia (Wolff et al., 2000) a P. asiatica (Guo et al., 2000). Vnitrodruhová variabilita druhu Plantago lanceolata byla hodnocena v rámci stanovení Diceho koeficientů pro samosprašné, cizosprašné, apomiktické a vegetativně mnoţené rostliny a průměrná hodnota pro tento druh byla stanovena na 59, 29 % (Vašíčková et al., 2009a). Větší variabilita detekovaná mezi jedinci populace Libor pravděpodobně souvisí s tetraploidním cytogenetickým stavem rostlin oproti běţně se v přírodě vyskytujícím diploidním populacím druhu P. lanceolata. Aţ 20% rozdíl variability diploidních a tetraploidních populací sledovali Qiang et al. (2011) u osmi populací morušovníku. O větší různorodosti polyploidů v rodě Plantago se zmiňuje Hooglander et al. (1993), který analyzoval chloroplastovou DNA u autopolyploidních populací druhu P. media původem z Ruska a Pyrenejí.
151
Hodnocení somaklonální variability V prvním experimentu bez opakování amplifikace se 3 mateřskými rostlinami odrůdy Libor (řada s označením 14) a 32 regenerovanými rostlinami dokázalo z deseti pouţitých RAPD markerů potvrdit výskyt somaklonální variability následujících osm: OPA11, OPA17, OPD2, OPM5, OPM12, OPN11, OPP9 a OPP17. Markery OPH13 a OPN12 byly detekovány monomorfní profily. Rozdíly se vyskytovaly jak mezi matkami a regenerovanými rostlinami, tak mezi regenerovanými rostlinami navzájem. Rozdílnou genetickou výbavu matky s 16 regeneranty (14/6) prokázaly markery OPA17 a OPM12 a markery OPD2 a OPP9 dokázaly odlišit matku, ze které pocházelo deset regenerantů (14/8). Výskyt odlišných RAPD zón alespoň u jednoho regeneranta z kaţdého souboru regenerantů pocházejících z odlišných matek, potvrdil primer OPA11. Rozdíly v DNA regenerovaných rostlin naopak prokázaly alespoň v jedné skupině i zbylé primery. Vliv nediferencované rodičovské buňky, která dá vznik kalusu, ze kterého regenerují dílčí rostliny naznačuje elektroforeogram primeru OPM12 (Obrázek 72), kterým bylo u šestnácti regenerantů vzniklých segmentací a regenerací jedné mateřské rostliny rozlišeno více skupin se stejným genotypem, odlišným od mateřského. Pravděpodobně kaţdá skupina rostlin regenerovala z jiného kalusu.
Obrázek 72.
Výskyt RAPD zón nalezených markerem OPM12 u genotypu 14/6
Vysoký výskyt odlišitelných genotypů nemusí odráţet výskyt somaklonální variability, která vzniká v průběhu vývojového cyklu explantátové kultury bez zásahu známých fyzikálních nebo chemických mutagenních faktorů (Novák, 1990). Frekvence výskytu této variability nejčastěji záleţí na rodičovském genotypu a podmínkách kultivace (Kaepler et al., 2000). Vzhledem k vysoké citlivosti metody RAPD na čistotu veškerých komponent PCR reakce a náchylnosti na průběh amplifikace (Welsh a McClelland, 1991) je nutné pouţívat vícenásobné amplifikace pro odhalení specifických opakovatelných vzorů.
152
Ve druhém experimentu byla zjišťována genetická stabilita rostlin regenerovaných ze sedmi mateřských genotypů odrůdy Libor (L) a čtyř mateřských genotypů populací Planta naturalis (P) třemi RAPD markery (OPA11, OPA17 a OPM12). Při analýzách detekoval marker OPA11 celkem 9 regenerantů odlišných od 2 mateřských genotypů, marker OPM12 celkem 13 regenerantů odlišných od 6 mateřských rostlin a marker OPA17 u stejného počtu mateřských genotypů dokonce 15 regenerantů. Opětovnou amplifikací jednotlivých vzorků však nebyla prokázána vypovídací schopnost metody, neboť se nepodařilo prokázat odlišnost stejných vzorků při opakování pokusu. Seznam regenerantů lišících se od mateřského genotypu při první a druhé amplifikaci je uveden v Tabulkách 53 a 54. Tabulka 53. Matka L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 P1 P2 P3 P4
Tabulka 54.
Regenerované rostliny lišící se od mateřského genotypu při první amplifikaci OPA11 L6/(6, 7, 12, 14, 16) L7/(1, 5, 6, 7) -
OPA17 L1/(10, 15) L3/10 L4/(12, 13, 14) L5/(1, 4, 9) L6/(8, 10, 14) P4/(5, 6, 7)
OPM12 L5/13 L6/1 L7/(1, 2) P1/4 P3/(2, 5) P4/(3, 4, 7, 9, 10, 11)
Regenerované rostliny lišící se od mateřského genotypu při druhé amplifikaci Matka L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 P1 P2 P3 P4
OPA11 L6/(2, 13) L7/(4, 6, 7, 8) -
OPA17 L4/(4, 12) L5/(1, 3, 7) L6/(4, 9, 12, 16) P4/11
153
OPM12 -
Z těchto experimentů vyplývá, ţe metoda RAPD není vhodná pro hodnocení DNA rostlin procházejících opětovnou diferenciací. Po opětovné amplifikaci těchto vzorků za stejných podmínek a s pouţitím totoţných postupů, chemikálií i přístrojů se však nepodařilo získat profily shodné s amplifikací první a prokázat genetické změny u stejných jedinců. Častý výskyt nespecifických amplifikací je důvod, proč se pouţití této metody omezuje zejména na řešení otázek genetických vzdáleností na úrovni příbuzných druhů nebo odlišení linií a klonů ve šlechtitelských programech, kde jsou vyhodnocovány jen signální bandy. K odstranění nespecifických amplikonů je běţně doporučováno optimalizovat průběh PCR reakce sníţením počtu cyklů či zvýšením anelační teploty (Rychlik et al., 1990). Při těchto postupech však dochází k odstraňování rovněţ slabě amplifikujících, ale specifických zón, které mohou postihovat variabilitu. Metoda RAPD je tedy pouţitelnou metodou k detekci klonálních genotypů jen v případě nalezení vhodných primerů. Přes veškeré výše zmíněné nevýhody je náhodná amplifikace polymorfní DNA vhodnou a stále pouţívanou metodou k detekci vnitrodruhové variability (Verma et al., 2009; Prakash et al., 2011; Qiang et al., 2011), kdy nespecifické zóny nejsou zařazeny do vyhodnocování RAPD profilů.
154
5.3 Chemické analýzy obsahových látek druhu Thymus pulegioides L. Při detekci sloţení silice 96 genotypů bylo plynovou chromatografií v kombinaci s hmotnostní spektrometrií detekováno 55 chemických látek, které se vyskytovaly v mnoţství větším neţ 1 %. Jejich Kovatsovy retenční indexy a průměrné obsahy látek v populacích uvádí Tabulka 3 a Tabulka 4 v kapitole 8 Přílohy. 5.3.1.1 Výskyt chemotypů Mezi zástupci šesti populací druhu Thymus pulegioides L. přenesených v letech 1998 a 1999 z okolí CHKO do polní kolekce genobanky v Olomouci bylo nalezeno šest chemotypů (karvakrolový, thymolový, geraialový, linaloolový, geraniolový a thujanolový), které byly jiţ dříve popsány u druhů Thymus vulgaris a Thymus pulegioides L. (Granger a Passet, 1973; Vernet et al., 1986). Procentuální zastoupení chemotypů mezi 96 jedinci je patrné z Obrázku 73 a vyplývá z něj zařazení zástupců mateřídoušek do dalších dvou kategorií – tzv. cycloheptanového chemotypu a nedefinované kategorie, které tvoří minoritní skupiny a jsou charakterizovány níţe.
Detekované chemotypy 2% 1% 1% 2%
Geranialový Karvakrolový
11%
Thymolový
20%
Linaloolový Nedefinovaný Cykloheptanový
9% 54%
Geraniolový Thujanolový
Obrázek 73.
Procentuální zastoupení chemotypů všech analyzovaných mateřídoušek
Nejvíce četným chemotypem u hodnocených genotypů byl chemotyp karvakrolový, jehoţ největší rozšíření u druhu T. pulegioides subsp. chamaedrys v přirozených populacích východního Slovenska zaznamenal také Mártonfi (1992). Rovněţ v zastoupení druhého nejvíce
rozšířeného
chemotypu
se
výsledky
s Mártonfim
(1992)
shodují.
Mezi
mateřídouškami z genobanky v Olomouci byl linaloolový chemotyp nalezen u 2 jedinců krušnohorské populace Horní Blatná, u jednoho jedince z populace Vysoká Pec v Beskydech a dále pak u všech 16 rostlin z populace Okruhlá v Beskydech. Mikrosatelitní analýzy 155
prokázaly uniformitu této populace všemi pěti markery, coţ naznačilo, ţe by se mohlo jednat o jeden genotyp, který se vegetativně rozšířil po celé pěstební parcele. Při hodnocení metodou RAPD však nebyla prokázána identita jedinců (kapitola 5.2.3.1), a proto bylo do vyhodnocování započteno všech 16 rostlin. Výskyt linaloolového chemotypu byl detekován u 20 % rostlin. Ke geranialovému chemotypu bylo přiřazeno 11 % genotypů a k thymolovému chemotypu 9 % rostlin. Geraniolový chemotyp se vyskytoval u jediného genotypu populace Mionší z Beskyd (3532/7) a jediný zástupce thujanolového chemotypu s 67,25% obsahem trans-sabinen hydrátu byl nalezen v krušnohorské populaci Měděnec (3525/9). V populacích z Beskyd a Krušných hor nebyl detekován fenchonový chemotyp, o kterém referuje Mártonfi (1992) na Slovensku. Fenchonový chemotyp nebyl u tohoto druhu detekován ani v populacích z Litvy (Mockute a Bertoniene, 199; Loţiene a Venskutonis, 2005). V litevských populacích byl potvrzen výskyt α-terpenyl-acetátového chemotypu, který však mezi genovými zdroji ČR zjištěn nebyl a ani Mártonfi se o něm na Slovensku nezmiňuje (Mártonfi, 1992; Mártonfi et al., 1994), stejně tak jako chemotyp s převládajícím obsahem cis-sabinen hydrátu, o kterém v Dánsku referují Groendahl et al. (2008). U dvou jedinců (3529/12 a 3529/15) z beskydské populace Ochmelovské vrchy byla na plynovém chromatografu detekována látka v retenčním čase 16,64 minut, která byla na hmotnostním spektrometru označena jako 1,3,5-tris-methylen-cykloheptan. Tato látka byla doposud nalezena u rajčatového dţusu (Servili et al., 1998) a v silici druhu Cinnamomum tamala (Begum et al., 2007), u léčivých rostlin však nikoliv. Vzhledem k tomu, ţe tato látka doposud nebyla u rodu Thymus definována, mohlo by se jednat o detekci nového chemotypu. Tuto hypotézu je však nutné potvrdit podrobnějšími rozbory. V silicích zkoumaných mateřídoušek se tato látka vyskytovala v obsahu 38,4 % a 39,5 % a současně s ním bylo detekován germakren D a trans-nerolidol v mnoţství větším neţ 10 % (Tabulka 3 a 4 v kapitole Přílohy). U ţádné další rostliny nebyla tato látka detekována ani ve stopových mnoţstvích. Trans-nerolidol byl zastoupen 22,5 % ještě u jedné rostliny (3526/16) z populace Horní Blatná z Krušných hor a společně s další rostlinou z této populace (3526/7) byla zařazena do kategorie genotypů, u kterých nebylo moţné definovat chemotyp, protoţe obsahovaly ve vyšších koncentracích pouze látky (germakren D, β-pinen a karyofylen E), které se vyskytují u všech ostatních chemotypů. Mártonfi (1992) při hodnocení chemického sloţení populací druhu T. pulegioides subsp. chamaedrys na Slovensku nalezl nedefinovaný chemotyp u 6 % rostlin.
156
5.3.1.2 Variabilita populací Variabilita v obsahu chemotypů u jednotlivých populací je graficky znázorněna v grafu na Obrázku 74, ze kterého vyplývá, ţe mezi populace s největší různorodostí chemotypů patří populace KH - Měděnec a B – Mionší. V těchto populacích se vyskytovaly společně geranialový, karvakrolový a thymolový chemotyp a zároveň byla prokázána odlišitelnost obou populací pomocí přítomnosti thujanolového a geraniolového chemotypu, které se nikde jinde nevyskytovaly. Nejniţší různorodost byla detekována u dvou populací z Beskyd – Okruhlá a Ochmelovské vrchy. Vysoká míra variability vyjádřená různorodostí chemotypů nalezená u populací Měděnec a Mionší nebyla potvrzena genetickými analýzami, kdy byly na základě pouţití metody RAPD a analýzy polymorfních mikrosatelitních lokusů detekovány jako nejvíce variabilní populace KH – Horní Blatná a B – Ochmelovské vrchy. Uniformita populace Okruhlá však byla potvrzena všemi pouţitými metodami. 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
16 14
14
12 8
8 5
2
4 22
1
KH - Měděnec
Geranialový Linaloový
Obrázek 74.
KH - Horní Blatná
2
1 1
KH - Vysoká pec
Karvakrolový Nedefinovaný
BOchmelovské vrchy Thymolový Cykloheptanový
3 1
B - Okruhlá
B - Mionší
Thujanolový Geraniolový
Zastoupení jednotlivých chemotypů odrážející variabilitu populací
Z porovnání populací z Krušných hor a Beskyd znázorněných v grafech na Obrázcích 75 a 76 lze pozorovat přibliţně dvakrát větší zastoupení fenolových chemotypů v Krušných horách, zatímco v Beskydech byl detekován o 13 % větší podíl geranialového chemotypu. Z těchto grafů je patrný vyšší polymorfismus v Beskydech, kde bylo detekováno šest chemotypů, avšak z kombinace s předchozím grafem na Obrázku 74 vyplývá větší vnitropopulační variabilita krušnohorských populací, které jednotlivě zahrnují vţdy alespoň tři chemotypy, zatímco dvě populace z Beskyd jsou charakteristické výskytem jednoho, resp. dvou chemotypů. 157
Krušné hory 2%
Geranialový
6% 4% 4%
Karvakrolový
13%
Thymolový Thujanolový
71%
Linaloový Nedefinovaný
Obrázek 75.
Podíl zastoupení chemotypů vyskytujících se na území Krušných hor
Beskydy 4% 2%
Geranialový
17%
Karvakrolový Thymolový
33% 6%
Linaloový
38%
Cykloheptanový Geraniolový
Obrázek 76.
Podíl zastoupení chemotypů vyskytujících se na území Beskyd
5.3.1.3 Zastoupení dominantního monoterpenu u jednotlivých chemotypů Určení chemotypu je vázáno nejen na výskyt monoterpenů pod vlivem série epistaticky dominantních genů, ale především na jejich převládající obsah. Pro jednotlivé chemotypy byly vypočteny průměrné obsahy dominantních látek a z následujících grafů na Obrázcích 77 - 80 je patrný rozdíl mezi obsahem dominantní látky u fenolových chemotypů (max. 60 %) s geranialovým a linaloolovým chemotypem (cca 80 %). Tyto výsledky potvrzují pozorování Passeta (1971), který detekoval u nefenolových chemotypů druhu T. vulgaris obsah dominantní sloţky v mnoţství více neţ 80 %, zatímco u fenolových se hodnoty pohybovaly v rozmezí 50-70 %. K obdobnému tvrzení dospěli rovněţ u druhu T. vulgaris Thompson et al. (2003), kteří vysvětlují niţší hodnoty dominantního monoterpenu u fenolových chemotypů přítomností prekurzorů p-cymenu a γ-terpinenu a navrhuje pro tyto chemotypy vycházet z obsahu všech třech látek dohromady. V následujících grafech jsou zachyceny trendy obsahů dominantních sloţek jednotlivých chemotypů společně s jejich prekurzory a látkami vţdy přítomnými s hlavní sloţkou. 158
100 80 60 40 20
linalool
Obrázek 77.
germacren D
3535/8
3526/3
3526/2
3530/16
3530/15
3530/14
3530/13
3530/12
3530/11
3530/10
3530/9
3530/8
3530/7
3530/6
3530/5
3530/4
3530/3
3530/2
0 3530/1
Obsah látky (%)
Linaloolový chemotyp
β-himachalen
Obsah dominantních složek silice zástupců linaloového chemotypu
Průměrný obsah linaloolu byl 82,94 ± 3,21 a z ostatních sloţek silice byl zároveň u všech genotypů přítomen germakren-D a β-himachalen. Zvláštností tohoto chemotypu je kvalitativní změna obsahu hlavního monoterpenu v závislosti na stáří. Výhradní výskyt fenolických silic, tedy thymolu a karvakrolu, v prvních třech měsících růstu rostliny detekovali Vernet et al. (1986), zatímco nové listy vyskytující se po této době obsahují podstatně více linaloolu. Oproti thymolovému, karvakrolovému a geranialovému chemotypu je obsah linaloolu velmi vyrovnaný, coţ je způsobeno pravděpodobným výskytem klonů v populaci 3530 Okruhlá.
