Fehérjék nemkovalens komplexképzésének és glikozilációjának tömegspektrometriás vizsgálata

DOKTORI (Ph.D) ÉRTEKEZÉS

Fehérjék nemkovalens komplexképzésének és glikozilációjának tömegspektrometriás vizsgálata

Imre Tímea Okleveles vegyészmérnök Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki kar, Kémia és Vegyészmérnöki Tudományok doktori iskola

Témavezető: Dr. Szabó Pál Tamás Tudományos főmunkatárs MTA, Kémiai Kutatóközpont, Biomolekuláris Kémiai Intézet, Farmakobiokémiai Osztály, Gyógyszer-kölcsönhatások Laboratórium Készült: a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpontjának Szerkezeti Kémia Intézetében 2009.

2

Köszönetnyilvánítás Elsőként szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Szabó Pálnak, türelméért, segítőkészségéért, szakmai tudásának átadásáért valamint, hogy munkámat, fejlődésemet szakmai és emberi szempontból folyamatosan támogatta. Szeretném köszönetemet kifejezni Dr. Vékey Károlynak, hogy lehetővé tette számomra, hogy doktori munkámat az MTA Kémiai Kutatóközpont Tömegspektrometria Osztályán végezhessem, és munkámban értékes szakmai segítséget nyújtott. Köszönetet szeretnék mondani a Tömegspektrometria Osztály jelenlegi és egykori munkatársainak, (Budai Lívia, Dr. Drahos László, Dr. Gömöry Ágnes, Dr. Jakab Annamária, Krenyácz Judit, Dr. Ludányi Krisztina, Dr. Nagy Kornél, Ozohanics Olivér, Dr. Pollreisz Ferenc, Dr. Schlosser Gitta, Szabó Rita, Sztáray Judit, Dr. Takáts Zoltán, és Újszászy Kálmán) akikkel együtt dolgozhattam, hogy ötleteikkel, tanácsaikkal segítették munkámat. Hálás vagyok együttműködő partnerként, Prof. Dr. Kremmer Tibornak, az Országos Onkológiai Intézet Biokémiai Osztály vezetőjének az AGP mintákért, szakmai támogatásáért valamint, hogy értékes javaslataival járult hozzá a kéziratok elkészüléséhez. Köszönet illeti Molnárné Dr. Szöllősi Évát, aki kollaborációs partnerként az AGP oligoszacharidokat állította elő számunkra. Köszönettel tartozom Dr. Héberger Károlynak a statisztikai számításokban nyújtott segítségéért. Továbbá köszönetet szeretnék mondani a külföldi együttműködő partnereinknek, Prof. Antonio Malorninak, Dr. Pócsfalvi Gabriellának, hogy lehetőséget biztosítottak számomra a legmodernebb ESI-QTOF és MALDI-TOF MS méréstechnikákhoz való hozzáférést. Szeretném köszönetemet kifejezni korábbi témavezetőnek, Dr. Keglevich Györgynek, a BME Szerves Kémia és Technológia Tanszék vezetőjének, aki törődésével és bátorításával szintén hozzájárult a szakmai fejlődésemhez. Köszönöm a Richter Gedeon Rt Centenáriumi Alapítványnak, hogy támogatta doktori munkám befejezését. Végül szeretném megköszönni családomnak, hogy támogattak a doktori munkám során és biztosították számomra azt a nyugodt családi légkört, amely nélkül ez a disszertáció nem jöhetett volna létre.

3

Rövidítésjegyzék AA

antranilsav

amu

atomic mass unit, atomi tömegegység

AGP

α-1 acid glycoprotein, alfa-1-savas glikoprotein

APCI

atmospheric pressure chemical ionization, atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció

BLG

béta-laktoglobulin

CD

circular dicroism spectroscopy, cirkuláris dikroizmus spektroszkópia

CE

capillary electrophoresis, kapilláris elektroforézis

CI

chemical ionization, kémiai ionizáció

CID

collision-induced dissociation, ütközés-indukált disszociáció

cPA

cis-parinaric acid, cisz-parinársav

Da

Dalton (atomi tömegegység)

DE

delayed extraction, késleltetett extrakció

DHB

2,5-dihidroxi benzoesav

EI

electron impact ionization, elektron ionizáció

ESI

electrospray ionization, elektrospray (elektroporlasztásos) ionizáció

FAB

fast atom bombardment ionization, gyorsatom bombázásos ionizáció

FT-ICR

Fourier-transform ion cyclotron resonance, Fourier-traszformációs ion ciklotron rezonancia

HPLC

high performance liquid chromatography, nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia

LDA

Linear Discriminant Analysis, Lineáris Diszkriminancia Analízis

MALDI

matrix-assisted laser desorption/ionization, mátrixszal-segített lézer deszorpciós ionizáció

MS

mass spectrometry, tömegspektrometria

MS/MS

tandem tömegspektrometria

m/z

tömeg/töltés

NMR

nuclear magnetic resonance spectroscopy, mágneses magrezonancia spektroszkópia

ORM

Orozomukoid

PCA

Principal Component Analysis, Főkomponens Analízis 4

PMF

peptide mass fingerprint, peptidtömeg ujjlenyomat

PNG-áz F

peptid N-glikozidáz F enzim

Q

kvadrupól

QqQ

hármas kvadrupól

SA

sinapinic acid, 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-fahéjsav

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis; nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis

XIC

extracted ion chromatogram, szelektált ionkromatogram

TOF

time of flight, repülési idő

Aminosavak esetén a hárombetűs jelölést alkalmaztam.

5

Tartalomjegyzék Rövidítésjegyzék ..................................................................................................................................................... 4 Tartalomjegyzék...................................................................................................................................................... 6 I. Bevezetés ............................................................................................................................................................. 8 II. Irodalmi áttekintés ............................................................................................................................................ 10 II.1 A fehérjék .................................................................................................................................................. 10 II.2 Proteomika ................................................................................................................................................. 11 II.2.1 Tömegspektrometrián alapuló proteomikai vizsgálatok .................................................................... 13 II.3 Proteomikában használt tömegspektrometria ............................................................................................ 14 II.3.1 Alkalmazott ionizációs technikák ...................................................................................................... 15 II.3.1.1 Elektrospray ionizáció ................................................................................................................ 15 II.3.1.2 Mátrixszal segített lézerdeszorpciós ionizáció (MALDI)........................................................... 18 II.3.2 Alkalmazott analizátorok ................................................................................................................... 20 II.3.2.1 Kvadrupól analizátor .................................................................................................................. 21 II.3.2.2 Repülési idő analizátor ............................................................................................................... 22 II.3.3 Tandem Tömegspektrometria (MS/MS) ............................................................................................ 24 II.4 Referenciák a II. részhez ............................................................................................................................ 27 III. Béta-laktoglobulin nemkovalens komplexképzésének és ligandum-kötőhelyének vizsgálata elektrospray – tömegspektrometriás (ESI-MS) technikával ......................................................................................................... 28 III.1 Irodalmi háttér .......................................................................................................................................... 28 III.1.1 Makromolekuláris fehérjekomplexek tömegspektrometriás tanulmányozása .................................. 28 III.1.2 A béta-laktoglobulin szerkezete és lehetséges funkciói .................................................................... 29 III.1.3 BLG ligandumkötő tulajdonsága ...................................................................................................... 31 III.1.4 A cisz-Parinársav .............................................................................................................................. 32 III.1.5 Limitált proteolizis ........................................................................................................................... 33 III.2 Célkitűzés ................................................................................................................................................. 34 III.3 Anyagok és módszerek ............................................................................................................................. 35 III.3.1 Anyagok ........................................................................................................................................... 35 III.3.2 A cisz-parinársav és egyéb zsírsavak kötődése béta-laktoglobulinhoz ............................................ 35 III.3.3 Kompetitív kötődési vizsgálatok ...................................................................................................... 35 III.3.4 Limitált tripszinolízis valamint a keletkezett m/z 5200 BLG fragmens tisztítása és komplexképzése cPA-val ........................................................................................................................................................ 36 III.3.5 Tömegspektrometriás mérések ......................................................................................................... 36 III.4 Eredmények és értelmezésük ................................................................................................................... 37 III.4.1 BLG ligandumkötő képességének vizsgálata ................................................................................... 37 III.4.2 Kompetitív kötődési vizsgálatok ...................................................................................................... 39 III.4.3 A BLG ligandumkötőhelyének tanulmányozása limitált tripszinolízissel ........................................ 41 III. 5 A III. fejezet összefoglalása .................................................................................................................... 45 III. 6 Referenciák a III. fejezethez .................................................................................................................... 46 IV. A humán szérum alfa-1-savas glikoprotein (AGP) tömegspektrometriás vizsgálata ...................................... 49

6

IV.1 Irodalmi háttér .......................................................................................................................................... 49 IV.1.1 Glikoproteinek .................................................................................................................................. 49 IV.1.2 Glikoziláció vizsgálatának analitikai eszközei ................................................................................. 51 IV.1.3 Proteinek glikozilációjának tanulmányozása tömegspektrometriával .............................................. 52 IV.1.3.1 Intakt glikoproteinek MS vizsgálata ......................................................................................... 53 IV.1.3.2 Glikoziláció pozícionális eloszlásának MS vizsgálata .............................................................. 54 IV.1.3.3 Oligoszacharidok MS vizsgálata .............................................................................................. 55 IV.1.3.3.1 MALDI MS ....................................................................................................................... 56 IV.1.3.3.2 ESI MS.............................................................................................................................. 58 IV.1.4 Az AGP tulajdonságai, biológiai jelentősége ................................................................................... 58 IV.1.5 Az AGP glikozilációjának vizsgálata ............................................................................................... 61 IV.2 Célkitűzések ............................................................................................................................................. 63 IV.3 Anyagok és módszerek ............................................................................................................................ 64 IV.3.1 Az AGP oligoszacharidok pozícionális eloszlásának ESI-QTOF-MS vizsgálata ............................ 64 IV.3.1.1 Anyagok ................................................................................................................................... 64 IV.3.1.2 AGP tripszines emésztése ......................................................................................................... 64 IV.3.1.3 Mintaelőkészítés tömegspektrometriás analízishez .................................................................. 64 IV.3.1.4 AGP triptikus emésztmény MALDI-TOF tömegspektrometriás vizsgálata ............................. 65 IV.3.1.5 AGP triptikus emésztmény kapilláris HPLC-MS, és MS/MS vizsgálata ................................. 65 IV.3.2 Humán szérum AGP oligoszacharidjaink MALDI-TOF MS és statisztikai analízise tumoros és normál mintákban ........................................................................................................................................ 66 IV.3.2.1 A humán szérum AGP izolálása és tisztítása ............................................................................ 66 IV.3.2.2 Humán szérum AGP emésztése PNG-áz F enzimmel .............................................................. 66 IV.3.2.3 AGP oligoszacharidok MALDI-MS vizsgálata ........................................................................ 66 IV.3.2.4 AGP oligoszacharidok pontos tömegmérése ............................................................................ 67 IV.3.2.5 MALDI-TOF eredmények statisztikai értékelés ....................................................................... 67 IV.4 Eredmények és értelmezésük ................................................................................................................... 68 IV.4.1 Az AGP-ben található N-glikánok pozícionális eloszlásának ESI-QTOF-MS vizsgálata ................ 68 IV.4.1.2 Az AGP tripszines hidrolizátum MALDI-TOF MS analízise ................................................... 70 IV.4.1.3 Az AGP triptikus emésztmény kapilláris RP-HPLC ESI-QTOF MS és MS/MS vizsgálata .... 71 IV.4.2 Humán szérum AGP oligoszacharidjaink MALDI-TOF MS és statisztikai vizsgálata tumoros és egészséges mintákban .................................................................................................................................. 83 IV.4.2.1 Humán szérum AGP N-glikánjainak MALDI-MS vizsgálata .................................................. 83 IV.4.2.2 Fukozilációs- és antenna-index ................................................................................................. 89 IV.4.2.3 Az AGP oligoszacharid eloszlásának lineáris diszkriminancia vizsgálata ............................... 91 IV.5 A IV. fejezet összefoglalása ..................................................................................................................... 98 IV.6 Referenciák a IV. fejezethez ..................................................................................................................... 99 V. Tézisek ........................................................................................................................................................... 105 VI. Közlemények ................................................................................................................................................ 107 NYILATKOZAT ................................................................................................................................................ 110

7

I. Bevezetés

I. Bevezetés

Az előző évtized óriási teljesítménye, hogy meghatározták az ember DNSállományának elsődleges szerkezetét, a humán genom nukleotidszekvenciáját (Human genom Program). A géneken túl viszont egy még bonyolultabb kapcsolatrendszerrel rendelkező világ, a gének által kódolt fehérjék tartománya kezdődik, amelyek közvetlenül vagy közvetett módon határozzák meg egy szervezet felépítését és funkcióját. Bár rengeteg fehérje és azok funkciója is ismert, a teljes humán fehérjeállomány (proteom) nagy része még feltárásra vár. A proteomikán alapuló vizsgálatok, amelyek valamely szövet, szerv vagy sejttípus által expresszált fehérjék összességét elemzik, mások, mint a genetikai vizsgálatok, bár jelentős mértékben támaszkodnak a genetikai adatbázisokra. A proteomika célja a sejtek működésének, az általuk termelt fehérjék összességének, a proteomnak a vizsgálata. A proteom vizsgálata igen nagy kihívás, mivel egy sejtben lényegesen többféle fehérje található, mint amennyi fehérjét kódoló gén van. Egy-egy génről több fehérjeforma képződhet, mivel több helyen is elkezdődhet a fehérjét kódoló RNS átíródása, máskor az RNS eltérő módon darabolódhat föl (alternatív splicing), továbbá a riboszómákon történt fehérjeszintézist követően a molekula sokféle változáson mehet keresztül (poszt-transzlációs módosítások). Így a ténylegesen létező fehérjék száma sokszorosa a gének számának, ami igen megnehezíti feltérképezésüket. Ez a korábban genetikusok által valószínűsített 100 000-féle fehérjével szemben közel egymillió, kémiai szerkezetét tekintve különböző protein jelenlétét teszi lehetővé a szervezetben. A proteomika jelentősége az orvosi diagnosztika és terápia területén is egyre jobban kezd kibontakozni. Ez az irány azt próbálja felderíteni, hogy egyes betegségek miképpen hozhatók összefüggésbe egyes protein(ek) jelenlétével vagy éppen hiányával, esetleg mutációjával.

Bíztató lehetőségek rejlenek máris a gyógyszerfejlesztés, az idegrendszeri

elváltozások, a fertőző betegségek, a szívbetegségek területén. A proteomkutatási technikák bevezetésével a rosszindulatú betegségek gyógyításában is új lehetőségek adódnak. A genetikai markerek mellett kezd fény derülni a kóros foszforilálásra, glikozilálásra, ami genetikai vizsgálatokkal nem mutatható ki. Az utóbbi évtizedekben a fehérjék analízisében a legkorszerűbb analitikai módszernek a tömegspektrometria számít. Kijelenthetjük, hogy a tömegspektrometria különböző kromatográfiás illetve elektroforetikus elválasztástechnikával kapcsolva szinte egyeduralkodó 8

I. Bevezetés

a proteomkutatásban. Ilyen irányú alkalmazását az új ionizációs módszerek (az úgynevezett elektroporlasztás, ESI és a mátrixszal segített lézer deszorpciós ionizáció, MALDI) kifejlesztése forradalmasította, lehetővé téve makromolekulák (elsősorban proteinek) és komplex keverékek (így például vér, vizelet) vizsgálatát. Sikerét annak köszönheti, hogy a tömegspektrometria képes igen kis mennyiségben rendelkezésre álló (femtomólnyi) és igen bonyolult mátrixokban lévő kis mennyiségekben előforduló komponensekről is szerkezeti és mennyiségi információt közölni. Mindezek eredményeképpen mind a biokémia, mind az orvosi analitika egyik fő eszközévé vált, melynek fontosságát mutatja, hogy a 2002. évi kémiai Nobel-díjat John B. Fenn (Virginia Commonwealth University, Richmond, USA) és Koichi Tanaka (Shimadzu Corporation, Kiotó, Japán) nyerte el a „biológiai makromolekulák tömegspektrometriás vizsgálatára” kidolgozott ionizációs technikák (ESI és MALDI) megalkotásáért. Doktori éveim során különféle biomolekulák (lipidek, szénhidrátok, nukleinsavak, proteinek,

glikoproteinek)

valamint

gyógyszermolekulák

és

metabolitjaik

tömegspektrometriás szerkezetfelderítésével foglalkoztam. Mindezek közül a dolgozatomban bemutatott eredmények két izolált fehérjéhez kapcsolódnak, amelyeket napjaink korszerűnek mondható tömegspektrometriás technikáit használva (ESI-QqQ, MALDI-TOF, ESI-QTOF) tanulmányoztam. Elsőként egy lipokalin fehérje (béta-laktoglobulin, BLG) és egy többszörösen telített zsírsav (cisz-parinársav, cPA) specifikus nemkovalens kötődését kívántam vizsgálni más zsírsavak mellett. Terveztem továbbá limitált tripszinolízist alkalmazva a molekula ligandumkötő helyének tömegspektrometriás meghatározását. Doktori munkám másik fontos kutatási területe egy akut fázis fehérje, az ún. α-1savas glikoprotein (AGP) szerkezetének tanulmányozása volt. Bár az AGP is a lipokalin fehérjecsaládba tartozik, vizsgálataink nem ligandumkötő tulajdonságának tanulmányozását érintette, sokkal inkább szerkezetének illetve a szerkezete és funkciója közötti kapcsolat felderítését célozta meg. A rendkívül heterogén szerkezetű szérumfehérje peptidláncához 5 különböző helyen ún. „komplex” struktúrájú oligoszacharid csoportok kapcsolódnak (N-glikánok). Ezek az oligoszacharid láncok változatos felépítésűek, jelenős heterogenitást mutatnak, amely a glikozileződés helyétől is függ. Kutatásaink célja az AGP glikozileződési mintázatának meghatározása és annak vizsgálata, hogy ez milyen jellemző változást szenved bizonyos rákos (ováriumtumoros és limfómás) megbetegedések esetén. Ezeknek a különbségeknek a kimutatása azért fontos, mert potenciálisan egy új, széles körben elfogadott onkomarker lehetőségét rejti magában. 9

II. Irodalmi áttekintés


II.1 A fehérjék

A fehérjék az élőlények alapvető molekulái, amelyek egy-két sejttípustól (pl. zsírsejtek) eltekintve a sejtek szárazanyagának kb. 50%-át teszik ki. Változatosságuk és specifikusságuk az élet számos területén megjelenik. Közvetlen vagy közvetett módon minden biológiai jelenség fehérjékkel kapcsolatos: biológiai információk hordozói, életfolyamatok irányítói és katalizátorai (enzimek), transzportfolyamatokban játszanak szerepet (membránfehérjék), fontos szereplői az immunvédelemnek, táplákozástani szempontból alapvető jelentőségűek (esszenciális aminosavak felvétele). Ők felelnek továbbá a sejtek alakjáért, a testfelépítés és a mozgás nélkülözhetetlen elemei (izom és izomműködés) stb. A fehérjék szerkezetét funkciójuk szigorúan meghatározza (és fordítva). Az élő szervezetekben 25-féle α-aminosav található, ezek közül 20 fehérjeépítő. Ez a 20 féle "proteinogén" aminosav a szomszédos amino és karboxil csoportjaik között kialakuló peptidkötés révén kapcsolódik egymáshoz, így kialakítva a fehérjék elsődleges szerkezetét, amit aminosavszekvenciának is nevezünk. Ezen túlmenően a fehérjeláncok tekeredésük folytán spirális (alfa-hélix) vagy lemezes (lamináris, béta-lemezes) szerkezeteket alakíthatnak ki, de a fehérjeszál nagy része rendezetlen is maradhat, ezáltal létrejön a fehérjék másodlagos szerkezete. A hosszú fehérje- (polipeptid) láncok a térben általában háromdimenziós, adott fehérjére jellemző formát mutatnak, ez a fehérjék harmadlagos szerkezete. Kialakulásukban szerepet játszanak az aminosavak oldalláncai között létrejövő különböző kovalens (diszulfidhíd) és nem-kovalens (ionos, hidrogénhíd, diszperziós) kötések. A negyedleges szerkezet több különálló fehérjelánc kapcsolatát fejezi ki, amelyek az élő szervezetben működési egységet képeznek. A fehérjék szerkezetét mindenekelőtt azok az aminosavak határozzák meg, amelyekből felépülnek. A sejtben a riboszómákon lezajló fehérjeszintézis után a fehérjemolekula sokféle szerkezeti változáson mehet keresztül. Gyakran találkozunk az aminosav oldalláncok utólagos (poszt-transzlációs) módosulásával, melynek során a protein egy része, például a szignálszekvencia, a transzportért felelős régió vagy a biológiai hatás kifejtését gátló aminosavrészek (Met), propeptidek lehasadhatnak. A molekula szabad amino csoportjaira acetil- illetve metilcsoportok is beépülhetnek. A hidroxilcsoportot tartalmazó aminosav10


oldalláncokon (például Ser, Thr) foszforsav- vagy zsírsavészterek, O-glikozidos kötésben szénhidrátláncok (oligoszacharidok) kapcsolódhatnak a polipeptidgerinchez. Aszparagin amincsoportot

tartalmazó

oldalláncához

N-glikozidos

kötéssel

szintén

különböző

oligoszacharid egységek kapcsolódhatnak, rendkívül sokféle kombinációs lehetőség megvalósítását eredményezve. Az így létrejött glikoproteinek egy részének igen speciális funkciója

van,

lehetnek

például

antigén-determinánsok

vagy

vírusreceptorok.

A

metalloproteinek valamilyen kationt tartalmaznak komplex kötésben, amelynek az esetek nagyobb részében közvetlen szerepe van a fehérje funkciójának kialakításában. Mai tudásunk szerint több mint 300 különböző kémiai átalakulás mehet végbe fehérjeszintézis után a sejtben, s ezek szoros összefüggésben vannak a fehérje biológiai funkciójával, illetve működésük „ki-be kapcsolásával”. Ezek a jelenségek még inkább alátámasztják azt, hogy csupán a genom vizsgálata nem elegendő a fenotípus pillanatnyi jellemzésére, mivel ezek a mechanizmusok végül is a funkcionálisan aktív fehérje-, illetve peptid végtermékek sokkal nagyobb változatosságát okozzák. Ahogy a bevezetésben is említettem, a gének számánál sokszorosan több fehérje fordulhat elő a sejtekben. A humán genom génjeinek számát 20 000–35 000-re becsülik, míg a fehérjék száma egyes vélekedések szerint 500 000 és egymillió közé esik. E komplex kép leírásával és lehetőségeinek kiaknázásával foglalkozik a proteomkutatás [1].

II.2 Proteomika A sejtben adott időpontban a genom által expresszált fehérjék összessége a proteom (PROTEins expressed by the genOM), melynek feltérképezése több mint 20 éves múltra tekint vissza. A proteomika kifejezést az 1990’-es évek közepén vezették be, amelynek célja a sejtek működésének, a proteomnak a vizsgálata [2]. Mint új tudományterület, a proteomika kialakulása a 90’-es évek elejére tehető, és a hagyományos kétdimenziós elektroforézis elterjedésével kapott lendületre, amit az időközben a fehérje-géltechnikai módszerek és a nagyfelbontású, digitális gélpásztázó rendszerek működése terén történő technikai fejlesztések tettek lehetővé. Sikerült már azt is megvalósítani, hogy egy géllapon akár több ezer protein (kb. 4000-6000 fehérjemolekula, illetve folt) elválasztható legyen nagy biztonsággal, ez pedig már annyi, mint amennyi peptid illetve fehérje molekulája van az egyszerűbb mikroorganizmusoknak.

11


A proteomkutatás eszközeit három nagyobb csoportba sorolhatjuk. Az elsőt a fehérjék elválasztásának, a másodikat a fehérjék azonosításának, a harmadikat a fehérjékkel kapcsolatos informatikának a módszerei alkotják. Az elmúlt közel három évtizedben a fehérjék elválasztására az említett elektroforézises technikák közül a kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis (2D-PAGE) tűnt a legmegbízhatóbbnak. Nagyfelbontású 2D-PAGE ma már közel 10 000 fehérjét képes gélenként elválasztani egymástól, amelyet érzékeny fehérjekimutatási eljárással (pl. Coomassie-blue, SYPRO Ruby és Deep Purple valamint ezüstfestéssel) lehet láthatóvá tenni. Az elválasztás elve meglehetősen egyszerű; az első dimenzióban izoelektromos fókuszálás (IEF) történik (a fehérjék addig vándorolnak egy pH gradiensben, amíg elérik az izoelektromos pontjukat, ahol töltésük zérus, tehát az elektromos tér nem hat rájuk), a második dimenzió pedig az IEF-fel elválasztott fehérjéknek a molekulatömegük (méret) szerinti elválasztása SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel. A fehérjék azonosítása nagy kihívás, de a folyamatosan fejlődő technikák segítségével egyre inkább megoldhatóvá válik. Az elektroforézis technika egyszerűsége sohasem tudta kompenzálni azokat a negatívumokat, amit a detektálás gyengesége okozott. A fehérjék azonosításánál ez pedig igen nagy problémákat jelent, amikor a sejtben igen kis mennyiségben jelenlévő fehérjéknek tulajdoníthatunk fontos biológiai funkciót. A nagy mennyiségben jelen lévő protein mellett egy nyomokban előforduló, hasonló méretű és töltésű komponens kimutatása csak nagyon

érzékeny analitikai

eljárással

lehetséges.

