J. Biol. Tropi. Vol. 6 No. 2, Juni 2005 : 57-64 ISSN 1411-9587
GENETIC DIVERSITY OF Clostridium bifermentans STRAINS BY AMPLIFIED RIBOSOMAL DNA RESTRICTION ANALYSIS Keragaman Genetik Sejumlah Isolat Clostridium bifermentans Berdasarkan Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis Faturrahman* *PS Biologi Universitas Mataram, Jl. Majapahit No 62 Mataram, tlp/fax. 0370-639376
ABSTRACT The genus of Clostridium is philogenetically closely related to Bacillus, the only genus that generated commercially available bioinsecticides, known as Bt-toxin. The purpose of this studi is to examine the genetic diversity in a number of isolates of Clostridium bifermentans, a clostridial species that has been used for many kind of industrial fermentation. Amplified Ribosomal DNA restriction Analysis (ARDRA) was carry out for 10 isolates. The result showed that isolates could be separated into three distinct groups, i.e : group 1 (Cb. ATCC638, R14-1b, R2-6, R3-1, Me1-6a, R8-1a, Lb-9 and Su1-4), groups 2 (St-1 and La2-6), and groups 3 that consisted only isolate Si-4. Key words : Clostridium bifermentans, ARDRA, genetic diversity
ABSTRAK Genus Clostridium memiliki hubungan filogenetik yang sangat dekat dengan Bacillus, satu-satunya genus yang menghasilkan bioinsektisida yang tersedia secara komersial, yang diketahui sebagai toksin Bt. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keragaman genetic dari sejumlah isolate Clostridium bifermentans, spesies yang lazim digunakan dalam berbagai industri fermentasi. Analisis berdasarkan Amplified Ribosomal DNA restriction Analysis (ARDRA) telah dilakukan terhadap 10 isolat C. bifermentans. Hasilnya menunjukkan bahwa isolat tersebut terpisah kedalam 3 kelompok yang berbeda, yaitu kelompok 1 (Cb. ATCC638, R14-1b, R2-6, R3-1, Me1-6a, R8-1a, Lb-9 dan Su1-4), kelompok 2 (St-1 dan La2-6), dan kelompok 3 hanya isolat Si-4. Kata kunci : Clostridium bifermentans, ARDRA, keragaman genetik
PENDAHULUAN
Pemanfaatan Clostridium sebagai pabrik biologis dalam industri bioteknologi sangat luas. Barloy, et al., (1996) mengutif Morris, (1993) mengatakan bahwa lebih dari 90 % pekerjaan yang melibatkan genus Clostridium ditujukan untuk bioindustri dan aspek-aspek medis. Sejumlah produk penting seperti asam butirat, asetat, aseton dan butanol dapat diproduksi oleh C. bifermentans, C. asetobutylicum, C. butyricum dan C. pasteurianum. C. bifermentans yang tergolong kedalam nonpatogenik Clostridia diketahui mampu melakukan biotransformasi atau bioremediasi senyawa nitroaromatik seperti 2,4,6-trinitrotoluena (TNT) dan turunannya melalui mekanisme hidrolitik (Lewis, et al., 1996). Lebih lanjut Sembries dan Crawford,
