GTGGCCGGTGATCGG-3’) dan reverse (5’-CCGATATGAGTCGAGAGGGCC-3’). Hasil PCR dicek dengan elektroforesis pada agarose 1,5%. Sekuensing gen target dilakukan di 1st Base Malaysia. Hasil sekuensing berupa elektroferogram dianalisis menggunakan Peak Trace untuk meningkatkan pembacaan peak data elektroferogram, kemudian dibaca dengan menggunakan program Finch TV. DNA Baser digunakan untuk memperoleh konsensus sekuen, BLAST digunakan untuk memastikan bahwa gen yang telah diperoleh merupakan gen target, ClustalX untuk mensejajarkan fragmen gen target dengan gen referensi. Untuk menemukan ORF (Open Reading Frame) digunakan SixFrame. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi gen Hf1-e1 menggunakan teknik PCR menghasilkan fragmen DNA sepanjang (Gambar. 1A) dengan sekuen konsensus sepanjang 419 pasang basa (Gambar. 1B).
Gambar 1. Visualisasi elektroforesis hasil PCR (kiri) dan Sekuen Gen Hf1-exon 1 Petunia x hybrida cv. Picotee Rose yang berhasil diisolasi.
Hasil analisis sekuen konsensus dengan menggunakan BLAST menunjukkan bahwa gen target memiliki tingkat similaritas (Identity) sebesar 100% dengan gen Hf1-e1 Petunia x hybrida cv. Baccara Red dengan query coverage sebesar 95% (Gambar. 2A), dan tingkat similaritas 99% dengan gen Hf1-e1 Petunia guarapuavensis dengan query coverage sebesar 99% (Gambar. 2B). Nilai similaritas tersebut menunjukkan bahwa sekuen gen yang diperoleh benar gen Hf1-e1 dari genus Petunia, karena memiliki similaritas lebih dari 25% (Pevsner, 2003). Basa nukleotida yang berbeda dapat disebabkan oleh adanya delesi, insersi, rekombinasi, maupun translokasi (Kumar dan Filipski, 2007).
Gambar 2. Gen target Hf1-e1 Petunia x hybrida cv. Picotee Rose hasil analisis BLASTdengan: A). gen Hf1-e1 P. x hybrida cv. Baccara Red; B). gen Hf1-e1 P. guarapuavensis. Garis merah : menunjukkan posisi gen target
Sekuen gen target kemudian disejajarkan dengan sekuen Petunia x hybrida cv. Baccara Red (Accession: AB270616) dan Petunia guarapuavensis (Accession: AB244230). Hasil menunjukkan pensejajaran gen Hf1-e1 P. x hybrida cv. Picotee Rose banyak kemiripan (conserve region) dengan P. x hybrida cv. Baccara Red dibandingkan dengan P. guarapuavensis (Gambar 3). Posisi gen Hf1-e1 P. x hybrida cv. Rose Picotee berada pada basa 17 sampai basa 435 dibandingkan dengan gen Hf1-e1 dari P. x hybrida cv. Baccara Red dan terdapat 16 bp upstream tidak teramplifikasi, dan berada pada basa 43 bp upstream sampai basa ke-375 dari gen Hf1-e1 P. guarapuavensis.
Gambar 3. Multiple alignment sekuen gen Hf1-e1 P. x hybrida cv. Picotee Rose dengan Query.
Hasil analisis Open Reading Frame menunjukkan bahwa frame ke-2 adalah ORF yang memiliki fragmen terpanjang dan tidak memiliki stop kodon, sehingga reading frame ke-2 paling mungkin sebagai sekuen target (Dolittle, 1986). Sekuen target pada frame ke-2 dimulai dari start codon (M), ATG pada basa ke-109 sampai dengan basa ke- 418 dan menjadi acuan untuk alignment asam amino gen Hf1-e1. Berdasarkan alignment asam amino gen Hf1-e1 (Gambar 4) yang dimulai dari sekuen yang diduga kuat sebagai start kodon ATG menunjukkan bahwa gen target yang diperoleh memiliki kesamaan sekuen asam amino dengan P. x hybrida cv. Baccara Red dan berbeda satu asam amino nomor 8 dengan P. guarapuavensis yang disebabkan adanya perbedaan kodon pada basa ke-88 yang mengkode asam amino nomor 8 yang dimiliki oleh P. guarapuavensis.
