Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 65 – 69, 2008 Yudi Rinanto
Fraksi aktif antijamur Candida albicans dari ekstrak metanolik bunga kamilen (Matricaria chamomilla, L) Anti-fungal active fraction to Candida albicans from methanolic extract of camilen flowers (Matricaria chamomilla, L.) Yudi Rinanto 1 *), Titik Sunarni 1) dan Bambang Iskamto 2) 1) 2)
Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta Fakultas Biologi, Universitas Setia Budi Surakarta
Abstrak Bunga kamilen (Matricaria chamomilla, L.) digunakan sebagai obat tradisional diantaranya sebagai antijamur. Penelitian awal menunjukkan ekstrak bunga aktif menghambat Candida albicans. Untuk mengetahui fraksi aktifnya, telah dilakukan diisolasi berdasarkan metode bioactive-guided fractionation. Serbuk bunga kering diekstraksi dengan metanol. Ekstrak metanolik difraksinasi dengan n-heksana, kloroform dan etil asetat. Fraksi n-heksan dilakukan kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan silika gel H 60 fase gerak n-heksan : etil asetat dan kloroform : metanol dengan peningkatan polaritas. Fraksi hasil KCV dipisahkan secara KLT preparatif dengan fase diam silika gel GF254 fase gerak n-heksan : kloroform (1:1). Uji aktivitas terhadap Candida albicans dilakukan secara difusi. Berdasarkan atas data KLT fraksi-fraksi hasil KCV digabung menjadi 9 fraksi (FK 1-9) dan Fraksi FK-3 paling aktif terhadap Candida albicans. Hasil KLT preparatif dari FK-3 diperoleh 5 subfraksi (FP 1-5) dan subfraksi yang paling aktif adalah FP-3 dan FP-5 dengan diameter daerah hambatan radikal 18 mm pada konsentrasi 3%. Kata kunci:Kamilen (Matricaria chamomilla, L), Candida albicans, antijamur.
Abstract The flowers of kamilen (Matricaria chamomilla, L.) has been used as antifungal in Indonesian traditional medicines. Previous study showed that the extract of flowers inhibited Candida albicans activity. In order to determine the active fraction, the using bioactive-guided fractionation method was used. The air-dried flowers was extracted from methanol. Methanolic extract was fractionated by using n-hexane, chloroform and ethyl acetate. n-Hexane fraction was separated by vacuum liquid chromatography (VLC) by busing silica gel H 60 with mobile phase n-heksan : ethyl acetate and chloroform : methanol by gradient polarity. VLC results fraction was separated by preparative thin layer chromatography with silica gel GF254 and mobile phase n-hexane : chloroform (1:1). The anti-fungal activities of Candida albicans was done by difuse method. Based on the TLC appearence , nine fractions were obtained (FK 1-9) from VLC, and FK-3 was the most active fraction in inhibiting Candida albicans. The result from preparative TLC of FK-3 was 5 subfractions (FP 1-5) Subfraction FP-3 and FP-5 were most active. that had inhibiting radical zone diameter 18 mm in 3% consentration. Key words : Kamilen ( Matricia chamomila, L), Candida albicans, anti-fungal.
Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 2008
65
Fraksi aktif antijamur Candida................
