FOTORECEPTOROK ELOSZLÁSA ÉS FEJLŐDÉSE

FOTORECEPTOROK ELOSZLÁSA ÉS FEJLŐDÉSE

Dr. Szepessy Zsuzsanna

Semmelweis Egyetem Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet Budapest 2001

Tartalomjegyzék Összefoglaló......................................................................................................................1 Summary ..........................................................................................................................3 Bevezetés...........................................................................................................................5 A szem fejlődésgenetikai megközelítése .................................................................6 Fotoreceptorok .........................................................................................................8 Színlátás ..........................................................................................10 Célkitűzés .......................................................................................................................15 Irodalmi háttér...............................................................................................................19 A fotoreceptorok eloszlása emlős retinában ..........................................................19 A színspecifikus csapok eloszlása emlős retinában ...............................................21 Heterogenitás a csapok eloszlásában ............................................................23 A térbeli elkülönülés biológiai jelentősége ..................................................28 Az átmeneti zóna ..........................................................................................29 A csapok fejlődése .................................................................................................30 A színspecifikus csapok megjelenési sorrendje............................................30 A csapok fejlődése in vitro ...........................................................................32 Retinatranszplantáció ..........................................................................32 Retinális szövettenyésztés...................................................................33 Az osztott retinájú egér fotoreceptorainak fejlődése ....................................36 A homogén eloszlású patkány retina fotoreceptorainak differenciálódása ..37 Módszerek ......................................................................................................................40 A retinális csapok elkülönítése...............................................................................40 Immuncitokémia ....................................................................................................42 Jelölési módszerek ........................................................................................43 Alkalmazott ellenanyagok......................................................................................44 Lektincitokémia .....................................................................................................46 A kísérleti állatok kiválasztása...............................................................................47 A retina kísérleti előkészítése ................................................................................48 Immuncitokémia és lektincitokémia alkalmazása..................................................49 Kiértékelés .............................................................................................................50 Számítógéppel segített feldolgozási folyamat ..............................................50 Eredmények ...................................................................................................................53 A nyúl retinájának vizsgálati eredményei ..............................................................53 A denevér retinájának vizsgálati eredményei ........................................................61 Megbeszélés ....................................................................................................................64 A fotoreceptor-sejtek “születése”...........................................................................64 A főemlősök fotoreceptorainak eloszlása ..............................................................65 A fovea fejlődése ...................................................................................................67 A színlátás hibái .....................................................................................................69 Retinális degenerációk ...........................................................................................70

A retinatranszplantáció kérdései ............................................................................71 Két “út” a csapok differenciálódásában .................................................................72 A látópigment koexpresszió tér- és időbeli összehasonlítása ................................74 Köszönetnyilvánítás.......................................................................................................76 Irodalomjegyzék ............................................................................................................77 Előadások, poszterek .....................................................................................................89 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények ..............................................91

Összefoglaló A színlátást különböző látópigmenteket tartalmazó fotoreceptor-típusok határozzák meg. A fotoreceptorok közötti morfológiai és biokémiai különbségek lehetőséget adnak arra, hogy emlősökben feltérképezzük a színspecifikus csapok eloszlását. Az immuncitokémia, a spektrális érzékenység alapján, láthatóvá teszi a változatos csap-mintázatokat. Fontos kérdés, ezen csap-mozaikok fejlődése. A retinakutatásban széleskörben használt állatot, a nyulat választottuk ki, hogy a csaptípusok (rövidullám- és közép/hosszúhullám-érzékeny) differenciálódását, digitális képfeldolgozás segítségével, tanulmányozzuk fejlődő retinában. Vajon a fejlődő patkány és mongolhörcsög retinájában kimutatott időbeli, átmeneti látópigment koexpresszió általános érvényű valamennyi emlősben? A kérdés vizsgálatára két monoklonális látópigment-ellenes antitestet (COS-1 és OS-2) alkalmaztunk retinális wholemountokon és tangenciális sorozatmetszeteken. A COS-1 ellenanyag a közép- és hosszúhullám-érzékeny csapokra specifikus, míg az OS-2 a kék csapokat jelöli meg. A látópigmentek megjelenési sorrendje az egyedfejlődés során megegyezett azzal, amit az eddig vizsgált emlősökben találtak. Az első immunopozitív fotoreceptorok a pálcikák voltak. Az immunopozitív rövidhullám-érzékeny (S) csapok jelentek meg ezután, a 2.-3. posztnatális napon, és a közép/hosszúhullám-érzékeny (M/L) csapok alakultak ki utoljára. Fejlődő nyúl retinában átmeneti látópigment koexpressziót nem sikerült kimutatni. A csapok differenciálódása vizsgálataink szerint két különböző úton valósulhat meg. Az egyik lehetőség a csapok fejlődésére a transzdifferenciálódás. Először a fiatal posztnatális retinában minden csap S pigmentet termel, majd ezek közül sok csap a másik (M) pigmentet kezdi expresszálni. Egy ideig mindkét látópigment megtalálható ugyanabban a sejtben. Ezekből az ún. “kettős csapokból”, alakulnak ki a definitív zöld csapok, miután a kék fotopigmentek eltűnnek a kültagokból. Néhány csap azonban nem alakul át, hanem megőrzi a kék pigment termelését az egész élet folyamán, rövidhullámérzékeny marad. A másik útja a csapok fejlődésének transzdifferenciálódás nélkül zajlik le. Nem fordulnak elő kettős csapok, minden csap a látópigment-expresszió első pillanatától kezdve vagy csak S pigmentet vagy csak M pigmentet termel.

A nyúl mellett a gyümölcsevő Megachiroptera alrend denevérfajainak retináit is tanulmányoztuk. Ezen fajok fotoreceptor rétegének bel- és kültagjai nem egy síkban helyezkednek el, hanem sajátos kriptákat alkotnak. Lehetséges, hogy a retina ezen follikuláris szerveződése elsősorban a környezet fény-periodicitásának érzékelésére szolgál, mivel a “gyűrt” retina kétdimenziós képek dekódolására nyilvánvalóan nem képes.

Summary Color vision is mediated by photoreceptor cell classes housing different visual pigments. The differences of morphological and biochemical characteristics between various photoreceptor types enable us to map the distribution of color-specific cones across the retina. Immunocytochemistry provides a means to distinguish among spectrally different cone types. This method has revealed the occurence of various photoreceptor distribution patterns in mammals. An important question is the development of various cone mosaics. The rabbit, an animal widely used in retinal research was selected. The differentiation of short-wave and middle-to-long-wave sensitive cone types was studied with digital image processing in the developing rabbit retina. The primary goal of our investigations was to decide whether the temporary coexpression of cone visual pigments in the developing rat and gerbil retina is a universal feature of all mammals. Immuncytochemistry with two monoclonal anti-visual pigment antibodies, COS-1 and OS-2, respectively, was used on retinal wholemounts and consecutive tangential semithin sections. COS-1 is specific for middle-to-long (M/L) wave sensitive cones, whereas OS-2 selectively labels the short (S) wave sensitive cones. The sequence in which the visual pigments start to be expressed is the same as that observed in other mammals. The first immunopositive cells to appear were the rods. Immunopositive S-cones appeared on the 2nd-3rd postnatal days, and M/L-cones were the latest photoreceptor elements to be detected. No visual pigment coexpression was observed in the developing rabbit retina. Two different basic mechanisms are proposed for the differentiation of the cone types. One possible mechanism of cone development is via transdifferentiation. At first, in the early postnatal retina all cones contain only S pigment, then most of these cones start to express the other (M) photopigment. Temporarily, both pigments are present in the same cell. These cones are identified as “dual cones”. The dual cones turn to be definitive green cones, after the blue pigment disappears from the outer segments. Some cones still keep producing blue pigment throughout their lifetime. These latter cones that do not undergo the shift give the definitive shortwave-sensitive cones. The other

way, in which cones can develop is without transdifferentiation. There are no dual cones at any time in the juvenile animals of these species. All cones are predestined to be either S cones or M cones. Besides of the rabbit, the retina of the Megachiroptean fruit eating bats was studied. The retina of these species forms folds and crypts in its photoreceptor layer. Since a folded photoreceptor layer is obviously not viable for decoding two-dimensional images, we suppose that this organization serves for a photometer task of the eye.

Bevezetés A fénynek kitüntetett szerepe van az élőlények életében. Már a növények és a legalacsonyabb rendű állatok is képesek a fény érzékelésére. Jól ismert a növények fototaxisa, illetve az egysejtű állatok sejtplazma mozgása fény hatására. Az alacsonyabbrendű soksejtű élőlényekben (pl. egyes csalánozók, gyűrűsférgek, kagylók, tüskésbőrűek) a fényinger felvételét a kültakaróban elszórtan elhelyezkedő látósejtek végzik. Ezek a sejtek a fénynek kitett testfelszíneken vagy a test egészén megtalálhatók, azonban csak a fény intenzitásbeli különbségének elkülönítésére teszik alkalmassá az állatot. A fejlődés során a látósejtek csoportokba rendeződnek. Szerkezeti, működési egységet hoznak létre; ez lesz a retina, amelyre a külvilág képe vetül. Kiegészülve más sejtekkel és segédszervekkel létrejön a látószerv, a szem. A törzsfejlődés során fénylátásra (szemfolt), iránylátásra (pigmentkehelyszem, serlegszem) és képlátásra (hólyagszem, összetett szem) alkalmas szemtípusok alakultak ki. A csalánozók az első törzs, amelynek néhány faja már rendelkezik komplex fényfelfogó szervvel. A polip fajokban általában az epidermiszben még szétszórtan elhelyezkedő neuroszenzoros sejtek szolgálják a fényfelfogást. Más csalánozóknál, egyes medúzákon, már kifelé dudorodó érzékpárnát: pigmentfolt-ocellust, vagy ennek az epidermiszrésznek a mélybe süllyedt változatát, a serlegszemet találjuk. Itt figyelhető meg először a receptorsejtek és pigmentsejtek váltakozó elhelyezkedése, ami egyszerű formája lehet a retinának. Evolúciós szempontból fontos, hogy mikor jelenik meg az ún. inverz szem, amikor a fénynek az egész retinán át kell haladnia, mert az ideghártya fényérzékeny része a pigmentsejtek felé néz. Ez a laposférgek pigmentkehelyszeménél figyelhető meg először, ahol a pigmentsejtek kehelyszerűen veszik körül a látósejteket és csak bizonyos irányból jövő fénysugarat érzékelhetnek. A legfejlettebb, képalkotásra alkalmas szemtípusok az összetett szem és a hólyagszem. Az összetett szem az ízeltlábúak törzsére jellemző. Egységei az ommatidiumok, amelyekből egy-egy szemben fajtól függően néhány vagy több ezer darab található meg. Mindenegyes ommatidium rendelkezik egy fénytörő (kitinlencse, kristálykúp) és egy fényfelfogó résszel, amelyeket pigmentsejtek (pigmentköpeny) választanak el egymástól [113]. A

hólyagszem egyszerűbb formája a gyűrűsférgeken jelenik meg, legfejlettebb típusai pedig a puhatestűeken és a gerincesekben találhatók meg.

A szem fejlődésgenetikai megközelítése Az

elmúlt

évtized

molekuláris

biológiai

kutatásainak

eredményei

megváltoztatták az élővilág fényérzékelő szerveinek fejlődéséről, evolúciójáról alkotott képet. A látórendszer fejlődésének fontos kérdése az, hogy egyetlen közös őstől származnak-e a különböző szemtípusok. Sokáig azt tételezték fel, hogy az evolúció során egymástól függetlenül, mintegy negyven különböző ősből jöttek létre az élővilágban előforduló fényérzékelő szervek. Többen azonban a monofiletikus elméletet hangoztatták, azaz a közös őstől származást. Ezt az a tény is alátámasztja, hogy a fény feldolgozása, a jelátvitel, minden élőlényben ugyanúgy zajlik. Az opszin fehérjét a retinál molekulával minden szemben megtalálhatjuk. Az igazán meggyőző ok, amely miatt ma már a monofiletikus eredetet fogadják el, hogy az egész élővilágban a látórendszer fejlődését azonos szabályozó gének irányítják. A legújabb molekuláris biológiai kutatások is ezt bizonyítják. Az egyes fejlődési szakaszokért felelős gének az evolúció évmilliói alatt megmaradtak, konzerválódtak [70]. Az utóbbi évek eredményei közé tartozik, hogy fény derült az oculogenesisben jelentős szerepet játszó homeobox-gének feladatára. A homeobox-gének rendelkeznek egy 180 bázispárból álló szakasszal, amely egy 60 aminosavból álló homeodomént kódol. Ez a szakasz, a DNS molekulához tud kapcsolódni, azaz transzkripciós faktorként működik [42]. Ezen gének között nagyfokú hasonlóságot sikerült kimutatni az evolúció során már korán elkülönült fajok esetében is. A szem fejlődésbiológiájának tanulmányozására az ecetmuslicát (Drosophila melanogaster) használják széles körben. Ez a faj ideális modellje a fejlődésbiológiai kutatásoknak, mert nagyon szapora, sok utód származhat egy pártól, az egyedek olcsón, egyszerűen fenntarthatók. Összesen négy kromoszómájuk van, tehát genomjuk igen kicsi, ezért is kedvezően használhatók genetikai vizsgálatokban. A Drosophilában több homeotikus génről bizonyították, hogy szerepük van az oculogenesisben. A Drosophila gének többségének homológjait pedig az emlősökben is megtalálták.

Az egyik fő szabályozó gén, a Pax-6, – amelynek a muslicagenomban lévő megfelelője az eyeless (ey) – döntő fontosságú a szem kialakulásában. A Pax-6 homológja egérben a small eye (sey), amely elnevezés jól kifejezi a heterozigóta egyedek jellegzetességét, a normálisnál kisebb szemet. A homozigóta egyedekben egyáltalán nem fejlődik ki a látószerv. A mutáns allélek emberben is hibás fejlődést idéznek elő. Heterozigótákban az irisz hiányát mutatták ki, míg a homozigóta egyedek életképtelennek

bizonyultak

[23].

Egerekben

funkcióvesztéses

mutációkkal

bizonyították, hogy a Pax-6 homológja nélkül, megkezdődik ugyan a szemhólyag fejlődése, de hamar elcsökevényesedik, a lencseplakod pedig már ki sem alakul. A kutatások nemcsak a funkcióvesztéses mutánsok vizsgálatára tértek ki, hanem arra is, hogy mi történik, ha a Pax-6-ot, illetve homológját ektópiásan fejezik ki. Ha Drosophilában a csápot létrehozó imaginális korongba ültették ezt a gént, akkor a csápok helyén összetett szem alakult ki. Ha a szárnykorongban fejezték ki, akkor a szárny egy része vált szemmé. Olyan kísérletet is végeztek, amikor más faj Pax-6 homológját ültették Drosophila lábimaginális korongjába. Ebben az esetben is szem fejlődött ki a lábak helyén. Mindezen adatok azt bizonyítják, hogy a Pax-6 gén az egész állatvilágban konzerválódott [73, 103]. A Pax család egy másik tagja, a Pax-2, is részt vesz a szem fejlődésében. Ez a gén a szemserlegnyél kialakulásában játszik szerepet. Kimutatták, hogy ezen gén hiányában a retinák fúziója következik be, vagyis létrejön az egyszeműség (cyclopia) [54,55]. A Six-3 gén, amelynek Drosophilában előforduló megfelelője a sine oculis (so), kiemelt szerepet tölt be az oculogenesisben, még a fülhólyag területén is képes szemlencsét indukálni. Kiemelnék néhány további homeobox gént, amelyek a retina fejlődésében jelentős szerepet játszanak. A retina progenitorsejtjeinek proliferációjában, és a különböző sejttípusok differenciálódásában vesz részt az otx2 az Rx génekkel együttműködve [57]. A Spa gén, amely ugyancsak a Pax család tagja, a fejlődő csapsejtek prekurzorában található és hiányában a fotoreceptorok degenerálódnak. Chx 10 a retina bipoláris és pálcika-sejtjeinek differenciálódásában játszik fontos szerepet, míg a Shh a ganglionsejtek rétegének keletkezéséért felelős. Az otx és CRB1 géneket kapcsolatba hozzák a retinitis pigmentosa nevű betegség kialakulásával [103].

Természetesen további vizsgálatok folynak annak érdekében, hogy a szabályozó folyamatokat felderítsék. Ha a szabályozó folyamatok is általánosnak bizonyulnak, és az evolúció egésze alatt megmaradtak, akkor biztosan állíthatjuk, hogy az oculogenesis törzsfejlődésére a monofiletikus elmélet érvényes.

Fotoreceptorok

A retina fényérzékelő látósejtjei a megnyúlt, neuroepitheliális fotoreceptorok, amelyek a fényenergiát felvéve, képesek azt feldolgozni és kémiai energiává alakítani. Feltételezik, hogy az első fotoreceptor-jellegű sejtszervek a zöld színtestek lehettek. Egyes elméletek szerint a fotoreceptorok olyan sejtekből fejlődtek ki, amelyek rendelkeztek ostorral és az ostor alapi részéhez pigmentgranulumok kapcsolódtak. A zöld szemes ostoros (Euglena viridis) testfelületi szemfoltja (stigma) ezt az elméletet támasztja alá. A gerincesek retinájában előforduló fotoreceptorok két fő típusát ismerjük, ezek a pálcika és a csap. Ezt az empirikus tényt, a duplicitási elv fogalmazza meg. Mind a pálcikákban, mind a csapokban megkülönböztetünk külső szegmenst (kültag), belső szegmenst (beltag), valamint szinaptikus végződést. A külső szegmensek membránból álló, ellapított korongocskákból (sacculus) épülnek fel, amelyek egy felületsokszorozó membránrendszert alkotnak. A fotopigmenteket és a fototranszdukciós kaszkád más elemeit (pl. transzducin, foszfodiészteráz) is ez a rész tartalmazza. A fotopigmentek integráns membránfehérjék, amik egy protein-részből, az opszinból és egy fényérzékeny prosztetikus csoportból, a kromofórból (11-cisz retinál vagy 11-cisz 3,4 dehidro-retinál) tevődnek össze. A kromofór kovalensen kötődik az opszin meghatározott részéhez. A kültagok membránrendszerében zajlik a fototranszdukció folyamata, amelyet röviden a következőképpen írhatunk le: Fény hatására megváltozik a retinál konformációja és foszforilálódik, amely aktivál egy G-proteint, a transzducint. Ez aktiválja a kaszkád következő enzimét, a cGMP foszfodiészterázt, aminek következtében a kültagban csökken a cGMP szint. Ennek hatására pedig a nátriumcsatornák záródnak és hiperpolarizáció jön létre. A reakció leállításában számos

fehérje vesz részt, a legismertebb az arrestin és a fosducin. Az arrestinről kimutatták, hogy csak pálcikákban és kék színre érzékeny csapokban található meg [52, 65]. A pálcikák korongocskái zártak, elkülönülnek egymástól (zárt membránkorong), membránjaik nem folytatódnak a fotoreceptor plazmamembránjában. Ezek a korongok eredetileg a kültag sejtmembránjának betüremkedései voltak, de a fejlődés folyamán attól teljesen elváltak, lefűződtek. A kültag megújulása során a beltag bázisa felől pótlódnak, majd megközelítik a pigmenthámot, ahol az elöregedett rész leválik és a pigmentsejtek fagocitálják őket. A csapok kúp alakú külső szegmensének sacculusai ezzel

szemben

egymásba,

majd

a

plazmamembránba

is

átmennek

(nyitott

membránkorong). Egy összefüggő membránrendszert alkotnak és így az extracelluláris térrel is közlekednek. A kültagokat a retinális pigmenthám nyúlványai veszik körül, amelyek a fotoreceptorok táplálásáról is gondoskodnak. A külső és a belső szegmens között található egy speciális, nem mozgó, rövid cilium, amelyből a központi tubulusok hiányoznak, így csak a 9×2 perifériás mikrotubulus található meg benne. Valójában a kültag ennek a csillónak a módosulataként fogható fel. A belső szegmens része az ellipszoid, amely sok mitokondriumot foglal magába és ezáltal a fotorecepció energiaigényét is biztosítja; a myoid, amelynek endoplazmás retikulumában a proteinek, így a látópigmentek és a fototranszdukciós-lánc fehérjéinek termelése is folyik; valamint a nukleáris régió, amelynek fő eleme a fotoreceptor sejtmagja [32]. A pálcikák gyenge megvilágítási körülmények között, sötétben, félhomályban is képesek a fényingereket felfogni, a szkotópikus látás meghatározói. Mélytengeri vagy éjszakai életmódot folytató, nokturnális állatoknak a homályhoz, sötét fényhez kell alkalmazkodniuk, ezért retinájukban a pálcikák dominálnak. Esetleg tiszta pálcika retinájuk van, megnyúlt kültagokkal vagy két sorban elhelyezkedő fotoreceptorral (pl. éjszakai gekkó). A halaknál, az óceánok mélyén, kb. 750 méter alatti mélységben nincsen semmiféle fény. Több itt élő faj saját jeleket hoz létre, maga gondoskodik a világításról ahhoz, hogy tájékozódni tudjon. Egyesek lumineszkáló vegyi anyagot képesek előállítani, más fajok szerveiben foszforeszkáló baktériumok élnek. Egész telepeket tartanak fenn a fejük, testük oldalán vagy különleges zacskóban. A baktériumok állandóan világítanának, de a tápanyaguk csökkentésével kioltható működésük. Az óceánok mélyén kialvó és felvillanó ritmikus fények ezeknek a baktériumoknak a

működését tükrözik. Az apró lámpáshalak, amelyek a szemük alatti zacskóban tartják baktériumaikat, ezzel a fénnyel képesek biztosítani a raj együttmaradását [111]. A madarak és a hüllők fotoreceptorai különös figyelmet érdemelnek, mivel beltagjaikban

olajcseppek

találhatók,

amelyek

színszűrőként

funkcionálnak.

Természetesen az éjjeli madaraknak nincs szükségük ilyen olajcseppekre, vagy csak egyes fotoreceptorokban fordulnak elő [111]. Bizonyos nokturnális állatok (pl. macska) jellegzetessége a tapetum lucidum, egy erőteljes fényvisszaverő képességgel rendelkező réteg, amely reflexió révén megnöveli a retinára jutó fény mennyiségét. A csapok nappali fényben aktívak, a fotópikus látásért felelősek. Képesek a különböző hullámhosszúságú fénysugarakat megkülönböztetni, azaz a színlátásban van döntő szerepük. A nappal aktív, diurnális fajok között vannak olyanok is (pl. mókuscickány), amelyek csap-gazdag retinával rendelkeznek. A főemlősök retinájának érdekessége, hogy a retina nagy részén a pálcikák vannak túlsúlyban, de rendelkeznek egy speciális területtel, a fovea centralis-szal, ahol kizárólag csapok fordulnak elő. Ez az éleslátás helye.