Thymolový chemotyp Obsah látky (%)
70 60 50 40 30 20 10 0 3525/4 3525/5 3525/11 3525/14 3525/15 3532/1 3532/3 3532/11 3535/15
p-cymen
Obrázek 78.
γ-terpinen
thymol
beta himachalene
Obsah dominantních složek silice zástupců thymolového chemotypu
Pro thymolový chemotyp byl vypočten průměrný obsah thymolu 45,02 ± 14,25, společně s p-cymenem 7,19 ± 2,23 a γ-terpinenem 14,49 ± 7,87 a u všech thymolových 159
genotypů byl přítomen β-himachalen. Biosyntetickou dráhu vzniku thymolu popsali v roce 1978 Poulose a Croteau, kteří potvrdili vznik thymolu aromatizací γ-terpinenu a p-cymenu následovanou hydroxylací p-cymenu. 70 60
Karvakrolový chemotyp
40 30 20 10 0
3525/2 3525/7 3525/10 3525/13 3526/1 3526/5 3526/8 3526/10 3526/12 3526/14 3529/1 3529/3 3529/5 3529/7 3529/9 3529/11 3529/14 3532/9 3532/13 3535/1 3535/3 3535/5 3535/7 3535/10 3535/12 3535/14
Obsah látky (%)
50
p-cymen Obrázek 79.
γ-terpinen
karvakrol
Obsah dominantních složek silice zástupců karvakrolového chemotypu
Průměrný obsah karvakrolu byl 44,43 ± 7,25 a společně s p-cymenem (5,49 ± 3,16 a γ-terpinenem 14,44 ± 5,14) se vţdy vyskytoval také karvakrol methyl ether, karyofylen - E a β-himachalen. Seskviterpen himachalen se u rostlin běţně vyskytuje ve třech formách (α, β, γ) a za dominantní látku je povaţován u cedrů (Abouhamza et al., 2001). Všechny chemotypy s výjimkou geraniolového jsou řízeny jedním dominantním genem, zatímco vznik geraniolu je řízen dvěma lokusy (Vernet et al., 1986). Na přesné definici tohoto chemotypu se mnozí autoři neshodují a řada z nich pouţívá pro odlišení rostlin s obsahem geraniolu označení zaloţené na kombinaci hlavních sloţek – GGN: geraniol/geraniol/neral (Loţiene a Venskutonis, 2004), citral-geraniol (Mártonfi, 1992; Mockute a Bernotiene, 2000). Citral je souhrnný název neralu (Z izomer, citral B) a geranialu (E izomer, citral A). V této disertační práci byl za geraniolový chemotyp povaţován pouze genotyp 3532/7 z Mionší v Beskydech, který obsahoval 68,32 % geraniolu, β-bourbonen, germakren-D, karyofylen-E, β-himachalen a geranyl-n-butyrát. Ke geranialovému chemotypu byly přiřazeny genotypy, které obsahovaly geranial (25,38 ± 5,08) společně s geraniolem (18,06 ± 6,82), neralem (14,0 ± 2,45) a bourbonenem (9,24 ± 6,33). U obou těchto chemotypů nedosahuje obsah hlavní komponenty silice hodnot nefenolových chemotypů, o kterých referují Vernet et al. (1986) a Thompson et al. (2003). 160
Obsah látky (%)
Geranialový chemotyp 40 30 20 10 0 3525/1
3525/3
3532/2
verbenol Obrázek 80.
3532/4
geraniol
3532/5
3532/6
geranial
3532/8 3532/12 3532/15 3532/16
β-bourbonene
Obsah dominantních složek silice zástupců geranialového chemotypu
161
5.3.1.4 Porovnání chemických a genetických analýz Korelace podobnostních matic Výsledky těsnosti závislosti mezi podobnostními maticemi na základě RAPD zón, mikrosatelitních alel a chemických analýz hodnocené Mantelovým testem jsou uvedeny v Tabulce 55. Na základě velikosti Pearsonova korelačního koeficientu nebyla nalezena statisticky významná závislost mezi jednotlivými skupinami proměnných (p < 0,05). Tabulka 55.
Porovnání závislosti genetické a chemické variability a variability detekované
pomocí mikrosatelitních a RAPD analýz Dvojice proměnných
N
Průměr Sm. odch.
Min.
Max.
|r|
RAPD analýzy Chemické analýzy
4560 4560
52,69 50,96
11,52 26,58
14,50 0,00
100,00 100,00
0,279
Mikrosatelitní analýzy Chemické analýzy
4560 4560
39,57 50,96
20,63 26,58
0,00 0,00
100,00 100,00
0,275
Mikrosatelitní analýzy RAPD analýzy
4560 4560
52,69 39,57
11,52 20,63
14,50 0,00
100,00 100,00
0,542*
* statisticky průkazná středně těsná závislost (p < 0,05)
Pearsonův korelační koeficient pro odhad míry závislosti podobností genotypů na základě chemického sloţení silice a RAPD analýz byl pro druh Thymus pulegioides L. vypočten na 0,279. Slabá těsnost závislosti se neshoduje s prací Echeverrigaray et al. (2001), kteří detekovali u druhu Thymus vulgaris velmi těsnou závislost RAPD a chemických analýz s korelačním koeficientem 0,779. Odlišné závěry mohou být zapříčiněny odlišným způsobem vyhodnocení chemických dat. Ve zde uváděném experimentu byla zohledňována pouze přítomnost/nepřítomnost látky a podobnost byla stanovena pomocí Diceho podobnostních koeficientů, zatímco Echeverrigaray et al. (2001) pouţili Euklidovské vzdálenosti zahrnující obsah jednotlivých látek v silici. Euklidovské vzdálenosti při hodnocení druhu Origanum vulgare z čeledě Lamiaceae pouţili Tonk et al. (2007), kteří při korelaci chemické a RAPD matice vypočetli Pearsonův koeficient v hodnotě 0,082. Z těchto výsledků vyplývá, ţe těsnost závislosti mezi chemickou variabilitou a diverzitou získanou na základě RAPD zón je druhově specifická. Výsledky mohou být rovněţ ovlivněny výběrem aplikovaných RAPD markerů a hodnocených RAPD zón. Jistý prvek náhody, kdy sledujeme fragmenty odpovídající
162
neznámým oblastem hodnoceného genomu (Welsh a McClelland, 1990), vychází z podstaty metody zahrnující tento fakt jiţ ve svém názvu – náhodné amplifikace polymorfní DNA. Korelací mikrosatelitního a chemického šetření byl detekován korelační koeficient o velikosti 0,275, a tudíţ nebyl nalezen významný vztah závislosti (p<0,05). Nezávislost výskytu mikrosatelitních alel s výskytem sloţek silice u odlišných botanických druhů potvrzují Mantelovým testem také Bottin et al. (2007), kdy nebyla prokázána korelace mezi podobnostními maticemi chemických a mikrosatelitních analýz santalu a chmele (Patzak et al., 2010). Jediná středně těsná závislost (0,542) byla detekována mezi podobnostními maticemi z mikrosatelitních a RAPD analýz. Porovnání těchto dvou metod u druhů rodu Thymus doposud nikdo nepublikoval. Hodnoty korelačních koeficientů odráţející závislost těchto dvou metod jsou velmi různorodé v závislosti na druhu rostliny. V čeledi lipnicovitých byla detekována jak závislost velmi těsná, pro druh Bromus tectorum L. o velikosti 0,954 (Ashley a Longland, 2009), tak i velmi slabá (0,267) pro druh Elymus caninus (L.) L. (Sun et al., 1999). V grafické podobě lze sledovat podobnost genotypů na Obrázcích 81, 82 a 83. Pomocí klastrovací metody UPGAMA v programu QuantityOne vznikly 3 dendrogramy v závislosti na metodě hodnocení populací a jednotlivé chemotypy jsou barevně odlišeny. Označení jednotlivých genotypů a příslušnost k chemotypu vyplývají z Tabulek 56 a 57. Z těchto dendrogramů je patrné, ţe mikrosatelitní, chemické a RAPD analýzy roztřídily data na základě podobnosti pokaţdé do odlišných skupin. Výjimku tvořila populace Okruhlá, jejíţ jedince všechny metody seřadily do jednoho klastru, coţ vyplývá z uniformity detekované metodami mikrosatelitních lokusů a chemických látek a rovněţ metodou RAPD byla detekována podobnost na hranici klonů. Dendrogram vytvořený na základě RAPD markerů obsahuje šest výrazných klastrů, které korespondují s původem rostlin. Přestoţe markery byly vybírány s ohledem na schopnost odlišení jednotlivých chemotypů, zachycují detekované RAPD zóny rozdíly mezi lokalitami a jediná populace Horní Blatná obsahovala tři jedince (vzorky č. 19, 23 a 32), kteří byli podobnější rostlinám z jiných populací. Zástupci všech ostatních populací si byli vzájemně více podobní neţ jedinci mezi populacemi. Největší podobnost byla detekována pro krušnohorskou populaci Horní Blatná a populaci Mionší z Beskyd, mezi kterými byla detekována 55% podobnost. Od těchto dvou populací byla odlišena populace Měděnec (KH) s 53% podobností. Poslední populace z Krušných hor Vysoká pec byla seřazena do dalšího klastru a podobnost s předchozími populacemi byla 51 %. Zbylé dvě populace 163
z Beskyd (Ochmelovské vrchy a Okruhlá) si mezi sebou byly podobné rovněţ z 51 % a podobnost s ostatními populacemi u nich byla detekována ve výši 48 %. Rovněţ po seřazení jedinců do klastrů na základě Diceho podobnostních koeficientů po hodnocení mikrosatelitních lokusů je moţné sledovat souvislost s lokalitou. Přestoţe u jedinců všech lokalit s výjimkou lokality Vysoká Pec, došlo k přiřazení vţdy alespoň jednoho vzorku k jiné populaci, lze na dendrogramu (Obrázek 81) odlišit čtyři výrazné klastry, které obsahují většinu jedinců jedné či dvou smíšených populací. Krušnohorské populace Vysoká Pec a Měděnec si byly podobné z 55 % a od populací Okruhlá a Horní Blatná se lišily z 53 % (47% podobnost). Pro tyto čtyři populace byla detekována 46% podobnost se zbylými dvěma populacemi Mionší a Ochmelovské vrchy, které od sebe nelze na základě hodnocení podobnosti mikrosatelitních alel jednoznačně odlišit. Na základě hodnocení chemického sloţení nebyla detekována souvislost s lokalitou a tři výrazné klastry na Obrázku 83 vznikly pro geraniol/geranialový chemotyp, linaloolový, do kterého byly přiřazeny rovněţ thujanolový, cykloheptanový a nedefinované chemotypy a poslední klastr je společný pro thymolový a karvakrolovým chemotyp. Podobnost mezi karvakrolovým/thymolovým chemotypem a ostatními chemotypy byla detekována ve výši 28 % a jejich odlišení potvrdilo zařazení chemotypů mezi fenolové (thymol a karvakrol) a nefenolové (všechny ostatní) chemotypy (Passet, 1971; Vernet et al., 1986). Tabulka 56.
Označení a původ genotypů druhu T. pulegioides Označení 1 - 16 17 - 32 33 - 48 49 - 64 65 - 80 81 - 96
Tabulka 57. Chemotyp Thymolový Karvakrolový Geranialový Linaloolový Geraniolový Thujanolový Cykloheptanový Nedefinovaný
Kód genobanky 3525 3526 3539 3530 3532 3535
Populace KH - Měděnec KH - Horní Blatná B - Ochmelovské Vrchy B - Okruhlá B - Mionší KH - Vysoká Pec
Příslušnost genotypů k chemotypu Genotyp 4, 5, 11, 14, 15, 65, 67, 75, 95 2, 6-8, 10, 12, 13, 16, 17, 20-22, 24-31, 33-43, 45, 46, 48, 67, 73, 74, 77, 78, 81-87, 89-94, 96
1, 3, 69, 70, 18, 19, 88, 49-64 71 9 44, 47 23, 32
164
Obrázek 81.
Přehled klastrů vytvořených na základě podobnosti genotypů analyzovaných
metodou RAPD
165
Obrázek 82.
Přehled klastrů vytvořených na základě podobnosti genotypů analyzovaných
pomocí mikrosatelitních markerů
166
Obrázek 83.
Přehled klastrů vytvořených genotypů na základě podobnosti hodnocených dle
složení chemických látek v silici
Korelace výskytu specifických markerů s chemotypy 167
Za účelem detekce konkrétních mikrosatelitních alel a RAPD zón, jejichţ výskyt by byl závislý na výskytu hlavní sloţky silice určující daný chemotyp, byl v závislosti na koeficientu kontingence a asociace zkoumán vztah těsnosti závislosti pro 4 nejvíce četné chemotypy – karvakrolový, linaloolový, geranialový a thymolový. Z následujících grafů je patrné, ţe nebyla detekována průkazná velmi těsná závislost (p<0,05) mezi výskytem RAPD zón a mikrosatelitních alel s výskytem dominantní látky jednotlivých chemotypů. Pearsonův koeficient kontingence, porovnatelný s koeficientem determinace, nedosahoval hodnot větších neţ 0,7. Přesto byly pro jednotlivé chemotypy vybrány alely a RAPD zóny, které se vymezovaly vyššími koeficienty kontingence a asociace od ostatních zón a alel. U mikrosatelitních alel se nepředpokládá, ţe by byly součástí kódujících úseků genů (Metzgar et al., 2000). Byl však zaznamenán výskyt mikrosatelitních lokusů v intronech (Tóth et al., 2000) a existuje rovněţ pravděpodobnost genetického draftu, kdy dochází ke svezení se určitých úseků DNA společně s lokusy při crossing-overu (Flegr, 2005). Závislost výskytu RAPD zón se zkoumanou vlastností a pouţívání RAPD markeru jako specifického markeru vyuţili jiţ v devadesátých letech Martin et al. (1991) či Michelmore et al. (1991), kteří navrhli metody detekce genů rezistence k bakteriálním chorobám, resp. peronosporám. Od té doby byly specifické RAPD markery vyuţity k identifikaci genů rezistence chorob u různých plodin (Mohan et al., 1997; Ananga et al., 2006), ale také k odhalení souvislostí mezi geny a zbarvením ovocných plodů (Cheng et al., 1996; Saraswathi et al., 2005; Inoue et al., 2006) a ryb (Araneda et al., 2005), geny pro růst (He et al., 2009), či např. odolností k chladu (Asghari et al., 2007).
168
Výskyt RAPD zón a mikrosatelitních alel společně s geranialem Geranial, trans citral, neboli trans geraniol aldehyd vzniká oxidací geraniolu. Vernet et al. (1986) pomocí hybridizačních pokusů zjistili, ţe vznik geraniolu je podmíněn dvěma lokusy a ţe tyto geny jsou epistaticky dominantní nad linaloolem, α-terpineolem, 4thujanolem, karvakrolem a thymolem. Jako dominantní látka byl geraniol detekován pouze u jednoho genotypu, zatímco geranial byl dominantní u devíti jedinců, u kterých byly provedeny následující analýzy. Jak je patrné z asociačních tabulek (Tabulky 58 a 59) jeví se všechny vybrané markery ve vazbové fázi cis, coţ by se dalo interpertovat jako detekci úseků DNA, které souvisí s výskytem genů pro geraniol. Vzhledem k nízkému koeficientu asociace (max. 0,412) a vysokému výskytu rekombinací mezi přítomností zóny a látky je zřejmé, ţe vybrané úseky DNA nemají přímou souvislost výskytu s geraniolem, ani s geny podporující expresi genů pro geraniol. Tabulka 58.
Asociační tabulka mikrosatelitních markerů se středně těsnou závislostí výskytu
společně s výskytem geranialu Asociace mikrosatelitních alel
Tabulka 59.
Alela E070/3 má alelu nemá
Geranial má látku nemá látku 9 15 4 68
D347/1 má alelu nemá
má látku
nemá látku 8 12 5 71
D257/1 má alelu nemá
má látku
nemá látku 5 8
4 79
Asociační tabulka výskytu RAPD zón se středně těsnou závislostí a geranialu Asociace RAPD markeru RAPD marker Geranial OPP14/17 má nemá má marker 7 4 nemá marker 5 80 169
O nízké závislosti výskytu alel a zón s výskytem geranialu svědčí následující Obrázky 84 a 85. Pouze slabá těsnost závislosti vysvětlující z 37,5 % výskyt geranialu výskytem mikrosatelitních alely E070/3, 36,9 % alely D347/1 a 36,7 % alely D257/1. Jedinou RAPD zónou vykazující střední vztah závislosti s geranailem byla OPP14/17, jejímţ výskytem lze vysvětlit výskyt geranialu z necelých 50 %.
Koeficient kontingence a asociace
Geranial 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
0,369
0,375
Mikrosatelitní alely
Obrázek 84.
0,367
Koeficient asociace V
Koeficient kontingence dle Pearsona
Průběh kontingence a asociace mikrosatelitních alel, které se vyskytovaly
Geranial
0,486
RAPD zóny
Obrázek 85.
