Genetic characterization of familial and sporadic paragangliomas of the head and neck. reeds ingevuld en afgerond (dd januari 2008)

Stage projecten 2008/2009 Afdeling Klinische Genetica, Laboratorium voor Diagnostische Genoomanalyse Moleculaire Genetica Zie ook www.lumc.nl/klingen Genetic characterization of familial and sporadic paragangliomas of the head and neck. reeds ingevuld en afgerond (dd januari 2008) Investigators Collaboration between Janneke Weiss, Leiden University Medical center, Leiden, The Netherlands and Mario Hermsen, Carlos Suárez (Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, Spain). Contact person: Janneke Weiss ([email protected]) Summary Mutations in SDHB, SDHC and SDHD, encoding different subunits of succinate dehydrogenase have been implicated in familial paraganglioma (PGL), and also one third of supposedly sporadic PGL cases display germline mutations in SDH genes. Very little is known about additional somatic genetic abnormalities that contribute to the development of the tumor. Moreover, it is not known whether tumorigenesis of sporadic PGL involves genetic changes different from familial PGL. In this project, we aim to study DNA copy number gains and losses by microarray CGH analysis in a series of familial and supposedly sporadic PGL tumors of the head and neck (carotid body, glomus jugulare, glomus tympanicum and vagus nerve), and to relate the findings to the mutation status of SDHB, SDHC and SDHD. The microarray CGH will be performed by the Spanish lab, the germline mutation analysis of the SDH genes by the Leiden laboratory. We have clinical data of more than 80 patients, both familial and supposedly sporadic. Tumor samples of at least 32 patients have been collected for DNA copy number analysis. We are in the process of obtaining blood samples for germline mutation analysis (n=35). Period: September – December 2007 (at least 4 months, may be longer)

1

Het opsporen van deleties in het DNA van patiënten met erfelijke paragangliomen en/of feochromocytomen met MLPA (begeleiding/contactpersoon: Janneke Weiss, [email protected]) ingevuld en afgerond per februari 2007 Kliniek: Glomustumoren (paragangliomen en feochomocytomen) zijn bijna altijd goedaardig en groeien langzaam, maar ze kunnen uiteindelijk soms de nabijgelegen zenuwen en bloedvaten in de verdrukking brengen (paragangliomen).Van de glomustumor bestaat een erfelijke en een niet erfelijke variant. In 80 tot 85% van de gevallen in Nederland gaat het om de erfelijke vorm, dit komt door het voorkomen van twee nederlandse foundermutaties. Elders is dat 30% (http://www.glomustumoren.nl/). Glomustumoren worden ook wel paragangliomen of chemodectomen genoemd. Het zijn goedaardige, heel zeldzame, vaatrijke gezwellen die in de hals of in het oor ontstaan. In de meeste gevallen ontwikkelen deze tumoren zich in het carotide lichaam. Het carotide lichaam speelt een zeer belangrijke rol in de acute adaptatie aan hypoxie door het cardiopulmonaire systeem te activeren. Glomustumoren groeien over het algemeen langzaam. Het beloop is dan ook vaak gunstig met weinig of geen klachten. Meestal is er sprake van een langzaam groter wordende zwelling in de hals of zijn er klachten van gehoorsvermindering met kloppend oorsuizen. Bij sommige patiënten kunnen zenuwen in de knel komen, met als gevolg heesheid, slikklachten of aangezichtsverlamming. De klachten ontstaan meestal tussen het 20e en het 40e levensjaar. De diagnose wordt gesteld met scans (meestal MRI). Soms is er sprake van één enkele tumor, maar als glomustumoren in de familie voorkomen ontstaan er doorgaans meerdere. Indien er klachten zijn of als er op de scans duidelijk groei is te zien, is behandeling soms aangewezen. Opereren heeft hierbij de voorkeur. Feochromocytomen zijn zeldzame tumoren van het bijniermerg die rond het 40ste levensjaar ontstaan. Deze tumoren produceren veel adrenaline en noradrenaline, welke een grote invloed op het sympathische zenuwstelsel hebben (verhoogde bloeddruk). De symptomen zijn als gevolg van catecholamine secretie hevige hoofdpijn, netvliesbloedingen, zweten, hartkloppingen, en woede-aanvallen. Ongeveer 2-10% is maligne. De behandeling bestaat uit operatieve verwijdering van de aangedane bijnier. Genen: De aandoeningen wordt veroorzaakt door het SDHB , het SDHC of het SDHD gen. De meeste mutaties worden gevonden in het SDHD en het SDHB gen. OP dit moment bieden wij alleen sequentie analyse van de hierboven genoemde genen aan. Recent is beschreven dat er ook grote deleties (van een heel exon of meerdere exonen) van deze genen de ziekte kunnen veroorzaken. Inmiddels is er een op de PCR gebaseerde techniek ontwikkeld, de MLPA (zie voor uitleg hieronder), waarmee deleties relatief snel en gemakkelijk opgespoord kunnen worden. Het doel van dit project is het opzetten van de MLPA techniek voor de genen die betrokken zijn bij de aandoening erfelijke paragangliomen en/of feochromocytomen. In eerste instantie moet de MLPA opgezet en geoptimaliseerd worden en vervolgens zal een geselecteerde groep patiënten onderzocht worden op de aanwezigheid van deleties in een van de deze genen. Duur van het project 6-9 maanden