Pendahuluan Telah diketahui berdasarkan penelitian sebelumnya ekstrak etanolik bunga kamilen berpotensi sebagai anti jamur Candida albicans (Ratnasari, 2005). Tanaman kamilen (Matricaria chamomilla L.) termasuk suku Asteraceae. Tanaman berbentuk herba tahunan, tinggi mencapai 60 cm, dengan bunga majemuk, tepi bunga berwarna putih dan banyak ditanam sebagai tanaman hias. Bunga kamilen banyak mengandung senyawa kimia saponin, polifenol, tannin dan flavonoid. Kelompok senyawa flavonoid berfungsi sebagai anti jamur (Robinson, 1995). Senyawa fenol dan derivatnya merupakan senyawa anti kuman yang dapat menimbulkan denaturasi protein dan merusak membran sel (Jawetz, 1986), sedangkan senyawa saponin dapat menghambat pertumbuhan jamur melalui mekanisme menurunkan tegangan permukaan. Belum ada bukti ilmiah apakah senyawa yang terkandung dalam bunga kamilen juga dapat berfungsi sebagai anti jamur khususnya Candida albicans. Metodologi Bahan
Bunga kamilen diperoleh dari BPTO tawangmangu. Bahan kimia yang digunakan untuk isolasi senyawa non-protein meliputi metanol, n-heksana, kloroform, n-butanol, etil asetat, silika gel GF254, silika gel H 60, selulosa, asam sitrat, asam borat, asam sulfat, amonium hidroksida, anisaldehida, besi (III) klorida. Media Sabouroud Glucose Cair ( SGC), Sabouroud Glucosa Agar (SGA), Mueller Hinton Agar, Standar barrium sulfat, garam fisiologis steril untuk uji aktivitas anti jamur. Alat
Alat maserasi, timbangan analitik, corong pisah, seperangkat alat kromatografi kolom vakum, penangas air, mikro pipet, Laminar air flow, autovortex mixer, vaccum evaporator, kolom gelas, petridish, tabung reaksi, jarum ose dan pinset. Jalannya penelitian Pembuatan ekstrak metanolik
Serbuk bunga kamilen 500 gram dilakukan maserasi dengan 4,75 liter metanol. Filtrat dipisahkan dengan penyaringan dan selanjutnya diuapkan dengan pengurangan tekanan.
66
Fraksinasi ekstrak metanolik
Sebanyak 10 gram ekstrak metanolik disuspensikan dengan 100 mL air dan selanjutnya dipartisi secara bertingkat berturut-turut dengan n-heksana, kloroform dan etil asetat untuk mendapatkan fraksi n-heksana, kloroform, eter dan air. Masing-masing fraksi diuapkan dengan pengurangan tekanan kecuali fraksi air diuapkan di atas penangas air. Fraksi kering yang diperoleh dilarutkan untuk dilakukan uji daya hambat terhadap Candida albicans. Fraksinasi dengan Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Fraksi aktif terhadap Candida albicans dilakukan pemisahan secara KCV sesuai metode yang dilakukan Alam dkk (2001) dengan sedikit modifikasi. Fraksi aktif 7,5 g dilarutkan dengan 10 mL eter dan dikeringkan dengan silika gel GF254. Pengepakan kolom dilakukan dengan memasukkan 20 g silika gel kering dalam sinter glass pada kondisi vakum. Serbuk ekstrak ditaburkan merata pada bagian atas kolom yang sudah termampatkan. Kertas saring diletakkan diatas serbuk ekstrak dan selanjutnya eluasi diawali dengan n-heksana 100%, pompa vakum dialirkan secara perlahan hingga seluruh eluen keluar, ditampung dalam wadah dan dilanjutkan dengan fase gerak campuran n-heksana etil asetat dan kloroform : metanol dengan peningkatan polaritas secara bertahap. Fraksi dengan profil kromatogram yang sama dikumpulkan, kemudian dikeringkan untuk selanjutnya dilakukan uji aktivitas terhadap Candida albicans. Fraksinasi dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
Fraksi hasil KCV yang mempunyai daya hambat terbesar terhadap Candida albicans dilakukan pemisahan secara KLTP. Fraksi aktif ditotolkan pada lempeng silika gel GF254 fase gerak n-heksana : kloroform (1 : 1) selanjutnya bercak yang terdeteksi dikerok kemudian masing-masing hasil kerokan dilarutkan dalam n-heksana. Filtrat disaring dan diuapkan untuk mendapatkan fraksi hasil KLTP. Masing-masing fraksi yang diperoleh selanjutnya diuji aktivitasnya terhadap Candida albicans. Uji anti jamur Candida albicans
Pengujian aktivitas dilakukan pada medium Sabouroud Glukosa Agar (SGA) dengan pengerjaan dibawah Laminar Air Flow. Metode uji secara difusi dengan membuat sumuran menggunakan boor drop nomer 2. Medium SGA diolesi suspensi biakan jamur Candida albicans kemudian didiamkan 5 menit. Masing-masing bahan uji pada konsentrasi tertentu diteteskan pada sumuran sebanyak 10 µL, kemudian
Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 2008
Yudi Rinanto
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27 °C. Pengamatan dilakukan dengan melihat besarnya diameter hambat masing-masing fraksi yang diuji.
Hasil uji aktivitas fraksi n-heksana, klorofom, etil asetat dan air terhadap Candida albicans (Tabel II). Berdasarkan luas diameter hambat terhadap Candida albicans menunjukkan bahwa hasil fraksinasi yang menggunakan pelarut n-heksana memberikan daya hambat paling besar (17,0 mm) jika dibandingkan fraksi lain dan kontrol pelarut.
