Funkce Melanoma-associated antigen (MAGE) proteinů

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

Funkce Melanoma-associated antigen (MAGE) proteinů

Brno, 2011

Vojtěch Sýkora

Poděkování Na tomto místě bych rád poděkoval vedoucímu své bakalářské práce panu Mgr. Janu Palečkovi Dr. rer. nat. za rady, pomoc a čas, který mi věnoval při studiu a řešení dané problematiky. Dále bych rád poděkoval Mgr. Kateřine Bednářové a Mgr. Lucii Kozákové za trpělivost při předávání zkušeností z praxe.

-2-

OBSAH SEZNAM ZKRATEK...............................................................................................................4 1. ÚVOD ....................................................................................................................................6 2. EVOLUCE ............................................................................................................................7 3. NSE3/MAGE-G1 PROTEINY - PODJEDNOTKY SMC5/6 KOMPLEXU.......................8 4. POLOHA MAGE GENŮ NA CHROMOZOMU ..............................................................10 6. PŘÍKLADY MAGE PROTEINŮ.......................................................................................13 6.1. Lidské MAGE proteiny ..................................................................................................13 6.1.1. I. třída......................................................................................................................13 6.1.1.A. MAGE-A1 .......................................................................................................14 6.1.1.B. MAGE-A2 .......................................................................................................14 6.1.1.C. MAGE-A3 .......................................................................................................14 6.1.1.D. MAGE-A4 .......................................................................................................14 6.1.1.E. MAGE-A11......................................................................................................15 6.1.1.F. MAGE-C1 ........................................................................................................16 6.1.2. II. třída ....................................................................................................................16 6.1.2.A. MAGE-D1 .......................................................................................................16 6.1.2.B. MAGE-D4 .......................................................................................................17 6.1.2.C. MAGE-G1 .......................................................................................................17 6.1.2.D. MAGE-L2........................................................................................................18 6.1.2.E. necdin...............................................................................................................18 6.2. Myší MAGE...................................................................................................................19 6.2.1. mMAGE-A3............................................................................................................19 6.2.2. mMAGE-B..............................................................................................................20 7. MAGE-EID KOMPLEXY..................................................................................................21 8. MAGE-RING PROTEINOVÉ KOMPLEXY....................................................................23 8.1. Proteiny s RING finger doménou ...................................................................................23 8.2. Specificita vazby MAGE proteinů s RING doménou ......................................................24 8.3. Komplexy RING proteinů s MAGE proteiny I. třídy ......................................................25 9. IMUNOTERAPIE...............................................................................................................26 9.1. Rekombinantní MAGE-A3 proteiny ...............................................................................26 9.2. DERMA a MAGRIT ......................................................................................................27 9.3. MAGE-A markery pro prognózu onemocnění ................................................................27 10. ZÁVĚR ..............................................................................................................................28 12. LITERATURA..................................................................................................................29 PŘÍLOHY ...............................................................................................................................37

-3-

SEZNAM ZKRATEK AR: Androgen Receptor ASCI: Antigen-Specific Cancer Immunotherapeutics ATP: Adenosine TriPhosphate CAP -D2 (-H2): Chromosome-Associated Protein D2 (až H2) Cdk4: Cycle-dependent kinase 4 cDNA: complementary DNA CG: Cancers-Germline CNS: Central Nervous System CpG: Cytosine phosphate Guanine CT: Cancer Testis Dlx5, 7: Distal-less homeobox 5, 7 DNMT1, 2, 3: DNA (cytosine-5)-MethylTransferase 1, 2, 3 E2F1: E2F transcription factor 1 EID: E1A-like Inhibitor of Differentiation Gankyrin: Gann ankyrin HDAC1, 3: Histone Deacetylase 1, 3 HIF: Hypoxia-Inducible Factor hMAGE: human MAGE IRD: Interspersed Repeat Domain LNX1: Ligand of Numb-protein X 1 MAGE: Melanoma-associated Antigen MDHD: MAGE-D Homology Domain MDM2: Murine Double Minute 2 MHC: Major Histocompability Complex MHD: MAGE Homologous Domain mMAGE: murine MAGE mRNA: messenger RiboNucleic Acid Msx1, 2: Msh homeobox 1, 2 MyoD: Myogenic Differentiation protein NRAGE: Neurotrophin Receptor interacting MAGE Nse1(-6): Non-SMC element 1(-6) NY-ESO-1 = CTAG1B: Cancer Testis Antigen 1B -4-

p75NTR: p75 NeuroTrophin Receptor PHD: Prolyl Hydroxylase Domain pVHL: protein Von Hippeln-Lindau PWS: Prader-Williho Syndrom Rb protein: Retinoblastoma protein RBCC: RING-B-box Coiled-Coil RING: Really Interesting New Gene RT-PCR: Real-Time Polymerase Chain Reaction SKIP: Ski Interacting Protein SMC: Structural Maintenance of Chromosomes SUMO: Small Ubiquitin-related Modifier TRIM28: Tripartite Motif-containing 28 TrkA: Tyrosine Kinase A UNC5H1: UNC-5 Homolog 1 WH-A, -B: Windged Helix-A, -B

-5-

1. ÚVOD První lidský člen MAGE (Melanoma-associated antigen) rodiny, dnes známý jako MAGEA1, byl nalezen v roce 1991 jako povrchový antigen přítomný na povrchu lidských melanomových buněk (van der Bruggen et al. 1991). MAGE-A1 je exprimován v nádorových buňkách a poté štěpen na krátké peptidy, které jsou vystaveny molekulami hlavního histokompatibilního komplexu (major histocompatibility complex, MHC) a rozpoznávány cytotoxickými T-lymfocyty. MAGE proteiny dělíme do dvou základních tříd podle místa jejich exprese ve tkáních a evoluce. První třída, do které patří skupiny proteinů MAGE-A, -B a -C, je exprimována v mužských zárodečných buňkách a v rakovinných buňkách. Z tohoto důvodu se v dnešní době zkoumá její využití v imunoterapii nádorů. Druhá skupina je převážně exprimována v normálních buňkách a patří do ní MAGE-D, -E, -F, -G, -H, -I, -K, -L a necdin. Nicméně například MAGE-L a necdin souvisí s patogenezí Prader-Williho syndromu. Charakteristická oblast společná pro členy MAGE rodiny je MAGE homologní doména (MHD). Je to centrální oblast, dlouhá přibližně 170 aminokyselin. Většina členů MAGE rodiny již byla identifikována, avšak funkce mnoha z nich zůstává doposud neznámá. U některých již víme, že mají například roli při normálním růstu či navození apoptózy. Nejlépe definovaná funkce je pro MAGE-G1, který je podjednotkou SMC5/6 komplexu. Tento komplex je důležitý pro dynamiku chromatinu a opravu DNA. Cílem této práce je shromáždit doposud zjištěné informace vedoucí k porozumění funkce MAGE proteinu.

-6-

2. EVOLUCE MAGE homologní proteiny lze nalézt již u nejjednodušších jednobuněčných eukaryotních organizmů, jako jsou například kvasinky. Ty obsahují funkční homolog lidského MAGE-G1 proteinu, který byl identifikovaný jako podjednotka SMC5/6 komplexu a následně pojmenován Nse3 (non-SMC element 3, Pebernard et al., 2004). Nse3/MAGE proteiny byly objeveny i u dalších organizmů. Například u hmyzu, hub (Nishimura et al., 2007), ptáků (LopezSanchez et al., 2007), ryb a rostlin (Schubert, 2009) existuje pouze jediný člen této rodiny a nejspíše je také podjednotkou SMC5/6 komplexu. Jako MAGE jsou tyto proteiny označovány až u savců. U savců, kteří nemají placentu, jako je ptakopysk patřící do podtřídy vejcorodých, byl objeven také pouze jeden Nse3/MAGE protein (Hudson et al., 2011). U vačice, dalšího neplacentálního savce, jsou dva zástupci MAGE rodiny. Naproti tomu pro placentální savce je typický zvýšený počet těchto proteinů, který se pohybuje v desítkách. U lidí je 33 MAGE genů a 22 pseudogenů (Tab 1). Přibližně stejný počet mají i myši. MAGE-G1 se objevuje u všech placentálních savců podobně jako i MAGE-L2. MAGEG1 je však jediný MAGE protein přítomný v SMC5/6 komplexu. Z těchto faktů vyplývá, že MAGE-G1 je evolučně nejstarším členem MAGE rodiny a zbylí členové z něj vychází (Hudson et al., 2011). Původnímu Nse3/MAGE genu se nejvíce podobají savčí MAGE proteiny II. třídy. Proteiny II. třídy jsou dobře konzervované mezi různými druhy organizmů, zatímco I. třída je silně divergentní (Chomez et al, 2001; Hudson et al., 2011). Například myší geny MAGE-A a MAGE-B byly takto pojmenovány, protože sekvence a izoelektrický bod odpovídajících proteinů jsou nejblíže lidským MAGE-A a -B proteinům. Nicméně celková sekvenční shoda mezi lidskými a myšími MAGE-A a -B ortology je slabá a MAGE-C geny nebyly dokonce u myší vůbec identifikovány. (Chomez et al., 2001). Naopak, podobnost např. MAGE-D2 proteinů (z II. třídy) těchto dvou druhů je 99 %. Nejpravděpodobnějším možným způsobem vzniku nových MAGE genů je reverzní transkripce, což je proces, při kterém RNA původního Nse3/MAGE genu byla přepsána zpět do DNA a zaintegrována do genomu (Chomez et al., 2001). Při reverzní transkripci pak došlo k vytvoření neúplné cDNA s mnoha mutacemi a vedlo ke vzniku MAGE proteinů různých tříd. Tento proces nastává poměrně často v savčím geonomu (Chomez et al, 2001).