(1997) menyatakan bahwa spora isolat C. bifermentans KMR-1 dapat digunakan sebagai inokulan untuk bioremediasi tanah dan air yang terkontaminasi TNT dan 1,3,5-triaza1,3,5trinitrosikloheksana (RDX). Penggunaan C. bifermentans makin meluas sejak ditemukannya suatu strain baru, C. b subsp. malaysia, yang dapat berperan sebagai control biologi untuk insekta. Strain ini merupakan strain bakteri anaerobic pertama yang diketahui bersifat entomopatogenik dan juga bakteri non-B.t yang memiliki gen cry dalam genomnya. Strain ini memiliki aktivitas yang tinggi melawan larva nyamuk dan lalat (blackfly). Protoksin yang dihasilkan C. b subsp. malaysia disandi oleh 2 buah gen, yaitu cbm71 dan cbm72, yang disebut sebagai gen serupa-cry (cry like-genes) oleh karena sekuen polipeptidanya yang sangat mirip dengan δ-
57
J. Biol. Tropi. Vol. 6 No. 2, Juni 2005 : 57-64 ISSN 1411-9587 endotoksin dari B.t., yang kemudian dinamakan cry16A dan cry17A (Seleena, et al., 1997; Barloy, et al., 1996; dan Barloy, et al., 1998). Penemuan gen serupa-cry diluar B.t memberi isyarat bahwa mungkin terdapat lebih banyak lagi gen serupa-cry yang terdistribusi secara lebih luas pada berbagai spesies bakteri. C. bifermentans biasanya ditemukan pada saluran pencernaan ternak dan manusia (Wang, et al., 1996), lapisan tanah dan sedimen laut (Smith, 1975), sedimen danau, sungai dan rawa serta specimen klinik (Smith, 1975; Cowen and Steele, 1974). Keragaman habitat hidup dari organisme ini memungkinkan adanya keragaman pada tingkat molekuler dan genetik. Pendekatan paling mutakhir yang dilakukan untuk memilih galur bakteri pembawa gen cry yang secara potensial unggul sebagai biopestisida adalah analisis molekuler keragaman genetik. Pendekatan ini penting selain untuk menyeleksi strain-strain unggul secara genetis juga untuk pengklasifikasiannya. Kuo dan Chak, (1996) menggunakan teknik Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR untuk mengidentifikasi galurgalur B. thuringiensis yang mengandung gen cry novel. Pengetahuan mengenai keragaman genetik mikroba pada tahun-tahun belakangan ini meningkat drastis, terutama setelah diperkenalkan teknik amplifikasi PCR gen rRNA – RFLP atau amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). Karakterisasi bakteri yang didasarkan pada amplifikasi gen 16S rRNA (small subunit rRNA) dengan teknik PCR telah digunakan secara luas untuk studi mengenai evolusi, taksonomi dan ekologi (Nubel, et al., 1996). Informasi sekuen 16S ribosomal DNA (rDNA) dapat digunakan untuk menganalisis filogenetik bakteri yang belum bisa dikulturkan dari beragam lingkungan (Tanner, et al., 1998). Teknik amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) pada dasarnya merupakan turunan dari PCR-RFLP, yaitu amplifikasi sekuen gen 16S-rDNA (gen penyandi 16S RNA ribosom) dengan menggunakan primer universal untuk bakteri atau prokariot. Hasil amplifikasi PCR ini kemudian dipotong dengan enzim restriksi yang memotong sering. Menurut Suwanto, (1995) adanya perbedaan baik dalam jumlah fragmen maupun ukuran profil pita DNA sebagai hasil pemotongan dengan enzim restriksi tertentu menunjukkan keragaman genetik. Nusslein dan Tiedje, (1998) memanfaatkan metode ARDRA untuk menduga keragaman dan mengkarakterisasi komunitas bakteri tanah Kepulauan Hawai berdasarkan komposisi basa G + C.
