FELADATOK A HEMOSZTÁZIS ALAPTESZTEK KÓROS EREDMÉNYE ESETÉN Dr. Várnai Katalin Semmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest)
2011.04.18.-22.
Hemosztázis A hemosztázis egy bonyolultan szabályozott rendszer, amelyben az érfal, a thrombocyták, a véralvadás és a fibrinolízis komponenseinek összehangolt működésével egyensúlyi állapot valósul meg. A fiziológiás és a patológiás állapotok megértésére több teória született, kezdve a klasszikustól (Morawitz 1904), a „vízesés” elméleten át (Macfarlane 1964, Davie és Ratnoff 1964) a legátfogóbb képet adó, sejt alapú modell kialakításáig (Hoffmann 1998). A „vízesés” elmélet a diagnosztikában még mindig nagyon jó eligazodást nyújt. Az elmélet alaptételei: •az alvadási faktorok a plazmában inaktív formában keringenek, •az aktiváció két úton indul: az intrinsic és extrinsic úton, •a faktorok egymást követő proteolízissel aktiválódnak kötött sorrendben, és az exponenciálisan növekvő számú faktor trombin generációhoz vezet, amely hatására a folyékony fibrinogén gél állapotú fibrinné alakul. A rutin véralvadási vizsgálatok általában ennél a lépésnél végződnek.
Koagulációs elméletek – múltban és a jelenben • • • • •
Klasszikus, négy tényezős teória (Morawitz 1904) Vízesés vagy kaszkád elmélet (Macfarlane 1964; Davie és Ratnoff 1964) Autokatalitikus elképzelés (Seegers és Barthels 1969) Átdolgozott véralvadási elmélet (Broze 1995) Sejt-alapú modell (Hoffman 1998) - egymást átfedő fázisok • Indítás • Felerősítés • Kiterjesztés • Stabilizáció
3
Koagulációs elméletek – múltban és a jelenben • •
Klasszikus, négy tényezős teória (Morawitz 1904) Vízesés vagy kaszkád elmélet (Macfarlane 1964; Davie és Ratnoff 1964) • az alvadási faktorok a plazmában inaktív formában keringenek, • az aktiváció két úton indul: az intrinsic és extrinsic úton, • a faktorok egymást követő proteolízissel aktiválódnak kötött sorrendben, az exponenciálisan növekvő számú faktor trombin generációhoz, így a folyékony fibrinogén gél állapotú fibrinné alakulásához vezet.
• • •
Autokatalitikus elképzelés (Seegers és Barthels 1969) Átdolgozott véralvadási elmélet (Broze 1995) Sejt-alapú modell (Hoffman 1998) - egymást átfedő fázisok 4
Koaguláció
Koaguláció
Koaguláció
Koaguláció
Koaguláció
Koaguláció
Sejt alapú modell
Two main functions of TF: 1) to activate factor X to Xa 2) to activate factor IX to IXa
Hemosztatikus egyensúly
Hemofilia - thrombofilia
Dade Behring Marburg GmbH
Hemosztázis vizsgálata A finoman hangolt egyensúly megbomlása vagy vérzékenységhez (hipokoaguláció) vagy trombózis készséghez (hiperkoaguláció) vezet. Bármely irányú eltérés kivizsgálása a rutin alaptesztekkel indul: • Thrombocyta szám (vérkép, kenet) • Protrombin idő (PI) • Aktivált parciális tromboplasztin idő (APTI) • Trombin idő (TI) • Fibrinogén (Clauss módszer) A kóros értékek további vizsgálatokat indukálnak, amely az eltérés irányától függően, hipo- vagy hiperkoaguláció kivizsgálását jelenti. A beteg anamnézisének, klinikai tüneteinek, és az alkalmazott terápiának az ismerete lényeges segítséget nyújt a további vizsgálatok sorrendjében.