-7-

3. NSE3/MAGE-G1 PROTEINY - PODJEDNOTKY SMC5/6 KOMPLEXU Bylo prokázáno, že Nse3/MAGE-G1 proteiny jsou esenciálními podjednotkami SMC5/6 komplexu v Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe a Homo sapiens organismech (Peberand et al., 2004; Taylor et al., 2008). SMC proteinové komplexy mají důležitou roli v soudržnosti sesterských chromatid, jejich kondenzaci a opravě DNA (Nasmyth et Haering, 2005). Existují tři SMC proteinové komplexy: kohezin, kondenzin a SMC5/6, které se nachází ve všech eukaryotických buňkách. Kohezin funguje jako molekulární “pouta“ a to tím, že drží sesterské chromatidy pohromadě až do začátku anafáze (Gruber et al., 2003). Kondenzin hraje klíčovou roli v kondenzaci chromozomů na začátku mitosy (Hirano, 2006). Poslední a nejméně prozkoumaný je SMC5/6 komplex. U kvasinek je tento proteinový komplex složený z heterodimeru Smc5-Smc6 a šesti non-SMC podjednotek, Nse1 až Nse6 (Paleček et al., 2006). Lidský SMC5/6 komplex postrádá podjednotky Nse5 a Nse6 (Obr. 1). Podjednotky SMC5/6 komplexu vytváří celkem 3 podkoplexy: Nse2 vytváří první podkomplex s Smc5-Smc6 (Zhao et al., 2006; Andrews et al., 2006), druhý je složen z Nse1, 3 a 4 (Sergeant et al., 2005; Paleček et al., 2006; Pebernard et al., 2006) a poslední, který se nenachází u člověka, se skládá z Nse5 a Nse6 (Pebernard et al., 2006).

Obrázek 1: Stavba lidského SMC5/6 komplexu. Hlavová doména SMC proteinu je složena z N- a Ckoncové globulární domény a je ovládána ATPázovou aktivitou. Ramena vytváří coiled-coil strukturu. Tato struktura je antiparalelní, protože se SMC monomer ohýbá, -šroubovice mezi sebou interagují a vzájemným obtočením tvoří rameno. Mezi šroubovicemi je ohybová doména, která zprostředkovává interakci mezi Smc5 a Smc6 proteiny. Nse1-Nse3-Nse4 podkomplex přemosťuje hlavové domény Smc5-Smc6 heterodimeru (převzato a upraveno z Hudson et al., 2011).

-8-

Nse1 podjednotka SMC5/6 komplexu obsahuje RING finger doménu, která funguje při ubiquitinaci jako E3 ubiquitin ligáza (Doyle et al., 2010). Tento protein interaguje s podjednotkami Nse3 a Nse4 (Obr. 1), ale s heterodimerem Smc5/6 přímo neinteraguje (Sergeant et al., 2005). Nse2 podjednotka interaguje pouze s Smc5 částí heterodimeru a to přes coiled-coil rameno (Sergeant et al., 2005). Nse2 patří mezi SUMO (small ubiquitin-related modifier) ligázy (Andrews et al., 2005). Podobně jako Nse1 obsahuje RING-like finger motiv, který se podílí na SUMOylaci proteinů. Nse4 patří do rodiny δ-kleisinů, což jsou proteiny přemosťující hlavové domény SMC dimerů (Schlieffer et al., 2003). Tato podjednotka se váže k hlavovým doménám Smc5 i Smc6 části. Nse4 je příbuzný rodině savčích transkripčních represorů EID (E1A-like inhibitor of differentiation) a existují dva jeho ortology (Hudson et al., 2011). Jmenovitě se jedná o NSE4a a NSE4b. Nse4b/EID3 stejně jako Nse4a interaguje s MAGE-G1(Taylor et al., 2008). Nse5 a Nse6 byly objeveny pouze v kvasinkách S. cerevisiae a S. pombe (Pebernard et al., 2006). U S. cerevisia. jsou tyto podjednotky esenciální. Naproti tomu u S. pombe esenciální nejsou, ale jejich ztráta způsobí zvýšenou citlivost tohoto organizmu k mutagenním faktorům. V jiných organizmech homology Nse5 a Nse6 zatím objeveny nebyly. Funkce SMC5/6 komplexu není doposud přesně objasněna, avšak ví se, že hraje roli při opravě dvouřetězcových zlomů DNA pomocí homologní rekombinace (Pebernard et al., 2004).

-9-

4. POLOHA MAGE GENŮ NA CHROMOZOMU Nejčastější poloha MAGE genů je na X chromozomu. Na tomto chromozomu jsou umístěny geny pro členy I. třídy, která zahrnuje hMAGE-A (human MAGE-A), hMAGE-B, hMAGE-C geny. První objevený lidský MAGE gen patřící do skupiny hMAGE-A je umístěn na Xp28 (De Plaen et al., 1994; Rogner et al., 1995). Další výzkumy nasměrované na oblast Xp21 vedly k objevení skupiny hMAGE-B genů (Lurquin et al., 1997; Muscatelli et al., 1995) a později došlo i k objevení hMAGE-C genů na Xp26-27 (Lucas et al., 1998, 2000). Na X chromozomu je umístěna i většina genů II. třídy. Například geny hMAGE-D v pozici Xp11 (Lucas et al., 1999) a dále pak geny hMAGE-E, -H, -I, -J a -K (Obr. 2). Dalším chromozomem, na kterém jsou geny pro hMAGE proteiny, je chromozom 15. Nejznámějším představitelem hMAGE proteinu kódovaném na tomto chromozomu je necdin, jehož sekvence je umístěna v oblasti 15q11-13 (Jay et al., 1997). Společně s necdinem je na totožném místě i sekvence pro hMAGE-G a -L2 (Boccaccio et al., 1999; Chibuk et al., 2001). Posledním chromozomem, na kterém byla nalezena sekvence pro hMAGE protein je chromozom 3, na kterém je na q raménku kódován hMAGE-F1 (Stone et al, 2001).

Obrázek 2: Poloha lidských MAGE genů na chromozomu (převzato a upraveno z Chomez et al., 2001).

- 10 -

5. MAGE HOMOLOGNÍ DOMÉNA MAGE homologní doména je jediná charakteristická oblast společná pro všechny MAGE proteiny (Chomez et al., 2001). MHD byla nalezena u savců, ale stejně tak je prezentována i v MAGE proteinech řady dalších mnohobuněčných organizmů, jako je například Drosophila melanogaster nebo Aspergillus niger (Barker et Salehi, 2002). Lidská MHD ma délku 165 – 171 aminokyselin (Chomez et al., 2001). Je vzájemně podobná mezi členy I. a II. třídy. V průměru sdílí lidské MHD 46% homologii. Ve specifických skupinách je konzervovanost ještě větší, například u čtyř členů lidských MAGE-D proteinů je to 75 % a u dvanácti členů MAGE-A skupiny 70 %. Obvykle je umístěna blízko COOH proteinového konce, kromě hMAGE-D2 (human MAGE-D2) proteinu, kde je lokalizován více v centrální pozici. Zajímavé je, že u hMAGE-E1 a -E2 je MHD zdvojena. Zbytek proteinové sekvence a především NH2-koncové oblasti jsou odlišné u různých MAGE proteinů (Sang et al., 2010) (Obr. 3).

Obrázek 3: Schematické znázornění lidských MAGE-A1, -A3, -A9, -A11, -B1 a -D2 proteinů. MAGE NH2-koncová oblast (MAGE_N, šrafovaná); MAGE homologní doména (MHD, černá); MAGE COOH-koncová oblast (MAGE_C, mřížkovaná) (převzato z Sang et al., 2010).

- 11 -

MAGE proteiny I. třídy se skládají z jedné MHD a malých, slabě konzervovaných NH2a COOH- koncových sekvencí (Barker et Salehi, 2002). Výjimkou je MAGE-C1, který má oproti ostatním prodloužený COOH- i NH2- konec (Obr. 4). U členů II. třídy je stavba poněkud rozmanitější. Struktura necdinu, MAGE-F1 a MAGEG1 je podobná struktuře MAGE-A a -B genů. Naproti tomu MAGE-D1-4, MAGE-E1 a MAGEL2 jsou velké proteiny s prodlouženým NH2- nebo COOH- koncem. NH2 koncové domény MAGE-D obsahují konzervovanou oblast asi 220 aminokyselin, která se nazývá MDHD (MAGE-D homology domain) (Obr. 4). MHD a MDHD jsou u proteinu MAGE-D1 odděleny roztroušenou opakující se doménou (interspersed repeat domain, IRD), která se skládá z 25 tandemových opakování hexapeptidů WQXPXX. Tento neobvyklý motiv je dobře konzervován mezi myšími, krysími a lidskými MAGE-D1 proteiny.

Obrázek 4: Struktura vybraných MAGE proteinů. MHD (žlutá) je region společný pro všechny MAGE proteiny. Naproti tomu MDHD (zelená) je oblast společná jen pro MAGE-D proteiny a IRD (oranžová) je region typický pouze pro MAGE-D1, který je umístěný mezi MHD a MDHD (převzato z Barker et Salehi, 2002).

- 12 -

6. PŘÍKLADY MAGE PROTEINŮ 6.1. Lidské MAGE proteiny 6.1.1. I. třída Mezi proteiny I. třídy se řadí podskupiny MAGE-A, MAGE-B a MAGE-C. Exprese genů této třídy je přítomna v různých histologických typech nádorů (Gillespie et Coleman, 1999). V normálních tkáních jsou exprimovány pouze v placentě a ve varlatech při spermatogenezi ve stádiu spermatogonia, což naznačuje zapojení těchto genů ve vývoji zárodečných buněk (Takahashi et al., 1995). Charakteristický je pro geny I. třídy velký terminální exon kódující celý protein. Některé MAGE proteiny I. třídy kódují antigeny, které jsou umístěny na povrchu buňky a zde jsou rozpoznávány cytotoxickými T buňkami (Boon et al., 1999). MAGE geny I. třídy patří do skupiny cancer/testis (CT) antigenů nebo také cancers-germline (CG) genů, které zahrnují přinejmenším 55 blízce příbuzných proteinů (Sang et al., 2010). Ačkoli bylo napsáno více než 100 článků o CT antigenech, neví se mnoho o jejich funkci v normální buňce. Většina genů sdílí jako multigenní rodina společné umístění na X chromozomu (Scanlan et al., 2002). Transkripce MAGE-A, MAGE-B a MAGE-C genů v rakovinných buňkách je způsobena demetylací jejich promotorů následkem procesu celogenomové demetylace (De Smet et al., 1996). Celogenomová demetylace byla pozorována u mnoha rakovinových onemocnění a koreluje s vývojem nádoru. Stabilní aktivace CT antigenů v nádoru nevyžaduje neustálou demetylační aktivitu (De Smet et al., 2004), nicméně závisí na přítomnosti specifických transkripčních faktorů, které udržují promotor nemetylovaný. Podle nejnovějších studií některé proteiny ze skupiny MAGE-A interagují s DNAvazebným povrchem středové domény proteinu p53 (Marcar et al., 2010). Tímto působením mohou potlačovat funkci p53, protože ho stéricky blokují a zamezují tak interakci p53 s promotory (např. p21, MDM2, PUMA). Overexprese MAGE-A proteinů měla za následek snížení hladiny p53 v důsledku vzýšené ubiqutynace a degradace, zatímco potlačení exprese MAGE-A proteinů vedlo ke stimulaci normální funkce p53. Navíc zvýšení přítomnosti MAGE-A2 v buňce vede k rezistenci k některým protinádorovým lékům, jako je například etoposid (Monte et al., 2006). Tato fakta zdůrazňují terapeutický potenciál MAGE-A interakce s p53.