Koeficient asociace V
OPP14/15
OPP14/9
OPP14/12
OPP14/6
OPP14/3
OPN11/24
OPN11/21
OPN11/18
OPN11/15
OPN11/12
OPN11/9
OPN11/6
OPN11/3
OPM4/21
OPM4/18
OPM4/15
OPM4/9
OPM4/12
OPM4/6
OPM4/3
OPD2/18
OPD2/15
OPD2/9
OPD2/12
OPD2/6
OPD2/3
OPA17/16
OPA17/13
OPA17/7
OPA17/10
0,381
OPA17/4
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
OPA17/1
Koeficient kontingence a asociace
společně s geraniolem
Koeficient kontingence dle Pearsona
Průběh kontingence a asociace RAPD zón, které se vyskytovaly společně
s geraniolem
170
Výskyt RAPD zón a mikrosatelitních alel společně s thymolem Společný výskyt dvou RAPD zón a tří mikrosatelitních alel s thymolem byl detekován rovněţ v genové vazbě cis a můţe se tedy jednat o úseky DNA pozitivně ovlivňující přítomnost thymolu. Pokud vycházíme z recesivně homozygotní sestavy alel ggaauullcc spojené s výskytem thymolu díky epistatické dominanci (Obrázek 86), jednalo by se teoreticky o geny související s inhibicí vzniku geraniolu, linaloolu, α-terpineolu, thujanolu a karvakrolu.
Obrázek 86.
Biosyntetická dráha vzniku dominantních monoterpenů v rodě Thymus
(upraveno dle Thompson et al., 2003) 171
Středně těsný vztah závislosti daný velikostí koeficientu asociace v rozmezí 0,4 – 0,7 byl nalezen pro thymol s mikrosatelitními alelami E070/4, D347/4 a D257/11 a RAPD zónami OPN11/24 a OPD2/8. Průběh závislosti u ostatních detekovaných alel a zón je
Koeficient kontingence a asociace
patrný z následujících grafů.
Thymol 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
0,458
0,383
Mikrosatelitlní alely
Koeficient asociace V
Obrázek 87.
0,405
Koeficient kontingence dle Pearsona
Průběh kontingence a asociace mikrosatelitních alel, které se vyskytovaly
společně s thymolem.
0,509 0,405
Koeficient asociace V
OPP14/15
OPP14/9
OPP14/12
OPP14/6
OPP14/3
OPN11/24
OPN11/21
OPN11/18
OPN11/15
OPN11/12
OPN11/9
OPN11/6
OPN11/3
OPM4/21
OPM4/18
OPM4/15
OPM4/9
OPM4/12
OPM4/6
OPM4/3
OPD2/18
OPD2/15
OPD2/9
OPD2/12
OPD2/6
OPD2/3
OPA17/16
OPA17/13
OPA17/10
OPA17/7
OPA17/4
RAPD zóny
Obrázek 88.
0,387
0,383
0,306
OPA17/1
Koeficient kontingence a asociace
Thymol 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Koeficient kontingence dle Pearsona
Průběh kontingence a asociace RAPD zón, které se vyskytovaly společně
s thymolem.
172
Tabulka 60.
Asociační tabulka mikrosatelitních markerů se středně těsnou závislostí výskytu
společně s výskytem thymolu Asociace mikrosatlitních alel
Tabulka 61.
Alela E070/4 má alelu nemá
Thymol má látku nemá látku 13 4 13 66
D347/4 má alelu nemá
má látku 13 13
nemá látku 8 62
D257/11 má alelu nemá
má látku 9 17
nemá látku 2 68
Asociační tabulka RAPD zón se středně těsnou závislostí výskytu společně
s výskytem thymolu Asociace RAPD markerů Thymol RAPD marker OPD2/8 má látku nemá látku má zónu 17 6 nemá 9 64 OPN11/24 má zónu nemá
má látku
nemá látku 9 17
2 68
Z tabulek asociace naznačujících genovou vazbu typu cis (coupling) je patrný velký počet získaných rekombinovaných jedinců, kteří buď obsahovali thymol a nebyl u nich detekován daný marker, či byla zaznamenána přítomnost markeru a nebyl přítomný thymol. Čím větší je počet těchto jedinců, tím slabší je vazba mezi markerem a danou vlastností, v tomto případě přítomností thymolu. Největší těsnost závislosti a zároveň nejniţší počet rekombinovaných jedinců byl detekován u RAPD zóny OPD2/8, jejíţ přítomností se z 50,8 % dá vysvětlit přítomnost thymolu.
173
Karvakrolový a linaloolový chemotyp Přestoţe syntéza dominantních látek těchto dvou chemotypů vychází z odlišného substrátu (Obrázek 86) a v řetězci epistaticky dominantních genů se vyskytuje ještě α-terpineol a 4-thujanol, byla detekována souvislost mezi výskytem alel s nejvyšší těsností závislosti na výskytu karvakrolu a linaloolu. U karvakrolového chemotypu byl Pearsonovým koeficientem kontingence detekován středně těsný vztah závislosti karvakrolu a šesti mikrosatelitních alel - E070/9, E089/3, D347/6, D347/13, D257/8, D257/17. U linaloolového chemotypu byl detekován středně těsný vztah závislosti linaloolu a šesti totoţných mikrosatelitních alel a jednou alelou - E070/5 další. Vazbové fáze jsou zřejmé z Tabulky 62 zahrnující asociaci společných mikrosatelitních alel a linaloolu i karvakrolu. Tabulka 62.
Asociační tabulka mikrosatelitních markerů se středně těsnou závislostí výskytu
společně s výskytem karvakrolu a linaloolu Asociace mikrosatelitních alel Alela Karvakrol E070/9 má látku nemá látku má alelu 1 19 nemá 62 14
Asociace mikrosatelitních alel Alela Linalool E070/9 má látku nemá látku má alelu 19 1 nemá 5 71
E089/3 má alelu nemá
má látku nemá látku 5 21 58 12
E089/3 má alelu nemá
má látku nemá látku 20 6 4 66
D347/6 má alelu nemá
má látku nemá látku 1 16 62 17
D347/6 má alelu nemá
má látku nemá látku 22 42 2 30
D347/13 má alelu nemá
má látku nemá látku 0 17 63 16
D347/13 má alelu nemá
má látku nemá látku 17 0 7 72
D257/8 má alelu nemá
má látku nemá látku 6 21 57 12
D257/8 má alelu nemá
má látku nemá látku 16 11 8 61
D257/17 má alelu nemá
má látku nemá látku 4 18 59 15
D257/17 má alelu nemá
má látku nemá látku 18 4 6 68
174
Zatímco u karvakrolu se všechny mikrosatelitní alely nachází ve vazbě typu trans (repulsion), u linaloolu je tomu přesně naopak, tedy ve vazbě typu cis. Tento výsledek by se dal interpretovat tak, ţe zatímco přítomnost těchto mikrosatelitních alel inhibuje vznik karvakrolu, pozitivně ovlivňuje vznik linaloolu. Tento výsledek potvrzuje nadřazenou pozici linaloolu, o které referují Vernet et al. (1986). Zároveň je tímto experimentem potvrzena souvislost mezi výskytem konkrétních mikrosatelitních alel a chemických látek, přestoţe je mikrosatelitní DNA povaţována za selekčně neutrální díky častému výskytu v oblastech nekódujících sekvencí genomu (Brohede a Ellegren, 1999). Zatímco v nekódujících sekvencích zástupců sedmi eukaryotních organismů odlišných říší byly detekovány všechny typy mono-, di-, tri-, tetra-, penta- a hexamerních repetic, v kódujících sekvencích, pravděpodobně díky selekci podmíněné tripletovým genetickým kódem, se oproti tomu vyskytují pouze tri- a hexamerní mikrosatelitní repetice (Metzgar et al., 2000). O četnějším výskytu tripletových a hexamerních mikrosatelitních motivů v exonech u všech chromozomů s výjimkou chromozomu Y v lidském genomu referují Subramanian et al. (2003). Zhang et al. (2004) identifikovali v genomu Arabidopsis thaliana 1140 genů, které obsahovaly alespoň jeden lokus s opakujícím se motivem AG či AAG a počet repeticí ovlivňoval funkčnost genu. Hypoteticky moţný výskyt mikrosatelitních alel publikovaných Landergottem et al. (2006) pro rod Thymus v exonech genů podílejících se na vzniku monoterpenů určujících chemotyp je vzhledem k repetitivnímu motivu mikrosatelitních lokusů E070 (GA), D346 a D257 (AG), E089 (GAA) a D347 (GA) (GAA) nejvíce pravděpodobný pro lokus E089. Souvislost mezi mikrosatelitními lokusy a monoterpeny však můţe existovat i v případě, kdy se jednotlivé lokusy vyskytují mimo exony a s určujícími geny jsou předávány při crossing-overu společně. O narušené selektivní neutralitě mikrosatelitních lokusů u sledě obecného (Clupea harengus) referují Watts et al. (2008). Přestoţe byla detekována pouze střední těsnost závislosti (Obrázek 89 a 90) a výskyt linaloolu lze vysvětlovat maximálně z 63,8 % pro alelu E070/9 a výskyt karvakrolu s maximální hodnotou koeficientu kontingence 0,548 u téţe alely, odlišení všech šesti mikrosatelitních alel a jejich opačná vazbová fáze naznačují spojitost s výskytem obou látek.
175
Koeficient kontingence a asociace
Karvakrol
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
0,540
0,548 0,512
Mikrosatelitní alely
Obrázek 89.
0,496
0,504
Koeficient asociace V
0,478
Koeficient kontingence dle Pearsona
Průběh kontingence a asociace mikrosatelitních alel, které se vyskytovaly
Koeficient kontingence a asociace
společně s karvakrolem
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Linalool
0,638
0,590
0,626
0,416
Mikrosatelitní alely
Obrázek 90.
0,626
0,582 0,444
Koeficient asociace V
Koeficient kontingence dle Pearsona
Průběh kontingence a asociace mikrosatelitních alel, které se vyskytovaly
společně s linaloolem
176
Obdobná situace se opakovala rovněţ u sledování závislosti RAPD zón, kdy byly při hodnocení obou chemických látek společně detekovány zóny OPA17/13, OPD2/1, OPN11/12, OPN11/19, OPP14/5 a OPP14/13. Středně těsná závislost výskytu karvakrolu byla detekována ještě pro RAPD zónu OPP14/2, zatímco s výskytem linaloolu korelovaly dále také RAPD zóny OPD2/4, OPD2/16, OPM4/2, OPM4/12, OPM4/16, OPM4/21 a OPP14/5. Tento vysoký počet markerů a rovněţ skutečnost, ţe u linaloolu byly detekovány nejvyšší koeficienty kontingence a asociace jsou pravděpodobně ovlivněny nízkou
Karvakrol 0,525
0,483 0,418 0,448 0,456
Obrázek 91.
Koeficient asociace V
OPP14/15
OPP14/12
OPP14/9
OPP14/6
OPP14/3
OPN11/24
OPN11/21
OPN11/18
OPN11/15
OPN11/9
OPN11/12
OPN11/3
OPM4/21
OPM4/18
OPM4/15
OPM4/9
OPM4/12
OPM4/6
OPM4/3
OPD2/18
OPD2/15
OPD2/9
OPD2/12
OPD2/6
OPD2/3
OPA17/16
OPA17/13
OPA17/10
OPA17/7
RAPD zóny
OPN11/6
0,442
0,442
OPA17/4
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
OPA17/1
Koeficient kontingence a asociace
variabilitou populace Okruhlá, která představovala 84 % jedinců linaloového chemotypu.
Koeficient kontingence dle Pearsona
Průběh kontingence a asociace RAPD zón, které se vyskytovaly společně
s karvakrolem.
0,612
0,578
0,546 0,456
0,522
0,430 0,423 0,442
0,491
Obrázek 92.
Koeficient asociace V
OPP14/15
OPP14/12
OPP14/9
OPP14/6
OPN11/21
OPN11/18
OPN11/15
OPN11/12
OPN11/9
OPN11/6
OPN11/3
OPM4/21
OPM4/18
OPM4/15
OPM4/9
OPM4/12
OPM4/6
OPM4/3
OPD2/18
OPD2/15
OPD2/9
OPD2/12
OPD2/6
OPD2/3
OPA17/16
OPA17/13
OPA17/10
OPA17/7
OPA17/4
RAPD zóny
OPP14/3
0,402
0,445
OPN11/24
0,550
OPA17/1
Koeficient kontingence a asociace
Linalool 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Koeficient kontingence dle Pearsona
Průběh kontingence a asociace RAPD zón, které se vyskytovaly společně
s chemickými látkami definující linaloolový chemotyp. 177
Z následující Tabulky 63 vyplývá, ţe tyto markery byly detekovány ve vazbě typu cis pro linalool a genová vazbě typu trans pro karvakrol. Rovněţ pro ostatní zmíněné RAPD zóny se středně těsnou závislostí výskytu pouze s linaloolem či karvakrolem platila tato skutečnost. Mezi RAPD zóny s nejmenším mnoţstvím rekombinovaných jedinců patří OPD2/1 a OPN11/19. Všechny společné vybrané RAPD zóny a mikrosatelitní alely je v budoucnu moţné vyizolovat, osekvenovat a porovnat nalezené sekvence s databází publikovaných sekvencí rostlinného genomu. Tabulka 63.
Asociační tabulka mikrosatelitních markerů se středně těsnou závislostí výskytu
společně s výskytem karvakrolu a linaloolu Asociace RAPD zón RAPD zóna Karvakrol OPA17/13 má látku nemá látku má zónu 5 17 nemá 58 16
Asociace RAPD zón RAPD zóna Linalool OPA17/13 má látku nemá látku má zónu 2 14 nemá 22 58
OPD2/1 má zónu nemá
má látku
nemá látku 0 16 63 17
OPD2/1 má zónu nemá
má látku nemá látku 16 0 8 72
OPN11/12 má zónu nemá
má látku
nemá látku 4 16 59 17
OPN11/12 má zónu nemá
má látku nemá látku 16 4 8 68
OPN11/19 má zónu nemá
má látku
nemá látku 2 16 61 17
OPN11/19 má zónu nemá
má látku nemá látku 16 2 8 70
OPP14/5 má zónu nemá
má látku
nemá látku 15 25 48 8
OPP14/5 má zónu nemá
má látku nemá látku 19 21 5 51
OPP14/13 má zónu nemá
má látku
nemá látku 10 22 53 11
OPP14/13 má zónu nemá
má látku nemá látku 20 12 4 60
178
6 Závěr Závěry disertační práce vycházející ze stanovených cílů a shrnující dosaţené výsledky v souvislosti s jejich praktickým vyuţitím je moţné shrnout do následujících bodů: U vybraných druhů byly optimalizovány metody izolace DNA, která splňovala všechny parametry kvality i kvantity nezbytné pro molekulární analýzy zaloţené na principu PCR a sekvenování. Pro vybrané druhy rodu Thymus a Plantago byly nalezeny optimální podmínky in vitro kultivace. Při mikropropagaci nepřímou organogenezí z listových segmentů druhu P. lanceolata L. byla detekována somaklonální variabilita analýzou mikrosatelitních lokusů a metodou RAPD, přičemţ druhá zmíněná metoda nemusí vţdy poskytovat zcela stabilní výsledky. Byly vybrány molekulární metody zachycující vnitrodruhovou variabilitu vybraných druhů rodů Thymus a Plantago. Restrikčním štěpením byla detekována vnitrodruhová a mezidruhová variabilita jaderné DNA pro ribozomální RNA u vybraných druhů rodů Thymus a Plantago. Byly nalezeny 3 restriktázy detekující mezidruhovou variabilitu ITS regionu druhů Plantago lanceolata L., P. media L. a P. major L. a rozdílné sekvence byly potvrzeny pomocí sekvenační analýzy. Mezi 31 restrikčními enzymy se nevyskytoval enzym, pomocí něhoţ by bylo moţné na základě analýzy ITS regionu specificky odlišit zástupce rodu Thymus. Všechny populace druhu Plantago media ssp. longifolia L. lze na základě průměrných Diceho podobnostních koeficientů (48,67 – 66,52 %) získaných RAPD metodou a variability detekované restrikčním štěpením ITS1 regionu označit za vhodné genové zdroje a doporučit jejich uchovávání. Analýzou čtyř polymorfních mikrosatelitních lokusů byla sledována vnitrodruhová variabilita samosprašného druhu Plantago major ssp. major na třech lokalitách s odlišným vlivem antropogenní činnosti. Největší variabilita byla touto analýzou zachycena na dně opuštěného jámového etáţového lomu přírodní památky Vinařická hora u Kladna.