2

DNA onderzoek naar Limb Girdle Spierdystrofie, type 2A (begeleiding/contactpersoon: Ieke Ginjaar en Wendy Frankhuizen , [email protected]) Achtergrond: De Limb Girdle spierdystrofieën (LGMD) zijn progressieve spierziekten met voornamelijk aantasting van de proximale (= dichtst bij de romp) spieren. De ziekte kan zeer wisselend verlopen van een heel ernstig tot een mild ziektebeeld. Er zijn op dit moment zeventien verschillende vormen van LGMD bekend: zeven autosomaal dominante en tien recessieve vormen met sterk overlappende ziektebeelden, hetgeen gericht genetisch onderzoek bemoeilijkt. De autosomaal dominante vormen (LGMD1) zijn over het algemeen milder en betrekkelijk zeldzaam (ca 10% van alle gevallen); de recessieve vormen (LGMD2) daarentegen komen vaker voor (ca 1:15.000 mensen). In Nederland wordt op dit laboratorium zowel eiwit- als DNA onderzoek verricht voor een groot aantal van de LGMD2 vormen. De meest voorkomende recessieve vorm (LGMD2A), ook wel calpaïnopathie genoemd, wordt veroorzaakt door het ontbreken van het eiwit calpaïne-3 in het spierweefsel. In eerste instantie wordt dan ook middels eiwit-analyse van het spierweefsel van de patiënt (Western blot analyse) onderzocht of dit eiwit ontbreekt. Indien het calpaïne-3 eiwit afwezig is of in kleinere hoeveelheden voorkomt, wordt mutatie onderzoek van het calpaïne-3 gen uitgevoerd. Tot nu toe werd het DNA van deze patiënten middels de Denaturing Gradient Gel Electroforese (DGGE) op afwijkingen in het calpaïne-3 gen onderzocht alvorens met sequentie analyse de precieze mutatie op te sporen. Resultaten: In totaal is tot nu toe bij 32 patiënten een reductie van de hoeveelheid dan wel volledige afwezigheid van het calpaïne-3 eiwit in het spierweefsel aangetoond. Bij 17 van hen werd geen mutatie in het calpaïne-3 gen gevonden en bij twee van de 15 overige patiënten is slechts één mutatie gevonden. Het is overigens bekend, dat er sprake kan zijn van een secundaire reductie van het calpaïne-3 eiwit (secundaire calpaïnopathie). Bij 13 patiënten werd de diagnose LGMD2A vastgesteld (primaire calpaïnopathie). Doel stage: Teneinde te onderzoeken of er met DGGE mutaties zijn gemist, willen wij het DNA van deze patiënten direct gaan sequensen. Het is de bedoeling, dat nu alle exonen van het calpaïne-3 gen van 19 verschillende patiënten gesequenst worden. Vervolgens zullen de resultaten van het DNA onderzoek worden vergeleken met die van het eiwit onderzoek. N.a.v. deze analyse hopen wij in de toekomst beter te kunnen voorspellen of er sprake is van een primaire dan wel een secundaire calpaïnopathie. Duur van het project 6-9 maanden