Gambar 4. Multiple alignment asam amino Hf1-e1 P. x hybrida cv. Picotee Rose dengan Query.
Perbedaan asam amino dapat disebabkan oleh adanya proses evolusi genom yaitu rekombinasi, delesi maupun insersi pada sekuen-sekuen tertentu (Darling et al., 2004). Kesamaan sekuen asam amino tersebut mengindikasikan bahwa sekuen yang diperoleh adalah benar gen Hf1-e1, karena protein yang dikode sama (Fetrow & Skolnick, 1998). PENUTUP A. Kesimpulan 1. Penelitian ini berhasil mengisolasi gen Hf1-e1 dari P. x hybrida cv. Picotee Rose dengan panjang sekuen gen 419 basa. 2. Posisi gen berada pada basa 17 sampai basa 435 dibandingkan dengan gen Hf1-e1 dari P. x hybrida cv. Baccara Red dan terletak pada basa 43 bp upstream dari P. guarapuavensis sampai basa ke-375. 3. Gen Hf1-e1 P. x hybrida cv. Rose Picotee sangat conserve dengan P. x hybrida cv. Baccara Red dibandingkan dengan P. guarapuavensis karena ada 2 basa yang berbeda. B. Saran Penelitian lanjut perlu dilakukan untuk mendapatkan basa fragmen exon 2 serta exon 3. DAFTAR RUJUKAN Direktorat Budidaya Dan Pascapanen Florikultura. 2014. Potensi, Permasalahan dan Tantangan Direktorat Budidaya dan Pascapanen Florikultura. Jakarta: Dirjen Holtikultura.
Darling, A.C.E., Mau, B., Blattner, F. & Perna, N.T. 2004. Mauve: Multiple Alignment of Conserved Genomic Sequence With Rearrangments. Genome Research. 14: 1394-1403. Dolittle, R.F. 1986. Of URFs and ORFs: A Primer on How to Analyze Derived Amino Acid Sequence. University Science Books- Mill Valley,CA. Fetrow, J.S. & Skolnick, J. 1998. Method for Prediction of Protein Function from Sequence using the Sequence-to-Structure-to-Function Paradigm with Application to Glutaredoxins/ Thioredoxins and T 1 Ribonucleases. Journal of Molecular Biology. 281: 949-968. Holton, T.A., Brugilera, F., Lester, D.R., Tanaka, Y., Hyland, C.D., Menting, J.G.T., Yi-Lu, C., Farcys, E., Stevenson, T.W. & Cornish, E.C. 1993. Cloning and expression of cytochrome P450 genes controlling colour. Nature. 366: 276-279. Kumar, S. & Filipski, A. 2007. Multiple Sequence Alignment: In Pursuit of Homologous DNA Positions. Genome Research. 17: 127-135. Pevsner, J. 2003. Bioinformatic and Functional Genomic. Canada: John Wiley&Sons. Shierly, B.W. 2001. Flavonoid Biosynthesis. A Colorful Model for Genetics Biochemistry, Cell Biology, and Biotechnology. Plant Physiology. 126: 485-493. Tanaka, Y., Brugliera, F. & Chandler, S. 2009. Recent Progress of Flower Colour Modification by Biotechnology. International Journal of Molecular Sciences. 10: 5350-5369. Tsuda, S., Fukui, Y., Nakamura, N., Katsumoto, Y., Yonekura- Sakakibara, K., FukuciMizutani, M., Ueyama, Y., Ohkawa, H., Holton, T.A., Kusumi, T. & Tanaka, Y. 2004. Flower Color Modification of Petunia hybrida commercial varieties by metabolic engineering. Plant Biotechnology. 21 (5): 377-386.