A

proteomkutatás következő nagy mérföldkövét a tömegspektrometriás szerkezetazonosítás területén bekövetkezett újítások, új ionizációs technikák (ESI, MALDI) kifejlesztése eredményezte, melyek használata mára a tömegspektrometriát a proteomkutatás egyik alappillérévé tette. A harmadik

módszer a proteininformatika, amely a bioinformatika egyik igen

gyorsan fejlődő ága. A bioinformatika matematikai, statisztikai módszerekkel, becslések segítségével értékeli a proteomika és genomika területéről származó a hatalmas mennyiségű adatot. Ma már a genomikai és strukturális eredményekből, a különböző nukleinsav és peptidszekvenálási projektekből származó információk az interneten óriási adatbázisok formájában állnak a kutatók rendelkezésére, amelyek többnyire szabadon hozzáférhetőek. A bioinformatika eszköztára, illetve az automatizálás nélkül a tömegspektrometriás vizsgálatok által generált hatalmas mennyiségű adat (akár mérésenként több tízezer spektrum) értékelése teljesen elképzelhetetlen volna.

12


II.2.1 Tömegspektrometrián alapuló proteomikai vizsgálatok Két módszer ismeretes a biológiai mintákból extrahált fehérjék azonosítására; az egyik az ún. „bottom-up”, a másik a „top-down” megközelítés [3]. A bottom-up módszernél (II.1Ábra) a komplex keverékekben található fehérjéket előbb elválaszthatjuk, majd redukálást, alkilezést követően enzimatikus (vagy kémiai) hasítást végzünk, amelyből peptidekhez jutunk. Az emésztésből származó peptidkeverék közvetlen (nano-ESI, v. MALDI)

módon

vagy

újabb

elválasztást

(HPLC)

követően

on-line

tandem

tömegspektrométerhez kapcsolva megkapjuk a peptidfragmensek tömegeit. A „peptide mass mapping” vagy „peptide mass fingerprint” (PMF) elemzés alapja, hogy a vizsgált fehérjéből előállított peptidtömegeket egy „virtuális” ujjlenyomathoz hasonlítja, amely az adatbázisban megtalálható fehérje teoretikus hasításából ered. Már 3-4 peptidtömeg elég lehet a fehérje meghatározására, azonban több adat csak növeli a találat megbízhatóságát.

Fehérjék „Bottom-up” módszer

Fehérjék elválasztása

„Top-down” módszer

„Shotgun” módszer, emésztés

Fehérjék elválasztása

Tiszta, vagy kevésbé komplex fehérje frakció

Peptid keverék

Emésztés

Peptid keverék Peptidek tömegmérése

Tiszta, vagy kevésbé komplex fehérje frakció

On-line többdimenziós (nD)LC-MS On-line (1D)LC-MS

On-line MS

Off-line MS

Fehérje prekurzorok tömegmérése Peptid prekurzorok tömegmérése

Target prekurzor ion kiválasztása

MSn

Információfüggő MS/MS PMF

Információfüggő MS/MS

Peptidek azonosítása Fehérjeazonosítás peptidtömeg alapján

Fehérjeazonosítás intakt proteinek MSMS-éből

Fehérjeazonosítás peptidek MSMS-éből

II.1 Ábra Tömegspektrometrián alapuló proteomikai vizsgálatok lehetőségei

13


Alternatívaként az összetett fehérjekeveréket is meg lehet emészteni, ekkor egy még komplexebb

peptidkeverékhez

jutunk,

amit

többdimenziós

kromatográfiával

tömegspektrométerhez kapcsolva vizsgálhatunk. Ez az ún. shotgun megközelítés. A top-down módszernél, a fehérjekeveréket szeparálják tiszta proteinfrakciókig, ezt követően off-line infúziós pumpáról adagolva vagy on-line LC-MS kapcsolással az intakt proteint a tömegspektrométerbe juttatják, ahol fragmentálják. II.3 Proteomikában használt tömegspektrometria A tömegspektrometria az elmúlt két évtized alatt a proteinkutatás vezető analitikai és szerkezetvizsgálati

eszközévé

vált.

Rendkívüli

érzékenységének

(attomól-femtomól

tartomány), pontosságának és gyorsaságának köszönhetően, különösen korszerű elválasztási módszerekkel kapcsolva a tömegspektrometria a fehérjék és más biomolekulák vizsgálatában a leghatékonyabb csúcstechnikának tekinthető. Ezen a technikán alapuló stratégiák a 90’-es évek közepétől a fehérjék aminosav-szekvenciájának meghatározására addig elsődlegesen használt Edman lebontáson alapuló módszert váltották fel. A tömegspektrometria olyan vizsgálati módszer, amelyben először a vizsgálandó vegyületből gázfázisú, pozitívan vagy negatívan töltött ionokat hoznak létre, amelyeket tömegük és töltésük (m/z, fajlagos tömeg) szerint szétválasztanak és detektálnak. Egy tömegspektrométer a következő egységekből épül fel: mintabeviteli rendszer, ionforrás, analizátor, detektor, vákuumrendszer valamint számítógép szabályzó és adatkezelő (adatgyűjtő, feldolgozó, értékelő, archiváló) funkcióval. Egy univerzálisan használható tömegspektrométer többféle mintabeviteli lehetőséggel rendelkezik, a mintabevitel történhet közvetlenül: gáz, folyadék, vagy szilárd formában, illetve komplexebb, többkomponensű minta esetében közvetetten, valamilyen kromatográfiás elválasztás (GC, HPLC, CE stb.) alkalmazásával. Az ionforrás feladata, hogy a vizsgálandó molekulából ionokat hozzon létre és ezeket az ionokat juttassa az analizátorba. Az ionizáció történhet elektronokkal, ionokkal, atomokkal vagy nagyenergiájú fotonnal történő kölcsönhatás eredményeként; kémiai úton ion–molekula reakció révén; valamint elektromos térerő vagy/és hőmérséklet hatására (spray ionizációs módszerek). Az analizátor fajlagos tömegük szerint választja szét az ionforrásból érkező ionokat. A detektor feladata, hogy az ionok számával arányos intenzitású jelet adjon, a vákuumrendszer (ami legalább kétfokozatú) funkciója pedig az ionok repüléséhez szükséges szabad úthossz biztosítása, az ion-molekula ütközések elkerülése. 14


A tömegspektrometria rohamos fejlődése az elmúlt két évtizedben számos új készüléktípust, mérési technikát eredményezett, amelyek teljes ismertetésére e dolgozat keretein belül nincs lehetőség. Disszertációmban ezért csak a doktori munkámhoz közvetlenül alkalmazott készülékeket/mérési módszereket mutatom be (ESI, MALDI ionizációk illetve a QqQ és TOF analizátortípusok). II.3.1 Alkalmazott ionizációs technikák A tömegspektrometria használata sokáig csak kis molekulatömegű és illékony vegyületekre korlátozódott, mivel az addigi ionizációs technikák nem tették lehetővé a hőre érzékeny, kevésbé illékony, nagyméretű és polárosabb minták ionizációját, illetőleg túlzott fragmentáció nélküli vizsgálatát. A 80’-as években azonban megjelentek a kíméletes (lágy) ionizációs technikák, utat nyitva a biológiai, biokémiai és orvosi-diagnosztikai problémák megoldása felé. Számos új, lágy ionizációs módszer terjedt el széleskörűen (a korábbi kémiai ionizáció után): a gyorsatom bombázásos ionizáció (fast atom bombardment, FAB), az elektroporlasztásos ionizáció (electrospray ionization, ESI) valamint a mátrixszal segített lézer-deszorpciós ionizáció (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI). A FAB ionizációval már lehetővé vált kisebb molekulatömegű biopolimerek, peptidek oligonukleotidok vizsgálata, azonban a mérhető tömegtartomány még továbbra is csak 6-8 kDa volt. A 80’-as évek végén bevezetett két új ionizációs technika, az ESI és a MALDI ionizáció, hatalmas előrelépést jelentett a nagyobb méretű biopolimerek (proteinek, peptidek, szénhidrátok, oligonukleotidok stb.) analitikájában. Ettől kezdve a tömegspektrometria alkalmazása a molekulatömeg meghatározásán kívül kiterjedt a fehérjék, a peptidek és a DNS szekvenciájának

meghatározására,

in

vitro

metabolizmusvizsgálatokra,

nemkovalens

kölcsönhatások, proteinek feltekeredésének tanulmányozására. Ez a két ionizációs mód, kezdetben egymással versenyezve, később egymást kiegészítve, mára a proteom kutatásának legfontosabb analitikai eszközévé nőtte ki magát. II.3.1.1 Elektrospray ionizáció Az elektrospray ionizáció a spray ionizációs módszerek csoportjába tartozik. Ebbe a csoportba tartozó ionizációs technikák közös vonása, hogy a minta viszonylag magas nyomáson (akár légköri) közvetlenül vagy folyadékkromatográfiás elválasztást követően folyadékáram segítségével kerül be a tömegspektrométer ionforrásába, ahol elektromos tér 15


(Electrospray, ESI) vagy hőmérséklet hatására (Thermospray, TSP); illetve ezeket kombinálva (Légköri Nyomású Kémiai Ionizáció, APCI) a minta porlasztása következik be. A folyamat következtében töltött cseppecskék képződnek, amit a cseppek párolgása követ és végül izolált gázfázisú ionok jönnek létre. Amíg a TSP módszernél az ionképzést elektrolit hozzáadása segíti, az ESI és APCI ionizációs technikáknál elektrosztatikus tér hatása eredményezi ezt atmoszférikus nyomáson.

+ ++

- - ++- - - - + + + + - - - - + + - + +- + + + - + + + + + + + + + - + + - - --- - + + - - +

+ +- + + - + ++

+-+ + ++

++ +

+

-

feszültségforrás

II.2 Ábra Az ionképződés folyamata elektrospray ionizáció során

Az elektrospray ionizációt már 1968-ban leírta Dole [4], mégis két évtizednek kellett eltelnie, amíg 1989-ben Fenn és Yamashita megvalósították az első elektrospraytömegspektrométer (ESI-MS) kapcsolatot, áttörést hozva a biomolekulák vizsgálatában [5, 6]. Az elektrospray ionizáció során a minta egy folyadékáram segítségével bekerül egy 0.1-0.5 mm belső átmérőjű fém kapillárisba, amelyre 2-6 kV feszültség van kapcsolva a belépő réshez viszonyítva (II.2 Ábra). A kapilláris hegye és az ellenelektród között kialakuló erős elektrosztatikus tér hatására a kilépő folyadék kúpszerűen kicsúcsosodik (Taylor kúp), és a csúcsáról töltéssel rendelkező folyadékcseppecskék szakadnak le. A folyadékcseppek a minta mellett még jelentős mennyiségű oldószert tartalmaznak, ezért a porlasztás hatásfokát tovább növelik inert porlasztógáz (nitrogén) segítségével, amit a kapilláris körül koaxiálisan elhelyezett csőbe vezetnek be. Ezt még kiegészítheti az aeroszol további fűtött kapillárison (200-250 °C) keresztüli áramoltatása. A megnövekedett folyadékmennyiség eltávolításának 16


egy másik lehetséges módja, amikor az elpárologtatás a mintára ellenáramú gázfüggöny segítségével történik (N2 függönygáz), aminek nagy előnye a fűtött kapillárissal szemben, hogy az áramló gáz tisztán tartja a belépő nyílást, az eltömődés veszélye kisebb. ESI folyamat során, mivel a párolgó cseppecskék töltése nem változik, méretük csökkenésével párhuzamosan felületi töltéssűrűségük nő. A cseppek párolgása addig tart, amíg a felületi töltésből eredő elektrosztatikus taszítóerő egyenlő lesz a felületi feszültségből adódó összehúzó erővel (Rayleight-féle instabilitási határ). Ekkor bekövetkezik az ún. Coulombrobbanás, és a csepp számos kisebb méretű töltött cseppre hasad. A kisebb cseppekből tovább folyatódik az oldószerpárolgás, és egyre kisebb méretű cseppekhez jutunk. Kétféle mechanizmus ismert egyedi gázfázisú ionok képződésére. Egyrészt – főleg makromolekulák esetében – az aprózódás során végül csak egy ion marad a cseppecskékben, amely bepárlódva megőrzi töltését (charge residue model, CRM vagyis „maradék töltés” modell). Másrészt – kisebb molekulák esetében – bizonyos cseppméret alatt (10 nm) és töltéssűrűség felett a túltöltött cseppecske további hasadás helyett gázfázisú ionokat emittálhat a felszínéről (Ion evaporation model, IEM vagyis Ionpárolgás). E két folyamatot nem lehet szétválasztani egyértelműen, általában párhuzamosan zajlanak egymás mellett, azonban sok esetben az egyik válhat dominánssá [7]. Az ESI technika ionos, poláris és polarizálható vegyületek vizsgálatára alkalmas, és mind pozitív mind negatív ionok előállítására képes. További jellegzetessége a többszörösen töltött ionok képződése (3-tól akár százszoros töltés), lehetővé téve igen nagy tömegű vegyületek vizsgálatát alacsony méréshatárú analizátorok alkalmazásával (m/z-t detektálunk, ami így belesik a készülék néhány ezer Da-os „tömegablakába”). Nagy ionizációs hatásfokának köszönhetően rendkívül érzékeny technika, és további előnye, hogy egyszerűen kapcsolható

kromatográfiás

módszerekkel

(HPLC,

CE)

lehetőséget

teremtve

a

többkomponensű keverékek/anyagok tanulmányozására. Hátránya, hogy csak illékony oldószerek és pufferek alkalmazhatók, mivel a sók és kevésbé illékony oldószerek az érzékenységet nagymértékben csökkentik, továbbá az ionforrás elszennyeződéséhez vezetnek. Egy hagyományos ESI-tömegspektrométer kb. 10 µL/perc - 1-2 ml/perc áramlási sebességű folyadékáramot használ. Nanoelektrospray esetében ez az áramlás lecsökken nl/perc-es sebességre, és a sprayképződés sokkal könnyebben megtörténik. Ilyenkor nincs szükség sem szárítógázra sem fűtésre, az aeroszol előállítását kizárólag az alkalmazott feszültség végzi. A nanoESI technika igen elterjedt a proteomikában, mivel sokkal toleránsabb oldószerekre nézve, vizes oldatokból is képes stabil aeroszolt előállítani. Az áramlási sebesség csökkenésével az ionizáció hatásfoka növekszik, mivel minél kevesebb 17


mennyiségű folyadék áramlik a kapillárison, annál kisebb méretű aeroszol cseppeket tudunk előállítani. Az alacsony áramlási sebesség további előnye, hogy az analízis ideje megnövekszik, egyre hosszabb ideig tudunk kis mennyiségű mintát analizálni, a tömegspektrométer paramétereit optimálni, szerkezeti információhoz jutni stb. További előnye, hogy jól illeszthető nano HPLC rendszerekhez. II.3.1.2 Mátrixszal segített lézerdeszorpciós ionizáció (MALDI) A 70’-es évek elejétől ígéretes kezdeményezésnek bizonyultak a plazmadeszorpciós (PD-), illetve lézerdeszorpciós ionizációs (LDI-) eljárások, azonban ezekkel a módszerekkel még nem sikerült jelentős előrelépést elérni a biomolekulák 5 kDa vagy ennél nagyobb móltömegű tartományában. A probléma megoldására a 80’-as években Hillenkamp és Karas valamint tőlük függetlenül Tanaka és munkatársai jöttek rá, miszerint nem a vizsgálni kívánt molekulát kell közvetlenül gerjeszteni, hanem a lézer energiáját elnyelő mátrixra van szükség, így elkerülhető a vizsgálandó vegyületek direkt lézerbesugárzás okozta fotodisszociációja [8, 9]. Az újonnan kifejlesztett ionizációs módszer lényege tehát, hogy a mintát összekeverik egy olyan mátrixszal, amelynek a lézer hullámhosszán jó a fényelnyelése, mintatartóra cseppentik, majd kristályosítják és lézerimpulzusokkal sugározzák be. A MALDI mérések kritikus pontja az alkalmazott mátrix helyes megválasztása. Leggyakrabban nikotinsav-, benzoesav-, illetve fahéjsav-származékokat használnak, amelyet igen nagy feleslegben (~10000:1) alkalmaznak az analithoz képest. A mátrix funkciója egyrészt, hogy a mintával „szilárd oldatot” képezve a vizsgálandó vegyület molekuláit egymástól izolálja, így a minta molekulák csak a mátrix molekulákkal vannak kölcsönhatásban, csökkentve a másodlagos kötőerőket, aggregációt. Másrészt a lézerből származó gerjesztő energiát veszik fel és közvetítik a vizsgálandó molekulák felé, elősegítve a benne „feloldott” molekulák ionizálódását. Lézerként legelterjedtebben az UV tartományba tartozó, 337 nm-en működő N2 lézert használják (olcsóbb), illetve a Nd-YAG lézert 266 nm és 355 nm hullámhossznál (drágább). Az UVMALDI ionizáció mellett labilis vegyületek (pl. sziálsav tartalmú vagy foszforilált peptidek) és nemkovalens komplexek vizsgálatára infravörös tartományban működő lézereket is használnak (IR-MALDI), azonban gyengébb felbontásuk, és legtöbb esetben rosszabb érzékenységük miatt kevésbé terjedtek el. A lézerimpulzusok hatására robbanásszerűen bekövetkezik a kristályokban a mátrix+minta fázisátalakulása/deszorpciója, és a szilárd felületről kiszakadva a minta és a mátrix molekuláit tartalmazó gázfelhő képződik (II.3 Ábra). A MALDI ionizáció 18


mechanizmusának leírására számos elképzelés látott napvilágot, azonban a pontos folyamat teljesen még ma sem ismert, inkább csak feltételezések születtek. Általános elképzelés szerint az analithoz képest jelentős mennyiségben jelenlévő mátrix molekulák elnyelik a lézer fotonok nagy részét, ami gyors vibrációs gerjesztődést eredményez. Ez a kristály lokális felmelegedését eredményezi és a gázfázisba/vákuumba kerülnek a mintamolekulákkal együtt. A gázfázisban ion-molekula töltéscsere reakciók mennek végbe, a mátrix-molekulák ionizálják az analit molekuláit; proton, illetve egyéb kation átadásával

[M+H] + illetve

[M+X]+ (X= Li, Na, K stb.), valamint deprotonálódással [M-H]- ionok keletkeznek. A kapott MALDI spektrumon az egyszeresen töltött ionok dominálnak, de ezeket kísérhetik kétszeresen, sőt háromszorosan töltött ionok ([M+2H]2+, [M+3H]3+) is. Felbukkanhatnak továbbá nemkovalens erőkkel összetartott addukt termékek: dimerek ([2M+H]+), trimerek ([3M+H]+) stb., illetve bizonyos vegyületek mátrixszal képzett adduktjai, amelyek jelenléte megkönnyíti a móltömeg azonosítását.

Mintatartó

lézer

hn

AH+

Rács

analizátor

Rács

+20 kV II.3 Ábra Az ionképződés folyamata MALDI ionizáció során

Lehetőségünk van MALDI ionizáció során a molekulatömegen kívül további szerkezeti ionformáció szerezésére is az ún. forrás utáni fragmentáció (post-source decay, PSD) alkalmazásával. Ebben az esetben miután a minta elhagyta az ionforrást, spontán (metastabilis) illetve ütközés indukált fragmentációját váltják ki. MALDI ionizációnál a mátrix megválasztása valamint a minta előkészítése alapvetően meghatározó jellegűek. Biokémiai vonatkozásban, például fehérjék peptidek vizsgálatára 19


elsősorban fahéjsav-származékokat: α-ciano-4-hidroxi-fahéjsavat (CHCA), 3,5-dimetoxi-4hidroxi-fahéjsavat (sinapinic acid, SA); oligoszacharidok tanulmányozására leggyakrabban 2,5-dihidroxi-benzoesavat (DHB); nukleinsavakhoz pedig 3-hidroxi-pikolinsavat (3-HPA) használnak. Adott hullámhosszra és vegyülettípusra többféle mátrix is alkalmazható, a leghatékonyabbak kiválasztását mindig kísérletek előzik meg. A minta preparálására szintén többféle megoldás létezik, amelyek közül a leggyakoribb az ún. „szárított csepp” módszer (dried droplet method), amikor a minta oldatát a mátrix telített oldatával összekeverik, ebből 0,5-1 L-t a mintatartóra cseppentenek, majd levegőn megszárítják. Másik megoldás (ritkább), amikor a mintatartó felületen először egy vékony mátrixréteget készítenek, és erre cseppentik, majd szárítják a minta oldatát (thin layer method) esetleg további mátrixot (sandwich method). A MALDI ionizáció előnyei közé tartozik rendkívüli érzékenysége. Napjainkban már peptidek, fehérjék femtomól ill. néhány attomólnyi mennyiségben is rutinszerűen vizsgálhatók vele. További előnye, hogy TOF (time of flight, repülési idő) analizátorhoz kapcsolva a vizsgálható molekulák tömegtartományának elméletileg nincs felső határa. Ez hatalmas áttörést jelentett a nagyméretű biomolekulák kutatásában (<500 kDa), bár az „ultranagy” tömegek (> 1-2 MDa) vizsgálatához érzékeny és speciális hűtött detektorra van szükség [10]. MALDI ionizációt használva keverékek egyidejű vizsgálata is lehetséges, nem igényel bonyolult tisztítást, elválasztást. További jó tulajdonságai közé sorolható a módszer gyorsasága, a minták újramérhetők, valamint hogy jobban tolerálja a sók, pufferek hatását, mint az elektrospray. II.3.2 Alkalmazott analizátorok A tömeganalizátorok a szó szoros, és átvitt értelmében is a tömegspektrométerek leglényegesebb funkcionális egységei. A proteomikai kutatások szempontjából az analizátorok legfontosabb paraméterei: érzékenység, felbontás, tömegpontosság, megfelelő tömegtartomány. A biológiai tömegspektrometriában napjainkig a következő fő analizátor típusok terjedtek el: kvadrupól (quadrupole, Q), ioncsapda (mely lehet 3D (3D iontrap), vagy lineáris (linear iontrap, LIT)), repülési idő (time of flight, TOF) illetve a Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia (Fourier transform ion cyclotron resonance, FTICR) analizátorok. Ezeken kívül meg kell még említenünk az utóbbi időben megjelent orbitrap (OT) analizátort is, amely különleges felbontóképességének köszönhetően a proteomikai területen is egy új, igen hatékony analitikai eszköz lehetőségét rejti magában [3]. 20


Az említett analizátorok mind működési elvükben, mind analitikai teljesítőképességükben teljesen eltérnek egymástól. Megállják a helyüket önállóan is, de előnyeiket kihasználva kombinálhatják is őket egymással. Ennek eredményeként jöttek létre a tandem készülékek: QqQ, QqLIT, QqTOF, TOF-TOF, és LIT-FTICR. Doktori dolgozatomban bemutatott eredményekhez ESI-QqQ, ESI-Q-TOF valamint MALDI-TOF típusú tömegspektrométereket használtam, ezért az említett analizátorok közül csak az általam alkalmazottakat ismertetem. II.3.2.1 Kvadrupól analizátor A kvadrupól elven működő analizátorok kifejlesztése a görög Christophilos kutatásait folytatva, Paul és Steinwegen fizikusok nevéhez fűződik (1953) [11] . A kvadrupól analizátor (vagy más néven kvadrupól tömegszűrő) négy párhuzamosan, egy képzeletbeli központi tengelytől egyenlő távolságban elhelyezett kör vagy hiperbolikus keresztmetszetű rúdból áll, amelyekre állandó egyenáramot, illetve nagyfrekvenciás váltóáramot kapcsolnak (II.4 Ábra). A két-két szemközti rúdra +(U+Vcos(ωt), illetve -(U+Vcos(ωt)) potenciált alkalmaznak, ahol U állandó potenciálérték, Vcos(ωt) pedig egy V amplitúdójú és ω frekvenciájú rádiófrekvenciás jel, aminek következtében kvadrupoláris elektromos tér alakul ki. Ebben az oszcilláló térben az ionok rezegve haladnak, pályájuk függ az m/z aránytól, az U és V értékétől, valamint a rádiófrekvenciás jel frekvenciájától (ω). Az analizátoron csak azok az ionok képesek átjutni (anélkül hogy az elektródként viselkedő rudak valamelyikéhez csapódnának), amelyek ionpályája stabil a rudak között. A többi ion rezgésének amplitúdója folyamatosan nő, míg bele nem ütköznek valamelyik rúdba. U, V és  megfelelő megválasztásával elérhető, hogy csak egy adott m/z-vel jellemzett ion jusson át az analizátoron. Az egyen- és váltófeszültség szisztematikus változtatásával (úgy, hogy hányadosuk, U/V állandó maradjon) vehető fel egy teljes tömegspektrum.