Vérzékenység vizsgálata Thrombocyta szám Mérsékelten csökkent thrombocyta szám (50-100 G/L) és klinikai tünetek megléte esetén thrombocyta funkciós tesztek végezhetők: • PFA100 (vérzési idő standardizált változata) (Collagen/Epinephrine és Collagen/ADP cartridge) • Hagyományos aggregométer (optikai elven alapuló). Alacsony thrombocyta szám esetén ajánlott a kenet megtekintése, mikroaggregátumok vagy fragmentociták (DIC) felismerésére. Az alvadásgátló (EDTA) okozta pszeudothrombocytopenia kizárása fontos, hogy elkerüljük a felesleges vizsgálatokat.
in vivo hemosztázis és PFA-100 mérés
Dade Behring Marburg GmbH
Koagulációs vizsgálatok Az alvadási szűrőtesztek az aktiváció egy-egy fázisán belüli eltérést jelzik az alvadási és fibrinolízis folyamatában. Az alaptesztek együttes elvégzése segít a további vizsgálatok kijelölésében. Megnyúlt PI vagy APTI esetén az első lépés a korrekciós vizsgálat elvégzése: beteg plazma és normál plazma 1 : 1 arányú keveréke. Ha a megismételt mérés értéke a normáléval megegyező, az egyes alvadási faktorokat kell meghatározni. Ha kóros marad, gátlótest irányába (LA vagy alvadási faktor ellenes gátló) végzünk meghatározásokat.
Megnyúlt APTI vizsgálati algoritmusa
Dade Behring Marburg GmbH
Korrekciót követő eljárások • • •
•
•
• •
Korrigálható PI és normál APTI esetén a VII. faktort, Korrigálható APTI és normál PI esetén VIII, IX, XI és XII faktorokat határozzuk meg. Csökkent VIII. faktor esetén von Willebrand betegség gyanúja is felmerülhet. A kivizsgálási algoritmus a vWF funkcionális és antigén mérését, a kollagén- és a VIII. faktor-kötőhely meghatározását, a multimerek analízisét, esetenként thrombocyta aggregációs mérést foglal magába. Korrigálható PI, APTI és normál TI mellett a közös aktivációs út faktorait határozzuk meg (II, V, VII, X). Májbetegség esetén az alvadási faktorok meghatározása felesleges. Kivételt képez a májtranszplantáció (V. faktor). Megnyúlt PI, APTI, és TI esetén a faktor meghatározások előtt a fibrinogén szintjének ellenőrzése szükséges. Az alacsony fibrinogén szint (0,3 g/L) vagy az elégtelen funkció valamennyi mérést befolyásolja. Dysfibrinogenémia elkülönítésére a fibrinogén funkcionális meghatározása mellett a kvantitatív meghatározás is szükséges. Megnyúlt TI-nél a nyomokban jelenlévő heparin kizárására reptiláz időt (RI) mérünk. Valamennyi szűrőteszt kórossá válhat DIC-ben, primer hiperfibrinolízisben; ilyenkor ismételt vizsgálatokkal követhető a folyamat, kiegészítve D-dimer, fibrin/fibrinogén degradációs produktum (fdp), fibrin monomer (FM) meghatározással.
vWD klasszifikáció
Dade Behring Marburg GmbH
Sikertelen korrekció, gátlótest meghatározás • Faktorellenes gátlótest esetén az inhibitor mennyiségi meghatározására a Bethesda módszert alkalmazzuk. A beteg plazmájának tovafutó hígítási sorát ismert VIII. faktor koncentrációjú plazmával mérjük össze, mindegyik hígításból VIII. faktor aktivitást mérünk azonnal és két órás, 37 ºC-on történő inkubálás után (azonnali, illetve progresszív gátlótest elkülönítése). 1 Bethesda egység (BU) az a gátlás, amely az ismert VIII. faktor aktivitást a felére csökkenti. Amelyik hígítási lépésnél találjuk az 50%-os csökkenést, annak a hígításnak a reciprok értéke adja a beteg gátlótest titerét. • LA pozitivitás foszfolipid-protein ellenes antitest, amely kimutatásához az antigén heterogenitása miatt két, különböző összetételű szűrőtesztet kell alkalmazni. Leggyakrabban használt módszerek: a hígított Russell vipera méreggel végzett koaguláció és az LA-érzékeny APTI. Pozitív eredménynél a bizonyító tesztet is be kell állítani (hígítatlan Russell vipera méreg, illetve hexagonális foszfolipid). Vérzékenység körébe tartozhat a XIII. faktor defektusa, amelyet azonban a rutin tesztek nem érzékelnek.
