Fylogeografie a biologie slepáka druhu Typhlops vermicularis z Mediteránu a Blízkého východu

Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra zoologie Oddělení ekologie a etologie

Diplomová práce

Fylogeografie a biologie slepáka druhu Typhlops vermicularis z Mediteránu a Blízkého východu Vojtech Baláž vedoucí práce: Daniel Frynta

Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracoval samostatně s použitím uvedené literatury. Vojtech Baláž v Praze, dne 30. 4. 2009.

Obsah 1. Předmluva............................................................................................................................................ 1 1.1 Poděkování ........................................................................................................................................ 2 2 Úvod ..................................................................................................................................................... 3

2.1 Co jsou Scolecophidia a proč je studovat .................................................................................... 3 2.1.1 Fylogeneze skupiny .............................................................................................................. 4 2.1.2 Taxonomie, popis čeledí a rodů ........................................................................................... 6 2.1.3 Zbarvení slepákovců a co ho ovlivňuje ............................................................................. 10 2.1.4 Folidóza ............................................................................................................................... 11 2.1.5 Biologie ................................................................................................................................ 13 2.6.2 Rozmnožování..................................................................................................................... 14 2.1.6 Areály ................................................................................................................................... 15

2.2 Mediterán – oblast, kde se něco děje......................................................................................... 17 2.3 Molekulární způsoby zjišťování historie druhů a jejich vzájemné příbuznosti ....... 19 2.4 Typhlops vermicularis (Merrem, 1820) .................................................................................... 21 3 Cíle práce: ........................................................................................................................................... 26

3.1 Chov: ...................................................................................................................................................... 26 3.2 Laboratorní zpracování materiálu: ............................................................................................ 26 4 Metodika ............................................................................................................................................ 27

4.1 Získávání vzorků ............................................................................................................................... 27 4.1.1 Sběry v terénu ..................................................................................................................... 27 4.1.2 Získání dalších jedinců a vzorků........................................................................................ 27

4.2 Chov........................................................................................................................................................ 27 4.3 Fotografická dokumentace, folidóza a měření ...................................................................... 29 4.4 Molekulární zpracování materiálu ............................................................................................. 31 4.4.1 Odběr vzorků ...................................................................................................................... 32 4.4.2 Izolace DNA ......................................................................................................................... 32

4.4.3 PCR ....................................................................................................................................... 33 4.4.4 Purifikace PCR produktu .................................................................................................... 35 4.4.5 Sekvenace ............................................................................................................................ 36

4.5 Úprava sekvenčních dat ................................................................................................................. 37 4.5.1 Kontrola kvality sekvencí................................................................................................... 37 4.5.2 Kompletace sekvencí .......................................................................................................... 37 4.5.3 Aligment, hledání haplotypů, přidání outgroups ............................................................. 38 4.5.4 Vytvoření a kontrola datasetů ........................................................................................... 38

4.6 Fylogenetické analýzy ..................................................................................................................... 39 4.6.1 Práce se sadou Phylip 3.65 (Felsenstein 2005): .............................................................. 39 4.6.2 Práce v programu Paup* .................................................................................................... 40 4.7 Tvorba konsenuálních stromů.............................................................................................. 41 5 Výsledky ............................................................................................................................................. 42

5.1 Získané vzorky ................................................................................................................................... 42 5.2 Chov........................................................................................................................................................ 44 5.2.1 Potrava................................................................................................................................. 44 5.2.2 Rozmnožování..................................................................................................................... 44

5.3 Molekulární zpracování materiálu ............................................................................................. 45 5.3.1 Vzorkování .......................................................................................................................... 45 5.3.2 Izolace .................................................................................................................................. 45 5.3.3 PCR ....................................................................................................................................... 45 5.3.4 Purifikace............................................................................................................................. 46 5.3.5 Sekvenace ............................................................................................................................ 46 5.3.6 Aligment , datasety ............................................................................................................. 48

5.4 Fylogenetická analýza, výsledky ................................................................................................. 49 5.4.1 Maximum Likelihood fylogram.......................................................................................... 51 5.4.2 Konsenuální stromy ........................................................................................................... 52

5.4.3 Popis získaných stromů ..................................................................................................... 54

5.5 Morfologický popis jedinců ........................................................................................................... 56 5.5.1 Tabulky rozměrů ................................................................................................................ 56 5.5.2 Popis exemplářů z Íránu, Turecka a Kypru ...................................................................... 57 5.5.3 Popis hlavové folidózy Íránských jedinců: ....................................................................... 58 5.5.4 Popis hlavové folidózy kyperského jedince:..................................................................... 59 5.5.5 Popis exemplářů G23 a G86 z Izraele ................................................................................ 59 6 Diskuze................................................................................................................................................ 61

6.1 Získávání vzorků ............................................................................................................................... 61 6.2 Poznatky z chovu .............................................................................................................................. 63 6.2.1 Potrava................................................................................................................................. 63 6.2.2 Rozmnožování..................................................................................................................... 64

6.3 Fylogeografie ...................................................................................................................................... 64 6.3.1 Situace na Balkáně a západním Turecku .......................................................................... 64 6.3.2 Situace v Íránu .................................................................................................................... 65 6.3.3 Situace v oblasti Levanty, jižního Turecka a Kypru ......................................................... 65

6.4 Morfologie............................................................................................................................................ 66 7 Souhrn ................................................................................................................................................ 68 8 Slovo závěrem .................................................................................................................................... 69 9 Přílohy na CD ...................................................................................................................................... 70 10 Bibliografie........................................................................................................................................ 70 10 Přílohy:.............................................................................................................................................. 83 Tabulka všech jedinců použitých v této práci........................................................................................ 84

Tabulka p-distancí všech získaných sekvencí, hodnoty zaokrouhleny na 0.1% ............. 85

1. Předmluva Když jsem si, ještě jako čerstvý student gymnázia, koupil knížku „Hady“ (Mattison 1999), měl jsem k tomu trochu zvláštní důvod. Nelákaly mě nádherné barevné fotografie, ani banální informace o běžných druzích, kterým se knížka hlavně věnuje. Pro mě byla zásadní jen příloha Systém hadov, vytištěná drobným písmem, snažící se o výčet druhové bohatosti všech skupin hadů. Na tomto stručném přehledu mě fascinovala početnost slovního spojení „málo známy“ a doufal jsem, že někdy budu mít příležitost toto spojení na pár místech přepsat. Takovou příležitost jsem dostal od svého školitele. Tato diplomová práce je výsledkem mého několikaletého úsilí. Má ale jenom skromný cíl poukázat na zajímavou a docela opomíjenou skupinu hadů, kteří se téměř cíleně snaží nedostat se na výsluní a stále mají ve svých kolonkách ono zmiňované „málo známy“.

1

1.1 Poděkování Za pomoc s kontrolou textu manželce Áji a její mamince Aleně, které byly obě tak hodné a celou tuto práci několikrát přečetly a opravily hromadu slovakizmů a gramatických chyb. Za pomoc s fylogenetickými programy, laboratorní metodikou a vším, co se točí kolem DNA, Pavlu Hulvovi, Ivanu Čepičkovi, Tomáši Pánkovi a Ivaně Hynkové. Za zaučení v práci se stereomikroskopem Olympus SZX 12 Robertu Černému. Za zapůjčení binokulární lupy Martinu Fikáčkovi. Za dodatečné vzorky chci poděkovat Dávidu Jandzíkovi a Danielu Jablonskému. Za rozmanitou pomoc v laboratoři, v terénu, při shánění článků, vzorků a dodávání odvahy a motivace patří velké díky Vašku Gvoždíkovi a Jirkovi Šmídovi. Nakonec chci také poděkovat školiteli Danielu Fryntovi, za zajímavé, málo probádané téma, do kterého jsem už v prvním roce studia na vysoké škole s nadšením skočil a pomalu se jím propracoval na tuto úroveň.

2

2 Úvod Pro význam a kontext výzkumu druhu Typhlops vermicularis je důležité se předem obeznámit s celou skupinou. Poukázat na to, co se o podzemních hadech slepákovcích ví a co ještě ne. Dále se pokusím říci něco málo o oblasti, kde se tento druh vyskytuje. Pak krátce pojednám o možnostech studia fylogeneze (evoluční historie) a její aplikovatelnosti na úvahy o změně areálů studovaných organismů. Nakonec se do tohoto kontextu pokusím zasadit studovaný druh. Proto začnu ze široka....

2.1 Co jsou Scolecophidia a proč je studovat Hadi ze skupiny Scolecophidia, česky slepákovci, jsou drobní, slepí, pod zemí žijící tvorové, z nichž někteří na první pohled vůbec nepřipomínají hady. Nezoolog si jejich průměrného zástupce snadno splete třeba se žížalou. Tato skupina má několik zvláštností. Její nejmenší zástupci dosáhli dolního limitu v miniaturizaci těla u plazů (Kley 2003; Hedges 2008). Taxonomie celé skupiny se potýká s vážným problémem jejich těžké nalezitelnosti, až 20% druhů je známo jen z jednotlivých typových exemplářů (Kley 2003). Každý rok jsou po celém světě objevovány nové druhy (Wallach 1993; Wallach 1999; McCranie and Wilson 2001; Wallach 2001; Lehr et al. 2002; Wallach 2002; Wallach and Pauwels 2004; Wallach 2005; Wallach and Boundy 2005; Thomas and Hedges 2007; Uetz et al. 2007). Počet známých druhů ze skupiny Scolecophidia se za posledních 15 let zvýšil o plnou šestinu (Uetz et al. 2007) a v současné době je popsáno 385 druhů. Zástupci této skupiny obývají všechny teplé oblasti světa. Pantropicky rozšířený Ramphotyphlops braminus je do současné doby jediným hadem, u kterého byla prokázána partenogeneze (McDowell 1974; Nussbaum 1980; Wynn et al. 1987; Kamosawa and Ota 1996; McCranie and Wilson 2001). U několika druhů z temperátních oblastí jsou predispozice ke vzniku ovoviviparie (Erasmus and Branch 1983).

3

U většiny druhů se předpokládá specializace na požírání mravenčích larev a kukel, v menší míře termitů. Tento způsob obživy vyžaduje mnohá přizpůsobení se na prolomení obranných mechanizmů predovaného sociálního hmyzu (podrobněji viz str. 13) (Shine and Webb 1990; Webb and Shine 1993; Webb and Shine 1993; Webb et al. 2000; Webb et al. 2001). Při „honu“ za potravou jsou někteří slepákovci schopni lézt do korun stromů (Cochran 1991; Kley 2003), jiní celý život tráví hluboko pod povrchem půdy (Wilson and Swan 2003). Už jen na základě tohoto výčtu několika zajímavostí je zřejmé, že tito na první pohled fádní tvorové jsou úžasným a z velké části vědou neprozkoumaným územím. Je možná škoda, že se této skupině věnuje jenom malý počet zoologů, což bude patrné z omezeného počtu autorů většiny citovaných prací.

2.1.1 Fylogeneze skupiny Skupina Scolecophidia je v rámci současných hadů řazena na nejnižší stupínek jako nejbazálnější, tj. první, která se oddělila od celé linie hadů. (Forstner et al. 1995; Lee and Scanlon 2002; Kumazawa 2004; Douglas et al. 2006). Je možné, že toto rozdělení se odehrálo už záhy po vzniku hadů někdy na začátku křídy před cca 120 miliony let (Carroll 1988) nebo ještě dříve v juře (Wallach 1998). Monofyletičnost, tj. to, zdali má celá skupina jednoho výlučného předka, byla u slepákovců zpochybňována jen výjimečně (Heise et al. 1995). Tato jasná linie hadů se od počátku své existence vydala úplně jinými cestami adaptací a ekologie než většina ostatních současných skupin, což je doloženo mnoha morfologickými specializacemi a odlišnostmi od Alethinophidia (Wallach 1998; Kley 2001).

4

A. Strom fylogeneze hadů založený na morfologické analýze (Lee and Scanlon 2002)

B. Strom fylogeneze hadů založený na analýze sekvencí 4 mitochondriálních genů (Forstner et al. 1995)

5

2.1.2 Taxonomie, popis čeledí a rodů Scolecophidia se dělí na tři morfologicky dobře vymezené čeledi: Anomalepididae, Typhlopidae a Leptotyphlopidae (Kley 2003). Vztahy mezi těmito skupinami jsou dosud nevyjasněné, ale Typhlopidae a Anomalepididae jsou obvykle považováni za sesterské skupiny (Wallach 1998; Kley 2001; Tavares-Bastos et al. 2007), někdy jsou řazeni do společné nadčeledi Typhlopoidea (Wallach 1998; Kley 2001). Anomalepididae (slepčíci) Anomalepididae jsou v rámci Scolecophidia považováni za morfologicky primitivní skupinu (Wallach 1998; Kley 2003). Úroveň poznání této skupiny je příznačná i pro zbývající dvě – málo zpracovatelných exemplářů ve sbírkách, nedostatek snadno rozeznatelných znaků k identifikaci druhů, minimální znalost biologie, nejisté areály atd. Patří sem 17 druhů ve třech rodech. Typhlopidae (slepáci) Typhlopidae jsou velkou čeledí zahrnující více než 260 druhů v dosud uznaných 6 rodech (podle Integrated Taxonomic Information System http://www.itis.gov): Acutotyphlops, Wallach, 1995; Cyclotyphlops, Bosch and Ineich, 1994; Ramphotyphlops, Fitzinger, 1843; Rhinotyphlops, Fitzinger, 1843; Typhlops, Oppel, 1811; Xenotyphlops, Wallach and Ineich, 1996

a další rody byly navrženy: Austrotyphlops Wallach 2006, Grypotyphlops Peters 1881, Letheobia COPE 1869. Pro lepší poznání čeledi Typhlopidae jsou důležité práce, ve kterých se autoři snaží najít dostatek podkladů pro vymezení samostatných rodů z původního rodu Typhlops a zpřehlednit obrovskou druhovou bohatost celé čeledi. Z tohoto pohledu má ve studiu slepákovců výjimečné postavení Van Wallach a jeho práce založená na podrobné analýze vnitřní anatomie. Ve své disertační práci zpracoval 77% v té době známých druhů a 6

vytvořil fylogenetické hypotézy o evoluci celé skupiny (Wallach 1998). Mnou studovaný druh Wallach zařadil na bázi celé linie k rodu Letheobia. V pozdější práci vytvořil klíč k určování afrických druhů tohoto rodu, ale slepákům ze skupiny Typhlops vermicularis se v něm nevěnoval (Broadley and Wallach 2007).

Fylogenetický strom nadčeledi Typhlopoidea podle Wallacha (1998). Že je čeleď Typhlopidae zajímavým objektem zkoumání dokazují jak zpětné objevy a potvrzení druhů, o jejichž platnosti se začínalo pochybovat, tak popisy nových druhů z celého světa:

7

Typhlops marxi (pojmenovaný podle amerického herpetologa Hymene Marxe) byl popsán podle jedince v muzejní sbírce původem z Filipín, 34 let po jeho ulovení (Wallach 1993) . Z Nové Guineje byl popsán nový druh Acutotyphlops kunuaensis (Wallach 1995) Dalším novoguinejským druhem objeveným v nedávné době je Typhlops hades (Kraus 2005). Z Pákistánu byly pro rod Typhlops popsány dva nové druhy a několik poddruhů (Khan 1998; Khan 1999), ale o jejich platnosti byly vzneseny pochybnosti (Wallach 2000). Typhlops meszoelyi, byl popsán podle dvou jedinců ulovených v roce 1972 na úpatí Himalájí ve výšce přes 2200 m.n.m. v severovýchodní části Indie (Wallach 1999). Australský slepák Ramphotyphlops becki byl po revizi muzejních sbírek vyňat ze synonymity a získal druhový status. (Shea and Wallach 2000) . Další druh popsaný podle muzejních sbírek je Typhlops stadelmani původem z Hondurasu (McCranie and Wilson 2001). Typhlops roxaneae byl popsán podle jedince z roku 1963, který byl nalezen v areálu jedné školy v Bankoku, Thajsko (Wallach 2001). Typhlops etheridgei, jediný zástupce čeledi pro oblast severozápadní Afriky, byl popsán 35 let po objevení dosud jediného exempláře, který ležel u silnice Route nationale 1 v Mauretánii (Wallach 2002). Nám geograficky nejbližší popis nového druhu slepákovce pochází z jižního Turecka. Rhinotyphlops episcopus rozšířil areál africko-blízkovýchodního rodu o plných 500 km na sever (Franzen and Wallach 2002). Typhlops lazelli, byl popsán na základě dvou jedinců z Hong Kongu, z nichž jeden byl nalezen přímo v kampusu místní univerzity (Wallach and Pauwels 2004). Druh Letheobia pauwelsi byl popsán z Gabunu (Wallach 2005). 5 nových druhů zařazených do rodu Letheobia bylo popsáno v roce 2007 (Broadley and Wallach 2007). Zajímavý původ má typová série druhu Letheobia jubana - první exemplář byl nalezen 8

v termitišti v Somálsku v roce 1979, další jedinci do paratypové série přibyli o několik let později při „kultivaci“ typové lokality pomocí buldozerů (Broadley and Wallach 2007). Juvenilní slepák nalezený v zavlažovací strouze na Filipínách vedl k popsání nového druhu a redefinici celého rodu Acutotyphlops. Tento nález potvrdil výskyt rodu Acutotyphlops na lokalitě vzdálené 4000 km od jeho původně známého areálu (Wallach, et al. 2007). Také malgašská herpetofauna se rozrostla o nový druh slepáka. V rodu Xenotyphlops byl popsán druh Xenotyphlops mocquardi (Wallach et al. 2007) a konečně potvrdil dříve nejistý geografický původ typových exemplářů dvou dalších druhů tohoto rodu. V roce 2007 se druhová pestrost slepákovců na Antilách rozrostla o 11 nových druhů rodu Typhlops a dosáhla celkového počtu 40 druhů (Thomas and Hedges 2007). Leptotyphlopidae (slepani) Leptotyphlopidae jsou morfologicky jasně definovanou čeledí. Její zástupci mají ve srovnání s předešlými čeleděmi zuby jen na spodní čelisti (os dentale), štíhlejší tělo, ocas relativně delší v poměru k tělu, kuriózním znakem je úplná redukce střechy lebeční u některých starosvětských druhů (Kley 2003). V současné době se čeleď dělí do 2 rodů a 107 druhů, patří sem obrovský rod Leptotyphlops a monotypický Rhinoleptus (Kley 2003). U této čeledi platí obdobná situace s popisováním nových druhů jako u Typhlopidae: Ze Sokotry pochází druh Leptotyphylops wilsoni (Hahn 1978). Podle jedinců původem z východního pobřeží Afriky byl popsán nový druh Leptotyphlops macroocularis (Broadley and Wallach 1996), jehož jméno si díky své kurióznosti zaslouží překlad od češtiny – slepan velkooký. Z jižní Ameriky pochází nově popsaný tříbarevný druh Leptotyphlops alfredschmidti (Lehr et al. 2002). 9

Typový jedinec nového druhu Leptotyphylops greenwelli z Nigérie byl nalezen v zoologické zahradě ve městě Ibadan (Wallach and Boundy 2005). Bez nadsázky se dá říct, že mnohé ještě nepopsané druhy slepákovců po celém světě stále leží bez povšimnutí na okrajích silnic, na ulicích, či ve sbírkách muzeí.