3

Opsporen van deleties in het NOTCH3 gen bij de (begeleiding/contactpersoon: Elles Boon, [email protected]) Ingevuld per 26-11-07

ziekte

CADASIL

Inleiding: CADASIL (cerebraal autosomaal dominante arteriopathie met subcorticale infarcten en leukoencephalopathie) is een erfelijke neurodegeneratieve ziekte, die wordt gekenmerkt door het op relatief jonge leeftijd doormaken van herseninfarcten en dementie. In het moleculair genetisch laboratorium van de afdeling Humane en Klinische genetica van het LUMC is sinds enige jaren DNA-diagnostiek mogelijk naar mutaties in het NOTCH3 gen, die CADASIL veroorzaken. Het NOTCH3 gen codeert voor één van de eiwitten uit de NOTCH familie. NOTCH eiwitten zijn grote transmembraan receptoren, die bestaan uit een extracellulair, ligand bindend domein, een transmembraan en een intracellulair domain van zes ankyrine repeats. Op dit moment worden in het laboratorium 23 van het 33 exonen tellende NOTCH3 gen op mutaties onderzocht. Tot nu toe zijn alle mutaties in deze 23 exonen aangetoond en er zijn (nog) geen mutaties in de literatuur gerapporteerd in de overige 10 exonen van het Notch3 gen. De DNA mutaties zijn missense mutaties waarbij in bijna alle gevallen een cysteïne aminozuur betrokken is: er ontstaat of verdwijnt een cysteïne residue. De CADASIL mutaties leiden tot een oneven aantal Cysteïnes in een EGF-like repeat. Cysteïnes kunnen zwavel (SS) bruggen vormen en zijn dus belangrijk voor de vouwing van het eiwit. De tot nu toe geïdentificeerde mutaties leiden dus waarschijnlijk alle tot veranderingen in de structuur van het eiwit. Daarnaast is er tot nu toe één deletie beschreven van drie cysteïnes, een vijftal inframe deleties (met en zonder cysteïnes) en een splice-site mutatie. De gevonden mutaties zijn dus missense mutaties of kleine deleties en tot nu toe is er nog geen onderzoek beschreven waar ook wordt gekeken of er grotere deleties voorkomen in het NOTCH3 gen die CADASIl veroorzaken. We willen dit graag onderzoeken mbv de MLPA. Stage opdrachten: 1) Het ontwerpen van MLPA probes en het opzetten van de MLPA. 2) Vervolgens zal het DNA van CADASIL patiënten, bij wie eerder geen puntmutatie in het NOTCH3 gen werd gevonden, worden onderzocht voor deleties/ duplicaties in het NOTCH3 gen. 3) Als er deleties/duplicaties worden gevonden is het interessant om het klinisch beeld van deze patiënten verder uit te zoeken en te kijken naar de correlatie van de deletie/duplicatie en het klinisch beeld. Duur van het project 3 maanden

4

Mozaïeke APC-mutaties, een onderschatte oorzaak van de patiënt met meerdere darmpoliepen? Analyse met MCA en PAP (begeleiding, contactpersoon: Astrid Out, [email protected]) Achtergrond Kiembaanmutaties in het APC-gen worden aangetoond in 80-90% van de casus met klassieke Familiaire Adenomateuze Polyposis (FAP). FAP is een aandoening die wordt gekenmerkt door 100-den tot soms wel 1000-den darmpoliepen. Echter in toenemende mate worden patiënten ingestuurd voor kiembaanmutatie analyse met een beperkt aantal poliepen (atypische FAP) of zonder een positieve familiegeschiedenis voor darmpoliepen. In deze groep kan in een veel lager percentage een APC-kiembaanmutatie worden aangetoond. Gezien de relatief hoge frequentie van de novo APC mutaties (10-20%) bij FAP-patiënten is de verwachting, naar analogie met andere vergelijkbare aandoeningen, dat mozaïcisme een substantieel deel van de polieppatiënten kan verklaren (Hes et al Gut 2008;57:71-76 ). Werkplan In dit onderzoeksproject willen we de frequentie van mozaïek APC mutaties bij polieppatiënten onderzoeken. In een pilot studie van 242 indexpatiënten met een pathogene APC mutatie konden 10 mozaïek casus (4%) worden aangetoond door toepassing van de reguliere technieken sequentie analyse, DGGE en PTT. Om zowel hoog- als laagniveau mozaïek APC mutaties aan te tonen, willen we een nieuwe techniek toe passen, HR-MCA (High resolution Melting Curve analysis). Een tweede techniek die hiervoor opgezet gaat worden is de zeer gevoelige Pyrophosphorolysis-activated polymerization (PAP). Mutaties gedetecteerd middels de HR-MCA zullen bevestigd worden in een directe sequentie analyse, pyrosequencing of middels de PAP-PCR. Met de HR-MCA en PAP-PCR-techniek willen we onderzoeken of er meer mozaïek casus kunnen worden opgespoord. Hiervoor zullen wij de volgende groepen bestuderen, a) 207 indexpatiënten zonder APC kiembaanmutaties en b) ouders van personen met schijnbare de novo APC mutaties. In theorie kan de PAP-techniek de aanwezigheid van 1 kopie van een enkele base mutatie 9 aantonen tussen 3x10 kopieën van het wild-type allel (Liu and Sommer, 2004). Met dit poliepproject willen wij deze nieuwe technieken opzetten in ons laboratorium en evalueren ten opzichte van de sensitiviteit van thans toegepaste technieken. Tevens willen we de technieken verder ontwikkelen en een kwantificeerbare methode opzetten. Duur van het project 6-9 maanden