Hasil Dan Pembahasan Ekstraksi dan fraksinasi
Ekstraksi 500 g bunga kamilen dengan metanol menghasilkan ekstrak pekat 30,203 g. Ekstrak metanolik yang diperoleh diambil 9,963 g untuk disuspensikan dengan air dan dipartisikan dengan n-heksana, kloroform, etil asetat. Fraksinasi dengan berbagai pelarut dimaksudkan untuk memisahkan kandungan kimia tanaman kedalam kelompok-kelompok polaritas sesuai pelarut yang digunakan. Hasil yang di peroleh tercantum pada Tabel I.
Hasil Kromatografi Kolom Vakum (KCV) dan uji aktivitasnya
Hasil KCV dari fraksi n-heksana menggunakan fase diam silica gel H 60 dan dielusi fase gerak n-heksana : etil asetat dan kloroform : metanol dengan peningkatan polaritas dan menghasilkan 30 fraksi. Masing-
Tabel I. Hasil fraksinasi Ekstrak etanolik Berat ekstrak metanolik (g) 9,963
Pelarut untuk fraksinasi
Fraksi yang dihasilkan Berat (g) Prosentasi (%) 2,658 26,67 % 1,476 14,82 % 1,610 16,17 % 1,800 18,72 %
n-heksana kloroform etil asetat air
Tabel II. Hasil uji aktivitas fraksi n-heksana, kloroform, etil asetat dan air terhadap Candida albicans Bahan uji Fraksi n-heksana Fraksi kloroform Fraksi etil asetat Fraksi berair Pelarut n-heksana Pelarut kloroform Pelarut etil asetat Pelarut metanol
Larutan uji Konsentrasi Volume uji (µL) 10% 10 10% 10 10% 10 10% 10 Murni 10 Murni 10 Murni 10 Murni 10
Diameter hambat (mm) rata-rata 17,0 11,5 -
Tabel III. Data hasil KCV dan uji aktivitas terhadap Candida albicans Kelompok Fraksi hasil KCV
Berat fraksi kering (g)
FK-1 FK-2 FK-3 FK-4 FK-5 FK-6 FK-7 FK-8 FK-9
0,280 0,199 1,409 1,856 2,025 0,690 0,316 0,250 0,137
Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 2008
Larutan uji Kadar (%)
Volume (µL)
5 5 5 5 5 5 5 5 5
10 10 10 10 10 10 10 10 10
Diameter hambat rata-rata (mm) 20,0 18,0 15,0 18,0 13,0 15,0
67
Fraksi aktif antijamur Candida................
Tabel IV. Data hasil KLTP dan uji aktivitas terhadap Candida albicans Fraksi KLTP FP-1 FP-2 FP-3 FP-4 FP-5
Berat fraksi kering (mg)
Larutan uji Kadar (%)
Volume (µL)
3 3 3 3 3
10 10 10 10 10
59 82 31 51 72
Diameter hambat (mm) 18,0 13,0 10,0 18,0
Tabel V. Hasil uji Kemurnian secara KLT No
Bahan
Fase gerak
Fase diam
1.
FP-2
2.
FP-5
n-heksana : kloroform (1:1) toluen : kloroform (1:1) toluen : kloroform (2:1) toluen : etil asetat (9:1) toluen : kloroform (1:1) toluen : kloroform (1:3)
Silika Gel GF254 Silika Gel GF254 Silika Gel GF254 Silika Gel GF254 Silika Gel GF254 Silika Gel GF254
masing fraksi selanjutnya dikontrol kandungan senyawanya dengan KLT dan fraksi dengan profil kromatogram sama dikumpulkan dan diperoleh sembilan kelompok fraksi yang berbeda. Fraksi hasil KCV (FK 1-9) selanjutnya diuji terhadap Candida albicans. Data hasil KCV dan uji aktivitas (Tabel III). Fraksi hasil KCV yang dilakukan akan dipisahkan lebih lanjut adalah fraksi paling aktif yaitu FK-3. Berdasarkan bercak yang terdeteksi pada sinar UV254 sebagian besar menunjukkan bercak gelap sedangkan pada pemberian uap amoniak tidak menunjukkan perubahan baik secara visible atau dibawah lampu UV maka sampai pada tahap ini dapat disimpulkan bahwa senyawa yang terdeteksi merupakan senyawa dengan gugus kromofor dan bukan golongan polifenol. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) dan uji aktivitasnya
Kromtografi lapis tipis preparatif dilakukan terhadap FK-3 dengan fase gerak n-heksana : kloroform (1 : 1) fase diam silica gel GF254. Hasil KLTP didapatkan lima fraksi dan masing-masing diuji dengan data (Tabel IV). Fraksi hasil KLTP yang akan dilanjutkan untuk identifikasi adalah fraksi paling aktif yaitu FP-2 dan FP-5. Uji kemurnian tahap pertama dilakukan dengan melihat profil kromatogramnya pada beberapa sistem yang berbeda.