2.1.3 Zbarvení slepákovců a co ho ovlivňuje Tělesné zbarvení slepákovců je kontinuum od jedinců bez kožních pigmentů po druhy silně pigmentované a někdy i různě ornamentované (Wallach et al. 2007). Většina slepákovců je zbarvena z dorzální strany jednolitě šedě nebo hnědě a z ventrální strany pak obvykle světleji (Kley 2003). Protože jsou tito hadi téměř slepí, zbarvení pro ně nemá význam vnitrodruhové komunikace. Spíše asi slouží jako antipredační ochrana, ale v podstatě nemusí mít žádný ultimátní důvod. U mnoha ve tmě žijících organizmů dochází ke redukci očí a k úbytku pigmentace. Z toho důvodu lze předpokládat, že druhy slepákovců, které ztratily či výrazně redukovaly pigmentaci, budou žít úplně skrytě, a na povrch půdy se dostávat jen ve výjimečných případech. Do tohoto předpokladu krásně zapadá například Australotyphlops (Ramphotyphlops) longissimus, který je považovaný za jediného troglobiontního plaza žijícího v Austrálii. Jeho tělo je nejenom extrémně štíhlé, ale také úplně bez pigmentu. Naneštěstí se o jeho biologii neví v podstatě nic, je známý jen jediný (typový) exemplář (Wilson and Swan 2003). Mezi další málo pigmentované druhy patří někteří zástupci rodu Xenotyphlops nebo například druh Leptotyphlops macrorhynchus z čeledi Leptotyphlopidae (Wallach et al. 2007). Souvislost tělesného zbarvení a způsobu života by si u slepákovců určitě zasloužila pozornost, důležitou roli v tom pravděpodobně hraje i biotop (Wallach et al. 2007). Tělesné zbarvení, ať už slouží slepákům k čemukoli, je dobře použitelným taxonomickým znakem. V mnoha případech byla právě vnitrodruhová variabilita zbarvení jedním z prvních impulsů k podrobnější analýze, která často vedla k popisu nových druhů (Shea and Wallach 2000; Lehr et al. 2002; Rabosky et al. 2004). 10

2.1.4 Folidóza Ošupení těla slepákovců je nejdostupnějším zdrojem taxonomických znaků, který je standardně používán, a je popsáno množství znaků s diagnostickou hodnotou (McDowell 1974; Wallach 1993; Thomas and Hedges 2007). Protože je u jednotlivých skupin slepákovců velká variabilita počtu, velikosti a umístnění hlavových štítků, je jejich terminologie neustálená a často matoucí (Hedges and Thomas 1991; Khan 1999; Wallach 2003; Kraus 2005). V této práci jsem se po konzultaci s doktorem Wallachem, v současné době možná největší autoritou na Scolecophidia, rozhodl použít jeho terminologie. Studovaný druh patří svým rozložením hlavových štítků spíše mezi původnější formy, což umožňuje jejich poměrně snadnou homologizaci se štítky u příbuzných druhů.

Obr. 1 Terminologie hlavových štítků použitá v této práci. Obrázek z popisu Typhlops etheridgei (Wallach 2002). Zkratky: F = frontale; PT = postfrontale; IP = interparietale; L = supralabiale; N = nasale; P = parietale; PR = preocualare; O = oculare; SO = supraoculare

11

Za základní kvantitativní znaky v ošupení lze považovat (Wallach 1998; Niyomwan et al. 2001; Broadley and Wallach 2007): počet řad šupin od hlavy po konec ocasu (počítáno na prostřední dorsální linii šupin), případně počet řad štítků od úst po anální štítek/ky počet šupin po obvodu těla (standardně na třech místech – za hlavou, v půli těla a v úrovni análního štítku)

Obr. 2 Zobrazení všech v současné známých typů SIP u čeledi Typhlopidae. Šedé štítky překrývají dorso-posteriorním okrajem štítek/ky, se kterými jsou v kontaktu. A-E zobrazené kombinace, se standardními zkratkami, druhem u kterého se vyskytují a popisem stavu podle Wallacha (1993): A – T-0, Rhinotyphlops anomalus, supralabiální štítky nepřekrývají žádné štítky B – T-I, Typhlops boulengeri, 1.supralabiální štítek překrývá nasale a postnasale C – T-II, Letheobia obtusa, 2. supralabiální štítek překrývá preoculare D – T-III, Typhlops vermicularis, 3. supralabiální štítek překrývá oculare E – T-V, Typhlops diardii, 2. a 3. supralabiální štítky překrývají dorsoposteriorně štítky v kontaktu Zkratky: R = rostrale; N = nasale, postnasale; P = preoculare; O = oculare; 1, 2, 3, 4, = 1.–4. supralabiale.

12

Mezi kvalitativní znaky patří: vzor překrývání supralabiálních štítků, tzv. SIP rozdělenost análního štítku (úplné rozdělení/ neúplné rozdělení) tvary a počty šupin na hlavě rozdělení nasálního štítku poloha oka relativně k šupinám a mnoho dalších.

2.1.5 Biologie Scolecophidia vsadili na lov drobné bezobratlé kořisti. Během dlouhé doby trvání této skupiny měli dostatek času vyvinout rozmanité spektrum potravních adaptací a specializací, které většině druhů umožňují využívat tak nebezpečný zdroj potravy, jako je sociální hmyz. Je zajímavé, že v době předpokládaného osamostatnění linie Scolecophidia od ostatních hadů se na Zemi již hojně vyskytovaly obě skupiny sociálního hmyzu, které jsou v současnosti jejich nejdůležitějšími potravními zdroji – tj. mravenci (92 Mya, Agosti et al. 1998) a termiti (trias nebo jura Martinez-Delclos and Martinell 1995) Slepákovci evidentně prošli dlouhou a intenzivní koevolucí se svou potravou. Některé druhy jsou schopny k vyhledání potravy využívat pachových značek konkrétních druhů hmyzu (Watkins II et al. 1967). Při napadení vojáky se minimálně jeden druh leptotyphlopida (Leptotyphlops dulcis) brání hmyz odpuzujícími substancemi (Gehlbach et al. 1968; Watkins II et al. 1969). U australských druhů rodu Ramphotyphlops(=Austrotyphlops sensu Wallach 2006) se zjistilo, že hladké šupiny slouží mimo jiné jako obrana proti mravencům, hladký povrch těla totiž neumožňuje zakousnutí mravenčích mandibul (Shine and Webb 1990; Webb and Shine 1993). Na základě dosud publikovaných prací nejsou mezi jednotlivými čeleděmi patrné rozdíly 13

v potravních preferencích, to je ale podle mého názoru jen artefakt malé probádanosti této problematiky. Naprostá většina druhů slepákovců se živí mravenci, konkrétně jejich nemetamorfovanými stádií – larvami a kuklami (Watkins II et al. 1969; Webb and Shine 1993; Abensperg and Steven 1997; Torres et al. 2000; Webb et al. 2000; Webb et al. 2001). Několik druhů, u kterých byla zjištěna vazba na termity jako zdroj potravy, se živí hlavně dělníky a alátními stádii, vojákům se obvykle vyhýbají (White et al. 1992; Webb and Shine 1993; Torres et al. 2000; Gower et al. 2004). I když je zmíněný sociální hmyz důležitým zdrojem potravy pro mnoho druhů, najdou se i výjimky. Jsou známy druhy naprosto nevybíravé, konzumující široké spektrum drobných bezobratlých živočichů (Punzo 1974). Acutotyphlops subocularis z Austrálie je pravděpodobně specialistou na požírání žížal (Webb and Shine 1993). Do dnešní doby jsou poznatky o potravní biologii slepákovců stále jen kusé a každý nový pokus o proniknutí do této problematiky má potenciál vrhnout více světla do jejich neznámého světa.

2.6.2 Rozmnožování Podle dosavadních poznatků je většina slepákovců vejcorodá, u dvou druhů se uvažuje o mezistupni k vejcoživorodosti (Erasmus and Branch 1983; Kamosawa and Ota 1996; Webb et al. 2000; Webb et al. 2001). Velikost snůšek se pohybuje v rozmezí 1–34 ks u australských druhů rodu Ramphotyphlops (=Australotyphlops sensu Wallach) (Shine and Webb 1990), 6–12 u jihoafrického druhu Typhlops bibronii (Erasmus and Branch 1983),1–6 u Ramphotyphlops braminus (Kamosawa and Ota 1996), 1–3 u afrických leptotyphlopidů (Webb et al. 2000). Délka inkubace se značně liší, obvykle trvá asi 3 měsíce (Kley 2003), u Ramphotyphlops braminus je relativně krátká v rozmezí 40-46 dní (Kamosawa and Ota 1996), ale v již zmíněných případech přechodu k ovoviviparii trvá jen 6 dní (Erasmus and Branch 1983). 14

Sexuální dimorfizmus je u mnoha druhů patrný ve velikosti těla a relativní délce ocasu, kdy samci mají v poměru k tělu relativně delší ocas než samice. Tento dimorfismus je výraznější u velkých druhů (Shine and Webb 1990; Webb and Shine 1993; Wallach 1995). Dost často se u slepákovců zmiňuje nepoměr pohlaví, kdy samiček je v populaci signifikantně více než samců (Shine and Webb 1990; White et al. 1992).

2.1.6 Areály

Přibližná mapa rozšíření Scolecophidia (Kley 2003). Červeně Anomalepididae, žlutě Leptotyphlopidae, zeleně Typhlopidae.

Slepákovci do současné doby osídlili většinu teplotně vhodných oblastí. Kam se nedostali přirozeně, tam pronikl alespoň Ramphotyphlops braminus pomocí člověka.(Storr 1968; Bauer 1987; Kley 2003; Pauwels, Wallach et al. 2004) Každá čeleď a většina rodů má dobře definovatelnou biogeografickou charakteristiku. Anomalepididae jsou geograficky omezeni jen na střední a Jižní Ameriku. 15

Leptotyphlopidae mají centrum svého rozšíření pravděpodobně v Africe a Jižní Americe. Z těchto center pronikli zástupci této čeledi přes Blízký východ do Asie, kde zasahují až na severozápadní okraj Indie. Z Jižní Ameriky se rozšířili přes Střední Ameriku až po jižní státy USA. Typhlopidae je čeleď s pantropickým rozšířením, téměř všechny její rody ale mají jasné biogeografické hranice rozšíření. Pro australské slepákovce původně patřící do rodu Ramphotyphlops byl vyčleněn samostatný rod Austrotyphlops (Wallach 2006) omezený jen na Austrálii a Novou Guineu. Druhy rodu Ramphotyphlops se vyskytují v jihovýchodní Asii, tomuto pravidlu se vymyká už několikrát zmiňovaný Ramphotyphlops braminus. (Nussbaum 1980; Shea and Wallach 2000). Na Nové Guinei a Šalamounových ostrovech žije rod Acutotyphlops a jak jsem se už zmínil, jeden druh tohoto rodu byl i objeven na Filipínách, konkrétně na ostrově Luzon (Wallach et al. 2007). Monotypický rod Cyclotyphlops se vyskytuje jen na ostrově Sulawesi (neboli Celebes) v souostroví Velké Sundy (In den Bosch and Ineich 1994). V Africe má svůj domov rod Rhinotyphlops, který dále zasahuje na Blízký východ a jedním druhem až do Indie. Indický druh je ale nově řazen do rodu Grypotyphlops (Wallach 2003). Na Madagaskaru žije rod Xenotyphlops (Wallach and Ineich 1996; Wallach et al. 2007). Na africkém kontinentu se vyskytují druhy rodu Letheobia (Wallach 1998; Broadley and Wallach 2007). Zbylé druhy z čeledi Typhlopidae patří do rodu Typhlops. Pokud je vymezen takto, tvoří určitě parafylum, tj. zahrnuje druhy, které jsou si vzájemně méně příbuzné, než s druhy zařazenými do jiných rodů. Druhy tohoto rodu jsou rozšířeny v Severní i Jižní Americe, 16

Africe, Asii a jeden druh také v Evropě. To, že jeden rod je rozšířen téměř po celém světě, když jiné rody jsou geograficky vymezené, také naznačuje, že něco s ním není v pořádku. Evolucí a rozšířením jednotlivých skupin slepákovců jsem se již zabýval ve své bakalářské práci (Baláž 2007). Wallach považuje za pravděpodobnější možnost starý původ skupiny (se vznikem nejpozději v juře) a Gondwanské rozšíření Typhlopidae za vikarianci (Wallach 1998). Čeleď Leptotyphlopidae, primárně rozšířená jen na západních kontinentech Gondwany, patrně vznikla až po prvním rozdělení Gondwany (Wallach 1998). V poslední době se ale na příkladě novosvětských zástupců skupiny dvouplazů (Amphisbaenia) ukázalo, že fosoriální plazi pravděpodobně měli schopnost překonat Atlantik dlouho po rozdělení Gondwany a minimálně jednou se jim to podařilo v Eocénu před cca 40 Mya (Vidal et al. 2008). Slepákovci jsou pro svou předpokládanou nízkou schopnost disperze a pomalé šíření dobrou skupinou pro biogeografický výzkum. Na relativně malé ploše mají potenciál vytvářet geograficky oddělené populace, ze kterých postupně vznikají nové druhy. V poslední době se tento potenciál ke speciaci ukazuje všude, kde se slepákovcům věnuje trochu větší pozornost, jak je zřejmé podle stále vzrůstajícího počtu druhů.

2.2 Mediterán – oblast, kde se něco děje Mediterán je z globálního hlediska považován za jedno z horkých míst biodiverzity (hot spot), hlavní důvodem pro toto zařazení je obrovská druhová pestrost rostlin (Myers et al. 2000). Co se fauny týče, nelze přehlédnout téměř 360 druhů plazů, z nichž skoro polovina jsou mediteránn endemiti (Cox 2006). Pro faunu Mediteránu měla zásadní význam tzv. Mesinská salinitní krize, tj. období před cca 5 Mya, kdy se zvedla oblast Gibraltarského průlivu a došlo k oddělení Středozemního moře od Atlantiku (Hsü et al. 1973). Protože toto území patří mezi oblasti s velkým odparem a malým zpětným přísunem vody z řek, začalo moře velmi rychle vysychat. Po poklesu hladiny došlo k suchozemskému propojení Afriky, Evropy a Malé Asie. Většina ostrovů se spojila s pevninou a byla obsazena směsí pevninských faun. Mesinská krize 17

trvala relativně krátce, asi 640 tisíc let, a po otevření Gibraltaru se mořské bariéry znovu obnovily (Rouchy and Caruso 2006). V opakujících se dobách ledových (1.8 mya až 10 tisíc) sloužily mediteránní části Evropy jako refugia pro teplomilnou faunu a flóru, která byla v severnějších oblastech vytlačena nepříznivými klimatickými podmínkami. Má se za to, že Pyrenejský poloostrov a Balkánský poloostrov byly pro evropskou faunu nejdůležitějšími refugii (Hewitt 1999; Džukić and Kalezić 2001). Populace, které byly zaledněním zatlačeny do izolovaných oblastí, se nezávisle na sobě vyvíjely a speciovaly. V refugiích se tak dlouhodobě vytvářela a koncentrovala druhová bohatost. Nově vzniklé druhy pak po zpětné expanzi na sever často vytvořily hybridní zóny (Hewitt 1999; Hewitt 2001; Joger et al. 2007). Současná doba, holocén, trvající posledních cca 10 tisíc let, někdy také nazývaná postglaciál, umožňuje postupné pronikání teplomilné fauny a flóry z refugií zpátky na sever (Joger et al. 2007). Mnoho těchto rekolonizací je rovněž umožněno člověkem (udržování kulturní stepi, fragmentace lesů), který v Evropě dramatickým způsobem ovlivňuje přírodu už od neolitu. Pro mnoho druhů plazů tvoří evropské oblasti spadající do Mediteránu severní hranici rozšíření. Patří mezi ně suchozemské želvy rodu Testudo nebo sladkovodní želva Mauremys rivulata. Z ještěrů mají severní hranici v jižní Evropě všichni do Evropy zasahující scinci (kromě krátkonožky štíhlé Ablepharus kitaibelii), všichni evropští gekoni a některé ještěrky. Co se hadů týče, na Mediterán jsou vázány druhy užovek rodu Platyceps, Hierophis, Telescopus, Malpolon, hroznýšek Eryx jaculus a ze slepákovců druhy Leptotyphlops algeriensis, Leptotyphlops cairi, Leptotyphlops macrorhynchus, Leptotyphlops nursii, Ramphotyphlops braminus, Rhinotyphlops episcopus, Rhinotyphlops simonii a Typhlops vermicularis (Cox 2006).

18

Mapa diverzity herpetoufauny Mediteránu (Cox 2006) Herpetofauna Mediteránu, jak jsem se už zmínil, je složena jak z endemitů, tak je zároveň z velké míry ovlivněna africkou a asijskou faunou. Za místo, kde dochází k největšímu míchání těchto vlivů, lze považovat oblast Levanty na Blízkém východě, kde se potkávají 4 zoogeografické jednotky – Afrotropická, Saharo-Sindská, Orientální a Palearktická (Disi 1996). Největší diverzita plazích druhů je koncentrována na jižním Balkáně, ale hlavně v jižním Turecku (v mediteránní části 90 druhů), v Izraeli (80 druhů) a Jordánsku (84 druhů) (Disi 1996; Cox 2006).