5

MLPA: het principe van de techniek: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) wordt gebruikt om deleties of duplicaties op te sporen. Er wordt gebruik gemaakt van twee oligonucleotides per probe. De ene bevat een specifieke sequentie aan het 3' eind en een universele sequentie aan het 5' eind. De andere heeft aan zijn 3' eind een algemene en aan het 5' eind een specifieke sequentie. Elke probe heeft een unieke lengte, waardoor later onderscheid tussen de probes kan worden gemaakt. Een van de primers heeft ook een fluorescent label aan het 5'eind, waardoor detectie mogelijk wordt. Bij 98ºC wordt het DNA enkelstrengs gemaakt. Bij 60ºC gaan de oligonucleotiden hechten aan het template DNA (dit is het DNA van interesse; een exon in een gen waarvan je wilt weten of dat al dan niet gedeleteerd is) en deze oligonucleotiden worden dan door middel van ligase aan elkaar geligeerd. Door de algemene eind sequentie aan de uiteinden van de probe kunnen de producten nu met dezelfde primer worden geamplificeerd met behulp van PCR. Niet geligeerde probes worden niet geamplificeerd, omdat deze niet aan beide kanten de algemene eind sequentie hebben. Het product worden geanalyseerd met behulp van capillair electroforese op de ABI310. Tijdens de electroforese lopen de PCR producten door een polymeer (POP4) dat zich in het capillair bevindt en worden ze gescheiden op lengte. Wanneer de gelabelde fragmenten door het capillair langs een laser komen, worden ze aangeslagen en zenden ze een specifieke golflengte uit, die wordt omgezet in een bepaalde kleur. Met behulp van speciale software worden de resultaten geanalyseerd. Doordat de hoeveelheid geamplificeerd PCR product gecorreleerd is aan de hoeveelheid geligeerde probe kan er vastgesteld worden of er 1, 2 of 3kopieën van een bepaald template DNA zijn.

Toe te passen technieken Op het laboratorium: het ontwerpen van primers m.b.v. speciale software, het opzetten, uitvoeren en optimaliseren van PCR reacties, het sequencen van PCR producten, het analyseren van sequentiedata met speciale software, het meekijken met de DNA isolatie uit bloed. Het uitvoeren en optimaliseren van de MLPA (voor detectie van grotere deleties/duplicaties). Voorts de interpretatie van de resultaten van het DNA-onderzoek en het eventueel initiëren van vervolgonderzoek. Eisen aan de student De stages op ons laboratorium vragen een behoorlijke mate van zelfstandigheid van de student. Na een korte inwerkperiode wordt er al snel van de student verlangd dat hij/zij de experimenten zelfstandig plant en uitvoert en uit zichzelf contact zoekt met de begeleider als daartoe aanleiding is. Naast de nodige praktische ervaring met laboratoriumwerkzaamheden, is handigheid en affiniteit met de computer essentieel en het gebruik van de belangrijkste Microsoft Office programma’s en internet zijn een vereiste. Wat bieden we je Een leuke en leerzame periode bij ons op het laboratorium. Je werkt naast analisten, AIO’s en medestudenten/stagiaires aan je eigen onderwerp. De begeleiding is zowel op het gebied van de labwerkzaamheden door een ervaren analist of AIO als ook de algehele begeleiding door de laboratium-specialisten voor b.v. het uitzetten van het onderzoek en het bespreken van de resultaten en verslaglegging.

6