Dalam penelitian ini, dilakukan analisis keragaman genetik C. bifermentans berdasarkan teknik Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA). Selain karena sifatnya yang reproducible, juga relatif cepat, murah dan sederhana. Tujuan Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dengan tujuan untuk mengetahui keragaman genetik isolat Clostridium bifermentans berdasarkan Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Anaerob Balai Penelitian Veteriner Bogor, dan Laboratorium Biologi Molekuler South East Regional Center for Tropical biology (SEAMEO-BIOTROP), Bogor. Penelitan ini berlangsung mulai bulan Juni-Oktober 2001. Bakteri yang digunakan adalah 10 isolat Clostridium bifermentans yang telah penulis isolasi sebelumnya. Jenis dan asal isolat C. bifermentans yang digunakan pada pelitian ini tertera pada Tabel 1. Selain itu disertakan pula C. bifermentans ATCC638 koleksi dari Laboratorium Biologi Molekuler SEAMEOBIOTROP. Tabel 1. Jenis dan asal isolat C. bifermentans Kode Isolat
Jenis dan Asal Isolat
R2-6 R3-1 R8-1a R14-1b Me1-6a St-1 La2-6 Lb-9
Cairan rumen sapi, asal Bogor Cairan rumen kerbau, asal Seteluk Cairan rumen domba, asal Bogor Cairan rumen domba, asal Bogor Sedimen danau, asal Meraran Sedimen rawa, asal Seteluk Tengah Tanah hutan bakau, Labuan Alas Tanah hutan bakau, Labuan Burung Sedimen sungai, Taman Suranadi Limbah pengolahan susu, PT Unilever
Si-4 Su1-4
Isolasi DNA genom bakteri Untuk keperluan reaksi rantai polimerase (PCR), total DNA genom C. bifermentans diekstraksi dengan metode Cetyl Trimetyl Ammonium Bromida (CTAB) yang dimodifikasi. Mula-mula isolat C. bifermentans diremajakan dengan menumbuhkannya pada medium Agar Darah selama 24 jam pada 37oC. Koloni tunggal yang tumbuh diambil dan dikulturkan dalam medium kaldu cair (TYG broth) selama semalam kemudian disentrifugasi pada 6000 rpm selama 2 menit untuk mendapatkan pelet bakteri. Pelet bakteri yang
58
J. Biol. Tropi. Vol. 6 No. 2, Juni 2005 : 57-64 ISSN 1411-9587 diperoleh dimasukkan kedalam 250 µl buffer TE pH 8.0 (10 mM TrisCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) dan disentrifugasi selama 2 menit pada 6000 rpm. Pelet diresuspensikan dalam 760 µl buffer TE yang sama, ditambahkan 2 mg/lt lisozim dan diinkubasi pada 37oC selama 1 jam. Kedalam suspensi tersebut ditambahkan 40 µl SDS 10% dan 8 µl (10 mg/ml) proteinase-K. Campuran dikocok dan diinkubasi pada 37oC sampai terbentuk larutan kental, kemudian ditambahkan 100 µl NaCl 5M dan 100 µl CTAB 10%. Setelah dikocok dan dipanaskan 60-65 o C selama 20 menit dalam penangas air, ditambahkan 500 µl campuran fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24:1). Campuran dikocok dan disentrifugasi selama 5 menit pada 6000 rpm. Supernatan dipindahkan kedalam tabung Eppendorf berisi isopropanol dingin, dibolak-balik dan didiamkan pada suhu ruang hingga muncul benangbenang DNA. DNA diendapkan dengan cara disentrifugasi selama 5 menit 10000 rpm. Endapan DNA dicuci dengan 70% alkohol dingin. Setelah dikeringkan dalam speed vacuum, selanjutnya DNA yang diperoleh disimpan dalam buffer Tris EDTA (TE) pH 8.0 pada suhu –20 oC (Maniatis et al., 1989) Amplifikasi 16S rDNA Amplifikasi PCR untuk 16S rDNA dilakukan dengan menggunakan 2 buah primer oligonukleotida spesifik prokariot yakni 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi, et al., 1998). Komponen reaksi PCR untuk total volume 25 µl terdiri atas 150-200 pg/ml DNA templat, 20 pmol tiap-tiap primer (Forward dan Reverse), 1 unit Taq DNA Polymerase beserta buffernya (1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl), 200 µM tiap-tiap dNTP, dan bahan penstabil termasuk BSA). Proses amplifikasi dijalankan dengan GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer, New Jersey) sebagai berikut : sebelum amplifikasi, dilakukan prapemanasan (pre PCR) pada suhu 95 oC selam 5 menit. Denaturasi pada suhu 92 oC selama 30 detik, pelekatan (annealing) pada suhu 55 oC selama 30 detik, dan perpanjangan (elongation) DNA pada 72 oC selama 1 menit. Siklus ini diulang hingga 30 kali, dan setelah daur terakhir dibiarkan terjadi pemanjangan DNA (post PCR)
pada suhu 72 oC selama 5 menit dan penyimpanan (store) pada suhu 4 oC.