2.3 Molekulární způsoby zjišťování historie druhů a jejich vzájemné příbuznosti S tím, jak roste naše poznání biologie organismů, jejich druhové rozmanitosti a rozšíření jednotlivých druhů, nabízí se otázka, jak areály druhů vlastně vzniky a jakou roli hrají v speciaci. Obrovským průlomem v metodologických možnostech studia historie druhů bylo vynalezení možnosti sekvenace DNA. Srovnáváním sekvencí DNA různých jedinců 19

můžeme odhadnout jejich vzájemnou příbuznost. Pro účely studia historie areálů se nejlépe osvědčily části genomu, které jsou děděny jen jedním pohlavím a nedochází v nich k rekombinaci. U živočichů se jedná o mitochondriální DNA nebo o obsah pohlavního chromozomu určujícího heterogametické pohlaví (Y, W) (Avise 2000). Pro studium historie areálů na vnitrodruhové až mezidruhové úrovni vznikl samostatný obor biologie – fylogeografie (Avise et al. 1987). Nástroji tohoto oboru jsou metody molekulární biologie, fylogenetiky, populační ekologie a klasické biogeografie. Molekulární data jsou často velkou pomocí pro taxonomii. Kvantifikace rozdílů v sekvencích umožňuje rozeznání kryptických druhů, které na základě morfologie unikají pozornosti. Molekulární data jsou také vhodným prostředkem k zamezení popisů druhů jen na základě vnitrodruhové variability a morfologické plasticity jednotlivých subpopulací ovlivněné lokálními podmínkami. Taková situace je známá například u suchozemských želv skupiny Testudo graeca, u které bylo na základě morfologických odlišností popsáno několik samostatných druhů, které ale podle molekulárních dat patří do jediné relativně mladé linie (Van der Kuyl et al. 2005; Parham et al. 2006). Ani sekvenační data ale nejsou ideálním podkladem pro taxonomii a použití odlišných metod vede často k různým závěrům. Někdy zase molekulární data nenesou dostatek informace pro vyřešení požadovaného problému, jako například hlubší fylogeneze Lacertidae (Fu 2000). Zároveň použití výhradně mitochondriálních genů neumožňuje detekovat případné křížení mezi liniemi. Do studia slepákovců molekulární studie ještě nijak výrazně nezasáhly. Svým výjimečným postavením na bázi všech recentních hadů mají sice privilegium být obsazováni jako outgroups do každé práce zabývající se hlubší fylogenezí hadů, ale takto bývá použito jen několik nejdostupnějších druhů (Forstner et al. 1995; Heise et al. 1995; Vences et al. 2001; Slowinski and Lawson 2002; Wilcox et al. 2002; Lawson et al. 2004; Vidal and David 2004; Dong and Kumazawa 2005; Gower et al. 2005; Douglas et al. 2006; Noonan and Chippindale 2006; Lee et al. 2007). Tyto práce nepřinesly do studia skupiny Scolecophidia téměř nic nového.

20

Samotných studií zaměřených přímo na slepákovce je velmi málo. V Austrálii se na základě sekvenace mitochondriálního genu pro 16S ribozomální podjednotku u 11 druhů povedlo od druhu Ramphotyphlops (=Austrotyphlops sensu Wallach) australis rozeznat druh Ramphotyphlops (=Austrotyphlops sensu Wallach) bicolor. Ve střední Americe se pomocí analýzy alozymů povedlo objevit 3 kryptické druhy rodu Typhlops (Hedges and Thomas 1991) a obdobná studie, ale bez objevení kryptických druhů, byla předtím provedena na druhu Typhlops jamaicanensis (Hedges 1989). Nejnověji byla sekvenační data použita v práci, která na základě morfologie popsala 11 nových druhů rodu Typhlops na Antilách (Thomas and Hedges 2007). Tím víceméně končí výčet molekulárně fylogenetických prací, ve kterých slepákovci hrají hlavní roli.

2.4 Typhlops vermicularis (Merrem, 1820) Byl popsán v roce 1820 Blasiusem Merremem v jeho díle Versuch eines Systems der Amphibien, ve kterém se autor pokusil o celkovou klasifikaci plazů a obojživelníků. V jeho popisu druhu Typhlops vermicularis přeloženo do češtiny doslova stojí: „Hlava pokryta štítky, ocas válcovitý, krátký. Hlava vejčitého tvaru, svrchní čelist mnohem delší než spodní. Trup na průřezu oválně pětihranný, u análního otvoru mírně tlustší. Štítky oválné. Habitat řecké ostrovy, Asie.“ K tomu se podle současných dat (Grillitsch et al. 1999; Atatür and Göcmen 2001; Wallach 2002) ještě může přidat: Vzor překrývání supralabiálních štítků, tzv. SIP, typu T.-III. 4 anální štítky. Nasální štítek na spodní straně rozdělen rýhou vedoucí od nozdry ke 2. supralabiálnímu štítku. Oko pod oculare. 302 – 412 řad šupin od hlavy po konec ocasu. Po obvodu těla 21-25 šupin. Maximální délka těla se u Typhlops vermicularis udává v rozmezí 25-40 cm (Grillitsch, Weish et al. 1999; Atatür and Göcmen 2001; Beshkov and Manev 2006), v Evropě je nejmenším druhem hada (Boulenger 1913; Radovanović 1941). Zbarvený je na zádech světle hnědě, břišní stranu má bělavou. Jako většina slepáků čeledi Typhlopidae má i Typhlops vermicularis redukované oči a krátký, nezužující se ocas zakončený ostrou špičkou. 21

Typhlops vermicularis je jediným zástupcem slepákovců s výskytem v Evropě. Jak je patrné na mapě jeho rozšíření, je jeho areál značně rozsáhlý. Podklady pro vytvoření mapy areálu rozšíření: (Merrem 1820; Boulenger 1913; Werner 1930; Bird 1936; Radovanović 1941; Leviton and Anderson 1970; Clark and Clark 1973; Bruno 1989; Schatti and Sigg 1989; Disi 1996; Budak, Tok et al. 1998; Corti et al. 1999; Grillitsch et al. 1999; Sindaco and Venchi 2000; Stoev 2000; Ugurtas and Yildirimhan 2000; Atatür and Göcmen 2001; Baran et al. 2001; Duhalov and Stoev 2002; Franzen and Wallach 2002; Tóth et al. 2002; Wallach 2002; Ugurtas et al. 2006; Gocmen et al. 2007; Ugurtas et al. 2007) a lokalitní údaje jedinců ve sbírkách muzeí: The Museum of vertebrate Zoology at Berkley (http://arctos.database.museum/SpecimenResults.cfm), California Academy of Sciences (http://research.calacademy.org/research/herpetology/catalog/Index.asp) Smithsonian Institution ( http://nhbacsmith2.si.edu/emuwebvzherpsweb/pages/nmnh/vz/ResultsListHerps.php)

22

Mapa rozšíření Typhlops vermicularis: červeně orámovaná oblast, kde je výskyt dobře podložený literárními prameny; slabě žlutě vybarveny oblasti s možným výskytem. Zelené značky označují lokality původu molekulárně zpracovávaných vzorků. 23

Z mapy je patrné, že v současné době se Typhlops vermicularis vyskytuje v Evropě jen na jižním Balkáně. Na konci miocénu dosahovalo rozšíření slepákovců v Evropě až po současné Holandsko a Ukrajinu, a i v průběhu pleistocénu se vyskytovali na řeckých ostrovech (Szyndlar 1991). Protože nalezený materiál tvoří pouze jednotlivé obratle, nelze určit, o jakou skupinu slepákovců se jednalo. Sám autor ale předpokládá, že mohlo jít o formu blízce příbuznou současnému Typhlops vermicularis. Typhlops vermicularis se udává jako představitel turansko-asijské fauny, čím se naznačuje jeho možný původ v Asii (Boulenger 1913; Sindaco and Venchi 2000), nebo se řadí k fauně palearktické (Disi 1985). Druhy, které pravděpodobně patří do jeho nejbližšího příbuzenstva, ale žijí výhradně v Africe (Wallach 1998; Wallach 2002). Až do relativně nedávné doby neexistovaly práce, které by řešily otázku zařazení druhu Typhlops vermicularis v rámci čeledi Typhlopidae. Podle Wallacha (1998) jsou dalšími blízkými příbuznými tohoto druhu africké druhy Typhlops caecatus a Typhlops cuneirostris. Tato skupina tvoří bazální větev k africké linii slepáků, pro kterou Wallach navrhnul použití rodového jména Letheobia (Cope). Zařazení druhové skupiny Typhlops vermicularis ponechal Wallach v rodě Typhlops i přesto, že jeho vlastní práce (1998) poukazuje na parafyletičnost tohoto rodu. Stejný autor v roce 2002 popsal podle jediného exempláře nový druh slepáka Typhlops etheridgei (Wallach 2002). Tento druh je na první pohled jen těžko odlišitelný od Typhlops vermicularis a jejich blízká příbuznost je vysoce pravděpodobná. Lze je rozeznat podle mírně odlišných proporcí hlavových štítků, různých počtů štítků na těle, výraznosti svrchní nasální rýhy a podobných diminutivních znaků. Jeden „znak“ k správnému určení stačí i pro naprostého laika – Typhlops etheridgei žije v severozápadní části Afriky, v Mauretánii, to znamená více než 4000 km od nejbližší lokality druhu Typhlops vermicularis. Další alternativní názory na zařazení druhu Typhlops vermicularis mezi ostatní druhy slepáků se mi nepovedlo objevit.

24

Nikdo se dosud nezabýval otázkou, zda se v případě Typhlops vermicularis nejedná o druhový komplex. Tomu by mohl nasvědčovat jeho obrovský areál rozšíření a zároveň jeho pravděpodobně velmi omezená schopnost šíření. 2.10.2 Něco málo z biologie O biologii druhu Typhlops vermicularis jsou jenom kusé, často anekdotické informace snadno dostupné na internetu. Tento zdroj informací je pro seriózní práci naprosto nepoužitelný. Pro pobavení můžu zmínit údaj o tom, že Typhlops vermicularis se člověku brání bodáním ostnem na konci ocasu (tento slouží při pohybu v substrátu), či to, že se živí veškerou drobnou potravou včetně červů. Jako mnoho jiných drobných plazů je v „lidové moudrosti“ veden jako prudce jedovatý. Mnohem méně informací o Typhlops vermicularis je v dostupných odborných pracích. Předpokládá se, že se živí převážně mravenci (Ilani and Shalmon 1984), termity (Grillitsch, Weish et al. 1999) a možná larvami drobného hmyzu (Atatür and Göcmen 2001). Je pravděpodobné, že jako u ostatních slepákovců probíhá páření na jaře a kladení vajíček v létě (Shine and Webb 1990; Webb and Shine 1993; Kamosawa and Ota 1996; Webb et al. 2000; Shea 2001; Webb et al. 2001; Kley 2003). Jako většina slepákovců je vejcorodý, s udávanou velikostí snůšek 4– 7 vajíček (Disi 2002). Typhlops vermicularis je skrytě žijící druh. Obývá různé otevřené biotopy, často pozměněné člověkem (Foufopoulos and Ives 1999; Grillitsch et al. 1999; Tóth et al. 2002).

25

3 Cíle práce: 3.1 Chov: - pokusit se o chov slepákovců v zajetí - vyzkoušet alternativní typy potravy - na základě poznatků z chovu nahlédnout do biologie

3.2 Laboratorní zpracování materiálu: - ze získaných vzorků osekvenovat část mitochondriálního genu pro cytochorm b - na základě získaných sekvencí navrhnout fylogeografickou strukturu druhu Typhlops vermicularis - zjistit případné morfologické rozdíly u linií objevených molekulárními metodami - zjistit, jestli se v případě studovaného druhu nejedná o druhový komplex

26

4 Metodika

4.1 Získávání vzorků 4.1.1 Sběry v terénu Za účelem získání živých jedinců jsem na vlastní náklady podnikl celkem 4 výpravy do oblastí s výskytem studovaného druhu. Přehled těchto expedic najdete v příloze v Tab. 1. Hledání slepáků v terénu probíhalo přes den odvalováním kamenů a jiných na zemi ležících objektů. V noci jsem slepáky hledal i na povrchu půdy. Každého nalezeného slepáka jsem vyfotografoval fotoaparátem Olympus Camedia C-70, 7,1megapixel a uskladnil v plastové přepravce. Jedinci ze stejných lokalit byli uskladněni společně. Substrát v přepravkách byl přírodní - hlína, mech, případně humusová vrstva půdy. Substrát jsem pravidelně vlhčil a slepáky pravidelně krmil.

4.1.2 Získání dalších jedinců a vzorků Zásadní část vzorků tvoří sběry mého školitele Daniela Frynty, který na několika expedicích do Íránu (Frynta et al. 1997) a na Kypr shromáždil celkově 22 jedinců slepáka Typhlops vermicularis, kteří byli fixováni 70– 80% denaturovaném lihu. Další vzorky jsem získal od kolegů zoologů z ČR a Slovenska, jejichž jména jsou uvedena v poděkování. 4.2 Chov Chovám celkem 9 jedinců druhu Typhlops vermicularis v plastových boxech velikosti 25*10*15cm. Substrátem je lignocel – kokosová drť, která má dobrou schopnost dlouhodobě udržovat správnou vlhkost. Slepáky udržuji při mírně zvýšené pokojové teplotě v rozmezí 21°- 25°C. Krmení probíhá standardně jednou týdně, hadi jsou krmeni ad libitum larvami a kuklami běžných druhů mravenců z rodů Myrmica, Lasius apod. 27

Potravu, která není zkonzumována, ponechám v krabičkách až do okamžiku, kdy začne projevovat známky kažení. Tato metodika byla inspirována pracemi (Erasmus and Branch 1983; Shine and Webb 1990; Kamosawa and Ota 1996), ve kterých byly popsány provedené pokusy s chovem slepákovců.

Krmení slepáků. Vlevo T05, vpravo T02 a T01.

Pokusy s alternativní potravou Provedl jsem pokusy s krmením slepáků alternativní potravou. Stejným způsobem, jakým je nabízena normální potrava, jsem jim nabídl různé typy potencionální náhradní potravy. Konkrétně se jednalo o termity rodu Reticulitermes, první instary cvrčků Acheta domestica a Gryllus sp. (živé či zabité mrazem), cvrččí vajíčka, první instary švábů Pycnoscelus surinamensis, čerstvě svlečené – málo keratinizované larvy potemníka moučného Tenebrio molitor a larvy zavíječů čeleď Pyralidae.

Pokusy s parfémováním potravy

28

Za účelem zvýšení atraktivity alternativní potravy jsem použil živé mravence, které jsem s pokusnou náhradní potravou nechal ve větší epruvetě. Potencionální alternativní potrava tak měla získat různé pachy z mravenců. Tímto způsobem jsem ošetřil všechny testované typy potravy zmíněné výše.

Rozmnožování O rozmnožování druhu Typhlops vermicularis existují jen kusé informace (Disi 1996; Atatür and Göcmen 2001). Pokusy o chov v zajetí se u slepákovců prováděly hlavně na partenogenetickém Ramphotyphlops braminus (Kamosawa and Ota 1996). Exemplář T01, původem z jižního Turecka z lokality Kizkalesi, snesl na konci léta (8. 9. 2008) 3 vajíčka. Ta byla poté udržována ve vrstvě lignocelu o stejné teplotě, v jaké jsou chováni dospělí slepáci, a při zvýšené vlhkosti. Při prvních známkách odumření byla vajíčka fixována v 5% formalínu. Zimování chovaných exemplářů Slepáci druhu Typhlops vermicularis v přírodních podmínkách zimují, a proto bylo nutné zimovat také jedince v zajetí. Měsíc před zazimováním jsem přerušil jejich krmení, aby neměli zbytky potravy v trávicím traktu. Dva týdny před zazimováním jsem slepáky přechovával v teplotě 18°C s nočním poklesem na 12°C. Nakonec jsem slepáky uložil do chladničky do teploty 4°C. Celková doba umělého zimování trvala od konce listopadu do konce dubna. V průměru jednou za měsíc jsem všechny jedince kontroloval, abych v případě úhynu mohl daného jedince oddělit od živých a fixovat.

4.3 Fotografická dokumentace, folidóza a měření V první fázi zpracovávání jedinců ze sbírky Daniela Frynty jsem všechny jedince vyfotografoval digitálním fotoaparátem Olympus Camedia C-70, 7,1megapixel, v režimu SuperMakro (min. ohnisková vzdálenost 7,9mm), citlivost nastavena na ISO 200 a 29

kvalita obrázků High quality, 3072*2304 pixelů, ve formátu jpg. Slepáky jsem fotil pod výkonnou zářivkou na milimetrovém papíru, a posléze i na tmavém podkladě za účelem zvýšení kontrastu fotografií. Snímal jsem tyto pozice: Hlava – dorsální pohled, ventrální pohled a oba laterální pohledy Tělo – v půlce těla jsem po obvodu vyznačil 3–4 body lihovým fixem a nasnímal je tak, aby bylo možné spočítat štítky mezi jednotlivými značkami a zjistit tak celkový počet řad štítků. Ocas - dorsální pohled, ventrální pohled a oba laterální pohledy. Po zhodnocení kvality takto získaných fotografií (tj. bez dodatečného zvětšení) jsem se rozhodl pořídit kvalitnější snímky pomocí digitálního stereomikroskopu Olympus SZX 12, který má vestavěný digitální fotoaparát. Fotil jsem pomocí programu QuickPHOTO Micro 2.3, který má funkci DeepFocus. Tato funkce umožňuje nafocení několika snímků při různém zaostření a následné spojení těchto snímků do jediné fotografie. Takto získaný obrázek nese informaci o strukturách v několika rovinách ostrosti a má nesrovnatelně vyšší kvalitu než běžně pořízené snímky. Snímky jsem pořizoval při různých způsobech osvětlení, na sucho nebo ponořené ve vodě, a snažil jsem se najít nasvícení, které by zviditelnilo co nejvíce detailů. Každý snímek je v tomto ohledu unikátní. Rozdíl zaostření mezi jednotlivými fotografiemi jsem nastavil na 200 µm, takže výsledný snímek byl složen v průměru z 10 fotografií. Kvalita byla nastavena na 2040*1536 pixelů v nekomprimovaném formátu tiff. Snímal jsem jen tyto pozice: Hlava – dorsální pohled, ventrální pohled a oba laterální pohledy Pořízené fotografie sloužily poté k měření rozměrů zdokumentovaných jedinců a počítání štítků. Po neúspěchu s počítáním štítků z pořízených fotografií jsem se rozhodl

30

pro pracnější postup. Počty štítků kolem těla jsem zjisťoval manuálně pomocí binokulární lupy Olympus SD 30 při různých zvětšeních (15X, 30X,45X). Detaily štítků na hlavě jsem pozoroval pomocí binokulární lupy Olympus SZ 30 při zvětšení 15X a 30X, a následně ručně zakreslil na papír. Podle nákresů jsem jednotlivé detaily zvýraznil na získaných fotografiích z SZX ve freeware programu PAINTnet. Výběr ze všech pořízených fotografií lze shlédnout na CD v příloze. Z pořízených fotografií jsem všechny jedince změřil pomocí programu TPS. Všechny kompletní jedince jsem zvážil na digitální váze s přesností 0,1g.