II.4 Ábra A kvadrupól analizátor felépítése

21


A kvadrupól analizátorok felbontása közel egységnyi, méréshatáruk néhány ezer Da. Számos előnyük közé tartozik, például, hogy egyaránt alkalmasak pozitív és negatív ionok analizálására, nincs szükségük extra nagy vákuumra (>10-7 Torr), viszonylag gyorsak, könnyen

és

egyszerűen

kezelhető

készülékek,

továbbá

jól

illeszthetők

a

nagy

átbocsátóképességű (high throughput) analitikai módszerekhez. II.3.2.2 Repülési idő analizátor Az első kereskedelemben kapható TOF-MS készülékek 1955-ben jelentek meg, amelyeket Wiley és McLaren terveztek, bár az első repülési idő mérésén alapuló tömegspektrométer atyjának W. E. Stephens tekinthető [12]. A repülési idő analizátorok elve talán a legegyszerűbb az összes analizátortípus között; az ionoknak ismert hosszúságú utat kell befutniuk, s az ehhez szükséges időt mérik (II.5 Ábra).

Anód Repülési úthossz M

+

M

Katód Rács Ionizációs tér

Detektor

Gyorsító tér Analizátor tér

II.5 Ábra TOF analizátor vázlata

Állandó gyorsító feszültséget alkalmazva, az ionok jól definiált kinetikus energiára (Ekin) tesznek szert, amiből sebességük meghatározható. Ekin  zeU 

1 2 mv 2

ahol m az ion tömege, v az ion repülési sebessége, z az ion töltésszáma, e az elektron töltése és U a gyorsító feszültség. Ha minden töltéshordozó azonos kinetikus energiára tesz szert, akkor: zU 

1 1 1 m1v12  m2 v22      mn vn2 2 2 2

Ha az ionok indítása állandó U gyorsítófeszültséggel történik, akkor az azonos kinetikus energiájú, azonos z töltésű, de különböző tömegű (m1, m2, ….mn) részecskék más-más

22


sebességgel (v1, v2,….vn) repülnek, és különböző t idő alatt teszik meg az L távolságot (térmentes repülési cső). A különböző tömegű ionokat az idő függvényében detektálhatjuk.

t

L L  v 2eU

m z

A repülési idő tehát adott L távolság (ionforrás - detektor távolság) és gyorsítófeszültség mellett csak a fajlagos tömeg függvénye (t egyenesen arányos az m/z arány négyzetgyökével). Ennél az analizátornál a felbontás szempontjából kulcsfontosságú, hogy az ionok ionforrásból való kilökődése (az „indítójel”) impulzusszerű legyen, mivel az időt csak az út megtétele utáni becsapódás alapján tudják meghatározni. Ezért ezek az analizátorok impulzusüzemű, elsősorban MALDI ionforrással alkalmazhatók (MALDI-TOF berendezések), vagy folytonos ionforrásokkal, kapuzott ionextrakciós technikával (ESI-TOF). Kezdetben a TOF készülékek főleg az elektronika és az adtafeldolgozás hiányának köszönhetően nem voltak túl sikeresek mivel felbontásuk még a legegyszerűbb egyszeres fókuszálású mágneses készülék felbontását sem érte el. Ez szükségképpen további fejlesztéseket indukált. A TOF készülékek felbontását csökkentő egyik tényező, hogy az azonos m/z értékű ionok meglehetősen széles sebesség (energia) eloszlásra tesznek szert a gyorsítóteret elhagyva. Ez adódhat abból, hogy az ionok, amelyek azonos tömeggel és kinetikus energiával rendelkeznek a potenciáltér különböző helyén, vagy eltérő időben keletkeznek, és ez a csúcsszélesség drasztikus kiszélesedését eredményezi. További befolyásoló faktor még a kezdeti (képződéskori) kinetikus energia eloszlás, vagyis az azonos tömegű ionok azonos helyen képződnek, de különböző kinetikus energiára tesznek szert (sebességszórás), ami szintén csúcsszélesítő hatással jár. Ezen problémák kiküszöbölésére, a felbontás javítására dolgozták ki az ún. delayed-extraction (DE, késleltetett extrakció) módszert, illetve a reflektron (iontükör) alkalmazását. A késleltetett ionextrakciós módszer alkalmazásánál, amikor az ionizáció megtörténik, még nincs feszültség a gyorsító ionoptikán. Feszültséget csak egy kicsivel később, a lézer impulzusától számított kb.10-400 ns után kapcsolnak az ionforrásra. A potenciál ráadása után a nagyobb mozgási energiájú (tér nélkül előrébb járó) ionok kisebb (rövidebb ideig tartó) elektromos potenciálnak vannak kitéve, mint a náluk kisebb kinetikus energiájú (tér nélkül hátrébb lévő, lassabb) társaik. Ennek eredményeképpen sebességfókuszálás következik be, és függetlenül a kezdeti sebességüktől, az azonos tömegű ionok egyszerre érik el a detektort, amitől a felbontás drasztikusan nő.

23


A másik széles körben alkalmazott módszer a felbontás javítására a reflektron vagy más néven iontükör használata. A reflektron a repülési cső végén helyezkedik el, és az azonos m/z értékű, de némileg eltérő sebességű ionok közötti repülési idő különbségeket egyenlíti ki. A reflektron gyűrűk (dróthálók) sorozatából áll, amelyekre fokozatosan növekvő potenciál van kapcsolva, 5-10 százalékkal nagyobb, mint a gyorsító feszültség, polaritása pedig azzal ellentétes. A nagyobb sebességű (ugyanakkora m/z értékű) ionok mélyebbre hatolnak a potenciáltérben, és ezért hosszabb pályára kényszerülnek, mint a kisebb sebességű ionok. A tükör belsejében fokozatosan lelassulnak, megállnak, majd tükröződve visszafele gyorsulnak az ionok. Amelyek hosszabb pályára kényszerülnek, azok repülési ideje is hosszabb lesz, mint kisebb sebességű, rövidebb utat megtevőké. Ennek következtében közel egyszerre érkeznek a detektorra, vagyis ily módon ismét fókuszálás történik, nagymértékben javítva a felbontást. A TOF készülékeknek számos előnyük van. Meglehetősen nagy felbontás (kb. 20000) érhető el velük; a mérhető tömegtartomány elvileg nem limitált (bár az 1-2 MDa méréséhez már specifikus detektor kell); felvételi sebességük gyors (10-5000 scan/s), kitűnő ionátviteli hatásfok (transzmisszió) miatt nagyon érzékenyek (1-10 fmol). Ezért nem csoda, hogy a MALDI-TOF és a Q-TOF készülékek igen népszerűek biológiai, biokémiai, orvosi illetve biotechnológiai területeken. Hátrányuk azonban, hogy a hagyományos lineáris TOF analizátorok felbontóképessége (R=m/Δm=t/2Δt) nagyobb tömegtartományban korlátozott (azonos Δm érték nagyobb m-nél sokkal kisebb Δt mérését jelenti, és a pontos idő mérése technikailag problémásabb).

II.3.3 Tandem Tömegspektrometria (MS/MS) A

lágy

ionizációs

technikák

(ESI

és

MALDI)

bevezetése

a

tandem

tömegspektrometriás technikák gyors fejlesztését idézte elő. A lágy ionizációs technikákkal általában intakt, fragmentáció nélküli ionokat kapunk, ami nélkülözhetetlen a molekulatömeg meghatározása szempontjából. A móltömeg azonban (kivéve a pontos tömeget) önmagában még nem elégséges ahhoz, hogy egy szerkezetet egyértelműen azonosítsunk. A tandem tömegspektrometria olyan rendkívül specifikus és érzékeny analitikai technika, amellyel az eredetileg nem fragmentálódó, stabil vegyületekről kapunk a szerkezetükre jellemző adatokat. A hagyományos tömegspektrometriánál lényegesen szelektívebb, alkalmazása bonyolult keverékek, mátrixok esetén különösen előnyös.

24


A tandem tömegspektrometriával általában az első analizátorral kiválasztunk egy iont, majd legtöbbször az ún. ütközéses aktivációval fragmentációra késztetjük (collision induced dissociation, CID). Ennél a technikánál a kiválasztott iont (esetenként elektrosztatikus terekkel történő gyorsítás után) semleges gázmolekulákkal (He, Ar, Xe) ütköztetjük, amely az ütközés(ek) során a gerjesztődik és disszociál. A disszociáció során keletkezett leányionokat a második analizátor segítségével választjuk külön, majd detektáljuk az MS-MS spektrumot. A módszert Keith R. Jennings vezette be 1968-ban. A tandem tömegspektrométerek egyik típusánál a készülék két azonos, vagy két különböző fajta analizátorral rendelkezik, és ezek között helyezkedik el az ütközési cella vagy ütközési kvadrupól. Ebben az esetben különböző terekben képződnek és bomlanak az ionok. A másik válfajánál az MS/MS folyamatok egy téren belül, de különböző időkben zajlanak. Ilyenek az ioncsapda és ICR készülékek

A) Product Ion Scan m/z

B) Precursor Ion Scan m/z

C) Neutral Loss Scan idő

D) Multiple Reaction Monitoring (MRM) idő

II.6 Ábra Lehetséges scanfunkciók QqQ analizátorok esetében

Manapság a tandem tömegspektrométerek közül a hármas kvadrupólokat használják a legelterjedtebben, amelyeken a következő MS üzemmódban lehet mérni (normál MS funkción kívül): Product Ion Scan (II.6A Ábra): Q1 kvadrupóllal kiválasztjuk az anyaiont (precursor ion, anyaion) ütközési cellában (Q2) ütköztetjük, majd a fragmenseit (product ion, leányion) a

25


Q3 kvadrupól pásztázásával analizáljuk. Proteomikában ez a legáltalánosabban használt MS/MS funkció, mivel a peptidek fragmentációjából azok aminosav-sorrendjüket kapjuk meg. Elsősorban a savamid-kötések hasadásából származó b- és y-ionsorozat képződik, attól függően, hogy töltés a peptid N vagy C terminális végén marad. Precursor Ion Scan (II.6B Ábra): Q3 analizátorral kiválasztunk egy specifikus, számunkra fontos fragmens iont, és Q1 pásztázásával megkapjuk mindazokat a prekurzor ionokat, amelyekből ez a fragmens ion képződhetett. Általában ezt a módszert használják különböző vegyületcsaládok kimutatására, proteomikában egyes specifikus funkciós csoportok (foszfát-észter vagy cukor-módosulások) vizsgálatára. Neutral Loss Scan (II.6C Ábra): Q1 és Q3 analizátor egy állandó, általunk megadott értékű különbséggel, összehangoltan pásztázik, így meghatározható, hogy mely ionok veszítenek egy bizonyos semleges molekulát. A semlegesvesztés móddal lehet detektálni például szerinen és treoninen foszforilált peptideket. Multiple Reaction Monitoring (MRM) (II.6D Ábra): Q1 és Q3 analizátor egy-egy adott ionra (prekurzorra és produkt ionra) van beállítva, így kizárólag egy bomlási folyamatot vizsgálunk. Mennyiségi meghatározásnál ezt a módszert használjuk, mivel rendkívüli szelektivitás és érzékenység érhető el vele. Proteomikai területen az MS/MS vizsgálatokhoz eddig az ütközéssel indukált bomlásokat használták legelterjedtebben, azonban az új fejlesztéseknek köszönhetően megjelentek új típusú fragmentációs technikák, további lehetőségeket teremtve a biomolekulák szerkezetfelderítésében. Az egyik az elektron befogáson alapuló disszociáció (electron capture dissociation, ECD), amelyet 1998-ban McLafferty laboratóriumában alkalmaztak először [13, 14]. Többszörösen protonált protein/peptid kationt termikus elektron befogással sikerült fragmentálni, és a CID bomlásoktól eltérően c- és z-típusú peptidfragmenseket detektáltak. Előnyük, hogy intenzívebb, információban gazdagabb MS/MS spektrumokat produkáltak, javítva a szekvencialefedettséget és megvédve a labilis poszt-transzlációs módosulásokat. Hátránya, hogy az ECD funkció leggyakrabban a drága, és bonyolult működésű FTICR készülékeken valósítható meg. Az ECD-hez hasonló fragmentációs technika az elektron transzfer disszociáció (electron transfer dissociation, ETD). A technikát 2004-ben Hunt fejlesztette ki, és nagy előnye, hogy már egyszerűbb, asztali tömegspektrométereken is kivitelezhető [15]. Az ETD ütköztetés során a tömegspektrométerben előállított fluorantén gyökanionok elektronokat adnak át a pozitív töltésű peptideknek, így a peptidlánc az amid csoportnál hasad el, fragmensgazdag spektrumot eredményezve. A fontosabb módosulások, mint pl. a 26


foszforilálás, és az aminosav mellékláncok ebben az esetben is sértetlenek maradnak. Az ETD kiegészíti a klasszikus CID ütköztetéssel nyert információkat. A nagy molekulatömegű peptidek sikeresen fragmentálhatóak az ETD-vel, így ez a fejlesztés lehetővé teszi a kis molekulatömegű fehérjék, nagy molekulatömegű peptidek top-down szekvenálását és támogatja az enzimeket alkalmazó bottom-up proteomikát, amelyek során nagyobb peptid fragmensek képződnek. II.4 Referenciák a II. részhez 1. 2.

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

10.

11. 12. 13. 14. 15.

Hudecz, F., Proteomika – az új kihívás. Lege Artis Medicinae-Tudomány, 2003. 13(3): p. 216-224. Wilkins, M.R., J.C. Sanchez, A.A. Gooley, R.D. Appel, I. HumpherySmith, D.F. Hochstrasser, and K.L. Williams, Progress with proteome projects: Why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotech. Gen. Eng. Rev., Vol 13, 1996. 13: p. 19-50. Han, X.M., A. Aslanian, and J.R. Yates, Mass spectrometry for proteomics. Curr. Op. Chem. Biol., 2008. 12(5): p. 483-490. Dole, M., L.L. Mack, R.L. Hines, R.C. Mobley, L.D. Ferguson, and M.B. Alice, Molecular Beams of Macroions. J. Chem. Phys., 1968. 49(5): p. 2240–2249. Yamashita, M. and J.B. Fenn, Electrospray ion source. Another variation on the free-jet theme. J. Phys. Chem., 1984. 88(20): p. 4451–4459. Fenn, J.B., M. Mann, C.K. Meng, S.F. Wong, and C.M. Whitehouse, Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules. Science, 1989. 246: p. 64-71. de la Mora, J.F., Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole’s charged residue mechanism. Anal. Chim. Acta, 2000. 406(1): p. 93-104. Karas, M. and F. Hillenkamp, Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal. Chem., 1988. 60(20): p. 2299–2301. Tanaka, K., H. Waki, Y. Ido, S. Akita, and Y. Yoshida, Protein and Polymer Analyses up to m/z 100 000 by Laser Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1988. 2(8): p. 151-153. Yanes, O., A. Nazabal, R. Wenzel, R. Zenobi, and F.X. Aviles, Detection of noncovalent complexes in biological samples by intensity fading and high-mass detection MALDI-TOF mass spectrometry. J. Prot. Res., 2006. 5(10): p. 2711-2719. Paul, W., Electromagnetic Traps for Charged and Neutral Particles (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed., 1990. 29: p. 739-748. Stephens, W.E., A pulsed mass spectrometer with time dispersion. Physical Review, 1946. 69: p., 691. Zubarev, R., Protein primary structure using orthogonal fragmentation techniques in Fourier transform mass spectrometry. Exp. Rev. Prot., 2006. 3: p. 251-261. Zubarev, R.A., N.L. Kelleher, and F.W. McLafferty, Electron capture dissociation of multiply charged protein cations. A nonergodic process. J. Am. Chem. Soc., 1998. 120: p. 3265-3266. Syka, J.E.P., J.J. Coon, M.J. Schroeder, J. Shabanowitz, and D.F. Hunt, Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 2004(101): p. 9528-9533.

27

III. Béta-laktoglobulin nemkovalens komplexképzésének és ligandum-kötőhelyének vizsgálata

III. Béta-laktoglobulin nemkovalens komplexképzésének és ligandumkötőhelyének vizsgálata elektrospray – tömegspektrometriás (ESI-MS) technikával III.1 Irodalmi háttér III.1.1 Makromolekuláris fehérjekomplexek tömegspektrometriás tanulmányozása A legtöbb biokémiai folyamatban a proteinek, peptidek, nukleinsavak egymással illetve egyéb kis molekulás ligandumokkal nemkovalens kölcsönhatásban vesznek részt. Elég csak az enzim-szubsztrát felismerésre, receptor-ligandum kötődésekre, oligomer protein komplexek továbbá egyéb sejtstruktúrák kialakulásának folyamataira gondolni. A nemkovalens makromolekuláris komplexeket gyenge másodlagos erők tartják össze, amelyek közül a legfontosabbak: H-kötések, elektrosztatikus kölcsönhatások, hidrofób kötések és van der Waals erők. Jóllehet a nemkovalens kölcsönhatások erőssége egy-két nagyságrenddel kisebb a kovalens kölcsönhatásoknál, tanulmányozásuk azonban kimagasló jelentőségű a proteinek funkcióinak megértéséhez. A nemkovalens kölcsönhatások tanulmányozása az elmúlt évtizedekben kezdődött, és mára a proteomikai kutatások egyik legfontosabb területét teszik ki. A nemkovalens komplexek szerkezetvizsgálatában a legfontosabb szempont hogy az analízis során a gyenge kötések végig megmaradjanak. Az eddig elterjedt NMR-, IR-, Ramanés CD-spektroszkópia, valamint röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálati módszerek mellett a tömegspektrometriának igen nagy szerep jutott ezen a területen is. Egy egyszerű tömegspektrum már információt ad a komplex molekulatömegéről és a sztöchiometriáról. Részletesebb vizsgálatokkal azonban kötődési állandók, a kapcsolódás kinetikája és energetikai adatok is meghatározhatók vele (mivel egyedi, gázfázisban izolált komplexek tanulmányozását teszi lehetővé) [1, 2]. A nemkovalens komplexek tömegspektrometriás tanulmányozását a 80-as évektől kezdve a lágy ionizációs technikák megjelenése tette lehetővé. Elsőként kémiai ionizációt, majd FAB ill. LSIMS-t (liquid secondary ion mass spectrometry, folyadék szekunderion tömegspektrometria) használtak másodlagos kötőerőkkel összetartott komplexek vizsgálatára. A 90-es években az ESI és MALDI technika megjelenése a nemkovalens komplexek vizsgálatának a területén is új távlatokat nyitott. Az újfajta lágy ionizációs technikák egyre kisebb belső energiájú molekulaionokat állítottak elő, alkalmassá téve őket egyre gyengébb 28


kölcsönhatások kimutatására. Ily módon váltak használhatóvá molekuláris kölcsönhatások és biokémiai folyamatok vizsgálatára. A MALDI ionizáció, amelyet az ESI-vel nagyjából egy időben vezettek be, miközben kiválóan alkalmas kis mennyiségű proteinek móltömegmeghatározására, a makromolekuláris komplexek tanulmányozására már kevésbé használható. A mintaelőkészítés során a szerves, savas mátrix oldattal történő kristályosítást és az ionizáció alatti energiaátadást a fehérjekomplexek nem élik túl, és az esetek többségében disszociálódnak. Az ionizációs technikák közül az ESI a legsikeresebben és leghatékonyabban alkalmazott módszer fehérjekomplexek vizsgálatára. Előnye a többi ionizációs módszerrel szemben, hogy toleráns az alacsony koncentrációban jelenlévő illékony pufferekre, így a fehérjekomplexek közel fiziológiás körülmények között tanulmányozhatók, lehetővé téve a gyenge kölcsönhatások tanulmányozását a fehérje kitekeredése és a komplex disszociációja nélkül. Másrészről viszont, a neutrális pH az ESI mérések során problémás lehet, mert ha a natív fehérje töltöttségi foka alacsony (feltekeredve nem tud felvenni megfelelő számú protont), tömegspektrometriával mérhető m/z értéke a készülék mérési tartományán kívül eshet. Makromolekuláris komplexek területén napjainkban a fehérje-fehérje, fehérje-DNS kölcsönhatások vizsgálata, valamint a fehérjék kismolekulás ligandummal történő komplexképzésének

tanulmányozása

irányzatokhoz.

fehérje-ligandum

A

tartozik

a

legdinamikusabban

kölcsönhatásoknak

fontos

fejlődő szerepe

kutatási van

a

gyógyszermolekulák tervezésénél. Egyes esetekben ugyanis a fehérjék célzottan tudják a ligandot elszállítani a kívánt helyre, hogy azok hatásukat a leghatékonyabban tudják kifejteni. Nemkovalens kötések irányított kialakítása jelenleg is elterjedt a gyógyszeriparban (ciklodextrinbe ágyazott gyógyszermolekulák), illetve a biotechnológiában (molekuláris felismerő rendszerek, bioszenzorok).

III.1.2 A béta-laktoglobulin szerkezete és lehetséges funkciói A lipokalin fehérjecsaládba tartozó béta-laktoglobulin (BLG) a kérődzők és számos nem kérődző faj tejében legnagyobb mennyiségben előforduló tejsavófehérje (a tejfehérjék majdnem 50%-át teszi ki), amely a terhesség illetve laktáció idején az emlőmirigyekben termelődik. Több mint 60 évvel ezelőtt izolálták a tehéntejből, és azóta bár számos, fizikokémiai és biológiai tulajdonságait részletesen tárgyaló összefoglaló cikk jelent meg [329


5], pontos szerepét nem sikerült tisztázni. Ismert az irodalomból, hogy szerkezetileg igen stabil globuláris fehérje (pH=2-n is ellenáll a denaturációnak) [6], amely normál körülmények között, semleges pH-n homodimer formában létezik, pH 2-3 között pedig monomerekre disszociál [7]. A monomer molekula 162 aminosavból áll és móltömege kb.18300 Da. Különböző fajokban számos genetikai variánsát kimutatták [8, 9] amelyek közül szarvasmarhában (Bos taurus, ez a legtöbbet vizsgált) az A és B fenotípusok a túlnyomórészt fellelhetők. A BLG-A a BLG-B variánstól csupán két aminosavban különbözik: a 64-es helyzetben Asp helyett a B-ben Gly, és a 118-as pozícióban Val helyett Ala található a B-ben [10]. Az öt Cys közül négy diszulfidkötésben vesz részt (66-160, 106-119), a 121-es helyzetben lévő Cys pedig hozzáférhető és különböző reakciókban vehet részt [11].