- 13 -

6.1.1.A. MAGE-A1 MAGE-A1,

první

známý

člen

MAGE

rodiny,

byl

objeven

v lidských

melanomových buňkách v roce 1991 (van der Bruggen et al., 1991). Byla objevena jeho interakce se SKIP (Ski Interacting Protein) proteinem (Laduron et al., 2004). SKIP je transkripční regulátor, který spojuje DNA vázebné proteiny s proteiny, které buďto aktivují nebo potlačují transkripci. MAGE-A1 inhibuje transaktivátor ovlivňující SKIP, jmenovitě se jedná o intracelulární část transmembránového proteinu Notch1. Navíc MAGE-A1 potlačuje transkripci svojí vazbou s HDAC1 (histone deacetylase 1). MAGE-A1 tedy svojí vazbou se SKIP a HDAC1 může fungovat jako účinný transkripční represor. Další studie při přechodném snížení DNMT1 metyltransferázy prokázaly, že je primárním enzymem pro udržení metylace promotoru MAGE-A1 genu (Loriot et al., 2006). U dalších použitých metyltransferáz (DNMT3A a DNMT3B) nebyly podobné účinky pozorovány.

6.1.1.B. MAGE-A2 Tento protein může interagovat s proteinem p53 a zároveň potlačovat jeho aktivitu (Marcar et al., 2010; Monte et al, 2006). MAGE-A2 je schopný přitahovat aktivní transkripční represor HDAC3 (histone deacetylase 3) do komplexu MAGE-A2/p53. Tento komplex pak dokáže potlačit transkripční aktivitu proteinu p53. Obdobné inhibiční účinky na funkci p53 má i MAGE-A1, -A3, nebo -A6.

6.1.1.C. MAGE-A3 Exprese Genu MAGE-A3 byla pozorována u různých nádorů, jako je například melanom, karcinom plic, leukémie, spinocelulární karcinom hlavy a krku, karcinom prsu, mnohočetný myelom, astrocytom, nádor vaječníků, hepatocelulární karcinom a osteosarkom (Gaugler et al., 1994; Martínez, 2007). V posledních letech nachází MAGE-A3 široké uplatnění v imunoterapii nádorů.

6.1.1.D. MAGE-A4 Pomocí kvasinkového dvouhybridního systému byla identifikována vazba MAGE-A4 proteinu s rakovinným proteinem, který se nazývá Gankyrin (Nagao et al., 2003). Tato specifická vazba je zprostředkována COOH-koncem MAGE-A4 proteinu. Gankyrin se skládá - 14 -

ze šesti gann ankyrin opakování a 38 aminokyselin na NH2-konci (Li et Tsai, 2002). Může se vázat k proteinům potlačujícím rakovinu, jako je Rb (retinoblastoma proteinem) protein, S6 ATP enzymová podjednotka proteazomu 26S nebo kináza Cdk4 (cell cycle-dependent kinase 4). Exprese Gankyrinu je zvýšená u pacientů s hepatocelulárním karcinomem v raném stádiu vývoje (Park et al., 2001). Toto zjištění naznačuje, že Gankyrin má roli v kontrole buněčného cyklu a tumorgenezi hepatocelulárního karcinomu. Nadprodukce Gankyrinu může vést ke zvýšené fosforylaci a degradaci Rb proteinu (Li et Tsai, 2002). Gankyrin tedy hraje důležitou roli v kontrole buněčného cyklu během vývoje rakoviny jater (Nagao et al., 2003). Vazba Gankyrinu s MAGE-A4 může částečně inhibovat růst Gankyrin nadprodukujících

buněk,

což

naznačuje,

že

tato

interakce

potlačuje

Gankyrinem

zprostředkovanou karcinogenezi. Na rozdíl od MAGE- A1, -A2, -A3 nebo A6 dokáže MAGE-A4 indukovat apoptózu in vitro zprostředkovanou proteinem p53 a to reakcí jeho karboxylového koncového fragmentu s p53 (Sakurai et al., 2004). Většina MAGE-A proteinů je považována za onkogeny. Je však zajímavé, že MAGE-A4 působí jako nádorový supresor.

6.1.1.E. MAGE-A11 MAGE-A11 se váže s androgen receptorem (AR) přes jeho NH2 koncový motiv FXXLF, což zvyšuje schopnost AR interagovat s transkripčními koaktivátory a zároveň stimuluje transkripční aktivitu AR (Bai et al., 2005). Dále může modulovat funkci hypoxických inducibilních faktorů (HIF), což je rodina bazických transkripčnich faktorů, které indukují odpověď na změny buněčné hladiny kyslíku (Aprelikova et al., 2009). Podjednoteky HIF- a - jsou součástí heterodimerického komplexu HIF (Wang et Semenza, 1995). Aktivace HIF, zodpovědná za nádorovou angiogenezi a regulaci glykolýzy, je řízena snížením dostupnosti kyslíku. Pokud je hladina kyslíku v normálním stavu (normoxie), je HIF- podjednotka hydroxylována prolyl hydroxylázou (PHD). Tato hydroxylace dovoluje interakci HIF- s E3-ubiquitin ligázou pVHL (von HippelnLindau protein) a následuje degradace v proteasomu (Kallio et al., 1999). Během normoxie se tedy  podjednotka vyskytuje v buňce jen ve velmi nízkých koncentracích. Jakmile však dojde k poklesu hladiny kyslíku (hypoxie), HIF- podjednotka se stabilizuje, přemísťuje do jádra, vytváří komplex s HIF- a aktivuje se transkripce jejích genů. MAGE-A11 moduluje funkci

- 15 -

HIF, tím že potlačuje aktivitu prolyl-hydroxylasy 2 (PHD2) a stabilizuje tak HIF- protein dokonce i ve stavu, kdy je kyslík v relativně normální koncentraci. 6.1.1.F. MAGE-C1 Nedávné studie identifikovaly NY-ESO-1 jako vazebného partnera MAGE-C1 (Cho et al., 2006). Oba tyto proteiny patří do skupiny CT antigenů a jedná se o první objev přímé interakce mezi těmito antigeny. Imunoprecipitace a imunofluorescence potvrdily tuto interakci a kolokalizaci obou antigenů v cytoplazmě melanomových buněk. Tato přímá interakce naznačuje možnost, že CT antigeny mohou regulovat svojí aktivitu skrze specifickou interakci s ostatními CT antigeny.

6.1.2. II. třída Do druhé třídy řadíme MAGE-D, -E, -F, -H, -I, -K, -L a necdin. Tyto proteiny jsou exprimovány v mnoha normálních tkáních (Chomez et al., 2001). U placentálních savců mají členové této třídy vysokou mezidruhovou homologii, příkladem je velmi silná homologie mezi myšími a lidskými MAGE-D2 proteiny (90%). Díky tomuto zjištění lze předpokládat, že budou mít i společnou funkci. Zatímco geny I. třídy se vyskytují výhradně na X chromozomu (kapitola 4.), geny II. třídy byly objeveny i na dalších chromozomech a jsou spojovány s nemocemi vznikajícími v důsledku mutací na těchto chromozomech (Jay et al., 1997; Isles et Wilkinson, 2000).

6.1.2.A. MAGE-D1 NRAGE nebo Dlxin je jiný název pro lidský MAGE-D1, který hraje důležitou roli ve zprostředkování apoptózy a transkripce (Barrett 2000, Masuda et al., 2001). Tento protein je normálně exprimován ve fetálních i dospělých tkáních, obzvláště v mozku. MAGE-D1 se váže k p75 neurotrophin receptoru (p75NTR), což je člen rodiny receptorů tumor nekrotizujících faktorů. Vazbou s tímto receptorem brání průběhu buněčného cyklu (Salehi et al., 2000). Nadprodukce MAGE-D1 inhibuje interakci mezi p75NTR a TrkA receptorem, čímž potlačuje průběh buněčného cyklu a indukuje apoptózu. Naproti tomu nadprodukce Trk receptoru zvyšuje vazbu mezi TrkA a p75NTR což vede k buněčné proliferaci. Navíc MAGE-D1 může interagovat i s UNC5H1, což je receptor na axonu (Williams et al., 2003). Bylo prokázáno, že tato interakce je zodpovědná za apoptózu zprostředkovanou UNC5H1. Mapováním vazebného místa s UNC5H1 byla objevena doména ZU-5, která je potřeba pro apoptózu zapříčiněnou tímto receptorem. - 16 -

MAGE-D1 se váže i s dalšími proteiny zapojenými do průběhu buněčného cyklu a apoptózy. Přes svojí IRD se váže s Msx2, Dlx7 nebo Dlx5 (Masuda et al., 2001). Msx a Dlx geny kódují transkripční faktory, které mají funkci ve vývoji končetin a nervového systému (Bendall et Abate-Shen, 2000). Msx funguje jako transkripční inhibitor, zatímco Dlx má funkci transkripčního aktivátoru (Masuda et al., 2001). Kromě toho se Msx1 a Msx2 účastní kontroly buněčného cyklu a Msx2 může podporovat buněčnou smrt. Efekt proteinu MAGE-D1 na Msx zůstává nejasný, ale víme, že MAGE-D1 je nezbytný pro transkripční aktivitu Dlx5.