179
Na základě čtyř RAPD markerů byla stanovena podobnost mezi tetraploidními jedinci druhu Plantago lanceolata L. odrůdy Libor. Diceho průměrný koeficient podobnosti byl stanoven na 50,71. Odrůdy byla hodnocena také pomocí tří mikrosatelitních markerů, kterými bylo detekováno 29 alel, přičemţ více neţ 2 alely byly detekovány u 60 % genotypů. Analýzou tří polymorfních mikrosatelitních lokusů bylo detekováno 36 alel u 37 zástupců šesti druhů polní genové kolekce rodu Thymus. Pro jednotlivé alely byly v daných populacích stanoveny frekvence jejich výskytu a ostatní základní populačněgenetické parametry. Na základě výskytu alel byl sestaven dendrogram vyjadřující genetickou vzdálenost jednotlivých druhů, který odráţí vzdálenost druhů ve shodě s počtem chromozomů a rozdělením sekce Serpyllum do jednotlivých podsekcí. Při hodnocení vnitrodruhové variability šesti populací genových zdrojů polní kolekce druhu T. pulegioides L. byly na základě analýz mikrosatelitních lokusů a pomocí metody RAPD detekovány dvě populace, u kterých lze vzhledem k jejich uniformitě (3535 Okruhlá) a polyploidii (3526 Horní Blatná) doporučit vyřazení z kolekcí genových zdrojů. Vzhledem ke zjištěné triploidii populace Okruhlá a neschopnosti tvorby semen jsou rostliny zajímavé z hlediska šlechtitelského a ekonomického, kdy mohou slouţit jako stabilní zdroj linaloového chemotypu bez náchylnosti k hybridizaci s ostatními druhy. Přestoţe ke zmnoţení chromozomových sad mohlo dojít jiţ na původních lokalitách, při uchovávání populací mateřídoušek v polní kolekci bez izolátorů jsou rostliny vystaveny riziku příbuzenského kříţení, které je v tomto rodě běţné. Alternativním řešením s jistotou stability genomu je uchovávání těchto variabilních druhů v podmínkách in vitro. U jednotlivých zástupců šesti populací genových zdrojů druhu Thymus pulegioides L. stanovena kvalita silice. Na základě obsahu 55 detekovaných látek byly genotypy roztříděny mezi 8 chemotypů. Nejvíce četnými chemotypy byly chemotyp karvakrolový (52 %), linaloolový (20 %), geranialový (11 %) a thymolový (9 %). V oblasti Krušných hor bylo pozorováno přibliţně dvakrát větší zastoupení fenolových chemotypů, zatímco u populací z Beskyd byl detekován o 13 % větší podíl geranialového chemotypu. U dvou jedinců z beskydské populace Ochmelovské vrchy byla v izolované silici v obsahu 38,4 % a 39,5 % detekována látka, která byla na hmotnostním spektrometru označena jako 1,3,5-tris-methylen-cykloheptan. Vzhledem k tomu, ţe tato látka
180
doposud nebyla u rodu Thymus detekována, mohlo by se jednat o detekci nového chemotypu. Tuto hypotézu je však nutné ověřit podrobnějšími rozbory. Na základě Diceho podobnostních koeficientů vypočtených pro jednotlivé typy analýz – chemické, RAPD a mikrosatelitní mezi podobnostními maticemi hodnocených Mantelovým testem nebyla nalezena statisticky významná závislost (p < 0,05). Pearsonův korelační koeficient pro odhad míry závislosti podobností genotypů na základě chemického sloţení silice a RAPD analýz byl roven 0,279, korelací mikrosatelitního a chemického šetření byl detekován korelační koeficient o hodnotě 0,275 a jediná středně těsná závislost (0,542) byla detekována mezi podobnostními maticemi z mikrosatelitních a RAPD analýz. Pro 4 nejvíce četné chemotypy – karvakrolový, linaloolový, geranialový a thymolový nebyla pomocí koeficientu kontingence a asociace detekována těsná závislost mezi výskytem detekovaných RAPD zón, resp. mikrosatelitních alel s výskytem dominantní látky jednotlivých chemotypů (p < 0,05). Mezi výskytem alel s nejvyšší těsnostní závislosti jednotlivých markerů a hlavní chemické látky karvakrolového a linaloolového chemotypu byla detekována souvislost. Zatímco u karvakrolu se všechny zóny, resp. alely nachází ve vazbě typu trans (repulsion), u linaloolu je tomu přesně naopak, tedy ve vazbě typu cis (coupling). Při hodnocení závislosti společného výskytu látky a zóny, které jsou v genové vazbě, se vychází z minimální pravděpodobnosti rekombinací mezi přítomností RAPD zóny, resp. alely a chemické látky. Vzhledem k tomu, ţe výskyt rekombinatních jedinců nebyl zanedbatelný a rovněţ nebyla detekována větší neţ střední těsnost závislosti, lze konstatovat, ţe výskyt detekovaných zón RAPD markerů s výskytem chemické látky určující chemotyp nesouvisí. Souvislost výskytu shodných zón u karvakrolového a linaloolového
chemotypu
je
v budoucnu
moţné
vysledovat
jejich
izolací,
osekvenováním a porovnáním nalezených sekvencí s databází publikovaných sekvencí rostlinného genomu.
181
Vyuţití výsledků a doporučení pro další výzkum Rod Plantago Vzhledem k tomu, ţe genetická variabilita tetraploidní odrůdy Libor nebyla doposud hodnocena, jsou tyto informace cenné zejména pro její udrţovatele – Agrogen Ţelešice, spol. s.r.o. Údaje o genetické variabilitě analyzovaných populací druhu Plantago media ssp. longifolia L. mohou být vyuţity pro doplnění pasportních
tabulek charakterizujících
uchovávané genové zdroje v genobance VÚVR Praze-Ruzyni, v.v.i. Zvládnutí technik kultivace, mikropropagace a optimalizace regenerace rostlin v in vitro podmínkách je důleţité pro rychlé namnoţení vhodných genotypů, které mohou být pouţity při buď při rekultivacích, nebo jako zdroje s vysokým obsahem účinných látek ve farmaceutickém průmyslu. Při navození nepřímé organogeneze a mikropropagace metodou listových segmentů byla detekována
somaklonální
variabilita,
jejíţ
výskyt
lze
omezit
pouţitím
metody
mikropropagace, která nezahrnuje růstovou fázi kalusu. Rod Thymus Získané výsledky upozorňují na nutnost sledovat uchovávané populace druhu Thymus pulegioides L. v procesu obsazování lokality v polní kolekci, zejména po přenesení vybraných genotypů. Pozorováním vegetativního způsobu rozmnoţování ve vznikající polní kolekci lze vysledovat jedince, kteří sniţují variabilitu populace. Pro podchycení variability a vlastností populace z původní lokality je vhodné odebírat co nejvíce genotypů a jednotlivé populace prostorově izolovat. Celistvé informace o průběhu konzervace genových zdrojů mateřídoušek lze získat ověřením a porovnáním variability populací na lokalitách, odkud byly populace před 12 lety přeneseny. Zachování původního charakteru populace lze docílit sečením rostlin před kvetením či udrţováním v in vitro podmínkách. Tímto způsobem se však naruší přirozený vývoj populace, který pomocí rozmnoţování s kaţdou další generací v populacích na místech odběrů probíhá. Za
účelem
objasnění
mezidruhové
hybridizace
mateřídoušek
v souvislosti
s ověřováním stupně ploidie je moţné zaloţit experimentální hybridizační pokusy jednotlivých druhů, coţ je časově velmi náročný proces, který zároveň vyţaduje velmi dobré botanické znalosti tohoto rodu. K prohloubení souvislostí výskytu jednotlivých chemotypů s detekovanými RAPD zónami lze izolovat a sekvenovat RAPD zóny, které vykazovaly korelaci s výskytem linaloolu a karvakrolu s následným porovnáním nalezených sekvencí v databázi NCBI. 182
7 Přehled citovaných zdrojů Abouhamza, B., Allaoud, S., Karim, A. 2001. Ar – Himachalene. Molecules. 6 (12). M236. Abu-Romman, S. 2011. Comparison of methods for isolating high quality DNA from sage (Salvia officinalis). Journal of Medicinal Plants Research. 5 (6). 938-941. Al-Amierab, H., Mansour, B. M. M., Toaima, N., Korus, R. A., Shetty, K. 1999. Screening of high biomass and phenolic producing clonal lines of spearmint in tissue culture using Pseudomonas and azetidine-2 carboxylate. Food Biotechnology. 13 (3). 227–253. Alvarez, I., Wendel J. F. 2003. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molecular phylogenetics and evolution. 29 (3). 417-34. Amos, B., Pemberton, J. 1992. DNA fingerprinting in non-human populations. Current Opinion in Genetics & Development. 2 (6). 857–860. Ananga, A. O., Cebert, E., Soliman, K., Kantety, R., Pacumbaba, R. P., Konan, K. 2006. RAPD markers associated with resistance to blackleg disease in Brassica species. African Journal of Biotechnology. 5 (22). 2041-2048. Andrade, L., Manolakos, E. S. 2003. Signal background estimation and baseline correction algorithms for accurate DNA sequencing. The journal of VLSI signal processing. 35 (3). 229-243. Andreasen, K., Baldwin, B. G., Bremer, B. 1999. Phylogenetic utility of the nuclear rDNA ITS region in the subfamily Ixoroideae (Rubiaceae): comparisons with cpDNA rbcL sequence data. Plant Systematics and Evolution. 217 (1-2). 119-135. Andronico, F., De Lucchini, S., Grazianic, F., Nardi, I., Batistoni, R., Barsacchi-Pilone, G. 1985. Molecular organization of ribosomal RNA genes clustered at variable chromosomal sites in Triturus vulgaris meridionalis (Amphibia, Urodela). Journal of Molecular Biology. 186 (2). 219-229. Angers, B., Estoup, A., Jarne, P. 2000. Microsatellite size homoplasy, SSCP, and population structure: A case study in the freshwater snail Bulinus truncatu. Homoplasy and Population Structure. 17 (12). 1926-1932. Araneda, C., Neira, R., Iturra, P. 2005. Identification of a dominant SCAR marker associated with colourtraits in Coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Aquaculture. 247 (1-4). 67-73. Arregui, L. M., Veramendi, J., Mingo-Castel, A. M. 2003. Effect of gelling agents on in vitro tuberization of six potato cultivars. American Journal of Potato Research. 80 (2). 141-144. 183
Asghari, A., Mohammadi, S. A., Moghaddam, M., Mohammaddoost, H. 2007. Identification of QTLS controlling winter survival in Brassica napus using RAPD markers. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 21 (4). 413-416. Ashley, M. C., Longland, W. S. 2009. Assessing cheatgrass (Bromus tectorum) genetic diversity and population structure using rapd and microsatellite molecular markers. Western North American Naturalist. 69 (1). 63-74. Babbar, S. B., Jain, N. 1998. Isubgol as an alternative gelling agent in plant tissue culture media. Plant Cell Reports. 17 (4). 318-322. Babůrek, J., Pošmurný, K. 2001.Významné geologické lokality na území NP Šumava a CHKO Šumava. Silva Gabreta. 6. 27-31. Baer, CH. F., Miyamoto, M. M., Denver, D. R. 2007a. Mutation rate variation in multicellular eukaryotes: causes and consequences. Nature Reviews Genetics. 8. 619-631. Baer, G. Y., Yemets, A. I., Stadnichuk, N. A., Rakhmetov, D. B., Blume, Ya. B. 2007b. Somaclonal variaiblity as a source for creation of new varieties of finger millet (Eleusine coracana (L.) Gaertn.). Cytology and Genetics. 41 (4). 204-208. Baird, E., Cooper-Bland, S., Waugh, R., De Maine, M., Powell, W. 1992. Molecular characterization of inter- and intra-specific somatic hybrids of potato using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Molecular and General Genetics. 223 (3). 469-475. Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., Idaomar, M. 2008. Biological effects of essential oils - A Review. Food and Chemical Toxicology. 46 (2). 446-475. Baldwin, B. G. 1992. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: An example from the compositae. Molecular phylogenetics and evolution. 1 (1). 3–16. Barrett, S. C. H., Kohn, J. R. 1991. Genetic and evolutionary consequences of small population size in plants: implications for conservation. 3-30 pp. In: Falk, D. A., Holsinger, K. E. (eds.). Genetics and conservation of rare plants. Oxford university press. New York. p. 304. ISBN: 0195064291. Barciszewska, M. Z., Szymañski, M., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. 2001. Structure and functions of 5S rRNA. Acta Biochimica Polonica. 48 (1). 191-198. Barna, K. S., Wakhlu, A. K. 1988. Axillary shoot induction and plant regeneration in Plantago ovata Forssk. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 15 (2). 169-173. Bauer, K. 1939. Über Explantation „in vitro“, Ergebnisse Biol. 16. 336 – 512.
184
Begum, J., Dutta, S., Yusuf, M., Chowdhury, J. U., Ahmed, K., Ahmed, S., Anwar, M. N. 2007. Antimicrobial Activity of Cinnamomum tamala Essential Oil and Its Composition and Toxicity on White Strain Rats. Bangladesh Journal of Microbiology. 24 (1). 14-18. Belhassen, E., Atlan, A., Couvet, D., Gouyon, P. H., Quetier, F. 1993. Mitochondrial genome of Thymus vulgaris L. (Labiate) is highly polymorphic between and among natural populations. Heredity. 71 (5). 462–472. Benbouza, H., Jacquemin, J. M., Baudoin, J. P., Mergeai, G. 2006. Optimalization of reliable, fast, cheap and sensitive silver staining method to detect SSR markers in polyacrylamide gels. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 10 (2). 77–81. Benjamins, R., Scheres, B. 2008. Auxin: the looping star in plant development. Annual Review of Plant Biology. 59. 443-65. Benett, I. J., Mc Comb, J. A., Tonkin, C. M., Mc David, D. A. J. 1994. Alternating cytokinins in multiplication media stimulates in vitro shoot growth and rooting of Eucalyptus globulus Labill. Annals of Botany. 74 (1). 53-58. Berglund, A. B. N., Saura, A., Westerbergh, A. 2006. Electrophoretic evidence for disomic inheritance and allopolyploid origin of the octoploid Cerastium alpinum (Caryophyllaceae). Journal of Heredity. 97 (3). 296-302. Beruto, M., Lanteri, L., Portogallo, C. 2004. Micropropagation of tree peony (Paeonia suffruticosa). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 79 (2). 249–255 Borrow, A., Brian, P. W., Chester, V. E., Curtis, P. J., Hemming, H. G., Henehan, C., Jeffreys, E. G., Lloyd, P. B., Nixon, I. S., Norris, Radley, M. 2006. Gibberellic acid, a metabolic product of the fungus Gibberella fujikuroi: Some observations on its production and isolation. Journal of the Science of Food and Agriculture. 6 (6). 340348. Bos, M., Harmens, H., Vrieling, K. 1986. Gene flow in Plantago I. Gene flow and neighbourhood size in P. lanceolata. Heredity. 56. 43–54. Böszörményi, A., Héthelyi, E., Farkas, A., Horváth, G., Papp, N., Lemberkovics, E., Szoke, E. 2009. Chemical and genetic relationships among sage (Salvia officinalis L.) cultivars and Judean sage (Salvia judaica Boiss.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11). 4663-4667. Bottin, L., Isnard, C., Lagrange, A., Bouvet, J. M. 2007. Comparative molecular and phytochemical study of the tree species Santalum austrocaledonicum (Santalaceae) 185
distributed in the New-Caledonian Archipelago. Chemistry & Biodiversity. 4 (7). 1541–1556. Brandstätter, A., Parsons, T. J., Parson, W. 2003. Rapid screening of mtDNA coding region SNPs for the identification of west European Caucasian haplogroups. International Journal of Legal Medicine. 117 (5). 291-298. Brohede, J., Ellegren, H. 1999. Microsatellite evolution: polarity of substitutions within repeats and neutrality of flanking sequences. Proceedings of the Royal Society of London. Series B 266. 825-833. Bruneton, J. 1999. Pharmacognosy, Phytochemistry Medicinal Plants. Lavoisier Publishing Paris. p. 1136. ISBN: 2743000287. Bruvo, R., Michiels, N. K., D'Sousa, T. G., Schulenberg, H. 2004. A simple method for calculation of microsatellite genotypes irrespective of ploidy levels. Molecular Ecology.13 (7). 2101–2106. Budar, F., Pelletier, G., 2001. Male sterility in plants: occurrence, determinism, significance and use. Comptes Rendus de l Academie des Sciences III. 324 (6). 543-550. Budzianowska, A., Skrzypczak, L., Budzianowski, J. 2004. Phenylethanoid glucosides from in vitro propagated plants and callus cultures of Plantago lanceolata L. Planta Medica. 70 (9). 834–840. Buchanan, F. C., Thue, T. D. 1998. Intrabreed polymorphic information content of microsatellites in cattle and sheep. Canadian Journal of Animal Science. 78. 425– 428. Buschiazzo, E., Gemmell, N. J. 2006. The rise, fall and renaissance of microsatellites in eukaryotic genomes. BioEssays. 28 (10). 1040–1050. Caboche, M., Aranda, G., Poll, A. M., Huet, J. C., Leguay, J. J. 1984. Auxin Conjugation by Tobacco Mesophyll Protoplasts. Plant Physiology. 75 (1). 54 – 59. Castleman, M. 2004. Velká kniha léčivých rostlin. Columbus. Praha. 635 s. ISBN: 8072491776. Cole, CH. T. 2005. Allelic and population variation of microsatellite loci in aspen (Populus tremuloides). New Phytologist. 167 (1). 155–164. Comai, L. 2005. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature review genetics. 6 (11). 836–846. Cousins, M. M., Adelberg, J. W., 2007. In vitro plant and organ culture of medicinal and neutriceutical species in laboratory and industrial scales. Acta Horticulturae, International Symposium on Medicinal and Nutraceutical Plants. 756. 95-102. 186