4.4 Molekulární zpracování materiálu Vzorky použité pro molekulární techniky byly z několika zdrojů, různé kvality a odlišného typu fixování a uskladnění, viz tabulka: kód

lokalita

oblast

typ vzorku

T01

Kizkalesi

Jižní Turecko

čerstvá krev

T02

Kizkalesi

Jižní Turecko

krev v lihu

T03

Anamurion

Jižní Turecko

čerstvá krev

T04

Anamurion

Jižní Turecko

krev, čistý líh

T05

Anamurion

Jižní Turecko

čerstvá krev

T07

Magnesia

Západní Turecko

krev, čistý líh

T08

Magnesia

Západní Turecko

krev, čistý líh

T09

Meyamey

Severo-východní Írán

čerstvá krev

612

Kresna

Jižní Bulharsko

kůže a svalstvo, čistý líh

613

Kresna

Jižní Bulharsko

kůže, kost, sval, čistý líh

614

Kresna

Jižní Bulharsko

kůže, kost, sval, čistý líh

Alb

Ardenica

Albánie

ocas, čistý líh

vzorku

31

G52

Geçitköy

Turecký Kypr

vydávená potrava

Syr

Al 'Adimah

Sýrie

kůže, sval, čistý líh

G24

Tuzluca

Východní Turecko

krev, čistý líh

G23

Qiryat Shemona

Izrael

hlava, čistý líh

G86

Almagor

Izrael

štítky, čistý líh

Jižní Řecko

krev, čistý líh

Jižní Řecko

krev, čistý líh

G60 G66

Kastania, Peloponnese Gialova, Peloponnese

CYP

Akrotiri

Řecký Kypr

tkáň, denaturovaný líh

I 32

Sivand

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 40

Kivi

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 45

Chalus

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 86

Maku

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 92

Kashan

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 165

Bazargan

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 198

Kheshmeh Khan

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 203

Razan

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 829

Deh Bakri

Írán

tkáň, denaturovaný líh

I 889

Firuz Abad

Írán

tkáň, denaturovaný líh

4.4.1 Odběr vzorků Vzorky z živých exemplářů jsem odebíral pokud možno co nejšetrněji. Pomocí jednorázové injekční stříkačky jsem odebral kapku krve nebo lymfy z dorsální strany ocasu. Z takto získaných vzorků jsem ihned izoloval DNA. 4.4.2 Izolace DNA Izolaci DNA ze vzorků jsem provedl pomocí standardního kitu DNeasy® Blood and Tissue Quiagen podle doporučeného protokolu s drobnými změnami. Před izolací jsem 32

vzorky vysušil. Vzorky krve v EtOH (T02, T04, T07, T08, G24, G66) jsem nejdříve dal krátce zcentrifugovat, cca 100 µl suspenze ze dna zkumavky jsem pipetou přenesl do čisté zkumavky a vysušil na topném bloku při teplotě 50°C. Krev jsem lyzoval podle návodu v PBS pufru a ne ve standardním pufru, který je součástí kitu. Většinu vzorků jsem nechal lyzovat přes noc na termobloku, ale některé tkáňové vzorky (Alb, Syr, 612, 613, 614) musely být za občasného promíchání lyzovány až po dobu 48 hod. Změnou oproti standardnímu protokolu bylo použití menšího množství eluačního činidla (100 µl), které bylo pro zvýšení účinku ohřáto na 60°C s následnou 1 minutovou inkubací rovněž při teplotě 60°C. Po izolaci jsem standardně prováděl kontrolu přítomnosti DNA na 1% agarózové gelové elektroforéze. Gel jsem připravoval ze 40 ml TBE, 0,4 g agarózy a 1,2 μl EtBr. Do gelu jsem posléze aplikoval 9 µl DNA s 5 µl nanášecího pufru. Použitý zdroj napětí byl značky BioRad. Elektroforéza probíhala při napětí 100 V a proudu 400 A po dobu cca 30 min. Získaná DNA byla uskladněna v 1,5 ml plastových zkumavkách v mrazničce při teplotě 20°C.

4.4.3 PCR Pro PCR byly využity dva páry primerů. Jeden pár pro amplifikaci kompletní sekvence cytochromu b (Burbrink et al., 2000) : L14910 5´-GACCTGTGATMTGAAAAACCAYCGTTGT-3´ H16064 5´-CTTTGGTTTACAAGAACAATGCTTTA-3´ tato dvojice primerů byla původně navržena na užovky rodu Elaphe, ale osvědčila se mi při použití na krajty rodu Morelia (Hynková and Baláž 2008) a podle literatury byla použita u mnoha dalších skupin hadů (Guiher and Burbrink 2008; Christopher M. R. Kelly 2009).

33

Druhá dvojice primerů pro úsek cytochromu b o maximální délce 380 bp (Kocher et al. 1989) byla: L14841 5-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3 H15149 5-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3 Tato dvojice primerů byla navržena pro univerzální použití na obratlovce a je použitelná i na jiné skupiny živočichů. Díky tomu jsou tyto primery funkční i na materiál horší kvality, ale PCR reakce je výrazně citlivější na kontaminaci.

Celkový objem směsi pro PCR reakci byl 30 µl. Složení PCR reakční směsi je uvedeno v následující tabulce. Po přidání Taq polymerázy jsem se směsí

chemikálie

objem (µl)

deionizovaná H2O

12,5

pracoval výhradně na ledu. Do 0,5 ml

taq 10x buffer

3

plastových zkumavek s víčkem jsem

25 mM MgCl2

2

nejdříve rozpipetoval mastermix (směs

oba primery (10 pmol/μl) 10 mM DNTPs Taq polymeráza 5 u/μl

všech složek pro PCR kromě templátové

3+3

DNA) v objemu 23 µl a poté přidal DNA v objemu 7µl.

3 0,25

Pro optimalizaci PCR programu jsem provedl několik pokusů s teplotním gradientem. Finální programy, které jsem používal, byly: kompletní cyt b

380bp dlouhý úsek cyt b

1. Počáteční denaturace............ 94°C 7:00 min............................. 94°C 7:00 min 2. Denaturace.............................94°C 40 s......................................94°C 30 s 3. Nasedání primerů............... ...46°C 30 s......................................45°C 30 s 34

4. Polymerace.............................72°C 60 s.................................... 72°C 60 s 5. Opakování kroků 2–4............39krát......................................... 35krát 6. Závěrečná polymerace............72°C 7:00 min..............................10:00 min 7. Ukončení reakce......................................4°C neomezeně dlouho Po domluvě s vedoucím laboratoře Pavlem Munclingerem jsem poslední krok v obou programech změnil na „20°C neomezeně“, aby nedocházelo ke zvýšenému opotřebení používaných termocyclerů. 4.4.4 Purifikace PCR produktu Nejdříve jsem používal postup purifikace PCR produktu extrakcí z gelu, a to pomocí QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen). Postup byl následující: Připravil jsem 2% agarosový gel: 50 ml TBE, 1 g agar, 1,5 µl EtBr. Do 2% agarosového gelu jsem aplikoval veškerý produkt z PCR, tj. 30 µl a 5 µl nanášecího pufru. Na jedno políčko jsem aplikoval hmotnostní marker (GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder s pruhy 100 až 3000bp pro celý cytochrom b, GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder s pruhy 100 až 1000bp pro úsek 380bp) pro kontrolu délky produktu. Elektroforéza probíhala po dobu asi 1 hod za těchto podmínek: zdroj BioRad, 9 V, 400 A. Ze získaného gelu jsem pod UV lampou vyřezal kousky obsahující pruh s požadovanou sekvencí. Takto získané části gelu jsem zvážil, trojnásobek hmotnosti gelu jsem použil jako ekvivalent objemu pufru QG, ve kterém se gel následně rozpouštěl. Dále jsem postupoval podle standardního postupu uvedeného v manuálu. Od této metody purifikace DNA z gelu jsem později upustil a používal metodu purifikace bez nutnosti vyřezání PCR produktu z agarózového gelu. 35

Nejdříve jsem po PCR provedl kontrolu DNA produktu na 2% standardním agarózovém gelu (stejné složení, jaké je uvedeno výše) pomocí elektroforézy. Na gel jsem nanášel jen 5 µl PCR produktu s 5 µl nanášecího pufru. Délku produktu jsem zkontroloval srovnáním s hmotnostním markrem. Zdroj napětí BioRad byl nastaven na 400 A, 100 W a přibližně 45 min. Vzniklé gely jsem opticky zkontroloval pod UV lampou a následně při nasvícení UV lampou zdokumentoval digitálním fotoaparátem. Obrázky gelů jsem ihned vytiskl a taky zazálohoval v digitální podobě ve fromátu jpg. K samotné purifikaci PCR produktu byl použit Quiagen PCR Purification kit, standardní protokol byl jen mírně upraven. V posledním kroku jsem použil menší množství eluačního činidla, tj. 25–50 µl v závislosti na kvantitě produktu (odhadnuto podle svítivosti pruhu na kontrolním gelu). Eluační činidlo EB bylo před samotnou eluací DNA ohřáto na 60°C a inkubováno v kolonce po dobu 3 min. Zjišťování kvality čistého PCR produktu: Koncentrace purifikované DNA byla zjištěna pomocí automatického spektrofotometru ND-1000 (Nanodrop®). Jako blank bylo použito eluační činidlo EB z purifikačního kitu. Výsledkem byla koncentrace DNA v ng/µl, poměr absorbancí při vlnových délkách 260 a 280, a poměr absorbancí při vlnových délkách 260nm a 230nm. Poměry absorbancí slouží pro kontrolu čistoty DNA. Pro čistou DNA platí, že poměr 260/280 musí být v rozmezí 1,8–2,2, a poměr 260/230 nesmí přesáhnout hodnotu 1,8. 4.4.5 Sekvenace Své vzorky jsem dával k sekvenaci do fakultní sekvenační laboratoře (http://www.natur.cuni.cz/~seqlab/index.htm). Sekvenační PCR byla provedena pomocí sekvenačního kitu ABI PRISM® BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) a primerů použitých pro primární amplifikaci cytochromu b. Množství templátové DNA potřebné pro sekvenaci závisí na délce čteného úseku a na kvalitě použité DNA. Jak je patrné z tabulky doporučených objemů DNA k sekvenaci, je 36

pro delší úseky potřebné vyšší množství templátu. Pro méně kvalitní DNA se její množství potřebné k sekvenaci ještě zvyšuje. Já jsem pro sekvenaci používal tyto hodnoty: pro primery L14910 a H16064 na kompletní cyt b: 50 ng DNA + 3,2 pmol primeru, ve vodním roztoku o objemu 14µl U problematických vzorků, které neměly ideální čistotu, jsem použil větší objemy DNA, tj. 100 ng. pro primery L14841 a H15149na 375 bp: 30 ng DNA, 3,2 pmol primeru, ve vodním roztoku o objemu 14µl

4.5 Úprava sekvenčních dat 4.5.1 Kontrola kvality sekvencí Po obdržení surových sekvencí ze sekvenační laboratoře jsem je zkontroloval v programu Sequence Scanner (Applied Biosystems). Tento program je schopný kontrolovat pravděpodobnost správného určení nukleotidů na základě dat ze sekvenátoru. Nejisté začátky a konce sekvencí jsem oříznul a všechny nukleotidy, jejichž pravděpodobnost nedosahovala 99%, jsem přepsal na N, tj. místa s neznámou hodnotou (podle anglického „any“ = jakýkoliv). 4.5.2 Kompletace sekvencí Sekvence získané pomocí primerů (H16064 a H15149) jsem nejprve pročistil v programu Sequence Scanner a potom přeložil do komplementární sekvence pomocí programu BioEdit. Všechny pročištěné, částečné sekvence získané pro každý vzorek jsem ručně alignoval a spojil do jedné finální sekvence.

37

4.5.3 Aligment, hledání haplotypů, přidání outgroups Všechny sekvence jsem společně uložil do jednoho souboru a vytvořil jejich aligment v programu Clustal X (Larkin et al. 2007). K vytvoření matic DNA p-distancí jsem použil program BioEdit. Tabulka p-distancí kvantifikuje odlišnosti mezi jednotlivými sekvencemi. Na jejím základě bylo relativně snadné určit, které sekvence patří stejným haplotypům, tj. jsou identické (viz příloha). K mým datům jsem přidal Genbank sekvence od všech druhů z čeledi Typhlopidae, u nichž byl osekvenován cytochrom b nebo větší úsek mitochodriálního genomu, který ho zahrnoval. Jednalo se o 3 druhy: Ramphotyphlops braminus (Genbank acc.: DQ343649), Typhlops platycephalus (Genbank acc.: AY099992) Typhlops mirus (Genbank acc.:AM236345). Tyto druhy byly v následujících analýzách použity jako outgroups. 4.5.4 Vytvoření a kontrola datasetů Hotové sekvence byly pro další použití uloženy ve formátech fasta, nexus a phylip. Pro fylogenetické analýzy jsem použil 3 soubory sekvencí: -

1. všechny haplotypy v jejich maximální délce oříznuté na obou koncích tak, aby konce dosahovaly min. 3 sekvence

-

2. jen sekvence dosahující délky přes 700 bp

-

3. všechny sekvence oříznuté tak, aby jejich vzájemný překryv byl aspoň 290 bp

U všech datových souborů jsem ověřil, jestli jsou dostatečně strukturované a nesou použitelnou fylogenetickou informaci. V programu PAUP* jsem pomocí funkce produkce 1000 náhodných stromů nechal spočítat standardní g1 statistiku pro změření šikmosti distribuce délek alternativních stromů (Hillis and Huelsenbeck 1992). 38

4.6 Fylogenetické analýzy Pro fylogenetickou analýzu jsem použil programy Phylip (Felsenstein 2005) a Paup* (Swofford 2003).

4.6.1 Práce se sadou Phylip 3.65 (Felsenstein 2005): Sekvence jsem v programu BioEdit (Hall 1999) uložil ve formátu používaném sadou Phylip, tj. „.phy“. 4.6.1.1 Metoda Neighbor-Joining Pro výpočet byly nejprve vygenerovány sady 1000 bootstrapových subreplikátů datového souboru v programu Seqboot. Následně byly spočítány DNA distance v programu DNAdist. Následoval výpočet stromu v programu Neighbor metodou Neighbor-Joining, nastaven Jukes Cantor parametr substitucí. Výsledných 1000 stromů bylo sloučeno do konsenzuálního stromu v programu Consense, kde bylo nastaveno pravidlo většinového konsenzu Majority rule – tj. uznání větví, které vyšly alespoň v 50% analýz. Výsledný strom byl nejdříve zakořeněn výše zmíněnými outgroupy pomocí programu Retree a následně vizualizován programem Drawgram a uložen ve formátu bmp v rozlišení 2000x2000 pixelů. Bootstrapové hodnoty jsem do výsledného kladogramu dopsal ručně v obrázkovém editoru Paint.Net podle výsledků z programu Consense uložených v textovém formátu. Postup pro zakořeňování a grafického znázornění fylogenetických stromů byl stejný pro výsledky všech použitých analýz.

39

4.6.1.2 Metoda Maximum Parsimony: Pro výpočet byly nejdříve vygenerovány sady 1000 bootstrapových subreplikátů (Felsenstein 1985) datového souboru v programu Seqboot. Tyto byly použity v programu DNApars k výpočtu stromů pomocí metody Maximum Parsimony. 4.6.1.3Metoda Maximum Likelihood: Pro výpočet byly nejdříve vygenerovány sady 100 bootstrapových subreplikátů (Felsenstein 1985)v programu seqboot. Tyto byly použity v programu Dnaml pro výpočet stromu pomocí metody maximální věrohodnosti. Výpočet byl proveden rychlejší variantou výpočtu pomocí heuristického hledání. 4.6.2 Práce v programu Paup* Nejprve jsem zjistil ideální parametry pro výpočty pomocí programu Modeltest 3.07 (Posada and Crandall 1998) 4.6.3 Metoda Maximum Parsimony Pro metodu MP byl v programu Paup* nastaveny tyto parametry: K vyhledání stromů, které mají nejlepší hodnotu parsimonnosti, byly provedeno heuristické hledání s 50 repeticemi. Strom byl swapován metodou TBR. Podpora větví získaného nejparsimonnějšího stromu byla zjištěna pomocí heuristického hledání jednotlivých dílčích topologií za použití 1000 sad bootstrapových (Felsenstein 1985) subreplikátů. 4.6.4 Metoda Maximum Likelihood K vyhledání stromu s nejvyšší hodnotou věrohodnosti bylo provedeno heuristické hledání s 20 repeticemi. Strom byl swapován metodou TBR. Pro výpočet ML stromu jsem použil parametry získané v programu Modeltest (Posada and Crandall 1998).

40

4.7 Tvorba konsenuálních stromů Z 6 výsledných stromů získaných analýzou datasetu 1 a datasetu 3, a ze 3 stromů získaných analýzou datasetu 2 jsem v programu Consense (součást balíku Phylip) vytvořil konsenzuální stromy. Pro výpočet těchto stromů jsem použil dvě pravidla – většinové (Majority Rule) a rozšířené většinové (Majority Rule extended). 4.7.1 Majority Rule Konsenzuální strom s pravidlem MR jsem nechal spočítat na základě MR konsenzuálních stromů, které jsem získal v analýzách NJ, MP a ML. Podporu jednotlivých větví v každé z analýz jsem napsal do vytvořeného konsenzuálního stromu. 4.7.2 Majority Rule extended Konsenzuální strom s pravidlem MRe jsem nechal spočítat na základě MRe konsenzuálních stromů, které jsem získal v analýzách NJ, MP a ML. Podporu jednotlivých větví v každé z analýz jsem napsal do vytvořeného konsenzuálního stromu.

41

5 Výsledky 5.1 Získané vzorky V roce 2008 se mi v Turecku povedlo objevit a ulovit celkem 8 jedinců druhu Typhlops vermicularis, a to na následujících třech lokalitách: Kizkalesi – lokalita středověké nekropole, v současné době zčásti zarostlá a zčásti přeměněná v pomerančovníkové sady. Jeden jedinec nalezen v odpoledních hodinách pod kamenem mimo obdělávanou půdu. Další jedinec nalezen brzy ráno pod kamenem přímo na polní cestě vedoucí k městu Kizkalesi.

Anamurion – lokalita ruiny antického města a nekropole. Dva jedinci nalezeni odpoledne pod kameny v blízkosti cesty. Jeden jedinec nalezen večer pod kamenem na keři porostlé ploše.

42

Magnesia – lokalita ruiny antického města. Tři jedinci nalezeni večer přímo mezi ruinami pod kameny. Jednoho živého jedince z Íránu jsem získal od Jiřího Šmída, který ho ulovil na jaře 2008 v opuštěné vinici na okraji vesnice Meyamey. Kromě slepáků jsem na těchto lokalitách nalézal mnohé další plazy: užovky rodu Eirenis, Platyceps, Telescopus, dvouplazy Blanus strauchi, scinky rodů Mabuya, Ablepharus, želvy Testudo graeca, a také mnoho zástupců výrazných skupin bezobratlých živočichů např. stonožky rodu Scolopendra, štíry z čeledí Buthidae i Scorpionidae, solifugy (Solifugae). Všichni slepáci bez problémů přežili dlouhý transport do České republiky. Další jedinci, z nichž byly použity vzorky pro molekulární analýzu, byli také nasbíráni výhradně v jarním období. O lokalitách, z nichž pochází vzorky z Íránu, nemám podrobnější informace. Jeden vzorek z Kypru byl nalezen u jezera při řecké vesnici Akrotiri, druhý asi 4 km od nejbližší vesnice -Geçitköy. Bulharské vzorky byly původem z kaňonu Kresna poblíž vesnice Kresnensko Choče. Jedinec, ze kterého pocházel Izraelský vzorek G23, byl nalezen mrtvý na chodníku v parku ve městě Qiryat Shemona. Druhý izraelský vzorek byl z blízkosti vesnice Almagor. Jednotlivé lokality jsou zakresleny na mapě na str. 23.