Hemofilia - thrombofilia
Dade Behring Marburg GmbH
Trombóziskészség vizsgálata
Thrombocyta szám Magas, néha extrém thrombocyta szám (>1000 G/L, pl. myeloproliferatív kórképek) járhat fokozott funkcióval, de gyakrabban inkább csökkent működést jelent. Vizsgálatukra csak a hagyományos aggregométer ad lehetőséget, mivel a PFA 100 <500 G/L használható. Heparin terápia mellett (5.-14. nap) fellépő thrombocytopenia (<100 G/L vagy a kiindulási érték felére csökkenése) esetén HIT-II szűrő teszt beállítása indokolt.
Trombóziskészség: koagulációs vizsgálatok Rövidült PI, APTI, TI, emelkedett fibrinogén szint trombóziskészségre hívhatják fel a figyelmet. Ennek kivizsgálási menete: • Természetes inhibitorok: antitrombin (AT), protein C (PC), protein S (PS) funkcionális meghatározása. Ha kóros, az antigén meghatározás is szükségessé válik az I. és II. típusú defektus elkülönítésére. • APC rezisztencia az V. faktor Leiden mutációjának funkcionális meghatározása, de a jelenség mutáció nélkül, szerzetten is felléphet. • Valamennyi alvadási faktor magas szintje (> 200%) trombózis rizikót jelenthet, így a faktor meghatározások (elsősorban VIII. faktor) is részei a kivizsgálásnak. • Az akut fázis proteinek (fibrinogén, VIII. faktor, vWF) magas szintjét csak gyulladásos paraméter (CRP) egyidejű meghatározásával lehet értékelni. • A D-dimer az alvadási és fibrinolitikus rendszer aktiválódását egyaránt jelzi. • Protrombin G20210A polimorfizmusra csak molekuláris biológiai módszer áll rendelkezésre.
Thrombophilia vizsgálat Ajánlott : VTE Első, ismeretlen okkal <50év, átmeneti kockázattal (pl. műtét) kiváltó ok nélkül, bármely életkorban Ismétlődő VTE szokatlan helyen (felkar, agy, intra-abdominális erek: v. portae, linealis, hepatica trombózisnál JAK2 vizsgálat /MPD/, ill. CD55/CD59 expresszió /PNH/) Gyermekkorban thrombózis Terhesség, gyermekágy, OC, HRT alatt Újszülött purpura fulminans Coumarin terápia bevezetésekor bőrnekrózis Két vagy több váratlan magzat vesztés Ismert thrombophiliás tünetmentes családtagja (halmozott és fiatal kori thrombózisok), női családtag, terhesség vagy OC szedése
Thrombophilia vizsgálat Ellentmondásos: fiatal (<50év), dohányzó nő AMI-ban, első, provokált VTE >50év (tu és intravasculáris eszköz hiányában) VTE és SERM (szelektív estrogen receptor modulátor) vagy tamoxifen Váratlan súlyos praeeclampsia, placenta abruptio, intrauterin növekedés elmaradás Nem ajánlott: Általános populáció szűrés OC, HRT, SERM terápia indítás előtt, vagy alatta Tünetmentes prenatális, újszülött, vagy prepubertás rutin teszt Arteriális trombózis rutin kezdő vizsgálataként, kivéve váratlan, atherosclerosis nélkül, vagy fiatal kor
Thrombophilia vizsgálat - gyermekkor Ajánlott: • Serdülőkorban spontán thrombózis • Kisgyermeknél VTE vagy stroke • Thrombózis kutatás (család)
Egyéni elbírálás (elégtelen adat): • VTE katéter mellett • Tünetmentes gyermek pozitív családi anamnézissel
Nem ajánlott: • Tünetmentes gyermek – magas rizikó
Eltérő klinikai megjelenés: katéter-VTE; vese, mesenterica, sinus thrombózis; stroke!