Analisis Restriksi 16S rDNA (ARDRA) Sebanyak 5.0 µl produk PCR direaksikan dengan enzim endonuklease restriksi RsaI (5’GT↓AC) sebanyak 1 µl (2 unit/µl) dengan 1X buffer Y+ TANGO kemudian ditambahkan akuabides hingga mencapai volume reaksi 20 µl. Campuran diinkubasi selama semalam pada suhu 37 oC dalam water bath, reaksi dihentikan dengan menempatkan campuran pada suhu 65 oC selama 20 menit. Running elektroforesis dilakukan horizontal pada gel agarosa konsentrasi 2% dalam buffer 1x TBE dengan tegangan 55 Volt pada suhu ruang. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dibilas dengan akuades. Profil pita-pita DNA diamati dengan UV transiluminator. Untuk dokumentasi digunakan Gel Doc 1000 dari BIORAD dan kemudian profil DNA hasil elektroforesis dibandingkan untuk melihat keragaman genetik isolat ( Suwanto, et al., 2000). Hubungan kekerabatan antar galur C. bifermentans dikonstruksi berdasarkan profil ARDRA enzim yang paling diskriminatif dengan membuat dendogram menggunakan program TREECON (van de Veer, 1995). HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis dengan ciri-ciri mikroskopi, fisiologi dan biokimiawi, maupun dengan teknik antibody fluoresen belum cukup untuk menentukkan klasifikasi isolat sampai pada tingkat galur, untuk itu pencirian dan penyusunan taksa berdasarkan sifat genotifik sangat penting. Dalam penelitian ini pencirian, klasifikasi taksonomi dan penentuan hubungan kekerabatan isolat-isolat C. bifermentans digunakan Ampliflied Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA). Pemilihan ARDRA untuk tujuan pencirian galur C. bifermentans disebabkan tehnik ini lebih reproducible, cukup sederhana dan relatif cepat. Hasil analisis PCR dengan menggunakan primer Universal spesifik prokariot yakni primer forward (63f) dan primer reverse (1387r) menghasilkan ukuran fragmen gen 16SrDNA ratarata sebesar ± 1.35 kb (Gambar 1)
59
J. Biol. Tropi. Vol. 6 No. 2, Juni 2005 : 57-64 ISSN 1411-9587 Well : 1 = Cb. ATCC638 2 = R14-1b 3 = R2-6 4 = R3-1 5 = Me1-6a M= Marker 6 = R8-1a 7 = St-1 8 = Si-4 9 = Lb-9 10= La2-6 11= Su1-4
Gambar 1. Hasil amplifikasi gen 16 rDNA (± 1350 bp). M adalah marker 1- Kb DNA Ladder, NEB. Marchesi, et al., (1998) telah mengevaluasi primer 63f dan 138r untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA dari Domain bacteria. Pasangan primer ini mampu mengamplifikasi gen tersebut dengan ukuran sekitar 1300 pasang basa. Desiliyarni, (1999) juga menggunakan primer tersebut untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA bakteri termofilik dari kawah Candradimuka Pegunungan Dieng dan memperoleh fragmen berukuran 1.3-1.35 kb. Secara umum gen penyandi 16S rRNA prokariot berukuran sekitar 1500 bp atau kira-kira 1300-1600 bp (Madigan, et al. 1997), terdiri atas daerah sekuen terkonservasi dan daerah yang hiper variatif. Beberapa segmen rRNA berevolusi sangat lambat sehingga filogeni dari taksa yang berdekatan dapat dikonstruksi kembali, sedangkan bagian lain cukup bervariasi sehingga dapat dipakai untuk menggolongkan spesies kedalam genus. Banyaknya posisi pada molekul 16S rRNA yang berevolusi secara bebas menyediakan data untuk menduga hubungan filogenetik sekelompok mikroba (Amann, et al. 1994).