III.1 Ábra BLG A röntgenkrisztallográfiás szerkezete

Az elmúlt években a BLG szerkezetét többdimenziós NMR-spektroszkópiával valamint röntgenkrisztallográfiával behatóan tanulmányozták, és szoros szerkezeti hasonlóságot állapítottak meg a human retinol(A-vitamin)-kötő proteinnel [12]. A molekulában egy igen stabil β-henger található, amely nyolc antiparalel β-lemezből (A-H) épül fel, ezen kívül egy hárommenetes α-hélix és egy további (kilencedik) β-lemez (I) található a molekula Cterminális részén [10, 13-17]. A β-lemezek kúpszerű zsebet formálnak, amelynek egyik oldalát az A-D, másik felületét az E-H β-láncok alkotják. A molekula az így kialakult harmadlagos szerkezetnek köszönheti ligandumkötő képességét, a központi üregbe ugyanis számos hidrofób molekula képes kötődni, ezért a BLG-t a lipokalin fehérjecsaládjába sorolják [18]. A fehérje szerkezetében kitüntetett szerep jut az E és F β-lánc közötti huroknak, (ami a 85-90 peptiddarab) mivel az konformációs átalakulás következtében (Tanford átalakulás) a központi kötőzseb felett bizonyos pH tartományban „kapuként” funkcionál [10, 14, 19]. Ez a 30


fehérjeszegmens pH=6,2 alatt fedélként az üreg fölé hajlik, megakadályozva bármilyen ligandum kötődését, ennél magasabb pH-n (illetve pH=7,1 felett) pedig „nyitott” helyzetű és a zseb hozzáférhetővé válik a hidrofób molekulák számára (III.1 Ábra). Míg a másik fő tejsavófehérjének, az alfa-laktalbuminnak pontosan meghatározott funkciója van (a laktóz szintáz szabályozófehérjéje), a béta-laktoglobulin ilyen jól definiált rendeltetését még nem ismerjük. Számos feltételezés látott már napvilágot a témában. A meglehetősen szerteágazó feladatkörrel rendelkező lipokalin fehérjecsalád tagjaként [18] hidrofób molekulák kötése és transzportálása az egyik lehetséges funkció. Sawyer és Kontopidis olyan javaslatokat is tett, hogy a BLG tejben található jelentős mennyiségének (fajtól, táplálástól és a laktáció állapotától függően a tehéntejben ~ 2-3 g/L) a fiziológiai oka is erre a feladatra vezethető vissza [20]. A szerkezeti és szekvencia hasonlósága a retinol-kötő proteinnel arra az elképzelésre vezetett, hogy az anyától az újszülött felé irányuló A-vitamin transzportban is részt vehet [21]. Perez és munkatársai szerint egy további lehetséges feladata, hogy újszülött korban közreműködik a tejben található lipidek lebontásában a pregastric lipáz enzim aktivitásának növelésével (az enzimet gátló zsírsavak eltávolításával) [22]. Egy következő hipotézis szerint, a BLG zsírsavkötő képessége növeli a fehérje proteolitikus degradációval és termikus denaturációval szembeni ellenállását, ezért e tulajdonsága egy elképzelhető szerkezetstabilizáló faktor lehet [14]. III.1.3 BLG ligandumkötő tulajdonsága A BLG komplexképző képességéről már a múlt század közepétől tudomásunk van, amikor felfedezték az SDS kötődését a fehérjéhez [23], kicsivel később pedig a retinolkötő protein (RBP) vizsgálata közben véletlenül találtak rá a BLG–A-vitamin komplexre. Később a két fehérje szerkezeti és hidrofób ligand kötési rokonságára is fény derült [24, 25]. Azóta számos egyéb hidrofób ligandummal történő komplexképzését mutatták ki, például zsírsavakkal [26-33], a ciklohexenil gyűrűt tartalmazó A-vitaminnal [30, 32, 34], aromás molekulákkal [35], porfirin [36, 37], keton-származékokkal és koleszterinnel [38, 39]. A BLG ezen ligandumkötő tulajdonságát olyan változatos technikákkal derítették fel, mint egyensúlyi dialízis, affinitás kromatográfia, elektronspin rezonancia spektroszkópia, spektrofotometria, és talán a legnépszerűbb a triptofán fluoreszcencia [5, 40]. NMR és röntgenkrisztallográfiás valamint

CD-spektroszkópiás

vizsgálatokat

is

gyakran

használnak

a

fehérje

komplexképzésenek monitorozására [7, 41]. A nagyszámú analízis azt mutatta, hogy a monomer fehérjének legalább két potenciális komplexáló helye van, ez első (központi 31


kötőhely) az említett belső hidrofób zseb, ami a β-henger belsejét jelenti, és van egy külső szintén hidrofób kötőhely, ami a β-henger és az α-hélix közötti térrészben foglal helyet [20]. Az első kötőhely pozícióját már pontosan meghatározták a fent említett módszerekkel, de a feltételezett második kötőhely helyzete eddig kielégítő kísérleti bizonyítékok hiányában bizonytalan volt. Bár egyes ligandumokra, például retinolra [42, 43], cisz-parinársavra (cPA) [44, 45] és 1-anilinonaftalén-8-szulfonátra (ANS) [44, 46] néhány tanulmány a kötőzsebbe történő kötődést javasolta [43, 45, 46], mások ugyanezekre a külső, fehérje felszínén való kötődést feltételezték [42, 44]. A BLG ligandumkötési mechanizmusa tehát még nem eléggé ismert és meglehetősen ellentmondásos. Azonban az orvosi illetve táplálkozási szempontból fontos biológiai jelentőséggel bíró molekulák, – amelyek esetleg a belső zsebbe képesek kötődni –, kötésében és transzportjában a BLG (direkt módon vagy némi módosítást követően) ígéretes hordozónak bizonyulhat. (Figyelembe kell venni azonban a BLG allergizáló hatását is, tehéntej allergia fő okozója ez a fehérje). Érdemes tehát olyan módszerek kutatása és alkalmazása, amelyek még több betekintést nyújtanak a ligandumkötésének a mechanizmusáról.

III.1.4 A cisz-Parinársav Munkánk során a BLG és egy többszörösen telítetlen zsírsav, a cisz-parinársav (cPA vagy más néven alfa-parinársav) kötődését, a kötés specifikusságát vizsgáltuk.

O 7

OH 15

13

11 9

17

III.2 Ábra cisz-parinársav

A cisz-parinársav egy természetes, növényi eredetű (Fiji szigeteki Makita fa magjában kb. 46%-ban található), 18 C-atomszámú, többszörösen telítetlen, 4 konjugált kettőskötéssel rendelkező zsírsav, ami nagyfokú telítetlensége miatt rendkívül hajlamos oxidációra. Fluoreszcens tulajdonsága miatt többnyire biomembránok vizsgálatára használják [47], mivel szerkezete nagyon hasonló a membránok kettősrétegét felépítő lipidekéhez, emlős sejtek membránjának foszfolipid kettősrétegébe [48], idegszövetbe képes beépülni [49]. Vizes 32


közegben egyáltalán nem képes fluoreszcenciára, azonban ha hidrofób környezetbe kerül (például egy fehérje lipidkötő helyére) a cPA fluoreszcenssé válik [50]. Kémiai tulajdonságainak köszönhetően egyre elterjedtebben alkalmazzák eukarióta sejtek kezdődő lipidperoxidációjának érzékeny markereként [51]. In vitro vizsgálatokban szelektív citotoxicitást mutatott humán leukémia sejtekkel szemben 5 μM vagy annál kisebb koncentrációban

[52]

illetve

rákos

glioma

sejtekkel

szemben,

a

tumorsejtek

lipidperoxidációjának előidézésével [53]. Mivel a cPA vízben alig oldódik, nemkovalens komplexként proteinekhez (hordozómolekulához) kapcsolódva megvalósulhat, hogy eljut a célsejtekhez és kifejtheti esetleges antitumor hatását.

III.1.5 Limitált proteolizis A proteázokat a biokémia számos területén használják proteinek elsődleges szekvenciájának meghatározására, enzimek aktiválására-inaktiválására valamint fehérjék teljes lebontására [54]. Ezek a reakciók általában olyan körülmények között mennek végbe, ahol a fehérjék denaturált formában vannak jelen, és ilyenkor az adott proteáz a specifitására jellemző aminosav/ak melletti peptidkötéseket hasítja. Ezzel a módszerrel megkaphatjuk a fehérjét felépítő peptiddarabokat, és tömegspektrometriás analízis után a protein elsődleges szerkezetéhez juthatunk. A denaturáló lépés azonban eleve kizárja, hogy információt kapjunk az elsődleges szerkezeten kívül egyéb magasabbrendű, pl. harmadlagos, negyedleges szerkezetekről. Amennyiben proteolízis útján szeretnénk ilyen szerkezeti információkat nyerni, a hidrolízises reakciót valamilyen módon lassítani kell, így jutunk el az ún. limitált proteolízishez. A proteolízis megállítása/befolyásolása számos módon lehetséges, ami a reakciókörülmények egyszerű változtatásait jelenti, így pl.: hőmérséklet, pH, ionerősség változtatását, vagy gyakran a vizsgálandó fehérje natív (vagy közel natív) állapotának biztosítását [54]. Végeredményben tehát a parciális hidrolízis a proteinek magasabbrendű szerkezetfelderítésének igen hatékony módszere lehet, mivel információt nyújthat az feltekeredett fehérjéken belüli egyes speciális peptidkötések helyzetéről. A biokémia és a proteomika fehérjék szerkezetfelderítésében leggyakrabban használt hidroláz enzim a tripszin (szerinproteázok csoportjába tartozik). A tripszin előnyösen olyan peptidkötést bont, melyek szomszédságában bázikus oldalláncot tartalmazó aminosav, lizin vagy arginin helyezkedik el. A hasítási reakció triptikus peptideket erdményez, és mivel a lizin és az arginin 5 és 6%-át teszi ki az emlősök fehérjéinek összes aminosav tartalmából, ez 33


azt jelenti, hogy 100 aminosavra kb. 11 triptikus peptid jut és olyan, kb. 8-10 aminosavat tartalmazó peptiddarabokat eredményez, amelyek tömegspektrometriás körülmények között is kényelmesen tanulmányozhatók (tömegük 2000 Da alatti). Ha a fehérje nincs denaturált állapotban, a proteáz általában a peptidkötéseknek csak egy részét tudja hasítani, mivel a protein ún. “mag” részében lévő peptidkötések borítottak, és a másodlagos szerkezeti egységek kevésbé hozzáférhetők az enzim számára. Első közelítésben tehát azt várnánk, hogy a tapasztalt hasítások főként a felületi peptidkötésekben következnek be, ott ahol “ki vannak téve” ill. közvetlenül érintkeznek az oldószerrel, ill. az emésztőenzimmel, ilyenek pl. a loop-ok. A fehérjék felszínén található aminosavak felderítése fontos információ lehet a proteinek funkciójának megismerésében, beleértve az enzimszubsztrát ill. fehéje-ligandum kölcsönhatások vizsgálatát is. A parciális proteolízis reakciókörülményeit mindenképen úgy kell megválasztani, hogy ne történjen meg a fehérje teljes degradációja. Számos módszert alkalmazhatunk, hogy a proteolízises reakciót megállítsuk/befagyasszuk. Az irodalom szerint az enzim:szubsztrát arányt 1/50 és 1/1000 között kell tartani, így a proteolízis csak részleges lesz, és idővel különböző peptiddarabok halmozódhatnak fel. Végrehajthatjuk a reakciót alacsony hőmérsékleten is, ill. végezhetjük az enzim optimális működésétől eltérő pH-n is, így is lassíthatjuk a reakciót. Ezeket mind különböző előkísérletekkel nekünk kell meghatározni. A legtöbb ilyen reakciót SDS-gélen követik, ami olcsó és egyszerű technika, de a tömegspektrometria is egyre elterjedtebb a limitált tripszinolízis nyomonkövetésére. Így a parciális proteolízis a fehérje felszínén lejátszódó események egyfajta monitorozása lehet pl. fehérje le- vagy feltekeredése, ill. ligandum indukált konformációváltozást is beleértve.

III.2 Célkitűzés Munkánk során célul tűztük ki a BLG és a cisz-parinársav (cPA) kötődésének tömegspektrometriás vizsgálatát. Vizsgálni kívántuk a kötődés sztöchimetriáját, valamint kompetitív komplexképzési vizsgálatok segítségével a kötés specificitását. Ehhez a különböző szénatomszámú telített és különböző számú telítetlenséget tartalmazó zsírsavakat használtunk. Terveztük továbbá a BLG limitált proteolízises vizsgálatát, hogy felderítsük, a molekula mely része vesz részt a komplexképzésben, amelyről egyelőre ellentmondásos információkkal rendelkezünk.

34


III.3 Anyagok és módszerek

III.3.1 Anyagok A kísérletekhez használt tisztított szarvasmarha BLG (A és B variánsok keveréke, 90% tisztaságú) a Sigma-Aldich Kft-től származott. Komplexképzéshez ligandumként a ciszparinársavat (9,11,13,15-cisz,transz,transz,cisz-oktadekatetraénsav; C18:4) a Calbiochem cégtől vásároltuk. Kompetitív kötődési reakciókban a következő telített és telítetlen zsírsavakat használtuk: minisztinsav (n-tetradekánsav; C14:0), palmitinsav (n-hexadekánsav; C16:0), sztearinsav (n-oktadekánsav; C18:0), olajsav (cisz-9-oktadecénsav, C18:1), linolsav (cisz,cisz-9,12-oktadecéndiénsav, C18:2), amelyek a Supelco cégtől származtak. A limitált proteolízishez használt tripszint (sequencing grade, szarvasmarha hasnyálmirigyből) a SigmaAldrich cégtől vásároltuk. Az alkalmazott oldószerek, a HPLC-tisztaságú etanol és víz, valamint az ecetsav (96%-os) szintén a Sigma-Aldrich cégtől származtak. III.3.2 A cisz-parinársav és egyéb zsírsavak kötődése béta-laktoglobulinhoz A komplexálási kísérletekhez minden esetben a BLG 5x10-5 M-os (0,915 mg/ml) vizes oldatát használtuk. A cPA-ból és a zsírsavakból 100%-os tisztaságú etanollal 2x10-3 M-os oldatokat készítettünk. Komplexképzés során a BLG oldathoz úgy adtuk hozzá a vizsgálni kívánt zsírsav oldatokat, hogy a ligandum:fehérje mólarány 10:1 legyen. Az inkubálást szobahőmérsékleten végeztük. A pH-t közvetlenül a tömegspektrometriás vizsgálatok előtt ecetsavval állítottuk be 2,5-ösre. III.3.3 Kompetitív kötődési vizsgálatok A létrehozott BLG-zsírsav komplexeket a zsírsavnak megfelelő moláris mennyiségű cPA-val inkubáltuk (cPA: zsírsav; 1:1). További kísérletekben a BLG-zsírsav komplexhez úgy adtam cPA-t hogy annak mennyisége tized része volt a zsírsav mennyiségéhez viszonyítva (zsírsav:cPA; 10:1).

35


III.3.4 Limitált tripszinolízis valamint a keletkezett m/z 5200 BLG fragmens tisztítása és komplexképzése cPA-val A BLG tripszines hidrolízisét vizes közegben, 25 °C-on, 1:100 tripszin:protein aránynál végeztük. A vizes oldat használata a pufferolt közeg helyett, valamint a hőmérséklet szobahőfokon tartása arra szolgáltak, hogy a proteolízist lassítsuk, és nagyobb intermedier proteindarabhoz/darabokhoz jussunk. Különböző időpontokban (5, 15, 30, 60, 150 perc, 24 óra) mintát vettünk, és a tripszin aktivitását a pH eltolásával (ecetsavval) ill. a hőmérséklet csökkentésével (0 ºC) blokkoltuk. A 30 perces limitált hidrolízis során keletkeztek nagyobb fragmensek (amelyek tömegét MS-el meghatároztuk), ezért ehhez az elegyhez adtam cPA-t ugyanolyan mennyiségben, mint eddig, hogy feltérképezzük, mely fragmentumok képesek a komplexkötésre. Mivel a m/z 5200 proteindarab volt képes megkötni a cPA-t, további, a korábbiakhoz hasonló kompetitív kötődés vizsgálata céljából ezt elválasztottuk az reakcióelegytől. HPLC-s elválasztás és frakciószedés helyett ultraszűrést választottuk. A 30 perces tripszinolízist követően a proteolízis ecetsavas blokkolása után az emésztményt először egy 10000 cut-off pórusátmérőjű centrifuga-membránon (Microcon YM-10) szűrtük és mostuk, hogy megszabaduljunk az el nem hidrolizált BLG-től ill. a tripszintől. A filtrátumot ezután egy másik, 3000-es cut-off pórusátmérőjű membránon (Microcon YM-3) szűrtük és mostuk, így a kisebb 3 kDa alatti peptideket elimináltuk. Az így kapott (3000 < M t <10000) tisztított mintát először ESI-MS-el vizsgáltuk (tisztaságellenőrzés, móltömeg-meghatározás), majd a cisz-parinársavval ismét elvégeztük a komplexképzést (ligand/protein 10:1 arányban).

III.3.5 Tömegspektrometriás mérések A tömegspektrometriás mérések Perkin Elmer Sciex API 2000 (Toronto, Kanada) típusú turboionspray ionforrással felszerelt hármas kvadrupól készüléken történtek. A mintákból 10-10 μl-nyit flow injection módban, víz/metanol/ecetsav (49,5/49,5/0,1) összetételű folyadék-áramba injektáltuk. A BLG-cPA illetve a BLG-zsírsav komplexeket tartalmazó mintákat közvetlenül mérés előtt ecetsavval pH=2,5-re állítottuk. Erre azért volt szükség, hogy a BLG és a komplexek többszörösen protonálódott ionjai (töltéseloszlásuk maximuma) a tömegspektrométer „tömegablakába” (m/z felső határa 1800) essenek. Ezekből a spektrumokból dekonvolúcióval kaptam móltömeg információkat, melyet a BioMultiView 1.3.1 szoftverrel végeztem el. 36


III.4 Eredmények és értelmezésük III.4.1 BLG ligandumkötő képességének vizsgálata Az elektrospray ionizációs technika kíméletes sajátsága miatt kiválóan alkalmas intakt proteinek és kismolekulák másodlagos kötőerőkkel összetartott komplexeinek direkt tömegspektrometriás vizsgálatára [1]. A kapott molekulatömegekből könnyen jutunk a komplex sztöchiometriájára vonatkozó információhoz. Munkánk során egy lipokalin fehérje, a béta-laktoglobulin (BLG) és egy többszörösen telített zsírsav, a cisz-parinársav (cPA) kötődését vizsgáltuk, hogy a protein vitatott ligandumkötésének körölményeit jobban megismerhessük. Együttműködő partnereink a BLG-cPA komplexet cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiával vizsgálták [45] különböző pH értékeken (3,0; 7,36 és 8,5) valamint ligand:protein aránynál (0,1-2,5 mólarányig). Cisz-parinársavat adva a fehérje vizes oldatához, új negatív CD csúcs jelent meg, pH 7,36 és 8,5-ön hasonlóképpen, a savas tartomány felé haladva a stabilitás azonban egyre csökkent. Ezt követően a mi feladatunk a CD spektroszkópiával észlelt komplex tömegspektrometriás elemzése volt. A kapcsolat specifikusságát is tanulmányoztuk, különböző szénatomszámú telített és telítetlen zsírsavak mellett vizsgáltuk a cPA és BLG kölcsönhatását. Az ESI-MS mérések során elsőként az intakt BLG móltömegét határoztuk meg, vizes oldatát direkt módon metanol/víz/ecetsavas folyadékáramba injektáltuk. Mivel a készülék felső tömeghatára m/z 1800, ami azt jelenti, hogy az ennél nagyobb móltömegű anyagokat csak többszörösen töltött formában láthatjuk. A 18 kDa-os BLG esetében ezt csak a minta megsavanyításával tudtuk elérni, ezért mérés előtt további ecetsavat adtunk hozzá, és a kb. 2,5-ös pH-jú mintát injektáltuk a készülékbe. A III.3a ábrán látható spektrumon a BLG többszörösen töltött, fehérjékre jellemzően statisztikus (boríték) eloszlásban keletkezett ionjait látjuk, amiből dekonvolúció után kapjuk meg a molekula valódi tömegét (III.3b Ábra). Két intenzív és két kisebb csúcsot kaptunk a spektrum rekonstrukciója után. A 18276 és 18362 Da móltömeg a BLG B és BLG A variánsnak felelnek meg, azonban két másik, kisebb intenzitású csúcs is megjelenik 18604 és 18692 Da-nál. Ezek a két BLG variáns kovalensen kötött ún. laktulóz konjugátumai, amit az irodalomból ismert Maillard reakció eredményez [55]. Morgan és Leonil szerint ez főként a BLG 47-es pozíciójában található lizin ε-aminocsoportja és a laktóz között végbemenő reakció eredménye, amely főként a tej hőkezelésekor játszódik le [56, 57]. 37


[M+15H]15+ 80000

[M+16H]16+ 1225.2

70000

1148.8

[M+14H]14+ 100000

BLG A BLG B 18362 18276

1312.5

80000

intenzitás, cps

Intenzitás, cps

[M+17H]17+ 60000

[M+13H]13+ 1081.2

50000 1413.2

40000

[M+12H]12+ 30000

[M+18H]18+

60000

1530.5

20000

* B+laktulóz * * A+laktulóz

40000

[M+11H]11+

1021.5

20000

1670.3

A+laktulóz B+laktulóz 18604

10000

0 18000

0 1000

1200

1400

1600

1800

18500

18692

19000

19500

Molekulatömeg, Da

m/z, amu

III.3 Ábra a) BLG (A és B variáns keveréke) ESI-MS spektruma, b) dekonvolúció után kapott tömegspektruma

A BLG és a cPA komplex tömegspektrometriás mérése során két ellentétes hatással kellett számolnunk: egyrészt meg kellett savanyítani a mintát, hogy az elektrospray körülmények között látható legyen, másrészt ügyelni kellett arra, hogy a túl savas közeg ne vezessen a komplex széteséséhez. A fehérje pH-függő konformációs átrendeződése (Tanford átalakulás) szintén ismeretes a szakirodalomból [19]. Az EF loop (85-90) mozgékonysága következtében pH=6,2 alatt a kötőzseb fölé hajlik, megakadályozva hogy oda ligandum kötődhessen. Lúgosabb pH tartományban nyitott helyzetet vesz fel, és hozzáférhetővé válik hidrofób kismolekulák számára. Ragona és munkatársai szerint a BLG ligandkötő tulajdonságát alapvetően ennek a fehérjeszakasznak a konformációváltozása, nyitott-zárt állapota befolyásolja leginkább, amiben a 89-es glutaminsavnak, ill. annak protonáltdeprotonált formájának kitüntetett szerepe van [41]. A BLG zsírsavkötő képességének pH érzékenysége más kísérletekben is azt mutatta, hogy a pH 5,5–8,5 tartományon kívül sokkal gyengébb kölcsönhatásokra képes [7, 55]. A jelenség valószínűleg elektrosztatikus kölcsönhatásokra (Coulomb-taszítás) vezethető vissza, a növekvő pH-n egyre negatívabb töltésű BLG a szintén negatív töltésű zsírsavmolekulákkal szemben kevésbé vonzó host/gazda molekula. Ezért úgy jártunk el, hogy a fehérjét a liganddal semleges pH-n kevertük össze különböző mólarányokban, és savval közvetlenül csak az ionizáció előtt érintkezhetett a minta. Így még kb. pH=2,5-nál is kimutatható volt a komplex, ahogy azt a III.4 ábrán található dekonvolúció után kapott tömegspektrumon látjuk.

38

III. Béta-laktoglobulin nemkovalens komplexképzésének és ligandum-kötőhelyének vizsgálata 7000

6000

intensity, cps

5000

BLG A 50000

**

4000

18362

BLG B 18275

*

3000

BLG A+cPA 18638

2000

40000 1000

BLG B+cPA 18551

intenzitás, cps

0

18500 18550 18600 18650 18700 18750 18800

30000

m/z, amu

20000

A+cPA 18638 B+cPA 18551 * **

10000

0 18000

18500


19000

Molekulatömeg, Da

III.4 Ábra BLG-cPA komplex dekonvolúció után kapott tömegspektruma. B:BLGB, A: BLGA variánsok

A BLG mind a két variánsa mutatta a komplexképző tulajdonságot. Két új csúcs jelent meg a dekonvolúciós spektrumon 18551 és 18638 Da-nál egy-egy cPa egységgel (276 Da) nagyobb tömegnél, jelezve a nemkovalens komplexek jelenlétét. Intenzitásuk arányát tekintve az adduktok különböznek a natív variánsok intenzitásarányától, az A variáns javára. A cPA felesleg ellenére (protein:ligandum arány 1:10 volt) nem voltak további cPA tömegegységgel növelt addukt csúcsok a spektrumban, ami azt jelenti, hogy a sztöchiometriát tekintve 1:1 arányban reagáltak egymással az anyagok, egy BLG molekulához egy cPA kötődött. A tömegspektrometriás vizsgálatok továbbá azt is mutatták, hogy ilyen savas pH-n már csak mintegy 10 %-ban van jelen a komplex. Az adduktok ilyen alacsony intenzitásának többféle oka lehet. Számos tanulmány mutatta ki hogy a BLG az említett pH=5,5-8,5 intervallumon kívüli komplexképző sajátsága jóval gyengébb, mint a tartományon belüli [13]. Bár a fehérje szerkezete még kb. 2-es pH-ig intakt marad, a töltésében bekövetkező változások valószínűleg nagymértékben csökkentik a ligandumok iránti affinitását. A nagyüzemi tejfeldolgozáskor bekövetkező glikozilációs reakciók is megváltoztatják a molekula konformációját, ami a töltéseloszlás és ezen keresztül a komplexképző tulajdonság megváltozását eredményezi. Másrészről az említett Tanford átmenet miatt savas pH-n a ligandkötés lecsökken.

III.4.2 Kompetitív kötődési vizsgálatok Annak érdekében, hogy meggyőződjünk a BLG és a cisz-parinársav kölcsönhatásának specificitásáról, kompetitív kötődési vizsgálatokat végeztünk. Jól ismert, és széleskörűen 39


tanulmányozott, hogy a BLG nagy affinitással köt számos hidrofób tulajdonságú kismolekulát pl. zsírsavakat. Ezért különböző szénatomszámú (C14, C16, C18) telített és telítetlen (egy és két kettőskötést tartalmazó) zsírsavat használtunk, hogy összevessük a BLG ezen molekulák felé irányuló komplexkötési erősségét. A kísérleteket a cPA-s komplexálási körülményeknek megfelelően hajtottuk végre (ugyanolyan pH-n és ligand:protein aránynál), a zsírsavakat először külön-külön vittük kölcsönhatásba a proteinnel. Ebben a kísérletsorozatban a zsírsavak a cPA-hoz hasonlóan 1:1 arányban kötődtek a proteinhez, azonban kizárólag a BLG A variánshoz történt ez a kötődés, BLG B-vel alkotott komplexeket nem detektáltunk. A tetradekánsav (C14:0) BLG-hez történő kötődése a palmitinsavhoz (C16:0) és sztearinsavhoz (C18:0) képest gyengébbnek bizonyult. Az III.5a és a III.6a Ábra BLG palmitinsavval és sztearinsavval alkotott komplexének dekonvolúcó után kapott spektrumát mutatja be. Ilyen körülmények között kis intenzitású és kizárólag az A variánssal létesített komplexek észlelhetők a spektrumokon.