Thrombophilia diagnosztikai algoritmusa (VTE) Anamnézis, fizikai vizsgálat
1. - <50év
2. átmeneti rizikó: trauma,
- Ismétlődő thrombózis
műtét, terhesség,
- Pozitív családi anamnézis
gyermekágy, immobilizáció,
- thrombózis szokatlan helyen
eostrogen terápia
Ha 1. vagy 1. és 2. feltétel jelen van
Thrombophilia kivizsgálás
3. Ha csak a 2. feltétel található, az 1. nélkül
További vizsgálat Ø
Thrombophilia kivizsgálás
1. elvégzendő tesztek Globális tesztek: PI, APTI, TI, Fibr APCR/FVL - koagulációs teszt, FV hiányos plazma
2. elvégzendő tesztek pozitív → FVL DNS analízis
FII G20210A mutáció - DNS analízis AT - funkcionális, chromogen assay
→ AT Ag (immunoassay)
PC - funkcionális, chromogen assay
→ PC Ag (immunoassay)
PS - funkcionális, chromogen assay
→ PS Ag (free – total)(immunoassay)
APA (LA, ACA, anti-β2-GP I)
→ Ismétlés 3 hónap múlva
Homocystein – plazma HC – immunoassay FVIII - koagulációs teszt
→ Ismétlés 3-6 hónap múlva
Ha minden negatív, ritkább vizsgálatok Dysfibrinogenemia – TI, RI
→ Fibr Ag (immunoassay) (aktivitás/Ag) S. Margetic Clin Chem Lab Med 2010;48 (Suppl 1):S27-S39
Thrombophilia diagnosztikai algoritmusa gyermekkorban Vizsgálati szint Alap
Kibővített
Teszt
Vizsgálat elve
CBC
Hematológiai automata
ESR
Westergren
CRP Sickle cells APTI, PI, TI AT PC PS FVL/ Prothrombin 20210 mutáció Éhgyomri HC
Immunológiai Kenet (Hgb elfo) Koaguláció Funkcionális: FXa Funkcionális: chromogen Immunológiai: free PS Ag DNS HPLC vagy immunológiai
Lipoprotein(a)
Immunológiai
APA (LA, ACL, anti-β2-GP I) FVIII
Koaguláció és immunológiai Koaguláció
Euglobulin lízis idő
Funkcionális
Plazminogén aktivitás
Funkcionális
Fibrinogén
Clauss
D-dimeer PAI
Immunológiai Funkcionális vagy immunológiai
PNH
Flow cytometer
F IX, XII, XI
Koaguláció A. Trampus-Bajkija Clin Chem Lab Med 2010;48 (Suppl 1):S97-S104
A
hemosztázis szűrőtesztjei általában Koaguláció
sejtmentes
plazmában mérik a fibrinképződést, és csak korlátolt információt adnak a hemosztázis egészének működéséről. A sejtes elemeket is tartalmazó globális tesztek, mint a trombin generációs teszt (endogén trombin potenciál) és a trombelasztográfia, közelebb visznek az in vivo folyamatokhoz. Nagyobb
érzékenységet
mutatnak
hipo-
és
hiperkoaguláció irányában. A
standardizáció
javításával,
minőségellenőrzési
kontrollokba való bevonással helyük lehet a hemosztázis vizsgálatában.