Profil RFLP atau ARDRA dari gen 16S rDNA ke-10 isolat tersebut dapat dilihat dengan memotong produk PCR yang dihasilkan diatas dengan beberapa enzim endonuklease restriksi tetramerik untuk mendapatkan fragmen yang cukup untuk dibandingkan, yaitu RsaI (GT↓AC), selanjutnya dilewatkan pada elektroforesis gel agarosa. Perbandingan jumlah dan ukuran profil pola pita 16S rDNA menunjukkan keragaman genetik isolatisolat bakteri (Suwanto, 1995). Gambar 2 memperlihatkan profil RFLP hasil pemotongan 16S rDNA dengan enszim restriksi RsaI. Dari gambar tersebut diperoleh bahwa Cb. ATCC638 (well 1), R14-1b (well 2), R2-6 (well 3), R3-1 (well 4), Me1-6a (well 5), R8-1a (well 6), Lb9 (well 9), dan Su1-4 (well 11) memiliki pola pita yang sama dengan 4 buah pita berukuran doublet 370-380 bp, 250 bp, 150 bp dan doublet 100 bp. Isolat St-1 (well 7) dan La2-6 (well 10) juga memiliki pola pita yang sama yaitu berukuran 450 bp, doublet 370-380 bp, dan 150 bp. Sedangkan isolat Si-4 (well 8) ada 3 buah pita yaitu 380 bp, 450 bp dan 520 bp.
Gambar 2. a. Profil RFLP 16S rDNA setelah pemotongan dengan RsaI. B. Interpretasi gambar a. dan M adalah penanda ukuran GeneRulerTM 50 bp ladder
60
J. Biol. Tropi. Vol. 6 No. 2, Juni 2005 : 57-64 ISSN 1411-9587 Untuk melihat tingkat konsistensi isolat-isolat yang memiliki pola pita yang sama serta tingkat diskriminasinya maka dilakukan pemotongan gen 16S rDNA dengan enzim restriksi HaeIII (GG↓CC) dan Sau3AI (↓GATC). Hasil running pada gel elektroforesis agarosa 2% menunjukkan bahwa Cb. ATCC638 (well 1), R14-1b (well 2), R2-6 (well 3), R3-1 (well 4), Me1-6a (well 5), R8-1a (well 6), Lb9 (well 9), dan Su1-4 (well 11) memperlihatkan pitapita DNA dengan pengelompokan yang sama atau tetap berada pada satu kelompok filogenetik, demikian pula halnya dengan isolat St-1 (well 7) dan La2-6 (well 10). Berdasarkan gambar 2 diatas dapat dilihat tingkat diskriminasi enzim restriksi tersebut dalam membedakan isolat-isolat C. bifermentans yang diisolasi dari habitat yang berbeda. Tampaknya penggunaan enzim RsaI cukup diskriminatif dalam membedakan galur galur bakteri karena menghasilkan jumlah fragmen yang relatif banyak. Hasil penelitian ini mendukung rekomendasi yang diajukan Moyer, et al. (1996) menyangkut penggunaan kelompok enzim tetramerik RsaI, HhaI dan BstUI sebagai enzim-enzim yang paling mampu
mendeteksi dan membedakan gen 16S rRNA untuk Domain Bacteria. Oleh karena C. bifermentans (referensi ATCC) memiliki persen mol G+C sebesar 26% (Holt, et al., 1994), maka agar galur-galur bakteri ini dapat dibedakan secara diskriminatif diperlukan enzim restriksi tetramerik yang miskin G+C atau kaya A+T. Semakin kaya kandungan A+T enzim restriksi yang digunakan maka akan semakin besar pula peluang enzim tersebut untuk memotong situs restriksi yang kaya A+T, sehingga akan diperoleh pita fragmen DNA yang lebih banyak dan semakin banyak variasi yang bisa dideteksi (Marchesi, et al., 1998). Profil 16S rDNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi RsaI selanjutnya diinterpretasikan menjadi matriks data biner dan dikonversikan menjadi matriks data kesamaan atau persen similaritas. Hasil tersebut digunakan untuk mengkonstruksi dendogram hubungan kekerabatan antar galur C. bifermentans menggunakan program TREECON (Gambar 3).