Čáp, J. 1979. Klíč k určování československých mateřídoušek, Zpráva Čs. Bot. Společ. 14. Praha. s. 101-108. Český lékopis. 2009. 3. sv. 1. vyd. Granda publishing as. Praha. 1280 s. ISBN: 9788024729947. Čílová, D., Vejl, P., Melounová, M., Vašek, J., Sedlák, P., Vašíčková, Š. 2009. Mikrosatelitní analýza variability populací jitrocele kopinatého (Plantago lanceolata L.) a jitrocele většího (P. major L.). Nové poznatky z genetiky a šlachtenia polnohospodárskych rastlín, Sborník ze 16. vědecké konference v Piešťanech. 21.-22. 10. 2009, 95–96. Číţková, A., Adam, M., Pavlíková, P., Ventura, K. 2011. Analýza sloţek silic v bylinných nápojích s vyuţitím metody mikroextrakce jednou kapkou. Chemické Listy. 105 (13). 13-15. Dakin, E. E., Avise, J. C. 2004. Microsatellite null alleles in parentage analysis. Heredity. 93 (5). 504–509. Daneshvar-Royandezagh, S., Khawar, K. M., Ozcan, S. 2009. In vitro micropropagation of garden thyme (Thymbra spicata L. var. spicata L.) collected from southeastern Turkey using kotyledon node. Biotechnology & Biotechnology. 23 (3). 25-32. Das née Pal, M., Raychaudhuri, S. S. 2003. Estimation of genetic variability in Plantago ovata cultivars. Biologia Plantarum. 47 (3). 459-462. Decout, E., Dubois, T., Guedira, M., Dubois, J., Audran, J. C., Vasseur, J. 1994. Role of temperature as a triggering signal for organogenesis or somatic embryogenesis in wounded leaves of chicory cultured in vitro. Journal of Experimental Botany. 45 (12). 1859-1865. Delarue, M., Santoni, V., Caboche, M., Bellini, C. 1997. Cristal mutations in Arabidopsis confer a genetically heritable, recessive, hyperhydric phenotype. Planta. 202 (1). 5161. De Capite, L. 1955. Action of light and temperature on growth of plant tissue cultures in vitro. American Journal of Botany. 42 (10). 869-873. De Silva, H. N., Hall, A. J., Rikkerink, E., McNeilage, M. A., Fraser, L. G. 2005. Estimation of allele frequencies in polyploids under certain patterns of inheritance. Heredity. 95 (4). 327-334. Debergh, P. C. 2006. Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium. Physiologia Plantarum. 59 (2). 270–276. Dhar, M. K., Friebe, B., Kaul, S., Gill, B. S. 2006. Characterization and physical mapping of ribosomal RNA gene families in Plantago. Annals of Botany. 97 (4). 541–548. 187
Dice, L. R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology. 26 (3). 297–302. Dijkstra, P., Kuiper, P. J. C. 1989. Effects of exogenously applied growth regulators on shoot growth of inbred lines of Plantago major differing in relative growth rate: differential response to gibberellic acid and (2-chloroethyl)-trimethyl-ammonium chloride. Physiologia Plantarum. 77 (4). 512–518. Doleţel, J., Greilhuber, J., Suda, J. 2007. Flow Cytometry with Plant Cells. Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. p. 479. ISBN: 9783527314874. Dommée, B., Assouad, M. W., Valdeyron, G. 1978. Natural selection and gynodioecy in Thymus vulgaris L. Botanical Journal of the Linnean Society. 77 (1). 17–28. Dorman, H. J., Deans, S. G. 2000. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology. 88 (2). 308 – 16. Dostál, J. 1989. Nová květena ČSSR 2. díl. Academia. Praha. 1340 s. ISBN: 8024206722. Dotlačil, L. 1998. Metody konzervace genetických zdrojů rostlin a moţnosti jejich vyuţití. In: Metody konzervace genofondu rostlin a moţnosti jejich vyuţití v ČR. Sborník referátů ze semináře konaného 19. listopadu 1998 ve VÚRV Praha-Ruzyně. Výzkumný ústav rostlinné výroby. Praha. 96 s. ISBN. 8023835696. Dover, G. A. 1982. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution. Nature. 299 (5879). 111-117. Duarte, J. M., dos Santos, J. B., Melo, L. C. 1999. Comparison of similarity coefficients based on RAPD markers in the common bean. Genetics and Molecular Biology. 22 (3). 427-432. Dunbar-Co, S., Wieczorek, A. M. 2011. Genetic structure among populations in the endemic Hawaiian Plantago lineage: insights from microsatellite variation. Plant Species Biology. 26 (2). 134–144. Dušek, K., Dušková, E., Karlová, K. 2005. Sběry genetických zdrojů zelenin, léčivých a aromatických rostlin, jejich monitoring a konzervace. In: Sborník referátů ze seminářů Aktuální problémy práce s genofondy rostlin v ČR, 23. 11. 2005 Hradec Králové a 22. 11. 2006, Kostelany. VÚRV, v.v.i. 26-31. ISBN: 808701104. Dušková, E. 20. 4. 2010, pers. comm. Ebrahim, M. K. H., Ibrahim, A. I. 2000. Influence of medium solidification and pH value on in vitro propagation of Maranta leuconeura cv. Kerchoviana. Scientia Horticulturae. 86 (3). 211-221. 188
Edwards, A., Civitello, A., Hammond, H. A., Caskey, C. T. 1991. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tendem repeats. American Journal of Human Genetics. 49 (4). 746-56. Eguchi, Y., Curtis, O. F., Shetty, K. 1996. Interaction of hyperhydricity‐preventing Pseudomonas sp. with oregano (Origanum vulgare) and selection of high phenolics and rosmarinic acid‐producing clonal lines. Food Biotechnology. 10 (3). 191-202. Ehlers, B. K., Maurice, S., Bataillon, T. 2005. Sex inheritance in gynodioecious species: a polygenic view. Proceedings of The Royal Society. 272 (1574). 1795–1802. Echeverrigaray, S., Agostini, G., Atti-Serafini, L., Paroul, N., Pauletti, G. F., Atti dos Santos, A. C. 2001. Correlation between the chemical and genetic relationships among commercial thyme cultivars. Journal of Agriculture Food and Chemistry. 49 (9). 4220-4223. El-Morsy, Sh. I., Dorra, M.D.M., Abd El-Hady, E. A. A., Hiaba, A. A. A., Mohamed, A. Y. 2009. Comparative studies on diploid and tetraploid levels of Nicotiana alata. Academic Journal of Plant Sciences. 2 (3). 182-188. Ennos, R. A. 2001. Inferences about spatial processes in plant population from the analysis of molecular markers. In: Silvertown, J., Antonovics, J. eds. Integrating Ecology and Evolution in a Spatial Context. Bleckwell Scinece, Cambridge, 423 p. ISBN: 063205824. Estoup, A., Jarne, P., Cornuet, J. M. 2002. Homoplasy and mutation model at microsatellite loci and thein consequences for population genetics analysis. Molecular Ecology. 11 (9). 1591-1604. Field, D., Wills, C. 1996. Long polymorphic microsatellites in simple organisms. Proceeding of the Royal Society of London, Series B: Biological Sciences. 263. 209-215. Flegr, J. 2005. Evoluční biologie. Academia. Praha. 559 s. ISBN: 9788020017673. Flegr, J. 2006. Zamrzlá evoluce aneb je to jinak, pane Darwine. Academia. Praha. 325 s. ISBN: 9788020014535. Fons, F., Tousch, D., Rapior, S., Gueiffier, A., Roussel, J. L., Gargadennec, A., Andary, C. 1999. Phenolic profiles of untransformed and hairy root cultures of Plantago lanceolata. Plant Physiology and Biochemistry. 37 (4). 291-296. Fracaro, F., Zacaria, J., Echeverrigaray, S. 2005. RAPD based genetic relationships between populations of three chemotypes of Cunila galioides Benth. Biochemical Systematics and Ecology. 33 (4). 409 – 417.
189
Fras, A., Maluszynska, J. 2003. Regeneration of diploid and tetraploid plants of Arabidopsis thaliana via callus. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. 45 (2). 145–152. Fraternale, D., Giamperi, L., Ricci, D., Rocchi, M. B. L., Guidi, L., Epifano, F., Marcotullio, M. C. 2003. The effect of triacontanol on micropropagation and on secretory system of Thymus mastichina. Plant cell, Tissue and Organ Culture. 74 (1). 87–97. Freeland, J. R. 2005. Molecular Ecology. 1st ed. John Wiley & Sons. Chichester. 400 p. ISBN: 9780470090626 Gálvez, M., Mart´ın-Cordero, C., López-Lázaro, M., Cortés, F., Ayuso, M. J. 2003. Cytotoxic effect of Plantago spp. on cancer cell lines. Journal of Ethnopharmacology. 88 (4). 125 – 130. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. 1968. Nutriet requirement of susupension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research. 50 (1). 151-158. Gao, S. L., Zhu, D. N., Cai, Z. H., Xu, D. R. 1996. Autotetraploid plants from colchicinetreated bud culture of Salvia miltiorrhiza Bge. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 47 (1). 73–77. Gaspar, T., Kevers, C., Franck, T., Bisbis, B., Billard, J.-P., Huault, C., Le Dily, F., Petit-Paly, G., Rideau, M., Penel, C., Crèvecoeur, M., Greppin, H. 1995. Paradoxical results in the analysis of hyperhydric tissues considered as being under stress: Questions for a debate. Bulgarian Journal of Plant Physiology. 21 (2–3). 80–97. George, E. F., Sherrington, P. D. 1984. Plant propagation by tissue culture: handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics. Eversley. p. 709. Goldstein, D. B., Schlötterer, Ch. 1999. Microsatellites, Evolution and Applications. 1st edition. Oxford University Press. p. 336. ISBN: 9780198504078. Gonçalves, S., Martins, N., Romano, A. 2009. Micropropagation and conservation of endangered species Plantago algarbiensis and P. almogravensis. Biologia Plantarum. 53 (4). 774-778. González, A. I., Peláez, M. I., Ruiz, M. L. 1996. Cytogenetic variation in somatic tissue cultures and regenerated plants of barley (Hordeum vulgare L.). Euphytica. 91 (1). 37-43. Gottschalk, W. 1976. Die Bedeutung der Polyploidie fur die Evolution der Pflanzen. Gustav Fisher Verlag. Stuttgart. p. 500. ISBN: 3437302213. Goudet, J. 2002. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3.2).
190
Gouyon, P. H., Vernett, P. 1982. The Consequences of Gynodioecy in Natural Populations of Thymus vulgaris L. Theoretical and Applied Genetics. 61. 315-320. Gouyon, P. H., Vernett, P. Guillerm, J. L., Valdeyron, G. 1986. Polymorphisms and environment: the adaptive value of the oil polymorphisms in Thymus vulgaris L. Heredity. 57. 59-66. Granger, G., Passet, J. 1973. Thymus vulgaris spontane de France: races chimiques and chemotaxonomie. Phytochemistry. 12. 1683-1691. Grattapaglia, D., Sederoff, R. 1994. Genetic Linkage Maps of Eucalyptus grandis and Eucalyptus urophylla Using a Pseudo-Testcross: Mapping Strategy and RAPD Markers. Genetics. 137 (4). 1121-1137. Gribble, K., Sarafis, V., Conroy, J. 2003. Vitrified plants: Towards an understanding of their nature. Phytomorphology. 53 (1). 1-10. Grisolia, A. B., Moreno, V. R., Campagnari, F., Milazzotto, M. P., Garcia, J. F., Adania, C. H., Souza, E. B. 2007. Genetic diversity of microsatellite loci in Leopardus pardalis, Leopardus wiedii and Leopardus tigrinus. Genetics and Molecular Research. 6 (2). 382–389. Groendahl, E., Ehlers, B. K., Keefover-Ring, K. 2008. A new cis-sabinene hydrate chemotype detected in large thyme (Thymus pulegioides L.) growing wild in Denmark. Journal of Essential Oil Research. 20. 40-41. Guo, S., Zhang, D., Cao, T. 2002. Principal axes analyses on population genetic differentiation of Plantago asiatica in Zhejiang. The journal of applied ecology. 13 (10). 1283-86. Gustafson, J. P., Dera, A. R., Petrovic, S. 1988. Expression of modified rye ribosomal RNA genes in wheat. Genetics. 85 (11). 3943-3945. Hale, M. L., Wolff, K. 2003. Polymorphic microsatellite loci in Plantago lanceolata. Molecular Ecology Notes. 3 (1). 134–135. Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT: Nucleic Acids Symposium Series 41, 95-98. Hang, A., Bregitzer, P. 1993. Chromosomal variations in immature embryo-derived calli from six barley cultivars. Journal of Heredity. 84 (2). 105–108. Hassan, N. S. 2004. Storage of in vitro banana shoot cultures at low temperature or under mineral oil layer. International Journal Of Agriculture & Biology. 6 (2). 303–306.
191
He, Y. Y., Liu, P., Li, J., Wang, Q. Y. 2009. Sequence characterized amplified regions (SCAR) reveal candidate markers linked to growth traits in the Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis. Fisheries Science. 75 (5). 1267-1274. Hess, D. 1983. Fyziologie rostlin, 1. vyd., Academia, Praha, 348 s. Heywood, V. H., Iriondo, J. M. 2003. Plant conservation: odl problems, new perspectives. Biological Conservation. 113 (3). 321–335. Hillis, D. M., Dixon, M. T. 1991. Ribosomal DNA: Molecular evolution and phylogenetic inference. The Quarterly Review of Biology. 66 (4). 411-453. Hooglander, R., Lumaret, N., Bos, M. 1993. Inter-intraspecific variation of chloroplast DNA of European Plantago spp. Heredity. 70 (3). 322–334. Hwang , U., Kim, W. 1999. General properties and phylogenetic utilities of nuclear ribosomal DNA and mitochondrial DNA commonly used in molecular systematics. The Korean Journal of Parasitology. 37 (4). 215-228. Chaturvedi, H .C., Jain, M., Kidwai, N. R. 2007. Cloning of medicinal plants through tissue culture - a review. Indian Journal of Experimental Biology. 45 (11). 937 - 348. Che, P., Lall, S., Nettleton, D., Howell, S. H. 2006. Gene expression programs during shoot, root, and callus development in Arabidopsis tissue culture. Plant Physiology. 141 (2). 620-637. Chen, H., Xu, G., Loschke, D. C., Tomaska, L., Rolfe, B. G. 1995. Efficient callus formation and plant regeneration from leaves of oats (Avena sativa L.). Plant Cell Reports. 14 (6). 393-397. Cheng, F. S. , Weeden, N. F., Brown, S. K. 1996. Identification of co-dominant RAPD markers tightly linked to fruit skin color in apple. Theoretical and Applied Genetics. 93 (1-2). 222-227. Chistiakov, D. A., Hellemans, B., Volckaert, F. A. M. 2005. Microsatellites and their genomic distribution, evolution, function and applications: A review with special reference to fish genetics. Aquaculture. 255 (1-4). 1-29. Chloupek, O. 2000. Genetická diverzita, šlechtění a semenářství, Academia, Praha, 310 s. Inoue, E., Kasumi, M., Sakuma, F., Anzai, H., Amano, K., Hara, H. 2006. Identification of RAPD marker linked to fruit skin color in Japanese pear (Pyrus pyrifolia Nakai). Scientia Horticulturae. 107 (3). 254-258. Ishikawa, N., Yokoyama, J., Tsukaya, H. 2009. Molecular evidence of reticulate evolution in the subgenus Plantago (Plantaginaceae). American Journal of Botany. 96 (9). 16271635. 192
Ivanova, M., Van Staden, J. 2008. Effect of ammonium ions and cytokinins on hyperhydricity and multiplication rate of in vitro regenerated shoots of Aloe polyphylla. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 92 (2). 227–231. Jakše J., Bandelj D., Javornik B. 2002. Eleven new microsatellites for hop (Humulus lupulus L.). Molecular Ecology Notes 2 (4). 544–546. Jalas, J. 1948. Chromosome studies in Thymus I. Somatic chromosome numbers with special reference to the fennoscandian forms. Hereditas 34 (4). 414–434. Jansky, S. 2000. Breeding for disease resistance in potato (ed. Janick J.). Plant Breeding Reviews. 19. 69–72. Jarne, P., Lagoda, P. J. L. 1996. Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology and Evolution. 11 (10). 424-429. Jeffreys, A. J., Tamaki, K., MacLeod, A., Monckton, D. G., Neil, D. L., Armour, J.,A. 1994. Complex gene conversion events in germline mutation at human minisatellites. Nature Genetics. 6 (2).136-145. Jirásek, V., Starý, F. 1986. Kapesní atlas léčivých rostlin. Státní pedagogické nakladatelství. Praha. 1986. 368 s. Johnson, S. S., Phillips, R. L., Rines, H. W. 1987. Possible role of heterochromatin in chromosome breakage induced by tissue culture in oats (Avena sativa L.). Genome. 29 (3). 439–446. Joubés, J., Chevalier, Ch. 2000. Endoreduplication in higher plants. Plant Molecular Biology. 43 (5-6). 735-745. Juven, B. J., Kanner, J., Schved, F., Weisslowicz, H. 1994. Factors that interact with the antibacterial action of thyme essential oil and its active constituents. Journal of Applied Microbiology. 76 (6). 626–631. Kaçar, Y. A., Biçen, B., Varol, I., Mendi, Y. Y., Serçe, S., Cetiner, S. 2010. Gelling agents and culture vessels affect in vitro multiplication of banana plantlets. Genetics and Molecular Research. 9 (1). 416-424. Kadota, M., Niimi, Y. 2003. Effects of cytokinin types and their concentrations on shoot proliferation and hyperhydricity in in vitro pear cultivar shoots. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 72 (3). 261-265. Kataeva, N. V., Alexandrova, I. G., Butenko, R. G., Dragavtceva, E. V. 1991. Effect of applied and internal hormones on vitrification and apical necrosis of different plants cultured in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 27 (2). 149-154. Keane, B., Pelikan, S., Toth, G. P., Smith, M. K., Rogstad, S. H. 1999. Genetic diversity of 193
Typha latifolia (Typhaceae) and the impact of pollutants examined with tandem-repetitive DNA probes, American Journal of Botany. 86 (9). 1226–1238. Kaeppler, S. M, Kaeppler, H. F., Rhee, Y. 2000. Epigenetic aspects of somaclonal variation in platns. Plant Molecular Biology. 43 (2-3). 179–188. Kalinowski, S. T., Taper, M. L. 2006. Maximum likelihood estimation of the frequency of null alleles at microsatellite loci. Conservation Genetics. 7 (6). 991–995. Kalinowski, S. T., Taper, M. L., Marshall, T. C. 2007. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology. 16 (5). 1099-1006. Kaloustian, J., Abou, L., Mikail, C., Amiot, M. J., Portugal, H. 2005. Southern French thyme oils: chromatographic study of chemotypes. Journal of the Science of Food and Agriculture. 85 (14). 2437–2444. Kevers, C., Coumans, M., Coumans-Gillès, M. F., Caspar, T. 1984. Physiological and biochemical events leading to vitrification of plants cultured in vitro. Physiologia Plantarum. 61 (1). 69–74. Keefover-Ring, K., Thompson, J. D., Linhart, Y. B. 2009. Beyond six scents: defububg a seventh Thymus vulgaris chemotyp new to southern France by ethanol exctraction. Flavour and Fragrance Journal. 24. 117-122. Kessler, C., Manta, V. 1990. Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases: A review. Gene. 92 (1-2). 1–248. Khawar, K. M., Sarhin, E. O., Sevimay, C. S., Cocu, S., Parmaksiz, I., Irambey, S., Ipek, A., Kaya, M. D., Sancak, C., Ozcan, S. 2005. Adventitious shoot regeneration and micropropagation of Plantago lanceolata L. Periodicum Biologorum. 107 (1). 113– 116. Kikuchi, S., Isagi Y. 2002. Microsatellite genetic variation in small and isolated populations of Magnolia sieboldii ssp. japonica. Heredity. 88 (4). 313–332. Klimko, M., Idzikowska, K., Truchan, M., Kreft, A. 2004. Pollen morphology of Plantago species native to Poland and their taxonomic implications. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 73 (2). 103-111. Kof, E. M., Vinogradova, I. A., Kalibernaya, Z. V., Chuvasheva, E. S., Kondykov, I. V. 2002. Characterization of hormonal complex in pea phenotypes differing in leaf morphology. Russian Journal of Plant Physiology. 49 (4). 507-512. Kolibáč, J. 1996. O uţitečnosti, účelu a zbytečnosti. Vesmír. 74. 331.