6.1.2.B. MAGE-D4 MAGE-D4 nebo také magphinin byl nalezen v mužských i ženských zárodečných buňkách, kde má regulační funkci během gametogeneze (Saburi et al., 2001). Jeho mimoděložní exprese v savčích buňkách potlačuje buněčnou proliferaci. Magphinin má 3 formy: magphinin-,  a . Sekvence magphininu obsahuje jaderný lokalizační signál, který mu dovoluje vstoupit do jádra a zde inhibovat proliferaci buňky (Saburi et al., 2001). Imunohistochemické studie dokázaly, že pozice magphininu se mění během různých stádií buněčného cyklu a to rozdílně u mužských a ženských buněk. Ještě před meiozou je magphinin- v mužských zárodečných buňkách produkován hlavně v cytoplazmě. Po první meioze, kdy se primární spermatocyty diferencují do sekundárních, je magphinin lokalizován v cytoplazmě i v jádře a poté buněčné dělení končí. Tento fakt naznačuje, že magphinin reguluje buněčný cyklus během formování mužských spermatocytů. V ženských zárodečných buňkách je distribuce magphininu rozdílná. Pokud mají oocyty jednovrstevné nebo dvouvrstevné vezikuly, pak je intracelulární magphinin, obzvláště magphinin-, umístěn pouze v cytoplazmě. Pokud jsou však vezikuly mnohovrstevné, protein je umístěn pouze v jádře. V takovém případě meioza končí v G2 fázi, což znamená, že magphinin kontroluje také utváření ženského vajíčka (Saburi et al., 2001).

6.1.2.C. MAGE-G1 Umístění genu MAGE-G1 je v proximální části chromozomu 15q stejně jako necdin a MAGE-L2 (Chibuk et al., 2001). Protože se jedná o další gen pro homologní protein s necdinem, je jeho jiné označení necdin-like 2. MAGE-G1 je podjednotkou lidského SMC5/6 komplexu (kap. 3). Není jasné, zda jeho dříve objevené funkční interakce s např. s E2F1 a p75NTR souvisí i s funkcí komplexu SMC5/6 nebo zda malá frakce MAGE-G1 proteinu plní ještě další speciální funkce. Bylo ukázáno, že - 17 -

MAGE-G1 může stejně jako necdin potlačovat apoptózu zprostředkovanou transkripčním faktorem E2F1. Reaguje steným způsobem jako necdin i s transmembránovým proteinem p75NTR (Kuwako et al., 2004). 6.1.2.D. MAGE-L2 Jiné pojmenování genu pro MAGE-L2 je necdin-like 1. Místo exprese genu MAGE-L2 je převážně uvnitř vyvíjejícího se centrálního nervového systému (CNS), částečně pak hypotalamu, mozkové kůře, míše nebo v placentě (Boccaccio et al., 1999). Umístění tohoto genu je stejné jako u necdinu, tedy 15q11-13, a je možné, že je také zapojen v patogenezi Prader-Williho syndromů (PWS). Množství MAGE-L2 mRNA se snižuje v pozdějším věku, ale je možné jí detekovat i v CNS dospělého člověka. Funkce tohoto proteinu není doposud známa. Na rozdíl od ostatních homologů necdinu (MAGE-G1 a -H1) se MAGE-L2 neváže s E2F1 ani s p75NTR (Kuwako et al., 2004).

6.1.2.E. necdin Necdin byl poprvé objeven v diferenciovaných nervových buňkách P19 v roce 1991 a je jedním z prvních popsaných MAGE proteinů (Maruyama et al., 1991). Je to protein dlouhý asi 325 aminokyselin. Gen pro necdin je umístěný na 15q11-13 a je exprimován ve všech postmitotických neuronech (Jay et al., 1997). Jeho exprese se zvyšuje jakmile neuron přichází do postmitotické fáze a předpokládá se, že přechod z buněčného cyklu do postmitotické fáze ulehčuje. Za zastavení proliferace buněk je pravděpodobně zodpovědná jeho interakce s transkripčními faktory E2F1, p53 a p75NTR (Kuwako et al., 2004; Taniura et al., 1998, 1999). E2F1 se specificky váže a transaktivuje geny, které jsou zapojeny ve vývoji buněčného cyklu (Yoshikawa, 2000). Tento proces je regulován Rb proteinem, který potlačuje aktivaci E2F1 vazbou na jeho transaktivační doménu během G1 fáze buněčného cyklu. Jakmile buňka přejde do S fáze, Rb protein se v důsledku fosforylace uvolní a komplex E2F1 může pokračovat ve své funkci. Necdin účinkuje velice podobně. Vytvoří vazbu s E2F1 a tím potlačí jeho funkci, což vede k zastavení buněčného cyklu a potlačení apoptózy (Taniura et al., 1998). Necdin také interaguje s proteinem p53, dobře známým nádorovým supresorem, který transaktivuje geny zapojené v zastavení růstu buňky a její apoptóze (Taniura et al., 1999). Necdin se váže na transaktivační doménu proteinu p53, čímž brání apoptóze zprostředkované tímto proteinem. Stejně jako MAGE-D1 může necdin reagovat s intercelulární doménou p75NTR a tím nejen zpomalovat průběh buněčného cyklu, ale i přispívat k apoptóze (Kuwako et al., 2004). - 18 -

p75NRT částečně ruší potlačování apoptózy zprostředkované vazbou E2F1 s MAGE proteinem a to tím, že snižuje vznik MAGE-E2F1 komplexů. Bylo však také zjištěno, že necdin vytváří komplexy s E2F1 a p75NTR v rozdílných nervových buňkách P19. Necdin tedy může mít v různých buňkách rozdílnou funkci. V některých buňkách může fungovat jako nádorový supresor a to svojí schopností vázat se s p75NRT a tím přispívat k apoptóze (Kuwako et al., 2004). Naopak v jiných buňkách může apoptózu potlačovat a to přes svoji vazbu s proteinem p53 nebo E2F1 (Taniura et al., 1998; 1999). Proximální oblast lidského chromozomu 15q je místo původu různých neurologických a mentálních poruch, jako je například PWS, Angelmanův syndrom, epilepsie, autismus nebo schizofrenie (Jay et al., 1997; Isles et Wilkinson, 2000). PWS je neurogenetická porucha, která je způsobená delecí 15q11-q13 oblasti chromozomu, ve které se nachází i necdin. Lidé s tímto syndromem trpí poruchou funkce hypotalamu a typická je pro ně obezita, zpožděný vývoj, mentální retardace, malý vzrůst, hypogonadismus, hyperfagie (přejídání) a návaly vzteku (Cassidy, 1997). Přesná buněčná funkce necdinu zůstává doposud neznámá, avšak má klíčovou roli v patogenezi PWS (Nakada et al., 2000).

6.2. Myší MAGE Jak již bylo v předchozích kapitolách řečeno, lidské a myší MAGE proteiny I. třídy mají jen velmi slabou homologii a proto funkce, kterou mají tyto proteiny u myší, se může do značné míry lišit od funkce lidských MAGE proteinů. Mnoho myších a lidských MAGE genů jsou výhradně exprimovány v nádorech a zárodečných buňkách, což vede k závěru, že tyto proteiny vykonávají normální funkci ve vývoji zárodečných buněk (Clotman et al., 2000; Osterlund et al., 2000; Takahashi et al., 1995). Například mMAGE-A a mMAGE-B4 jsou přednostně exprimovány ve spermatogoniích, zatímco mMAGE-B1, -2 byl nalezen hlavně v postmeiotických spermatidách.

6.2.1. mMAGE-A3 U myší se MAGE-A3 váže na pro-kaspázu-12, čímž inhibuje aktivaci kaspázy-12 (Morishima et al., 2002). Myší kaspáza-12 indukuje apoptózu jako odpověď na poškození směřující do endoplazmatického retikula. Takovým poškozením může být inhibice glykosilace. Tento fakt naznačuje, že exprese proteinu mMAGE-A3 ochraňuje nádorové buňky před tímto poškozením a proto může poskytovat rakovinným buňkám výhodu pro přežití.

- 19 -

Proapoptický efekt kaspázy-12 není zřejmě velký vzhledem k tomu, že myši bez kaspázy12 se vyznačovaly pouze mírným poklesem apoptózy (Lamkanfi et al., 2004).

6.2.2. mMAGE-B Exprese MAGE-B1, -2 a MAGE-B3 byla studována v celém embryu pomocí RT-PCR a výsledky ukázaly, že pouze MAGE-B3 je exprimován 11 až 15 dní po oplození (De Backer et al., 1995). Myší MAGE gen, který byl důkladně prozkoumán během ranného období života je mMAGE-B4 (Osterlund et al., 2000). Tento gen je exprimován v dospělých buňkách, ale i v reprodukčních žlázových buňkách plodu. mMAGE-B4 protein se nachází v cytoplazmě, ale ne v jádře. Ve varlatech probíhá proliferace zárodečných buněk až do doby, než se zastaví v G0/G1 fázi buněčného cyklu. mMAGE-B4 je v této fázi v zárodečných buňkách vysoce exprimován. Toto zjištění naznačuje, že mMAGE-B4 by mohl mít významnou funkci v samčích zárodečných buňkách a to udržováním gonocytů ve stavu, kdy neproliferují.