43

5.2 Chov

5.2.1 Potrava Slepáci v chovu nepřijímali žádný z nabízených alternativních typů potravy. Larvy a kukly mravenců rodu Lasius a Myrmica požírali bez problémů a ve velkém množství. 5.2.2 Rozmnožování V průběhu chovu (tj. od května 2008) jsem ani jednou nezaznamenal páření. Samice původem z jižního Turecka (lokalita Kizkalesi) dne 8. 9. 2008 snesla 3 vajíčka. Vajíčka byla patrná přes břišní stěnu hada už cca 2 týdny před snůškou. Byla hodně protažená až válcovitá. Měla pevný, neprůhledný kožovitý obal. Jejich rozměry byly: -1,94x0,60 cm - 2,46x0,57 cm - 2,36x0,61 cm

Všechna vajíčka začala do dvou týdnů projevovat známky odumření.

44

5.3 Molekulární zpracování materiálu 5.3.1 Vzorkování Odběr vzorků krve (resp. lymfy) z dorsální strany ocasu ze živých jedinců pomocí injekční stříkačky byl úspěšný. Všichni jedinci přežili tuto proceduru bez komplikací a vzorky byly dobré kvality. Tuto metodu lze považovat za nedestruktivní a pro studovaný druh dobře aplikovatelnou. Jiný typ vzorků získaných nedestruktivně, tj. šupiny a vydávenou potravu, lze použít, ale z těchto vzorků se nepovedlo amplifikovat delší úseky DNA. 5.3.2 Izolace DNA se mi povedlo získat z většiny vzorků, různé typy vzorků ale měly výrazně odlišné výtěžky nukleových kyselin.

5.3.3 PCR Optimalizační postupy PCR v teplotním gradientu ukázaly, že předem vybrané programy jsou pro mou práci vhodné, snížení ani zvýšení teploty nasedání primeru by výsledek neovlivnilo pozitivně.

Obr. Kontrola produktu po PCR. Vlevo produkty PCR reakce s použitím primerů pro 380 bp dlouhý úsek. 45

5.3.4 Purifikace Purifikace z gelu: Tuto metodu jsem zamítl kvůli problémům s čistotou a výtěžky DNA. Tento problém se zdá být obecnou vadou používaného kitu. Proto laboratoř sekvenace DNA tento kit nedoporučuje. Z takto purifikovaných vzorků se nepovedlo ani jeden osekvenovat. Purifikace pomocí kitu Quiagen PCR purification kit měla poměrně dobré výsledky, ale i tak některé vzorky nedosahovaly ideální čistoty a koncentrace DNA. 5.3.5 Sekvenace Tabulka výtěžků PCR purifikace, jejich čistoty a délky finálně získané sekvence. vzorek

produkt primerů pro celý cyt b

produkt primerů pro

délka získané

v ng/μl (poměr hodnot

380 úsek cyt b v ng/μl

sekvence

absorbancí 260/280 260/230)

(hodnoty 260/280 260/230)

T01

16,9 (1,95 1,73)

29,2(1,7 1,67)

772

T02

22,28(1,96 1,95)

19,5(1,83 1,54)

502

T03

19,6 (1,88 2,01)

T04

22,19(1,79 1,56)

23,7 (1,8 1,7)

800

T05

26,2(1,95 1,88)

22,4(1,87 1,62)

789

T07

20,59(1,92 1,39)

27,7(1,84 1,79)

801

T08

25,9(1,94 1,46)

14,5(1,88 1,32)

782

T09

10,7(2,02 2,43)

23,9(1,9 1,71)

976

612

45,16(1,93 2,06)

924

613

17,04(1,78 1,74)

890

614

44,02(1,85 1,54)

873

Alb

19,7(1,75 2,26)

1046

G52

736

18,7(2,19 1,45) 46

322

Syr

22,0(1,73 1,32)

21,6(1,81 1,56)

886

G24

31,98(1,88 2,06)

27,5(1,75 1,30)

922

G23

24,7(1,6 1,23)

29,8(1,88 1,77)

955

G86

17,1(2,01 1,58)

331

G60

20,4(1,93 1,25)

322

G66

17,78(1,75 1,88)

9,8(1,76 1,21)

G66

28,3 (1,79 1,92)

22,9(2,07 1,68)

835

CYP

25,38(1,74 1,76)

29,0(1,70 1,48)

997

I 32

22,3(1,91 2,23)

294

I 40

44,5(1,86 1,18)

337

I 45

33,9(1,87 1,60)

321

I 86

25,5(1,71 2,03)

323

I 92

37,3(1,80 1,19)

291

I 165

27,5(1,86 1,86)

325

I 198

10,7(1,50 2,00)

335

I 203

15,5(1,76 1,97)

300

I 829

20,2(1,71 1,38)

295

I 889

19,8(1,71 1,70)

366

Sekvenace vzorků byla problematická, primery L14910 a H16064 pro kompletní cytochrom b přinášely slabé výtěžky při PCR a při sekvenaci často dávaly jen slabé výsledky. Mírně lepší výsledků jsem dosáhl při zvýšení množství templátové DNA v sekvenační směsi. Surové sekvence získané z těchto primerů měly až 200 prvních bazí nízké průkaznosti a musely se výrazně ořezávat. Ve finále to vedlo ke zkrácení získané sekvence z potenciálních 1100 bazí o 200 až 400 bazí.

47

5.3.6 Aligment , datasety Protože sekvence mitochondriálního genu pro cytochrom b v podstatě neobsahuje mezery je tvorba jeho aligmentu bezproblémová.

Podle g1 statistiky vychází pro moje datasety signifikantně šikmá distribuce délek alternativních stromů (P ≤ 0,01 dle Hillis &

g1 statistika

Huelsenbeck 1992) což znamená, že nesou použitelnou fylogenetickou informaci. Hodnoty g1 statistiky jsou shrnuty v tabulce.

dataset

celkový počet znaků

dataset 1

- 1,285308

dataset 2

- 1,523382

dataset 3

- 1,680721

počet parsimonně

délka stromu (počet

počet stejně

informativních

kroků nutných k

parsimonních

znaků

vytvoření stromu)

stromů

dataset 1

918

227

761

208

dataset 2

919

215

709

2

dataset 3

348

136

361

1529

Tabulka parametrů jednotlivých datasetů pro metodu MP.

48

5.4 Fylogenetická analýza, výsledky

Balkán

Írán1

Írán2

a

jižní

jižní

Sýrie

Izrael

Turecko Turecko

západní

1

2

Turecko Balkán

1.64%

a západní Turecko Írán1

4.28%

2.99%

Írán2

5.20%

4.87%

2.76%

jižní

5.49%

7.63%

6.40%

3.37%

5.26%

7.33%

7.33%

5.67%

0%

Sýrie

5.27%

6.23%

6.97%

5.45%

5.35%

Izrael

11.09% 11.75% 11.51% 12.04% 12.54% 11.23%

Turecko 1 jižní Turecko 2 9,14%

Tabulka průměrných hodnot p-distancí pro jednotlivé linie; na diagonále nejvyšší hodnota divergence v rámci skupiny pro sekvenci patřící do sady dlouhých sekvencí. (Celková tabulka p-distancí v příloze.) Linie: Balkán a západní Turecko – vzorky T06, T07, T08, Alb, 612, 613, G66 Írán 1 – vzorky T09, I32, I40, I165, I198, I203, I889, I829 49

Írán 2 – vzorky G24, I45, I86, I92, jižní Turecko 1 – vzorky Cyp, G52, T03, T04, T05 jižní Turecko 2 – vzorky T01, T02 Sýrie – vzorek Syr Izrael – vzorky G23, G86 Na základě nekorigovaných DNA p-distancí vychází výrazná odlišnost izraelských vzorků G23, G86 od zbylých vzorků. Tato odlišnost je v průměru vyšší než 10%. Zároveň jsou si oba tyto vzorky také výrazně vzdálené. Zjištění ideálních parametrů pro výpočty pomocí programu Modeltest 3.07 vybraný model: HKY+I+G -lnL =

4538.5713

počet testvaných modelů K =

6

zjištěné frekvence bazí: freqA =

0.3619

freqC =

0.3097

freqG =

0.0861

freqT =

0.2424

poměr travsicí a transverzí Ti/tv = 3.6812 podíl invariabilních míst (I) =

0.4881

Gamma distribuce = 1.1347

50

5.4.1 Maximum Likelihood fylogram

Fylogenetický strom vytvořený v programu Paup*, metodou Maximum likelihood, s modelem substitucí určeným pomocí programu Modeltest. Délka větví zobrazuje genetickou vzdálenost větví, mírka udává délku větve odpovídající 10% genetické divergence. Hodnoty udávají procenta podpory větví pomocí 37 bootstrapových sad.

51

5.4.2 Konsenuální stromy Schéma kladogeneze, většinový konsenzus založený na 6 analýzách datasetů 1 a 3, tj. všech sekvencí s jejich maximální délkou a všech sekvencí oříznutých na cca 300 bp. Nad větví její podpora podle datasetu 1, pod větví její podpora podle datasetu 3. Hodnoty v pořadí: % ze 100 bootstrapů metodou ML v programu Phylip; % podpory z 1000 bootstrapů metodou MP v programu Paup; podpora z 1000 bootstrapů podle metody NJ v programu Phylip. x značí metodu, která danou větev nevytvořila. 52

Schéma kladogeneze, rozšířený většinový konsenzus založený na 6 analýzách datasetů 1 a 3, tj. všech sekvencí s jejich maximální délkou a všech sekvencí oříznutých na cca 300 bp. Nad větví její podpora podle datasetu 1, pod větví její podpora podle datasetu 3. Hodnoty v pořadí: % ze 100 bootstrapů metodou ML v programu Phylip; % podpory z 1000 bootstrapů metodou MP v programu Paup*; podpora z 1000 bootstrapů podle metody NJ v programu Phylip. x značí metodu, která danou větev nevytvořila.

53

Schéma kladogeneze, většinový konsenzus založený na 3 analýzách datasetu 2, tj. všech sekvencí s délkou nad 700 bp. Hodnoty v pořadí: % podpory větve ze 100 bootstrapů metodou ML v programu Phylip; % podpory z 1000 bootstrapů metodou MP v programu Paup*; podpora z 1000 bootstrapů podle metody NJ v programu Phylip. x značí metodu, která danou větev nevytvořila. 5.4.3 Popis získaných stromů Na fylogenetickém stromě vytvořeném z datasetu 1 metodou maximální věrohodnosti je patrná velká genetická vzdálenst izraelských vzorků od ostatních vzorků a od sebe navzájem.

54

Podle konsenzuálních stromů vytvořených na základě analýz datasetů 1 a 3 je patrných několik linií, které mají akceptovatelnou, i když ne podle všech metod vysokou podporu. Větev s nejsilnější podporou, obsahující vzorky z různých lokalit, je tvořena dvěmi izraelskými vzorky. Vysokou podporu má podle 3 analýz pro dateset 1, při použití zkrácených sekvencí její podpora jen mírně klesá. Všechny vzorky s původem mimo Izrael patří do jedné skupiny, která se dále dělí na 4 dobře podpořené podskupiny a 2 vzorky bez zařazení. Vzájemné vztahy těchto linií jsou na základě mých dat nerozřešené. Íránské vzorky patří pravděpodobně do dvou skupin, které vycházejí podle většiny použitých metod (Írán1, Írán2), ale jejich podpora není příliš vysoká. Balkánské vzorky tvoří se vzorky ze západního Turecka společnou větev s relativně vysokými hodnotami podpory v datasetu 1 i 2 ale při použití jen zkrácených sekvencí v datasetu 3 je podpora této větve velmi nízká. Spojení vzorků z Kypru a vzorků z Anamuru je sice logické, ale při použití datasetu 1 nemá výraznou podporu a metoda NJ tuto větev nevytvořila. Tato metoda zároveň nevytvořila ani společnou větev pro kyperské vzorky. V datasetu 2 je podpora spojení anamurských vzorků a jednoho kyperského podle všech metod vysoká. Pro dataset 3 žádná z metod jejich spojení výrazně nepodporuje. Vzorky z Kizkalesi v jižním Turecku a ze Sýrie podle provedených analýz nepatří ani do jedné z rozeznaných skupin, při rozšířeném většinovém konsenzu sice jsou náznaky jejich příbuznosti k anamursko-kyperské linii, ale toto spojení není ani jednou metodou většinově podpořené.

55

5.5 Morfologický popis jedinců Zbarvení živých jedinců je na gradientu od světle hnědé s tóny růžové, přes hnědé, až po téměř černé. Nejsvětleji zbarvení jsou jedinci ze západního Turecka (T06-8) a jedinec z Íránu (T09). Hnědě zbarvení jsou jedinci z jižního Turecka (T01-5). Izraelští slepáci (viz foto níže) jsou nejtmavěji zbarvení. 5.5.1 Tabulky rozměrů Na základě srovnání hmotností všech dostupných jedinců je patrné, že v rámci studovaného souboru jedinců není zřejmé rozdělení do skupin podle tělesné velikosti (které by v opačném případě mohlo odpovídat věkovým skupinám), viz graf. 7

6

5

4

3

2

1

T0 05 T0 IR 08 A 09 2 T0 IR 04 A IR 040 A 20 3 T0 IR 03 A IR 169 A 19 6 T0 IR 07 A 17 4 T0 IR 06 A IR 086 A 0 IR 32 A 19 8 T0 IR 02 A 1 IR 68 A IR 166 A IR 167 A 17 5 T0 IR 09 A IR 889 A 18 3 C IR YP A IR 197 A IR 045 A IR 165 A 82 9 T0 IR 01 A IR 905 A 20 2

0

Graf rozložení hmotnosti (osa y, v gramech) jednotlivých exemplářů (osa x). Tabulka

vzorek

délka těla

šířka těla

šířka

délka/šiřka šířka těla

rostrale/

hlavy

šířka hlavy

počet šupin

počet šupin

po obvodu

po obvodu

těla za

těla v půlce

hlavou

těla

cyp

22,7

0.43

52.94

0.36

47%

24

24

i32

17,62

0.39

45.63

0.32

31%

24

22

56

i40

16,65

0.28

59.77

0.26

43%

23

22

i45

18,99

0.45

42.58

0.41

38%

26

24

i86

18,05

0.34

53.42

0.29

38%

25

22

i92

12,35

0.28

43.89

0.26

42%

24

24

i165

23,1

0.42

55.38

0.35

39%

24

24

i166

20,85

0.36

58.13

0.32

41%

23

23

i167

22,2

0.36

61.85

0.32

36%

24

24

i168

20,85

0.37

56.37

0.31

34%

22

22

i169

16,21

0.28

57.05

0.26

39%

23

24

i174

17,7

0.33

53.52

0.28

38%

24

24

i175

21,92

0.42

52.23

0.33

38%

23

24

i183

23,92

0.44

54.85

0.36

40%

24

24

i196

14,67

0.31

47.11

0.26

39%

24

24

i197

21,69

0.41

52.73

0.36

39%

23

22

i198

17,63

0.37

48.17

0.29

37%

23

22

i202

25,62

0.46

55.98

0.38

36%

24

24

i203

11,34

0.28

40.97

0.24

42%

23

24

i829

23,14

0.46

50.06

0.38

36%

25

24

i889

21,84

0.43

51.12

0.34

40%

26

24

i905

25

0.46

54.71

0.43

39%

25

24

37%

21

g23

Tabulka délky a šířky těla, šířky hlavy, délky a šířky rostrálního štítku a vzájemných poměrů některých z nich u dostupných exemplářů.

V studovaném souboru slepáků Typhlops vermicularis přesahuje nejdelší exemplář délku 25 cm. Poměr šířky a délky těla, tzv. hodnota štíhlosti (někdy používaná jako poznávací znak), má velkou variabilitu s hodnotami od 41 do 61. 5.5.2 Popis exemplářů z Íránu, Turecka a Kypru Slepáci Typhlops vermicularis z Íránu jsou barevně částečně pozměněni uložením v etanolu, jehož vlivem obvykle dochází ke snížení sytosti zbarvení (Niyomwan et al. 57

2001; Lehr et al. 2002). Dorsálně jsou pískově až hnědožlutě zbarveni, na ventrální straně jakákoliv pigmentace chybí. Živý exemplář z Íránu je relativně málo pigmentovaný, a z větší části růžově zbarvený prosvítajícími tkáněmi. Živí jedinci z Turecka jsou z dorsální strany zbarveni jemně do hněda, vedle pigmentovaných částí šupin prosvítá růžové zbarvení pod pokožkou ležících tkání. Z ventrální strany jsou všichni slepáci zbaveni světle, místy jsou přes kůži patrné obrysy vnitřních orgánů.

fotografie a nákres folidózy jedince I 202, Razan, Írán

5.5.3 Popis hlavové folidózy Íránských jedinců: Rostrale je velké anteriorně se mírně zužující, posteriorně na kontaktu s nasales a frontale tvořící tupou špičku. Ke kontaktu nasales dochází až pod okrajem rostrale. Rýha rozdělující spodní část nasale vede od nozdry postero-ventrálně ke 2. supralabiale, nad nozdrou je jen nepatrná, a není patrná z dorsálního pohledu. Preoculare je přibližně stejně široké jako oculare, posteriorní okraj je mírně konkávně vykrojený. Oculare je zhruba kosodélníkovité, spodní okraj je překrytý 3. supralabiale. Oko se nachází pod oculare, blízko při jeho anteriorní hraně. Frontale je o něco širší než delší, je větší než postfrontale a menší než interparietale. Postfrontale je stejně široké jak dlouhé. Parietale je více než 2,5krát širší než delší, posazené šikmo na rovinu těla. Interparietale je přibližně 2krát širší než delší. Studované exempláře mají vzor překryvu supralabiálií (SIP) typu T-III., to znamená 3. supralabiale svou dorsoposteriorní částí překrývá oculare (viz. Obr2 na str 12). Velikost supralabiales S1 < S2 < S3 < S4. Třetí supralabiale je stejně dlouhé jako široké. 58

Fotografie a nákres folidózy jedince Cyp, Akrotiri, Kypr.

5.5.4 Popis hlavové folidózy kyperského jedince: Rostrale je velké anteriorně se mírně zužující, posteriorně na kontaktu s nasales a frontale tvořící tupou špičku. Ke kontaktu nasales dochází až pod okrajem rostrale. Rýha rozdělující spodní část nasale vede od nozdry postero-ventrálně ke 2. supralabiale, nad nozdrou je jen nepatrná a není patrná z dorsálního pohledu. Preoculare je trochu méně široké než oculare, jeho posteriorní okraj je mírně konkávně vykrojený. Oculare je zhruba kosodélníkovité, spodní okraj je překrytý 3. supralabiale. Oko se nachází pod oculare, blízko při jeho anteriorní hraně. Frontale je širší než delší, je větší než postfrontale a přibližně stejně velké jako interparietale. Postfrontale je stejně široké jako dlouhé. Parietale je více než 2krát širší než delší, posazené šikmo na rovinu těla. Interparietale je stejně velké jako frontale a je obdobného tvaru. Kyperský exemplář má vzor překryvu supralabiálií (SIP) typu T-III., to znamená 3. supralabiale svou dorsoposteriorní částí překrývá oculare (viz. Obr2 na str 12). Velikost supralabiales S1 < S2 < S3 < S4. 3. supralabiale je stejně dlouhé jako široké.