Színlátás A színlátás elméletének megalkotása Helmholtz és Young nevéhez fűződik [1]. A XIX. században feltételezték, hogy az adott színérzetet embernél a három alapszínre (vörös, zöld, kék) maximálisan érzékeny fotopigmentekből eredő impulzusok relatív gyakorisága határozza meg. Mára ezt a feltevést sikerült bizonyítani és egyre inkább megismerjük a színlátás molekuláris genetikai hátterét is. A színdiszkrimináció alapja ugyanis két vagy több csaptípus együttes jelenléte, amelyek a látható fénytartomány különböző részeire érzékeny látópigmenteket tartalmazzák. A látópigmentekben az opszin fehérje az, ami változékony és meghatározza a spektrális érzékenységet. Az állatvilágban előforduló színváltozások létrejöttében azonban a kromofórok is szerepet játszanak. A mimikri, elsősorban az egyed védelme érdekében végbemenő folyamat, de színváltozás a különböző szexuális magatartásokhoz kapcsolódóan is kialakulhat. Bizonyos halfajok pl. az ívás idején gyakran megváltoztatják színeiket, hogy elijesszék vetélytársaikat, felkeltsék a másik nem érdeklődését. A feltűnés, de egyben a megadás jele is lehet a szín megváltoztatása. A látópigment funkciója ezekben

az esetekben nemcsak az opszin-fehérje mutációjával változhat meg, hanem a kromofórok

biokémiai

átalakulásával

is.

Halakban,

kétéltűekben

migráció,

metemorfózis során az A1 vitamin aldehidjének (11 cisz-retinál) és az A2 vitamin aldehidjének (11 cisz-3,4-dehidroretinál) aránya változhat meg. Ebben a változásban a fénynek, hőmérsékletnek, hormonoknak lehet fontos szerepük [111]. A csapokat annak alapján osztályozhatjuk, hogy milyen hullámhosszúságú fényre érzékenyek, azaz milyen opszin fehérjét tartalmaznak. A legtöbb emlős fajban kétféle csaptípus van, a dikromácia terjedt el a legszélesebb körben. A kétféle csaptípus: a rövidhullám-érzékeny (kék vagy ultraibolya szenzitív) és a közép-hosszúhullámérzékeny (vörös vagy zöld szenzitív) csap-populáció. A rövidhullám-érzékeny csapokat S-csapoknak, az általuk termelt fotopigmentet S-pigmentnek nevezzük. A közép- és hosszúhullámra specifikus látópigmenteket termelő fotoreceptorok pedig az M/L csapok. A megfelelő abszorpciós maximumok fajonként kismértékben eltérnek egymástól. Főemlősökben általában három különböző csaptípus – hosszúhullám- (L), középhullám(M), és rövidhullám-érzékeny (S) – található. Ez a trikromácia.

1. ÁBRA

A csapok látópigmentjeinek abszorpciós görbéi

Az abszorpciós görbékből leolvasható, hogy a vörös színre specifikus fotoreceptorok leginkább 560 nm-es hullámhosszra érzékenyek (tulajdonképpen narancssárga színtartomány), a zöldek 530 nm-re, míg a kékek abszorpciós maximuma 440 nm-nél található [82]. A rodopszin abszorpciós maximuma 495 nm-nél van. A görbék széles lefutása azt mutatja, hogy egy bizonyos hullámhossz hatására egyidejűleg több csaptípus is aktivált állapotba kerülhet. Sokáig azt tartották, hogy az emlősök szemlencséje nem engedi át az UVsugarakat, így UV-érzékeny csapok sem fordulhatnak elő retinájukban. A rágcsálókban azonban biztosan vannak ilyenek. Jacobs és munkatársai kísérletei nyomán nemrégiben derült csak fény arra, hogy egyes rágcsálókban nem kék, hanem ultraibolya (UV)érzékeny csapok találhatók [44,45]. Az emlős retina rövidhullám-érzékeny csapjai vagy kék vagy UV érzékenyek lehetnek, ugyanabban a fajban egyszerre mindkettő nem fordul elő. Madaraknál UV-érzékeny csapok már régóta ismertek. Egyes ragadozó madarak áldozatuk, az egerek elterjedését, azok vizelete alapján tudják nyomon követni, a vizelet nyomai ugyanis az UV-fényt nagyobb mértékben verik vissza [99]. A nem-emlős gerincesek színlátásáról csak annyit említenék meg, hogy halakban vagy madarakban négy, illetve öt különböző spektrális érzékenységű látópigment is jelen lehet [26]. Ezekben az állatokban ultraibolya-érzékeny csapok is előfordulnak a kékek mellett, és olyan vörös-érzékeny csapok is vannak, amelyek abszorpciós maximuma ténylegesen a vörös színtartományba esik. Bizonyos állatok fotoreceptor mozaikja, színspecifikus csapjainak eloszlása a retinában szabályos, jól elrendezett geometriai alakzatot mutat. Halakban a különböző fényérzékenységű fotoreceptorok elrendeződése általában a fajra jellemző fenotípusos bélyeg, míg a magasabbrendű gerincesekben, emlősökben általában nem beszélhetünk geometriailag szabályos fotoreceptor eloszlásról [5, 18, 85, 86]. A gerincesek ősei adaptálódtak a különböző fényviszonyokhoz, és ennek megfelelően látórendszerük is módosult. A fotopigmentek evolúcióját vizsgálva, valószínűsíthető, hogy közös őstől származtak (2.ábra).

vörös opszin zöld opszin rodopszin

kék opszin

2. ÁBRA Az emberi látópigmentek evolúciója. A kék pigment és a rodopszin illetve a vörös és a zöld pigment közös eredete jól látható. A csappigmentek feltehetőleg kb. 500 millió évvel ezelőtt válhattak szét egymástól. Az L és M opszin génjei valószínűleg duplikálódással keletkeztek, ami magyarázhatja nagyfokú homológiájukat. Ez a homológia az emberi vörös- és zöldérzékeny csappigmentek között kb. 96%-ra tehető. A rodopszin és a kék látópigment génje, illetve a vörös-zöld fotopigment génjei között mindössze 47-49%-os a homológia. A kék fotopigment génje a 7., a rodopszin génje a 3., míg a vörös és zöld opszin génjei az X kromoszóma q karján egymáshoz közel, tandem sorrendben találhatók. 1984-86-ban sikerült a humán rodopszin, vörös, zöld, kék opszinok génjeit azonosítani és klónozni [66, 67]. A fotopigmentek mellett komplett, jól fejlett neuronhálózat nélkülözhetetlen a színlátáshoz. A retinára eső fény feldolgozása már a színspecifikus csapokból és pálcikákból felépülő fotoreceptor-mozaikban elkezdődik, és ezen receptorok szoros térbeli kapcsolatára van szükség a színek megfelelő érzékeléséhez. A fotoreceptorok vertikális, a retinára merőleges információátadásán kívül, amely a bipoláris- és a ganglionsejteken keresztül történik, nagyon fontosak a horizontális összeköttetések is. Az ingerületnek a retina síkjával párhuzamos feldolgozása olyan asszociációs neuronokkal történik, amelyek nyúlványai ugyanazon sejtrétegen belül elhelyezkedő, távoli sejtekkel szinaptizálnak. Az amakrin sejtek a stratum plexiforme internum rétegben létesítenek kapcsolatot a bipoláris sejtek között, míg a horizontális sejtek a stratum plexiforme externum rétegben a ganglionsejteket kapcsolják össze. Ezek a sejtek végzik a különböző érzékenységű csaptípusokból érkező szignálok nagyobb

területre történő kiterjedését vagy éppen gátlását, a receptív mezők (opponent color unit) létrehozását, amelyek a színkontrasztok érzékeléséhez szükségesek [60]. A központi idegrendszer segítségével pedig a fényérzékeny elemek térbeli elrendeződésén alapuló színdiszkrimináció is megvalósul.

Célkitűzés A fotoreceptor-típusok morfológiailag és biokémiailag is eltérnek egymástól. Ez segíthet abban, hogy a csapok, pálcikák térbeli eloszlását a különböző fajok retináiban megvizsgáljuk és feltérképezzük. Morfológiai megfigyelésen nyugszik az a tény, hogy a főemlősök fovea centralis-ában, mely a fotópikus látás központja, a pálcikák részleges vagy teljes hiánya mutatható ki. 1866-ban Schultze demonstrálta, hogy emberben ezen a helyen kizárólag csapok vannak, míg a retina más területein mindkét fotoreceptor-típus megtalálható. A csapok hisztológiailag jól láthatóan elkülönülnek a pálcikáktól. Ilyen jellegzetes tulajdonság a beltag nagyobb átmérője, a kültag kisebb hossza, a sejtmag membrana limitans alatti közvetlen elhelyezkedése, a kültag nyitott membránkorongjai. Ezek a jellemvonások tették lehetővé, hogy a csapok eloszlását és elkülönítését a pálcikáktól könnyen meg lehetett valósítani, a fotoreceptorok térbeli és időbeli feltérképezése korán elkezdődhetett. Alacsonyabbrendű gerincesekben az olajcseppek jelenléte, valamint a retinálismozaik szabályossága, és a szigorúan meghatározott térbeli eloszlás nemegyszer már az egyes csaptípusok megkülönböztetését is lehetővé teszi. Az azonosítást megkönnyítik a kettős vagy ikercsapok, amelyek főtagja nagyobb, mint a járulékos kisebb tag, így radier metszeten jól felismerhetők [5, 18, 85, 86]. A hisztokémiai módszerek térhódításával pedig a pálcikák és csapok elkülönítésén túl emlősökben is azonosíthatóvá váltak az egyes csaptípusok. Látópigment-ellenes antitestek és az immuncitokémia megjelenésével rengeteg új információ látott napvilágot. Többek között lehetőség nyílt a retinán belül a különböző hullámhosszra érzékeny csapok térbeli orientálásának felderítésére is. A megkülönböztetés

alapját

nemcsak

a

látópigmentek

képezhetik,

hanem

a

fototranszdukciós kaszkád pálcika-, illetve csap-specifikus enzimei. Ezen enzimek elleni antitestek segítik a szelektív kimutatást. A lektincitokémia, amely egyes szénhidrátcsoportok jelölésére alkalmas, további módszert biztosít a pálcikák és csapok, illetve egyes csapféleségek elkülönítésre [61, 81]. A fotoreceptorok az ún. interfotoreceptor mátrixon keresztül kapcsolódnak a pigmentsejtekhez, amely sejtkapcsoló struktúrákat, kötőszövetes lemezeket nem

tartalmaz, voltaképpen egy proteoglikán rétegnek fogható fel [9]. A pálcikák és a csapok esetében eltérőnek találták a mátrix szénhidrát komponensét, a pálcika- és csaphüvelyeket. Ezt felhasználva különíthető el egymástól a két fő fotoreceptor-típus. Pl. a földimogyoró lektin (PNA) a csapokat jelöli meg, míg a búzacsíra lektinje (WGA) a pálcikákra specifikus. Az utóbbi években derült fény arra, hogy lektineket használva bizonyos emlős fajokban a kétféle csaptípus között is mutatkozik különbség [96]. A fényérzékelő sejtek retinán belüli feltérképezése, és az így kimutatható mintázat tanulmányozása mellett, a fotoreceptorok differenciálódásának kutatása is nagy lendülettel folyik a látópigment-ellenes antitestek segítségével. A retinális-mozaik normál fejlődésének tanulmányozásakor felvetődnek a következő kérdések: Mikor jelennek meg a különböző fotoreceptorok? Hogyan alakul térbeli elrendeződésük az életkor függvényében? A fotoreceptorok fejlődéséről sok újdonságot sikerült ebben az évtizedben kideríteni. A különböző korú állatok retináinak összehasonlításával nyomon követhetjük a normál fejlődést,

míg

kísérletes

feltételek

mellett

(retinatranszplantációk,

illetve

szövettenyészetek, retinális degenerációk vizsgálata) a kóros fejlődés és a szabályozó mechanizmusok felderítése válik lehetővé. Munkacsoportunk

immuncitokémiai

módszerekkel

(látópigment

ellenes

antitestekkel, lektincitokémiával) emlősök retinájában tanulmányozza az egyes fotoreceptorok térbeli elrendeződését, a különböző színspecifikus csapok eloszlását. Feltérképezzük

az

emlős

retinák

fotoreceptor

mintázatát.

Meghatározzuk

a

fotoreceptorok számát, amely számítások alapján izodenzitás térképek készíthetők. Tanulmányozzuk a fotoreceptor-mozaik kialakulását [II]. Elsősorban a következő kérdésekre keresünk választ: Milyen sorrendben jelennek meg a fotoreceptorok? Milyen életkorra tehető a különböző színspecifikus csapok megjelenése? Hogyan alakul számuk a retinában a fejlődés során? Munkám során elsősorban a nyúl, mint igen gyakran vizsgált kísérleti állat, fotoreceptorainak,

színspecifikus

csapjainak

feltérképezésével,

fejlődésével

foglalkoztam. A nyúlon végzett retinatranszplantációk keltették fel érdeklődésemet ezen állat szeme iránt. Vajon természetes körülmények között mikor jönnek létre az egyes fotoreceptorok? Célom az volt, hogy meghatározzam, mikor jelennek meg a

posztnatálisan fejlődő nyúl retinájában a különböző színspecifikus csapok, azaz milyen sorrendben differenciálódnak. Célul tűztem ki azt is, hogy meghatározzam a színspecifikus csapok számát az életkor függvényében. Felmerült az a kérdés is, hogy a csapokat körülvevő csaphüvely szerkezetében van-e különbség a két színspecifikus csap között nyúlban, illetve lektincitokémiával (PNA) elkülöníthetők-e a rövid- és középhullám-érzékeny csapok. Az utóbbi évek eredményei azt mutatják, hogy a csapok fejlődése során egyes fajoknál létezik egy olyan állapot, amikor nemcsak egy látópigmentet expresszálnak, hanem egyszerre, egyidőben kettőt is (átmeneti látópigment koexpresszió). Patkányban és mókuscickányban munkacsoportunk már korábban kimutatta ezt a jelenséget. Joggal tételeztük fel, hogy ez a jelenség általános érvényű a dikromata emlős fajok között. Nem volt azonban az sem kizárható, hogy létezik olyan faj is, amelyben nem figyelhető meg a fejlődés során a fotopigmentek átmeneti koexpressziója. Vizsgálataim egyik leglényegesebb kérdése annak eldöntése volt, hogy a fejlődő nyúl színspecifikus csapjainál megfigyelhető-e ez a folyamat. Ezekre a kérdésekre a hagyományos hisztokémiai módszereket kiegészítve, digitális képfeldogozást alkalmazva próbáltam válaszolni. Célom volt a digitális képfeldolgozás nyújtotta előnyök kihasználásával igazolni a fejlődés során kialakuló átmeneti látópigment koexpresszió meglétét vagy hiányát. Egy egyszerű és gyorsan reprodukálható csapszámláló program, egy új számítógépes technika kifejlesztése is szerepelt a terveim között, hogy a hagyományos időrabló számolást megkönnyítsem, illetve annak eredményeit ellenőrizhessem. A nyúl mellett egy másik emlősfaj, a denevér retináját is tanulmányoztam. A denevérek kitűnő térbeli tájékozódása már az 1700-as években az érdeklődés középpontjába került. A denevérek éjjel aktív életmódot folytatnak, amihez kifinomult ultrahangos navigációs rendszer szükséges. Ez rendkívül hatékony visszhanglokátorként működik. Ezen hangokat az emberi fül nem is képes érzékelni. Az egyes kibocsátott jelek visszhangjából, a körülöttük lévő tárgyak helyzete mellett, a repülő zsákmány pozícióját is tévedhetetlenül meg tudják határozni. A denevérek (Chiroptera) rendjében két alrendet különítenek el, az egyik a Microchiroptera alrend, amelybe a fajok nagy része besorolható, és amelyek rovarokkal

táplálkoznak,

a

másik

a

Megachiroptera

alrend,

amelyhez

a

gyümölcsevő

repülőkutyafélék tartoznak [98]. Ezek a legnagyobb denevérek; bundájuk vörösesbarna, nagy szemük, apró fülük hívja fel magukra a figyelmet. Vajon van-e különbség a retinák felépítésében az egyes alrendek, illetve az egyes fajok között? Ennek kiderítése érdekében néhány denevérfaj retinájának finom szerkezetét vizsgáltuk meg fény- és elektronmikroszkóppal.

Irodalmi háttér

A fotoreceptorok eloszlása emlős retinában

Az immuncitokémia elterjedése jelentős eredményeket és változásokat hozott a fotoreceptorok eloszlására és fejlődésére vonatkozó ismereteinkben. Az emlősök nagy részének pálcika-domináns retinája van. A csapok aránya ezekben a fajokban 1%-tól (pl. patkány) 13-14%-ig (pl. mongol hörcsög) terjed [90,39] (3.ábra). Mindössze néhány fajban fordul elő csap-domináns retina (pl. mókuscickány, ürge), ahol a fotoreceptorok kb. 95%-a csap [65,72] (4.ábra).

Fotoreceptorok eloszlása pálcika-domináns retinában

Csap Pálcika

3. ÁBRA

Fotoreceptorok eloszlása csap-gazdag retinában

Csap Pálcika

4. ÁBRA A főemlősök ideghártyája azért érdekes, mert nagy része pálcikában gazdag, de kifejlődött bennük egy kis terület, az éleslátás helye, a fovea centralis, amely csapgazdag. Így tulajdonképpen mindkét retina-típus (csap-gazdag, pálcika-gazdag) jellemzőit hordozza. A legtöbb emlős ideghártyáján található egy olyan terület, ahol a fotoreceptorok sűrűsége jelentősen nagyobb, mint a retina többi részén. Ez a főemlősöknél a pálcikamentes fovea, más állatoknál, ahol pálcikák is előfordulnak, area centralis-nak nevezik. Számos fajban foltszerűen jelentkezik, de vannak olyanok is, ahol a retina közepén végighúzódó horizontális zónát alkot (pl. nyúl). Ezt a területet látócsíknak (visual streak) nevezzük [47]. A látócsík a horizont leképezésében vesz részt és elsősorban azokra az állatokra jellemző, amelyeknek nyílt területen széles látókörben kell mozogni, tájékozódni. Olyan fajok is léteznek (pl. patkány), ahol nincsen fotoreceptorokban gazdag központi rész, area centralis, de itt is megfigyelhető egy centroperifériás grádiens, vagyis a centrális rész felé a fotoreceptor-sűrűség megnövekszik a perifériáshoz képest [90].

A színspecifikus csapok eloszlása emlős retinában Csap-domináns állatok közül ürgében immuncitokémiai technikával kimutatták, hogy a teljes retina 91%-át zöld csapok, 6%-át kék csapok, míg 3%-át pálcikák népesítik be [2]. A mókuscickány retinájában is hasonló eredményt kaptak, a kék csapok 4-10%-ban fordulnak elő. Az egyes fotoreceptorok eloszlásában csak kisebb regionális eltérések mutatkoztak. A kék csapok denzitását az alsó retinarészben észlelték a legmagasabbnak, míg a legkisebbnek az area centralis-hoz közeli a temporális részen. Az alsó részben a pálcikák sűrűsége is nagyobbnak bizonyult [72]. Számos fajban a retina csapjai nem mutatnak területi elkülönülést, de a kék csapok aránya

az

alsó

félben

valamivel

magasabb,

mint

felül

(kutya,

macska).

Immuncitokémiai vizsgálatokkal kiderült, hogy az ürge retina fotoreceptorai sem teljesen homogén eloszlásúak [49]. Pálcika-domináns emlősök közül az első faj, a patkány volt, amit részletesen megvizsgáltak és retinájukat feltérképezték. Meghatározták mindenegyes kvadránsból az immunopozitív kék és vörös-zöld csapok számát, arányát. Az S csapok 5-10%-ban fordultak elő, legmagasabb arányban a retina centralis részén [90]. A hörcsög, a kutya, a macska, a mókuscickány esetében is homogén csap-eloszlást mutattak ki, kb. 5-10%-os átlagos S csap előfordulással a teljes retinában. Tehát a két csaptípus a legtöbb emlős retinájában, akár pálcika-, akár csapdomináns, viszonylag állandó arányban található meg. Az M/L csapok 90%-ban, míg az S csapok csak általában 10%-ban vannak jelen [II] (5.ábra).

Színspecifikus csapok eloszlása emlős retinában

Zöldérzékeny csap Kékérzékeny csap

5. ÁBRA Több feltevés sok évtizeden keresztül tartotta magát a retina kutatásában, mind a csapok eloszlása, mind a fotoreceptorok differenciálódása terén. Ezek közül néhányat említenék, amelyek a munkám során előtérbe kerültek és téves voltukra csak az utóbbi években derült fény: •

A két csaptípus minden emlősben homogén módon népesíti be a retinát, és csak a centroperifériás grádiens miatt jelentkezik kisfokú heterogenitás a területi eloszlásban.

•

Nincs a retinának olyan része, ahol csak egyféle csap található, kivéve a főemlősök fovea centralisának legközépső része, ahonnan a kék csapok hiányoznak.

•

Emlősökben minden egyes csap kültagja csak egyféle látópigmentet tartalmaz. Nem léteznek olyan emlős fajok, amelyeknek csapjaiban több látópigment egyszerre, egyidőben van jelen. Látópigment-koexpresszió nem lehetséges. (Halak és kétéltűek esetében ez a jelenség már korábban ismert volt, hiszen metamorfózissal, az életstílus megváltozásával gyakran jár együtt

koexpresszió

illetve

kolokalizáció,

ami

egyben

a

szem

színérzékenységének életkor szerinti megváltozását is eredményezi [111].) Az utóbbi években fogalmazódott meg tehát a kérdés, hogy a színspecifikus csapok minden emlősben homogén módon népesítik-e be a retinát. Nem létezik-e olyan

faj, ahol heterogén eloszlás figyelhető meg? Nincs-e a főemlősök fovea centralisához hasonlóan más emlősben is olyan terület, ahol valamelyik színérzékeny csap hiányzik [27,91,108]?