- 20 -

7. MAGE-EID KOMPLEXY Nse3/MAGE-G1 proteiny interagují s Nse1 a Nse4 podjednotkami SMC5/6 komplexu a vytváří Nse1-Nse3-Nse4 podkomplex (kapitola 3). Nedávno bylo zjištěno, že interakce Nse3 proteinu s Nse4 podjednotkou je evolučně velmi konzervovaná. Protein Nse4 je příbuzný rodině transkripčních represorů EID a existují dva jeho lidské ortology: NSE4a a NSE4b (Hudson et al., 2011). Přičemž NSE4b je podjednotka SMC5/6 komlexu vyskytujícího se ve varlatech nebo v placentě. Lidský název tohoto proteinu je EID3. NSE4a je ortolog nacházející se v SMC5/6 komplexu v somatických buňkách. V nejnovější studii byl u Schizosaccharomyces pombe identifikován konzervovaný hydrofobní povrch MHD domény Nse3, který interaguje s Nse4 (Hudson et al., 2011). Při zkoumání evoluční podobnosti této interakce bylo objeveno, že některé lidské MAGE proteiny mohou interagovat nejen s NSE4a a NSE4b, ale i dalšími proteiny z EID rodiny (Obr. 5), které se vyznačují významnou sekvenční podobností s N-koncovou částí Nse4 proteinu. Protože EID1 protein sdílel společné vlastnosti s proteinem E1A je jeho označení (E1Alike inhibitor of differentiation 1) (MacLellan et al., 2000; Miyake et al., 2000). EID1 byl charakterizován jako inhibitor CBP/p300. Přičemž CBP/p300 má funkci při diferenciaci buňky. EID1 inhibuje transaktivaci závislou na proteinu MyoD (myogenic differentiation protein), což je protein, který ma roli při regulaci myogenní diferenciace. EID1 potlačuje aktivitu acetyltransferázy p300, která je transkripční koaktivátor proteinu MyoD. EID1 je exprimován ve všech lidských tkáních, nejvíce však v srdečním a kosterním svalstvu. V nedávné době byla identifikována interakce mezi EID1 a necdinem (Bush et Wevrick, 2008). Necdin nemá přímý vliv na MyoD, ale působí proti represivnímu efektu EID1 a tím přispívá k normální myogenní diferenciaci. Podobně bylo zjištěno, že NSE4b/EID3 potlačuje transkripční aktivaci některých promotorů v lidských hepatocytech HuH7 (Bavner et al., 2005). Další průzkumy prokázaly, že také interakce Nse4b/EID3 s MAGE-G1 proteinem ovlivňuje transkripční aktivitu jaderných receptorů (Hudson et al., 2011).

- 21 -

Obrázek 5: Interakce MAGE proteinů s proteiny EID rodiny. Znaménko + značí interakci a znaménko - znamená, že interakce nebyla detekována (převzato z Hudson et al., 2011).

- 22 -

8. MAGE-RING PROTEINOVÉ KOMPLEXY Neméně důležitou interakcí jako je Nse3-Nse4 je i interakce Nse3 s Nse1. Nse1 podjednotka je protein s RING finger domémou. Avšak na rozdíl od Nse4, která interaguje s většinou MAGE proteinů, u Nse1 byla prokázána interakce pouze s MAGE-F1 a -G1. Zajímavé však je, že ostatní MAGE proteiny interagují i s jinými proteiny s RING finger doménou.

8.1. Proteiny s RING finger doménou RING (Really Interesting New Gene) finger doména obsahuje ve své struktuře bohatě cysteinové a méně pak histidinové aminokyseliny (Borden et Freemont, 1996). Tyto aminokyseliny vytváří proteinovou strukturu, na kterou se váží dva zinkové ionty a vytváří tak zinc-finger motiv. Mnoho RING doménových proteinů funguje v ubiquitinační kaskádě jako E3 ubiquitin ligáza, tím že se váže k E2 enzymům a připojují ubiquitin k substrátu (Lorick et al., 1999). Některé MAGE proteiny I. i II. třídy se váží s RING E3 ubiquitin ligázami a zvyšují jejich aktivitu (Doyle et al., 2010). Ubiquitin je malý globulární protein, který se kovalentně připojuje k cílovému proteinu určenému k degradaci. Tento proces se nazývá ubiquitinace. E3 ubiquitin ligáza je součástí ubiquitinace, což je proces zodpovědný za degradaci více než 80 % normálních i abnormálních intracelulárních proteinů (Obr. 6).

Obrázek 6: Průběh ubiquitinace. Ubiquitin je přidaný k cílovému substrátu ve třech krocích vyžadujících 3 enzymy, E1, E2 a E3. V prvním kroku ubiquitinace je aktivován enzym E1 pomocí ATP. E1 poté aktivuje ubiquitin. V kroku dvě je ubiquitin přenesen na enzym E2 a v posledním kroku se ubiquitin pomocí E3-ligázy připojuje k substrátu. Takto rozpoznané proteiny jsou degradovány na malé peptidy v 26S proteazomu (převzato z Wang et Maldonado, 2006). - 23 -

MAGE proteiny se váží přímo a specificky k různým proteinům s RING doménou (Obr. 7). Například MAGE-B18 vytváří silný komplex s LNX1, ale ne s TRIM28 či NSE1 (Doyle et al., 2010). Většina MAGE proteinů vytváří komplex pouze s jedním RING proteinem, avšak i zde existují výjimky jako je například MAGE-F1 nebo -G1, které se váží se dvěma. Samotný NSE1 v přítomnosti UbcH13/Mms2 E2 enzymu má slabou ubiquitin ligázovou aktivitu (Pebernard et al., 2008). Nicméně jeho aktivita se výrazně zvýší po přidání MAGE-G1 (Doyle et al., 2010). Ke zvýšení však nedochází po přidání například MAGE-C2, který se s NSE1 neváže. Z tohoto poznatku vyplývá, že MAGE-G1 přímo zvyšuje aktivitu in vitro skrze svojí vazbu s NSE1. Podobný efekt byl pozorován například i u vazby MAGE-C2 proteinu s TRIM28.

Obrázek 7: Vazebné afinity označených MAGE proteinů a E3 RING ubiqiutin ligáz. Silná afinita (strong); středně silná afinita (intermediate); slabá afinita (weak); neprokázaná afinita (not detectable); netestováno (not tested) (převzato z Doyle et al., 2010).

8.2. Specificita vazby MAGE proteinů s RING doménou MAGE proteiny nerozpoznávají obyčejné motivy na jejich RING proteinových partnerech. Specificita, díky které se vytváří MAGE-RING komplexy, je dána MHD doménou MAGE proteinů, která se váže k jedinečným regionům na RING doménách (Doyle et al., 2010). MAGE proteiny se vážou k proteinům obsahujícím RING doménu skrze svoji MHD, která je složená ze dvou winged-helix motivů (WH-A a WH-B) (Obr. 8). Naproti tomu vazebná oblast na RING doméně je rozdílná. Například MAGE-C2 se váže s coiled-coil oblastí na TRIM28,

- 24 -

MAGE-B18 se zásaditou (basic) oblastí na LNX1 a MAGE-G1 s WH1 motivem na N-konci NSE1.

Obrázek 8: Mapa interagujících regionů MAGE-B18-LNX1, MAGE-C2-TRIM28 a MAGE-G1-NSE1 (převzato z Doyle et al., 2010).

8.3. Komplexy RING proteinů s MAGE proteiny I. třídy Členové všech tří skupin I. třídy se váží s TRIM28, což je protein s RING-B-box coiledcoil doménou (RBCC) umístěnou blízko NH2-konce (Friedman et al., 1996). Wang et al. (2005) ve své práci zveřejnili, že TRIM28 má roli v nádorovém bujení jako korepresor proteinu p53 a to tím, že se váže na MDM2. Podle nejnovějších studií však MAGE-C2-TRIM28 reguluje protein p53 nezávisle na MDM2 (Doyle et al., 2010). Tyto MAGE proteiny aktivují TRIM28 uiquitin ligázovou aktivitu, která má za následek zvýšenou degradaci nádorového supresoru p53. Zástupci první MAGE proteinové třídy mohou podporovat životaschopnost buňky a tudíž poskytovat růstovou výhodu melanomům a jiným zhoubným nádorům (Yang et al., 2007).

- 25 -

9. IMUNOTERAPIE MAGE geny I. třídy, které jsou exprimovány v rakovinných buňkách, mohou být využity jako antigenní cíle v nádorové imunoterapii (Atanackovic et al., 2004; van der Bruggen. et al., 1991; Castelli et al, 2000; Takahashi et al., 1995). Proteiny I. třídy jsou však produkovány i zárodečnými buňkami ve varlatech, avšak zde nejsou exprimovány molekuly hlavního histokompatibilního komplexu I ani II a proto na těchto buňkách nemohou být MAGE proteiny vystaveny a rozpoznávány T-lymfocyty a díky tomu u nich při imunoterapii nevznikají nepříznivé vedlejší účinky. Lidské MAGE proteiny I. třídy jsou rozštěpeny v proteazomu na specifické nádorové antigenní

peptidové

fragmenty.

Tyto

peptidy

jsou

transportovány

z cytoplazmy

do endoplazmatického retikula prostřednictvím specifických membránových peptidových pump. Zde se naváží na MHC I molekuly. MHC molekuly s navázaným peptidem se poté přesouvají do Golgiho aparátu a na povrch antigen prezentující buňky. Takto vystavené MHC s peptidy jsou rozpoznávány CD8+ T lymfocyty (Boon et al., 1999). Na tomto faktu je založena studie využívající tyto peptidy jako cíle pro vývoj nového séra proti nádorům. Byl popsán vysokoafinitní peptid odvozený z MAGE-A1, -A2, -A3, -A4, -A6, -A10, -A12, který dokáže indukovat aktivitu u cytotoxických T-lymfocytů (Graff-Dubois et al., 2002). Tyto lymfocyty jsou poté schopny individuálně rozpoznat každý MAGE-A antigen a následně zabít rakoviné buňky produkující MAGE-A.

9.1. Rekombinantní MAGE-A3 proteiny MAGE-A skupina proteinů

vyvolává spontánní

humorální

imunitní odpověď

u pacientů s rakovinou. Jejich objevení vedlo k vývoji antigenně specifických vakcín proti nádorům (Brichard et Lejeune, 2007). V imunoterapii se využívají rekombinantní MAGE proteiny, které mají potenciál aktivovat širokou imunitní odpověď zprostředkovanou T-lymfocyty. Tyto proteiny mohou být používány v široké populaci pacientů s rakovinnými buňkami exprimujícími MAGE-A. Řada klinických cest zahrnuje proteiny produkované rekombinantními technologiemi, zejména pak MAGE-A3 (Marchand et al., 1999, Tyagi et Mirakhur, 2009). Byly prováděny studie navržené k imunizaci rekombinantním proteinem MAGE-A3 u pacientů s metastázujícím melanomem a u pacientů s nemalobuněčnými karcinomy plic

- 26 -

(NSCLC) (Vansteenkiste et al., 2007). U pacientů léčených MAGE-A3 proteinem bylo při operaci NSCLC pozorováno zmenšení relativního rizika o 27 %. U pacientů s Non-Hodgkinovým lymfomem se exprese genu MAGE-A3 prokázala u 47,3 %. Přičemž exprese tohoto genu se snížila po chemoterapii (Han et al., 2010). Po 3-4 cyklech chemoterapie byl MAGE-A3 nalezen u 7,5 % pacientů a po 6-8 cyklech pouze u 4,1 %. Nicméně exprese těchto genů nemá prognostický význam u pacientů této skupiny.