5.5.5 Popis exemplářů G23 a G86 z Izraele

59

G86, živý jedinec, Almagor ( V.Gvoždík)

nákres a fotografie folidózy jedince G23 z Qyriat Shemona (tečkovaně správná poloha rostrale, které je na jedinci odchlíplé)

Zbarvení jedince je z dorsální strany tmavě-šedé až černé, jednotlivé šupiny jsou po okrajích mírně světle lemované, při zvětšení vytvářejí jemný síťovaný vzor. Zbarvení z ventrální strany je světlé až smetanově bílé. Ve vzdálenosti 10 kostálních štítků od hlavy má jedinec G23 celkově 21 štítků po obvodu těla. Tyto řady šupin jsou tvořeny 9 řadami dorsálních, plně vybarvených šupin, 8 řadami šupin světlých, 2 a 2 řadami šupin po bocích těla, které tvoří barevný přechod mezi ventrálním a dorsálním zbarvením. Hlava je z dorsální i laterální strany tupě zakončená, tvarem odpovídající jedincům druhu Typhlops vermicularis. Popis hlavové folidózy jedince G23, Qyriat Shemona, Izrael: Rostrale je velké, anteriorně se nezužuje, jeho posteriorní hrana je zaoblená. Ke kontaktu nasales dochází na okraji rostrale. Rýha rozdělující spodní část nasale vede od nozdry postero-ventrálně ke 2. supralabiale, nad nozdrou je jen velmi krátká, dosahující svou délkou 1/3 průměru nozdry, z dorsálního pohledu je patrná jen při zvětšení (alespoň15x). Preoculare je stejně široké jako oculare, jeho posteriorní okraj je v úrovni 60

oka konkávně vykrojený. Oculare je zhruba kosodélníkovité, spodní okraj je překrytý 3. supralabiale. Oko se nachází na hraně preoculare a oculare. Frontale je kosočtvercové, je menší než postfrontale a interparietale. Postfrontale je kosočtvercové. Parietale je více než 1,5krát širší než delší, posazené kolmo na rovinu těla. Interparietale je do stran protáhlé, asi 2krát širší než delší. Studovaný exemplář má vzor překryvu supralabiálií (SIP) typu T-III., to znamená 3. supralabiale svou dorsoposteriorní částí překrývá oculare (viz. Obr2 na str 12). 1.supralabiale je drobné, stěží patrné, podlouhlé, v kontaktu s rostrale a nasale. 2. supralabiale je stejného tvaru, v kontaktu s nasale a preoculare. 3. supralabiale je výrazně širší než delší, frontálně v kontaktu s preocuare, a částečně překrývá oculare, jak již bylo zmíněno. 4. supralabiální štítek je největší, přibližně čtvercový, v kontaktu s oculare, postoculare a tělními štítky.

6 Diskuze 6.1 Získávání vzorků Živé exempláře, o kterých se pojednává v této práci, byly odchyceny v jarním období v průběhu dubna 2008. Veškeré předchozí výpravy do oblasti jejich výskytu nepřinesly žádané výsledky. Důvodem neúspěchu výprav do Turecka 2005 a 2006, do Bulharska 2006 a jižních oblastí bývalé Jugoslávie v roce 2007 bylo špatné načasování. Neúspěšné výpravy byly plánovány s ohledem na akademický rok, ale nebraly v úvahu biologii hledaného druhu, takže jejich neúspěch nebyl překvapivý. Slepáci jsou na povrchu půdy zastižitelní hlavně na jaře, kdy mají podobně jak ostatní hadi období páření a hodně času tráví hledáním jedinců opačného pohlaví. Najít slepáky v létě je velmi nepravděpodobné, lze očekávat, že v období vysokých teplot zalézají do hlubších partií půdy. Všichni živí jedinci z Turecka byli odchyceni na ruinách a podobných, člověkem ovlivněných lokalitách. Tato místa mají hned několik výhod. Tím, že jsou památky určitým způsobem formálně chráněny, je omezeno jejich intenzivnější využití pro 61

zemědělské účely. V Turecku jsou často extenzivně spásány, což zabraňuje jejich zarůstání, a vytvářejí se tak vhodné podmínky pro život mnoha druhů plazů. Velké množství na zemi ležících kamenů, které jsou často jen mělce zanořeny do půdy, vytváří pro plazy ideální prostředí. Zároveň jsou ruiny pro člověka docela přehledným terénem a obvykle jsou taky snadno dostupné. Není zřejmé, co kolokalizace slepáků a člověkem pozměněných biotopů vypovídá o případném vztahu rozšíření tohoto hada a lidské činnosti. Může se jednat jen o chybu v samplingu, jednoduše proto, že lokality v blízkosti lidských sídel jsou dostupnější, a proto jsou častěji navštěvovány. Ovšem u slepákovců není ojedinělá situace, kdy v částečně narušené krajině dosahují některé druhy relativně vysoké početnosti, dokonce vyšší než v přírodním prostředí (Storr 1968; Gower et al. 2004). Jestli se o obdobný jev jedná i u Typhlops vermicularis nelze podle mých dat odhadnout. U Ramphotyphlops braminus a několika dalších druhů je činnost člověka nepopiratelně důležitým faktorem rozšiřujícím jejich přirozený areál do nových oblastí (Myers 1958; Storr 1968; Lieberma and Lieberma 1970; Nussbaum 1980; Pauwels et al. 2004). V případě Typhlops vermicularis se o člověkem vytvořenou populaci může jednat v případě ostrova Dugi v Chorvatsku, ale nikdo se zatím této otázce hlouběji nevěnoval (Grillitsch et al. 1999). Moje data nepotvrzují žádný dálkový výsadek Typhlops vermicularis, který by mohl být způsobený člověkem. Tento druh se zdá mít přirozeně rozložené fylogenetické linie, které víceméně odpovídají fylogeografické struktuře pozorované u jiných plazů (Fritz et al. 2007; Kyriazi et al. 2008). Velmi přínosným pro získání nových poznatků o biologii slepákovců byl mohl být pokus o terénní sledování v přirozeném prostředí, jak se to již podařilo u fosoriálních obojživelníků červorů (Measey et al. 2003a; Measey et al. 2003b). Kromě časové a technické náročnosti je zde ještě problém s nalezením vhodné lokality, kde by početnost slepákovců byla dostatečně vysoká, aby případné „mark and recapture“ testy byly použitelné. Jsem přesvědčený, že takové lokality existují – podle databáze vzorků v California Academy of Sciences (http://research.calacademy.org/research/herpetology/catalog/Index.asp), se v průběhu měsíce povedlo na několika málo lokalitách v Turkmenistánu nasbírat celkově 167 62

jedinců druhu Typhlops vermicularis. Takže místa s masovým výskytem těchto hadů pravděpodobně existují.

6.2 Poznatky z chovu 6.2.1 Potrava Neúspěch s alternativní potravou jen potvrzuje fakt, že slepáci nejsou snadno chovatelní plazi a pro studium jejich biologie je chov v zajetí možnou, ale komplikovanou záležitostí. I když jsou slepáci nenároční co se obytného prostoru týče, úzká potravní specializace a malá estetická atraktivita jejich chov vymezuje jen pro malou skupinu lidí specializovaných na tyto fosoriální hady. Slepáci Typhlops vermicularis chovaní v zajetí nepříjimali jako potravu termity, sociální hmyz, který má přibližně stejný areál rozšíření jako slepákovci. Toto pozorování lze vysvětlit několika způsoby: a) Nabízení termiti rodu Reticulitermes jsou tzv. central site nester, to znamená, že kolonie se nachází přímo ve zdroji potravy. Dělníci z kolonie nevycházejí a kolonie je v podstatě naprosto izolovaná od okolního světa. Proto, i když žijí na stejné lokalitě, nebudou se se slepáky potkávat moc často a sloužit jim jako potrava. Z tohoto důvodu by bylo zajímavé otestovat i druhy termitů, jejichž zdroje potravy jsou mimo kolonii a dělníci mají stezky mezi potravou a kolonií, takže je slepáci mohou běžně v přirozeném prostředí potkávat. b) Podobnost areálů Scolecophidia a termitů je v podstatě náhodná, daná jen obdobnými klimatickými faktory, které vymezují vhodnou oblast pro přežívání těchto skupin (u termitů udávaná termoklina 0°C). c) I když v tropech jsou druhy, které běžně požírají termity (Shine and Webb 1990; Webb and Shine 1993; Torres et al. 2000; Webb et al. 2001), Typhlops vermicularis tento typ potravy pravděpodobně nevyužívá ve větší míře.

63

d) podmínky v chovu jsou tak odlišné od reálných, že slepáci se nechovají k nabízené potravě přirozeným způsobem. Tuto možnost podporuje fakt, že termiti jsou jako potrava studovaného druhu docela často zmiňováni. Dokonce exemplář, ze kterého byl odebrán jeden z řeckých vzorků, byl uloven přímo v termitišti. 6.2.2 Rozmnožování Zaznamenané množství snesených vajíček řadí slepáka Typhlops vermicularis mezi druhy s malými snůškami. Počet vajíček by mohl být ovlivněn podmínkami v chovu, ale vzhledem k jejich velkým rozměrům asi není fyzicky možné, aby byla snůška u tohoto druhu výrazně větší. Tento poznatek odpovídá údajům o malých množstvích 4–7 vajíček udávaných v literatuře (Disi 2002). Malé snůšky u plazů korelují s vyšší rychlostí molekulární evoluce (Bromham 2002), což je možná jeden z důvodů, proč Typhlops vermicularis vytvořil několik sekvenčně odlišných linií i na relativně malé ploše (území Levanty). 6.3 Fylogeografie Má data ukázala na přítomnost několika jasných fylogeneticky distinktních skupin, které odpovídají situaci známé i u jiných plazů (Kyriazi et al.; Van der Kuyl et al. 2005; Parham et al. 2006). Neúplné pokrytí areálu rozšíření a malá délka sekvencí ale naneštěstí neumožňují přesnější odhalení vzájemných vztahů mezi těmito skupinami. 6.3.1 Situace na Balkáně a západním Turecku Populace Typhlops vermicularis na kontinentálním Balkáně podle DNA distancí vychází jako mladá populace s nízkou variabilitou na relativně velké ploše. Stejný haplotyp vzorků z lokalit Ardenica a Kresna, které jsou od sebe vzdálené cca 300 km, tomu nasvědčuje. Odpovídá to stavu pozorovanému i u jiných organismů v oblastech, kam se jen recentně rozšířily (Hewitt 2001). Domnívám se, že to může být způsobeno tím, že Typhlops vermicularis byl v poslední době ledové na Balkáně rozšířen jen omezeně a současný balkánský areál byl osídlen potomky z jediné populace až po oteplení s nástupem současného interglaciálu. Zároveň balkánské vzorky i při relativně dlouhých sekvencích nevykazují jasnou fylogenetickou strukturu. Alternativně se může jednat o 64

dálkový výsadek způsobený člověkem. Osobně si ale myslím, že přirozené rozšíření je pravděpodobnější. Výrazná odlišnost řeckých vzorků z poloostrova Peloponés (G 66, Gialova, G60 Kastania) od vzorků z Bulharska a Albánie podporuje informace o tom, že v Řecku slepákovci přežívali i v ledových dobách (Szyndlar 1991). Spojení balkánských a západotureckých vzorků do jedné linie je z geografického hlediska logické. Západní Turecko a Balkán byly v geologické minulosti často propojeny, nejen v oblasti Dardanel, ale taky „ostrovním“ mostem přes Egejské moře (Foufopoulos and Ives 1999; Hausdorf and Hennig 2005; Poulakakis et al. 2008). 6.3.2 Situace v Íránu Dvě oddělené linie slepáků v Íránu jsou pravděpodobně důsledkem dvou oddělených invazí na toto území. Zarážející je, že na základě mých dat nejsou tyto dvě linie geograficky vyhraněné. Jedna linie je sice víceméně na severozápadě země, ale jeden její člen je z centrální části. Vzorek z města Maku má nejisté postavení a snižuje podporu větve, ve které se nachází. Druhá linie, ze které mám větší počet vzorků, je rozšířena ve východní části země, rozšířený konsenzuální strom dokonce zobrazuje i společnou větev 3 jihovýchodních vzorků. Při normálním většinovém konsenzu tvoří východní linie nerozřešené mnohonásobné větvení. Je to způsobeno příliš malo délkou sekvencí, které se mi z většiny Iránských vzorků povedlo získat. 6.3.3 Situace v oblasti Levanty, jižního Turecka a Kypru Kvůli nedostatečnému samplingu tureckého pobřeží nelze zjistit, jestli je kyperská populace vytvořená člověkem. V analýzách mají kyperské vzorky tendenci tvořit společnou linii se vzorky z Anamuru, který je ke Kypru nejbližší částí turecké pevniny. Jejich vzájemná divergence kolem 3%, ale naznačuje jejich dlouhou izolaci. Mezi kyperskými vzorky je zároveň téměř 2% odlišnost, což jednak může být způsobeno více importy z různých míst, nebo dlouhou izolací linií obývajících jih a sever Kypru. Oblast Levanty v mých analýzách obhájila post nejdůležitějšího bodu ve východním Mediteránu. Na tomto mostě mezi čtyřmi biogeografickými oblastmi 65

(Afrotropické, Saharo-Sindské, Palearktické a Orientální) (Disi 1996) se ukázala obrovská variabilita sekvencí. Vzorky z jižního Turecka, Sýrie a Izraele se od všech ostatních sekvenčně lišily tak moc, že ani v jedné z analýz nebyly přiřazeny k některé z výše zmiňovaných skupin. Poukazuje to na možnost, že v této oblasti se udržují opravdu dlouhodobě oddělené linie, které jsou podle mého názoru na cestě speciace. Levanta patrně sloužila druhu Typhlops vermicularis k pronikání z oblasti jeho původu na nová území. Podle mého názoru to byl směr z Afriky do Asie. Domnívám se, že Typhlops vermicularis by měl bých chápán spíše jako africký prvek, který úspěšně expandoval na velké území blízkého a středního východu. Toto tvrzení je podpořeno faktem, že jeho nejbližší příbuzné druhy jsou výlučně africké (Wallach 1998; Wallach 2002; Broadley and Wallach 2007). Moje data zároveň ukazují na genetickou variablilitu kolem 10% i mezi vzorky, jejichž lokality jsou vzdáleny jen desítky kilometrů (Almagor vs. Qyriat Shemona) případně necelých 200km (Izrael vs. Sýrie) u vzorků z Levanty. Co výrazně kontrastuje s výsledky zbylých vzorků ze zbytku areálu royšíření. jejich genetická divergence nepřekračuje 5% mezi i vzorky, které jsou od sebe lokalitně vzdálené téměř 4000km (Ardenica vs. Deh Bakri). I když jsou izraelské vzorky ve všech analýzách řazeny do jedné linie, je jejich vzájemná divergence velmi vysoká. Je možné, že se jedná o zástupce samostatných linií bazálních k zbytku druhu Typhlops vermicularis. Na základě velké genetické divergence jedince z Qyriat Shemona je možné ho považovat za samostatný druh.

6.4 Morfologie V souboru slepáků ze sbírky Daniela Frynty je velká variabilita jedinců co do velikosti, hmotnosti, štíhlosti těla a dalších znaků. Počet štítků po obvodu v půlce těla zjištěný u jedinců z Íránu rozšiřuje jejich počet z dosud udávaných 24 (Wallach 2002) na 22-24. Izraelský vzorek z Qyriat Shemona, Izrael (G23), jehož hlavu mám k dispozici, se od všech ostatních jedinců Typhlops vermicularis morfologicky liší v těchto znacích (na prvním místě situace u G23):

66

-

intenzita pigmentace dorsální strany těla dosahující až černého zbarvení vs. narůžovělé až hnědé zbarvení dorsální strany těla

-

poloha oka na rozhraní oculare a preoculare vs. oko pod anteriorní částí oculare

-

frontale malé, v řadě postrostrálních štítků je nejmenší vs. frontale větší než postfrontale

-

rostrale se anteriorně nezužující vs. rostrale anteriorním směrem mírně se zužující

-

rostrale s oblou dorsální hranou vs. rostrale s tupým začpičatěním

-

3. supralabiale obdélníkovitého tvaru, širší než delší vs. 3. supralabiale přibližně kosočtvercové

-

osa parietales kolmá na rovinu těla vs. parietales položené šikmo na rovinu těla

-

ve vzdálenosti 10 štítků za hlavou 21 štítků kolem těla vs. 22-26

Variabilita hlavových štítků v rámci skupiny mimo Izrael se týká hlavně velikosti postrostrální řady štítků, tvaru a velikosti parietales.

67

7 Souhrn Tato práce se zabývá studiem fylogeografie a některých aspektů biologie slepáka druhu Typhlops vermicularis. Pro její účely bylo použito celkově 42 jedinců, původem z 26 lokalit. Sampling pokrývá většinu známého areálu studovaného druhu. Jedná se o historicky první pokus o poznání vnitrodruhové fylogenetické struktury zástupce Scolecophidia z oblasti Mediteránu a jeden z mála pokusů o studium jejich biologie pomocí chovu v zajetí. Na základě sekvencí mitochondriálního genu pro cytochrom b bylo objeveno několik jasných fylogenetických linií. Balkánské populace vykazují velmi nízkou genetickou rozrůzněnost a jsou nejblíže příbuzné západotureckým. V Íránu se nachází dvě samostatné linie, které vykazují geografický překryv, jejich vzájemný vztah ale nebylo možné na základě mých dat zjistit. Největší genetické divergence byly objeveny v oblasti Levanty a uvažuji o možnosti, že tato oblast byla místem, odkud se druh šířil do zbytku současného arálu. Nejvýznamnějším výsledkem této práce bylo objevení bazální linie z Izraele, které zástupci jsou nejen molekulárně ale i morfologicky odlišní od všech ostatních studovaných jedinců. Devět jedinců původem z Turecka a Íránu bylo za účelem studia potravních nároků chováno v zajetí. Podle předběžných zjištění je Typhlops vermicularis úzce potravně specializovaný na mravenčí kukly a larvy. Byla zaznamenána jedna snůška o 3 vejcích. Chov nadále pokračuje.