Heterogenitás a csapok eloszlásában A háziegér (Mus musculus), mint az emlős géntérképezés és génmanipuláció gyakran vizsgált modellje, volt az első faj, amely ezeket a hipotéziseket megcáfolta. Az immuncitokémia mellett, elektroretinográfiás vizsgálattal is igazolták, hogy kétféle csap létezik a retinájában, egyikük 360-365 nm-es, míg a másik csoport 510 nm-es érzékenységi csúccsal rendelkezik [45]. 1994-ben Chiu és munkatársai molekuláris biológiai módszerrel is bizonyították az S és M/L fotopigmentek jelenlétét. Az egér közismerten pálcika-domináns retináját, amelyben kb. 3% csap fordul elő, feltérképezve egy nem várt térbeli eloszlás mutatkozott a rövid- és középhosszúhullámú csapok között. A dorzális és ventrális retinafélben ugyanis nem egyenletesen oszlottak el a színspecifikus csapok. A dorzális retinában még a korábban feltételezett jellegzetes 1:10 arány mutatkozott az S és M/L csapok között, a ventrális retinában azonban szokatlanul magas volt az S csapok száma, a zöld csapok pedig teljesen hiányoztak [91,93]. Calderone és Jacobs fiziológiailag megerősítette, hogy a ventrális retinában az UV érzékenység dominál, míg a dorzális részen a zöldérzékenység. Az idézett szerzők vizsgálatának lényege az volt, hogy összehasonlították a szem különböző kvadránsaiban zöld illetve ultraibolya fény megvilágítására keletkező elektromos aktivitást és a spektrális érzékenységet [16]. Ezzel a korábban feltételezett egyenletes eloszlás elve végképp megdőlt. A két csaptípus más-más retina területeken van jelen, a színspecifikus csapok markánsan eltérő eloszlást mutatnak. Azt a területet, ahol csak kék csapok vannak és a zöldek teljesen hiányoznak, kék- illetve S-mezőnek nevezzük. Kiterjedése, területének nagysága az eddig vizsgált emlős fajokban nem azonos, de konzekvensen a legventrálisabb retinarészt foglalja el. A két retinafél között egereken egy átmeneti zónát lehet meghatározni. A jelenségre némiképpen emlékeztet a galamb retinája, amelyben az ún. vörös mező (pecking field) található meg. Ez a szem dorzális részén elhelyezkedő terület nagy számban tartalmaz

közép- és hosszúhullám-érzékeny csapokat. Élettani jelentősége az, hogy a földön kapirgáló madár retinájának ez a része a talaj képét tükrözi le [26]. Több albino és pigmentált egérfaj (M. spicilegus, M. spretus, M. macedonicus) esetében is hasonló, osztott retinát mutattak ki. A határvonal a két retinafél között nagyjából a horizontális meridián területén helyezkedik el. Ezzel ellentétben számos nem európai egérfajban (pl. M. caroli, M. cooki, M, plathythrix, M. pahari) a csapok eloszlása homogén. Sőt ezek közül néhány fajban (M. plathythrix, M. pahari) kizárólag M csapokat találtak, rövidhullám-érzékenyek egyáltalán nem fordultak elő. Még egy meglepő eredmény, hogy az Apodemus rend (erdei egér) tagjainak nem osztott a retinája, a színspecifikus csapok homogén módon népesítik be a teljes retinát. A Mus spicilegus és az Apodemus sylvaticus fajok közös morfológiai és fiziológiai tulajdonságokkal bírnak, ugyanott élnek, hasonlóan táplálkoznak, a szemük felépítése azonos, ideghártyájuk csapeloszlásában mégis különböznek. Egy renden belül sincs azonos fotoreceptor-eloszlás, ugyanis az Apodemus sylvaticus mind M és S csapokkal rendelkezik, de az Apodemus microps retinájában azonban nincsenek S csapok [87]. Vajon a kék csapok nem nélkülözhetetlenek ezen éjszakai állatok látófunkciójához? Úgy tűnik, hogy nem. Ezekből az eredményekből azt is megállapíthatjuk, hogy a retina osztottsága egy faj-specifikus jellemző, ami független a környezeti tényezőktől. Eddig csak az európai egérfajokban sikerült a csapok heterogén eloszlását bizonyítani, de számos rágcsálófaj retináját még egyáltalán nem vizsgálták. Egyes rágcsálókban (pl. patkány, hörcsög, pocok) nem találtak elkülönült retinát. Eleinte azt tartották, hogy a laboratóriumi egerek különleges osztott retinája a mesterséges megvilágítás eredménye, mivel a jelenséget először olyan laboratóriumi törzsek felnőtt egyedeiben írták le, amelyek generációkon keresztül mesterséges fényviszonyok között nevelkedtek. Ezt azonban egyértelműen cáfolja az a tény, hogy a laboratóriumi patkányban, amelynek egyedeit ugyanolyan sajátos megvilágítási körülmények között tenyésztik, nincs heterogenitás a retinában és elektrofiziológiailag sem mutattak ki dorzo-ventrális asszimmetriát. További cáfolat az, hogy a “közönséges” házi egérnél is megfigyelhető dorzo-ventrális elkülönülés, annak ellenére, hogy ez a faj nyilvánvalóan természetes körülmények között él és folyamatosan természetes megvilágítást kap [87].

Logikus következtetés, hogy az osztott retinával rendelkező állatokban egy közös csaptípus vonul végig az egész retinán, amely mindkét opszint termeli, de a két opszin szintje különböző és ez határozza meg a csapok fenotípusát [38]. Kimutatták, hogy az UV csapok nagy része M pigmentet is termel, míg a ventrális részen vannak kizárólag olyan csapok, amelyek csak UV-érzékenyek [16]. Valószínűleg az S és M opszin expressziójának kontrollja más a dorzális és ventrális területeken, ezért jön létre a területi különbözőség, az osztott retina. Van színlátása ezeknek az állatoknak? Magatartásuk alapján ma csak annyit mondhatunk, hogy a két spektrális érzékenység jelen van, de ez még nem elegendő bizonyíték a valódi dikromatikus színlátás meglétéhez vagy hiányához. Az egéren kívül több emlősnél bizonyítást nyert a heterogenitás a csapok mintázatának kialakulásában. A tengeri malac retinájában, és az általam kiválasztott és vizsgált nyúl retinájában egyaránt megtalálható ez a területi eloszlásbeli különbség [47,80]. Felnőtt nyúl retináját feltérképezve azt mutatták ki, hogy jellegzetes pálcikadomináns

retinával

rendelkezik.

Lektincitokémiával

bizonyították,

hogy

a

fotoreceptorok kb. 5%-a csap. A nyúl retina “látócsíkja”, ahol a csapok és a ganglionsejtek denzitása a legmagasabb, horizontálisan, középtájon helyezkedik el, valamivel a discus nervi optici alatt [47]. Különböző fiziológiai vizsgálatok alátámasztották a nyúl dikromatikus látását, két spektrális csúccsal a kék (425 nm) és zöld (520 nm) tartományban. Tehát a nyúl retinában háromféle fotoreceptor található: pálcika, S csap, M/L csap. A színspecifikus csapok eloszlásának tanulmányozásakor figyeltek fel arra, hogy az ora serratához közeli legventrálisabb retinarészben egy keskeny, félhold alakú terület van, kb. 5%-a a teljes retinának, ahol csak kék csapok találhatók. A nyúlnál ez egy horizontális retinasávnak felel meg, ezért kék csíknak is nevezzük. Ez teljesen ekvivalens az egérben lévő Smezővel, bár a területe jóval kisebb a teljes retinafélnél. Famigletti kimutatta, hogy a kék csík kiterjedése különböző nyúl alfajokban eltérő lehet [34]. Ezt a területet leszámítva, a csapok többsége zöld-specifikus pigmentet expresszál, az M/L csapok száma meghaladja az S csapok számát. Az egész retinát figyelembe véve végül is az emlősökre jellemző 1:10 arány mutatkozik a különböző színérzékenységű csapok között. A látócsík, az area centralis, területén is ugyanilyen az arány, viszont a

fotoreceptor-kültagok kisebbnek bizonyulnak, és jóval sűrűbben helyezkednek el. A látócsík felett található a nervus opticus rostjainak kisugárzása, ami a vakfoltnak felel meg. A maradék felső retinarész és egy keskeny sáv a látócsík és a kék mező között kevésbé specializálódott területei a nyúl retinának (6. ábra).

discus nervi optici látócsík kék csík

6. ÁBRA Nyúl retina sematikus ábrája. A látócsík, amely az éleslátás helye, a discus nervi optici alatt horizontálisan helyezkedik el. A kék csík, ahol csak rövidhullámérzékeny csapok vannak, a legventrálisabb része a retinának.

Rovarevő fajokban olyan mintázatot is leírtak, amelyben a ventrális retinában az S csapok 50-70% körül is jelen lehetnek fajtól függően, de az M csapok sehonnan sem hiányoznak. Tehát nem rendelkeznek tényleges S-mezővel, de a csapok eloszlása mégsem az általános 1: 10 arányt mutatja [71]. A dorzo-ventrális asszimmetria mellett megfigyelhető egy temporo-nazális grádiens is. Ürgében a nazális területen mutattak ki jelentősen magasabb S csap előfordulást. Néhány pozícionális marker is tükrözi ezt az eloszlást. Pl. kizárólag a retina temporális felén található ganglionsejtekben fordul elő egy TRAP nevű antigén [59]. A palackorrú delfin vizsgálatával arra kerestek választ, hogy színlátása vajon, megegyezik-e a szárazföldi emlősökével. Ebben a fajban is a kék csap teljes hiányát sikerült kimutatni, méghozzá az egész retinában. A többi nokturnális állathoz hasonlóan, ez a faj is monokromát, vagyis csak pálcikákkal, és zöld opszint termelő csappokkal rendelkezik. A kék opszin génje azonban jelen van, ha nem is

expresszálódik a deléciók miatt. Tehát olyan diurnális emlősről van szó, amely rövidhullámú csapokat nem tartalmaz [36]. Vannak más emlősök is, amelyekben kék-érzékeny csapok nincsenek. Leszögezhetjük tehát, hogy az emlősök között akad néhány olyan faj is, amelyre nem jellemző a dikromácia, hanem csak monokromatikus színérzékenységgel rendelkezik [36,71,92]. Összegzésképpen a következő ábrán tüntetjük fel a különböző csapmintázatokat, egy-egy jellegzetes példával illusztrálva:

nyúl

házi egér

B

A

patkány

erdei egér

D

C 7. ÁBRA

Színspecifikus csapok eloszlása emlős retinában. A függőlegesen vonalkázott területen csak kék-érzékeny csapok, a vízszintesen vonalkázott területen csak zöld-érzékeny csapok, míg a keresztekkel jelölt területen mind a kétféle csaptípus megtalálható. A Háziegér osztott retinája. B Nyúl osztott retinája, ahol a kizárólag kék csapokat tartalmazó mező jóval keskenyebb. C Patkány homogén eloszlású retinája, ahol mindkét csaptípus egyenletes eloszlásban van jelen. D Erdei egér homogén retinája, ahol csak zöld-érzékeny csapok vannak.

A térbeli elkülönülés biológiai jelentősége A csapok heterogén eloszlásának biológiai jelentőségére talán megadhatja a magyarázatot az, hogy a ventrális retinára a felső látótér, azaz az ég képe vetül. Így az S-érzékeny csapok az eget figyelve, az állatra leselkedő veszélyekről, a felülről támadó ragadozókról adnak gyors információt, hiszen ez a rész a kék és ultraibolya sugarakra igen érzékeny. Míg a dorzális, M csapokban gazdag retinarész a horizontot szemlélve a füves, zöld területek megfigyelője [II]. Ezekre a logikusnak tűnő érvekre azonban nincsenek bizonyítékok. Miért élnek egymás mellett pl. olyan egérfajok, amelyek egyike osztott retinával rendelkezik, míg a másik nem? Ha az életben maradáshoz előnyt jelent a kék csapokban gazdag retinarész, akkor a homogén retinával bíró fajok az evolúció folyamán eltűntek, kipusztultak volna, a heterogén mintázat sokkal elterjedtebb lenne az állatvilágban. Az eddigi vizsgálatok szerint pedig inkább a homogén eloszlás az általános [92]. Ezt figyelembe véve más magyarázata, más biológiai előnye lehet az osztott retinának. Ez azonban még nem ismert. Felvetődik a kérdés, hogy miképpen érzékeli a színeket az egyetlen csaptípussal rendelkező S-mező, hiszen zöld látópigmentet tartalmazó receptorok nem találhatók ezen a területen, márpedig a kétféle csap lokális közelsége mindenféle kontraszttevékenység alapja kell, hogy legyen. Azt lehet feltételezni, hogy hasonló mechanizmus működik az S-mezővel rendelkező állatokban (így az egér ventrális retinájában is), mint egy bizonyos színlátási zavarban szenvedő emberben. Szemészeti kutatások bizonyították, hogy csak a kék csappal rendelkező monokromát páciensek képesek egy bizonyos tartományban színeket megkülönböztetni. Ezen betegeknél genetikailag hiányzik a vörös- és a zöld-érzékeny pigmentek génje, mégis 440 és 500 nm hullámhossz között, ahol a pálcikák és kék csapok szimultán aktívak, meg tudnak különböztetni színeket. Ebből az következik, hogy a pálcikák és a kék csapok valószínűleg közös utat is használnak az információk feldolgozására, továbbítására [75].

Az átmeneti zóna Az átmeneti zóna az osztott retinákban található, a kétféle mező találkozásánál. Ha valaki ezt a területet egérben vizsgálja, akkor megfigyelheti, hogy a jelölt vörös/zöld és kék csapok együttes száma szokatlanul magas. Felvetődik a kérdés, hogy az egyik csappigment helyet cserél a másikkal, látópigment koexpresszió is kialakul? Azaz egy csap több látópigmentet expresszál egyszerre? Ennek a bizonyítására kettős immunjelölést alkalmaztak. Egér retina wholemount preparátumain M/L-specifikus monoklonális COS-1 antitestet és S-specifikus poliklonális 108B ellenanyagot használtak [II]. A csapok nagy többsége mindkét ellenanyagot megkötötte, jelezve, hogy mindkét látópigment szimultán termelődik. A műtermék, valamint a keresztreakciók kizárása miatt, más ellenanyagokat, más módszert is alkalmaztak. A wholemount retinák mellett sorozatmetszeteket is készítettek ultramikrotommal, és az egymás után következő metszeteket felváltva reagáltatták a kétféle antitesttel. Nagy számú csap így is mindkét ellenanyaggal jelölődött [80]. Felnőtt nyúlban, tengeri malacban is találtak kettősen jelölt csapokat az átmeneti zónában. A koexpressziós területek kiterjedése fajonként változik (200-1000 µm). Az osztott retinával bíró tengeri malacban az átmeneti zóna sokkal nagyobb területre terjed ki, mint egérben és nyúlban [47,80]. Rovaroknál és alacsonyabbrendű gerincesekben korábban is ismert volt a koexpresszió lehetősége. Ezzel szemben emlősben az –– egy csap egy pigment –– elmélet tartotta magát. A fent idézett eredmények szerint emlősökben is előfordulhat két pigment egyetlen látósejtben. Élettani vizsgálatok ugyancsak alátámasztották ezt a viszonylag újkeletű felfedezést. Kiderült, hogy hosszúhullámú felvillanásokkal elnyomható egerekben az UV-fényre adott válasz. Ez csakis úgy jöhet létre, hogy a hosszúhullámú fény ugyanazokat a csapokat aktiválja, amelyek UV fényre reagálnak, vagyis ugyanabban a csapban egyszerre mindkét fotopigment jelen van [53]. Calderon és Jacobs két hörcsögfaj csapmintázatában azt találta, hogy a teljes retinában az immunjelölt csap szubpopulációk azonos arányban fordultak elő. Talán ezek a fajok lehetnek a példák arra, hogy az egész retinát kettős csapok népesítik be. A

másik lehetséges magyarázat az, hogy a Szibériai hörcsögben a színspecifikus csapok aránya 1:1. A koexpresszió vizsgálatánál az adott ellenanyag epitóp specificitását és az adott pigment faj-specificitását is figyelembe vették, illetve elektrofiziológiai módszerekkel ellenőrizték [17]. Kérdés az, hogy a koexpresszó milyen szerepet játszik a színlátásban, mi a biológiai jelentősége az evolúciós illetve az ontogenetikus folyamatokban. Jelen pillanatban erre még nem tudjuk a választ. Genetikai kísérletet már végeztek, mégpedig transzgenikus egeret állítottak elő, hogy tanulmányozzák az egér színlátó rendszerét. Az emberi L pigment promoter génjét egy könnyen detektálható reporter génnel kapcsolták össze, majd egerek petesejtjébe ültették. Az így létrejött transzgént már a gén termékének szintézisét megelőzően lokalizálni lehet. Mind a természetesen termelődött, mind a mesterségesen adott fotopigment működőképesnek bizonyult. Mivel az állatokban azonban hiányzik az adekvát idegrendszeri neuronhálózat ezeknek a feldolgozásához, így hiába voltak meg a feltételek a színlátáshoz, mégsem alakult ki [24].

A csapok fejlődése

A színspecifikus csapok megjelenési sorrendje Az utóbbi években fordult az érdeklődés a különböző emlős retina-mintázatok fejlődése, kialakulása felé. Különböző korú emlősök teljes retináit pálcika, S és M/L fotopigment ellenes antitesttel reagáltatva, az immunopozitív elemek megjelenése egyben a látópigmentek expresszióját bizonyítja. Látópigment-ellenes antitestekkel végzett immuncitokémia mellett in situ hibridizációs próbákat is használva próbálják a fotoreceptor

differenciálódás

tér-

és

időbeli

elrendeződését

felderíteni.

A

magasabbrendű emlősökben az opszin expressziója még az intrauterin életben elkezdődik, de az alacsonyabbrendű emlősöknél a kültagok morfogenezise és a látópigmentek termelése csak a születés után indul el [12,13,29,77,93,95]. Erről szóló tanulmányok azt mondják, hogy először a pálcika fenotípusa jelenik meg centrálisan az első vagy második posztnatális napon, majd a fejlődés a periféria

felé folytatódik. Ez a centroperifériás grádiens az egész fejlődés folyamán megmarad. Az első csap később jelenik meg, a negyedik illetve ötödik posztnatális napon. Ez kék, rövidhullám-érzékeny csap lesz, méghozzá az alsóbb retinarészen. Ez a dorzo-ventrális grádiens is végig fennáll a fejlődés során. Az utolsó elem, amely létrejön, az M/L csap, a kilencedik, tizedik posztnatális napon a dorzális retinában. Tehát a sorrend: pálcika – S csap – M/L csap [93,95] [I, II]. Más-más emlős fajokban is hasonló sorrendet sikerült kimutatni, eltekintve a főemlősök foveájáról szóló némiképpen ellentmondó adatoktól [105,106,12,13]. Ismert ténynek számít azonban, hogy a fotoreceptor-sejtek kialakulásának, születésének sorrendje nem egyezik meg az opszin molekula expressziójának sorrendjével. A pálcika-sejtek később jelennek meg, mint a csap-sejtek, mégis jellegzetes látópigmentjük, a rodopszin, korábban expresszálódik, mint a csapok látópigmentjei [20,21]. A fototranszdukciós kaszkád-proteinek megjelenését vizsgálva kimutatták, hogy azok többsége 1-3 héttel az S opszin megjelenése után keletkezik, amikor már az M/L opszin is jelen van. Tehét az S csapok kb. 3 hétig, az M/L csapok rövidebb ideig ugyan, de nem expresszálnak fototranszdukciós fehérjéket. Mi irányíthatja ezen kaszkádproteinek megjelenését? Valószínűleg lokális jelek, amelyek származhatnak a pigmenthámból, az interfotoreceptor mátrix fehérjéiből, a bipoláris sejtekből [83]. Alacsonyabbrendű gerincesekben más sorrendben jönnek létre a színspecifikus csapok. Csirkében először az M/L csapok fenotípusa jelenik meg a pálcika-mentes area centralis-ban. Ezt követően a pálcikák, végül a kék csapok jelennek meg [11]. Xenopus laevis-ben, egy kétéltűben, a csapok és a pálcikák szimultán kezdik el opszinjaik termelését [22]. Aranyhalban a ventrális retinában az UV-érzékeny opszin jelenik meg először, aztán a rodopszin, majd a kék és vörös opszin [85,86]. Minden esetben az opszin-expresszió a ventrális retinában jelenik meg először.

A csapok fejlődése in vitro Retinatranszplantáció A retinatranszplantáció az egyik lehetséges módszer arra, hogy a retina különböző sejtjeinek – így akár a fotoreceptoroknak – fejlődését, differenciálódását kísérletes körülmények között nyomon követhessük. Az eddig elvégzett átültetések eredményei, melyeknél újszülött vagy embrionális állati illetve humán szövetet helyeztek felnőtt állatba, azt mutatják, hogy a különböző retina sejttípusok túlélik a beavatkozást és jól fejlődnek. Ezt több neuronális és gliális sejtmarkerrel, valamint elektronmikroszkópos vizsgálattal is igazolták [6,89]. Embrionális nyúl retinák felnőtt nyúl szubretinális térségébe való átültetésével tanulmányozták a színspecifikus csapok megjelenését, számuk alakulását, egymáshoz viszonyított arányukat. A transzplantátumokban a látósejtek kisebb, nagyobb ún. rozettákban, vagyis lumennel rendelkező gömböcskékben helyezkedtek el. A rozetták rétegződése általában a normál retina szerkezetét, rétegeit tükrözte, ahol a lumen felé irányult fotoreceptor-kültagokat könnyen fel lehetett ismerni. Ez azért fontos, mert a látópigment ellenes antitestek ezt a fotoreceptor részt jelölik meg a rozettákban is. A fotoreceptorok általában keskenyebbek és alacsonyabbak voltak a transzplantátumban, de mind a háromféle látósejtet sikerült azonosítani. Az S csapok megjelenését követően, 5-7 nappal később jelentek meg az M/L csapok. A recipiens retinában az átültetett rész közelében degenerált fotoreceptorokat mutattak ki, de a csapok eloszlása a gazdaállatokban ugyanolyan volt, mint a normál állatok esetében. Egy érdekes dologra azonban felfigyeltek; minden transzplantátumban, minden korcsoportban kevesebb volt az M/L csapok száma, mint a nem transzplantáltak esetében. A csapok többsége kék-érzékeny pigmentet tartalmazott. Volt olyan rozetta is, amelyből teljesen hiányoztak a zöld csapok. Normálisan nyúlban az M/L csapok száma meghaladja az S csapok számának kétszeresét. Ezzel szemben a transzplantáltaknál ugyanezt az arányt: 0.25-nek találták. A pálcikák sűrűsége nagyjából megegyezett mindkét esetben, tehát a pálcikák fejlődése nem változott az átültetés során, viszont jelentős S csap dominancia jött létre [6,89]. Ebből az a következtetés vonható le, hogy az átültetés során az S csapok fejlődése valószínűleg zavartalan marad, míg az M/L csapok a művelet következtében

elpusztulnak, vagy differenciálódásuk lelassul. A másik lehetőség, hogy az M/L csapok az S csapokból alakulnak ki, vagyis transzdifferenciálódnak. A graftban az átültetéskor már kialakulhatnak a kék csapok, míg az átültetés időpontja megelőzheti, vagy éppen egybeeshet a zöld csapok létrejöttével, és így differenciálódásuk lelassul. Az is lehetséges, hogy eredetileg minden csap a kékké válás útját követi, és egy speciális jel hatására alakulnak ki a kékekből a zöld csapok. Mivel az embrionális retinát leválasztják, valószínűleg ezzel megszüntetik ezt a meghatározó szignált, így a legtöbb csap kék marad. Miért vannak jelen mégis zöld csapok? Valószínűleg néhány csap már az átültetéskor elkötelezetté válik, s ezek képezik a transzplantátumban a zöld-érzékeny csapokat. Az sem zárható ki, hogy a differenciálódáshoz nélkülözhetetlen faktor nem teljesen hiányzik, csak mennyisége kisebb. A kísérletek eredményei azt is bizonyítják, hogy nem elég a faj- és szervspecifikus környezet jelenléte a normális differenciálódási folyamatokhoz, hanem a megfelelő kor-specifikus környezetre is szükség van. Patológiás feltételek is megváltoztatják a csapok arányát. Milam leírta, hogy egy retinitis pigmentosá-ban szenvedő beteg retinájában csak kék csapokat tartalmazó rozettákat talált, a vörös/zöld csapok gyakorlatilag teljesen hiányoztak [63].