9.2. DERMA a MAGRIT DERMA (Adjuvant immunotherapy with MAGE-A3 in melanoma) a MAGRIT (MAGEA3 as Adjuvant Non-Small Cell Lung Cancer Immunotherapy) jsou dvě klinické studie velké fáze III na pacientech s melanomem kůže a NSCLC (Tyagi et Mirakhur, 2009). Cílem těchto studií je zkoumat účinnost MAGE-A3 v antigenně specifické imunoterapii nádorů (ASCI, Antigen-specific cancer immunotherapeutics) a v předcházení nového vzplanutí rakoviny poté co je nádor vyoperován.

9.3. MAGE-A markery pro prognózu onemocnění Role MAGE-A transkriptů a peptidů jako diagnostických markerů je v současné době ve výzkumu (Sang et al., 2010). Doposud je však významnost MAGE-A transkriptů jako markerů pro prognózu nejistá. MAGE-A transkripty předpovídají nepříznivý výsledek u pacientů s rakovinou plic, mnohočetným myelomem, karcinomem děložního krčku a karcinomem močového měchýře. Nicméně pozitivní prognóza s expresí MAGE genů byla pozorována u neuroblastomu či rakoviny prsu. Existuje však také skupina nemocí, u kterých nebyl pozorován prognostický význam MAGE-A genů. Do této skupiny patří například pacienti s lymfomem nebo s karcinomem jícnu.

- 27 -

10. ZÁVĚR V této bakalářské práci bylo hlavním cílem shromáždit doposud zjištěné informace o jednotlivých MAGE proteinech a pomocí nich a dalších informací o jejich původu a roli v SMC komplexech přiblížit jejich funkci. Ačkoliv byly MAGE proteiny objeveny v roce 1991, jejich přesná funkce zůstává doposud neznámá. I přestože členové I. a II. třídy MAGE genů jsou exprimováni v rozdílných tkáních, všichni obsahují MHD, což naznačuje určitou funkční podobnost. Nedávné studie udělaly velký pokrok k objasnění role jednotlivých MAGE proteinů v buněčném vývoji a apoptóze. Příkladem může být lidský gen pro necdin, který může přispívat k patogenezi PWS. Velmi zajímavé, z pohledu dalších studií, se jeví zapojení MAGE proteinů v procesu degradace proteinů a to přes jejich vazbu s E3 RING ubiquitin ligázami. V dnešní době je výzkum MAGE proteinů z velké části zaměřen na imunoterapii. V tomto směru je důležité využití MAGE proteinů I. třídy. Hromadící se data naznačují, že I. třída MAGE proteinů hraje významnou roli ve vzniku nádoru a ve schopnosti přežívání nádorových buněk. Zvláště pak zajímavé se jeví využití rekombinantních MAGE-A proteinů. Některé studie se zabývají funkcí MAGE proteinů v SMC5/6 komplexu a jejich evolucí. Zjištění, že původním MAGE proteinem je MAGE-G1 a z tohoto proteinu vychází zbylí členové MAGE rodiny, přináší nový pohled do této doposud záhadné proteinové rodiny. Nové objevy týkající se interakce podjednotek SMC5/6 komplexu se v budoucnu jeví jako klíčové pro objasnění funkce tohoto komplexu a MAGE proteinů.

- 28 -

12. LITERATURA Andrews, E. A., Palecek, J., Sergeant, J., Taylor, E., Lehmann, A. R., Watts, F. Z. 2005. Nse2, a component of the Smc5-6 complex, is a SUMO ligase required for the response to DNA damage. Mol. Cell Biol. 25: 185 – 196. Aprelikova, O., Pandolfi, S., Tackett, S., Ferreira, M., Salnikow, K., Ward, Y., Risinger, J. I., Barrett, J. C., Niederhuber, J. 2009. Melanoma antigen-11 inhibits the hypoxiainducible factor prolyl hydroxylase 2 and activates hypoxic response. Cancor Res. 69: 616–624. Atanackovic, D., Altorki, N. K., Stockert, E., Williamson, B., Jungbluth, A. A., Ritter, E., Santiago, D., Ferrara, C. A., Matsuo, M., Selvakumar, A., Dupont, B., Chen, Y. T., Hoffman, E. W., Ritter, G., Old, L. J., Gnjatic, S. 2004. Vaccine-induced CD4+ T cell response to MAGE-3 protein in lung cancer patients, J. Immunol. 172: 3289–3296. Bai, S., He, B., Wilson, E. M., 2005. Melanoma antigen gene protein MAGE-11 regulates androgen receptor function by modulating the interdomain interaction. Mol. Cell. Biol. 25: 1238–1257. Barker, P. A., Salehi, A. 2002. The MAGE proteins: emerging roles in cell cycle progression, apoptosis, and neurogenetic disease. J. Neurosci. Res. 67: 705 – 712. Barrett, G. L. 2000. The p75 neurotrophin receptor and neuronal apoptosis. Progr Neurobiol 61: 205–229. Bavner, A., Matthews, J., Sanyal, S., Gustafsson, J. A., Treuter, E. 2005. EID3 is a novel EID family member and an inhibitor of CBP-dependent co-activation. Nucleic Acids Res 33: 3561–3569. Bendall, A. J., Abate-Shen, C. 2000. Roles for Msx and Dlx homeoproteins in vertebrate development. Gene 247: 17–31. Boccaccio, I., Glatt-Deeley, H., Watrin, F., Roeckel, N., Lalande, M., Muscatelli, F. 1999. The human MAGEL2 gene and its mouse homologue are paternally expressed and mapped to the Prader-Willi region. Hum. Mol. Genet. 8: 2497–2505. Boon, T., Van den Eynde, B. J. 1999. Shared tumor-specific antigens. In Rosenberg, S. A. 2002. Principles and Practice of the Biologic Treatment of Cancer, Ed. 3: 493-504. Borden, K. L. B., Freemont, P. S. 1996. The RING finger domain: a recent example of a sequence- structure family. Current Opinion in Structural Biology 6: 395-401. Brichard, V. G., Lejeune, D. 2007. GSK’s antigen-specific cancer immunotherapy programme: pilot results leading to Phase III clinical development. Vaccine 25: B61-B71. Cassidy, S. B. 1998. Prader-Willi syndrome. J Med Genet 34: 917–923. Castelli C., Rivoltini, L., Andreola, G., Carrabba, M., Renkvist, N., Parmiani, G. 2000. T-cell recognition of melanoma-associated antigens. J. Cell. Physiol. 182: 323–331. - 29 -

Clotman, F., De Backer, O., De Plaen, E., Boon, T., and Picard, J. 2000. Cell- and stagespecific expression of Mage genes during mouse spermatogenesis. Mamm. Genome. 11: 696–699. De Backer, O., Verheyden, A. M., Martin, B., Godelaine, D., De Plaen, E., Brasseur, R., Avner, P., and Boon, T. 1995. Structure, chromosomal location, and expression pattern of three mouse genes homologous to the human MAGE genes. Genomics 28: 74–83. De Plaen, E., Arden, K., Traversari, C., Gaforio, J. J., Szikora, J. P., De Smet, C., Brasseur, F., van der Bruggen, P., Lethe´, B., Lurquin, C., Brasseur, R., Chomez, P., De Backer, O., Cavenee, W., Boon, T. 1994. Structure, chromosomal localization and expression of twelve genes of the MAGE family. Immunogenetics 40: 360–369. De Smet, C., De Backer, O., Faraoni, I., Lurquin, C., Brasseur, F., Boon, T. 1996. The activation of human gene MAGE-1 in tumor cells is correlated with genome-wide demethylation. PNAS USA 93: 7149–53. De Smet, C., Loriot, A., Boon, T. 2004. Promoter dependent mechanism leading to selective hypomethylation within the 5 region of gene MAGE-A1 in tumor cells. Mol Cell Biol 24: 4781–90. Doyle, J. M., Gao, J., Wang, J., Yang, M., Potts, P. R. 2010. MAGE-RING protein complexes comprise a family of E3 ubiquitin ligases. Mol Cell 39: 963-974. Friedman, J. R., Jensen, D. E., Speicher, D. W., Huang, X. P., Neilson, E. G., Rauscher, F. J. 3rd. 1996. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes Dev 10: 2067–78. Fukuda, M. N., Sato, T., Nakayama, J., Klier, G., Mikami, M., Aoki, D., Nozawa, S. 1995. Trophinin and tastin, a novel cell adhesion molecule komplex with potential involvement in embryo implantation. Genes Dev 9: 1199–1210. Gaugler, B., Van den Eynde, B., Van der Bruggen, P., Romero, P., Gaforio, J. J., De Plaen, E., Lethé, B., Brasseur, F., Boon, T. 1994. Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a melanoma by autologous cytolytic T lymphocytes. J Exp Med 179: 921– 30. Gerlich, D., Koch, B., Dueux, F., Peters, J. - M., Ellenberg, J. 2006. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr. Biol. 16: 1571 – 578. Gillespie, A. M., Coleman, R. E. 1999. The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy. Cancer Treat. Rev. 25: 219 – 227. Graff-Dubois, S., Faure, O., Gross, D. A., Alves, P., Scardino, A., Chouaib, S., Lemonnier, F. A., Kosmatopoulos, K. 2002. Generation of CTL recognizing an HLA-A*0201restricted epitope shared by MAGE-A1, -A2, -A3, -A4, -A6, -A10, and -A12 tumor antigens: implication in a broad-spectrum tumor immunotherapy. J. Immunol. 169: 575– 580.