68

8 Slovo závěrem Slepákovci jsou i přes svou druhovou bohatost stále velkou neznámou. V podstatě se není čemu divit. Z kombinace jejich velikosti, fosoriálního způsobu života a těžké určitelnosti vzniká organizmus, který hned na první pohled odradí potencionálního zájemce o jeho studium. Z estetického hlediska je to zvíře pro chov ne zrovna nejvhodnější, žijící pod povrchem půdy a málokdy aktivní. V oblastech, kde se vyskytuje více druhů, lze živé exempláře s jistotou správně určit jenom stěží. Udržovat slepáky při životě dá hodně námahy a doslova mravenčí práce, rozmnožovat je v zajetí se, pokud vím, ještě nikomu nepodařilo. Na hledání morfologických znaků je nutná dobrá binolupa nebo mikroskop. Vyfotit slepáka tak, aby fotografie nesla aspoň trochu použitelné informace, dá hodně námahy, a v případě živých jedinců je to téměř vyloučené. I tak není dobré se potížemi nechat odradit, stojí za to podívat se do světa těchto drobných tvorů, kteří v teplých oblastech běžně leží nepovšimnutí pod kameny nebo ti méně šťastní v muzejních sbírkách v lahvích s lihem. Moje práce poukazuje na to, že druh Typhlops vermicularis na svém velkém areálu sice vytváří distinktní linie, ale ty lze zařadit do úrovně druhu. Jedině v oblasti Levanty je výrazně vyšší genetická a evidentně i morfologická variabilita, která si vyžaduje hlubší prostudování. Pokud se nebude věnovat větší pozornost slepákům žijícím v této oblasti, bude se zde ještě dlouho doslova šlapat po nepopsaných druzích.

69

9 Přílohy na CD: Fotografie, fylogenetické stromy, sekvence atd.

10 Bibliografie Abensperg Traun, M. and D. Steven (1997). "Ant- and termite-eating in Australian mammals and lizards: A comparison." Australian Journal of Ecology 22(1): 9-17. Agosti, Donat; Grimaldi, David; Carpenter, James M. (1998). „Oldest known ant fossils discovered“. Nature, 391, 6666, pp. 447 Atatür, M. K. and B. Göcmen (2001). "Amphibians and Reptiles of the Northern Cyprus. 1st edition. Ege Universitesi Basimevi Bornova-Izmir." Avise, J. C. (2000). Phylogeography: The History and Formation of Species London, England, Harvard University Press. Avise, J. C., J. Arnold, et al. (1987). "INTRASPECIFIC PHYLOGEOGRAPHY: The Mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics " Annual Review of Ecology and Systematics 18: 489-522. Baláž, V. (2007). Biologie a fylogenetika hadů skupiny Scolecophidia. Katedra zoologie, Přírodovědecká Fakulta, Univerzita Karlova v Praze. Bakalářská práce. Baran, I., Y. Kumlutas, et al. (2001). "The herpetofauna of the Vicinity of Silifke." Turkish Journal of Zoology 25(2001): 245-249. Bauer, A. M. (1987). "Geographic distribution, Ramphotyphlops braminus (Brahminy blind snake)." Herpetological Review 18(2): 41. Beshkov, V. and K. Manev (2006). Amphibians and reptiles in Bulgaria. Sofia, Pensoft Publ. Bird, C. G. (1936). "The distribution of Reptiles and Amphibians in Asiatic Turkey, with notes on a cllection from the Vilayets of Adana, Gaziantep, and Malatya." Annals and Magazine of Natural history 18: 257. 70

Boulenger, G. A. (1913). The snakes of Europe. London, Methusen and Co. Ltd. Broadley, D. G. and V. Wallach (1996). "Remarkable new worm snake (Serpentes: Leptotyphlopidae) from the east African coast." Copeia(1): 162-166. Broadley, D. G. and V. Wallach (2007). "A review of East and Central African species of Letheobia Cope, revived from the synonymy of Rhinotyphlops Fitzinger, with descriptions of five new species (Serpentes : Typhlopidae)." Zootaxa(1515): 31-68. Bromham, L. (2002). "Molecular Clocks in Reptiles: Life History Influences Rate of Molecular Evolution." Molecular Biology and Evolution 19(3): 302-309. Bruno, S. (1989). "Introduction to a study of the herpetofauna of Albania." British Herpetological Society Bulletin 29. Budak, A., C. V. Tok, et al. (1998). "A Report on Reptiles Collected from Kumluca-Kalkan (Antalya), Turkey." Tr. J. of Zoology 22: 185-189. Carroll, R. L. (1988). Vertebrate Paleontology and Evolution. New York, W. H. Freeman & Co.,. Clark, R. J. and E. D. Clark (1973). "Report on a collection of amphibians and reptiles from Turkey." Occasional papers of the California Academy of Sciences(104): 1-62. Cochran, P. A. (1991). "An unusual microhabitat for a fossorial snake in the rainforest of Peru." Transactions of the Kansas Academy of Science 94: 77-78. Corti, C., M. Masseti, et al. (1999). "Man and herpetofauna of the Mediterranean islands." Revista Espanola de Herpetologia 13: 83-100. Cox, N., Chanson, Janice and Stuart, Simon (Compilers) (2006). "The Status and Distribution of Reptiles and Amphibians of the Mediterranean Basin. IUCN, Gland, Switzerland and Cambridge, UK. v + 42 pp." Disi, A. M. (1985). "A contribution to the herpetofauna of Jordan. 2. New records and a systematic list of snakes from Jordan." Snake 17(1): 31-42.

71

Disi, A. M. (1996). "A contribution to the herpetofauna of Jordan. VI. The Jordanian herpetofauna as a Zoogeographic indicator." Herpetozoa 9(1/2): 71-81. Disi, A. M. (2002). "Jordan Country Study on Biological Diversity: The Herpetofauna of Jordan. The General Corporation for the Environment Protection, The Hashemite Kingdom of Jordan, Amman." Dong, S. and Y. Kumazawa (2005). "Complete Mitochondrial DNA Sequences of Six Snakes: Phylogenetic Relationships and Molecular Evolution of Genomic Features." Journal of Molecular Evolution 61: 12-22. Douglas, D. A., A. Janke, et al. (2006). "A mitogenomic study on the phylogenetic position of snakes." Zoologica Scripta 35(6): 545-558. Duhalov, D. and P. Stoev (2002). "Brief Assessment of the Impact of Strouma Motorway on the Herpeto-fauna of the Kresna Gorge (appendix to the position of BALKANI Wildlife Society)." Džukić, G. and M. L. Kalezić (2001). "The biodiversity of Amphibians and Reptiles in the Balkan peninsula." Erasmus, H. and W. R. Branch (1983). "Egg retention in the South African blind snake Typhlops bibronii." Journal of Herpetology 17(1): 97-99. Felsenstein, J. (1985). "Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap." Evolution 39: 783-791. Felsenstein, J. (2005). "PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6 " Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle. Forstner, M. R. J., S. K. Davis, et al. (1995). "Support for the Hypothesis of Anguimorph Ancestry for the Suborder Sepentes from Phylogenetic Analysis of Mitochondrial DNA Sequences." Molecular Phylogenetics and Evolution 4(1): 93-102. Foufopoulos, J. and A. R. Ives (1999). "Reptile Extinctions on Land-Bridge Islands: Life-History Attributes and Vulnerability to Extinction." The american naturalist 153(1): 1-25. 72

Franzen, M. and V. Wallach (2002). "A new Rhinotyphlops from southeastern Turkey (Serpentes : Typhlopidae)." Journal of Herpetology 36(2): 176-184. Fritz, U., D. Ayaz, et al. (2007). "Go east: phylogeographies of Mauremys caspica and M. rivulata – discordance of morphology, mitochondrial and nuclear genomic markers and rare hybridization." Journal of Evolutionary Biology 21: 527-540. Frynta, D., J. Moravec, et al. (1997). "Results of the Czech Biological Expedition to Iran. Part 1. Notes on the distribution of amphibians and reptiles." Acta Soc. Zool. Bohem. 61: 3-17. Fu, J. (2000). "Toward the phylogeny of the family Lacertidae—Why 4708 base pairs of mtDNA sequences cannot draw the picture." Biological Journal of the Linnean Society 71(203217). Gehlbach, F. R., J. F. Watkins II, et al. (1968). "Blind snake defensive behaviour elicited by ant attacks." BioScience 18(8): 784-785. Gocmen, B., G. Nislon, et al. (2007). "On the occurence of the Black Cat Snake, Telescopus nigriceps (Ahl, 1924) (Serpentes: Colubridae) from the Southeastern Anatolia, Turkey with some taxonomical comments." North-Western Journal of Zoology 3(2): 81-95. Gower, D. J., S. P. Loader, et al. (2004). "Assessing the conservation status of soil-dwelling vertebrates: insights from the rediscovery of Typhlops uluguruensis (Reptilia: Serpentes: Typhlopidae)." Systematics and Biodiversity 2(1): 79-82. Gower, D. J., N. Vidal, et al. (2005). "The phylogenetic position of Anomochilidae (Reptilia : Serpentes): first evidence from DNA sequences." Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research 43(4): 315-320. Grillitsch, H., P. Weish, et al. (1999). "Typhlops vermicularis Merrem, 1820 in the Dalmatian island of Dugi Otok (Croatia) (Squamata: Serpentes: Typhlopidae)." Herpetozoa 1999 30 Dezember; 12(3 4): 161 162 12(3-4): 161-162. Guiher, T. J. and F. T. Burbrink (2008). "Demographic and phylogeographic histories of two venomous North American snakes of the genus Agkistrodon." Molecular Phylogenetics and Evolution 48(2): 543-553.

73

Hahn, D. E. (1978). "A brief review of the genus Leptoyphlops (Reptilia, Serpentes, Leptotyphlopidae) of Asia, with description of a new species." Journal of Herpetology 12(4): 477-489. Hall, T. A. (1999). "BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT " Nucleic Acids Symposium Series 41 95-98. Hausdorf, B. and C. Hennig (2005). "The influence of recent geography, palaeogeography and climate on the composition of the fauna of the central Aegean Islands." Biological Journal of the Linnean Society 84: 785-795. Hedges, S. B. (1989). "Geographic protein variation in the Jamaican blind snake, Typhlops jamaicensis (Serpentes: Typhlopidae)." Caribbean Journal of Science 1989; 25(1 2): 93 96 25(1-2): 93-96. Hedges, S. B. (2008). "At the lower size limit in snakes: two new species of threadsnakes (Squamata: Leptotyphlopidae: Leptotyphlops) from the Lesser Antilles." Zootaxa 1841: 1-30. Hedges, S. B. and R. Thomas (1991). "Cryptic species of snakes (Typhlopidae: Typhlops) from the Puerto Rico bank detected by protein electrophoresis." Herpetologica 47(4): 448-459. Heise, P. J., L. R. Maxson, et al. (1995). "Higher-level snake phylogeny inferred from mitochondrial DNA sequences of 12S rRNA and 16S rRNA genes." Molecular Biology and Evolution 12(2): 259-265. Hewitt, G. M. (1999). "Post-glacial re-colonization of European biota." Biological Journal of the Linnean Society 68: 87-112. Hewitt, G. M. (2001). "Speciation, hybrid zones and phylogeography - or seeing genes in space and time." Molecular Ecology 12: 537-549. Hillis, D. M. and J. P. Huelsenbeck (1992). "Signal, noise, and reliability in molecular phylogenetics analyses." Heredity 83: 189-195.

74

Hsü, K. J., W. B. F. Ryan, et al. (1973). "Late Miocene Desiccation of the Mediterranean." Nature 242: 240-244. Hynková, I. and V. Baláž (2008). Phylogeography of green tree python Morelia viridis (poster abstract). Zoologické dny 2008. J. BRYJA, NEDVĚD, O., SEDLÁČEK, F., ZUKAL, J. České Budějovice Ústav biologie obratlovců AV ČR: 75-76 Christopher M. R. Kelly, N. P. B. M. H. V. D. G. B. (2009). Phylogeny, biogeography and classification of the snake superfamily Elapoidea: a rapid radiation in the late Eocene. 25: 38-63. Ilani, G. and B. Shalmon (1984). "Blind snake menu." Israel Land and Nature 10(1): 36. In den Bosch, H. A. J. and I. Ineich (1994). "The Typhlopidae of Sulawesi (Indonesia): a review with description of a new genus and a new species (Serpentes: Typhlopidae)." Journal of Herpetology 28(2): 206-217. Joger, U., U. Fritz, et al. (2007). "Phylogeography of western Palaearctic reptiles – Spatial and temporal speciation patterns." Zoologischer Anzeiger 246(2007): 293-313. Kamosawa, M. and H. Ota (1996). "Reproductive biology of the brahminy blind snake (Ramphotyphlops braminus) from the Ryukyu archipelago, Japan." Journal of Herpetology 30(1): 9-14. Khan, M. S. (1998). "Notes on Typhlops diardi Schlegel, 1839, with description of a new subspecies (Squamata, serpentes, scolecophidia)." Pakistan Journal of Zoology 30(3): 213-221. Khan, M. S. (1999). "Two new species and a subspecies of blind snakes of genus Typhlops from Azad Kashmir and Punjab, Pakistan (Serpentes: Typhlopidae)." Russian Journal of Herpetology 6(3): 231-240. Kley, N. J. (2001). "Prey transport mechanisms in blindsnakes and the evolution of unilateral feeding systems in snakes." American Zoologist 41(6): 1321-1337. Kley, N. J. (2003). Anomalepididae, Leptotyphlopidae, Typhlopidae. In: Grzimek’s Animal Life Encyclopedia. M. Hutchins, J. B. Murphy and N. Schlager. Farmington Hills, Gale Group. Volume 7. Reptiles. 75

Kocher, T. D., K. R. Thomas, et al. (1989). "Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: Amplification and sequencing with conserved primers(cytochrome b/12S ribosomal DNA/control region/evolutionary genetics/molecular phylogenies)." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 6196-6200. Kraus, F. (2005). "New species of blindsnake from Rossel Island, Papua New Guinea." Journal of Herpetology 39(4): 591-595. Kumazawa, Y. (2004). "Mitochondrial DNA sequences of five squamates: phylogenetic affiliation of snakes." DNA Research 11: 137-144. Kyriazi, P., N. Poulakakis, et al. "Molecular phylogeny and biogeography of circum Mediterranean populations of Ophisops elegans (Sauria: Lacertidae) inferred from mitochondrial sequence data." Kyriazi, P., N. Poulakakis, et al. (2008). "Mitochondrial DNA reveals the genealogical history of the snake-eyed lizards (Ophisops elegans and O. occidentalis) (Sauria: Lacertidae)." Molecular Phylogenetics and Evolution 49(3): 795-805. Larkin, M. A., G. Blackshields, et al. (2007). "Clustal W and Clustal X version 2.0." Bioinformatics 23: 2947-2948. . Lawson, R., J. B. Slowinski, et al. (2004). "A molecular approach to discerning the phylogenetic placement of the enigmatic snake Xenophidion schaeferi among the Alethinophidia." Journal of Zoology 263: 285-294. Lee, M. S. Y., A. F. Hugall, et al. (2007). "Phylogeny of snakes (Serpentes): combining morphological and molecular data in likelihood, Bayesian and parsimony analyses." Systematics and Biodiversity 5: 371-389. Lee, M. S. Y. and J. D. Scanlon (2002). "Snake phylogeny based on osteology, soft anatomy and ecology." Biological Reviews 77(3): 333-401. Lehr, E., V. Wallach, et al. (2002). "New species of tricolor Leptotyphlops (Reptilia : Squamata : Leptotyphlopidae) from central Peru." Copeia 2002(1): 131-136.

76

Leviton, A. E. and S. C. Anderson (1970). "The Amphibians and Reptiles of Afghanistan, a checklist and key to the herpetofauna." Proceedings of the California Academy of Sciences 38(10): 163-206. Lieberma, D. and M. Lieberma (1970). "Record of Brahminy blind snake, Typhlops braminus , from island of Hawaii." Pacific Science 24(4): 528-&. Martinez-Delclos, X. and J. Martinell (1995). "The Oldest Known Record of Social Insects." Journal of Paleontology 69(3): 594-599. Mattison, C. (1999). Hady. Praha, OTTOVO nakladatelství. McCranie, J. R. and L. D. Wilson (2001). "Taxonomic status of Typhlops stadelmani Schmidt (Serpentes: Typhlopidae)." Copeia 2001(3): 820-822. McDowell, S. B. (1974). "A catalogue of the snakes of New Guinea and the Solomons, with special reference to those in the Bernice P. bishop Museum, part I. Scolecophidia." Journal of Herpetology 8(1): 1-57. Measey, G. J., D. J. Gower, et al. (2003)a. "A mark–recapture study of the caecilian amphibian Gegeneophis ramaswamii (Amphibia: Gymnophiona: Caeciliidae) in southern India." Journal of Zoology 261: 129-133. Measey, G. J., D. J. Gower, et al. (2003)b. "Quantitative surveying of endogeic limbless vertebrates — a case study of Gegeneophis ramaswamii (Amphibia: Gymnophiona: Caeciliidae) in southern India." Applied Soil Ecology 23(2003): 43-53. Merrem, B. (1820). "Versuch eines Systems der Amphibien." Myers, C. W. (1958). "A possible introduction of the snake Typhlops in the United States." Copeia 1958(4): 338. Myers, N., R. A. Mittermeier, et al. (2000 ). "Biodiversity hotspots for conservation priorities." Nature 403: 853-858 Nichols, R. (2001). "Gene trees and species trees are not the same." Trends in Ecology & Evolution 16(7): 358-364.

77

Niyomwan, P., K. Thirakhupt, et al. (2001). "A Key to the Blind Snakes in Thailand." The Natural History Journal of Chulalongkorn University 1(1): 47-52. Noonan, B. P. and P. T. Chippindale (2006). "Dispersal and vicariance: The complex evolutionary history of boid snakes." Molecular Phylogenetics and Evolution 40(2): 347-358. Nussbaum, R. A. (1980). "The brahminy blind snake (Ramphotyphlops braminus) in the Seychelles Archipelago- distribution, variation, and further evidence fro parthenogenesis." Herpetologica 36(3): 215-221. Parham, J. F., O. Turkozan, et al. (2006). "Genetic evidence for premature taxonomic inflation in Middle Eastern tortoises." Proceedings of the California Academy of Sciences 57(33): 955-964. Pauwels, O. S. G., V. Wallach, et al. (2004). "First record of Ramphotyphlops braminus (Serpentes: Typhlopidae) from Gabon, western central Africa." Hamadryad 29(1): 138139. Posada, D. and K. A. Crandall (1998). "Modeltest: testing the model of DNA substitution." Bioinformatics 14 (9): 817-818. Poulakakis, N., V. Pakaki, et al. (2008). "Molecular phylogeny of the Greek legless skink Ophiomorus punctatissimus (Squamata: Scincidae): The impact of the Mid-Aegean trench in its phylogeography." Molecular Phylogenetics and Evolution 47(1): 396-402. Punzo, F. (1974). "Comparative analysis of the feeding habits ot two species of Arizona blind snakes, Leptotyphlops h. humilis and Leptotyphlops d. dulcis." journal of Herpetology 8(2): 153-156. Rabosky, D. L., K. P. Aplin, et al. (2004). "Molecular phylogeny of blindsnakes (Ramphotyphlops) from western Australia and resurrection of Ramphotyphlops bicolor (Peters, 1857)." Australian Journal of Zoology 52: 531-548. Radovanović, M. (1941). "Zur Kenntnis der herpetofauna des Balkans." Zoologischer Anzeiger 136(7/8): 145-159.