Retinális szövettenyésztés A retina szövettenyésztése a fotoreceptorfejlődés tanulmányozásának a másik célravezető módja. A szövettenyészetekkel a szervspecifikus faktorok kizárhatók, így a környezeti tényezők direkt hatása és a posztmitotikus szomszédos csapok egymásra hatása is vizsgálható a fotoreceptorok differenciálódására. A technika komoly előnyei közé tartozik, hogy jó esély van a retina normális rétegződésének kialakulására. Újszülött egér retina szövettenyészetein követték a fotoreceptorok kialakulását. A dekapitálás után, az enukleált szemeket protein kinázzal kezelték, ami a kötőszövetes részeket eltávolította. A szem elülső szegmensét az üvegtesttel együtt leválasztották, majd a retinákat a pigmenthámmal együtt kiültették nitrocellulóz membránra, és szövettenyésztő médiumokban tenyésztették. Néhány hétig növekedett ezen a talajon a retina. Különböző időpontokban a tenyésztést megszakítva, a tenyésztett anyagot fixálták. A retinákból fagyasztott metszeteket készítettek, majd a metszeteken

látópigment-ellenes antitestekkel végeztek immunreakciót, vagy a pigmenthámot és a nitrocellulóz filtert leválasztva, wholemount retinaként, végezték el a pálcikák és csapok jelölését. A pigmenthámot enzimatikus emésztéssel távolították el és így a külső szegmens már hozzáférhetővé vált az antitestek számára [84]. A szövettenyészetekben is differenciálódott a retina, az összes rétegét kimutatták. A kialakuló sejtek normál morfológiai és biokémiai tulajdonságokkal rendelkeztek. A csapok és a pálcikák a szokott sorrendben alakultak ki, amit lektincitokémiával (WGA, PNA) és antirodopszin ellenanyagot használva igazoltak. A tenyészetekben is először a pálcika jelent meg a normális retinákhoz és transzplantátumokhoz hasonlóan, a 3-5. posztnatális napon. PNA pozitív elemek pár nappal a pálcikák után mutatkoztak először. Meglepő módon M/L csapokat nem lehetett azonosítani a szövettenyészetekben, ezek teljesen hiányoztak, még több héttel a kiültetés után is. A pálcikák és az S csapok időben, rendben megjelentek, de a középhosszúhullám-érzékeny csapok nem. Teljes retinákat végigmetszettek, különböző ellenanyagokat (pl. COS-1, JH492) is alkalmaztak, wholemountokat is vizsgáltak, de M/L csap nem volt kimutatható. Kettős immunjelölést is alkalmaztak, PNA-val és OS-2-vel (S csap-specifikus monoklonális antitest). Mindenegyes PNA-val jelölt fotoreceptor, OS-2-vel is immunopozitivitást mutatott. Tehát minden csap S pigmentet expresszált [84], és „pigment-nélküli csap” nem volt kimutatható. Az inkubációs idők hossza nem volt hatással az M/L csapok kifejlődésére. Lehetséges, hogy a retina túlélési ideje, ami egér esetében maximum két hónap volt, nem elegendő, ahhoz, hogy ebben a megváltozott, nem szerv-specifikus környezetben létrejöjjenek az M/L csapok. Az S csapok eloszlása a fejlődés folyamán szabálytalan és mivel M/L csapok egyáltalán nincsenek, nem lehet S mezőt sem azonosítani, vagyis a teljes retina egy kék mezőnek felel meg. A dorzális és ventrális retinafél között mégis található különbség. A ventrális retinafélben kb. négyszer annyi S csapot mutattak ki, mint a dorzális részen. Mindez megegyezik azzal, amit az in vivo kísérletek tükröznek. Tehát az S csapok fajspecifikus eloszlása megmarad in vitro körülmények között is. Végeztek olyan kísérletsorozatot is, ahol különböző korú állatok retináit ültették ki azzal a céllal, vajon megjelennek-e a COS-1 pozitív, zöld-érzékeny elemek. Ha a kiültetésre 3-4 napos korban került sor, megjelentek az M/L csapok, bár számuk kisebb lett a normálisan fejlődő retinákéhoz képest. Ha a 9. és 10. posztnatális nap után történt

a kiültetés, akkor méginkább megjelentek ezek az elemek és denzitásuk is megfelelt a normálisan fejlett állatok retináiban mért értékeknek. A közép-, hosszúhullám-érzékeny csapok minden esetben, minden korosztályban kizárólag csak a dorzális retinában voltak kimutathatók [108]. Kétéltűben (Xenopus laevis) is vizsgálták a fotoreceptorok differenciálódását. Tudjuk azt, hogy a kétéltűekben más a differenciálódási sorrend, de a különböző korú szövettenyészeteknél hasonló jelenség zajlott le, mint emlősöknél. Itt is bizonyos kor előtt átültetett retinákban nem jelent meg az egyik fotoreceptor [22]. Kérdés, hogy meg lehet-e változtatni ezt a topográfiai eloszlást bizonyos körülmények között? A ventrális retinában csak S csapok jönnek létre és nem alakulnak ki M/L csapok még abban az esetben sem, ha újszülött ventrális retinát együtt ültetnek ki felnőtt dorzális retinarésszel. Tehát a ventrális csapok opszin fenotípusát nem lehet megváltoztatni diffúzibilis faktorokkal, az M/L csapok azonban feltehetőleg függetlenek ezektől. Milyen faktorok vehetnek részt az egyes retina mezők létrejöttében? Több molekuláról, enzimről, sejtfelszíni markerről bizonyították, hogy a retinában dorzoventrális grádiens szerint oszlik meg. Egyik ilyen faktor a retinsav, mely a fotoreceptorok specializációjában, az ideghártya területi eloszlásában szerepet játszhat. Szintje az embrionális egér retinában is asszimmetrikusan oszlik el, valamint az embrionális neuroepitheliumról is leírták, hogy endogén retinoidokra különböző területeken más-más választ ad. In vitro tanulmányokban a retinoid egyedül, vagy más szteroiddal együtt befolyásolhatja a fotoreceptor fenotípusának kialakulását. Wikler fetális Rhesus majomban azt találta, hogy a lokális tényezők, a sejtkörnyezet megváltozása módosíthatják a posztmitotikus csapok fenotípusát, valamint a fejletlen csapok korai pozíciója döntő fontosságú az opszin fenotípusának meghatározásában. A csapok keletkezése és korai differenciálódása, fotopigment termelése között azonban bizonyos idő eltelik. Rhesus majomban pl. az embrionális 65. napon az éretlen csapokat már ki lehet mutatni, de az opszin termelése csak közel két hónappal a keletkezés után, az embrionális 120. napon indul el [105,106]. Egér retinában a fejletlen csapok már a 13. embrionális napon morfológiai jelek alapján, valamint lektincitokémiával azonosíthatók, míg az opszin expressziója csak később következik be [20,21].

Összegezve a csapok in vitro fejlődését, a szövettenyésztés és a transzplantáció eredményei között a legnagyobb eltérés az, hogy az utóbbi esetben megjelentek normális zöld csapok, a szövettenyésztés során azonban nem.

Az osztott retinájú egér fotoreceptorainak fejlődése Mint a fejezet elején már említettem, felnőtt egér retinájában kétféle csaptípus található. A színspecifikus csapok eloszlása heterogén, mégpedig a retina ellentétes felein különböző csapok foglalnak helyet. Ventrálisan csak kék csapok, míg dorzálisan mindkét csappopuláció megtalálható. Vajon a kétféle csap fejlődése különbözik az egér retina ontogenezise alatt? Az első megjelent fotoreceptor, a pálcika volt a 3. posztnatális napon. Az első csaptípus megjelenése a 4.-5. posztnatális napon következett be, mégpedig a ventrális retinafélen. A csapok mindegyike OS-2 pozitivitást mutatott, tehát S csapoknak tekinthetők. Ekkor a dorzális retinában még nem alakult ki egyetlen csap sem. Majd az egész retinában emelkedni kezdett az OS-2 pozitív csapok száma, de a ventrális félen a sűrűségük mindvégig jóval nagyobb volt. Izodenzitás görbék alapján az S csapok maximális denzitását az alsó nazális kvadráns közepén találhatjuk. Az első M csap a 11.-12. posztnatális napon jelentkezett a felső, dorzális retinafélben. Számuk emelkedést mutatott, de az egész posztnatális fejlődés folyamán csak a dorzális retinában lehetett kimutatni őket, az alsó retinából teljesen hiányoztak. Az M csapok maximális denzitását a felső temporális kvadránsban mutatták ki, tehát éppen szemben a kék csapokkal [93]. A fotoreceptorok differenciálódása valószínűleg nem függ attól, hogy mikor kerül sor a szem kinyílására, mert ez normálisan a 14. posztnatális napon következik be, és addigra a három fotoreceptor differenciálódása már csaknem befejeződött. A vak periódusban történik a fotopigmentet tartalmazó struktúrák, a kültagok nagy részének kialakulása. Főemlősökben is a vak periódusban következik ez be, de viszonylag korábbi időszakra esik, mégpedig az intrauterin életre. Érdekes, hogy a csapoknál megfigyelhető egy centroperifériás gradiens a fejlődés során, míg pálcikáknál nem. A retina mintázata, a különböző csap-mezők másodlagosan jönnek létre? Migráció vagy valamelyik színspecifikus csappopuláció

eltűnése játszik ebben szerepet? Vagy a fejlődés során végig fennáll a retina egyes részei között a heterogenitás, tehát elsődleges a mintázat kialakulása? Az immuncitokémiai vizsgálatok alapján azt lehet megállapítani, hogy az első detektálható kültag megjelenésétől kezdve a csapok térbeli megoszlása a fejlődés egésze folyamán ugyanolyan marad, nem vándorolnak a retina területén. A két mezőn belül a csapok aránya szigorúan meghatározott [93] [II]. Azt azonban nem lehet kizárni, hogy a kültagok detektálhatósága előtt a már elkötelezett csap-sejtek vándoroltak, helyet váloztattak-e. A homogén eloszlású patkány retina fotoreceptorainak differenciálódása A csapok transzdifferenciálódással történő fejlődését támasztja alá a fejlődő patkány retina vizsgálata. Különböző korú patkány S és M/L csapjainak alakulását nyomon követve meglepő eredmény született. Az első csaptípus, az S csap, ami az 5. posztnatális napon jelent meg és denzitása magas volt, meghaladta a felnőtt patkányban észlelt denzitást. A felnőtt patkány retina egyébként is kitűnik az emlősök közül azzal, hogy igen alacsony a kék csapok száma. Majd a 11. posztnatális napig ez a denzitás még tovább emelkedett, s a két hetes patkány retina kb. egy nagyságrenddel több kék csapot tartalmazott, mint felnőtt korában. Majd egy drasztikus esés után a harmadik hét végén lehetett a felnőtt patkányra jellemző kék csap sűrűséget tapasztalni. Az M/L csapok később, a 9. posztnatális napon kezdtek vörös/zöld pigmentet expresszálni, majd denzitásuk emelkedni kezdett és hamarosan elértek egy platót. Ezután egy kis mértékű csökkenés következett be, de viszonylag magas szinten maradt a számuk az egész élet folyamán. Érdekesség, hogy amikor az M/L csapok száma lassan emelkedni kezdett, akkor az S csapok száma ugrásszerűen lecsökkent a felnőttekre jellemző szintre és a csapok összegzett sűrűsége nem mutatott jelentős változást. Megvizsgálva a kétféle csap kinetikáját kiderült, hogy a hirtelen bekövetkező kék csapszám esés párhuzamosan zajlott a zöld csapok emelkedésével. Ez felveti azt a lehetőséget, hogy az S csapok fenotípusa megváltozik és átalakul M/L csappá, tehát nem elpusztulnak, hanem átalakulnak ezek a csapok. Ezt bizonyítja, hogy degenerálódott vagy a programozott

sejthalál áldozatává váló piknotikus magvú, apoptotikus S csapsejtek nem voltak jellemzőek erre a periódusra. A retina felületének növekedése a 10. és 30. posztnatális nap között sem okozhat ekkora mértékű csapszám esést. A módosult fotopigmentek jelenlétét is ki lehet zárni, mert a PNA-val jelölt csapok mindegyike kék vagy vörös/zöld pigmentet tartalmazott. A teljes csapszám változatlansága is azt tükrözi, hogy az egyik csappigment átalakul a másikká. Az

átalakulás,

transzdifferenciálódás

tényét

sikerült

immuncitokémiai

módszerrel alátámasztani [95] [II]. Ha ugyanis transzdifferenciálódás áll fenn, akkor kell lenni egy átmeneti állapotnak, amikor a csap mindkét pigmentet egyszerre, egyidőben szimultán termeli. Ez azzal magyarázható, hogy az apikális korongok pusztulása és az újonnan szintetizált kültag proteinek keletkezése nem azonos ütemben zajlik. Az apikális csap-korongok elvesztése lassabban megy végbe. Kettős immunjelöléssel; egy poliklonális, nyúlban termelt S pigment specifikus 108B ellenanyaggal, valamint egy monoklonális, egérben termelt M/L pigment specifikus COS-1 antitesttel, igazolták 9. és 20. posztnatális nap közötti wholemount retinákon a kétféle fotopigment egyidejű expresszióját. A zöld csapok korábbi létrejöttét igazolja az is, hogy a zöld pigment megjelenésekor az M csapok többsége már nem olyan pontszerű képlet, mint kezdetben voltak a kék csapok. A 30. posztnatális naptól kezdve már nem voltak kettősen jelölt csapok a retinában. A csapok többsége ekkor már nem jelölődött 108B-vel, csak néhány csapban folytatódott az „eredeti” kék pigment termelődése. Ezek lettek a definitív S csapok. A többség zöld pigmentet kezdett expresszálni, és az eredeti S fotopigment kb. két héten belül eltűnt a kültagokból. Ezen populációból származtak a végleges M/L csapok [95]. Itt említeném meg, hogy találtak olyan különleges fotoreceptort, amely mind pálcika, mind csap tulajdonsággal bír [100]. OS-2-vel és antirodopszinnal is reagáltak ezek a sejtek. Csak egy látópigmentet termelnek, kettős természetükhöz nem kell két látópigment jelenléte. A jelentősége ezeknek a sejteknek nem ismert. Ürgében ellenőrizték, hogy van AO (anti-rodopszin, rodopszin ellenes antitest) pozitív elem, ami nem reagál OS-2-vel, tehát nem csak egy keresztreakcióról van szó [49]. Mókuscickányban, egy másik csap-gazdag retinával bíró állatban azonban nem tudták

ezt ellenőrizni az alacsony csapszám miatt [72]. Nem valószínű, hogy döntő szerepet játszanak ezek a fotoreceptorok a csap-gazdag retina látórendszerében. A patkányhoz hasonlóan mongolhörcsög retinájában is kialakul átmeneti látópigment koexpresszió a csapok differenciálódásakor. További kutatás tárgyát képezi, hogy mely állatok csapjainak fejlődésekor alakul még ki ez a jelenség.

Módszerek A retinális csapok elkülönítése Az emlősök színspecifikus csapjainak szelektív jelölése, a fotoreceptorok eloszlásának feltérképezése, a retinális mozaik meghatározása élettani és morfológiai módszerekkel nehézségekbe ütközik, tökéletesen nem valósítható meg. Morfológiailag ugyanis a rövidhullám-érzékeny csapok esetleg csak a nagyobb beltag-átmérőjükről, hosszabb kültagjukról, kisebb végtalpukról ismerhetők fel. Ismérvük még, hogy jobban benyúlnak a szubretinális térbe, és vitreálisabban helyezkednek el, mint az M/L csapok [3,4]. Nem-emlős gerincesekben pl. halakban a csapok geometriailag felépített csapmozaikjaiban betöltött helyzetük alapján, illetve kétéltűekben és madarakban a beltag olajcseppjei segítségével lehet megkülönböztetni morfológiailag a csaptípusokat. Fiziológiai módszerek közül az elektroretinogramm (ERG) segítségével a spektrális maximumok határozhatók meg. A mikrospektrofotometria, amelynek során egy fotoreceptor kültagon fénysugarat bocsátanak át, egy-egy fotoreceptor saját hullámhossz-érzékenységét adja meg. Az egyes csapféleségek között sok élettani eltérés mutatkozik. Ezek közül néhányat említenék: A kék-szenzitív rendszer kevésbé érzékeny, valamint nem működnek közre a fényesség érzékelésében [33]. Az S-csapok ERG-görbéje inkább a pálcikákhoz hasonlít, mint a vörös-zöld csapokhoz [114]. A kék csapok – a pálcikákhoz hasonlóan – degeneratív elváltozásokkal szemben sokkal érzékenyebbek. Talán ez a magyarázata annak is, hogy krónikus szembetegségek kísérőtüneteként gyakran jelentkezik kék színvakság [40]. Valószínűleg ezeknek a kék csapoknak a membránfelépítése sérülékenyebb, amit bizonyíthat, hogy bizonyos festékek intravitreális beadását követően ezek a csapok jelölődtek meg [30,31]. A hisztokémiai módszerek bevezetése lehetővé tette emlősökben is a különböző színspecifikus csapok megkülönböztetését és feltérképezését [4,31]. Először 1977-ben Marc és Sperling használt hisztokémiai módszert, mégpedig a nitroblue tetrazóliumot (NBT), amivel a kék fény hatására aktiválódott csapokat sikerült megjelölni. A

következő lépést 1981-ben De Monasterio és munkatársai tették meg, akik már egy fluoreszcens jelölőanyagot, a Procion yellow-t használták. Ezek az eljárások még nehezen voltak reprodukálhatók és az eredmények gyakran ellentmondásosnak bizonyultak. Az utóbbi évtizedben az immuncitokémia és a molekuláris biológia rohamos fejlődésével lehetőség nyílt arra, hogy a fotoreceptorok tanulmányozásán keresztül jobban megismerhessük az emlős fajok csap-mintázatát. A csapok a látópigmenteken kívül a fototranszdukciós kaszkád bizonyos enzimeiben is különböznek. Ezen enzimek elleni specifikus antitestek lehetővé teszik a csaptípusok szelektív kimutatását. Az arrestin (S-antigén) egy szolubilis fehérje, amely a kaszkádot gátolja, befejezi. Ez a folyamat pálcikákban és csapokban hasonlóan megy végbe, de mégis S-antigén elleni antitestet alkalmazva, csak néhány csap és a pálcikák jelölődtek. Kiderült, hogy ezek a rövidhullám-érzékeny csapok [10,35,52,65]. A foszfodiészterázt gátló részről is kimutatták, hogy csak pálcikákban és kék csapokban fordul elő [41]. A humán fotoreceptorok között különböző a karboanhidráz (CA) enzim eloszlása. Anti-CA ellenanyagot használva a közép- és hosszúhullám-érzékeny csapokat sikerült megjelölni, tehát ez az enzim a kék csapokban és a pálcikákban nem található meg [68,69]. Mókuscickányban a NADH-diaforáz ellenanyaga, ürgében fosducin és transducin β1-alegysége elleni antitest jelölte szelektíven a pálcikákat és a kék csapokat. A többi fotoreceptor specifikus proteint ürgében (pl. γ-foszfodiészteráz) minden látósejtben azonosítani lehetett [100,108]. Érdekes az, hogy számos esetben a pálcikák és a kék csapok azonos tulajdonságokat mutatnak, ami jelezheti közös eredetüket, amelyet Nathans és munkatársai által leírt molekuláris homológia is jelez a rodopszin és a kék pigment között [66,67]. A kétféle fotoreceptor-típus közötti közeli rokonságot bizonyíthatja az is, hogy ürgében a kék csapokra specifikus OS-2 elleanyaggal a pálcikák nagy része is megfestődik [92]. További hasonlóság, hogy a pálcikákkal és S csapokkal szinaptizáló bipoláris sejtek ugyanazt a protein kináz C izoenzimet tartalmazzák [48]. A molekuláris biológiai technikák (pl. opszin cDNS klónozása) még közelebb viszik a kutatókat a látópigmentek megismeréséhez. Az in situ hibridizációs próbák igen elterjedtek a fotoreceptorok differenciálódásának tanulmányozásában is, amellyel szöveti metszeten a látópigmentek génexpressziója során termelődött specifikus mRNS-

ek lokalizálhatók [12]. Ez a reakció annyira érzékennyé tehető, hogy egy fejlődő sejtben jelen lévő néhány mRNS molekula is detektálható.