0.1
97 100 42
R3-1 R2-6 R10-1a Me1-6a Su1-4 Lb-9 R14-1b CbATCC638 Si-4
95
La2-6 St-1
P. Putida 12639
Gambar 3. Dendogram yang menunjukkan hubungan kekerabatan antar galur C. bifermentans dari profil RFLP 16S rDNA hasil pemotongan enzim RsaI. Angka-angka dipercabangan menunjukkan nilai bootstrap dari 100 kali ulangan. Dendogram pada Gambar 3 menunjukkan bahwa ke-10 galur C. bifermentans pada level 0.100 dipisahkan kedalam 3 kelompok yaitu kelompok 1 yang terdiri dari Cb. ATCC638, R14-1b, R2-6, R31, Me1-6a, R8-1a, Lb-9, dan Su1-4 berada dalam satu kerabat; kelompok 2 yang terdiri dari St-1 dan La2-6; sedangkan kelompok 3 yaitu isolat Si-4. Isolat-isolat yang tergabung dalam kelompok satu sebagian besar berasal dari saluran pencernaan ternak ruminansia (R14-1b, R2-6, R3-1dan R8-1a), sedangkan Me1-6a diisolasi dari sedimen danau Meraran pada jarak 20 m dari daratan pada kedalaman 2.5 m dan Su1-4 diisolasi dari limbah
pengolahan susu dan diduga berasal dari C. bifermentans yang berasal dari ternak. Isolat St-1, La2-6 dan Si-4 membentuk percabangan filogenetik yang terpisah dari kelompok pertama. Secara genetik mungkin mereka beragam, isolat-isolat ini beradaptasi dengan kondisi lingkungannya dan kemudian memperlihatkan galurgalur yang berbeda dengan kelompok I. Isolat St-1 terlihat berkerabat dengan La2-6 dengan nilai bootstrap sebesar 95 (Gambar 3). Nilai bootstrap 95 dalam analisis ini mengandung arti bahwa pengulangan sebanyak 100 kali, kejadian munculnya penggabungan kedua isolat dalam satu percabangan sebanyak 95 kali. Walaupun demikian, ketiga isolat
61
J. Biol. Tropi. Vol. 6 No. 2, Juni 2005 : 57-64 ISSN 1411-9587 tersebut memiliki paling tidak satu buah pita yang berukuran sama dengan kelompok satu yaitu pita DNA berukuran 380 pasang basa. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan diatas maka dapat ditarik beberapa kesimpulan, sebagai berikut : 1. Pengunaan ARDRA dengan enzim endonuklease restriksi RsaI untuk membedakan galur-galur bakteri cukup diskriminatif. 2. Berdasarkan ARDRA, isolat-isolat C.bifermentans terbagi kedalam tiga kelompok hubungan filogenetik dan tiap-tiap galur dalam satu kelompok berkerabat dekat. Saran Perlu dilakukan analisis genetik berdasarkan Restriction Fragment Length Polymorphisms-PCR untuk mengidentifikasi galur-galur C. bifermentans yang mengandung gen serupa-cry (Bt like-toxin). UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih yang setulusnya kami sampaikan kepada Prof. Dr. Antonius Suwanto, M.Sc selaku Kepala Research Center for Microbial Diversity (RCMD) yang telah bersedia mendanai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA Amann, R.I., W. Ludwig, and Schifer, 1994. Phylogenetic Identification and in situ Detection of Individual Microbial Cell Without Cultivation. J. Microbiol. Rev. 59 : 143-169 Barloy, F., A. Delucluse, L. Nicolas and MM. Lecadet, 1996. Cloning and Expression of the First Anaerobic Toxin Gene from C. bifermentans subsp. malaysia, encoding a New Mosquitocidal Protein with homologies to B.thuringiensis delta – Endotoxin. J. Bacteriol 178 (11): 3099-3105 Barloy, F., A. Delucluse, and MM. Lecadet, 1998. Distribution of Clostridial cry-likes Genes Among B.thuringiensis and Clostridium Strain. Current Microbiol 36 : 232-237 Cowen an Steele, 1974. Manual for Identification of Medical Bacteria. Cambridge University Press. Cambridge Desiliyarni, T. 1999. Analisis keragaman Genetik Bkteri Termofilik dari Kawah Candradimuka, Pegunungan Dieng dengan Teknik PCR-RFLP gen 16S rRNA. Thesis. Holt, J.G., N.R. Crieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley, and S.T. William, 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 8th Edition. Lippin Cott Williams & Wilkin. A Wlter Cluer Company. Baltimore Maryland.