78

Rouchy, J. M. and A. Caruso (2006). "The Messinian salinity crisis in the Mediterranean basin: A reassement of the data and an integrated scenario." Sedimentary Geology 188-189: 3567. Shea, G. M. (2001). "Spermatogenic cycle, sperm storage, and Sertoli cell size in a Scolecophidian (Ramphotyphlops nigrescens) from Australia." Journal of Herpetology 35(1): 85-91. Shea, G. M. and V. Wallach (2000). "Reexamination of an anomalous distribution: Resurrection of Ramphotyphlops becki (Serpentes: Typhlopidae)." Pacific Science 54(1): 70-74. Shine, R. and J. K. Webb (1990). "Natural history of Australian Typhlopid snakes." Journal of Herpetology 24(4): 357-363. Schatti, B. and H. Sigg (1989). "Die Herpetofauna der Insel Zypern. Teil 2. Schildkroten, Echsen und Schlangen." Herpetofauna 61(11): 17-26. Sindaco, R. and A. Venchi (2000). "The reptiles of Anatolia: a checklist and zoogeographical analysis." Biogeographia XXI: 441-481. Slowinski, J. B. and R. Lawson (2002). "Snake phylogeny: evidence from nuclear and mitochondrial genes." Molecular Phylogenetics and Evolution 24(2): 194-202. Stoev, P. (2000). "On the distribution, biology and ecology of amphibians and reptiles in the Derventski Heights and the Sakar Mountain, south-east Bulgaria." Historia naturalis bulgarica 12(2000): 59-69. Storr, G. M. (1968). "First Australian record of the asian blind-snake Typhlops braminus." Journal of Herpetology 1(1/4): 98. Swofford, D. L. (2003). "PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts." Szyndlar, Z. (1991). "A review of neogene and quaternary snakes of central and eastern europe i. scolecophidia boidae colubrinae." Estudios Geologicos (Madrid) 47(1-2): 103-126. Tavares-Bastos, L., L. D. Cunha, et al. (2007). "Ultrastructure of spermatozoa of scolecophidian snakes (Lepidosauria, Squamata)." Acta Zoologica 88(3): 189-197.

79

Thomas, R. and S. B. Hedges (2007). "Eleven new species of snakes of the genus Typhlops (Serpentes: Typhlopidae) from Hispaniola and Cuba." Zootaxa 1400: 1-26. Torres, J. A., R. Thomas, et al. (2000). "Ant and termite predation by the tropical blindsnake Typhlops platycephalus." Insectes Sociaux 47(1): 1-6. Tóth, T., L. Krecsák, et al. (2002). "Herpetofaunal locality records on the Greek island of Corfu." Herpetozoa 15(3/4): 149-169. Uetz, P., J. Goll, et al. (2007). Die TIGR-Reptiliendatenbank. Elaphe. 15: 22-25

Ugurtas, I. H., R. S. Kaya, et al. (2007). "The Herpetofauna of the Islands in Uluabat Lake (Bursa)." Ekoloji 17(65): 7-10. Ugurtas, I. H., M. Sevinc, et al. (2006). "New localities for Leptotyphlops macrorhynchus (Jan, 1862) (Reptilia: Leptotyphlopidae) in Turkey." Turkish Journal of Zoology 30: 373-376. Ugurtas, I. H. and H. S. Yildirimhan (2000). "Herpetofauna of the Eastern Region of the Amanos Mountains (Nur)." Turkish Journal of Zoology 24: 257-261. Van der Kuyl, A. C., D. L. P. Ballasina, et al. (2005). "Mitochondrial haplotype diversity in the tortoise species Testudo graeca from North Africa and the Middle East." BMC Evolutionary Biology 5(29): 1-8. Vences, M., F. Glaw, et al. (2001). "Phylogeny of South American and Malagasy Boine snakes: molecular evidence for the validity of Sanzinia and Acrantophis and biogeographic implications." Copeia 2001(4): 1151-1154. Vidal, N., A. Azvolinsky, et al. (2008). "Origin of tropical American burrowing reptiles by transatlantic rafting." Biology Letters - od unora dostupny 4(1): 115-118. Vidal, N. and P. David (2004). "New insights into the early history of snakes inferred from two nuclear genes." Molecular Phylogenetics and Evolution 31(2): 783-787. Wallach, V. (1993). "A new species of blind snake, Typhlops marxi, from the Philippines (Serpentes, Typhlopidae)." Raffles Bulletin of Zoology 41(2): 263-278. 80

Wallach, V. (1993). "The supralabial imbrication pattern of the Typhlopoidea (Reptilia: Serpentes)." journal of Herpetology 27(2): 214-218. Wallach, V. (1995). "A new genus for the Ramphotyphlops subocularis species group (Serpentes: Typhlopidae), with description of a new species." Asiatic Herpetological Research 6: 132-150. Wallach, V. (1998). The Visceral Anatomy of Blindsnakes and Wormsnakes and its Systematic Implications (Serpentes: Anomalepididae, Typhlopidae, Leptotyphlopidae). The Department of Biology, Northeastern University Boston,Massachusetts. Phd. dissertation Wallach, V. (1999). "Typhlops meszoelyi, a new species of blind snake from northeastern India (Serpentes: Typhlopidae)." Herpetologica 55(2): 185-191. Wallach, V. (2000). "Critical review of some recent descriptions of Pakistani Typhlops by M.S. Khan, 1999 (Serpentes: Typhlopidae)." Hamadryad 25(2): 129-143. Wallach, V. (2001). "Typhlops roxaneae, a new species of Thai blindsnake from the T-diardii species group, with a synopsis of the Typhlopidae of Thailand (Serpentes : Scolecophidia)." Raffles Bulletin of Zoology 49(1): 39-49. Wallach, V. (2002). "Typhlops etheridgei, a new species of African blindsnake in the Typhlops vermicularis species group from Mauritania (Serpentes: Typhlopidae)." Hamadryad 27(1): 108-122. Wallach, V. (2003). "Scolecophidia miscellanea." Hamadryad 27(2): 222-240. Wallach, V. (2005). "Letheobia pauwelsi, a new species of blindsnake from Gabon (Serpentes: Typhlopidae)." African Journal of Herpetology 54(1): 85-91. Wallach, V. (2006). "The nomenclatural status of Australian Ramphotyphlops (Serpentes : Typhlopidae)." Bulletin of the Maryland Herpetological Society 42(1): 8-24. Wallach, V. and J. Boundy (2005). "Leptotyphylops greenwelli a new wormsnake of the L-bicolor species group from Nigeria (Serpentes : Leptotyphlopidae)." Annals of Carnegie Museum 74(1): 39-44.

81

Wallach, V., R. M. Brown, et al. (2007). "An enigmatic new species of blind snake from Luzon Island, Northern Philippines, with a synopsis of the genus Acutotyphlops (Serpentes : Typhlopidae)." Journal of Herpetology 41(4): 690-702. Wallach, V. and I. Ineich (1996). "Redescription of a rare Malagasy blind snake, Typhlops grandidieri Mocquard, with placement in a new genus (Serpentes: Typhlopidae)." Journal of Herpetology 30(3): 367-376. Wallach, V., V. Mercurio, et al. (2007). "Rediscovery of the enigmatic blind snake genus Xenotyphlops in northern Madagascar, with description of a new species (Serpentes : Typhlopidae)." Zootaxa(1402): 59-68. Wallach, V. and O. S. G. Pauwels (2004). "Typhlops lazelli, a new species of Chinese blindsnake from Hong Kong (Serpentes: Typhlopidae)." Breviora 512: 1-21. Watkins II, J. F., F. R. Gehlbach, et al. (1967). "Ability of the blind snake, Leptotyphlops dulcis, to follow pheromone trails of army ants, Neiv Amyrmex nigrescens and N. opacithorax." The Southwestern Naturalist 12(4): 455-462. Watkins II, J. F., F. R. Gehlbach, et al. (1969). "Attractant-repellent secretions of blind snakes (Leptotyphlops Dulcis) and their army ant prey ( Neiv Amyrmex Nigrescens)." Ecology (Washington D C) 50(6): 1098-1102. Webb, J. K., W. R. Branch, et al. (2001). "Dietary habits and reproductive biology of typhlopid snakes from Southern Africa." Journal of Herpetology 35(4): 558-567. Webb, J. K. and R. Shine (1993). "Dietary habits of Australian blindsnakes (Typhlopidae)." Copeia 1993(3): 762-770. Webb, J. K. and R. Shine (1993). "Prey-size selection, gape limitation and predator vulnerabilty in Australian blindsnakes (Typhlopidae)." Animal behaviour 45: 1117-1126. Webb, J. K., R. Shine, et al. (2000). "Life-history strategies in basal snakes: reproduction and dietary habits of the African thread snake Leptotyphlops scutifrons (Serpentes : Leptotyphlopidae)." Journal of Zoology 250: 321-327.

82

Werner, F. (1930). "Contribution to the knowledge of the reptiles and Amphibians of Greece, especially the Aegean Islands." Occasional papers of the Museum of Zoology, University of Michigan(211): 1-46. White, L. R., R. Powell, et al. (1992). "Food habits of three syntopic reptiles from the Barahona Peninsula, Hispaniola." Journal of Herpetology 26(4): 518-520. Wilcox, T., P., D. Zwickl, J., et al. (2002). "Phylogentic relationships of the dwarf boas and a comparison of Bayesian and bootstrap measures of phylogentic support." Molecular Phylogenetics and Evolution 25(2002): 361-371. Wilson, S. and G. Swan (2003). A complete guide to reptiles of Australia, New Holland Publishers (Australia) Pty. Ltd. . Wynn, A. H., C. J. Cole, et al. (1987). "Apparent triploidy in the unisexual Brahminy blind snake, Ramphotyphlops braminus." American Museum Novitates: 1-7 No. 2868.

10 Přílohy:

1 Tabulka expedic

Rok

Oblast

Délka pobytu (týdny)

Období

2005

Západní Turecko

4

červen

2006

Bulharsko

1

červenec

Západní Turecko

3

srpen

2007

Chorvatsko-Makedonie

3

červenec

2008

Turecko (Canakkale-Hatay)

4

duben

83

Tabulka všech jedinců použitých v této práci. T09

Meyamey, Írán

Jiří Šmíd

T01

Kizkalesi, Turecko

Vojtech Baláž

CYP

Akrotiri, Kypr

Daniel Frynta

T02

Kizkalesi, Turecko

Vojtech Baláž

I 32

Sivand, Írán

Daniel Frynta

T03

Anamur, Turecko

Vojtech Baláž

I 40

Kivi, Írán

Daniel Frynta

T04

Anamur, Turecko

Vojtech Baláž

I 45

Chalus, Írán

Daniel Frynta

T05

Anamur, Turecko

Vojtech Baláž

I 86

Maku, Írán

Daniel Frynta

T06

Magnesia, Turecko

Vojtech Baláž

I 92

Kashan, Írán

Daniel Frynta

T07

Magnesia, Turecko

Vojtech Baláž

I 165

Bazangan, Írán

Daniel Frynta

T08

Magnesia, Turecko

Vojtech Baláž

I 166

Bazangan, Írán

Daniel Frynta

612

Kresnensko Chanče, Bulharsko

Dávid Jandzík

I 167

Bazangan, Írán

Daniel Frynta

613

Kresnensko Chanče, Bulharsko

Dávid Jandzík

I 168

Bazangan, Írán

Daniel Frynta

614

Kresnensko Chanče, Bulharsko

Dávid Jandzík

I 169

Bazangan, Írán

Daniel Frynta

Alb

Ardenica, Albánie

Daniel Jablonski

I 174

Bazangan, Írán

Daniel Frynta

G52

Gecitköy, Kypr

Václav Gvoždík

I 175

Bazangan, Írán

Daniel Frynta

Syr

Al´ Adimah, Sýrie

Václav Gvoždík

I 183

Qarloq, Írán

Daniel Frynta

G24

Tuzluca, Turecko

Václav Gvoždík

I 196

Kheshmeh Khan, Írán

Daniel Frynta

G23

Qyriat Shemona, Izrael

Václav Gvoždík

I 197

Kheshmeh Khan, Írán

Daniel Frynta

G86

Almagor, Izrael

Václav Gvoždík

I 198

Kheshmeh Khan, Írán

Daniel Frynta

G60

Kastania, Řecko

Václav Gvoždík

I 202

Razan, Írán

Daniel Frynta

G66

Gialova,Řecko

Václav Gvoždík

I 203

Razan, Írán

Daniel Frynta

I 829

Deh Bakri, Írán

Daniel Frynta

84

I 889

Firuz Abad, Írán

Daniel Frynta

I 905

Dodehak, Írán

Daniel Frynta

85

Tabulka p-distancí všech získaných sekvencí, hodnoty zaokrouhleny na 0.1% 612 612 0.0 614 614 0.0 0.0 613 613 0.7 0.1 0.0 Alb Alb 0.0 0.0 0.1 0.0 G66 G66 1.3 0.7 0.8 0.7 0.0 G60 G60 1.3 1.3 1.3 1.3 0.0 0.0 T07 T07 1.5 1.5 1.5 1.5 1.9 3.6 0.0 T08 T08 1.3 1.3 1.3 1.3 1.6 2.9 0.4 0.0 T09 T09 4.0 3.3 3.2 3.3 4.2 3.9 4.4 4.6 0.0 I32 I32 3.9 3.9 3.9 3.9 2.4 2.4 5.7 5.7 1.7 0.0 I40 I40 4.0 4.0 4.0 4.0 2.8 2.6 5.8 5.8 1.5 0.3 0.0 I165 I165 3.5 3.5 3.5 3.5 2.6 2.6 4.9 4.9 0.9 0.4 0.0 0.0 I198 I198 4.6 4.7 4.6 4.7 3.4 2.9 6.4 6.4 2.1 0.7 0.3 0.3 0.0 I203 I203 4.7 4.8 4.7 4.8 3.3 2.2 7.1 6.7 2.9 0.7 0.4 0.4 0.7 0.0 I829 I829 4.6 4.6 4.6 4.6 3.0 2.3 5.8 5.6 3.0 0.4 0.7 0.8 1.1 1.1 0.0 I889 I889 6.1 4.3 4.5 4.3 3.0 2.6 6.1 6.1 2.4 0.3 0.6 0.6 0.9 1.1 0.7 0.0 G24 G24 5.3 4.9 5.0 4.9 5.5 6.9 5.2 5.3 4.3 7.2 6.2 5.9 6.3 8.2 7.3 7.0 0.0 I86 3.2 3.2 3.2 3.2 1.6 1.6 4.8 4.4 4.4 3.0 2.7 2.8 2.8 2.6 2.3 3.2 2.8 I45 6.3 6.3 6.3 6.3 5.3 5.3 6.3 6.4 5.6 5.5 4.6 4.6 4.9 5.3 4.7 5.3 1.9 I92 6.5 6.6 6.5 6.6 5.4 5.4 6.5 6.5 5.6 5.1 4.6 4.6 4.6 4.9 4.3 5.4 1.4 T03 4.5 4.5 4.5 4.5 5.2 6.6 4.5 5.0 4.1 6.2 6.2 5.5 6.9 7.6 7.4 7.4 4.9 T04 5.9 5.9 5.7 5.9 6.7 8.2 5.3 6.0 5.2 7.9 7.8 7.3 8.4 9.3 8.5 8.8 6.2 T05 5.8 5.8 5.7 5.8 6.6 7.4 5.2 5.8 5.3 7.5 7.1 6.5 7.7 8.9 8.1 8.1 6.0 G52 5.4 5.4 5.4 5.4 4.1 3.9 6.5 6.5 5.4 3.8 3.8 3.9 4.1 4.0 3.8 4.4 8.4 Cyp 5.2 4.8 4.5 4.6 5.0 5.5 4.7 5.5 5.0 5.7 5.6 5.2 6.2 7.0 6.5 6.6 6.7 T01 5.1 5.1 5.1 5.1 5.9 7.2 4.9 5.4 5.0 7.1 6.8 6.2 7.4 8.5 8.5 7.7 5.6 T02 4.6 4.6 4.6 4.6 5.4 7.0 4.6 4.9 4.8 6.9 7.5 6.5 8.6 8.6 8.6 8.6 5.5 Syr 5.1 5.1 5.0 5.1 5.8 4.9 5.2 5.9 5.3 5.7 6.2 5.7 6.9 7.0 6.5 6.5 6.3 G86 12.5 12.1 12.5 12.1 11.1 10.6 13.8 13.8 13.5 11.1 11.4 11.6 11.3 11.9 12.0 11.3 13.5 G23 10.0 9.3 9.2 9.2 10.2 11.2 9.6 10.2 9.1 11.4 11.6 11.5 12.3 13.0 13.2 11.9 9.9 R.b 28.0 27.2 26.7 27.4 27.9 26.0 28.4 28.4 28.1 26.2 27.1 26.7 27.2 28.3 29.7 26.9 26.9 T.m 35.3 34.6 34.2 35.3 33.0 33.3 32.9 33.4 34.2 33.4 34.2 33.5 34.9 34.8 36.0 35.1 35.0 T.p 26.4 26.0 25.4 26.3 25.7 24.0 24.9 25.7 27.0 22.2 25.0 24.0 25.9 24.0 25.2 25.2 27.9

Balkán a západní Turecko, Írán 1, Írán2, jižní Turecko 1, jižní Turecko 2, Sýrie, Izrael, outgroupy

86

I86 0.0 I45 1.6 0.0 1.3 0.4 5.2 7.2 5.9 7.7 5.4 7.7 2.8 6.7 4.8 8.0 6.9 7.4 8.0 9.1 5.7 7.8 7.8 11.8 10.8 13.5 23.0 25.7 23.8 35.7 20.7 25.7

I92 0.0 6.8 7.6 7.3 6.1 7.6 7.7 8.5 8.1 11.3 13.6 24.6 33.4 24.6

T03 0.0 T04 0.2 0.0 T05 0.3 0.8 0.0 5.3 6.1 6.7 2.1 3.1 3.4 4.3 5.5 5.4 4.0 5.5 5.8 4.1 5.5 5.4 12.7 14.5 14.8 8.9 10.8 11.1 26.2 29.7 29.7 29.5 33.1 32.7 24.4 27.1 27.0

G52 0.0 Cyp 1.9 0.0 T01 8.1 5.5 0.0 T02 8.6 3.9 0.0 0.0 6.6 5.6 5.6 5.1 11.1 13.5 14.5 17.4 12.7 10.5 9.5 8.9 28.2 28.6 29.8 32.3 31.2 34.8 31.9 34.9 26.8 28.0 26.6 27.1

Syr 0.0 12.2 10.3 27.5 34.6 27.8

G86 0.0 9.1 29.0 31.8 30.0

G23 0.0 28.4 34.4 27.5

R.b 0.0 T.mir 36.9 0.0 30.3 30.5