Immuncitokémia A fotoreceptor-mozaik tanulmányozásában döntő fontosságú lépés volt a színspecifikus látópigmentek elleni antitestek termelése [50,51,78,88], aminek következtében az immuncitokémia az utóbbi években jelentősen megváltoztatta a fotoreceptorok eloszlásáról alkotott nézeteket. Egyértelművé, aránylag könnyen kivitelezhetővé vált a csapok elkülönítése. Miért döntő fontosságú ez a módszer a retina morfológiájának kutatásában? Az immuncitokémia legnagyobb előnye más direkt fiziológiai mérési módszerekkel

szemben,

mint

például

a

mikrospektrofotometria

vagy

az

elektroretinográfia, hogy nem szükséges hozzá különös műszer, készülék, illetve sokáig életben tartott, túlélő retina-preparátum sem. Nagy területeket, esetleg a teljes retinát reagáltathatjuk antitestekkel, így “wholemount”-on térképezhetjük fel a fotoreceptorok pontos topográfiáját. Ennek a metodikának igen fontos szerepe van a fejlődésbiológiai kutatásokban is, hiszen mielőtt még részt vennének a fényérzékelő pigmentek az állat aktív látófunkcióiban, mielőtt lehetőség lenne bármilyen fiziológiai vizsgálatra, a csaptípusokat már azonosítani lehet. A különböző fenotípusokat el lehet különíteni, amint a specifikus pigmentek szintézise elkezdődik. Az immuncitokémiai technikáknak azonban határai is vannak, ugyanis az adott faj fotopigment-fehérjéjének (rodopszin vagy opszin) bizonyos epitópját detektálják és nem a “látósejt” aktuális spektrális szenzitivitását adja meg ez a módszer. Óvatosan kell kezelni az immuncitokémiai eredményeket, ugyanis egy faj fotoreceptor populációját felismerő

ellenanyag,

nem feltétlenül

specifikus

egy

másik

faj

ugyanazon

hullámhosszúságú látósejtjére. Az adott faj immunjelölt fotoreceptorainak jelenlétét élettani módszerekkel (pl.mikrospektrofotometria, elektroretinográfia, elektrofiziológia) mindig ellenőrizni kell. Nagyon figyelmes anatómiai és fiziológiai összehasonlító vizsgálatokat kell végezni ahhoz, hogy valós képet kapjunk a retinális fotoreceptorok térbeli orientációjáról. A módszer további hátránya, hogy a fotopigmenteknél előforduló

nagyfokú aminosav-szekvencia homológia miatt gyakran nem lehet azonos alcsaládon belül megkülönböztetni a látópigmenteket. Minden

immunjelöléshez

megfelelő

kontrollt

kell

készíteni,

hogy

meggyőződjünk az ellenanyagok specifikusságáról. A leggyakrabban alkalmazott a negatív kontroll, amikor az első illetve második antitest elhagyásával vagy más reagenssel (pl. inaktív savóval) helyettesítve végezzük el a teljes immunreakciót. Természetesen ezeken a metszeteken „nem szabad” pozitivitást találnunk. A másik kontroll, a pozitív kontroll, amit leginkább patológiai munkáknál használnak. Ekkor a pozitív kontrollnál tapasztalt reakció győzheti meg a szakembert, hogy nem technikai hiba okozta a vizsgált anyag negativitását (pl. tumor szövetek negativitása esetén).

Jelölési módszerek

A sikeres immunjelölés alapvető feltétele közé tartozik a specifikus ellenanyag, valamint egy olyan fixálási eljárás, amely a minta antigenitását megtartja és közben az anyag morfológiája sem változik meg. Az antigén-antitest reakció specificitása biztosítja mind fény-, mind elektronmikroszkópos vizsgálatoknál a szöveti alkotók pontos lokalizálását. Az immuncitokémiai reakcióknak két fő módja van: direkt és indirekt eljárások. A direkt eljárásokban az antigén ellen termelt antitest maga hordozza a jelzőanyagot, míg az indirekt reakciókban az antitest és a jelzőanyag közé még egy vagy több molekula bekapcsolódik. A direkt eljárások nem terjedtek igazán el, mert minden reagenst jelölni kell, valamint kevésbé érzékenyek, mint az indirektek. Több indirekt immuncitokémiai módszer ismert pl. peroxidáz-antiperoxidáz (PAP), alkalikus foszfatáz-antialkalikus foszfatáz (APAAP) valamint avidin-biotin komplex (ABC) kapcsolódásán alapuló reakció. Sok jelölőanyag használatos pl. a fluoreszcens festékek közül: fluoreszcein-izotiocianát (FITC), tetrametil-rodamin-izotiocianát (TRITC). A kromogének közül, amelyek oxidálódva színes végterméket adnak, a legelterjedtebb a 3 diaminobenzidin-tetrahidroklorid (DAB), mely barna színű oldhatatlan reakciótermékké oxidálódik. Munkánk során FITC-cel jelölt második ellenanyagot valamint avidin-biotin reakciót alkalmaztunk. Az avidin jellegzetessége, hogy specifikusan képes négy biotin

molekulát megkötni. Ezért, ha az immunreakcióban biotinált második antitestet használunk, akkor a peroxidázzal jelzett avidin-biotin komplex avidinjének szabad helyeihez tud kapcsolódni ez az ellenanyag, azon keresztül pedig az antigén (8. ábra).

ABC-komplex avidin biotin peroxidáz komplex

biotinált antitest

antitest

antigén

8. ÁBRA ABC reakció sematikus ábrája

Alkalmazott ellenanyagok Kutatócsoportunk

immuncitokémiai

módszerekkel

emlős

fajokban

tanulmányozza a fotoreceptorok elrendeződését, fejlődését. Látópigment-specifikus ellenanyagokkal különítjük el a külünböző csap-szubpopulációkat egymástól, és a csapokat a pálcikáktól. Mono- vagy poliklonális antitestekkel történik a fotopigmentek szelektív jelölése. Jól ismert tény, hogy a poliklonális ellenanyagok az antigén

különböző epitópjaival reagálnak, míg a monoklonálisak csak egy bizonyos epitóppal lépnek kapcsolatba. Ezzel magyarázhatjuk nagyfokú specificitásukat és elterjedésüket az immunjelölésben. Az emlős S pigment primér szerkezete feltűnően különbözik az M/L pigmenttől, és ez azt jelenti, hogy egyértelműen elkülöníthetők. Kísérleteink során leginkább két monoklonális ellenanyagot (COS-1 és OS-2) a csapok elkülönítésére, míg a pálcikák kimutatására egy poliklonális (AO) antitestet alkalmaztunk. Az utóbbi a pálcikában gazdag marha retinából kivont rodopszin elleni ellenanyag, a COS-1 és OS-2 csirke durva fotoreceptormembrán-szuszpenziója ellen egérben termelt monoklonális antitestek. A legbiztatóbb sejtvonal a csap kültagjának specificitása alapján lett kiválasztva. Az ellenanyagok látópigment ellenes specificitása felől immunbiokémiai (immunoblotting) és morfológiai módszerekkel (fény- és elektronmikroszkópia) is meggyőződtek. Az antitestek epitóp specificitását is azonosították, mégpedig szintetikus peptideket használva, amelyek az immunreakciót blokkolták. Mindkét ellenanyag, amelyek az IgG3 osztályhoz tartoznak, a megfelelő csappigment citoplazmatikus oldalán lévő epitópra specifikusak, míg az AO esetében extracellulárisan helyezkedik el az epitóp. A COS-1 epitópja a humán vörös-zöldérzékeny pigment C-terminális utolsó 6 aminosava, míg az OS-2 a kék-érzékeny pigment C-terminálisának 12 aminosava. Az AO epitópja a marha rodopszin Nterminális része [78]. Az ellenanyagok a kültaghoz kapcsolódnak. A monoklonális COS-1 antitest minden eddig vizsgált emlősnél az M/L csapokra specifikus, azonban a zöld vagy vörös látópigmentek ezen belül nem különülnek el a nagyfokú aminosav szekvencia homológia miatt. A másik antitest, az OS-2, az emlős S csapokat jelzi. Az S csapok abszorpciós spektruma azonban az ultraibolya (360 nm) vagy a kék (420-440 nm) tartományban is lehet, de az OS-2 nem képes ezt a két csaptípust szelektíven megjelölni, mert mindkettő ugyanazon alcsalád tagja, és aminosav sorrendjük nagyon hasonló. Az emlősök S csapjai vagy kék, vagy ultraibolya pigmentet expresszálnak, ezért az OS-2 segítségével nem lehet ezt a két pigmentet specifikusan elkülöníteni. Egy poliklonális ellenanyagot a 108B-t, ami ugyancsak az S csapokat jelöli, kettős immunjelöléseknél használtunk. Ezzel az antitesttel sem tudjuk a kék, illetve UV pigmenteket megkülönböztetni. Szintetikus humán kék és vörös/zöld pigment elleni másik pár antitestekkel [50,51] is csak két csap-populációt tudunk szelektíven jelölni.

Lektincitokémia A fotoreceptorokat körülvevő interfotoreceptor mátrix felépítésében, szénhidrát tartalmában, mutatkoznak különbségek a pálcikák és a csapok között, de bizonyos fajokban az egyes csap-populációk között is. A lektincitokémia, ami többségében növényi eredetű fehérjéket, az ún. lektineket használja fel egyes szénhidrátcsoportok kimutatására, lehetőséget nyújt a pálcikák és csapok elkülönítésére [7,8,9,19,61,81]. A fotoreceptorok az interfotoreceptor mátrix segítségével érintkeznek a pigmentsejtekkel. Ennek, a pálcikák valamint a csapok esetében különböző az összetétele. Vannak olyan mátrixkomponensek, amelyek minden fotoreceptorra jellemzőek és olyanok is, amelyek segítségével el lehet különíteni az egyes csap-populációkat. A peanut agglutinin lektin (PNA), amelyet földimogyoróból izoláltak, a csapokat jelöli szelektíven, mert a csaphüvelyben található β-galaktóz N-acetilgalaktózamin oldalláncra specifikus. A wheat germ agglutinin (WGA), amely búzacsíra lektin, a pálcikák kimutatására alkalmas, ugyanis a pálcikák hüvelyében lévő N-acetilglükózamint és sziálsavat képes megjelölni. Nemcsak

a

mátrix

szénhidráttartalma,

hanem

a

fotoreceptormembrán

cukormolekulái is jellemzőek a látósejtekre. Ultrastrukturális vizsgálatok kimutatták, hogy a fotoreceptormembrán tartalmaz proteoglikánokat, amelyekhez képesek a lektinek kötődni. Bizonyos fajokban lektincitokémiával a csaptípusokat is el lehet különíteni a szénhidrát-komponensek különbözősége alapján. A CSA-1 ellenanyag, egy csap-specifikus, szénhidrát tartalmú fehérjét képes megjelölni a fotoreceptormembránban. Disznóban a vörös/zöld csapokat mutatták ki PNA és CSA1 keverékével [79]. Ürgében tripszin emésztés után a zöld csapok bel- és kültag-membránjához kötődött PNA a kék csapokat nem ismerte fel, míg a zöld csapok erősen festődtek. Tripszinnel a csaphüvelyt el lehet távolítani, el lehet emészteni, így a lektin csak a kültag

szénhidrátjaihoz

tud

kapcsolódni.

A

csapokat

körülvevő

csaphüvely

lektinkötésében is jelentkeztek különbségek. PNA lektin-fluorokrómot használva tripszin emésztés nélkül, ürgében a zöld csapok mátrix-doménjei halványabban jelölődtek, mint a kékek. Tehát tripszin emésztés előtt a kék csapok intenzív PNA

pozitivitást mutattak, míg emésztés után egyáltalán nem jelölődtek, a zöld csapok azonban immunopozitívak maradtak [96]. Az interfotoreceptor-mátrix 250 kD molekulasúlyú komponense ellen sikerült előállítani egy ellenanyagot, az F22-t. Ez az antitest egér retinában a 16. posztnatális napig minden fotoreceptor hüvelyét megjelöli, de ezután már csak a csapokét [62]. Más fajoknál nem találtak eltérő jelölődést.

A kísérleti állatok kiválasztása Munkám során a nyulat, mint oly sokszor vizsgált állatot választottam ki, hogy a fotoreceptorainak fejlődését nyomon kövessem. A nyulat gyakran használják a látási folyamatok kutatásában, a retinatranszplantációs kísérleteknek is közkedvelt alanya. Ez a faj, jellegzetes képviselője a pálcika-domináns osztott retinával rendelkező emlősöknek, azaz retináját a színspecifikus csapok heterogén módon népesítik be. Mint az irodalmi összefoglalásban már említettem, felső és centrális retinarészükben sok M és kevés S csap található, míg a legventrálisabb területen, az S-mezőben, kizárólag kék csapok vannak. Ezek a jellemzők igen eltérnek az eddigi fejlődéstani vizsgálatokban tanulmányozott osztatlan retinával és átmeneti látópigment koexpresszióval bíró emlősöktől (pl. patkány). Az állat könnyű tenyésztése és beszerezhetősége mellett, a fejlődéstanilag még csak kísérletes körülmények között (retinatranszplantáció) kutatott retinája keltette fel érdeklődésemet. Nagyon kíváncsi voltam arra, hogy színspecifikus csapjai hogyan fejlődnek in vivo. A retina fejlődését, a fotoreceptorok differenciálódását különböző korú nyúl retinák összehasonlításával végeztem. Kísérleteinket tizenhárom korcsoportban, 1 és 24 posztnatális nap közötti pigmentált (Dutch belted fajtájú) és albinó (Új-Zéland fajtájú) nyúlon hajtottam végre. Korábbi kísérleteink azt mutatták, hogy a 24 napos nyúl retinája már biztosan megegyezik a felnőttekével, tehát idősebb korosztályt ezért nem vizsgáltam. Néhány denevérfajt is tanulmányoztam annak érdekében, hogy a retinájuk felépítésében van-e különbség a többi, nem ultrahangos tájékozódást használó

emlősökhöz viszonyítva, illetve a kis szemmel rendelkező Microchiroptera és a nagy szemű Megachiroptera rendek között kimutatható-e eltérés. A vizsgált Microchiroptera rend tagjai: Myotis blythi oxygnatus, Rhynolophus ferrum equinum, Taphozous longimanus, Scotophylus hethai, Scotophylus temmenckii. A vizsgált Megachiroptera rend tagjai: Cynopterus sphinx és Rousettus niloticus. A Myotis faj hazánkból származott, a Rousettus fajt a budapesti állatkertből szereztük be, míg a többi denevérfaj Indiából származott és kollaborációs partnerek segítségével jutottunk hozzá. Az állatokat néhány napig megegyező feltételek mellett tartottuk, normál laboratóriumi fényviszonyok között.

A retina kísérleti előkészítése Éter narkózist követő dekapitálás után a nyúl szemeket enukleáltuk. A szemet, a limbus mentén körbevágtuk, az elülső képleteket leválasztottuk. A hátsó szemkelyhet (posterior eyecup) 4%-os paraformaldehidben (0.1 M foszfát puffer [pH 7.4]) két napig 4˚C-on fixáltuk. A felső retinarészről, mely a papilla nervi optici és az ora serrata közötti területet foglalja magába, egy kb. 2x2 mm-es darabot kivágtunk. Összehasonlításképpen az alsó retinarészről, melyben az úgynevezett “kék csík” (csak kék csapokat tartalmazó zóna) is található, illetve a központi területekről, ahol a látócsík helyezkedik el, is vettünk mintákat. A retinadarabok egy részét wholemount-ként kezeltük. Ez azt jelenti, hogy a teljes retinát reagáltatjuk az ellenanyagokkal, majd az immunreakció elvégzése után a retinát fotoreceptor rétegével felfelé kiterítve vizsgáljuk. Az antitestekkel történő reakció előtt 0.4%-os Triton X-100 reagenssel preinkubációt végeztünk, hogy a nem specifikus kötőhelyek számát blokkoljuk, a nem specifikus jelölést csökkentsük. A retinaminták többi részét víztelenítés után Araldit gyantába ágyaztuk és ultramikrotommal (Reichert Ultracut S) 1 µm vastag, félvékony radier és tangenciális metszeteket készítettünk. Az ellenanyagok reagáltatását megelőzően a metszeteken 1%os BSA-t (bovine serum albumin) tartalmazó foszfát pufferrel a nem specifikus kötőhelyeket blokkoltuk.

Félvékony, tangenciális sorozatmetszeteket készítettünk a fotoreceptorok külső szegmensének szintjéről, annak kimutatására, hogy vannak-e olyan csapok, amelyek kétféle látópigmentet egyszerre, egyidőben expresszálnak. Ez a metszési sík a retina felszínével

párhuzamos,

így

a

fotoreceptorok

hossztengelyükre

merőlegesen

vizsgálhatók. A kültag hosszától és a metszetvastagságtól függően a fotoreceptor kültagja több metszeten keresztül látható és így azonosítható. Tehát ezáltal alkalmas a látópigment koexpresszió megfigyelésére, kimutatására. A színspecifikus csapok kimutatására elvégeztük mind a wholemountokon, mind a metszeteken az immunreakciót. Lektincitokémiát is végeztünk annak kimutatására, hogy a csap-populációk jelölésében jelentkezik-e különbség. A denevérek esetében is éternarkózist alkalmaztunk. 1%-os glutáraldehid és 4 %-os paraformaldehid oldattal perfúziós fixálást végeztünk, majd a szemeket enukleáltuk. A leválasztott retinákat Poly-Bed 812 műgyantába ágyaztuk be. Ultramikrotommal (Reichert Ultracut S) 1 µm félvékony, illetve 70-90 nm ultravékony metszeteket készítettünk. A félvékony metszeteket toluidinkékkel festettük meg fénymikroszkópos

vizsgálatra.

Az

ultravékony

metszeteken

uranilacetáttal

és

ólomcitráttal végeztük el a kontrasztozást.

Immuncitokémia és lektincitokémia alkalmazása Két látópigment-ellenes monoklonális ellenanyagot használtunk a csapok jelölésére: a COS-1, a középhullám- (zöld) és hosszúhullám- (vörös) érzékeny pigmentet ismeri fel, az OS-2 pedig a rövidhullám-érzékeny (kék) csapokat jelöli. A PNA lektin a csaphüvelyek specifikus kimutatását végzi. A COS-1, ami szövettenyészetben termelt hibridoma felülúszó, 1:50-szeres, míg a hasüregben termelt ascites OS-2-t 1:25000-szeres hígításban alkalmaztuk, a biotinált-PNA-t (Sigma) 1:10szeresben. A kötött ellenanyagot, a jelölt fotoreceptorokat, biotinált anti-egér második ellenanyaggal és ABC reagenst használva diaminobenzidinnel (DAB), mint kromogénnel tettük láthatóvá. A DAB-ot hidrogén-peroxid jelenlétében használtuk. A pálcikákat patkányban termelt poliklonális ellenanyaggal, antirodopszinnal (AO) 1:100-

szoros hígításban jelöltük meg. Majd biotinált anti-patkány második ellenanyaggal és ABC-DAB reagensekkel együtt váltak mikroszkópban is megfigyelhetővé. A wholemount preparátumokon az előbb leírt ABC-DAB módszeren kívül, fluoreszcens festékkel (FITC) konjugált második ellenanyaggal is végeztünk immunreakciót. A tangenciális sorozatmetszetek szomszédos tagjait felváltva a kétféle csap-ellenes ellenanyaggal (COS-1, OS-2) reagáltattuk. A szomszédos metszetek azonos részeit összehasonlítva, mindenegyes csap külső szegmensét azonosítani lehetett a jelölt ellenanyagokkal. A kontroll reakciókat minden esetben az első illetve a második ellenanyag elhagyásával készítettük el.

Kiértékelés A nyúlnál végzett immunreakciók eredményét fénymikroszkóppal (Axiophot; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) vizsgáltuk. Néhány esetben Nomarski optikát vagy a fluoreszcens metszeteknél, fényszűrőket használtunk. Az eredményeket hagyományos mikroszkóp kamerával és digitális kamerával (Kodak Professional DCS 460) fényképeztük le. A két csap-populáció időbeli megoszlása miatt tanulmányoztuk a csapok számát, megszámoltuk azokat, és meghatároztuk denzitásukat. A csapszámláláshoz minden korosztályból két illetve három állatot használtunk fel. Mindenegyes retinából legalább öt mintadarabot vettünk az előzőleg már leírt különböző (felső, középső és alsó) területekről. A hagyományos fényképeken kézi számolással mértük fel a csapok számát. A denevér retinák morfológiáját fény- és elektronmikroszkóppal (OPTON CEM 902) is tanulmányoztuk. Számítógéppel segített feldolgozási folyamat

A digitális képeken a jelölt csapok eloszlását és sűrűségét digitális képfeldolgozás segítségével végeztük. Kifejlesztettünk egy csapszámláló programot Mathworks Matlab szoftverkörnyezetben, grafikus felhasználói felülettel (ConeCount).

Az eredményeket manuálisan is ellenőriztük, illetve az automatikus számolásnál mindig meggyőződtünk arról, hogy a program azokat és csak azokat az elemeket számolja meg, amelyek tényleg immunopozitív fotoreceptorok. A képfeldolgozás menetét a következő folyamatábra szemlélteti (9. ábra):

Mikroszkóppal készült digitális kép

Zajszűrés

Fekete-fehér tónusos kép előállítása

Képmorfológiai műveletek

Csapok számlálása (Connected components labelling)

9. ÁBRA

A mikroszkópos képből szükség szerint képjavítási eljárásokkal (pl. zajszűrés) jobban kiemelhetők a háttérből a csapok. Majd fekete-fehér tónusos kép elkészítésével csökkenthető az adatmennyiség, számunkra információvesztés nélkül, hiszen a csapok fekete-fehér felvételen is jól láthatók. A következő lépésben a kép információtartalmát két részre tudjuk osztani: csap és háttér. Így képmorfológiai művelettel bináris kép állítható elő. Ebből a bináris képből kell meghatározni a csapok számát. Ehhez pedig az összetartozó pixeleket egy pixelre le kell vékonyítani, majd ezeket megszámolni. A vékonyítás egy algoritmus szerint történik, melyben azok a pixelek, amelyeknek van legalább egy szomszédja kitörlődnek, egészen addig, amíg egyedül nem maradnak. A képfeldolgozási eljárás végén, a levékonyítás után, következik a számlálás, ami standard képfeldolgozási művelet. A csatlakozó komponens címkézési eljárás (connected components labelling) biztosítja, hogy minden különálló folt egyedi azonosítót kap, a számlálásban az utolsó azonosító adja meg a kérdéses elemek – jelen esetben a megfestett csapok – számát. Ahhoz, hogy az egységnyi felületre eső csapszámot meg tudjunk határozni, különböző nagyításokon lefényképezett Bürker-kamrával végeztük el a rendszer kalibrálását. Más laboratóriumi szoftverekkel (pl. Image Pro Plus) összehasonlítottuk működési mechanizmusát. A tangenciális sorozatmetszetek szomszédos tagjain végzett immunreakciók eredményét digitális kamerával lefényképeztük. Ha a képeket egymásra helyeztük, akkor egyértelművé vált, hogy vannak-e kettősen jelölt csapok az adott területen az adott metszetben. A jobb láthatóság érdekében a digitális képfeldolgozás eszközeivel a jelölt csapokhoz digitálisan különböző színeket rendeltünk. A COS-1 jelölt csapokhoz pirosat, míg az OS-2 pozitívekhez kéket. Majd a képeket egymásra “szuperponálva” jól láthatóvá vált az, hogy vannak-e egy, illetve két látópigmentet egyszerre termelő fotoreceptorok, vagy nincsenek. Mindehhez Adobe Photoshop 5.0 szoftvert használtunk.

Eredmények A nyúl retinájának vizsgálati eredményei Látópigment-ellenes antitesteket alkalmazva meghatároztuk nyúl retinájában a fotoreceptorok megjelenési sorrendjét. Más emlősökhöz hasonlóan, nyúl retina wholemountjain is először az anti-rodopszin pozitív pálcikák jelentek meg, az 1.-2. posztnatális napon. Majd a csapok közül, az S csapok kezdték el fotopigmentjeik expresszálását. A felső-középső retinarészről vett mintákban az OS-2 immunopozitív elemek a 3. posztnatális napon jelentkeztek.