20000

20000

18000

18000

intensity, cps

a)

140000

14000

BLG A 18360

BLG B

120000

b)

**

12000 10000

*

8000

18275

140000

BLG A

BLG B 18360 18275

BLG A+C16

Intenzitás, cps

16000

16000

120000 18615

14000

**

12000

*

10000

BLG B+cPA

4000

Intenzitás, cps

Intenzitás, cps

100000

4000 2000

80000

0 18500

18550

18600

18650

18700

18750

18800

mass, amu

60000


40000

0 18000

0 18500

80000

18550

18600

18650

18700

18750

18800

Molekulatömeg, Da

60000

0 18000

19000


A+cPa 18638 B+cPA 18554 * **

20000

18500

18554

2000

40000

BLG A+C16 18615 ** *

20000

18638

C16:cPA 8000 10:16000

6000

100000

BLG A+cPA

18500

Molekulatömeg, Da

19000

Molekulatömeg, Da

III. 5 Ábra a) BLG:C16 komplex komplex dekonvolúció után kapott tömegspektruma cPA hozzáadás előtt, b) a cPA hozzáadás után. B:BLGB, A: BLGA variánsok 20000 18000

BLG A

**

18000

BLG B 18360

16000

140000

14000

intensity, cps

18275 140000

*

12000

BLG A+C18

Intenzitás, cps

18550

18600

18650

18700

18750

18800

mass, amu

60000

20000 0 18000

A+C18 18646 ** *

18500

18637

100000

18646

80000

40000

BLG A+cPA

8000

4000

2000 0 18500

10000

6000

4000

100000

12000

C18:cPA 10:1

18275

**

*

14000

BLG B 18361

8000 6000

120000

16000

BLG A

120000

10000

Intenzitás, cps

160000

b)

20000

intensity, cps

a)


0 18500

BLG B+cPA 18552

18550

18600

80000

18650

18700

m/z, amu

60000

40000

20000

0 18000

19000

2000


A+cPA 18637 B+cPA 18552 * **

18500

19000

Molekulatömeg, Da

Molekulatömeg, Da

III. 6 Ábra a) BLG:C18 komplex dekonvolúció után kapott tömegspektruma a cPA hozzáadás előtt, b) BLG:C18 komplex a cPA hozzáadás után. B:BLGB, A: BLGA variánsok

40

18750

18800


A telítetlen kötések komplexképzést befolyásoló hatását is megvizsgáltuk, egy ill. két kettőskötést tartalmazó zsírsavat, olajsavat (C18:1) és

linolsavat (C18:2) használva

ligandumként. Ezekből a kísérletekből az derült ki, hogy a telítetlenség jelenléte a BLG ligandumkötési hajlamát kismértékben növeli. Kompetitív kötődései kísérletekben először a zsírsavval egyenlő moláris mennyiségű cPa-t adtunk a BLG-zsírsav komplexekhez. Ekkor minden esetben kizárólag BLG-cPA komplexeket detektáltunk, ami egyértelműen arra utal, hogy a BLG affinitása a cPA felé erősebb, mint a többi zsírsav esetében. Abban az esetben, amikor a zsírsav tízszeres mennyiségben volt jelen a cPA-hoz képest, ismét ugyanerre az eredményre jutottunk, ami a III.5b és a III.6b dekonvolúció után kapott spektrumán jól látható. A BLG cPA felé megnövekedett affinitása számos tényezőnek tudható be; a ligandum tartalmazza mind a zsírsavakra mind az A-vitaminra jellemző szerkezeti tulajdonságokat, fontos funkcionális részleteket. Ilyen a láncvégi karboxilcsoport, aminek a kötődésben betöltött jelentőségéről már beszámoltak mások is [21], illetve a többszörösen telítetlen láncszerkezet, ami az A-vitaminhoz teszi hasonlatossá a cPA-t, amely molekula felé a BLG ismerten kiemelt affinitással rendelkezik. III.4.3 A BLG ligandumkötőhelyének tanulmányozása limitált tripszinolízissel A BLG-cPA komplex kimutatása és specifikusságának vizsgálata után célul tűztük ki a cisz-parinársav kötődésének részletesebb tanulmányozását, ill. a kötődés helyének pontosabb meghatározását limitált tripszinolízissel. Eredményeinket szerettük volna összehasonlítani az irodalomban fellelhető, más technikákkal (röntgenkrisztallográfia, NMR) meghatározott kötődési pozíciókra vonatkozó információkkal. Ehhez a parciális hidrolízis reakciókörülményeit úgy kellett optimálni, hogy a szubsztrát BLG molekulánk ne szenvedjen teljes degradálódást. Esetünkben arra voltunk kíváncsiak, hogy ezzel a módszerrel rátalálunk-e a BLG-nek egy olyan nagyobb fehérjerészletére, ami a ligandumkötő helyet tartalmazva képes komplexképzésre. A részleges tripszinolízist vizes közegben (semleges pH) 1:100 tripszin:BLG arányra optimáltuk, a hidrolízist ecetsav hozzáadásával és fagyasztással blokkoltuk. A reakció időbeli lefolyását ESI-MS-rendszeren követtük, aminek eredményét a III.7 Ábra szemlélteti. A spektrumokon láthatjuk a reakcióban 5, 30, 150 perc és 24 óra után keletkezett termékeket.

41


120000

BLG triptikus peptidjei

a


BLG többszörösen töltött ionjai

100000

b

500000

intensity, cps

Intenzitás, cps

400000 80000

60000

5+ 1041.2 7+ 650.3

6+ 867.8

100000

20000

0 400

600

800

1000

1200

1400

0 200

1600

400

600

800

m/z

800000


200000

1041.2

40000

300000


1000

1200

1400

1600

m/z


c 300000

d

700000 250000

500000

Intenzitás, cps

Intenzitás, cps

600000


400000 300000

5+ 1041.2

200000


150000

100000

100000 0 200

200000

50000

400

600

800

1000

1200

1400

0 200

1600

m/z

400

600

800

1000

1200

1400

1600

m/z

III.7 Ábra A BLG limitált tripszinolíziséből származó termékek ESI-MS spektrumai (a) 5 perces-, (b) 30 perces-, (c) 150 perces és (d) 24 órás reakcióidő után

A limitált tripszinolízis során már az első 5 percben megjelentek kisebb triptikus fragmensek, bár még az ép fehérje dominál a reakcióelegyben. Időben azonban jól követhető a protein fogyása, ezzel párhuzamosan több nagyobb móltömegű fragmens is megjelenik. 24 óra múlva már a kisméretű triptikus peptidek dominálnak a spektrumban. 30 perc után néhány nagyobb intenzitású intermedier fragmens tűnik fel, dekonvolúció után a legmarkánsabb két fragmens tömege 2708 és 5200 Da. Ehhez a reakcióelegyhez cPA-t adtunk, hogy e két fehérjefragmens ligandkötő képességet teszteljük. A ligandum hozzáadása az M=5200 fragmentum parinársav tömegével megnövekedett intenzív ionja tűnt fel a dekonvolúciós spektrumon, ami a cPA kötődését jelenti, ahogy azt a III.8 ábrán látjuk.

42


350000

a

5201.0

250000

5201.0

b

300000 200000

Intenzitás, cps

Intenzitás, cps

250000

200000

150000

150000

100000

+cPA

100000

5477.0 5143.0

50000

5143.0

50000

0

0 4600

4800

5000

5200

5400

5600

5800

6000

4600

Molekulatömeg, Da

4800

5000

5200

5400

5600

5800

6000

Molekulatömeg, Da

III.8 Ábra A BLG 30 perces limitált tripszinolízisének dekonvolóció után kapott ESI-MS spektruma a) ligandum nélkül, b) cPA hozzáadása után

Ezen fragmens membránszűréssel történő izolálása után ismét elvégeztük a komplexképző kísérleteket parinársavval és zsírsavakkal. Palmitinsav esetében nagyon gyenge intenzitású komplex képződését tapasztaltuk. Leszorításos, kompetitív kötődési vizsgálatokat is végrehajtottunk, palmitinsavat és sztearinsavat is adtunk a tisztított peptidfragmenshez, majd ezután raktuk hozzá a cPA-t (a korábbi kísérletekben leírt mennyiségekkel dolgozva, először 1:1, majd 1:10 volt a cPA:zsírsav mólaránya). Minden esetben kizárólag a cPA tömegével (M=276 Da) megnövekedett ion (M=5477 Da) volt detektálható, ami azt mutatja, hogy a cPA specifikusan, 1:1 arányban kötődik a BLG molekularészletéhez. Eredményeinkből azt a következtetést vontuk le, hogy az 5200-as fehérjefragmens minden bizonnyal tartalmazza a cPA kötődésért felelős molekularészletet. Ezután a BLG szekvenciájából egy számítógépes értékelőprogrammal (GPMAW) sikerült azonosítani a kérdéses triptikus intermediert, ami a (41-70) illetve a (149-162) peptiddarabok diszulfid-híddal összekötött BLG fehérjeszakaszai (Lásd III.9 ábrán a besatírozott szekvencia). A kérdéses fragmens kitüntetett stabilitását már Surroca és munkatársai is kimutatták, akik a BLG termikus hatásra bekövetkező aggregációját tanulmányozták SDS-PAGE és MALDI TOF MS technikákkal [58].

43


[1]

[2] 10

20

Leu-Ile-Val-Thr-Gln-Thr-Met-Lys-Gly-Leu-Asp-Ile-Gln-Lys-Val-Ala-Gly-Thr-Trp-Tyr [3] 30

40

Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile-Ser-Leu-Leu-Asp-Ala-Gln-Ser-Ala-Pro-Leu-Arg[4] 50

60

Val-Tyr-Val-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Thr-Pro-Glu-Gly-Asp-Leu-Glu-Ile-Leu-Leu-Gln-Lys[5] Gly

[6]

[7]

[8]

70

80

Trp-Glu-Asn-Asp-Glu-Cys-Ala-Gln-Lys- Lys- Ile-Ile-Ala-Glu-Lys-Thr-Lys-Ile-Pro- Ala[9]

[10] 90

[11] 100

Val-Phe-Lys-Ile-Asp-Ala-Leu-Asn-Glu-Asn-Lys-Val-Leu-Val-Leu-Asp-Thr-Asp-Tyr-Lys[12] 110

Ala

120

Lys-Tyr-Leu-Leu-Phe-Cys-Met-Glu-Asn-Ser-Ala-Glu-Pro-Glu-Gln-Ser-Leu-Val-Cys-Gln[13]

[14] 130

[15] 140

Cys-Leu-Val-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Asp-Asp-Glu-Ala-Leu-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ala-Leu[16]

[17] 150

160

Lys-Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro-Thr-Gln-Leu-Glu-Glu-Gln-Cys[18]

His-Ile

III.9 Ábra BLG A és B aminosavszekvenciája. A nyilak a tripszin elméleti hasítási pozícióit jelölik, a besatírozott, szürke részek a [41-70]S-S[149-162]-es fragmenst jelzik (a BLG A és B-re vonatkozó szekvenciainformációt lásd a szövegben)

Látható, hogy a fragmens szerkezete csupán egy aminosavban tér el a BLG két variánsában – a 64-es pozícióban az A variánsban Asp, a B-ben Gly aminosav van –, mégis a B variáns 5144 Da-nál meglehetősen gyenge intenzitással detektálható. Ez jó egyezést mutat a komplexképzési reakciókban megfigyeltekkel, ahol minden esetben az A variánsnál tapasztaltunk nagyobb ligandkötési affinitást. Úgy tűnik, hogy egy aminosav eltérés a variánsok konformációjában és komplexálási tulajdonságaiban is különbségeket indukál, továbbá a tripszinnel szemben is eltérő viselkedést mutat. Ráadásul a fragmensünk tartalmazza azt a 60 és 69-es pozícióban helyezkedő lizineket amelyeknek szintén lényeges szerepet tulajdonítanak, mivel a ligandumok/zsírsavak karboxilcsoportjával H-kötést képesek kialakítani [13].

44


Ha figyelembe vesszük a BLG alaposan tanulmányozott és viszonylag jól ismert másodlagos és harmadlagos szerkezeti elemeit (nyolc antiparalel β-lemez által formált βhenger, egy hárommenetes α-hélix és egy kilencedik β-lánc), akkor a kapott [41-70]S-S[149162] fragmentum a β-lemezekből a B és D egy részét, a teljes C lemezt és az I-nek szintén egy részét tartalmazza. Röntgenkrisztallográfiás mérések szerint a 66 és 160-os Cys-ek között kialakult diszulfidhíd a molekula felszínén [14], a központi hidrofób kötőhely bejáratához közel található, ami az intermedierünk komplexképző affinitásával szintén összeegyeztethető. A közelmúltban Dong és munkatársai a BLG két lehetséges kötőhelyéhez (egyik a központi hidrofób zseb, másik egy szintén hidrofób felszíni „hasadék”) történő kapcsolódást vizsgálta a lokális polaritás tanulmányozásával (N-terminális fluoreszcens jelölést használva) [59], és a következő konklúzióra jutott: közel semleges pH-n a semleges és a hidrofób ligandumok kötődését többnyire a hidrofób kölcsönhatások befolyásolják és a kötőzsebbe történő kötődés a kedvezményezett. 6,2-es pH alatt a kötőzseb az EF loop zárt állása miatt hozzáférhetetlen, és a ligandumok a külső kötőhelyhez kapcsolódnak. Kísérleteik után azt is feltételezték, hogy a BLG-nek a külső hidrofób kötőhelye nem egy jól definiáltan elkülönülő molekularészlet (mint a központi hidrofób zseb), szerkezetét inkább a hidrofób oldalláncok ligand által indukált elrendeződése eredményezi. A töltéssel rendelkező ligandumok kötődése a BLG-hez komplex folyamat, mert ezek kapcsolódását a hidrofób és az elektrosztatikus kölcsönhatások egyaránt meghatározzák [60]. Összességében ugyanannak a molekulának a belső zsebbe vagy a külső kötőhelyre történő kötődését egyrészt a kísérleti körülményektől függően a loop nyitott/zárt állása, másrészt a kölcsönhatás jellege (hidrofób affinitás vagy elektrosztatikus kölcsönhatás) határozza meg. Mindezek tükrében feltételezhetjük, hogy esetünkben a tömegspektrometriás körülményekhez szükséges savas pH miatt, a cPA a BLG külső hidrofób kötőhelyéhez kapcsolódhat. A parciális proteolízis során kapott fehérjedarab azonosított szerkezete [4170]S-S[149-162] tartalmazza egyrészt a feltételezett külső kötőhelyet, másrészről viszont a 60 és 69-es lizineket is, amelyeknek szintén kitüntetett szerepet tulajdonítanak a zsírsavak kötésében. III. 5 A III. fejezet összefoglalása

Munkánk során a BLG és a cisz-parinársav specifikus, 1:1 sztöchiometriájú kötődését mutattuk ki 2,5-ös pH-n, ESI-MS módszerrel. A kötés specificitását kompetitív kötődési 45


kísérletekkel igazoltuk, amelyekben a különböző szénatomszámú, telített és telítetlen zsírsavak jelenléte mellett vizsgáltuk a BLG-cPA komplexet. A kapott eredményekből megállapíthatjuk, hogy a BLG komplexképző képességét több faktor határozza meg, amelyek közül a ligandum mérete, valamint telítetlenségeinek száma alapvetően befolyásoló tényezők. A legintenzívebb komplexképzést a 18 szénatomszámú zsírsav ligandumok esetében tapasztaltuk. Egy másik fontos tényező a kötődési folyamatban a telítetlenség foka: a zsírsavak telítetlenségének növekedése a komplexképződést kismértékben, de növelte, azonban a legintenzívebb komplexeket minden esetben a BLG-cPA eredményezte. Valószínűsíthető, hogy a cPA megfelelő mérete, láncvégi karboxilcsoportja, valamint konjugált kettőskötés rendszere a felelős a BLG-hez történő kiemelkedő kötődési tulajdonságáért.

Limitált tripszinolízis során a molekulának olyan részletéhez jutottunk,

amely közvetlenül részt vesz a komplexképzésben. A kapott fehérje fragmentum szerkezetét azonosítottuk; ez a diszulfidhíddal összekötött [41-70]S-S[149-162] fragmens az intakt molekulához hasonlóan komplexálta a cPA-t.

III. 6 Referenciák a III. fejezethez 1. 2.

3. 4. 5. 6.

7. 8.

9.

10. 11.

12.

Loo, J.A., Electrospray ionization mass spectrometry: a technology for studying noncovalent macromolecular complexes. International Journal of Mass Spectrometry, 2000. 200(1-3): p. 175-186. Pramanik, B.N., P.L. Bartner, U.A. Mirza, Y.H. Liu and A.K. Ganguly, Electrospray ionization mass spectrometry for the study of non-covalent complexes: an emerging technology. J. Mass Spectrom., 1998. 33(10): p. 911-920. Tilley, J.M.A., The chemical and physical properties of bovine beta-lactoglobulin. Diary Sci. Abstr., 1960. 22: p. 111-125. Kinsella, J.L. and D.M. Whitehead, Protein in whey: Chemical, physical, and functional properties. Adv. Food and Nutrition Res., 1989. 33: p. 343-438. Sawyer, L., S. Brownlow, I. Polikarpov and S.Y. Wu, beta-lactoglobulin: Structural studies, biological clues. Int. Dairy J., 1998. 8(2): p. 65-72. Papiz, M.Z., L. Sawyer, E.E. Eliopoulos, A.C.T. North, J.B.C. Findlay, R. Sivaprasadarao, T.A. Jones, M.E. Newcomer and P.J. Kraulis, The structure of b-lactoglobulin and its similarity to plasma retinolbinding protein. Nature, 1986. 324(6095): p. 383-385. Sawyer, L. and G. Kontopidis, The core lipocalin, b-lactoglobulin. Biochim. Biophys. Acta, 2000. 1482(1-2): p. 136-148. Godovac-Zimmerman, J., I. Krause, M. Baranyai, S. Fischer-Frühholz, J. Juszczak, G. Erhardt, J. Buchberger and H. Klostermeyer, Isolation and rapid sequence characterization of two novel bovine beta-lactoglobulins I and J. J. Protein Chem., 1996. 15(8): p. 743-750. Godovac-Zimmermann, J., A. Conti, M. Sheil and L. Napolitano, Covalent structure of the minor monomeric beta-lactoglobulin-II component from donkey milk. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1990. 371(9): p. 871-879. Qin, B.Y., M.C. Bewley, L.K. Creamer, H.M. Baker, E.N. Baker and G.B. Jameson, Structural basis of the Tranford trasition of bovine b-Lactoglobulin. Biochemistry, 1998. 37(40): p. 14014-14023. Preaux, G. and R. Lontie, Revised numbering of the free cysteine residue and of the disulfide bridges in the sequence of beta-lactoglobulin A and B. Archives Internationales De Physiologie Et De Biochimie, 1972. 80(5): p. 980-981. Pervaiz, S. and K. Brew, Homology of b-Lactoglobulin, serum retinol -binding protein, and HC. Science, 1985. 228(4697): p. 335-337.

46


13. 14.

15. 16. 17.

18. 19. 20. 21. 22.

23. 24. 25. 26. 27.

28. 29.

30. 31. 32. 33. 34.

35. 36. 37. 38. 39.

Qin, B.Y., L.K. Creamer, E.N. Baker and G.B. Jameson, 12-Bromododecanoic acid binds inside the calyx of bovine -lactoglobulin. FEBS Lett., 1998. 438(3): p. 272-278. Brownlow, S., J.H.M. Cabral, R. Cooper, D.R. Flower, S.J. Yewdall, I. Polikarpov, A.C.T. North and L. Sawyer, Bovine beta-lactoglobulin at 1.8 angstrom resolution - Still an enigmatic lipocalin. Structure, 1997. 5(4): p. 481-495. Fogolari, F., L. Ragona, L. Zetta, S. Romagnoli, K.G. De Kruif and H. Molinari, Monomeric bovine beta-lactoglobulin adopts a beta-barrel fold at pH 2. FEBS Lett., 1998. 436(2): p. 149-154. Kuwata, K., M. Hoshino, V. Forge, S. Era, C.A. Batt and Y. Goto, Solution structure and dynamics of bovine beta-lactoglobulin A. Protein Sci., 1999. 8(11): p. 2541-2545. Qin, B.Y., M.C. Bewley, L.K. Creamer, E.N. Baker and G.B. Jameson, Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Sci., 1999. 8(1): p. 73-83. Flower, D.R., A.C.T. North and C.E. Sansom, The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim. Biophys. Acta, 2000. 1482(1-2): p. 9-24. Tanford, C., L.G. Bunville and Y. Nozaki, The reversible transformation of b-lactoglobulin at pH 7.5. J. Am. Chem. Soc., 1959. 81(15): p. 4032–4036. Kontopidis, G., C. Holt and L. Sawyer, Invited Review: beta-lactoglobulin: Binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science, 2004. 87(4): p. 785-796. Kontopidis, G., C. Holt and L. Sawyer, The Ligand-binding Site of Bovine b-Lactoglobulin: Evidence for a Function. J. Mol. Biol., 2002. 318(4): p. 1043-1055. Perez, M.D., L. Sanchez, P. Aranda, J.M. Ena, R. Oria and M. Calvo, Effect of b-lactoglobulin on the activity of pregastric lipase. A possible role for this protein in ruminant milk. Biochim. Biophys. Acta, 1991. 1123(2): p. 151-155. McMeekin, T.L., B.D. Polis, E.S. Della-Monica and J.H. Custer, A crystallization complex of blactoglobulin with dodecyl sulphate. J. Am. Chem. Soc., 1949. 71: p. 3606–3609. Wishnia, A. and T.W. Pinder, Hydrophobic interactions in proteins. The alkane binding site of âlactoglobulins A and B. Biochemistry, 1966. 5: p. 1534–1542. Lovrien, R. and W.F. Anderson, Resolution of binding sites in b-lactoglobulin. Arch. Biochem. Biophys., 1969. 131: p. 139–144. Jones, M.N. and A. Wilkinson, The interaction between Beta-lactoglobulin and sodium N-dodecyl sulphate. Biochem. J., 1976. 153(3): p. 713-718. Pérez, M.D., C. Díaz de Villegas, L. Sánchez, P. Aranda, J.M. Ena and M. Calvo, Interaction of fatty acids with beta-lactoglobulin and albumin from ruminant milk. J. Biochem., 1989. 106(6): p. 1094– 1097. Frapin, D., E. Dufour and T. Haertle, Pobing the fatty acid binding site of beta-lactoglobulins. J. Protein Chem., 1993. 12(4): p. 443-449. Pérez, M.D., P. Puyol, J.M. Ena and M. Calvo, Comparison of the ability to bind lipids of betalactoglobulin and serum albumin of milk from ruminant and non-ruminant species. J. Dairy Res., 1993. 60(1): p. 55–63. Creamer, L.K., Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine beta-lactoglobulin. Biochemistry, 1995. 34(21): p. 7170–7176. Wu, S.Y., M.D. Perez, P. Puyol and L. Sawyer, beta-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity. J. Biol. Chem., 1999. 274(1): p. 170-174. Narayan, M. and L.J. Berliner, Fatty acids and retinoids bind independently and simultaneously to betalactoglobulin. Biochemistry, 1997. 36(7): p. 1906–1911. Narayan, M. and L.J. Berliner, Mapping fatty acid binding to beta-lactoglobulin: Ligand binding is restricted by modification of Cys 121. Protein Sci., 1998. 7(1): p. 150–157. Puyol, P., M.D. Perez, J.M. Ena and M. Calvo, Interaction of Bovine -Lactoglobulin and Other Bovine and Human Whey Proteins with Retinol and Fatty Acids. Agricult. Biol. Chem., 1991. 55(10): p. 2515– 2520. Dufour, E., P. Roger and T. Haertlé, Binding of benzo(a)pyrene, ellipticine, and cis-parinaric acid to beta-lactoglobulin - influence of protein modifications. J. Protein Chem., 1992. 11(6): p. 645-652. Dufour, E., M.C. Marden and T. Haertlé, Beta-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin-IX at 2 different binding-sites. FEBS Lett., 1990. 277(1-2): p. 223–226. Marden, M.C., E. Dufour, P. Christova, Y. Huang, E. Leclerc-L'Hostis and T. Haertlé, Binding of hemeCO to bovine and porcine beta-lactoglobulins. Arch. Biochem. Biophys., 1994. 311(2): p. 258–262. Wang, Q.W., J.C. Allen and H.E. Swaisgood, Binding of vitamin D and cholesterol to betalactoglobulin. J. Diary Sci., 1997. 80(6): p. 1054-1059. Jameson, G.B., J.J. Adams and L.K. Creamer, Flexibility, functionality and hydrophobicity of bovine beta-lactoglobulin. Int. Dairy Journal, 2002. 12(4): p. 319-329.

47


40. 41.

42.

43. 44.

45.

46.

47.

48. 49.

50.

51.