194
Koorevaar, G. N., Ivanovic, S., Van Damme, J. M. M., Koelewijn, H. P., Van’T Westende, W. P. C., Smulders, M. J. M., Vosman, B. 2002. Dinucleotide repeat microsatellite markers for buck’s-horn plantain (Plantago coronopus). Molecular Ecology Resources. 2 (4). 524–526. Kostaki, M., Giatrakou, V., Savvaidis, I. N., Kontominas, M. G. 2009. Combined effect of MAP and thyme essential oil on the microbiological, chemical and sensory attributes of organically aquacultured sea bass (Dicentrarchus labrax) fillets. Food Microbiology. 26 (5). 475-482. Kováč, J. 1995. Explantátové kultury rostlin. Vydavatelství Univerzity Palackého v Olomouci. Olomouc. 140 s. ISBN: 8070440368. Kögl, F., Haagen-Smit, A. J., Erxleben, H. 1933. Uber ein Phytohormon der Zell-streckung. Reindarstellung des Auxins aus menschlichen Harn. IV.Mitteilung. Zeitschrift fur physicalische Chemie. 214. 241–261. Krishnamurthi, M. 1976. Isolation, fusion and multiplication of sugarcane protoplasts and comparison of sexual and parasexual hybridization, Journal Euphytica. 25 (1). 145150. Kubát, K., Hrouda, L., Chrtek, J. jun., Kaplan, Z., Kirschner, J., Štěpánek, J. 2002. Klíč ke květeně České republiky. Academia. Praha. 980 s. ISBN: 8020008365. Kuiper, P. J. C., Bos, M. 1992. Plantago: A multidisciplinary study. Ecological Studies, Springer Verlag, Berlin. 30 (4). p. 358. Landergott, U., Naciri, Y., Schneller, J. J., Holderegger, R. 2006. Allelic configuration and polysomic inheritance of highly variable microsatellites in tetraploid gynodioecious Thymus praecox agg., Theoretical and Applied Genetics. 113 (3). 453-465. Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. 1981. Somaclonal variation: a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical Applied Genetics. 60 (4). 197–214. Leberg, P. L. 2002. Estimating allelic richness: effects of sample size and bottlenecks. Molecular Ecology. 11 (11). 2445-2449. Legendre, M., Pochet, N., Pak, T. 2007. Sequence-bsed estimation of minisatellite and microsatellite repeat variability. Genome Research. 17 (12). 1787-1796. Letham, D. S., Palni, L. M. 1983. The biosynthesis and metabolism of cytokinins. Annual Review of Plant Physiology. 34. 386 – 399. Levin, D. A. 2002. The role of chromosomal change in plant evolution. Oxford University Press. New York. 230 p. ISBN: 0195138600.
195
Levinson, G., Gutman, G. A. 1987. Slippedstrand mispairing: A major mechanism for DNA sequence evolution. Molecular and Biology Evolution 4 (3). 203-221. Lewis, W. H. 1980. Polyploidy in species populations. 104–143. In: Polyploidy, Biological Relevance. Plenum Press. New York. p. 594. ISBN: 9780306403583. Li, R., Mock, R., Huang, Q., Abad, J., Hartung, J., Kinard, G. 2008. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2). 48–55. Li, Y. C., Korol, A. B., Fahima, T., Beiles, A., Nevo, E. 2002. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review. Molecular Ecology. 11 (12). 2453-2465. Litt, M., Luty, J. A. 1989. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics. 44 (3). 397-401. Liu, X., Wang, L. P., Li, Y. C., Li, H. Y., Yu, T., Zheng, X. D. 2009. Antifungal activity of thyme oil against Geotrichum citri-aurantii in vitro and in vivo. Journal of Applied Microbiology. 107 (5). 1450–1456. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., (eds.). 2000. Molecular Cell Biology. 4th edition. W. H. Freeman and Company. New York. p. 973. ISBN: 0716731363. Loeschcke, V., Tomiuk, J., Jain, S. K. 1994. Conservation Genetics. Birkhäuser Verlag. Basel p. 445. ISBN: 3764329394. Loţiene, K., Venskutonis, P. R. 2005. Influence of environmental and genetic factors on the stability of essential oil composition of Thymus pulegioides. Biochemical systematic and ecology. 33. 517-525. Mahdavi, S., Karimzadeh, G. 2010. Karyological and nuclear DNA content variation in some Iranian endemic Thymus species (Lamiaceae). Journal of Agricultural Science and Technology. 12 (4). 447-458. Makowczynska, J., Andrzejewska-Golec, C. E., Sliwinska, C. E. 2008. Nuclear DNA content in different plant materials of Plantago asiatica L. cultured in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 94 (1). 65–71. Makowczynska, J., Andrzejewska-Golec, C. E. 2003. Micropropagation of Plantago asiatica through culture of shoot-tips. Acta societatis botanicorum poloniae. 72 (3). 191–194. Makowczynska, J., Andrzejewska-Golec, C. E. 2008. Micropropagation of Plantago camtschatica Link. Acta societatis botanicorum poloniae. 77 (4). 269–273.
196
Manicacci, D., Atlan, A., Rossello, J. A. E., Couvet, D. 1998. Gynodioecy and reproductive trait variation in three Thymus species (Lamiaceae). International Journal of Plant Science. 159 (6). 948–957. Mantel, N. 1967. The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Ressearch. 27. 209-220. Martin, G. B., Williams, J. G. K., Tanksley, S. D. 1991. Rapid identification of markers linked to a Pseudomonas resistence gene in tomato by using random primers and near-isogenic lines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6). 23362340. Mártonfi, P. 1992. Polymorphism of Essentials oil in Thymus pulegioides subsp. chamaedrys in Slovakia. Journal of Essentials Oil Research. 4. 173-179. Mártonfi, P., Grejtovský, A., Repčák, M. 1994. Chemotype pattern differentiation of Thymus pulegioides on different substrates. Biochemical systematics and ecology. 22 (8). 819-825. Mártonfi, P., Mártonfiová, L. 1996. Thymus chromosome numbers from Carpathians and Pannonia. Thaiszia. 6. 25-38. Masterson, J. 1994. Stomatal size in fossil plants: Evidence for polyploidy in majority of angiosperms. Science. 264 (5157). 421–424. Matesanz, S., Gimeno, T. E., De la Cruz, M., Escudero, A., Valladares, F. 2011. Competition may explain the fine-scale spatial patterns and genetic structure of two co-occurring plant congeners. Journal of Ecology. 99 (3). 838–848. Mayor, M. L., Nestares, G., Zorzoli, R., Picardi, L.A. 2003. Reduction of hyperhydricity in sunflower tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 72 (1). 99-103. Mayr, E. 1963. Animal species and evolution. Belknap Press. Cambridge. p. 797. ISBN: 0674690133. Mäkinen, H. S., Shikano, T., Cano, J. M., Merilä, J. 2008. Hitchhiking mapping reveals a candidate genomic region for natural selection in three-spined stickleback chromosome VIII. Genetics. 178 (1). 453–465. McClintock, B. 1984. The significance of responses of the genome to challenge. Science. 226 (4676). 792–801. Mederos, S., Méndez, M. 1991. Tissue culture studies on Plantago major L.: use of shoot-tip explantants. In vitro cell, development of biological plants. 27 (2). 386. Mederos, S., Martin, C., Navarro, E., Ayuso, M. J. 1997. Microporpagation of a medicinal plant Plantago major L. Biologia Plantarum. 40 (3). 465 – 468. 197
Mendes, M. L., Romano, A. 1999. In vitro cloning of Thymus mastichina L. field-grown plants. Acta Horticulture. 502. 303-306. Metzgar, D., Bytof, J., Wills, C. 2000. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA. Genome Research. 10 (1). 72–80. Metzker, L. M. 2010. Sequencing technologies - the next generation. Nature Reviews Genetics. 11 (1). 31-46. Mewes S., Krüger, H., Pank, F. 2008. Physiological, morphological, chemical and genomic diversities of different origins of thyme (Thymus vulgaris L.). Genetic Resources and Crop Evolution. 55 (8). 1303-1311. Mihulka, S. 2001. Jak vzniká oddělené pohlaví u rostlin? Vesmír. 80. 12 . Michaelsa, S. D., Amasinoa, R. M. 1999. Flowering locus C encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering. Plant Cell. 11. 949-956. Michelmore, R. W., Paran, I., Kesseli, R. V. 1991. Identification of markers linked to diseaseresistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88. 9828-9832. Michet, A., Chalchat, J. C., Figuérédo, G., Thébaud, G., Billy, F., Pétel, G. 2008. Chemotypes in the volatiles of wild thyme (Thymus pulegioides L.). Journal of Essential Oil Research. 20 (2). 101-103. Miller, J. 1981. Fossil pollen records of extant angiosperms. The Botanical Review. 47 (1). 1142. Miller, M. P. 1997. Tools for Population Genetic Analyses (TFPGA) 1.3. A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. Miller, C. O., Skoog, F., Okumura, F. S., Von Saltza, M. H., Strong, F. M. 1956. Isolation, structure and synthesis of kinetin, a substance promoting cell division. The Journal of the American Chemical Society. 78. 1375-1380. Miller, J. S., Venable, D. L. 2000. Polyploidy and the evolution of gender dimorphism in plants. Science. 289 (5488). 2335-2338. Minocha, S. C. 1987. Plant growth regulators and morphogenesis in cell and tissue culture of forest trees. 50-66. In: Bonga, J. M., Durzan, D. J. (eds). Cell and Tissue Culture in Forestry. Martinus Nijhoff Publishers. Hague. p. 416. ISBN: 9024726603. Mitalipov, S., Wolf, D. 2009. Totipotency, pluripotency and nuclear reprogramming. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114. 185–199.
198
Mockute, D., Bernotiene, G. 2001. The α-terpenyl acetate chemotype of essential oil of Thymus pulegioides L. Bichemical sstematics and ecology. 29 (1). 69-71. Mohan, M., Nair, S., Bhagwat, A., Krishna, T. G., Yano, M., Bhatia, C. R., Sasaki, T. 1997. Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants. Molecular Breeding. 87 (3). 87–103. Morales, R. 1997. Synopsis of the genus Thymus in the Mediterranean area. Lagascalia. 19 (1-2). 249 – 262. Morales, R. 2002. The History, Botany and Taxonomy of Genus Thymus. In: “The Genus Thymus”, Stahl-Biskup, E., Sáez, F. (eds.). Taylor and Francis. London. pp. 1-43. Morgan-Richards, M., Wolff, K. 1999. Genetic structure and differentiation of Plantago major reveals a pair of sympatric sister species. Molecular Ecology. 8 (6). 1027– 1036. Morgante, M., Olivieri, A. M. 1993. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. The Plant Journal. 3 (1).175–182. Murashige, T. 1974. Plant propagation through tissue culture. Annual Review of Plant Physiology. 25. 135 - 166. Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco cultures. Plant Physiology. 15. 473–497. Nazar, R. N., Wong, W. M., Abrahamson, J. L. A. 1987. Nucleotide sequence of the 18-25 S ribosomal RNA intergenic region from a Thermophile, Thermomyces lanuginosus. The Journal of Biological Chemistry. 262 (16). 7523-7527. Nei, M., Li, W. H. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76. 5269–5273 Nilsson, E., Gyllenstrand, N., Wolff, K. 2006. Six polymorphic microsatellite markers for Plantago maritima. Molecular Ecology Notes. 6 (4). 1093–1095. Novák, F. J. 1990. Explantátové kultury a jejich vyuţití ve šlechtění rostlin. 1. vyd. Academia. Praha. 208 s. ISBN: 8020003444. Olhoft, P. M., Phillips, R. L. 1999. Genetic and epigenetic instability in tissue culture and regenerated progenies. 111 – 148. In: Lerner, H. R. (ed.). Plant Responses to environmental stresses: From phytohormopnes to genome reorganization. Marcel Dekker. New York. p. 750. ISBN: 0824700449. Otto, S. P., Whitton, J. 2000. Polyploid incidence and evolution. Annual Review of Genetics. 34. 401 – 437. 199
Ozudogru, E. A., Kaya, E., Kirdok, E., Issever-Ozturk, S. 2011. In vitro propagation from young and mature explants of thyme (Thymus vulgaris and T. longicaulis) resulting in genetically stable shoots. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. 47 (2). 309-320. Palermo, M., De Vita, A., Peruzzi, L., Gargano, D., Bernardo, L., Musacchio, A. 2010. Does Plantago brutia Ten. (Plantaginaceae) merit specific rank? Insights from nrDNA and cpDNA data. Journal of the Societa Botanica Italiana. 144 (3). 573 – 581. Paponov, I. A., Paponova, M., Tealea, W., Mengesb, M., Chakraborteeb, S., Murrayb, J. A. H., Palmea, K. 2008. Comprehensive transcriptome analysis of auxin responses in Arabidopsis. Molecular Plant. 1 (2). 321-337. Park, B. S., Choi, W. S., Kim, J. H., Kim, K. H., Lee, S. E., 2005. Monoterpenes from thyme (Thymus vulgaris) as potential mosquito repellents. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1). 80-83. Passet, J. 1971. Thymus vulgaris L.: Chémotaxonomie et biogenese monoterpenique. Thése de Doctorat. Faculté de Pharmacie. Montpellier. France. Patzak, J., Nesvadba, V., Henychová, A., Krofta, K. 2010. Assessment of the genetic diversity of wild hops (Humulus lupulus L.) in Europe using chemical and molecular analyses. Biochemical Systematics and Ecology. 38 (2). 136-145. Phillips, R. L., Kaeppler, S. M., Olhoft, P. 1994. Genetic instability of plant tissue cultures: breakdown of normal controls. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91. 5222–5226. Picoli, E. A. T., Paiva, E. A. S., Xavier, A., Aguiar, R. M., Carolino, S. M. B., Fári, M. G., Otoni, W. C. 2008. Ultrastructural and biochemical aspects of normal and hyperhydric eucalypt. International Journal of Horticultural Science. 14 (3). 61–69. Pierik, R. L. M. 1997. In vitro culture of higher plants. 4th edition. Kluwer Academic Publishers. Dodrecht. p. 353. ISBN: 9024735319. Pióro-Jabrucka, E., Suchorska-Tropio, K., Szalacha, E. 2007. Genetic and chemical variability of common thyme (Thymus pulegioides L.) and wild thyme (Tymus serpyllum L.). Zeszyty Problemowe Postepow Nauk Rolniczych. 517. 593-601. Poulose, J., Croteau, R. 1978. Biosynthesis of aromatic monoterpenes: Conversion of γterpinene to p-cymene and thymol in Thymus vulgaris L. Archives of Biochemistry and Biophysics. 187 (2). 307-314.