10. ÁBRA OS-2 immunopozitív csapok különböző korú nyúl retinákon. A felső retinarészből vett mintákat monoklonális OS-2 ellenanyaggal reagáltattuk, majd FITC-cel konjugált második ellenanyaggal tettük a reakciót láthatóvá. A Az 1. posztnatális (P1) napon S csapokat nem lehet kimutatni. B Az első immunopozitív kék csap a P3. napon jelenik meg. C Az S csapok száma a következő napokban nem emelkedik hirtelen. (P16) D P24 napos nyúl retinája azt mutatja, hogy felnőtt állatban is az S csapok denzitása alacsony marad. Mikronvonal: 2 µm

A COS-1 ellenanyaggal azonosítható M/L csapok csak az első hét végén voltak kimutathatók. A 6-7. posztnatális nap előtt COS-1 pozitív elemet nem találtunk.

11. ÁBRA COS-1 immunopozitív csapok különböző korú nyúl retinákon. A felső retinarészből vett mintákat monoklonális COS-1 ellenanyaggal reagáltattuk, majd FITC-cel konjugált második ellenanyaggal tettük a reakciót láthatóvá. A Az 1. posztnatális napon (P1) M/L csapokat nem lehet kimutatni. B Az első immunopozitív zöld csap a P6. napon jelenik meg. C Az M csapok száma a következő napokban ugrásszerűen megnő. (P16) D P24 napos nyúl retinája azt mutatja, hogy felnőtt állatban az M csapok denzitása relative magas marad. Mikronvonal: 2 µm

Tehát nyúl esetében is a fotoreceptorok kialakulási sorrendje: pálcika - S csap - M/L csap. Az eddig vizsgált emlősökben, akár homogén csap-eloszlású retinával rendelkeztek (patkány, hörcsög stb.), akár heterogénnel (egér, tengeri malac stb.) a sorrend ugyanennek bizonyult. Kivétel a főemlősök foveája, ahol ellentmondó eredmények születtek. A kifejlesztett csapszámláló program (ConeCount) segítségével, amelynél mindig meggyőződtünk arról, hogy csak a jelölt kültagokat számolja, meghatároztuk a színspecifikus csapok

denzitásának alakulását különböző korú, különböző fajtájú (Dutch belted, Új-Zéland) nyúlon. A hagyományos úton történő számolási eredményeket összehasonlítottuk a program által kapott eredményekkel. A kétféle módon nyert eredmények megegyeztek. A megjelent kék csapok denzitása (felületegységre eső száma) az életkor előrehaladtával lassan, fokozatosan kezdett emelkedni. A 14. posztnatális napra érte el a maximumát. Ez kb. 2000/mm2 volt, ami nem jelentett nagy kiugrást a csapok számában. A maximum elérése után, a 14. posztnatális napot követően, az S csapok denzitása lassan csökkenni kezdett és az első hónap vége felé, a 24. posztnatális napra már elérte a felnőtt állatokra jellemző szintet. A másik csaptípus számának alakulása teljesen eltérőnek bizonyult. Az első COS-1 pozitív csap megjelenése után, ezeknek a száma rohamos emelkedést mutatott, míg elérte a maximumot a második hét vége felé, a 1014. posztnatális napra. Ez a maximum denzitás kb. 12000/mm2 volt. Ezután a kiemelkedő csúcsot követően egy kisebb mértékű csökkenés jelentkezett. A denzitás azonban mindig 9000/mm2 körül alakult, ami már a felnőtt nyúlra jellemző (12. ábra).

csapok száma/mm2

12500 COS-1

10000

OS-2

7500 5000 2500 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

posztnatális napok 12. ÁBRA Színspecifikus csapok denzitásának alakulása az életkor függvényében fejlődő nyúl retinában. Az OS-2 pozitív S csapok denzitása (fekete oszlop) lassan emelkedik. Ezzel szemben az M csapok denzitása (pontozott oszlop) hirtelen megnő, a második posztnatális hétre eléri a csúcsát, majd kismértékben csökken.

Több felső, centrális terület csapjait megszámolva és ábrázolva ugyanilyen görbéket kaptunk. A kék csík területén, amely a legventrálisabb része a nyúl retinának, M/L csapok egyáltalán nem fordultak elő. Felmerülhet az a kérdés, hogy minek tudható be, mivel magyarázható a második hét utáni denzitás csökkenés. Ehhez mindenképpen hozzájárul a retina növekedése (kb. 10%-ra tehető a felületnövekedés), aminek üteme meghaladja a csapszám emelkedését. A mérési eredményeink azt tükrözik, hogy a fejlődő nyúl retina a 14. és 24. posztnatális nap között jelentősen növekszik, ami magyarázhatja a denzitásbeli csökkenést ezen két időpont között. A másik tényező a “programozott sejthalál” lehet, aminek fontos szerepe van a retina kialakulásában, a különböző sejtek eloszlásának létrejöttében. A csapok számának időbeli alakulása nyúlban eltér attól, amit pl. patkányban tapasztaltak [95]. Nincs meg ugyanis a pár napos retinában az OS-2 csapok hirtelen emelkedésével kialakult denzitási csúcs, ami aztán akkor kezd csökkenni, amikor a COS-1 pozitív csapok száma már emelkedik. Tehát nyúlban nem figyelhető meg a két csaptípus számának szimultán, de ellenkező értelmű változása. Ez megint felveti a látópigment koexpresszió kérdését, hiszen patkányban a kezdetben kialakult S csapok egy része kezd el M/L látópigmentet is termelni, ezért van szimultán változás a kétféle csap között. Lehetséges, hogy fejlődő nyúl retinában nincsenek kettősen jelölt csapok? A kérdésre a választ a tangenciális sorozatmetszetek adják meg. Ezeken a metszeteken egymás után következően felváltva alkalmaztuk a COS-1 és az OS-2 antitesteket. A metszetek azonos területeit ábrázoló részeket megkeresve és összehasonlítva próbáltunk kettősen jelölt csap-kültagokat találni. Az azonos részek megtalálásában a pigmentált Dutch belted fajtánál a pigmentsejtek elhelyezkedése volt segítségünkre, míg albino nyulaknál a csapmintázat alapján lehetett a retinákat nagy pontossággal azonosítani. A hagyományos fényképeket nagy figyelemmel helyeztük egymásra illetve egymás mellé (13.-14.ábra).

13. ÁBRA P12 napos nyúl retina tangenciális sorozatmetszetei. A képek bal felső sarkában látható apró fekete pontok a pigmentepithel sejtek granulumai. A keskeny nyíl az OS-2 pozitív (kék) csapokat jelzi, amelyek COS-1-gyel nem festődtek. A vastag nyíl a COS-1 pozitív (zöld) csapokat jelzik, amelyek OS-2-vel nem jelölődtek. Mikronvonal: 10 µm.

14. ÁBRA A 13. ábra nagyobb nagyítása. A hosszú függőleges nyíl az identikus pálcika-kültagokat jelzi, amelyek egyik csap-specifikus antitesttel sem jelölődtek. A ferde nyíl OS-2 pozitív csapra mutat, amely nem festődött COS-1-gyel. A rövid függőleges nyíl a COS-1 pozitív csapokat jelzi, amelyek OS-2-vel nem jelölődtek. Kettős csapok nincsenek. Mikronvonal: 5 µm.

A digitális kamerával készült képeken képfeldolgozó program (Adobe Photoshop 5.0) segítségével az OS-2 jelölt csapokhoz fekete színt rendeltünk. Majd az azonos területről készült képeket a program használatával szuperponáltuk egymásra. Így jól láthatóvá vált, hogy látópigment koexpresszió nem fordul elő. A metszeteket 12 naposnál nem fiatalabb állatokból készítettük, mert igaz ugyan, hogy már a 6-7. posztnatális naptól mindkét csaptípus jelen van, de számuk alacsony és kültagjuk nem elég hosszú, hogy két, három szomszédos metszeten látható legyen, így nem alkalmasak a vizsgálatra. Összesen harminc, fejlődő 12-20 napos állat közel száz tangenciális metszetét vizsgáltuk meg a fejlődéstani tanulmányunk során, de a retinában, a felső, centrális és a kék csík területén kettősen jelölt csapokat nem találtunk [I] (14-15. ábra).

15. ÁBRA P14 napos nyúl retina két egymást követő tangenciális sorozatmetszete egymásra szuperponálva digitális képfeldolgozással. Az egyik metszetet COS-1, míg a másikat OS-2 ellenanyaggal reagáltattuk, majd a digitálisan készült képeket figyelmesen, az identikus területeket megkeresve, egymásra helyeztük. Az M csapok szürke színűek (eredeti DAB szín), fekete nyilakkal jelölve, az S csapokhoz fekete színt rendeltünk fehér nyilakkal jelölve. Minden

immunopozitív csap vagy COS-1-gyel (fekete nyíl) vagy OS-2-vel (fehér nyíl) jelölődött. Kettős csapok nincsenek. Mikronvonal: 2 µm.

Ezzel szemben felnőtt, már nem fejlődő nyúl retinában volt egy vékony terület, mégpedig az átmeneti zóna (kék csík és a centrális terület között), ahol néhány kettős csapot találtunk. Lektincitokémiával, PNA lektint használva próbáltuk elkülöníteni nyúl retinában a színspecifikus csapokat egymástól. Az utóbbi években az ürgén kívül mókuscickányban is sikerült azt kimutatni, hogy a PNA a különböző csapokat másképpen jelöli [96]. Nyúl retinájában csak a pálcikákat lehetett megkülönböztetni a csapoktól. Az S és M/L csapok jelölésében nem mutatkozott eltérés (16. ábra). B

A

16. ÁBRA PNA reakció P24 napos nyúl retinán. A nyíl PNA pozitív csapot jelöl. Nyúlban nem különíthetők el ezzel a reakcióval az egyes csaptípusok. A hosszmetszeti kép. B keresztmetszeti kép. Mikronvonal: 5 µm

A denevér retinájának vizsgálati eredményei Több

denevérfajt

tanulmányoztunk

annak

érdekében,

hogy

retinájuk

morfológiájában vannak-e különbségek. Az ultrahangos tájékozódás előtérbe kerülése vajon befolyásolja-e a retina felépítését? Az általunk vizsgált Microchiroptera fajok (Myotis blythi oxygnatus, Rhynolophus ferrum equinum, Taphozous longimanus, Scotophylus hethai, Scotophylus temmenckii) kis szemmel rendelkeznek és retinájuk csökevényes, ami már fénymikroszkópos vizsgálat során kiderült. Elektronmikroszkóppal is tanulmányozva a retinákat, a fotoreceptorok nagy részének kültagja pálcika alakú, tehát pálcika-domináns retinával rendelkeznek. A külső magvas réteg igen fejlett, míg a ganglion sejtrétegben csak elszórtan találhatók sejtek. Néhány nagy ganglionsejt a bipoláris sejtek között helyezkedik el. Ezeknél a fajoknál más eltérést a retina felépítésében nem találtunk. A gyümölcsevő Cynopterus sphinx és Rousettus niloticus, Megachiroptera fajok érdekesebbnek bizonyultak. Ezeknek a nagy szemű állatoknak retina-morfológiai vizsgálataiból meglepő információkhoz jutottunk. A retinák fotoreceptor rétege nagy többségben igen fejlett, hosszú kültagú pálcikákat tartalmaz. A fotoreceptor réteg bel- és kültagjai azonban nem egy síkban helyezkednek el, hanem sajátos kriptákat alkotnak. Ezáltal egy gyűrt réteget hoznak létre, ami a retinának follikuláris elrendeződést ad. A bipoláris sejtek sora még követi a fotoreceptorok ezen képződményeit, de a retina más rétegei pl. a ganglion sejtek rétege és az opticus rostok rétege már nem [III] (17. ábra).

choroidea

kript külső magvas réteg

belső magvas réteg ganglionsejtek rétege

17. ÁBRA A gyümölcsevő Cynopterus sphinx és Rousettus niloticus denevér fajok retinájának fénymikroszkópos képe (40x). Ezeknek az állatoknak egy másik érdekessége, hogy a pigmentepitheliumban csak néhány pigmentgranulum található. Ehelyett a pigmentsejtek citoplazmájában különböző méretű zsírcseppek helyezkednek el. A pigmenthámhoz a choroidális oldal felől pigmentszemcséket tartalmazó, több sorban lévő melanofór-sejtek kapcsolódnak, amelyek bevezetnek a fotoreceptorok által létrehozott kripták közé. Choroidális papillanak is nevezhetjük ezeket (18. ábra).

18. ÁBRA A gyümölcsevő denevér (Rousettus niloticus) retinájának részlete (21600x). A pigmenthámhoz a choroidea felől pigmentszemcséket tartalmazó melanofór sejtek kapcsolódnak. P: pigmenthám, C: choroidea, K: fotoreceptor-kültag A retina ezen follikuláris szerveződése lehetséges, hogy a környezet fényperiodicitásának érzékelésére szolgál, mivel a “gyűrt” retina kétdimenziós képek dekódolására nem képes. Feltételezzük, hogy a retina ezen sajátságos szerkezete az éjjel aktív fajok szemének fényérzékelő tevékenységéhez kapcsolódik [III].

Megbeszélés A fotoreceptor-sejtek “születése” Ismert tény, már több fajban igazolták [74], hogy a csapsejtek korábban válnak elkötelezetté, mint a pálcikák, amelyek a retina legfiatalabb sejtjei közé tartoznak. Egér retinában radioaktív timidin beépülésével megállapították, hogy a csap-sejtek nagy része már a 13. embrionális napon posztmitotikussá válik, míg a pálcika-sejtek esetében ez csak az egér születése körül következik be [21]. Transzgenikus egér vonallal is megkeresték azt az időt, amikor az egyes sejtek elkötelezetté válnak. Emberi kék látópigment génjét, mint promotert megfelelő reporter génnel (β-galaktozidáz, lacZ, humán növekedési hormon) fúzionálva a géntranszkripció nyomon követhető, mégpedig a reporter géntermék megjelenése jelzi a promoter gén aktivációjának időpontját [112]. Ezen kísérletek szerint is a csappá determinálódás az embrionális 13. napra tehető [24]. Ezzel szemben a pálcikák fenotípusának kialakulása mégis megelőzi a csapokét [12,74,85,86]. A pálcika-sejtek gyorsabban differenciálódnak, a csapok mintha információra várnának. Lehetséges, hogy a csapok differenciálódása korán megtörténik más sejttípusoktól, így a pálcika-sejtektől, de egymástól később válnak el, amikor a pálcikák már rodopszint expresszálnak. Fejlődő nyúl retináját vizsgálva hasonló eredményt kaptunk, az anti-rodopszin pozitív elemek korábban jelentek meg, mint a színspecifikus csapok. Az aranyhal is modellként szolgál az emlős retina fejlődésének kutatásában. Ebben a fajban in situ hibridizációval kimutatták, hogy a pálcikák rodopszin termelése megelőzi a csapok opszin termelését. A sejtek születése és a sejt opszin-expressziójának megindulása (differenciálódás) között, több idő telik el a csap-sejteknél, mint pálcikasejteknél [85,86]. Ismert tény, hogy nem az opszin az első fotoreceptor-specifikus géntermék,

ami

a

fotoreceptorok

differenciálódásakor

keletkezik.

Az

IRBP

(interphotoreceptor retinoid binding protein) emlősökben megelőzi a rodopszin expresszióját, így korai differenciálódási indikátornak tekinthető [43]. Wagenhorst 1985-ben klónozta az aranyhal IRBP-t, amely ebben a fajban csak a csapokban termelődik, tehát már korán elkülöníthető a két fő fotoreceptor-típus ezzel az általános csap-markerrel. Az aranyhalban a pálcika-sejtek születése után 3 nappal kezdődik el a

rodopszin termelése, ezzel szemben csap-sejtekben csak 7-12 nappal a “születésnapjuk” után lehet az opszin-fehérjét kimutatni [101]. Azt is sikerült bizonyítani in situ hibridizációval, hogy ebben a fajban a legkorábbi állapotoktól kezdve csak egyféle opszin-típus expresszálódik, nincs koexpresszió. Feltették, hogy a csapok kialakulása már fenotípus szerint különböző korban történik, ám valószínűbbnek látszik az, hogy a csap-sejtek egyszerre alakulnak ki, csak a differenciálódásuk esik különböző időpontra [85,86]. A fejlődő emlős retinákban is ez a feltevés valószínűsíthető. Lehetséges, hogy a posztmitotikus pálcikák a közeli csapokat specifikus opszin termelésére késztetik. A pálcikák és a csapok közötti kommunikáció így fontosnak bizonyulhat és a pálcikák ezáltal szerepet játszhatnak a csap-mozaik kialakulásában, felépülésében. Nyúlban a színspecifikus csapok kialakulási sorrendje az egyedfejlődés során megegyezett azzal, amit az eddig vizsgált emlősökben találtak (pálcika – S csap – M/L csap). Ettől ellentétes adataink csak a főemlősök csapjainak fejlődéséről vannak. Nézzük meg, hogy mit tudunk a főemlősök, így az emberi retina fotoreceptorainak topográfiájáról és kialakulásáról!

A főemlősök fotoreceptorainak eloszlása A főemlősök retinája több évtizede a kutatás középpontjában áll. Régóta tudjuk, hogy az emberi fovea centralis-ban kizárólag csapok helyezkednek el, a pálcikák teljesen hiányoznak. Ismert továbbá, hogy a foveális csapok átmérője a perifériás csapoknál kisebb, így több található belőlük egységnyi területen. Az utóbbi évek azonban sok új eredményt hoztak a főemlősök színlátásában. Emberben átlagosan 4.6 millió csap és 92 millió pálcika található. A teljes retinát figyelve a pálcika-csap arány 20:1 [27]. A főemlősök retinájában az egyes csapokat körülvevő pálcikák viszonylag szabályos körben helyezkednek el. A foveához közelítve egyre alacsonyabb lesz a pálcika-csap arány, egyre kevesebb pálcika fog egyegy gyűrűt alkotni. A fovea közelében a pálcikák rendezettsége felbomlik, és a discus nervi optici körül elérik denzitási csúcsukat, a pálcika-gyűrűn (rod ring), majd bizonyos

fajokban, így az emberben is teljesen eltűnnek a fovea területéről [29]. Pálcikák tehát a humán foveában nincsenek, a pálcika-mentes terület átmérője kb. 0.35 mm [27]. Vannak azonban olyan főemlős fajok, ahol kis számban ugyan, de előfordulnak pálcikák az éleslátás helyén. A legnagyobb csap denzitással minden főemlősben a fovea rendelkezik [13,27,29]. A csapok száma a periféria felé fokozatosan csökken. Az emberi retina perifériáján kimutattak ugyan egy csapokban gazdagabb területet, ami valószínűleg fejlődéstanilag egy ősibb résznek felel meg. Ez nem nő jelentősen a szem fejlődése során, és így a pálcikák, mint a fiatalabb fotoreceptor-sejtek kevesebb számban vannak itt jelen [109]. Már 1977-ben nitroblue tetrazólium-mal (NBT) kimutatták, hogy páviánban a kék csapok aránya 12-14% a színspecifikus csapokhoz képest. Később más majomfajban is hasonló összefüggéseket kaptak, sőt anti-kék opszin ellenanyagot használva is ugyanilyen

eredmények

születtek

[30,31,104].

Főemlősökben

a

közép-,

és

hosszúhullámú csapok eloszlását nehéz feltérképezni, mert a vörös és zöld csapok morfológiailag igen hasonlóak és specifikus ellenanyag sem áll rendelkezésre az elkülönítésükre. NBT hisztokémiai kísérlettel azonban sikerült mind a három csaptípust páviánban megtalálni, és ez azt is kimutatta, hogy kb. másfélszer annyi zöld csap helyezkedik el a retinában, mint vörös-érzékeny. Pszichofiziológiai módszerekkel más eredményt kaptak embernél, mégpedig a vörös csapok számát kétszer annyinak találták, mint a zöldekét mind a foveában, mind a periférián [25]. Mikrospektrofotometriával a foveában az L és M csapok aránya 1:1-nek bizonyult [64]. Ezeknek az eltérő eredményeknek a magyarázatát még nem ismerjük. A főemlősök retinális mintázata nem alkot egységes képet. A fajok között, de még egy fajon belül is variációk fordulnak elő. Az óvilági majmok, emberszabású majmok és az ember trikromatikus színlátású. Újvilági majmokban nagyfokú polimorfizmus mutatkozik, lehetnek di- vagy trikromátok is. Ezeknél a fajoknál derült fény arra, hogy a színlátás nemtől való függőséget is mutat. A hímneműek mind dikromátok, míg a nőneműek dikromátok, ha homozigóták vagy trikromátok, ha heterozigóták.

Néhány

nokturális

főemlős

monokromát,

ugyanis

következtében a meglévő S opszin génje nem expresszálódik [13,46].

mutációk

Miért jelentett előnyt a trikromácia? Talán a zöld környezetben a színes gyümölcsök könnyebb, gyorsabb felismerése vált ezzel lehetővé [13]. Humán vizsgálatok alapján egy meglepő jelenséget írtak le először az éleslátás helyéről. A felnőtt emberi fovea kb. 100 µm-es központi részén a kék csapok teljesen hiányoznak. A kék csapokat nem tartalmazó fovea rész szabálytalan alakú, nem pontosan a legmagasabb csapdenzitás közepén helyezkedik el. Később kiderült, hogy emberben legnagyobb ez a terület, de más főemlős fajban is megtalálható. Vannak olyan fajok is, amelyek foveájában nincsen rövidhullám-érzékeny csap-mentes terület. [13,28,56,104,105]. Az ún. foveális tritanópia pontos magyarázata azonban még nem ismert. Lehetséges, hogy egy korfüggő, patológiás helyzetről, degenerációs jelenségről van szó, amit az is bizonyíthat, hogy fejlődő Rhesus majom foveájában mindenhol kimutattak S csapokat [77]. Hogyan oszlanak el a kék csapok a retinában? Itt sincs egységes kép. Az újvilági majmokban, ahol kék-mentes területet nem lehet elkülöníteni a foveában, random elhelyezkedést állapítottak meg. Az óvilágiaknál és az emberszabásúaknál viszont szabályos hexagonális elrendeződést lehet találni. A középen elhelyezkedő egy S csap körül hat M/L csap mutatható ki [56]. Felmerült az a kérdés, hogyan fejlődik ki az éleslátás helye, hogyan jön létre a kék csap mentes terület? Mikor jön létre a jellemző mintázat?