52. 53. 54. 55. 56.

57.

58.

59.

60.

Sawyer, L., b-Lactoglobulin, in Advanced Dairy Chemistry I, Kluwer, Editor. 2003, P. F. Fox and P. McSweeney: Amsterdam. p. 319–386. Ragona, L., F. Fogolari, M. Catalano, R. Ugolini, L. Zetta and H. Molinari, EF loop conformational change triggers ligand binding in beta-lactoglobulins. Journal of Biological Chemistry, 2003. 278(40): p. 38840-38846. Lange, D.C., R. Kothari, R.C. Patel and S.C. Patel, Retinol and retinoic acid bind to a surface cleft in bovine beta-lactoglobulin: a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer. Biophysical Chemistry, 1998. 74(1): p. 45-51. Cho, Y.J., C.A. Batt and L. Sawyer, Probing the retinol-binding site of bovine beta-lactoglobulin. J. Biol. Chem., 1994. 269(15): p. 11102-11107. Yang, J., J.R. Powers, S. Clark, A.K. Dunker and B.G. Swanson, Hydrophobic probe binding of betalactoglobulin in the native and molten globule state induced by high pressure as affected by pH, KlO(3) and N-ethylmaleimide. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002. 50(18): p. 5207-5214. Zsila, F., T. Imre, P.T. Szabo, Z. Bikadi and M. Simonyi, Induced chirality upon binding of cisparinaric acid to bovine beta-lactoglobulin: spectroscopic characterization of the complex. FEBS Lett., 2002. 520(1-3): p. 81-87. Collini, M., L. D'Alfonso, H. Molinari, L. Ragona, M. Catalano and G. Baldini, Competitive binding of fatty acids and the fluorescent probe 1-8-anilinonaphthalene sulfonate to bovine beta-lactoglobulin. Protein Science, 2003. 12(8): p. 1596-1603. Sklar, L.A., B.S. Hudson and R.D. Simoni, Conjugated Polyene Fatty-Acids as Membrane Probes Preliminary Characterization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1975. 72(5): p. 1649-1653. Rintoul, D.A. and R.D. Simoni, Incorporation of a Naturally Occurring Fluorescent Fatty-Acid into Lipids of Cultured Mammalian-Cells. Journal of Biological Chemistry, 1977. 252(22): p. 7916-7918. Harris, W.E. and W.L. Stahl, Incorporation of Cis-Parinaric Acid, a Fluorescent Fatty-Acid, into Synaptosomal Phospholipids by an Acyl-Coa Acyltransferase. Biochimica Et Biophysica Acta, 1983. 736(1): p. 79-91. Palmer, C.N.A. and C.R. Wolf, cis-Parinaric acid is a ligand for the human peroxisome proliferator activated receptor : development of a novel spectrophotometric assay for the discovery of PPAR ligands. FEBS Lett., 1998. 431(3): p. 476-480. Drummen, G.P.C., J.A.F. Op den Kamp and J.A. Post, Validation of the peroxidative indicators, cisparinaric acid and parinaroyl-phospholipids, in a model system and cultured cardiac myocytes. Biochim. Biophys. Acta, 1999. 1436(3): p. 370-382. Cornelius, A.S., N.R. Yerram, A. Kratz D and A.A. Spector, Cytotoxic effect of cis-parinaric acid in cultured malignant cells. Cancer Res., 1991. 51(22): p. 6025-6030. Traynelis, V.C., T.C. Ryken and A.S. Cornelius, Cytotoxicity of cis-parinaric acid in cultured malignant gliomas. Neurosurgery, 1995. 37(3): p. 484-489. Hubbard, S.J., The structural aspects of limited proteolysis of native proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1998. 1382(2): p. 191-206. Pérez, M.D. and M. Calvo, Interaction of beta-lactoglobulin with retinol and fatty-acids and its role as a possible biological function for this protein. J. Dairy Sci., 1995. 78(5): p. 978-988. Leonil, J., D. Molle, J. Fauquant, J.L. Maubois, R.J. Pearce and S. Bouhallab, Characterization by ionization mass spectrometry of lactosyl beta-lactoglobulin conjugates formed during heat treatment of milk and whey and identification of one lactose-binding site. J. Dairy Sci., 1997. 80(10): p. 2270-2281. Morgan, F., S. Bouhallab, D. Molle, G. Henry, J.L. Maubois and J. Leonil, Lactolation of betalactoglobulin monitored by electrospray ionisation mass spectrometry. Int. Diary J., 1998. 8(2): p. 9598. Surroca, Y., J. Haverkamp and A.J.R. Heck, Towards the understanding of molecular mechanism in the early stages of heat-induced aggregation of b-lactoglobulin AB. J. Chromatogr. A, 2002. 970(1-2): p. 275-285. Dong, S.Y., Z.W. Zhao and H.M. Ma, Characterization of local polarity and hydrophobic binding sites of beta-lactoglobulin by using N-terminal specific fluorescence labeling. Journal of Proteome Research, 2006. 5(1): p. 26-31. Fogolari, F., L. Ragona, S. Licciardi, S. Romagnoli, R. Michelutti, R. Ugolini and H. Molinari, Electrostatic properties of bovine beta-lactoglobulin. Proteins-Structure Function and Genetics, 2000. 39(4): p. 317-330.

48

IV. A humán szérum alfa-1-savas glikoprotein (AGP) tömegspektrometriás vizsgálata

IV. A humán szérum alfa-1-savas glikoprotein (AGP) tömegspektrometriás vizsgálata IV.1 Irodalmi háttér

IV.1.1 Glikoproteinek A gének által kódolt fehérjék a fehérjeszintézist követően számos szerkezeti változáson

mehetnek

keresztül,

amelyeket

összefoglaló

néven

poszt-transzlációs

módosulásnak nevezünk. A poszt-transzlációs módosulások (PTM) a proteinek rendkívül fontos tulajdonságai, mivel gyakran ezek adják meg a fehérje specifikus biológiai aktivitását és rendeltetését. Az eddig megismert több mint 300 féle PTM közül a mind prokariótákban mind eukariótákban megtalálható glikoziláció a leggyakoribb [1]. Manapság a glikoziláció felderítése a proteomika egy igen fontos és központi kutatási területe. A szénhidrátok olyan biológiai folyamatok résztvevői, mint pl. embrionális fejlődés, sejten belüli és sejtek közötti kapcsolattartás, hormonok, ill. toxinok felismerése, immunválasz kialakítása, valamint proteinek szabályozásának és kölcsönhatásának a koordinálása. Néhány glikokonjugátum a sejtek felszínén receptorként működik. A glikánok szerkezetileg jóval bonyolultabbak, mint pl. a proteinek vagy az oligonukleotidok, ebből adódóan specifikus molekuláris felismerést kódolhatnak, meghatározzák a fehérje feltekeredését és stabilitását. A glikoziláció iránti figyelem annak is betudható, hogy az oligoszacharidok jelenlétét, ill. szerkezeti és mennyiségbeli változását megfigyelték különböző patológiai állapotokban, mint pl. tumoros megbetegedések, atherosclerosis, reumás artritisz, immunhiányos betegségek esetében. A legtöbb testfolyadékban (mint pl. szérum, cerebrospinális folyadék, vizelet, tej, nyál) található fehérje glikoprotein. Diagnosztikus és terápiás célokra ezek a proteinek a legkönnyebben hozzáférhetőek, ezért nem meglepő, hogy a legtöbb klinikai biomarker és terápiás célmolekula glikoprotein. Ide sorolhatjuk például a prosztatarák biomarkerét a prosztataspecifikus antigént (PSA), valamint az ováriumtumorra jellemző CA125-öt. A proteinek glikozilációjának két legfontosabb típusa az N- és O-glikoziláció (IV.1 Ábra). Az első típus esetén az oligoszacharidok az aszparagin oldalláncához N-glikozidos kötéssel

kapcsolódnak

N-acetil-glükózamin

(GlcNAc)

monoszacharidon

keresztül,

amennyiben az Asn-Xxx-(Ser, Thr) szekvenciasor teljesül, ahol Xxx prolin kivételével bármilyen aminosav lehet (N-linked glycans). A N-kötött glikánoknak további három 49


alcsoportja van. Ezeknek van egy közös, három mannózból és két GlcNAc-ból álló core/”mag” része, ahol a két külső mannózhoz további monoszacharid egységek (antennák) kapcsolódhatnak. Ha csak mannóz kapcsolódik a központi egységhez, akkor „oligomannóz” típusú, ha N-acetil-laktózamin (Gal-GlcNAc) kapcsolódik hozzá akkor „komplex” típusú, és végül, ha egyik mannózhoz N-acetil-laktózamin másikhoz mannóz kacsolódik, akkor „hibrid” típusú glikánról beszélünk.

II. N-kapcsolt glikánok

I. O-kapcsolt glikánok

Példák a)

b)

c)

IV.1 Ábra O- és N-kapcsolt glikánok. Az N-glikánok három fő csoportja a) hibrid, b) oligomannóz c) komplex típusú N-kötött oligoszacharidok

A core mannóz szerkezethez kapcsolódhat még fukóz is, tovább növelve az oligoszacharidok szerkezeti változatosságát. A komplex glikánok bioszintézisét további lánczáró/lánchosszabbító lépések fejezik be, emlősökben legtöbbször ez sziálsav valamint (további elágazásként) fukóz beépülését jelenti. A másik leggyakoribb glikozilációs típus eredményezi az O-kötött glikánokat (Olinked glycans), amely egy jóval szélesebb körű, diverzebb osztály. Itt nincs sem központi definiált mag szerkezet, sem aminosavsor kitétel, a cukoregységek az egyszerű, egy monoszacharidos kötődéstől a nagyméretű szulfatált poliszacharidokig számtalan verzióban kapcsolódhatnak a fehérjelánchoz. Emlősökben N-acetil-galaktózamin (GalNAc) a kezdő monoszacharid, amelyen keresztül kötődik a fehérje hidroxilcsoport oldalláncot tartalmazó 50


aminosavjaihoz (Ser, Thr), bár ismeretes más cukoregységen keresztüli kapcsolat is [2]. A két fő glikozilációs típuson kívül ritkán az is előfordul, hogy a protein bizonyos cisztein vagy lizin aminosavjaihoz kötődik valamilyen szénhidrát egység [3], továbbá C-glikozilációt is megfigyeltek már triptofán oldalláncon [4]. A glikoproteinekben az egyes glikozilációs pozíciókban mind elágazottságukban, mind összetételükben eltérő glikánok lehetnek jelen (különböző mértékű lehet a sziálsavtartalom, és fukoziláltság), ami nagymértékű mikroheterogenitához vezet. Másrészről a glikozilációs helyek gyakran csak részben betöltöttek oligoszacharidokkal, ami makroheterogenitást eredményez. Ezért a glikoproteineket mindig szerkezetileg nagyon hasonló glikozilációs variánsok heterogén keverékének, glikoformáinak kell tekinteni. A glikoproteinek

szerkezetének

teljes

vizsgálata

ezért,

a

peptidlánchoz

kapcsolódó

oligoszacharid struktúrák igen nagymértékű heterogenitása miatt, a proteomkutatás egyik legnagyobb kihívást jelentő feladata. IV.1.2 Glikoziláció vizsgálatának analitikai eszközei Glikoproteinek glikozilációjának tanulmányozását, az oligoszacharidok illetve glikánok

szerkezetének

és

funkciójának

felderítését

a

(proteomika

analógiájára)

glikoproteomika célozza meg. A glikoziláció vizsgálatára többféle stratégia létezik. Egyfelől a natív formában lévő intakt fehérjét, annak glikoformáit szeparálás után tanulmányozzák. Másfelől különböző enzimek (endoproteinázok) segítségével a molekulát kisebb darabokra, peptidekre és glikopeptidekre hasítják, és a keverékből a glikoproteineket szeparálják, dúsítják, vagy szelektíven detektálják. A harmadik lehetőség, amikor a glikoproteinek oligoszacharid részét vagy kémiai úton (hidrazinolízis) vagy egy specifikus enzimmel, pl. peptid-N-glikozidázzal (PNG-áz F) lehasítják a peptidláncról, majd a peptidtől való szeparálás és egyéb tisztítási lépések vagy származékképzés után vizsgálják. Az első esetben, intakt glikoproteinek szerkezetének felderítésére alkalmas analitikai eszközök között találjuk a concanavalin A lektin affinitáskromatográfiás [5-7], vagy modernebb változatát, az affinitás immunoelektroforézises módszereket [8-11], továbbá a kapilláris elektroforézist [12] és a tömegspektrometriás technikákat (MALDI-TOF, ESI-MS). A második esetben, glikopeptidek illetve a glikozilációs pontok vizsgálatára szintén szóba jöhet a concanavalin A lektin-affinitáskromatográfia [13-17] valamint MALDI és ESI-MS techinkák. Harmadik esetben, a glikánok frakcionálására és jellemzésesre alkalmasak a 51


különböző

HPLC

fordítottfázisú-HPLC

technikák, ill.

úgymint

széntöltetű

anioncserés

(grafit

kromatográfia,

kolonna,

GCC)

normálfázisú-,

HPLC

rendszerek.

Oligoszacharidok vizsgálatára szintén használnak lektin affinitáskromatográfiát, és kapilláris elektroforézist, valamint tömegspektrometriás (MALDI és ESI-MS) analízist. Az esetek többségében egy analitikai módszerrel nem lehetséges a glikoproteinek teljes szerkezeti felderítését megoldani, hanem különböző technikák együttes, vagy egymás utáni alkalmazásával tudunk komplett glikozilációs képet alkotni. IV.1.3 Proteinek glikozilációjának tanulmányozása tömegspektrometriával A glikobiológiában alkalmazott analitikai eszközök is küszködnek a biológiai vizsgálatokkal

járó

szokásos

nehézségektől,

mint

például

az

elenyészően

kis

mintamennyiségek, kémiai módosulások, konjugációk valamint nehezen elválasztható komplex keverékek. Mindezek ellenére az elmúlt években jelentős új fejlesztések történtek a glikoziláció

tanulmányozásában.

A

modern

elválasztástechikákkal

kombinált

tömegspektrometria jelenleg a legsokoldalúbb és leghatékonyabb analitikai eszköz proteinek glikozilációjának és a szénhidrátok szerkezetének felderítésére. A hagyományos analitikai módszerekhez képest igen nagy előnye, a kis mintamennyiségek igénye és nagy érzékenysége. Az első tömegspektrométeren végzett glikozilációs vizsgálat több mint harminc évvel ezelőtt történt, amikor egy glikoprotein O-kapcsolt diszacharidjainak azonosítását valósították meg az akkoriban rendelkezésre álló EI és CI ionizációs módszerekkel [18]. Az analízishez derivatizálásra (permetilezés) volt szükség hogy a mintát illékonnyá tegyék. Az eltelt évek fejlesztései

következtében

az

intakt

glikokonjugátumok,

a

glikopeptidek

és

az

oligoszacharidok szerkezetkutatása a „lágy” ionizációs technikákkal (FAB, ESI és MALDI ) kapcsolt tömegspektrometriával valósítható meg. A FAB-MS-t sokáig sikeresen alkalmazták oligoszacharidok tanulmányozására, ami a molekulatömegen kívül további információt szolgáltatott a cukoregységek kapcsolódási sorrendjéről és elágazásukról. Az utóbbi években szinte kizárólag a MALDI és az ESI ionizációt használják az oligoszacharidok szerkezetkutatására, cukrok kapcsolódási sorrendjének meghatározására [19-22]. A kapott szerkezeti információ természetesen nagymértékben függ az ionforráshoz kapcsolt analizátorok teljesítményétől. A következőkben a korábban említett háromszintű glikozilációs vizsgálat

(intakt

protein,

glikopeptidek,

glikánok

szintjén)

tömegspektrometriás

megközelítését fogom bemutatni. A témában számos összefoglaló cikket találunk [23-29]. 52


IV.1.3.1 Intakt glikoproteinek MS vizsgálata A nagyméretű biomolekulák tömegspektrometriás tanulmányozására a 90’-es évektől a már említett MALDI és ESI ionizációs módszereket használják sikeresen. A glikoproteinek esetében az oligoszacharidok okozta mikroheterogenitás a szerkezetanalízist igencsak bonyolítja, ezért natív állapotban ezeket ritkán vizsgálják tömegspektrometriával. Ha intakt állapotban tanulmányozzuk a glikoproteint, annak méretétől, tömegétől és glikoziláltságának mértékétől függően az egyes glikoformák megkülönböztetéséhez igen nagy felbontású készülékre van szükségünk. A TOF analizátorok csak kisebb glikoproteinek glikoformáinak szétválasztásához szükséges felbontással rendelkeznek (pl. egy glikozilációs pont limitált számú glikánnal), más esetben általában felbontatlan, széles móltömegeloszlású csúcsokat kapunk. Ezzel a módszerrel jól használható MALDI-MS spektrumokat kaptak plazminogén aktivátor (Desmodus salivary plasminogen activator, DSPAα1) [30], monoklonális antitest [31], interleukin 4 receptor [32] és humán csont szialoprotein (bone sialoprotein, BSP) [33] vizsgálata során. A mérés és a mintaelőkészítés azon paramétereit optimálva, amely glikoproteinek deszorpcióját/ionizációját befolyásolják, a MALDI spektrum minőségén (reprodukálhatóság, felbontás) jelentős javulás érhető el [34]. Sottani és mtsai [34] beszámoltak arról, hogy a 2,4,6-trihidroxiacetofenon és a 4-hidroxi-3-metoxifahéjsav nemcsak a reprodukálhatóság, de a megfelelő felbontás eléréséhez is jó eredményeket szolgáltató mátrixok. A nagyobb glikoproteinek általában 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-fahéjsavval (SA) intenzív, széles jeleket szolgáltatnak. 2,6-dihidroxiacetofenon [35] glikoproteinek vizsgálatában szintén jól használható mátrix, különösen a sziálsavas glikoproteinek esetében ammónium-citráttal keverve kevésbé szenved fragmentációt az analízis során. Juhász és mtsai szerint a 2(p-hidroxifenilazo)benzoesav (HABA) a konvencionálisan alkalmazott mátrixoknál (SA,

DHB,

α-ciano-4hidroxifahéjsav)

lényegesen

jobb

felbontást

produkál

nagy

glikoproteinek esetében [36]. Általában elmondhatjuk, hogy intakt glikoproteinek MALDI-TOF vizsgálatánál kb. 20 kDa móltömeg alatti molekulák megfelelő felbontással vizsgálhatóak (izotópfelbontás csak kb. 10 kDa alattiakra). 10 kDa móltömeg felett a sók és egyéb adduktok, az esetleges fragmentumok valamint a nagyszámú glikoforma miatt a megfelelő felbontású spektrumok nem készíthetők. Az intakt glikproteinek ESI MS tanulmányozásáról csak igen kevés információval rendelkezünk jelenleg. A feladat rendkívül nehéz a glikorészben rejlő nagymértékű heterogenitás miatt. A glikánstruktúrák adduktképzéssel sók kötésére hajlamosak, ami 53


nagymértékben lerontja a spektrumok minőségét és értékelhetetlen csúcsokat eredményez. Ezenfelül az oligoszacharidok a molekula felületének nagy részét elfoglalják, a potencionális protonálódási helyeket eltakarva, kevesebb töltéssel rendelkező ionokat eredményeznek, amik még jóval a kvadrupól analizátor tömegtartományán kívül esnek. Feng és Konishi 150-200 kDa közötti glikoproteineket vizsgáltak, és megállapították, hogy bár a kvadrupól analizátornak nincs elégséges felbontása a glikoformák elválasztására, de az ekkora tömegű glikokonjugátumokról hasznos analitikai információt, átlagmóltömeget képes szolgáltatni az ESI-MS technika [37]. Wilm és Mann bemutatták, hogy az ESI MS ilyen területen történő alkalmazhatósága jelentősen javítható nanospray ionizációval [38]. A nanoelektrospray a deszolvatáció hatásfokának nagymértékű növekedésével jótékonyan befolyásolta az erősen glikozilált fehérjék vizsgálhatóságát. IV.1.3.2 Glikoziláció pozícionális eloszlásának MS vizsgálata A nagyobb méretű glikoproteinek kémiai vagy enzimatikus hasításával kisebb tömegű glikozilált

peptidfragmentumokhoz,

glikopeptidekhez

jutunk,

és

ezek

analízisével

felülkerekedhetünk az intakt molekulák felbontás okozta problémáján. A proteinek glikozilációjának glikopeptidek szintjén történő szerkezetkutatása éppen olyan fontos, mint a lehasított glikánok tanulmányozása. Glikopeptidek vizsgálatával a peptidlánchoz való kapcsolódás információja megmarad, és lehetőségünk van az egyes glikozilálódási pozíciók oligoszacharid

eloszlásának,

mikroheterogenitásának

felderítésére.

A

glikopeptidek

előállíthatók (redukálást és alkilálást követően) glikoproteinek proteolitikus emésztésével. Leggyakrabban a tripszint alkalmazzák erre a célra (lizin és arginin mellett a C-terminális irányból hasít), de a szintén C-terminális irányából az aszparaginsav és glutaminsav aminosavaknál hasító Glu-C [39, 40], illetve a nagyobb méretű alifás és aromás aminosavaknál hasító pronáz enzim is használható erre a célra. A kapott peptid-glikopeptid keveréket ezt követően off-line MALDI- vagy on-line HPLC ESI-MS technikákkal jellemezhetjük. A glikopeptidek azonosítása egy komplex peptid-glikopeptid elegyből meglehetősen nagy kihívás. Alacsony detektálási érzékenységük betudható a glikozilációs pontokon található cukorszerkezetek heterogén eloszlásának (site heterogeneity). A glikopeptidek jeleit a jobban ionizálódó peptidek elnyomják, különösen, ha a glikopeptiden még negatív töltésű sziálsavas oligoszacharidok tartózkodnak. Ezért a peptid-glikopeptid keverék komponenseit érdemes a tömegspektrometriás analízis előtt elválasztani. 54


A glikopeptideket általában MALDI-TOF MS, vagy ESI-MS és ESI MS/MS technikákkal

vizsgálják.

A

glikoproteinek

triptikus

hidrolizátumának

ESI-

tömegspektrometriás jellemzésének előnyeit elsőként Ling és munkatársai írták le [41]. Legfontosabb érdemük, hogy a komplex keverékből kromatográfiás elválasztás közben a glikopeptidek szelektíven detektálhatók, ami a glikánrészekből jellegzetesen lehasadó oxóniumionok megjelenésével, azok szelektív monitorozásával valósítható meg [42]. A glikopeptidek így már néhány pikomolnyi

mennyiségben detektáltatók az olyan

karakterisztikus oxóniumionok megjelenésével, mint pl. m/z 204:HexNAc, 274:NeuAc-H2O, 292:NeuAc, 366:Hex-HexNAc, 657: NeuAc-Hex-HexNAc, amelyek az ionforrásban alkalmazott magasabb orifice feszültség hatására képződnek [43, 44]. Egy másik alternatívaként hármas kvadrupól készülékeken tandem tömegspektrometriával, prekurzor ion scan módban is véghezvihetjük a vizsgálatot. Ilyenkor az első kvadrupol (Q1) analizátor azokat a prekurzor ionokat detektálja, amelyekből a karakterisztikus oxóniumionok a Q2 ütközési cellában képződtek. Glikopeptidek MALDI-TOF-MS detektálása néhány glikoprotein emésztéséből származó elegyből már igen nehéz feladat. Ilyenkor a MALDI vizsgálat előtt a glikopeptideket elválasztják az analízist zavaró komponensektől (detergensek, sók, stb.) Erre a célra leggyakrabban a lektin affinitáskromatográfiát (például concanavalin A-t) alkalmazzák, amely főként a biantennáris glikánokra szelektív. A glikopeptidek méretét figyelembe véve az elegyet gélkromatográfiával, vagy adott pórusméretű membránon való ultraszűréssel is tisztíthatják [45]. Számos új módszer, technikai megoldás látott napvilágot glikopeptidek tisztításáról és MALDI- valamint ESI-MS analíziséről, amelyek részletes bemutatására a dolgozat limitált terjedelme miatt nincs lehetőség. Neves összefoglaló cikkek alaposan tárgyalják a témában elért eredményeket [40, 45-49].