68
Jumlah bercak 1 1 3 1 1 1
Kemurnian Belum murni Murni secara KLT
Hasil uji tercantum pada Tabel V. Berdasarkan hasil uji kemurnian secara KLT dengan tiga jenis fase gerak yang berbeda polaritasnya menunjukkan FP-5 murni secara Kromatografi Lapis Tipis, sedangkan FP-2 masih belum menunjukkan kemurnian. Deteksi bercak dibawah lampu UV254 menunjukkan peredaman florescensi dan tidak menujukkan perubahan warna dengan uap amoniak. Berdasarkan daya hambat terhadap Candida albicans dan uji kemurnian terhadap FP-5 maka dapat disimpulkan jika senyawa yang terkandung dalam FP-5 mempunyai aktivitas terhadap Candida albicans. Kesimpulan Senyawa yang terdapat dalam fraksi hasil kromatografi lapis tipis preparatif dari bunga kamilen (FP-5) mempunyai aktivitas terhadap Candida albicans dengan luas daerah hambat 18,0 mm pada konsentrasi 3%. Deteksi bercak dibawah lampu UV254 dan uap amoniak menunjukkan bahwa dalam FP-5 mengandung senyawa dengan gugus kromofor yang bukan golongan polifenol. Ucapan Terima Kasih Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Direktorat Pembina Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Direktorat
Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 2008
Yudi Rinanto
Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Nasional yang telah memberikan bantuan pendanaan melalui program penelitian
Fundamental dengan nomer kontrak: 017/SP3/ PP/DP2M/II/2006, sehingga penelitian ini dapat dilaksanakan.
Daftar Pustaka Alam, G., Wahyuono, S., Hakim, L. dan Gandjar, I.G., 2001, Efek Penghambatan dan Penunjang Kontraksi Trakea (in-vitro) dari Ekstrak n-heksana daun Eugenia caryophyllata Thumb, Majalah Obat Tradisional, volume 6 (8),16 – 23. Choi, S. Z., Choi, S. U. and Lee, K. R., 2004, Phytochemical Constituents of the Aerial Parts from Solidago virga-aurea var. gigantea., Arch. Pharm Res, 27(2), 164-168. Chen, J. J., Chang, Y. L., Teng, C. T., Lin, W. Y, Chen, Y. C. and Chen, I. S., 2000, New Tetra hydroprotoberberine N-Oxide Alkaloid and Anti-platelet Aggregation Constituents of Corydalis tashiroi, Planta Med.,(67), 423-427 Han, Y., Nishibe, S., Noguchi., Y. and Jin, Z., 2001, Flavonol glycosides from the stems of Trigonella foenum-graecum, Phytochemistry, (58), 577-580. Jawetz, E., Melnick, J. L. and Adelberg, E. A, 1986, Mikrobiologi Untuk Profesi Kesehatan, Edisi XVI (terjemahan), EGC Press, Jakarta. Ratnasari, C., 2005, Uji Daya Anti Jamur Ekstrak Bunga Kamilen (Matricaria chamomilla, L.) Secara Soxhletasi dan Maserasi Terhadap Candida albicans, Skripsi, Universitas Setia Budi, Surakarta. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, ITB, Bandung. Tortora, F. C, 2002, Mycrobiology an intruduction media update, Benyamin cummings, San Fransisco, Boston, New York.
* Korespondensi: Yudi Rinanto Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta. Jl. Letjen Sutoyo Mojosongo – SOLO, - 57127, E-mail:
[email protected].
Majalah Farmasi Indonesia, 19(2), 2008
69