- 30 -

Gruber, S., Haering C. H., Nasmyth, K. 2003. Chromosomal Cohesin Forms a Ring. Cell 112: 375 – 386. Han, M. H., Eom, H. S., Park, W. S., Yun, T., Park, S., Kim, H. J., Jeon, C. H., Kong, S. Y. 2010. Detection of circulating lymphoma cells in patients with non/Hodgkin lymphoma using MAGE-A3 gene expression in peripheral blood. Leuk Res 34: 1127–31. Hirano, T. 2006. At the heart of the chromosome: SMC proteins in action. Moll. Cell Biol. 7: 311 – 322. Hudson, J. J. R., Bednarova, K., Kozakova, L., Liao, Ch., Guerineau, M., Colnaghi, R., Vidot, S., Marek, J., Bathula, S. R., Lehmann, A. R., Palecek, J. 2011. Interactions between the Nse3 and Nse4 Components of the SMC5-6 Complex Identify Evolutionarily Conserved Interactions between MAGE and EID Families. PLoS One 6: 17270. Chibuk, T. K., Bischof, J. M., Wevrick, R. 2001. A necdin/MAGE-like gene in the chromosome 15 autism susceptibility region: expression, imprinting, and mapping of the human and mouse orthologues. BMC Genet. 2: 22. Cho, H. J., Caballero, O. L., Gnjatic, S., Andrade, V. C. C., Colleoni, G. W., Vektore, A. L., Outtz, H. H., Fortunato, S., Altorki1, N., Ferrera1, C. A., Chua, R., Jungbluth, A. A., Chen, Y. T., Old, L. J., Simpson, A. J. G. 2006. Physical interaction of two cancertestis antigens, MAGE-C1 (CT7) and NY-ESO-1 (CT6). Cancer Immunity 6: 12. Chomez, P., De Backer, O., Bertrand, M., De Plaen, E., Boon, T., Lucas, S. 2001. An overview of the MAGE gene family with the identification of all human members of the family. Cancer Res 61: 5544-5551. Isles, A. R., Wilkinson, L. S. 2000. Imprinted genes, cognition and behaviour. Trends Cogn. Sci. 4: 309–318. Jay, P., Rougeulle, C., Massacrier, A., Moncla, A., Mattei, M. G., Malzac, P., Roeckel, N., Taviaux, S., Lefranc, J. L., Cau, P., Berta, P., Lalande, M., Muscatelli, F. 1997. The human necdin gene, NDN, is maternally imprinted and located in the Prader-Willi syndrome chromosomal region. Nat. Genet. 17: 357–361. Kallio, P. J., Wilson, W. J., O'Brien, S., Makino, Y., Poellinger, L. 1999. Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor 1alpha by the ubiquitin-proteasome pathway. J Biol Chem 274: 6519-25. Kawano, Y., Sasaki, M., Nakahira, K., Yoshimine, T., Shimizu, K., Wada H., Ikenaka, K. 2001. Structural characterization and chromosomal localization of the MAGE-E1 gene. Gene 277: 129–137. Kuwako, K., Taniura, H., Yoshikawa, K. 2004. Necdin-related MAGE proteins differentially interact with the E2F1 transcription factor and the p75 neurotrophin receptor. J Biol Chem. 279 :1703-12. Laduron, S., Deplus, R., Zhou, S., Kholmanskikh, O., Godelaine, D., De Smet, C., Hayward, S.D., Fuks, F., Boon, T., De Plaen, E. 2004. MAGE-A1 interacts with adaptor SKIP and the deacetylase HDAC1 to repress transcription. Nucleic Acids Res 32: 4340-50. - 31 -

Lamkanfi, M., Kala,i M., Vandenabeele, P. 2004. Caspase-12: an overview, Cell. Death. Differ. 11: 365–368. Li, J., Tsai, M. D. 2002. Novel insights into the INK4-CDK4/6-Rb pathway: counter action of gankyrin against INK4 proteins regulates the CDK4-mediated phosphorylation of Rb. Biochemistry 41: 3977-8339. Lopez-Sanchez, N., Gonzalez-Fernandez, Z., Niinobe, M., Yoshikawa, K., Frade, J. M. 2007. A single Mage gene in the chicken genome encodes CMAGE, a protein with functional similarities to mammalian type II MAGE proteins. Physiol Genomics 30: 156–171. Lorick, K. L., Jensen, J. P., Fang, S., Ong, A. M., Hatakeyama, S., and Weissman, A. M. 1999. RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11364–11369. Loriot, A., De Plaen, E., Boon, T., De Smet, C. 2006 Transient down-regulation of DNMT1 methyl transferase leads to activation and stable hypomethylation of MAGE-A1 in melanoma cells. J Biol Chem 281: 10118–26. Losada, A., Hirano, T. 2005. Dynamic molecular linkers of the genome: the first decade of Smc proteins. Genes Dev. 19: 1269 – 1287. Lucas, S., Brasseur, F., Boon, T. 1999. A new MAGE gene with ubiquitous expression does not code for known MAGE antigens recognized by T cells. Cancer Res. 59: 4100–4103. Lucas, S., De Plaen, E., Boon, T. 2000. MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2 and MAGEC3: four new members of the MAGE family with tumor-specific expression. Int. J. Cancer, 87: 55–60. Lucas, S., De Smet, C., Arden, K. C., Viars, C. S., Lethe´, B., Lurquin, C., Boon, T. 1998. Identification of a new MAGE gene with tumor-specific expression by representational difference analysis. Cancer Res., 58: 743–752. Lurquin, C. De Smet, C., Brasseur, F., Muscatelli, F., Martelange, V., De Plaen, E., Brasseur, R., Monaco, A. P., Boon, T. 1997. Two members of the human MAGEB gene family located in Xp21.3 are expressed in tumors of various histological origins. Genomics 46:397–408. MacLellan, W. R., Xiao, G., Abdellatif, M., Schneider, M. D. 2000. A novel Rb- and p300binding protein inhibits transactivation by MyoD. Mol Cell Biol 20:8903–8915. Marcar, L., MacLaine, N. J., Hupp, T. R., Meek, D. W. 2010. Mage-A cancer/testis antigens inhibit p53 function by blocking its interaction with chromatin. Cancer Res. 70: 10362-70 Marchand, M., van Baren, N., Weynants, P., Brichard, V., Dre´no, B., Tessier, M-H., Rankin, E., Parmiani, G., Arienti, F., Humblet, Y., Bourlond, A., Vanwijck, R., Lie´nard, D., Beauduin, M., Dietrich, P. Y., Russo, V., Kerger, J., Masucci, G., Ja¨ger, E., De Greve, J., Atzpodien, J., Brasseur, F., Coulie, P. G., Van der Bruggen, P., Boon, T. 1999. Tumor regressions observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by gene MAGE-3 and presented by HLA-A1. - 32 -

Int. J. Cancer 80: 219–230. Martínez, A., Olarte, I., Mergold, M. A., Gutierrez, M., Rozen, E., Collazo, J., AmancioChassin, O., Ordóñez, R. M., Montesinos, J. J., Mayani, H., McCurdy, D. K., Ostrosky-Wegman, P., Garrido-Guerrero, E., Miranda, E. I. 2007. mRNA expression of MAGE-A3 gene in leukemia cells. Leukemia Res 31: 33–7. Maruyama, K., Usami, M., Aizawa, T., Yoshikawa, K. 1991. A novel brain-specific mRNA encoding nuclear protein (necdin) expressed in neurally differentiated embryonal carcinoma cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178: 291–296. Masuda, Y., Sasaki, A., Shibuya, H., Ueno, N., Ikeda, K., Watanabe, K. 2001. Dlxin-1, a novel protein that binds Dlx5 and regulates its transcriptional function. J Biol Chem 276: 5331–5338. Miyake, S., Sellers, W. R., Safran, M., Li, X., Zhao, W., Grossman, S. R., Gan, J., DeCaprio, J. A., Adams, P. D., Kaelin, W. G. Jr. 2000. Cells degrade a novel inhibitor of differentiation with E1A-like properties upon exiting the cell cycle. Mol Cell Biol 20:8889-8902. Monte, M., Simonatto, M., Peche, L. Y., Bublik, D. R., Gobessi, S., Pierotti, M. A., Rodolfo, M., Schneider, C. 2006. MAGE-A tumor antigens target p53 transactivation function through histone deacetylase recruitment and confer resistance to chemotherapeutic agents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 11160–11165. Morishima, N., Nakanishi, K., Takenouchi, H., Shibata, T., Yasuhiko, Y. 2002. An endoplasmic reticulum stress-specific caspase cascade in apoptosis. Cytochrome cindependent activation of caspase-9 by caspase-12. J. Biol. Chem. 277: 34287–34294. Muscatelli, F., Walker, A. P., De Plaen, E., Stafford, A. N., Monaco, A. P. 1995. Isolation and characterization of a new MAGE gene family in the Xp21.3 region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4987–4991. Nagao, T., Higashitsuji, H., Nonoguchi, K., Sakurai, T., Dawson, S., Mayer, R. J., Itoh, K., Fujita, J. 2003. MAGE-A4 interacts with the liver oncoprotein gankyrin and suppresses its tumorigenic activity. J. Biol. Chem. 278: 10668–10674. Nakada, Y., Taniura, H., Uetsuki, T., Yoshikawa, K. 2000. Characterization and chromosomal mapping of a human necdin pseudogene. Gene 245: 185–191. Nakagawa, T., Zhu, H., Morishima, N., Li, E., Xu, J., Yankner, B. A., Yuan, J. 2000. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta. Nature 403: 98–103. Nasmyth, K., Haering, C. H. 2005. The structure and function of SMC and kleisin complexes. Annu. Rev. Biochem 74: 595 – 648. Nishimura, I., Shimizu, S., Sakoda, J. Y., Yoshikawa, K. 2007. Expression of Drosophila MAGE gene encoding a necdin homologous protein in postembryonic neurogenesis. Gene Expr Patterns 7: 244–251.