IV.1.3.3 Oligoszacharidok MS vizsgálata A harmadik stratégia a glikoziláció tanulmányozására, amikor a glikoproteinek oligoszacharid tartalmát kémiai vagy enzimatikus úton lehasítják a polipeptidláncról, majd szerkezetüket kromatográfiás és/vagy tömegspektrometriás módszerekkel határozzák meg. A kémiai

hidrolízis

vízmentes

hidrazinnal

történik

[50],

és

az

oligoszacharidok

hidrazonszármazékát eredményezi. A másik, a proteomikában elterjedtebb és kíméletesebb enzimatikus bontás, amikor a fehérjét denaturálást követően leggyakrabban peptid N55


glikozidáz F enzimmel (PNG-áz F) reagáltatják, ami specifikusan az N-kapcsolt glikánokat hasítja a glikoproteinről. A reakcióban a szénhidrát és a peptidlánc aszparaginja közti amidkötés hidrolízise történik, hasítás termékei pedig a glikozilaminok (amik azonnal szokásos glikánokká alakulnak), a peptidláncban pedig aszparagin helyén aszparaginsav marad vissza a kapcsolódási pontnál. Ez az enzimatikus bontás lehetővé teszi, hogy az Nglikánok

láncvégi

redukáló

végei

visszaalakuljanak

és

reduktív

aminálással

az

oligoszacharidok UV-aktív, vagy fluoreszcens származékai állíthatók elő. Ez a lépés a glikánok érzékenyebb és szelektívebb detektálását teszi lehetővé, így azok a glikoproteinek is vizsgálhatók, amelyek korlátozott mennyiségben állnak rendelkezésre. A keletkezett komplex glikánkeverék vizsgálata elektoforetikus [51, 52], NP-HPLC, [53, 54], RP-HPLC [55, 56] módszerekkel, UV-, fluoreszcenciás vagy tömegspektrometriás (MALDI-TOF MS, vagy ESI-MS) detektálással, illetve ezek kombinálásával történhet [57, 58]. A MALDI és ESI ionizációkkal többnyire a lehasított glikánok fragmentáció nélküli (vagy enyhe fragmentációt szenvedett) molekulatömegéről nyerhető információ.

IV.1.3.3.1 MALDI MS A MALDI-TOF MS technika egyedülálló adottsága, hogy komplex oligoszacharid keverékekből is képes olyan spektrumokat produkálni, amelyeket a többszörös töltésű és jelentős fragmentációból származó csúcsok nem bonyolítanak. További előnye, hogy jól tolerálja az olyan szennyezőket, mint a sók [59] és a konvencionálisan alkalmazott pufferek [60], valamint mintaelőkészítési lépése is gyors és egyszerű. Oligoszacharidok vizsgálatában az ESI-nél érzékenyebb módszer. MALDI-MS analízis során pozitív ionizációs módban a glikánok intenzív [M+Na]+ addukt formájában detektálhatók, míg ESI-MS esetén egy adott glikán intenzitása a többszörösen töltött ionjai között oszlik meg, ami érzékenységcsökkenést is jelent egyben. Ezért a glikánok szerkezetvizsgálatában a MALDI-TOF-MS a legnépszerűbb és mondhatjuk, hogy leggyakoribb analitikai eszköz. Helyesen megválasztott mátrix esetében például N-glikánok vizsgálatában a kapott jel intenzitása tükrözheti a targeten található minta mennyiségét, ezért a keverékben található glikánok relatív mennyiségi arányai MALDI-MS analízissel

meghatározhatóak.

Glikánok

MALDI


vizsgálatában

mátrixként leggyakrabban 2,5-dihidroxi benzoesavat (DHB) használnak, amivel neutrális oligoszacharidok esetén kb. 50-100 fmol-os kimutatási határ is elérhető. Érzékenység és felbontás növelésére számos komponens hozzáadását írták már le az irodalomban. Például DHB-hez 1-hidroxiizokinolint (HIQ) adva eredményesen növelte az oligoszacharidok 56


ionizálhatóságát [61]. A savas (sziálsavat tartalmazó) glikánok analízisében az érzékenység növekedését tapasztalták negatív módban egy másik mátrix, a 2,4,6-trihidroxi-acetofenon (THAP) és ammónium citrát alkalmazásával [62]. A

neutrális

glikánok

Na-adduktok

formájában

legintenzívebben, és gyakran kíséri őket kisebb intenzitással

[M+Na]+

ionizálódnak

a

[M+K]+ ion is. Sziálsavas

oligoszacharidok vizsgálata nehezebb MALDI-TOF-MS-sel, pozitív módban olyan kation addukt sorozat keletkezik, mint [M+Na]+, [M+K]+, [M-nH+(n+1)Na]+, és [M-nH+(n+1)K]+. A sziálsav könnyen lehasad a tömegspektrométerben, amit figyelembe kell venni az analízis során [27], ezért ezeket a glikánokat lineáris módban kell mérni. A sziálsavas részek stabilitásának növelésére számos származékképzési megoldás létezik. Például a sziálsav karboxilcsoportjának metilészterré alakítása a neutrális és szializált glikánok szimultán analízisét teszi lehetővé pozitív módban [63]. Glikánok permetilációja is nagymértékben csökkenti a sziálsavak MS körülmények közötti spontán hasadását [64]. A glikoproteinek glikozilációs profilja rendkívül érzékeny a sejten belüli biológiai változásokra. A glikoproteinek oligoszacharid-szerkezetében élettani folyamatok hatására bekövetkező változások megfigyelésében ezért a tömegspektrometriás technikáknak fontos szerepet töltenek be, mivel a külöböző glikoproteinek vagy glikoprotein keverékek oligoszacharid eloszlásáról (glikán profiljáról) viszonylag gyorsan nyerhető információ MALDI-TOF-MS analízissel. Mills munkatársaival kidolgozott egy módszert, amiben a vérszérum PNG-áz F-el lehasított N-glikánjainak tömegét határozta meg veleszületett II-es típusú glikozilációs rendellenességben (CDGIIx: Congenital Disorders of Glycosylation type IIx) szenvedő betegekben [65].

Morelle és munkatársai a szérum N-hez kötött

oligoszacharidjainak kvantitaív tömegspektrometriás vizsgálatát célozták meg különböző betegségekben [66]. Véghezvitték a humán szérumban található N-glikánok direkt PNG-áz Fes hasítását, majd egy egyszerű egylépéses, porózus grafit töltetű SPE tölteten történő tisztításos lépés után az N-glikánok metilészter származékát állították elő, majd ezt MALDITOF-MS

technikával

szekvenciaanalízisét

vizsgálták.

elvégezve

A

MALDI

exoglikozidáz

targeten

enzimek

az

N-glikánok

segítségével

26

további N-glikánt

azonosítottak. Ezek a glikánok részben tükrözik a szérum N-glikomjának extrém heterogenitását és felhasználhatók prognózisra vagy egyes betegségek diagnosztikus markereiként. Kyselova és munkatársai 2007-ben a humán szérum teljes glikántartalmát vizsgálták prosztatarák esetén. Az PNG-áz F-el lehasított oligoszacharidokat permetilezték és MALDI-TOF tömegspektrometriás módszerrel vizsgálták. A detektált oligoszacharidok intenzitás adatait statisztikai elemzésnek (főkomponens analízisnek) vetették alá, ami alapján 57


szignifikáns eltéréseket tapasztaltak az egészséges és daganatos egyének mintái között. A permetilezett oligoszacharidok kvantitatív tömegspektrometriás vizsgálatának eredményei reprodukálhatók voltak, és korreláltak a kromatográfiás meghatározások adataival [67].

IV.1.3.3.2 ESI MS Az ESI-MS és ESI-MS/MS is elterjedt technikák glikánok szerkezetvizsgálatára [49]. Általában ESI körülmények között a neutrális oligoszacharidok ionizálhatósága elég gyenge. Valójában a natív glikánok pikomólnyi mennyiségű detektálása sem egyszerű feladat. Pozitív ionizációnál [M+Na]+ kvázimolekulaion csak magas orifice feszültségen ad intenzív jelet, azonban ez jelentős forráson belüli fragmentációt idéz elő. Negatív módban [M-H]- keletkezik a legintenzívebben, de ez szintén forráson belüli fragmentációval járhat. Ezért az ESI-MS vizsgálatok előtt a glikánok származékképzése szükséges, vagy nátrium- ill. ammóniumacetát hozzáadásával az ionizáció hatásfoka növelhető. Legnagyobb érzékenységbeli javulás azonban nanoelektrospray ionforrás alkalmazásával érhető el [3]. Az ESI-MS egyedüli előnye a MALDI-MS technikával szemben, az az eset, amikor az ESI-MS-t on-line HPLC detektorként alkalmazzák. Az elmúlt években a HPLC-ESI-MS a glikánok szerkezetének vizsgálatának hatékony eszközzé vált [68, 69]. A kromatográfiás technikák közül a RP kromatográfiát, a NP kromatográfiát, a grafittöltetű szén kromatográfiát és az anioncserés kromatográfiát kapcsolják a tömegspektrométerekhez és alkalmazzák glikán keverékek elválasztására, szerkezetazonosításra. IV.1.4 Az AGP tulajdonságai, biológiai jelentősége Az alfa-1 savas glikoprotein (AGP, AAG) vagy orozomukoid (ORM) a humán szérum egy jellegzetes, rendkívül nagy, kb. 45% oligoszacharid tartalmú, 36-43 kDa tömegű, ún. akut fázisú fehérje frakciója. A nagy mennyiségben hozzá kötődő sziálsavnak köszönhetően alacsony izoelektromos ponttal (pI~2,8–3,8) és kiváló vízoldhatósággal rendelkezik. Az AGP 0,4–0,7 mg/ml koncentrációban fordul elő az egészséges emberek szérumában, ami az akut fázis szindrómák (fizikai traumák, sérülések, bakteriális fertőzések, vagy gyulladások) és egyéb

patológiás

esetben

(pl.

daganatos

megemelkedik [70-72].

58

megbetegedések)

különböző

mértékben


IV.2 Ábra A humán AGP aminosavsorrendje (Alapszekvencia: ORM1 F1, az alsó indexben az egyik lehetséges ORM2 A szekvencia látható)

Polipeptidláncát 183 aminosav alkotja (IV. 2 Ábra) [73] amelyet három gén kódol, genetikai polimorfizmust eredményezve. Az AGP A gén kódolja a fő genetikai variánst, az ORM1-et (ORM1*F1, ORM1*F2 és ORM1*S variánsokat, különböző allélek eredményezik) az AGP B/B’ gének, amelyek egyébként azonosak (egy duplikáció eredményei) pedig az ORM2 variánst (ORM2*A). Az ORM1 variánsok (F1, F2 és S) ugyanazon gén eltérő alléljeinek termékei és öt aminosavban térnek el egymástól (az ORM1 F- ben Gln-20/Val156; ORM1 F2-ben Gln-20/Met-156 és az ORM1 S ben Arg-20/Val-156). Az ORM2 variáns 22 aminosav szubsztitúciós pozícióban különbözik az ORM1 variánsoktól számos eltérő variánst eredményezve, ami igen nagymértékű genetikai polimorfizmust jelent. A szekvenciája

(pl.

ORM1)

megtálalható

a

SwissProt

adatbázisában

(http://ca.expasy.org/uniprot/P02763). Az AGP szerkezetét két diszulfid-híd stabilizálja az 5ös es 147-es, valamint a 72-es es 164-es ciszteinek között. Az AGP szénhidrátszerkezetét alaposan tanulmányozták, mivel egyike azon kevés glikoproteinnek, amely a bi- és triantennáris oligoszacharidokon kívül tetraantennáris 59


glikánokat is tartalmaz [72]. Az AGP komplex N-glikánjait neutrális monoszacharidok (galaktóz, mannóz, fukóz), hexózamin (N-acetil glükózamin) valamint sziálsav (N-acetil neuraminsav) építik fel. Az AGP szénhidráttartalma a lineáris peptidlánc öt kitüntetett helyén (15, 38, 54, 75, és 85-ös helyzetben) aszparagin β-karboxil-csoportján keresztül N-glikozidos kötéssel kapcsolódik a polipeptidlánchoz [70, 72]. Az egyes glikozilációs pozíciókban mind szerkezetükben, elágazottságukban, mind összetételükben (különböző mértékű lehet a sziálsavtartalom, és fukoziláltság) eltérő glikánok lehetnek jelen, ami nagymértékű mikroheterogenitáshoz vezet. Az AGP polimorf peptidláncának jellegéből és változatos oligoszacharid szerkezetéből adódóan

különböző

elválasztástechnikai

módszerekkel

(ioncserés

kromatográfia,

Concanavalin A lektin-kromatográfia, izoelektromos fókuszálás, kapilláris elektroforézis, lektin-immuno affinitási elektroforézis stb.) a molekulavariánsokra választható szét. A közel 50 éve ismert komplex fehérje szerkezetét az 1970’-es években Schmid és munkatársai derítették fel, élettani szerepe azonban még ma is tisztázatlan. Az AGP elsősorban a májban szintetizálódik, de különböző kórfolyamatokban szöveti eredetű (hámszövet, endothél sejtek, prosztata és különböző tumorok) is lehet. Az AGP peptidláncából eredő genetikai polimorfizmus és a glikoziláció okozta nagymértékű mikroheterogenitás (glikozilációs mintázat) eredményeként a plazmában (betegségektől függetlenül is [71]) az AGP számos különböző glikoformája van jelen [74]. Különböző patológiás körülmények hatására az AGP-nek mind a plazmakoncentrációja, mind az eltérő glikoformák relatív előfordulása megváltozhat [71, 75]. A glikánok szerkezetében bekövetkező változások elsősorban három különböző tulajdonságot érintenek: az elágazódás (antennaritás), a sziálsavtartalom, és fukóztartalom változása. Biantennáris és erősebben fukozilált glikánok mennyiségének növekedését figyelték meg krónikus gyulladás [76], rák [77], diabetes mellitus [78] és reumás artritisz [6] esetében. Terhességben, ösztrogénkezelés során az oligoszacharidok elágazottságának növekedéséről, a fukoziláltság csökkenéséről számoltak be [79]. Az oligoszacharid NeuAcα2–3Galβ1–4(Fucα1–3)GlcNAc részlete, melyet szialil LewisX antigénnek neveznek, különösen gyakran tárgyát képezi az élettani folyamatokat érintő diagnosztikai jellegű vizsgálatoknak [10, 39, 76, 78]. Akut fázis szindrómák az AGP glikozilációjában szintén változásokat indukáltak, többszörösen fukozilált

glikoformák

jöttek

létre,

többnyire

LewisX

antigén

formájában

[75].

Hiperfukozilációt figyeltek meg májcirrózis esetén, és az ún. „fukozilációs indexet” (“AGPFI” = fukozilált AGP/AGP koncentrációja a szérumban) [80] vezették be, aminek megállapították a diagnosztikus használhatóságát különböző májbetegségekben. Intenzívebb 60


elágazottságot és fukozilációt találtak veleszületett Ia típusú glikozilációs rendellenesség esetén [81]. Krónikus légzőszervi megbetegedések, mint például asztmánál, az AGP oligoszacharidok antennaritása növekedett, bár sem a fehérje koncentrációja sem a fukóztartalma nem változott [82].

Daganatos betegségek széles skáláján (pl. tüdő-,

gyomorrák, colorectális tumor) a szérum jelentősen emelkedett AGP mennyisége a nagyobb mennyiségű biantennáris és fokozottabban fukozilált oligoszcharidjaihoz volt köthető [83, 84]. Általában a tumoros betegségekben emelkedett szintje miatt a szérum AGP, más diagnosztikai próbákkal együtt a malignus folyamatok felismerésében, a terápia hatásosságának követésében jól használható markernek tekinthető [85]. Számos megfigyelés ellenére az AGP élettani szerepe sok tekintetben ma is ismeretlen. Feltételezhető, hogy mint igen savas hordozó fehérje fontos szerepet tölt be szteroidok, különböző kationos élettani vegyületek (biogén aminok) és terápiás hatóanyagok kötésében, transzportjában. Ezen tulajdonsága miatt a lipokalinok családján belül az immunokalinok csoportjához sorolják [86]. Emellett immmunválaszt módosító kettős (szupresszív és induktív) hatása az AGP egyik sajátos biológiai aktivitását mutatja.

IV.1.5 Az AGP glikozilációjának vizsgálata Glikoziláció vizsgálatára, különösen a különböző patológiás körülmények hatására bekövetkező változására leggyakrabban lektin affinitáskromatográfiás módszereket, antigénantitest kölcsönhatáson, illetve tömegspektrometrián alapuló technikákat használnak. Az első két

technika

előnye

relatív

egyszerűségük,

valamint

alkalmazhatóságuk

nagy

áteresztőképességű vizsgálatokban. Segítségükkel a glikánok elágazottságáról, vagy fukoziláltsági állapotáról nyerhetünk információt, de részletesebb szerkezeti tulajdonságokkal nem szolgálnak. Tömegspektrometriás módszerekkel alaposabb szerkezeti képet alkothatunk a glikoproteinek glikozilációs mintázatáról, mikroheterogenitásáról. Az AGP (és egyéb glikoproteinek) glikozilációjának tömegspektrometriás vizsgálatára az említett három stratégia alkalmas, vizsgálhatjuk tehát az intakt protein, a glikoprotein vagy a lehasított glikánok szintjén. Intakt formában igen ritkán tanulmányozzák a glikoproteineket tömegspektrometriával, ultranagyfelbontású

2004-ben

azonban


Nagy és vizsgálatát

munkatársai valósították

az meg

intakt

AGP

ESI-FT-ICR

technikával, amellyel első alkalommal vittek véghez egy igen komplex sziálsavas glikoprotein mikroheterogenitásának molekulaionból történő vizsgálatát [87]. 61


Az AGP glikozilációs pozícióinak oligoszacharid eloszlását (site occupancy) már sokan tanulmányozták. Treuheit és Costello a glikoprotein Glu-C enzimes emésztéséből kapott

glikopeptideket

RP-HPLC-s

módszerrel

vizsgálták,

majd

MALDI-TOF

tömegspektrometriával meghatározták a glikopeptidek tömegét, valamint becslést adtak az egyes kapcsolódási pontokon előforduló glikánok eloszlására [74]. A HPLC elválasztás során átfedő csúcsok elkerülése érdekében a glikopeptideket deszializálták. Vizsgálataik azt mutatták, hogy a két fő genetikai variáns az öt glikozilációs pozícióban eltérő arányban tartalmazza a bi-, tri- és tetraantennáris glikánokat. Juhász és Martin egy nemspecifikus endoproteázzal, pronázzal emésztette az AGP-t, és keletkező glikopeptideket MALDI-TOF tömegspektrometriával negatív módban analizálta [40]. Ezzel a módszerrel az AGP öt glikozilációs helyét megtalálta és 27 glikopeptid szerkezetét azonosította. Dage az AGP glikánjain lehetségesen előforduló szialil LewisX antigén pozícionális eloszlását vizsgálta HPLC-ESI-MS technikával, az m/z 803 oxóniumion szelektív monitorozásával. Eredményei azt mutatták, hogy az AGP mindegyik kapcsolódási pontján tartalmazott legalább egy LewisX antigént. Higai és munkatársai a humán szérum AGP oligoszacharidok szerkezetét és pozícionális eloszlását tanulmányozták akut és krónikus gyulladásos betegségek esetén. Az glikoproteint Glu-C enzimmel emésztették és a termékeket RP-HPLC módszerrel választották szét. A glikopeptid frakciók glikántartalmát PNG-áz F enzimes emésztést követően MALDITOF módszerrel analizálták, csakúgy, mint a visszamaradt peptideket. Az egészséges és betegek szérumából származó AGP-k oligoszacharidjainak pozíció szerinti eloszlása szignifikánsan különbözött [88]. Az AGP-ből származó N-glikánok kromatográfiás és tömegspektrometriás vizsgálata során a PNG-áz F enzimes emésztést követően a kapott oligoszacharidokat gyakran derivatizálják a redukáló végükön, például 2 amino-benzoesavval, 2-aminobenzamiddal vagy 2-aminopiridinnel stb. [89], hogy a detektálhatóságuk érzékenységét növeljék. Küster és csoportja új módszert dolgozott ki SDS-PAGE-vel elválasztott glikoproteinek N-glikánjainak szerkezetvizsgálatára. Redukálás és alkilálást követően a gélben PNG-áz F-el hasították az AGP N-glikánjait, majd vizes extrakció után Me-észter származékukat képezték, végül tisztítás után MALDI-TOF tömegspektrometriával analizálták. A glikánok további exoglikozidázos emésztésével behatóbb szerkezeti információt (cukorszekvencia) nyert, amivel az AGP négy fajban (ember, marha, birka, kutya) előforduló N-glikánjai közötti szerkezeti különbségeket tárta fel [90]. Merchef és munkatársai az AGP komplex glikánjait modellként használta MALDI-CID fragmentációs kísérletekhez. Módszerüket sikeresen alkalmazták az oligoszacharidok cukorszekvenciájának meghatározására. A savas jellegű 62


cukoregységek stabilizálását szintén észterképzéssel oldották meg [91]. Sei és munkatársai az intakt AGP glikoformáit kapilláris elektroforézissel választották szét, majd a kigyűjtött frakciókat PNG-áz F enzimmel emésztették. Az így kapott glikánokat 8-aminopirén-1,3,6triszulfonáttal derivatizálták, majd szerkezetüket MALDI-MS-es azonosították [12]. Viseaux és Domon az AGP permetilált glikánjainak először ESI és MALDI-TOF-MS technikával, majd 2-aminobenzamiddal derivatizált származékakat HPLC-ESI-MS módszerrel vizsgálták [92]. A glikozilációs mintázat egyszerűsítése érdekében a láncvégi sziálsavakat enzimatikusan lehasították.

Módszerük

(szemikvantitatív)

az

addigiaknál

ionformácival

részletesebb

szolgált

a

bonyolult

szerkezeti

és

kvantitatív

oligoszacharid

keverékek

glikoformáiról.

IV.2 Célkitűzések Munkánk során célul tűztük ki a szerkezetében nagyfokú heterogenitással rendelkező glikoprotein, a humán szérum AGP glikozilációs mintázatának tömegspektrometriás tanulmányozását. Vizsgálni kívántuk az AGP oligoszacharid-szerkezetében bekövetkező változásokat daganatos megbetegedések esetén. Ehhez a következőket terveztük: 1. Az AGP-ben található glikánoknak a peptidlánchoz való kapcsolódási helye szerinti vizsgálatához célul tűztük ki a humán szérum AGP tripszines emésztését, és a keletkező peptidek, glikopeptidek szelektív tömegspektrometriás detektálását. 2. Terveztük továbbá a PNG-áz F enzimmel hasított és derivatizált nagyszámú (43) egészséges, ováriumtumoros és limfómás betegekből származó egyedi oligoszacharid minta MALDI-TOF MS analízisét, az eredmények statisztikai értékelését. Célunk volt az AGP oligoszacharid

mintázatában

szerkezetváltozások

egyes

patofiziológiás

kimutatása, valamint

ezen

glikozilációs

biomarkerként történő alkalmazhatóságának vizsgálata.

63

(rákos)

állapotok

mintázat

okozta

potencionális


IV.3 Anyagok és módszerek IV.3.1 Az AGP oligoszacharidok pozícionális eloszlásának ESI-QTOF-MS vizsgálata

IV.3.1.1 Anyagok Az AGP glikozilációs mintázatának vizsgálatához a humán szérum alfa-1-savas glikoproteint

a Sigma-Aldrich Kft-től

vásároltuk. Az

ammónium-hidrogénkarbonát

(NH4HCO3), az acetonitril (HPLC tisztaságú), a trifluorecetsav (TFA), a sósav (HCl), a tripszin (TPCK-kezelt) a jódacetamid (IAA) és a ditiotreitol (DTT) szintén a Sigma-Aldrich (Budapest) Kft.-től származott. A Na-3-[(2-metil-undecil-1,3-dioxolán-4-il)metoxil]-1propánszulfonát (I) kereskedelmi néven: RapiGest SF denaturáló ágenst a Waters Kft.-től vásároltuk. A vizsgálatokhoz Millipore MilliQ víztisztítóval tisztított, ionmentesített vizet használtunk. IV.3.1.2 AGP tripszines emésztése A gyártó (Waters) által javasolt leírás alapján 50 mM-os NH4HCO3 pufferben (pH 7,8) 0,2 (w/v)%-os Rapigest SF (Na-3-[(2-metil-undecil-1,3-dioxolán-4-il)metoxil]-1-propánszulfonát) oldatot készítettem, aminek 25 μl-ében feloldottam 50 μg AGP-t (280 pmol/μl). 100 mM-os NH4HCO3-ban oldott 45 mM-os ditiotreitolból (DTT) 3 μl-t adtam az AGP-hez, hogy végső koncentráció 5mM-os legyen DTT-re. 30 percig 60 °C-on termosztáltam az elegyet. Miután szobahőmérsékletre hűtöttem, 5 μl 100 mM-os jódacetamidot (ami szintén 100 mM-os NH4HCO3-ban volt oldva) adtam, hogy a végső koncentrációja 15 mM legyen az elegyben. Az alkilezést szobahőmérsékleten, sötétben 30 percig végeztem. A redukált és alkilált AGP-hez ezután 1:10 (enzim:fehérje) arányban tripszint adtuk, és 37 ºC-on 60 percig termosztáltam.