A fovea fejlődése Főemlősökben a foveában jelennek meg leghamarabb a fotoreceptor-sejtek. A multipotens progenitorsejtekből először a csap-sejtek alakulnak ki, majd a periféria felé haladnak. A pálcika-sejtek keletkezése 5-10 nappal később következik be. A fotoreceptor-sejtek kb. 60-90 nap múlva érkeznek el a központból, azaz a foveából, az ora serrata-hoz [13]. Az első immuncitokémiailag kimutatható csap, a 80. embrionális nap körül jön létre. Ezeket a fotoreceptorokat először M/L csapoknak azonosították [105]. Az újabb vizsgálatok kapcsán ezzel ellentétes adatok láttak napvilágot, mégpedig az, hogy a foveában az M/L és S csapok egyszerre jelennek meg, míg az extrafoveális retinaterületeken a kék-érzékenyek az elsők. A korábban megjelenő csapok a körülöttük

lévő sejteket specifikus fotopigment termelésére késztethetik. Többen az S csapokat tartják irányítóknak, amik telodendritjeik révén szabályozhatják azt, hogy a szomszédos sejtek ne kék opszint termeljenek [12,13]. A fejlődés előrehaladtával egyre több fotoreceptor alakul ki, és a fovea a 100. embrionális napra már a felnőttre jellemző képet adja, tehát egy S csap helyezkedik el hat M/L csap közepén. A fovea egy részén néhány főemlős fajban és az emberben nincsenek kék csapok. Immuncitokémiai vizsgálatok során a pigmenthám leválasztása közben a kültag sérülhet, ami miatt egy ideig általánosnak vélték a rövidhullám-érzékeny csapok hiányát a főemlős fovea kis részén. Ezzel szemben bizonyos fajokban (pl.makákó) in situ hibridizációval felnőtt állatban is kimutattak a fovea közepén S csapokat [13]. Az OS-2 antitest felhasználásával pedig bizonyították, hogy a 142 napos Rhesus majom embrióban a fovea egészében találhatók S-csapok, tehát embrionális korban, a fejlődés kezdetén, még nem hiányoznak a kék-érzékeny fotoreceptorok [77]. Feltételezik, hogy a kék csap, amelynek térbeli feloldóképessége kisebb, kiszorul erről a területről a tökéletesebb látás érdekében. Nem tudni, hogy ezek a csapok a fejlődés során pusztulnak-e el vagy a fovea átrendeződése következtében tűnnek el. Mi lehet az oka a főemlős foveában a különböző S csap eloszlásnak? Az egyik lehetőség, hogy a genetikai vagy lokális tényezők a retinális progenitorsejtekre különbözőképpen hatnak és így egyes fajok foveájának központi része expresszál kék pigmentet, míg más fajoké nem. Többen azt tartják, hogy a lokális tényezők döntik el a fotoreceptorok fenotípusának kialakulását. A másik lehetőség, hogy minden faj foveájának egészében jelen vannak a rövidhullám-érzékeny csapok, de bizonyos fajokban eltűnnek a központi részről, programozott sejthalál áldozatává válnak, még mielőtt kék opszint expresszálnának. Ezt támasztja alá az is, hogy Röhlich 1994-ben fetális majom foveájában jelentős mennyiségű S csapot mutatott ki, Dorn 1995-ben pedig pálcikákat írt le ugyanitt. A fejlődő főemlős retinában azonban eddig apoptózist nem sikerült kimutatni. Az előző állításokból feltételezhetjük, hogy a kék csapok illetve a pálcikák, amelyek az embrionális életben jelen vannak a fovea egészében, vagy kivándorolnak onnan, vagy az M/L csapok haladnak keresztül rajtuk a fovea középpontjába. Egy következő lehetőség, hogy az S csapok M/L fenotípusúvá változnak a fovea bizonyos részén. Emberben azonban eddig nem sikerült kettős csapokat, azaz látópigment koexpressziót kimutatni [13]. Ha ez az opszin expressziója előtt következik

be, akkor nagyon nehezen lehet ezt bizonyítani. A későbbi transzdifferenciálódásnak viszont ellentmond az, hogy új szinaptikus kapcsolatokat kellene kiépíteni, vagy esetleg a nem megfelelő szinapszisoknak kellene megszűnni. Az még kutatás tárgyát képezi, hogy a késői fetális korban lehetségesek-e ilyen változások.

A színlátás hibái Emberben a közép- és hosszúhullám-érzékeny látópigmentek variációi, hibái fordulnak elő leggyakrabban. A lakosság kb. 5%-át érintik ezek a színlátási anomáliák. A

zöld-érzékeny

pigment

hibáját

deuteranomáliának,

míg

teljes

hiányát

deuteranópiának nevezzük. A vörös színlátás zavara a protanomália, míg a vörös látópigment teljes hiánya a protanópia. A kék színvakság a tritanópia, amely bizonyos főemlősök foveájának kis részén normálisan is megtalálható [1]. Anomális trikromácia akkor jön létre, ha az eredetitől eltérő abszorpciós maximummal rendelkező fotopigment jelenik meg. Ezek érzékenysége általában 6 nmnyi eltérést mutat. Az M és L opszin-fehérjék abszorpciós különbségei gyakoribbak, amelyeket a génszekvencia igen kis mértékű eltérései okoznak. Az M és L pigmentek egy génduplikáció következtében válhattak el egymástól. Először az X kromoszóma egy lókusza kódolta ugyanis ezeket a pigmenteket, amelyek nagyfokú polimorfizmust mutattak. Majd az X kromoszómán tandem sorrendben elhelyezkedő két lókuszt foglaltak el. Emberben kimutatták, hogy az X kromoszómán a vörös pigment génje helyezkedik el proximálisabban, amelyet egy vagy több zöld pigment-gén is követhet. A lakosság 25%-a két pigment-gént hordoz, 50% hármat, 20% négyet, 5% ötöt vagy többet [66,67,110]. Ha kétfajta csappigment hiányzik, akkor azt monochromasiának, míg a teljes színvakságot achromatopsiának nevezzük. A színlátás zavarai lehetnek öröklöttek és szerzettek. A vörös és zöld csappigmentek génjei X kromoszómához, nemhez kötötten, míg a kék csappigment autoszomálisan (7. kromoszóma) öröklődik. A színlátás szerzett

zavarai közül csak néhányat említek: a fénytörő közegek homályát, a retina felszínén lévő vérzést, exsudátumot, illetve a csapok sérülését.

Retinális degenerációk Számos degeneratív retina megbetegedés létezik, amelyek a fotoreceptorok kóros működését, öregedését vagy elpusztulását idézik elő. Ezekben a betegségekben korai apoptózist, programozott sejtelhalást lehet kimutatni. A fotoreceptorok kültagja kezdetben széttöredezik, a citoplazma és a kromatin kondenzálódik, majd az elpusztuló részekből, maradványokból létrejön az ún. “apoptótikus test” [76]. Retinitis pigmentosa-ban, amely a leggyakoribb primer retinális dystrophia, a pálcika külső szegmense dezorganizálódik, megrövidül és létrejön a betegség legjellemzőbb klinikai tünete a hemeralópia. A struktúrfehérjék expresszálódását vizsgálva, a periferinről, amely a kültag korai fejlődésében is részt vesz, kimutatták, hogy más fehérjékkel komplexet alkotva a külső szegmens fotoreceptor-membránját stabilizálja. Ezen struktúrfehérje mutációja következtében instabillá válik a membrán és a degeneratív retina megbetegségekhez hasonló, jellegzetes szövettani elváltozások alakulnak ki [83]. Felmerül a kérdés, hogy az öröklődésen kívül a fény vagy más exogén faktorok szerepet játszanak-e ezen betegségcsoport kialakulásában. Több transzkripciós faktorról, protoonkogénről kiderült, hogy befolyásolják a programozott sejthalál létrejöttét (pl. c-fos). A diurnális ritmus zavara is retinadystrophiát okozhat. Érdekes, hogy kék fénnyel masszív apoptózist tudtak előidézni, míg zöld fénnyel nem. Erre a magyarázatot az adhatja meg, hogy kék fényre a rodopszin képes regenerálódni, és „knock out” egereken pedig kimutatták, hogy a programozott sejthalál csak rodopszin jelenlétében alakul ki [76]. Az egerekben előforduló “rd” (retinal degeneration) elnevezésű kórkép modellként szolgálhat az emberi retinadegenerációk kutatásában. Egy SJL elnevezésű laboratóriumi egértörzsben az rd degeneráció egy intraretinális tumorral szövődött és a fejlődő retina redőzötté vált, mintha a rendelkezésre álló hely nem lenne elegendő számára. A betegség létrejöttéért egy olyan génmutációt tettek felelőssé, amelynek következtében a foszfodiészteráz (PDE) enzim funkciója kiesett. Így a fotoreceptorok

kültagjaiban a cGMP szint megnövekedett, ami már igen korán, a morfológiai elváltozások előtt kimutatható volt. Ennek ellenére ezen mutáns egerekben a fotoreceptorok kialakulása, morfogenezise időben megindult, a kóros állapot kezdetben morfológiailag nem volt felismerhető. A második héten azonban a fotoreceptorok, ezek közül is inkább a pálcikák száma jelentősen csökkent [14,15,97]. Különböző korú normális és rd egeret összehasonlítva az a meglepő eredmény született, hogy a csapok fejlődése normálisan megindult, sőt még a kétféle csaptípus eloszlása is ugyanolyannak mutatkozott mindkét esetben. A csapok a degeneráció során végig megőrzték a kezdetektől fennálló regionális különbségüket. A degeneráció kezdetén a pálcikák nagymértékben elpusztultak, de a csapok nem követték ezt. Még kb. az 5. hónapban is nagy számban kimutathatók voltak a retinában. Ezek a csapok azonban már súlyosan degenerálódtak, hiszen sok csap egésze immunreaktívnak bizonyult, valamint a csapok között nagyfokú reakció-erősségbeli különbségek is mutatkoztak, ami a fotoreceptor-membrán károsodásával magyarázható. Ezek az immuncitokémiai változások azt tükrözik, hogy a színspecifikus látópigmentek jelen vannak ugyan, de valószínűleg a fotorecepció már károsodott [97]. Távlati cél természetesen a lassan, több év alatt kialakuló degeneratív betegségek állatmodellezésén túl, retinatranszplantációval történő gyógyításuk. Megoldást jelenthet azonban a génterápiás Bcl-2 túltermelés is, ugyanis a Bcl-2 proteinről az utóbbi években mutatták ki, hogy túlprodukciója elpusztítja az apoptótikus fotoreceptorokat [76].

A retinatranszplantáció kérdései Visszatérve az általam intenzívebben vizsgált nyúl retinára, az irodalmi háttérben leírt retina átültetéssel kapcsolatos feltevéseket egészíteném ki. A fotoreceptorok kialakulási sorrendje mind az átültetés, mind a normál fejlődés esetében ugyanannak bizonyult (pálcika, S csap, M/L csap). Ezek mellett ismertté vált, hogy nyúlban a csapok differenciálódása transzdifferenciálódás nélkül zajlik le. Az a feltevés így elvethető, hogy az átültetés során amiatt található kevesebb zöld-érzékeny csap, mert a kék csapokból nem tudnak azok létrejönni, átalakulni [89].

Ebben az állatban nem a kék csapokból transzdifferenciálódnak a zöld-érzékenyek, hanem egymástól függetlenül fejlődnek. A még éretlen csapsejtek válnak az átültetés áldozataivá. Lehetséges, hogy a zöld látópigmentet termelő csaptípus sebezhetőbb, okozva ezzel azt, hogy kísérletes körülmények között a rövidhullám-érzékeny csapok „uralkodnak” felettük. Többen azonban nem értenek ezzel egyet, hiszen az S csapok jobban ismertek arról, hogy különböző ártalmas ágensekkel szemben érzékenyek. A leglogikusabb magyarázatnak az tűnik, hogy a két csaptípus zavartalan fejlődéséhez szükséges faktorok közül azok, amelyek az M/L csapok differenciálódásához nélkülözhetetlenek, nincsenek jelen, ellenben az S csapok kialakulásához szükségesek jelen vannak [6,89]. Ha egy fotoreceptorban a látópigment expressziója elkezdődött, akkor az a látósejt már elkötelezte magát, fenotípusa kialakult. Az átültetés pillanatában a pálcikák már valószínűleg elkötelezték magukat, így a manipuláció ellenére fejlődésük zavartalan. Ezzel szemben a kétféle csap-osztály elkülönülése még ekkor nem indult el vagy csak éppen elkezdődött. A kísérletes körülmények, az átültetés pedig egy hibás differenciálódási útnak kedveznek, amely feltehetőleg a kék pigment szintézise. Így a később kialakuló zöld csapok differenciálódása zavart szenved. A faj-, és szervspecifikus környezet azonban még lehetővé teszi, hogy a zöld-érzékeny elemek ne hiányozzanak teljesen.

Két “út” a csapok differenciálódásában A színspecifikus csapok differenciálódása nyúlban eltérőnek bizonyult a patkány és a mókuscickány retinájában tapasztalttól. Ebben az állatban nem figyelhetők meg kettős csapok a fejlődés során, nincsen átmeneti látópigment koexpresszió. Ezek alapján a csapok fejlődése, differenciálódása legalább két különböző fejlődési mechanizmussal jöhet létre. Összefoglalva ismertetném ezt a két utat. Azokban az emlős fajokban (patkány, mongolhörcsög, mókuscickány), amelyek retinájában nincsen dorzo-ventrális topográfiai asszimmetria, egyenletes eloszlásban vannak jelen a csaptípusok, minden csapban a kék pigment szintézise kezdődik el először. Majd egy eddig még ismeretlen tényező hatására, bizonyos csapok letérnek a

kék pigmentet termelő útról és zöld pigmentet kezdenek expresszálni. A két fotopigment ezekben a csapokban egy ideig együtt, szimultán jelen van, átmeneti látópigment koexpresszió alakul ki. A felnőtt állatokban azonban már minden csap csak egy pigmentet expresszál. A zöld csapok transzdifferenciálódással jönnek létre. Az M/L csapokká azok alakulnak, amelyekben az eredeti kék-érzékeny pigment termelése, a zöld pigment szintézisének megkezdésével, fokozatosan megszűnik. Az S-csapok pedig azok lesznek, amelyek életük végéig S-pigmentet termelnek, a zöld pigment expresszálása el sem kezdődik bennük (19. ábra).

újszülött

3-4 napos

6-7 napos

12-14 napos

felnõtt

19. ÁBRA Csapok fejlődése transzdifferenciálódással. A fekete terület a kék (UV)-érzékeny csapokat, a fehér terület a zöld-érzékeny csapokat, míg a szürke terület azokat a csapokat jelzi, amelyek mindkét fotopigmentet szintetizálják. Először minden csap kék (UV) pigmentet expresszál, majd később egyes csapokban a zöld pigment szintézise elkezdődik. Ezekben a csapokban létrejön a látópigment koexpresszió, de felnőtt állatban minden csap már csak egy fotopigmentet termel. A másik csap-differenciálódási út azokban a fajokban figyelhető meg (nyúl), amelyek felnőtt egyedei osztott retinával, heterogén csap-eloszlással rendelkeznek. A színérzékenység ezekben az állatokban korán eldől, a végső fenotípusnak megfelelő fotopigment expresszálódik a kezdetektől. A látópigmentek már a szintézis kezdetén kétfélék. A megjelenő első csapok kék pigmentet termelnek, de a később kialakuló csapok egyből a zöld pigment termelését kezdik el, tehát kettős csapok nincsenek. Ezekben az esetekben nincs a retina fejlődése során látópigment koexpresszió, nincs transzdifferenciálódás (20.ábra).

újszülött

3-4 napos

6-7 napos

12-14 napos

felnõtt

20. ÁBRA Csapok fejlődése transzdifferenciálódás nélkül. A fekete terület a kék (UV)-érzékeny csapokat, a fehér terület a zöld-érzékeny csapokat jelzi. Az először megjelenő csapok kék (UV) pigmentet termelnek, majd később megjelennek a zöld-érzékeny csapok. Kettős csap, látópigment koexpresszió nincs.

Az emlősök nagy részében a fejlődő retina látópigment koexpressziója nem tükröződik. Úgy tűnik, hogy a transzdifferenciálódás nem domináns útja a csapok differenciálódásának. Az eddigi vizsgálatok alapján az egyes fajokban vagy az egyik vagy a másik differenciálódási út van jelen. Nem tisztázott még, hogy mindkét folyamat szerepet játszhat-e ugyanazon retina ontogenezisében. Természetesen további kutatásokra van szükség ahhoz, hogy ezekre a kérdésekre választ kapjunk illetve, hogy más differenciálódási utakat is megismerjünk, valamint azokat kísérletekkel is igazoljuk.

A látópigment koexpresszió tér- és időbeli összehasonlítása A nyúl retina térbeli eloszlását összehasonlítva a fejlődő patkány retina időbeli eloszlásával meglepő hasonlóságot kapunk. A ventrális és dorzális területek térbeli eloszlása a nyúl retinában az átmeneti zónával együtt, hasonlít a patkány retina fejlődési szintjeihez, állomásaihoz [95]. A nyúl retina legventrálisabb része csak S csapokat tartalmaz, az egy hetes fejletlen patkány retinához hasonlóan. A nyúlban lévő átmeneti zóna kettős csapjai, analógok a két, három hetes patkány retinában található kettős

csapokkal. A dorzális retina pedig sok zöld csappal rendelkezik, mint ahogy a felnőtt patkány retinában is magas az M/L és S csapok aránya. Itt már nincsenek kettős elemek. Felfogható ez úgy is, hogy a különböző csap-mintázatok megfelelnek egy-egy az evolúció során megjelenő fejlődési stádiumnak. Ha az S csapok átmeneti szerepet töltenek be az M csappá alakulásban, akkor azok a területek, ahol nem jelenik meg az M csap, egy ősibb részét képezik a retinának, amely a filogenezisben vagy ontogenezisben megrekedt. A kisebb, nagyobb S-mezők lehetséges, hogy a fotoreceptorok evolúciójának bizonyos állomásait tükrözik. Ennek teljes bizonyításához azonban még több faj színspecifikus csapjainak fejlődését meg kell vizsgálni. Az eddigi megfigyelések alapján az ősibb csapok kék pigmentet termelnek, és a homogén eloszlású retinákban (pl. patkány) a differenciálódás a retina egészén végigvonul, ezért vannak mindenhol az ideghártyában zöld csapok is. Azokban az állatokban, amelyek osztott retinával rendelkeznek, a ventrális retinarész nem megy keresztül az átváltozáson, azon a területen minden csap “fejletlen” állapotban marad, kék pigmentet szintetizálva. A közönséges házi egér mutatja a legősibb állapotot, mert itt az átmeneti zóna a horizontális meridiánra lokalizálódik, tehát már a retina felénél megakad a differenciálódás folyamata. A nyúlban csak megközelíti ez a folyamat a legventrálisabb részt, de nem éri el azt, ezért kimarad egy keskeny ventrális csík az átalakulásból. Olyan fajt még nem találtak, ahol csak kék csapok lennének, azaz a legősibb fejlődési stádiumot képviselnék. A csak zöld-specifikus csapokat tartalmazó fajok retináit azonban nem lehet ebbe az elképzelt rendszerbe besorolni. Vajon ezen állatok retinái utólag veszítették el kék csapjaikat vagy az átalakuláskor tűntek el minden kettős csapból a kék látópigmentek? A jövő kutatásai valószínűleg megadják a magyarázatot ezekre a vitatott kérdésekre.

Köszönetnyilvánítás

Szeretném őszinte, hálás köszönetemet kifejezni témavezetőmnek, Dr. Szél Ágoston egyetemi tanárnak, aki bevezetett a retina fejlődésbiológiai kutatásaiba és fáradhatatlanul segítette, kiemelt figyelemmel kísérte munkámat. Sok hasznos tanáccsal, észrevétellel látott el a kísérletes kutatómunka, valamint a publikációk elkészítése során. Köszönöm programvezetőmnek, Dr. Oláh Imre egyetemi tanárnak segítőkészségét és mindenkor megértő szavait. Köszönet Dr. Vígh Béla egyetemi tanárnak, aki újabb ötletekkel, megjegyzésekkel, szakirodalommal és sok-sok biztatással támogatott. Köszönöm továbbá Dr. Röhlich Pál egyetemi tanárnak megjegyzéseit, segítségét. Köszönet illeti a Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet Elektronmikroszkópos Laborjának minden dolgozóját, akik nagyon lelkesen és kitartóan segítették munkámat, valamint meleg baráti légkört teremtettek számomra. Végül szeretném megköszönni szüleimnek és családomnak mindazt a biztatást, amivel a kutatás során mellettem álltak.