200
Prakash, K., Pitchaimuthu, M., Ravishankar, K. V. 2011. Assessment of genetic relatedness among okra genotypes [Abelmoschus esculentus (l.) Moench] using RAPD markers. Electronic Journal of Plant Breeding. 2 (1). 80-86. Pramanik, S., Raychaudhuri, S. 1997. DNA content, chromo- some composition and isozyme patterns in Plantago L. Botanical Review. 63 (2). 124–139. Procházka, S., Macháčková, I., Krehule, J., Šebánek, J. 1998. Fyziologie rostlin. 1. vyd. Academia. Praha. 484 s. ISBN: 8080693838. Punnett, H. H. 1953. Cytological evidence of hexaploid cells: In Maize Endosperm. Journal of Heredity. 44 (6). 257-259. Qiang, L., Chang-yu, Q., Fang-rong, Z., Wei-guo, Z., Xiao-qing, Ch., Rong-jun, F., Guangshu, Z., Yi, L., Yan-rong, Z. 2011. Assessment of RAPD polymorphism amongst mulberry diploids and their homologous tetraploids. Journal of Southern Agriculture. 42 (1). 152 -156. Radin, D. N., Carlson, P. S. 1978. Herbicide-tolerant tobacco mutants selected in situ and recovered via regeneration from cell culture. Genetical Research. 32 (1). 85-89. Rahman, M., Rajora, O. 2001. Microsatellite DNA somaclonal variation in micropropagated trembling aspen (Populus tremuloides). Plant Cell Reports. 20 (6). 531-536. Ranum, L. P., Day, J. W. 2002. Dominantly inherited, non-coding microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics & Development. 12 (3). 266-271. Rasch, D., Verdooren, L. R., Gowers, J. I. 1999. Fundamentals in the Design and Analysis of Experiments and Surveys, Wisseshaftsverlag GmbH, Oldenbourg, 253pp. Rediga, P., Shaulb, O., Inzéc, D., Van Montagub, M., Van Onckelen, H. 1996. Levels of endogenous cytokinins, indole-3-acetic acid and abscisic acid during the cell cycle of synchronized tobacco BY-2 cells. Febs Letters. 391 (1-2). 175-180. Rendall, D., Di Fiore, A. 2007. Homoplasy, homology and the perceived special status of behavior in evolution. Journal of Human Evolution. 52 (5). 504-521. Richards, A. J. 1997. Plant breeding systems. 1st edition. G. Allen & Unwin. London. p. 529. ISBN: 0412574500. Richards, K. W. 2001. Pollination concerns in the conservation of plant genetic resources. Acta Horticulturae. 561. 191-210. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. 2007. REBASE - enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucleic Acids Research. 35. 269–270. Rogers, J. 1972. Measures of genetic similarity and distance. Studies Genetics VII. University Texas Publisher. Texas. 145-153. 201
Rønsted, N., Chase, M. W., Albach, D. C., Bello, M. A. 2002. Phylogenetic relationships within Plantago (Plantaginaceae): evidence from nuclear ribosomal ITS and plastid TrnL-F sequence data. Botanical Journal of the Linnean Society. 139. 323–338. Rout, R., Samantaray, S., Das, P. 2000. In vitro manipulation and propagation of medicinal plants. Biotechnology Advances. 18 (2). 91-120. Rozen, S., Skaletsky, H. 2000. Primer3 on the www for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132. 365 – 386. Russell, J. R., Fuller, J. D., Macaulay, M., Hatz, B. G., Jahoor, A., Powell, W., Waugh, R. 1993. Direct comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs, AFLPs, SSRs and RAPDs. Theoretical and Applied Genetics. 95 (4). 714–722. Rychlik, W., Spencer, W. J., Rhoads, R. E. 1990. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research. 18 (21). 6409 – 6412. Ryu, T. H., Yi, S. I., Kwon, Y. S., Kim, B. D. 2007. Microsatellite DNA somaclonal variation of regenerated plants via cotyledon culture of Hot Pepper (Capsicum annuum L.). Korean Journal of Genetics. 29 (4). 459-464. Říha, M. 2003. Modernizace výukového procesu u předmětů ovocné, okrasné školkařství a ovocnářství. 96-103. In: Salaš, P. (ed.). Sborník přednášek z odborného semináře. Lednice na Moravě. 179 s. ISBN: 8071574562. Sáez, F., Sánchez, P, Piqueras, A. 1994. Micropropagation of Thymus piperella, Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 39 (3). 269-272. Saher, S., Piqueras, A., Hellin, E., Olmos, E. 2005. Prevention of hyperhydricity in micropropagated carnation shoots by bottom cooling: implications of oxidative stress. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (2). 149-158. Sahin, F. P., Yamashita, H., Guo, Y., Terasaka, K., Kondo, T., Yamamoto, Y., Shimada, H., Fujita, M., Kawasaki T., Sekai, E., Tanaka, T., Goda, Y., Mizukami, H. 2007. DNA authentication of Plantago herb based on nucleotide sequences of 18S-28S rRNA internal transcribed spacer region. Biological and Pharmaceutical bulletin. 30 (7). 1265-1270. Saker, M. M., Kawashity, S. A. 1998. Tissue culture and flavonoid content of Nepeta and Plantago species endemic in Egypt. Fitoterapia. 69 (3). 358–364. Salas, J. B., Téllez, T. R., Pardo, F. M. V. 2009. A contribution to ex-situ conservation of Mediterranean thymes: Germination trials. Acta Botanica Malacitana. 34, 39-55.
202
Samfira, I., Moisuc A., Sărăţeanu, V., Bostan, C., Haş, C., E. 2010. The influence of the altitude gradient on grasslands features. Research Journal of Agricultural Science. 42 (1). 531 – 535. Sansberro, P. A., Rey, H. Y., Luna, C. V., Mroginski, L. A. 2001. Influence of gelling agents on Ilex paraguariensis tissue culture. Acta Horticulturae. 560. 453-456. Saphiro, H. M. 2003. Practical flow cytometry. 4th edition, John Wiley & Sons, Hoboken, New Yersey, p. 281. ISBN: 0471411256. Saraswathi, M. S., Siva, S. A., Uma, S., Sathiamoorthy, S., Vadivel, E. 2005. RAPD markers in flesh colour determination of papayas (Carica papaya L.). Acta Horticulturae. 740. 127-132. Sarihan, E. O., Ozturk, M., Basalma, D., Khawar, K. M., Parmaksiz, I., Özcan, S. 2005. Prolific adventitious shoot regeneration from Black Psyllium (Plantago afra L.). International Journal Of Agriculture & Biology. 7 (6). 879–881. Sastri, D. C., Hilu, K., Appels, R., Lagudah, E. S., Playford, J., Baum, B. R. 1992. An overview of evolution in plant 5S DNA. Plant Systematics and Evolution. 183 (3-4). 169-181. Seguí-Simarro, J. M., Nuez, F. 2007. Embryogenesis induction, callogenesis, and plant regeneration by in vitro culture of tomato isolated microspores and whole anthers. Journal of Experimental Botany. 58 (5). 1119-1132. Segvić Klarić, M., Kosalec, I., Mastelić, J., Piecková, E., Pepeljnak, S. 2007. Antifungal activity of thyme (Thymus vulgaris L.) essential oil and thymol against moulds from damp dwellings. Letters in Applied Microbiology. 44 (1). 36-42. Selkoe, K. A., Toonen, R. J. 2006. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters. 9 (5). 615–629. Semagn, K., Bjørnstad, Å., Ndjiondjop, M. N. 2006. An overview of molecular marker methods for plants. African Journal of Biotechnology. 5 (25). 2540-2568. Servili, M., Selvaggini, R., Begliomini, A. L., Montedoro, G. F. 1998. Effect of thermal treatment in the headspace volatile compounds of tomato juice. Developments in Food Science. 40. 315-330. Sestras, R., Tamas, E., Pamfil, D., Mihalte, L., Sestras, A., Chis, L., Qin, C. 2007. The influence of the genotype upon the in vitro and in vivo growth of greenhouse carnations. Agronomy Research. 5 (1). 51 – 58.
203
Shetty, K., Carpenter, T. L., Kwok, D., Curtis, O. F., Potter, T. L. 1996a. Selection of high phenolics-containing clones of Thyme (Thymus vulgaris L.) using Pseudomonas sp. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 44 (10). 3408–3411. Shetty, K., Carpenter, T. L., Curtis, O. F., Potter, T. L. 1996b. Reduction of hyperhydricity in tissue cultures of oregano (Origanum vulgare) by extracellular polysaccharide isolated from Pseudomonas spp. Plant Science. 120 (2). 175-183. Scheffer, J. J. C. 1993. The isolation of esential oil. Acta Horticulturae. 344. 2-8. Schenk, R. V., Hildebrandt, A. C. 1972. Medium and techniques fot induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany. 50. 199-204. Schlötterer, Ch., Tautz, D. 1992. Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Research. 20 (2). 211-215. Schmidt, T., Heslop-Harrison, J. S. 1996. The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93. 8761-8765. Sia, E. A., Butler, C. A., Dominska, M., Greenwell, P., Fox, T. D., Petes, T. D. 2000. Analysis of microsatellite mutations in the mitochondrial DNA of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97. 250-255. Silvertown, J., Antonovics, J., Ennos, R. A. 2001. Inferences about spatial processes in plant populations from the analysis of molecular markers. In: Silvertown J., Antonovics J. [eds.], Integrating ecology and evolution in a spatial context, 45–71. Blackwell Science, Cambridge, UK. Singh, N., Lal, R. K., Shasany, A. K. 2009. Phenotypic and RAPD diversity among 80 germplasm
accessions
of
the
medicinal
plant
isabgol
(Plantago
ovata,
Plantaginaceae). Genetics and Molecular Research. 8 (4). 1273-1284. Skała, E., Wysokińska, H. 2004. In vitro regeneration of Salvia nemorosa L. from shoot tips and leaf explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. 40 (6). 596602. Skoog, F., Miller, C. O. 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. In: Symposium of the Society for Experimental Biology. 11. 118-131. Slavík, B. (ed.) 2000. Květena České republiky. 6. sv. 1. vyd. Academia. Praha. 770 s. ISBN: 8020003061.
204
Small, R. L., Cronn, R. C., Wendel, J. F. 2004. Use of nuclear genes for phylogeny reconstruction. Australian Systematic Botany. 17 (2). 145‐170. Smith, G. P. 1976. Evolution of repeated DNA sequences by unequal crossover. Science. 191 (4227). 528-535. Smolik, M., Jadzack, D., Korzeniewska, S. 2009. Assessment of morphological and genetic variability in some Thymus accessions using molecular markers. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj. 37 (2). 234-240. Soković, M. D., Vukojević, J., Marin, P. D., Brkić, D. D., Vajs, V., Van Griensven, L. J. L. D. 2009. Chemical composition of essential oils of Thymus and Mentha species and their antifungal activities. Molecules. 14. 238-249. Solomakos, N., Govaris, A., Koidis, P., Botsoglou, N. 2008. The antimicrobial effect of thyme essential oil, nisin, and their combination against Listeria monocytogenes in minced beef during refrigerated storage. Food Microbiology. 25 (1). 120-127. Soltis, P. M., Soltis, D. E. 2000. The role of genetic and genomic attributes in the success of polyploids. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (13). 7051– 7057. Stahl-Biskup, E., Sáez, F. 2002. Thyme: the genus Thymus, Taylor a Francis, New York, p. 333. Stellman, P. 1978. The possible role of insect visits in pollination of reputedly anemophilous plants, exemplified by Plantago lanceolata, and syrphid flies. 41 – 46. In: Richards, A. J. (ed.) The pollination of flowers by insects. Linnean Society Symposium Series 6. London. p. 213. ISBN: 012587460. Streisinger, G., Okada, Y., Emrich, J., Newton, J., Tsugita, A. 1966. Frameshift mutations and the genetic code. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 31. 77–84. Subramanian, S., Mishra, R. K., Singh, L. 2003. Genome-wide analysis of microsatellite repeats in humans: thein abundance and density in specific genomic regions. Genome Biology. 4 (3). R13. Suda, J. 2004. An employment of flow cytometry into plant biosystematics. PhD. Thesis. Univerzita Karlova. Praha. 50 s. Suda, J. 2005. Co se skrývá za rostlinnou průtokovou cytometrií? Ţiva. 53 (1). 46-48. Suda, J., Travníček, P. 2006. Reliable DNA ploidy determination in dehydrate tissues of vascular plants by DAPI flow cytometry – new prospects for plant research. Cytometry. 69A (4). 273 – 280.
205
Sun, G. L,, Díaz, O., Salomon, B., Von Bothmer, R. 1999. Genetic diversity in Elymus caninus as revealed by isozyme, RAPD, and microsatellite markers. Genome. 42 (3). 420-31. Sunnucks, P. 2000. Efficient genetic markers for population biology. Trends in Ecology and Evolution. 15 (5). 199-203. Squirrell, J., Wolff, K. 2001. Isolation of polymorphic microsatellite loci in Plantago major and P. intermedia. Molecular Ecology Notes. 1 (3). 179 – 181. Šašecí, M., Traxl, V. 1987. Šlechtitelská dokumentace Jitrocele kopinatého. ÚKZÚZ. Brno. Šebánek, J., Gréc, L., Javor, A., Švihra, J. 1983. Fyziologie rostlin. 1. vyd. Státní zemědělské nakladatelství. Praha. 560 s. 070678303/15. Talei, G. R., Meshkatalsadat, M. H. 2007. Antibacterial activity and chemical constitutions of essential oils of Thymus persicus and Thymus eriocalyx from west of Iran. Pakistan journal of biological sciences. 10 (21). 3923-3926. Tautz, D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research. 17 (16). 6463-71. Tarayre, M., Saumitou-Laprade, P., Cuguen, J., Couvet, D., Thompson, J. 1997. The spatial genetic structure of cytoplasmic (cpDNA) and nuclear (allozyme) markers within and among populations of the gynodioecious Thymus vulgaris (Labiatae) in southern France. American Journal of Botany. 84 (12). 1675-1684. Tel, G., Oztürk, M., Duru, M. E., Harmandar, M., Topçu, G. 2010. Chemical composition of the essential oil and hexane extract of Salvia chionantha and their antioxidant and anticholinesterase activities. Food and Chemical Toxicology. 48 (11). 3189-3193. Thompson, J. D., Chalchat, J. C., Michet, A. E., Linhart, Y. B., Ehlers, B. 2003. Qualitative and quantitative variation in monoterpene co-occurrence and composition in the essential oil of Thymus vulgaris chemotypes. Journal of Chemical Ecology. 29 (4). 859 -880. Tonk, F. A., Yüce, S., Bayram, E., Giachino, R. R. A., Sönmez, Ç., Telci, İ., Furan, M. A. 2007. Chemical and genetic variability of selected Turkish oregano (Origanum onites L.) clones. Plant Systematics and Evolution. 288 (3-4). 157-165. Toma, I., Toma, C., Ghiorghita, G. 2004. Histo-anatomy and in vitro morphogenesis in Hyssopus officinalis L. (Lamiaceae). Acta botanica Croatica. 63 (1). 59–68. Torras, J., Grau, M. D., López, J. F., De las Heras, F. X. C. 2007. Analysis of essential oils from chemotypes of Thymus vulgaris in Catalonia. Journal of the Science of Food and Agriculture. 87 (12). 2327–2333. 206
Tóth, G., Gáspari, Z., Jurka, J. 2000. Microsatellites in different eukaryotic genomes: Survey and analysis. Genome Research. 10 (7). 967-981. Traxl, V. 1992. Léčivé rostliny ze zahrady, Květ, Praha, 143 s. Trindade, H., Costa, M. M., Lima, S. B., Pedro, L. G., Figueiredo, A. C., Barroso, J. G. 2009. A combined approach using RAPD, ISSR and volatile analysis for the characterization of Thymus caespititius from Flores, Corvo and Graciosa islands (Azores, Portugal). Biochemical Systematics and Ecology. 37 (5). 670-677. Tripathi, L., Tripathi, J. N. 2003. Role of biotechnology in medicinal plants. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 2 (2). 243-253. Tyler, K. D., Wang, G., Tyler, S. D. Johnson, W. M. 1997. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification-based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. Journal of clinical microbiology. 35 (2). 339–346. Udall, J. A., Wende,l J. F. 2006. Polyploidy and crop improvement. Crop Science. 46 (1). 314. Uchendu, E. E., Reed, B. M. 2008. A comparative study of three cryopreservation protocols for effective storage of in vitro-grown mint (Mentha Spp.). Cryo Letters. 29 (3). 181188. Vahabi, A. A., Lofti, A., Solouki, S., Bahrami, S. 2008. Molecular and morphological markers for the evaluation of diversity between Plantago ovata in Iran. Biotechnology. 7 (4). 702 – 709. Van Damme, J. M. M., Van Delden, W. 1982. Gynodioecy in Plantago lanceolata L. I. Polymprohysm for plasmon type. Heredity. 49 (3). 303–318. Van Dijk, H. 1984. Genetic variability in Plantago species in relation to their ecology. 2. Quantitative characters and allozyme loci in P. major. Theoretical and Applied Genetics. 68 (2). 43 – 52. Van Dijk, P., Bijlsma, R. 1994. Simulations of flowering time displacement between two cytotypes that form inviable hybrids. Heredity. 72 (5). 522–535. Van Dijk, P., Hartog, M., Van Delden, W. 1992. Single cytotype areas in autopolyploid Plantago media L. Biological Journal of the Linnean Society. 46. 315-331. Van Dijk, H., Bakx-Schotman, T. 1997. Chloroplast DNA phylogeography and cytotype geography in autopolyploid Plantago media. Molecular Ecology. 6 (4). 345-352. Van Dijk, H., Van Delden, W. 1981. Genetic variability in Plantago species in relation to their ecology. I. Genetic analysis of the allozyme variation in P. major subspecies. Theoretical and Applied Genetics. 60 (5). 285–290. 207
Van Dijk, H., Van Delden, W. 1990. Evidence for autotetraploidy in Plantago media and comparisons between natural and artificial cytotypes concerning cell size and fertility. Heredity. 65 (3). 349–357. Van Dijk, P. J. 1991. Evolutionary aspects of polyploidy in Plantago media L. PhD thesis. University of Groningen. Groningen. 143 p. Varma, A., Padh, H., Shrivastava, N. 2007. Plant genomic DNA isolation: An art or a science. Biotechnology Journal. 2 (3). 386–392. Vašíčková, Š., Vejl, P., Zoufalá, J., Česká, J. 2009. Vnitrodruhová variabilita botanických taxonů vybraných v závislosti na způsobu rozmnoţování. Agriculture. 55 (2). 62-68. Vejl, P., Skupinová, S., Sedlák, P., Bardová, M. 2002. Analýzy rostlinného genomu, 1. vyd., ČZU v Praze, Praha, 238 s. Venkateswarlu, K., Nazar, R. 1991. A conserved core structure in the 18–25S rRNA intergenic region from tobacco, Nicotiana rustica. Plant Molecular Biology. 17 (2). 189–194. Venkatachalam, L., Sreedhar, R. V., Bhagyalakshmi, N. 2007. Genetic analyses of micropropagated and regenerated plantlets of banana as assessed by RAPD and ISSR markers. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (3). 267-274. Verma, P. C., Chakrabarty, D., Jena, S. N., Mishra, D. K., Singh, P. K., Sawant, S. V., Tuli, R. 2009. The extent of genetic diversity among Vanilla species: Comparative results for RAPD and ISSR. Industrial Crops and Products. 29 (2-3). 581-589. Vernet, P., Gouyon, P. H., Valdeyron, G. 1986. Genetic control of the oil content in Thymus vulgaris L.: a case of polymorphism in a bioisynthetic chain. Genetica. 69. 227-231. Vieira, R. F., Grayer, R. J., Paton, A., Simon, J. E. 2001. Genetic diversity of Ocimum gratissimum L. based on volatile oil constituents, flavonoids and RAPD markers. Biochemical Systematics and Ecology. 29 (3). 287-304. Vonášek, F., Trepková, E., Novotný, L. 1987. Látky vonné a chuťové. Státní nakladatelství technické literatury. Praha. 437 s. ISBN: 0481087. Voráčková, Z., Lipavská, H., Konečný, P. 1998. The efficiency of transfer of plants cultivated in vitro to ex vitro conditions as affected by sugar supply. Biologia Plantarum. 41 (4). 507-513. Wang, R. R. C., Chen, J., Joppa, L. R. 1995. Production and identification of chromosome specific RAPD markers for Langdon Durum wheat disomic substitution lines. Crop Science. 35. 886-888.