- 33 -

Ono, T., Losada, A., Hirano, M., Myers, M. P., Neuwald, A. F., Hirano, T. 2003. Differential contributions of condensin I and condensin II to mitotic chromosome architecture in vertebrate cells. Cell. 115: 109 – 21. Osterlund, C., Tohonen, V., Forslund, K. O., Nordqvist, K. 2000. Mage-b4, a novel melanoma antigen (MAGE) gene specifically expressed during germ cell differentiation. Cancer Res. 60: 1054–1061. Palecek, J., Vidot, S., Feng, M., Doherty, A. J., and Lehman, A. R. 2006. The Smc5-Smc6 DNA repair komplex bringing of the Smc5-Smc6 heads by the kleisin, Nse4, and nonkleisin subunits. J. Biol. Chem. 281: 36952 – 36959. Park, T. J., Kim, H. S., Byun, K. H., Jang, J. J., Lee, Y. S., Lim, I. K. 2001. Sequential changes in hepatocarcinogenesis induced by diethylnitrosamine plus thioacetamide in Fischer 344 rats: induction of gankyrin expression in liver fibrosis, pRB degradation in cirrhosis, and methylation of p16(INK4A) exon 1 in hepatocellular carcinoma. Mol Carcinog 30: 138-150. Pebernard, S., McDonald, W. H., Pavlova, Y., Yates III, J. R., Boddy, M. N. 2004. Nse1, Nse2 and novel subunit of the Smc5-Smc6 complex, Nse3, play a crucial role in meiosis. Mol. Cell Biol. 15: 4866 – 4876. Pebernard, S., Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. 2008. Nse1 RINGlike domain supports functions of the Smc5-Smc6 holocomplex in genome stability. Mol. Biol. Cell 19: 4099–4109. Pebernard, S., Wohlschlegel, J., McDonald, W. H., Yates, J. R., 3rd, Boddy, M. N. 2006 The Nse5-Nse6 dimer mediates DNA repair roles of the Smc5-Smc6 complex. Mol Cell Biol 26: 1617–1630. Rogner, U. C., Wilke, K., Steck, E., Korn, B., Poustka, A. 1995. The melanoma antigen gene (MAGE) family is clustered in the chromosomal band Xq28. Genomics, 29: 725–731. Saburi, S., Nadano, D., Akama, T. O., Hirama, K., Yamanouchi, K., Naito, K., Tojo, H., Tachi, C., Fukuda, M. N. 2001. The trophinin gene encodes a novel group of MAGE proteins, magphinins, and regulates cell proliferation during gametogenesis in the mouse. J. Biol. Chem. 276: 49378–49389. Sakurai, T., Itoh, K., Higashitsuji, H., Nagao, T., Nonoguchi, K., Chiba, T., Fujita, J. 2004. A cleaved form of MAGE-A4 binds to Miz-1 and induces apoptosis in human cells. J. Biol. Chem. 279: 15505–15514. Salehi, A. H., Roux, P. P., Kubu, C. J., Zeindler, C., Bhakar, A., Tannis, L. L., Verdi, J. M., Barker, P. A. 2000. NRAGE, a novel MAGE protein, interacts with the p75 neurotrophin receptor and facilitates nerve growth factor-dependent apoptosis. Neuron 27: 279–288.

Sang, M., Wang, L., Ding, Ch., Zhou, X., Wang, B., Wang, L., Lian, Y., Shan, B. 2010. Melanoma-associated antigen genes - An update. Cancer Lett. 302:85-90.

- 34 -

Scanlan, M. J., Simpson, A. J., and Old, L. J. 2004. The cancer/testis genes: review, standardization, and commentary. Cancer Immun. 4: 1. Sergeant, J., Taylor, E., Palecek, J., Fousteri, M., Andrews, E., Sweeney, S., Shinagawa, H., Watts, F. Z., Lehmann, A. R. 2005. Composition and architecture of the Schizosaccharomyces pombe Rad18 (Smc5-6) complex. Mol Cell Biol 25: 172–184. Schubert, V. 2009. SMC proteins and their multiple functions in higher plants. Cytogenet Genome Res 124: 202–214. Schlieffer, J., Kaitna, S., Maurer-Stroh, S., Glotzer, M., Nasmyth, K., Eisenhaber, F. 2003. Kleisins: a superfamily of bacterial and eukaryotic SMC protein partners. Mol. Cell 11: 571 – 575. Stone, B., Schummer, M., Paley, P. J., Crawforda, M., Forda, M., Urband, N., Nelson, B. H. 2001. MAGE-F1, a novel ubiquitously expressed member of the MAGE superfamily. Gene 267: 173-182. Suzuki, N., Nadano, D., Paria, B. C., Kupriyanov, S., Sugihara, K., Fukuda, M. N. 2000. Trophinin expression in the mouse uterus coincides with implantation and is hormonally regulated but not induced by implanting blastocysts. Endocrinology 141:4247–4254. Suzuki, N., Zara, J., Sato, T., Ong, E., Bakhiet, N., Oshima, R. G., Watson, K. L., Fukuda, M. N. 1998. A cytoplasmic protein, bystin, interacts with trophinin, tastin, and cytokeratin and may be involved in trophinin-mediated cell adhesion between trophoblast and endometrial epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 5027–5032. Takahashi, K., Shichijo, S., Noguchi, M., Hirohata, M., Itoh, K. 1995. Identification of MAGE-1 and MAGE-4 proteins in spermatogonia and primary spermatocytes of testi. Cancer Res. 55: 3478–3482. Taniura, H., Matsumoto, K., Yoshikawa, K. 1999. Physical and functional interactions of neuronal growth suppressor necdin with p53. J. Biol. Chem. 274: 16242–16248. Taniura, H., Taniguchi, N., Hara, M., Yoshikawa, K. 1998. Necdin, a postmitotic neuronspecific growth suppressor, interacts with viral transforming proteins and cellular transcription factor E2F1. J. Biol. Chem. 273: 720–728. Taylor, E. M., Copsey, A. C., Hudson, J. J. R., Vidot, S., Lehmann, A. R. 2008. Identification of the Proteins, Including MAGEG1, That Make Up the Human SMC5-6 Protein Complex. Mol. Cell. Biol. 28: 1197-1206. Tyagi, P., Mirakhur, B. 2009. MAGRIT: the largest-ever phase III lung cancor trial aims to establish a novel tumor-specific approach to therapy, Clin. Lung Cancer 10: 371–374. van der Bruggen, P., Traversari, C., Chomez, P., Lurquin, C., De Plaen, E., Van den Eynde, B., Knuth, A., Boon, T. 1991. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643-1647. Vansteenkiste, J., Zielinski, M., Linder, A. 2007. Final results of a multi-center, double blind,

- 35 -

randomized placebo controlled Phase II study to assess the efficacy of MAGE-A3 immunotherapeutic as adjuvant therapy in stage IB/II Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). J Clin Oncol 25:7554. Wang, C., Ivanov, A., Chen, L., Fredericks, W. J., Seto, E., Rauscher, F. J. 3rd, Chen, J. 2005. MDM2 interaction with nuclear corepressor KAP1 contributes to p53 inactivation. EMBO J 24: 3279–90. Wang, G. L., Semenza, G. L. 1995. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 270: 1230-7. Wang, J., Maldonado, M. A. 2006. The ubiquitin-proteasome system and its role in inflammatory and autoimmune diseases. Cell Mol Immunol. 3:255-61. Williams, M. E., Strickland, P., Watanabe, K., Hinck, L. 2003. UNC5H1 induces apoptosis via its juxtamembrane region through an interaction with NRAGE. J. Biol. Chem. 278: 17483–17490. Xiao, J., Chen, H. S. 2004. Bilogical functions of melanoma-associated antigens. World J. Gastroenterol. 10: 1849 – 1853. Yang, B., O’Herrin, S. M., Wu, J., Reagan-Shaw, S., Ma, Y., Bhat, K. M., Gravekamp, C., Setaluri, V., Peters, N., Hoffmann, F. M., Peng, H., Ivanov, A. V., Simpson, A. J. G., Longley, B. J. 2007. MAGE-A, mMage-b, and MAGE-C proteins form complexes with KAP1 and suppress p53-dependent apoptosis in MAGE-positive cell lines. Cancer Res. 67: 9954–9962. Yoshikawa K. 2000. Cell cycle regulators in neural stem cells and postmitotic neurons. Neurosci. Res. 37: 1–14. Zhao, X., Blobel, G. 2005. A SUMO ligase is part of a nuclear multiprotein complex that affects DNA repair and chromosomal organization. Proc Natl Acad Sci USA 102: 4777– 47782.

- 36 -

PŘÍLOHY

- 37 -

Tabulka 1: Lidské a myšší MAGE proteiny. T: Exprimovaný pouze v nádorových a pohlavních buňkách; P: Pseudogeny; N: Exprimováný v normálních buňkách; -: Neznámá exprimace (převzato a upraveno z Chomez et al., 2001) Typ I skupina MAGE-A

MAGE-B

MAGE-C

protein MAGE-A1 MAGE-A2 MAGE-A3 MAGE-A4 MAGE-A5 MAGE-A6 MAGE-A7 MAGE-A8 MAGE-A9 MAGE-A10 MAGE-A11 MAGE-A12 MAGE-A13 MAGE-A14 MAGE-A15 MAGE-B1 MAGE-B2 MAGE-B3 MAGE-B4 MAGE-B5 MAGE-B6 MAGE-B7 MAGE-B8 MAGE-B9 MAGE-B10 MAGE-B11 MAGE-B12 MAGE-B13 MAGE-B14 MAGE-B15 MAGE-B16 MAGE-B17 MAGE-C1 MAGE-C2 MAGE-C3 MAGE-C4 MAGE-C5 MAGE-C6 MAGE-C7

výskyt T T T T T T P T T T T T P P P T T T T T T P P P T P P P P P T T T T T T P P P

Typ II skupina MAGE-D

MAGE-E

MAGE-F MAGE-G MAGE-H MAGE-I MAGE-J MAGE-K MAGEL-2 necdin

protein MAGE-D1 MAGE-D2 MAGE-D3 MAGE-D4 MAGE-E1 MAGE-E2 MAGE-E3 MAGE-F1 MAGE-G1 MAGE-H1 MAGE-I1 MAGE-I2 MAGE-J1 MAGE-K1 MAGE-L2 necdin

výskyt N N N N N N N N N N P P P P N N