Irodalomjegyzék

1. ALBERT B (1994): Szemészet. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest p55-57. 2. AHNELT PK (1985): Characterization of the color related receptor mosaic in the ground squirrel retina. Vision Res. 25: 1557-1567 3. AHNELT PK, KERI C, KOLB H (1990): Identification of pedicles of putative bluesensitive cones in the human retina. J. Comp. Neurol. 239: 39-45 4. AHNELT PK, KOLB H, PFLUG R (1987): Identification of a subtype of cone photoreceptor, likely to be blue sensitive, in the human retina. J. Comp. Neurol. 255: 18-34 5. BEAUDET L, FLAMARIQUE IN, HAWRYSHYN CW (1997): Cone photoreceptor topography in the retina of sexually mature pacific salmonid fishes. J. Comp.Neurol. 383: 49-59 6. BERGSTRÖM A, EHINGER B, WILKE K, ZUCKER CL, ADOLPH AR, SZÉL Á (1994): Development of cell markers in subretinal rabbit retinal transplants. Exp. Eye Res. 58: 301-313 7. BLANKS JC, JOHNSON LV (1984): Specific binding of peanut lectin to a class of retinal photoreceptors cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25: 546-557 8. BLANKS JC, JOHNSON LV (1983): Selective lectin binding of the developing mouse retina J.Comp.Neurol. 221:31-41 9. BOK D (1985): Retinal photoreceptor-pigment epithelium interactions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 26:1659-1694 10. BÖNIGK W, ALTENHOFEN W, MÜLLER F, DOSE A, ILLING M, MOLDAY RS, KAUPP UB (1993): Rod and cone photoreceptor cells express distinct genes for cGMPgated channels. Neuron 19: 865-877

11. BRUHN SL, CEPKO CL (1996): Development of the pattern of photoreceptors in the chick retina. J. Neurosci. 16: 1430-1439 12. BUMSTED K, JASONI C, SZÉL Á, HENDRICKSON A (1997): Spatial and temporal expression of cone opsins during monkey retinal development. J. Comp. Neurol. 378: 117-134 13. BUMSTED K, HENDRICKSON A (1999): Distribution and development of shortwavelength cones differ between Macaca monkey and human fovea. J. Comp. Neurol. 403: 502-516 14. CAFFE AR, SÖDERPALM A, VAN VEEN T (1993): Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr.Eye Res. 12: 719-726 15. CAFFE AR, SZÉL Á, JULIUSSON B, HAWKINS R, VAN VEEN T (1993): Hyperplastic neuroretinopathy and pigment epithelial cell disorder precede accelerated retinal degeneration in the SJL/N mouse. Cell Tiss. Res. 271: 297-307 16. CALDERON JB, JACOBS GH (1995): Regional variations in the relative sensitivity to UV light in the mouse retina. Vis. Neurosci. 12:463-468 17. CALDERON JB, JACOBS GH (1999): Cone receptor variations and their functional consequences in two species of hamster. Vis. Neurosci. 16: 53-63 18. CAMERON DA, EASTER SS (1993): The cone photoreceptor mosaic of the green sunfish, Lepomis cyanellus. Vis. Neurosci. 10: 375-384 19. CARTER-DAWSON LD, BURROUGHS M (1992): Percentage of cones in the mouse retina assessed from PNA labeled interphotoreceptor matrix. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33: 815 20. CARTER-DAWSON LD, LAVAIL MM (1979): Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188:245262

21. CARTER-DAWSON LD, LAVAIL MM (1979): Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidin. J. Comp. Neurol. 188: 263-272 22. CHANG WS, HARRIS WA (1998): Sequential genesis and determination of cone and rod photoreceptors in Xenopus. J. Neurobiol. 35: 227-244 23. CHAO LY, HUFF V, STRONG LC, SAUNDERS GF (2000): Mutation in the PAX6 gene in twenty patients with aniridia. Hum. Mutation 15: 332-339 24. CHEN J, TUCKER CL, WODFORD B, SZÉL Á, LEM J, GIANELLA-BORRADORI A, SIMON MI, BOGENMANN E (1994): The human blue opsin promoter directs transgene expression in short-wave cones and bipolar cells in the mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91: 2611-2615 25. CICERON CM, NERGER JL (1989): The relative numbers of long-wavelengthsensitive to middle-wavelength-sensitive cones in the human fovea centralis. Vision Res. 29: 115-128 26. CSERHÁTI P, SZÉL Á, RÖHLICH P (1986): Four cone types characterized by antivisual pigment antibodies in the pigeon retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 7481 27. CURCIO C, SLOAN KR, KALINA R, HENDRICKSON A (1990): Human photoreceptor topography J.Comp.Neurol. 292:497-523 28. CURCIO C, ALLEN KA, SLOAN KR, LEREA CL, HURLEY JB, KLOCK IB, MILAM AH (1991): Distribution and morfology of human cone photoreceptors stained with antiblue opsin. J. Comp. Neurol. 312: 610-624 29. CURCIO C, HENDRICKSON A (1991): Organization and development of the primate photoreceptor mosaic. Progr. Retinal Res. 10: 89-120 30. DE MONASTERIO FM, MCCRANE EP, NEWLANDER JK, SCHEIN SJ (1985): Density profile of blue-sensitive cones along the horizontal meridian of macaque retina. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci.26: 289-302

31. DE MONASTERIO FM, SCHEIN SJ, MCCRANE EP (1981): Staining of blue-sensitive cones of the macaque retina by a fluorescent dye. Science 213: 1278-1281 32. DJAMGOZ MBA, ARCHER SN, VALLERGA S: Neurobiology and clinical aspects of the outer retina. Chapman & Hall, London 1995. p25-55 33. EISNER A, MACLEOD DIA (1980): Blue-sensitive cones do not contribute to luminance. J. Opt. Soc. Am. 70: 121-123 34. FAMIGLETTI EV, SHARPE SJ (1995): Regional topography of rod and immunocytochemically characterized “blue” and “green” cone photoreceptors in rabbit retina. Vis. Neurosci. 12: 1151-1175 35. FARBER DA, LOLLEY R (1976): Enzymatic basis for cyclic GMP accumulation in degenerative photoreceptor cells of mouse retina J. Cyclic Nucl. Res. 2:139-148 36. FASICK JI, CRONIN TW, HUNT DM, ROBINSON PR (1998): The visual pigments of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Vis. Neurosci. 15: 643-651 37. GALLI-RESTA L (1998): Patterning the vertebrate retina: The early apperence of retinal mosaics. Sem. Cell Dev. Biol. 9:279-284 38. GLÖSSMANN M, AHNELT P (1998): Coexpression of M- and S-opsin extends over the entire inferior mouse retina. Eur. J. Neurosci 10: 357 39. GOVARDOVSKII VI, RÖHLICH P, SZÉL Á, KHOKHLOVA TV (1992): Cones in the retina of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus; an immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Res. 32:19-27 40. GREENSTEIN VC, HOOD DC, RITCH R, STEINBERGER D, CARR RE (1989): S (blue) pathway vulnerability in retinitis pigmentosa, diabetes and glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 1732-1737 41. HAMILTON SE, HURLEY JB (1990): A phosphodiesterase inhibitor specific to a subset of bovine retinal cones J. Biol. Chem.265: 11259-11264

42. HANES ST, BRENT R (1990): A genetic model for interaction of the homeodomain recognition helix with DNA. Science 251: 426-429 43. HAUSWIRTH WW, LANGERIJT AVD, TIMMERS AM, ADAMUS G, ULSHAFER RJ (1992): Early expression and localization of rhodopsin and interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRPB) in the developing fetal bovine retina. Exp. Eye Res. 54: 661-670 44. JACOBS GH, DEEGAN JF (1994): Sensitivity to ultraviolet light in the gerbil (Meriones unguiculatus), Characteristics and mechanisms. Vision Res. 34: 143314441 45. JACOBS GH, NEITZ J, DEEGAN II JF (1991): Retinal receptors in rodents maximally sensitive to ultraviolet light. Nature 353: 655-656 46. JACOBS GH (1996): Primate photopigments and primate color vision. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 577-581 47. JULIUSSON B, BERGSTRÖM A, RÖHLICH P, EHINGER B, VAN VEEN T, SZÉL Á (1994): Complementary cone fields of the rabbit retina. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci. 35:811-818 48. KOLBH, ZHANG L, DEKORVER K (1993): Differential staining of neurons in the human retina with antibodies to protein kinase C isoenzymes. Vis. Neurosci. 10: 341-351 49. KRYGER Z, GALLI-RESTA L, JACOBS GH, REESE BE (1998): The topography of rod and cone photoreceptors in the retina of the ground squirrel. Vis. Neurosci. 15: 685691 50. LEREA CL, BUNT-MILAM AH, HURLEY JB (1989): Alfa transducin is present in blue-, green-, and red-sensitive cone photoreceptors in the human retina. Neuron 3:367-376

51. LEREA CL, SOMERS DE, HURLEY JB, KLOCK IB, BUNT-MILAM AH (1986): Identification of specific transducin alfa subunits in retinal rod and cone photoreceptors. Science 234: 77-80 52. LONG K, AGUIRRE G (1987): Retinal S-antigen in mammalian cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28:339 53. LYUBARSKY AL, FALSINI B, PENNESI ME, VALENTINI P, PUGH EN JR (1999): UVand midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: A possible phenotype for coexpression of cone photopignents. J. Neurosci.19: 442-455 54. MACDONALD ET AL. (1995): Midline signalling is required for Pax gene regulation and patterning of the eyes. Development 121: 3267 55. MACDONALD ET AL. (1996): Pax proteins and eye development. Curr. Op. Neuorobiol. 6:49 56. MARTIN PR, GRÜNERT U, CHAN TI, BUMSTED K (2000): Spatial order in shortwavelength-sensitive cone photoreceptors: a comparative study of the primate retina. J. Opt. Soc. Am. A. 17: 557-567 57. MATHERS PH, GRINBERG A, MAHON KA, JAMRICH M (1997): The Rx homeobox gene is essential for vertebrate eye development. Nature 387: 603-607 58. MCCRANE EP, DE MONASTERIO FM, SCHEIN SJ, CARUSO RC (1983): Nonfluorescent dye staining of primate blue cones. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci. 24: 1449-1455 59. MCLOON SC (1991): A monoclonal antibody that distinguishes beetwen temporal and nasal retinal axons. J. Neurosci. 11: 1470-1477 60. MICHAEL CR (1968): Receptive fields of single optic nerve fibers in a mammal with an all-cone retina. J. Neurphys 31:249-282 61. MIEZIEWSKA KE, VAN VEEN T, MURRAY JM, AGUIRRE GD (1991): Rod and cone specific domains in the interphotoreceptor matrix. J. Comp. Neurol. 308: 371-380

62. MIEZIEWSKA KE, SZÉL Á, VAN VEEN T, AGUIRRE GD, PHILP N (1994): Redistribution of insoluble interphotoreceptor matrix components during photoreceptor differentiation in the mouse retina. J. Comp. Neurol. 345: 115-124 63. MILAM AH, JACOBSON SG (1990): Photoreceptor rosettes with blue cone opsin immunoreactivity in retinitis pigmentosa. Ophthalmology 97: 1620-1631 64. MOLLON JD, BOWMAKER JK (1992): The spatial arrengement of cones in the primate fovea. Nature 360: 677-679 65. MÜLLER B, PEICHL L, DE GRIP WJ, GERY I, KORF HW (1989): Opsin-and S-antigenlike immunreactions in photoreceptors of the tree shrew retina. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci. 30: 530-535 66. NATHANS J, THOMAS D, HOGNESS DS (1986): Molecular genetics of human color vision: the genes encoding blue, green, and red pigments. Science 232:193-202 67. NATHANS J (1999): The evolution and physiology of human color vision: insights from molecular genetic studies of visual pigments. Neuron 24: 299-312 68. NORK TM, MANGINI NJ, MILLECCHIA LL (1993): Rods and cones contain antigenically distinctive S-antigens. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci. 34: 2918-2925 69. NORK TM, MCCORMICK SA, CHAO GM, ODOM JV (1990): Distribution of carbonic anhydrase among human photoreceptors Invest. Ophthalmol.Vis. Sci. 31: 14511458 70. OLIVER AND GRUSS (1997): Current views on eye development. Trends in Neurosci, 20:415 71. PEICHL L, KUNZLE H, VOGEL P (1988): Cone photoreceptors in insectivore retinae. Eur. J. Neurosci. Suppl. 10: 355 72. PETRY HM, ERICHSEN JT, SZÉL Á (1993): Immunocytochemical identification of photoreceptor populations in the tree shrew retina. Brain Res 616: 344-350

73. QUIRING R, WALLDORF U, KLOTER U, GEHRING WJ (1994): Homology of the eyeless gene of Drosophila to the small eye gene in mice and aniridia in humans. Science 265: 785-789 74. RAYMOND PA, BARTHEL LK, CURRAN GA (1995): Developmental patterning of rod and cone photoreceptors in embryonic zebrafish. J. Comp. Neurol. 359: 537-550 75. REITNER A, SHAREPE LT, ZRENNER E (1991): Is colour vision possibble with only rods and blue-sensitive cones? Nature 352: 798-800 76. REME CE, GRIMM C, HAFEZI F, WENZEL A, WILLIAMS TP (2000): Apoptosis in the retina: the silent death of vision. News Physiol. Sci. 15: 120-125 77. RÖHLICH P, AHNELT P, DAWSON WW, SZÉL Á (1994): Presence of immuno-reactive blue cones in the fetal monkey fovea. Exp.Eye Res. 58: 249-252 78. RÖHLICH P, SZÉL Á (1993): Binding sites of photoreceptor-specific antiodies COS-1, OS-2 and AO. Curr. Eye Res. 12: 935-944 79. RÖHLICH P, SZÉL Á, JOHNSON LV, HAGEMAN GS (1989): Carbohydrate components recognized by the cone specific monclonal antibody CSA-1 and by peanut agglutinin are associated with red- and green-sensitive cone photoreceptors. J.Comp. Neurol 289: 395-400 80. RÖHLICH P, VAN VEEN T, SZÉL Á (1994): Two different visual pigments in one retinal cone cell. Neuron 13: 1159-1166 81. SAMESHIMA M, UEHARA F, OHBA N (1987): Specialization of the interphotoreceptor matrices around cone and rod photoreceptor cells in the monkey retina, as revealed by lectin cytochemistry. Exp. Eye Res. 45: 845-863 82. SCHNAPF JL, KRAFT TW, BAYLOR DA (1987): Spectral sensitivity of human cone photoreceptors. Nature 325: 439-441

83. SEARS S, ERICKSON A, HENDRICKSON A (2000): The spatial and temporal expression of outer segment proteins during development of Macaca monkey cones. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci. 41: 971-979 84. SÖDERPALM A, SZÉL Á, CAFFE AR, VAN VEEN T (1994): Selective development of one cone photoreceptor type in retinal organ culture. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35: 3910-3921 85. STENKAMP DL, HISATOMI O, BARTHEL LK, TOKUNAGA F, RAYMOND PA (1996): Temporal expression of rod and cone opsins in embryonic goldfish retina predicts the spatial organization of the cone mosaic. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37: 363376 86. STENKAMP DL, BARTHEL LK, RAYMOND PA (1997): Spatiotemporal coordination of rod and cone photoreceptor differentiation in goldfish retina. J.Comp.Neurol. 382:272-284 87. SZÉL Á, CSORBA G, CAFFÉ AR, SZÉL GY, RÖHLICH P, VAN VEEN T (1994): Different patterns of retinal cone topography in two genera of rodents, Mus and Apodemus. Cell Tiss. Res.276:143-150 88. SZÉL Á, DIAMANTSTEIN T, RÖHLICH P (1988): Identification of the blue sensitive cones in the mammalian retina by anti-visual pigment antibody. J. Comp. Neurol. 273: 593-602 89. SZÉL Á, JULIUSSON B, BERGSTRÖM A, WILKE K, EHINGER B, VAN VEEN T (1994): Reversed ratio of color-specific cones in rabbit retinal cell transplants Dev. Brain Res. 81:1-9 90. SZÉL Á, RÖHLICH P (1992): Two cone types of the rat retina detected by anti-visual pigment antibodies. Exp. Eye Res. 55: 47-52 91. SZÉL Á, RÖHLICH P, CAFFÉ AR, JULIUSSON B, AQUIRRE G, VAN VEEN T (1992): Unique topographic separation of two spectral classes of cones in the mouse retina J. Comp.Neurol. 325: 327-342

92. SZÉL Á, RÖHLICH P, CAFFÉ AR, VAN VEEN T (1996): Distribution of cone photoreceptors in the mammalian retina. Microsc. Res. Techn. 35: 445-462 93. SZÉL Á, RÖHLICH P, MIEZIEWSKA K, AQUIRRE G, VAN VEEN T (1993): Spatial and temporal differences between the expression of short- and middle-wave sensitive cone pigments in the mouse retina: developmental study. J.Comp.Neurol. 331: 564577 94. SZÉL Á, RÖHLICH P, VAN VEEN T (1993): Short-wave sensitive cones in the rodent retinas. Exp. Eye Res. 57: 503-505 95. SZÉL Á, VAN VEEN T, RÖHLICH P (1994): Retinal cone differentiation. Nature 370: 336 96. SZÉL Á, VON SCHANTZ M, RÖHLICH P, FARBER DB,

VAN VEEN T

(1993): Difference

in PNA label intensity between short- and middle-wavelength sensitive cones in the ground squirrel retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 3641-3645 97. VAN VEEN T, SZÉL Á, CAFFE AR (1993): Topography of surviving cones in the retina of the rd mouse. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34:740 98. VARGA J (1995): Állatrendszertani gyakorlatok. Eszterházy Károly Tanárképző Főiskola Állattani Tanszék jegyzete p.75-78 99. VIITALA J, KORPIMAKI E, PALOKANGAS P, KOIVULA M (1985): Attraction of kestrels to vole scent marks visible in ultraviolet light. Nature 373: 425-427 100.

VON SCHANTZ M,

SZÉL Á, VAN VEEN T, FARBER D (1994): Expression of soluble

phototransduction-associated proteins in ground squirrel retina. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci. 35: 3922-3930 101.

WAN J, STENKAMP DL (2000): Cone mosaic development in the goldfish retina

is independent of rod neurogenesis and differentiation J.Comp.Neurol. 423: 227-242

102.

WANG Y, MACKE JP, MERBS SL, ZACK DJ, KLAUNBERG B, BENNETT J,

GEARHART J, NATHANS J (1992): A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron 9: 429-440 103.

WAWERSIK S, MAAS RL (2000): Vertebrate eye development as modeled in

Drosophila. Human Mol. Gen. 9: 917-925 104.

WIKLER KC, RAKIC P (1990): Distribution of photoreceptor subtypes in the

retina of diurnal and nocturnal primates. J. Neurosci. 10: 3390-3401 105.

WIKLER KC, RAKIC P (1991): Relation of an early-differentiating cones to the

photoreceptor mosaic in the primate retina. Nature 351: 397-400 106.

WIKLER KC, RAKIC P (1994): An array of early differentiating cones precedes

the emergence of the photoreceptor mosaic in the fetal monkey retina Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:6534-6538 107.

WIKLER KC, STULL DL, REESE BE, JOHNSON PT, BOGENMANN E (1998):

Localization of protein kinase C to UV-sensitive photoreceptors in the mouse retina. Vis. Neurosci. 15:87-95 108.

WIKLER KC, SZÉL Á, JACOBSEN AL (1996): Positional information and opsin

identity in retinal cones. J. Comp. Neurol. 374: 96-107 109.

WILLIAMS DR, MACLEOD DIA, HAYHOE MM (1981): Foveal tritanopia. Vision

Res. 21: 1341-1356 110.

YOKOYAMA S, YOKOYAMA R (1989): Molecular evolution of human visual

pigment genes. Mol. Biol. Evol. 6: 186-197 111.

YOKOYAMA S (2000): Molecular evolution of vertebrate visual pigments. Prog.

Ret. and Eye Res. 19: 385-419 112.

ZACK DJ, BENNETH J, WANG Y, DAVENPORT C, KLAUNBERG B, GEARHART J,

NATHANS J (1991): Unusual topography of bovine rhodopsin promoter-lacZ fusion gene expression in transgenic mouse retinas. Neuron 6: 187-199

113.

ZBORAY (1997): Az érzékszervek. Eötvös Kiadó, Budapest p66.

114.

ZRENNER E, GOURAS P (1979): Blue-sensitive cones of the cat produce a rodlike

electroretinogram. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci. 18: 1076-1081

Előadások, poszterek Szepessy Zs, Fejér Zs, Szél Á, Manzano a Silva M.J., Vígh B. (1999): Localization of free calcium ions in photoreceptors of the pineal organ and retina. Magyar Idegtudományi Társaság VI. Konferenciája, Harkány Szepessy Zs, Barsi Á, Szél Á (1999): Fejlődő retina vizsgálata nyúlban digitális képfeldolgozással. VII. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Budapest Szepessy Zs, Szél Á (1999): Színspecifikus csapok differenciálódása fejlődő nyúl retinájában. SOTE PhD Tudományos Napok, Budapest Szepessy Zs, Barsi Á, Szél Á (1999): Fotoreceptorok fejlődése nyúl retinában. X. Magyar Anatómus Kongresszus, Budapest Szél Á, Szepessy Zs, Lukáts Á, Fekete T, Röhlich P. (1999): A retinális csapok differenciálódása. X. Magyar Anatómus Kongresszus, Budapest Szél Á, Lukáts Á, Fekete T, Szepessy Zs, Röhhlich P (1999): Morphological approaches in colour vision studies. 4th Multinational Congress on Electron Microscopy, Veszprém Szepessy Zs, Lukáts Á, Fekete T, Szél Á (1999): Cone differentiation of the developing rabbit and tree shrew retina. Semmelweis Symposium, Budapest Szepessy Zs, M. Ghosh, Dávid Cs, Vígh B. (2000): Fine structure of the retina in bats. Magyar Idegtudományi Társaság VII. Koferenciája, Budapest Zadori A, Cs. Frank L, Dávid Cs, Szepessy Zs, Vígh B (2000):Ultrastructural studies of the pineal complex of guinea-fowl (Numida meleagris). Magyar Idegtudományi Társaság VII. Koferenciája, Budapest

Cs. Frank L, Dávid Cs, Szepessy Zs, Zadori A, Vígh B (2000): A corpus pineale ultramikroszkópos szerkezete és posztembrionális fejlődése dzsungáriai törpehörcsögben. Magyar Idegtudományi Társaság VII. Koferenciája, Budapest Szepessy Zs, Lukáts Á, Fekete T, Szél Á (2000): Fotoreceptorok fejlődése nyúl és mókuscickány retinájában. PhD Tudományos napok, Budapest Szél Á, Lukáts Á, Szepessy Zs, Röhlich P (2000): Development of color cone patterns. 9th International Conference on Retinal Proteins, Szeged Cs. Frank L, Fehér Zs, Szepessy Zs, Vígh B. (2000): Similar organization of the retina and pineal organ in Megachiroptean fruit eating bats. XVII. Arbeitstagung der Anatomische Gesellschaft in Würtzburg. Lukáts Á, Szepessy Zs, Röhlich P, Szél Á. (2001): A retinális fotoreceptorok fejlődése. IX. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Debrecen Lukáts Á, Cs. Frank L, Zádori A, Dávid Cs, Szepessy Zs, Szél Á, Röhlich P, Vígh B. (2001): Fine structural comparison of the retina in Micro- and Megachiroptean bats. Magyar Idegtudományi Társaság VIII. Konferenciája, Szeged Szél Á, Lukáts Á, Szepessy Zs, Röhlich P, Vígh B, Bennett N, Cooper H.M (2001): Visual pigment coexpression in all retinal cones of the siberian hamster. Association for Research in Vision and Ophthalmology, 2001 Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA.. Lukáts Á, Szepessy Zs, Röhlich P, Vígh B, Bennett N, Cooper HM, Szél Á. (2001): Visual pigment coexpression in all cones of rodents. XI. Magyar Anatómus Kongresszus, Debrecen

Az értekezés témájában megjelent saját közlemények

I.

SZEPESSY ZS, LUKÁTS Á, FEKETE T, BARSI Á, RÖHLICH P, SZÉL Á.

(2000): Cone differentiation with no photopigment coexpression. Investigative Ophthalmology and Visual Science 41(10): 3171-3175 II.

SZÉL Á, LUKÁTS Á, FEKETE T, SZEPESSY ZS, RÖHLICH P. (2000):

Photoreceptor distribution in the retina of subprimate mammals. Journal of Optical Society of America A. 17 (3): 568-579 III.

FEJÉR ZS, HALDAR C, GHOSH M, CS. FRANK L, SZEPESSY ZS, SZÉL Á,

MANZANO E SILVA M. J, VÍGH B. (2001): Pineal organ-like organization of the retina in Megachiroptean bats. Acta Biologica Hungarica 52 (1): 17-27