208
Watts, P. C., O’Leary, D., Cross, M.C., Coughlan, J., Dillane, E., Kay, S. M., Wylde, S., Stet, R., Nash, R. D. M., Hatfield, E. M. C. 2008. Contrasting levels of genetic differentiation among putative neutral microsatellite loci in Atlantic herring Clupea harengus populations and the implications for assessing stock structure. Hydrobiologia. 606 (1). 27-33. Weber J. L, May P. E. 1989. Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction. American Journal of Human Genetics 44. 388-396. Welsch, J., McClelland, M. 1991. Genomic fingerprinting using arbitrarily primed PCR and a matrix of pairwise combinations of primers. Nucleic Acids Research. 19 (19). 5275 – 5279. White, P. R. 1963. The cultivation of animal and plant Cells. 2. ed. Ronald Press Company. New York. p. 228. Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., Tingey, S. V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research. 18 (22). 6531–6535. Wolff, K. 1991a. Genetic analysis of morphological variability in three Plantago species with different mating systems. Theoretical and Applied Genetics. 81 (1). 111–119. Wolff, K. 1991b. Analysis of allozyme variability in three Plantago species and a comparison to morphological variability. Theoretical and Applied Genetics. 81 (1). 119–126. Wolff, K. 1990. Genetic analysis of ecologically relevant morpohogical variability in Plantago lanceolata L. Theoretical and Applied Genetics. 79 (4). 481-488. Wolff, K., Morgan-Richards, M. 1997. PCR markers distinguish Plantago major subspecies. Theoretical and Applied Genetics. 96 (2). 282–286. Wolff, K., Morgan-Richards, M. 1998. Cross-species amplification of primers developed from Plantago major and P. intermedia in two Hawaiian Plantago species from the section Plantago. Molecular Ecology Resources. 9 (3). 981–984. Wolff, K., Morgan-Richards, M., Davison, A. W. 2000. Patterns of molecular genetic variation in Plantago major and P. intermedia in relation to ozone resistance. New phytologist. 145 (3). 501–509. Wolff, K., Schoen, E. D., Van Rijn, J. P. 1993. Optimizing the generation of random amplified polymorphic DNAs in Chrysanthemum. Theoretical and Applied Genetics. 86 (8). 1033-1037.
209
Wolff, K., Houston, K., Dunbar-Co, S. 2009. Cross-species amplification of primers developed from Plantago major and P. intermedia in two Hawaiian Plantago species from the section Plantago. Molecular Ecology Resources. 9 (3). 981–984. Yokoyama, A., Yamashino, T., Amano, Y., Tajima Y., Imamura, A., Sakakibara, H., Mizuno, T. 2007. Type-B ARR transcription factors, ARR10 and ARR12, are implicated in cytokinin-mediated regulation of protoxylem differentiation in roots of Arabidopsis thaliana. Plant & cell physiology. 48 (1). 84-96. Ziv, M. 1991. Quality of micropropagated plants: Vitrification, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. 27 (2). 64-69. Zhang, L., Yuan, D., Yu, S., Li, Z., Cao, Y., Miao, Z., Qian, H., Tang, K. 2004. Preference of simple sequence repeats in coding and non-coding regions of Arabidopsis thaliana. Bioinformatics. 20 (7). 1081-1086.
210
8 Přílohy Tabulka 1.
Chemické složení médií Sloţení v [mg/l] NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2 2H2O FeNaEDTA MnSO4 . H2O ZnSO4 . 7H2O H3BO3 KI Na2MoO4 2H2O CoCl2 6 H2O CuSO4 5 H2O Glycine Nicotinic acid Pyridoxine Thiamin Inositol
Médium Murashige a Skoog Schenk a Hildebrandt 1650 0 1900 2500 170 NH4H2PO4 300 370,6 MgSO4 195 501,17 Ca Cl2 151 36,7 19,8 11,929 10,00 8,6 1,0 6,2 5,0 0,83 1,0 0,25 0,1 0,036 0,1 0,025 0,2 2 0 0,5 5 0,5 0,5 0,1 5,0 100 1000
211
Tabulka 2.
Seznam restrikčních enzymů Enzym
Restrikční místo
Pufr
AccI AluI BamHI BshNI (BanI) BsmAI BsrBI BsuRI (HaeIII) DdeI DpnII DraI Eco47III (Aor54HI) EcoRI EheI HhaI Hin1I Hin1II Hin6I HindIII HinfI HPaII (MspI) KpnI (Acc65I) MnII NcoI PvuII RsaI SacI SduI SmaI SsiI (AciI) TaqI Tru1I (MseI) XbaI
gt/mkac ag/ct g/gatcc g/gyrcc gtctc(N)1 ccg/ctc gg/cc c/tnag /gatc ttt/aaa agc/gct g/aattc ggc/gcc gcg/c gr/cgyc catg/ g/cgc a/agctt g/antc c/cgg ggtac/c cctc(7/6) c/catgg cag/ctg gt/ac gagct/c gdgch/c ccc/ggg ccgc(-3/-1) t/cga t/taa t/ctaga
B+ Tango Tango Spec. Spec. Spec. Spec. Tango Tango Tango Tango R RTango/Spec. Tango/Spec. Spec. Spec. B+ B+ O OSpec. Tango Spec. Tango Tango Spec. Tango Spec. Spec. Tango Y+ Spec. R Tango Y+ RR+ Tango Y+ R+ O+ Y+ Tango G O+ GTango Spec. Tango Tango Spec. Spec. Tango Spec. Spec. Tango Spec. O Tango Spec. O R Spec. Tango R Tango
212
Tabulka 3.
Průměrný výskyt detekovaných látek v populacích z Krušných hor s hodnotou
udávájící počet genotypů v dané populaci, u kterých byla látka detekována
Látka
α-pinena camphen sabinen 1-octen-3-ol β-pinen δ-3-carena α-terpinen p-cymena γ-terpinen limonena β-trans-ocimen β-cis-ocimen cis sabinen hydrát linalool linalyl anthranilát camphor borneol neurčeno (MW 124) neurčeno (MW 124) nerol thymol, methyl ether neral karvakrol, methyl ether thymoquinon geraniol geranial neurčeno (MW 164) thymola karvakrola neurčeno (MW 164) cycloheptan thymol acetát karvakrol acetát β-bourbonen β-cubeben karyofylen Z karyofylen Ea α-himachalen neurčeno (MW 204) neurčeno (MW 204) germakren D β-himachalene γ-cadinene δ-cadinene neurčeno (MW 204) geranyl n butyrát trans nerolidol germakren D-4-ol karyofylen oxid neurčeno (MW 264)
RI 926 948 973 980 989 1010 1014 1023 1059 1030 1038 1049 1067 1096 1106 1144 1165 1189 1229 1227 1234 1241 1243 1250 1256 1271 1276 1294 1303 1309 1351 1359 1374 1382 1388 1404 1416 1447 1458 1474 1478 1505 1511 1521 1540 1558 1562 1574 1580 1701
Krušné hory Měděnec Horní Blatná Průměr Výskyt Průměr Výskyt 5,23 1,86 1,61 1,28 8,71 10,92 20,72 1,40 1,32 1,13 2,07 2,50 2,98 12,89 4,41 3,17 12,91 21,93 21,61 24,69 1,20 5,66 3,98 1,20 3,15 1,51 4,31 1,23 1,07 14,72 -
1/16 14/16 10/16 10/16 13/16 13/16 4/16 1/16 4/16 4/16 1/16 2/16 5/16 2/16 13/16 10/16 2/16 2/16 14/16 14/16 1/16 2/16 14/16 3/16 3/16 4/16 15/16 1/16 1/16 3/16 -
1,28 1,23 1,52 4,90 1,31 5,96 11,34 1,03 1,88 39,47 1,38 1,16 4,16 2,91 4,06 46,10 3,82 1,19 7,50 1,11 1,08 6,15 5,20 1,11 1,65 2,67 22,49 4,57 -
1/16 1/16 12/16 5/16 7/16 12/16 12/16 1/16 1/16 4/16 2/16 1/16 12/16 5/16 3/16 13/16 1/16 1/16 15/16 1/16 1/16 14/16 16/16 4/16 10/16 1/16 1/16 2/16 -
Vysoká pec Průměr Výskyt 1,27 1,37 1,41 1,60 5,28 19,42 1,32 88,85 6,84 2,93 1,35 20,71 39,29 1,22 6,37 3,18 5,32 1,10 1,06 -
2/16 9/16 15/16 15/16 15/16 15/16 3/16 2/16 14/16 3/16 3/16 15/16 4/16 16/16 16/16 16/16 2/16 1/16 -
a – chemické látky určeny pomocí hmotnostní spektrometrie, retenčních indexů a porovnáním se standardy
213
Tabulka 4.
Průměrný výskyt detekovaných látek v populacích z Krušných hor s hodnotou
udávájící počet genotypů v dané populaci, u kterých byla látka detekována
Látka
RI
α-pinena camphen sabinen 1-octen-3-ol β-pinen δ-3-carena α-terpinen p-cymena γ-terpinen limonena β-trans-ocimen β-cis-ocimen cis sabinen hydrát linalool linalyl anthranilát camphor borneol neurčeno (MW 124) neurčeno (MW 124) nerol thymol, methyl ether neral karvakrol, methyl ether thymoquinon geraniol geranial neurčeno (MW 164) thymola karvakrola neurčeno (MW 164) cycloheptan thymol acetát karvakrol acetát β-bourbonen β-cubeben karyofylen Z karyofylen Ea α-himachalen neurčeno (MW 204) neurčeno (MW 204) germakren D β-himachalene γ-cadinene δ-cadinene neurčeno (MW 204) geranyl n butyrát trans nerolidol germakren D-4-ol karyofylen oxid neurčeno (MW 264)
926 948 973 980 989 1010 1014 1023 1059 1030 1038 1049 1067 1096 1106 1144 1165 1189 1229 1227 1234 1241 1243 1250 1256 1271 1276 1294 1303 1309 1351 1359 1374 1382 1388 1404 1416 1447 1458 1474 1478 1505 1511 1521 1540 1558 1562 1574 1580 1701
Beskydy Ochmelovské vrchy Okruhlá Mionší Průměr Výskyt Průměr Výskyt Průměr Výskyt 1,09 1,28 2,64 1,32 3,37 13,76 1,40 1,19 1,10 5,91 2,38 43,97 38,98 1,62 3,04 9,55 4,26 7,47 1,32 12,54 -
1/16 2/16 15/16 8/16 14/16 14/16 2/16 3/16 1/16 12/16 1/16 14/16 2/16 6/16 2/16 14/16 13/16 16/16 4/16 2/16 -
83,34 2,06 5,44 -
16/16 16/16 16/16 -
1,68 2,01 1,00 3,42 4,97 15,18 1,89 2,28 1,35 3,36 6,33 14,28 4,81 1,27 24,83 26,24 1,26 25,99 23,29 1,29 2,16 9,37 7,58 3,02 11,06 1,61 1,04 1,32 1,05 1,15
7/16 6/16 1/16 6/16 7/16 7/16 4/16 1/16 1/16 8/16 4/16 8/16 6/16 2/16 9/16 8/16 1/16 4/16 8/16 1/16 1/16 9/19 6/16 13/16 16/16 2/16 2/16 3/16 1/16 1/16
a – chemické látky určeny pomocí hmotnostní spektrometrie, retenčních indexů a porovnáním se standardy
214
Seznam pouţitých zkratek A – adenin AFLP – délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů agg – agregát BAP – 6-benzylaminopurin C – cytosin CMS – cytoplazmatická samčí sterilita ČSÚ - Český statistický úřad DNA – deoxyribonukleová kyselina cpDNA – chloroplastová DNA mtDNA – mitochondriální DNA rDNA – ribozomální DNA FISH - fluorescenční in situ hybridizace FLC – Flowering Lokus C, lokus genu pozdního kvetení IAA – indol-3-octová kyselina IBA – kyselina 2-indolyl-máselná G - guanin GA3 – kyselina giberelová GC – plynová chromatografie NAA – naftyloctová kyselina CHKO – chráněná krajinná oblast IGS – intergenová mezerníková oblast ITS – vnitřní přepisovaná mezerníková oblast LAKR – léčivé, aromatické a kořeninové rostliny MS – Murashige a Skoog médium MS – hmotnostní spektrometrie MS – samčí sterilita NTS – nepřepisovaná mezerníková oblast PCR – polymerázová řetězová reakce PIC – polymorfní informační obsah RAPD – náhodná amplifikace polymorfní DNA RFLP – délkový polymorfismus restrikčních fragmentů RNA – ribonukleová kyselina rRNA – ribozomální RNA 215
SE – somatická embryogeneze SH – Schenk a Hildebrandt médium ssp – poddruh SSR – jednoduché opakující se sekvence DNA (mikrosatelitní sekvence DNA) subsp – poddruh T – thymin TFPGA – Tools for Population Genetic Analyses , nástroje pro populační genetické analýzy trnL-F – geny kódující t-RNA, lokalizované ve velké unikátní oblasti chloroplastové DNA UPGMA – Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean, metoda párování pomocí neváţených aritmetických průměrů var – varieta VNTR – Variable number tandem repeat, tandemové repetice s variabilním počtem opakování VŠCHT – Vysoká škola chemicko – technologická v Praze VÚRV – Výzkumný ústav rostlinné výroby 2,4-D – Kyselina dichlorfenoxyoctová
216