Kuo, S.W. and K.F. Chak., 1996. Identification of Novel cry-Type Genes from B. thuringiensis Strain on the Basis of Restriction Fragment Leng Polymorphism of the PCR-Amplified DNA. J. Appl. & Envi. Microbiol. 62 (4) : 1369-1377 Lewis, TA., S.Goszczynski, RL Crawford, RA. Korus, and W. Admassu, 1996. Product of Anaerobic 2,4, 6-Trinitrotoluena (TNT) Transformation by C. bifermentans. . J. Appl. & Envi. Microbiol. 62 (12) : 4669-4674 Madigan, M.T., J.M. Martinko, dan J. Parker, 1997.(1997). Brock. Biology of Microorganisms. 9th edition. Prentice Hall. Upper Saddle River. Maniatis, T., J. Sambrook,and E. Fritsh, 1989. Molecular Cloning a Laboratory manual. (vol 1). Cold Spring Harbor laboratory Press. USA Marchesi, JR., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom, and W.G. Wade, 1998. Design and Evaluation of Usefull bacterium-Spesific PCR Primers that Amplify gens Coding for Bacterial 16S rRNA. J. Appl. & Envi. Microbiol. 64 : 795-799 Moyer, C.L., JM Tiedje, F.C. Dobbs, and D.M. Karl, 1996. A Computer Simulated RFLF Analysis of Bacterial Small Sub Unit rRNA Genes : Efficacy of Selected Teterameric Restriction enzym for Studies of Microbial Diversity in Nature. . Appl. & Envi. Microbiol. 62 (7): 2504-2507 Nubel, U., B. Engelen, A. Felske, J. Snaidr, A. Weishuber, RI. Amann, W. Ludwigh and H. Backhaus, 1996. Sequence Heterogenities of Genes Encoding 16S rRNA in Paenibacillus polymxa Detected by Temperature Gradient Gel Electroforesis. J. Bacteriol. 178(19): 56365643 Nusslein, K & J.M. Tiedje, 1998. Characterization of Dominant and Rare members of Young Hawaian Soil Bacterial Community with Small-Subunit Ribosomal DNA Amplified from DNA Fractionated on the Basis of its Guanine and Cytosine Composation. J. Appl. & Envi. Microbiol. 62 (4) : 1283-1289 Seleena, D. A., H.L. Lee, and MM Lecadet, 1997. Operational and Scientific Notes a Novel Insecticidal Serotype of C. bifermentans. J. Am. Mos. Cont. Asso. 13 (4): 395-397 Sembries, S., and RL Crawford, 1997. Production of C. bifermentans Spores as Innoculum for Bioremediation of Nitroaromatic Contaminant. J. Appl. & Envi. Microbiol. 63 (5) : 2100-2104 Smith, L.D.S, 1975. The Phatogenic Anaerobic Bacteria. 2th edition. Thomas Publisher.USA
58
J. Biol. Tropi. Vol. 6 No. 2, Juni 2005 : 57-64 ISSN 1411-9587 Suwanto, A., 1995. Keanekaragaman hayati mikroorganisme : Seberapa Jauh Kita Mengenalnya? J. Hayati. FMIPA IPB Suwanto, A., Yogiara, D. Suryanto, I. Tan, dan Puspitasari, 2000. Selected Protocol. In: Report of the International Training Workshop on Advance in molecular Biology Technique to Assess Microbial Biodiversity. BIOTROP, Bogor. Tanner, MA., B.M. Goebel, M.A Dojka & NR. Face, 1998. Specific Ribosomal DNA Sequences from Diverse Environmental Setting Correlate with Experimental Contaminant. J. Appl. & Envi. Microbiol. 64 (8) : 1211-1217
Van de veer, Y., (1995). How to Make Phylogenetic Tree from ARDRA Using Treecon Software. In: Report of the International Training Workshop on Advance in molecular Biology Technique to Assess Microbial Biodiversity. BIOTROP, Bogor. Wang, RF., WW Cao, and CE. Cerniglia, 1996. PCR Detection and Quantification of Predominant Anaerobic Bacteria in Human and Animal Fecal Samples. J. Appl. & Envi. Microbiol. 62 (4) : 1242-1247
59