IV.3.1.3 Mintaelőkészítés tömegspektrometriás analízishez A RapiGest SF detergens elbontását (savas hidrolízisét) a következő módon végeztük: 4,2 μl 500 mM-os HCl oldatot adtam az AGP emésztményhez, hogy a végső koncentrációja 30-50

64


mM (pH ≈ 2) legyen, és 37 ºC-on 45 percig inkubáltam. LC-MS analízis előtt 10 percig centrifugáltam (13000 rpm). MS analízishez a mintát tízszeresére hígítottam. IV.3.1.4 AGP triptikus emésztmény MALDI-TOF tömegspektrometriás vizsgálata Az AGP tripszines hidrolizátum MALDI-TOF MS vizsgálata egy 337 nm nitrogén lézerrel rendelkező Voyager DE-Pro MALDI-TOF (Applied Biosystems, Framingham, MA) tömegspektrométeren történtek (Instituto di Scienze dell’ Alimentazione, Consiglio Nazionale Delle Ricerche, Avellino), lineáris módban, pozitív ionizációs módban. A spektrumok felvétele 20 kV gyorsítófeszültségen, 180 ns késleltetési idővel (delay time) és m/z 500-8000 tömegtartományban történt, illeve a tripszines hidrolízis eredménysségének ellenőrzéséhez az m/z 8-50 kDa tartományban is készítettünk felvételt. A mintatartó felületén 1μl (kb.1pmol) AGP emésztményt ugyanennyi 2,5-DHB mátrix telített acetonitriles (10 mg/ml) oldatával kevertünk össze és hagytuk megszáradni. IV.3.1.5 AGP triptikus emésztmény kapilláris HPLC-MS, és MS/MS vizsgálata A tripszines hidrolízis termékeit egy Waters CapLC HPLC-rendszerrel kapcsolt nanospray ionforrással felszerelt Micromass QTof Micro (Manchester, EK) tömegspektrométeren vizsgáltuk. Az emésztményből tízszeres hígítást követően 1,4 μl-t (4 pmol) injektáltunk egy C18-as előtétoszlopon (5 x 0,3 mm) keresztül a kapilláris oszlopra (C18, 0,3x150 mm, 5 μm, PepMap, LCPackings, Amsterdam). Az A mozgófázis összetétele: 0,1%TFA/2%ACN/97,9% H2O, a B mozgófázis összetétele: 0,1%TFA/5%H2O/94,9% ACN volt. Az alkalmazott elúciós gradiens a követező volt: 3 percig mosás 5% B-vel, majd lineáris gradienst alkalmaztuk 20 % B-ig 7 perc alatt, aztán 50 perc alatt 40% B-ig, majd 4 perc alatt 100% B. Szobahőmérsékleten

történt

az

elválasztás,

5

μl/perc

áramlási

sebességgel.

A

tömegspektrometriás mérések elektrospray (nanospray) ionizációval, az m/z 100-2200 amu tömegtartományban, pozitív módban történtek. A tömegspektrométer működési paraméterei a glikopeptidek detektálására voltak optimálva (kapillárisfeszültség: 3200 V, kúpfeszültség: 20 V, ütközési cella 5 V). Az MS/MS mérések tájékozódó scan (survey scan) módban (Parent Ion Discovery) végeztük, amely során a készülék ütközési cellájában másodpercenként váltakozva 5 illetve 25 V ütközési energiát alkalmaztunk, így szimultán egy kis és egy nagy energiájú felvételt kaptunk. Az MS/MS felvételeknél prekurzor/parent ion szelekció az m/z 1000-2200 tömegtartományból történt. 65


IV.3.2 Humán szérum AGP oligoszacharidjaink MALDI-TOF MS és statisztikai analízise tumoros és normál mintákban IV.3.2.1 A humán szérum AGP izolálása és tisztítása A vizsgálatok az Országos Onkológiai Intézetben klinikailag igazolt, ovárium daganatos és limfómás betegek, valamint egészséges egyének (önkéntes véradók) vérszérumából történtek. A szérum AGP vérből történő izolálását, kromatográfiás tisztítását az Országos Onkológiai Intézet Biokémiai Osztálya végezte a 85-ös hivatkozásban leírtaknak megfelelően [85]. IV.3.2.2 Humán szérum AGP emésztése PNG-áz F enzimmel Az AGP oligoszacharidjainak PNG-áz F enzimmel történő hasítását, majd antranilsavas (2amino-benzoesav, 2AA) derivatizálását és tisztítását szintén az Országos Onkológiai Intézet Biokémiai Osztálya végezte (ami egyúttal egy doktori munka alapját is képezik [93]. IV.3.2.3 AGP oligoszacharidok MALDI-MS vizsgálata Az antranilsavval derivatizált, tisztított N-glikánok tömegspektrometriás vizsgálata egy 337 nm nitrogén lézerrel rendelkező Voyager DE-Pro MALDI-TOF (Applied Biosystems, Framingham, MA) tömegspektrométeren történtek Olaszországban (Instituto di Scienze dell’ Alimentazione, Consiglio Nazionale Delle Ricerche, Avellino), lineáris módban, pozitív és negatív ionizációs módban. A spektrumok felvétele 20 kV gyorsítófeszültségen, 200 ns késleltetési idővel (delay time) és m/z 500-8000 tömegtartományban történt. A mintatartó felületén az oligoszacharidok vizes oldatát (1μl, 50-100 pmol/μl a törzsoldat tízszeres hígítását követően) ugyanennyi 2,5-DHB mátrix telített acetonitriles (10 mg/ml) oldatával kevertünk össze és hagytuk megszáradni a levegőn. Spektrumonként 50 lézerimpulzust alklamaztunk, és 200 lézerimpulzust adtunk össze mintánként. Minden mintát két párhuzamos spotra vittük fel. A különböző spotokból származó spektrumokat nem átlagoltuk. Tömegkalibrációt minden méréssorozat előtt végeztem, külső kalibrációval, standard peptidkeverékkel. A mintákat 2-2 napig mértük pozitív/negatív módban.

66


IV.3.2.4 AGP oligoszacharidok pontos tömegmérése A pontos tömeg- és MS/MS méréseket egy QTOF Premier Tömegspektrométeren (Waters, Manchester, EK), V-üzemmódban, negatív ionizáció módban hajtottuk végre. Pontos tömeg mérésekhez a következő készülék-paramétereket alkalmaztuk: kapillárisfeszültség: 2,5 kV, sampling cone 40,0 V, extraction cone 4,0 V, forráshőmérséklet: 90°C. Referencia (mass lock): Leucin-enkefalin (50 pg/μl) volt, amely állandó külső kalibrációt biztosított. Az oligoszacharid mintákat egy fecskendőpumpával (áramlási sebesség: 5 μl/min) juttatuk a tömegspektrométerbe. MS/MS felvételek készítésénél a készülékparaméterek ugyanezek voltak, az ütközési energia 25 V volt, és a spektrumok felvétele az m/z 100-2000 tartományban történt. IV.3.2.5 MALDI-TOF eredmények statisztikai értékelés

A kapott MALDI-MS spektrumokat Data Explorer 4.7 (ABI, Framingham, MA) program segítségével dolgoztuk fel. Az automatikus értékeléshez a spektrumokból m/z és intenzitás adatokat tartalmazó .txt file-okat állítottunk elő. A nagyszámú spektrum értékelésében a csoportunkban kifejlesztett szoftver segített, ami a tömegszám alapján először beazonosította az N-glikán szerkezeteket, majd a hozzájuk tartozó intenzitásokból készített listát. Egy adott glikán összintenzitása tartalmazta a H+, Na+, K+-ionokkal, illetve ezek kombinációjával képzett adduktionjaik intenzitását, vagyis pozititív módban a [M+Na]+, [M-H+2Na]+, [M2H+3Na]+ és [M+K]+; negatív módban [M-H]-, [M+Na-2H]- [M+2Na-3H]- és [M+K-2H]ionok intenzitásait összegezve. Az így kapott adatokból relatív intenzitásokat számoltam az egyes glikánokhoz (összintenzitáshoz a glikánok intenzitásait vettem csak figyelembe). A lineáris diszkriminancia-analízis (LDA) végrehajtásához a Statistica 7.0 szoftwert használtuk (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). Az azonosított N-glikánok relatív intenzitásait definiáltuk változóknak (34-34 glikán pozitív és negatív módban) az osztályokat pedig az egészséges a limfómás és ováriumtumoros (3 csoport) minták alkották.

67


IV.4 Eredmények és értelmezésük

IV.4.1 Az AGP-ben található N-glikánok pozícionális eloszlásának ESI-QTOF-MS vizsgálata

IV.4.1.1 Új felületaktív denaturáló anyag (RapiGest SF) használata az AGP tripszines emésztéséhez Ismeretes, hogy nehezen oldódó, vagy proteolízisnek ellenálló fehérjék enzimatikus hasítása igen fáradságos munka és csak néhány peptidet eredményez. Azonban, ha például proteinek poszt-transzlációs módosulásának felderítése a célunk, nagy szekvencialefedettség (sequence coverage) különösképpen fontos és kívánatos. Glikoproteinek kiterjedt antennáris szénhidrátrészei sztérikusan akadályozhatják működésben a proteázokat, így például a tripszin vagy egyéb proteáz gyakran kihagyja azokat a hasítási helyeket, amelyek pl. egy glikozilált aszparagin közelében vannak. Az emésztések hatékonyságának növeléséhez gyakran használnak denaturáló anyagokat, például ureát, guanidin-hidrokloridot (GHCl), nátrium dodecilszulfátot (SDS) és szerves oldószereket, amelyek elősegítik az feltekeredett proteinek „kitekeredését” és oldhatóvá tételét. Ezek az anyagok azonban sokszor okoznak nemkívánatos kémiai módosulásokat, ami viszont rontja a proteolízis hatásfokát. Továbbá, a reakcióelegyben maradt felesleges denaturálószer gyakran zavarja a kromatográfiás és tömegspektrometriás analízist, így a vizsgálatok előtti összetett mintaelőkészítési, tisztítási lépések bevezetését (dialízis, SPE, RP-HPLC, denaturálószer kikristályosítása) igényli. Oldatbeli tripszines emésztésekhez a Waters cég bevezetett egy viszonylag új, savérzékeny felületaktív denaturálószert RapiGest SF néven (Na-3-[(2-metil-undecil-1,3-dioxolán-4il)metoxil]-1-propánszulfonát) [94]. A RapiGest SF eredményesen kitekeri és oldhatóvá teszi a fehérjéket és előkészíti őket a proteolitikus hasításra. Nem akadályozza a leggyakrabban alkalmazott enzimeket (tripszin, GluC, LysC, AspN, kimotripszin) aktivitásukban. Savérzékeny tulajdonsága miatt a LC-MS és MALDI MS vizsgálatok előtt a reagens elbontásához egyszerűen csak savat (HCl, TFA) kell adni a mintához, és egy gyors reakcióban olyan termékekké alakul, amelyek nem zavarják az MS mérést (IV.3 Ábra). Ezzel a denaturálószerrel több, proteolízisnek ellenálló globuláris és membránfehérje emésztését oldották meg [95, 96]. Glikoproteinek területén történő alkalmazásukra azonban csak kevés példát találunk. 68


O (CH2)3 O O

II

SO3- Na +

CH3(CH2)10 H+

O

+

CH3(CH2)10

(CH2)3

SO3- Na +

O

I

HO

III

OH

IV.3 Ábra RapiGest SF: Na-3-[(2-metil-undecil-1,3-dioxolán-4-il)metoxil]-1-propánszulfonát (I) savas hidrolíziséből kapott termékek: tridekán-2-on (II) és nátrium 3-(2,3-dihidropropoxy) propánszulfonát (III)

Az AGP-ben található N-glikánok kapcsolódási pontok szerinti eloszlásának tanulmányozása érdekében az AGP polipeptidláncát tripszinnel emésztettük. A korábban alkalmazott, hagyományosnak tekinthető hidrolízisek (denaturáció GHCl-al, redukálás, alkilálás és tripszines emésztés) nem hozták meg a kívánt eredményt (csak kevés peptid volt detektálható, glikopeptideket nem láttunk), az akkor bevezetésre kerülő RapiGest SF detergenst alkalmaztuk sikeresen. Tudomásunk szerint ez volt az első alkalom, hogy egy ilyen nagymértékben glikozilált protein bontását sikerült megvalósítani, és a mintaelőkészítési lépéseket nagymértékben leegyszerűsíteni (2004) [97].

Az addigi kb. másfél napos (és

eredménytelen) procedúra is jelentősen, kb. 4 órára csökkent. A tripszines bontás első lépéseként a szilárd AGP-hez, a gyártó által javasolt leírás szerint

RapiGest

SF

oldatot

adtunk.

Bizonyított,

hogy a

RapiGest

SF

széles

koncentrációtartományban nem zavarja aktivitásában az enzimet, miközben gyors, oldatban történő bontást eredményez [95]. Redukálás és alkilálás, majd a tripszinnel történő hidrolízis után 0,5 M-os sósav hozzáadásával bontottunk el a denaturálószert, ami tridekán-2-on (II a IV.3 Ábrán) és nátrium 3-(2,3-dihidropropoxy) propánszulfonát (III a IV.3 Ábrán) termékekhez vezetett. Ez a lépés azért is fontos, mivel az intakt RapiGest SF erős ionpárképző ágens lehet a RP-HPLC analízis során, és a peptidek retenciós idejét is megváltoztathatja. A savas hidrolízis II. termékét centrifugálással távolítottuk el, a másik produktum pedig retenció nélkül eluálódott, így nem zavarta az MS mérést.

69


IV.4.1.2 Az AGP tripszines hidrolizátum MALDI-TOF MS analízise A tripszines emésztés eredményességének ellenőrzése céljából a peptid-glikopeptid keveréket először MALDI-TOF MS technikával pozitív ioniozációs módban vizsgáltuk. A kapott spektrumon (IV.4 Ábra) az alacsonyabb tömegtartományban található csúcsok az AGP triptikus

(oligoszacharid

nélküli)

peptidjeinek

felelnek

meg,

míg

a

magasabb

tömegtartományban találhatóak a glikopeptidek. Nem volt az intakt AGP molekulatömegére utaló csúcs a 30-40 kDa-os tartományban, ami azt jelenti, hogy a tripszines hasítás maradéktalanul végbement. A 4-6,5 kDa-os tartományban relatív nagy intenzitással jelentek meg a glikopeptidek, ám a triptikus peptidek csúcsai jóval intenzívebben jelentkeznek az alacsonyabb tartományban, ami a már említett ionizációs képességükből eredő különbségből ered. A triptikus peptidekre a szekvencia lefedettség 65% -os volt (peptidekre nézve), amely a korábbi RapiGest SF nélküli hidrolízis termékekhez képest (55%) jobb eredményt hozott. A legszembetűnőbb különbség az volt, hogy míg Rapigest SF nélkül nem kaptunk glikopeptideket (MALDI spektrumon nem volt 4-6 kDa tartományban jel), addig az új detergenst alkalmazva ez megvalósult. 35000

*

Intenzitás, cps

30000

AGP triptikus peptidek

25000

*

20000

* 15000

* 10000

* * *

5000

AGP glikopeptidek

*

*

*

1000

2000

*

0

3000

4000

5000

6000

7000

m/z, amu

IV.4 Ábra. Rapigest SF-el denaturált AGP triptikus peptidjeinek MALDI-TOF MS spektruma, * azonosított AGP triptikus peptiek,

tripszin autolíziséből származó termékek

Látható, hogy bár off-line módban, MALDI-TOF analízissel is kimutathatók a glikopeptidek, a triptikus pepdidekhez képest jóval kevesebb a számuk. Azt is látszik, hogy a glikopeptid csúcsok meglehetősen szélesek, ami a jelentős heterogenitásuknak tudható be. A megfigyelést a készülék lineáris módban tapasztalt alacsonyabb felbontása is okozza, azonban 70


ismert, hogy a nagyobb felbontású reflektron módban történő mérések a labilis szénhidrátegységek (különösen a sziálsav) hasadását eredményezik A továbbiakban a glikopeptidek oligoszacharid szerkezetének és azok kapcsolódási hely szerinti eloszlásának tanulmányozása céljából HPLC-ESI-MS és MS/MS méréseket végeztünk. IV.4.1.3 Az AGP triptikus emésztmény kapilláris RP-HPLC ESI-QTOF MS és MS/MS vizsgálata Az AGP-ben található komplex oligoszacharidok szerkezetének azonosítása, valamint kapcsolódási pont szerinti eloszlásuk tanulmányozása céljából a RapiGest SF-el kezelt és tripszinnel hidrolizált mintát a glikopeptidek szelektív detektálását célozva on-line fordított fázisú HPLC-ESI-MS módszerrel analizáltuk. A tömegspektrométer egy CapLC HPLCrendszerrel kapcsolt, nanospray ionforrással felszerelt nagyfelbontású QTOF készülék volt. A készülék felbontásának köszönhetően a nagytömegű és többszörösen töltött állapotú glikopeptidek töltésállapotát is könnyen meghatároztuk. Azonosításhoz glikopeptidek nomenklatúrájának problémáját kellett elsőként áthidalnunk, ugyanis az irodalomban addig a nagyszámú, oligoszacharidok szerkezetkutatását célzó vizsgálat ellenére nem találtunk egységes, korrekt elnevezést.

Ezért Dage és munkatársai [39] által leírt nomenklaturát

követtük, vagyis a Bi, Tri, Tetra, Penta, Hexa elnevezések a glikánokban található „antennák” (pontosabban az un. N-acetil-laktózamin: Gal-GlcNAc egységek) számára utal; az S és az utána következő szám a sziálsavak (N-acetil-neuraminsav) számát, míg az F a fukóztartalmat jelöli. A glikopeptidek elnevezésében a római számok a glikozilációs pozíciót, az alsó indexük a genetikai variánsukat jelöli. Például a IV1-TetraS3F1 jelölés az AGP

IV.

glikozilációs pontját (75-ös helyzetű Asn) jelöli, ami az ORM1 genetikai variáns peptidláncának [84-90] peptidszakasza, amihez egy tetraantennáris, három sziálsavas és egy fukózt tartalmazó komplex glikán kapcsolódik. A bemutatott szerkezetek azonosítása móltömegük alapján történt, továbbá az adatokat tandem tömegspektrometriás (MS/MS) mérésekkel is alátámasztottuk. Az AGP tripszines emésztményének nagyfelbontású kapilláris HPLC-ESI-QTOF analíziséből kapott HPLC kromatogram látható az IV.5 ábrán. A felső ábrán (IV.5a) a bázisionkromatogram (BPI) található, ami a scan-enként a legintenzívebb iont ábrázolja. A BPI megfelel a hagyományosan használatos totálion kromatogramoknak (TIC) más néven összionáramnak, ám

szívesebben használják

71

komplex keverékek

– mint például


fehérjeemésztmények – bemutatására, mivel egyszerűbb, „letisztultabb” kromatogramokat szolgáltat.

C18, 300um, normal, 20 V cone, 5 V coll. E. AGP_121105_normal Sm (Mn, 1x1)

a)

12,8

100

21,0

BPI 19,0

27,1 41,1

%

14,8

11,1

18,2

16,3 42,8

0 AGP_121105_normal Sm (Mn, 1x1) 100

TOF MS ES+ BPI 1.44e3

18,4

XIC m/z = 657,2

II, V

%

IV1, IV2

I2(8-20)

8,8

46,5

19,5

b)

TOF MS ES+ 657 382

I1(8-24) 26,6

I2(5-20)

I1(5-24)

21,3

III 42,8

32,2

28,7 0

Time 5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

Idő, perc IV.5 Ábra a) Az AGP tripszines emésztmény bázision kromatogramja (BPI) b) az m/z 657,2 (NeuAcGlcNAc-Gal) diagnosztikus oxóniumion extrahált ion kromatogramja (XIC), ami a glikopeptideket tartalmazó csúcsokat mutatja. Az extrahált csúcsok fölötti jelölések magyarázatát a szövegben illetve az 1. Táblázatban találjuk.

A HPLC-MS analízis során a célunk a komplex peptid-glikopeptid keverékből a glikopeptidek szelektív detektálása volt, hiszen a glikozileződési helyeken található oligoszacharidok szerkezetére voltunk kíváncsiak. Nem elhanyagolható, hogy az AGP tripszines hasításából kb. ötször annyi peptidfragmens keletkezik, mint glikopeptid, ez utóbbiak

ráadásul

szerkezetükben

a

változatos

cukorösszetevőknek

köszönhetően

nagymértékű heterogenitással rendelkeznek; továbbá ESI körülmények között a peptideknél gyengébb intenzitással ionizálódnak. A glikopeptidek jellegzetes fragmentációja (az ionforrásban alkalmazott magas feszültség (declustering potencial), illetve ütközési cellában alkalmazott magasabb ütközési energia hatására) az említett diagnosztikus/karakterisztikus cukor oxóniumionokat eredményezi. Ezek a következők lehetnek: GlcNAc: m/z 204,1; NeuAc (sziálsav): m/z 292,1 és 274,1 (NeuAc-H2O), Gal-GlcNAc: m/z 366,1 és NeuAc-Gal-GlcNAc: 72


m/z 657,2. Ezeket az ionokat gyakran használják az emésztményekben található glikopeptidek szelektív azonosítására [44, 98]. Az IV.5b ábrán egy ilyen diagnosztikus fragmens ion, az m/z 657,2 szelektív ionkromatogramja látható (+/- 0,1 Da tömegkülönbséggel kiextrahálva). A többi diagnosztikus oxóniumion szelektív ionkromatogramja nagyon hasonló képet produkált, csak intenzitásbeli különbségek voltak az egyes kromatogramok között, de a glikopeptideket mutató retenciós idők azonosak voltak. Ezek alapján az AGP glikopeptidek móltömegeit egyértelműen lehetett azonosítani. Az is látható (a várakozásnak megfelelően), hogy ezek csupán kis csúcsok az AGP emésztmény többi peptidcsúcsa között. C18, 300um, normal, 20 V cone, 5 V coll. E.

42,8 perc

AGP_121105_survey 1203 (41.988) Sm (Mn, 3x1.00); Cm (1193:1206)

1: TOF MS ES+ 1.05e3

100

III. Glikozilációs pozíció

Intenzitás, %

(1 kihagyott hasítási hellyel)

%

III-TriS34+ III-TetraS34+ III-TetraS44+ III-TetraS45+

III-TetraS35+

III-TriS35+ 0 200

III-TriS24+ m/z

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

m/z, amu

IV.6 Ábra A 42,8 perchez tartozó kromatográfiás csúcsból vett ESI-tömegspektrum, ami a III. glikozilációs pozíciót tartalmazó glikopeptidet reprezentálja. A glikopeptidek szerkezetét elméleti molekulatömegük alapján, valamint MS/MS mérésekkel igazoltuk.

Megfigyelhető továbbá az is, hogy a kapott kromatográfiás glikopeptid csúcsok sokkal szélesebbek, mint a peptidek csúcsai a BPI kromatogramon. A belőlük (glikopeptid csúcsok) kapott tömegspektrumokon mindig egy sorozat többszörösen töltött glikopeptid tömege jelenik meg, bizonyítva a molekula glikozilációs helyeinek heterogenitását. A IV.6 ábrán erre látunk egy példát. A 42,8 perchez tartozó kromatográfiás csúcsból vett tömegspektrum is mutatja, hogy a retenciós időt elsősorban a peptidrész és nem az oligoszacharid határozza meg. Az azonos peptiddarabon eltérő glikánegységeket tartalmazó glikopeptidek retenciós ideje csak igen kimértekben különbözik, amint azt a IV.7 ábrán található szelektív ionkromatogramokból is látjuk. Ez még azt is bizonyítja, hogy a (IV.6 ábrán) m/z 1000-2000 tartományban észlelhető eltérő tömegek valódi molekulaionok, és nem fragmentumok.

73


42.78

100

XIC 1604,5(4+)

%

0 42.91

100

XIC 1531,6(4+)

%

0 43.41

100

XIC 1440,4(4+)

%

0 43.58

100

XIC 1367,7(4+)

%

0 36.00

37.00

38.00

39.00

40.00

41.00

42.00

43.00

44.00

45.00

46.00

47.00

48.00

49.00

Time 50.00

Idő, perc

IV.7 Ábra. Az m/z 1604,5 (4+); 1531,6 (4+); 1440,4 (4+); 1367,7 (4+) ionok extrahált ionkromatogramjai (XIC), amelyek sorra a III-TetraS4, III-TetraS3, III-TriS3, III-TriS2 szerkezeteknek felelnek meg. A glikopeptid peptidrésze tartalmaz egy kihagyott hasítási helyet.

C18, 300um, normal, 20 V cone, 5 V coll. E.

III-TriS3

AGP_121105_survey 1203 (41.988) M1 [Ev-48252,It10] (Gs,0.750,940:1992,1.00,L33,R33); Sm (Mn, 3x1.00); Cm (1193:1206)

1: TOF MS ES+ 2.05e3

5760

100

III-TetraS3 6125

III-TetraS4 Intenzitás, %

6417

%

III-TetraS2 5834 III-TriS3F1 5906

III-TriS2

IIITetraS3F1

5469

6271

III-TetraS4F1 6563

0

mass 4800

5000

5200

5400

5600

5800

6000

6200

6400

6600

6800

7000

7200

Molekulatömeg, Da

IV.8 Ábra A 42,8 perces kromatográfiás csúcshoz tartozó, III. glikozilációs pozíciót tartalmazó glikopeptidek dekonvolúció után kapott ESI-MS spektruma. A glikopeptidek szerkezetét elméleti molekulatömegük alapján, továbbá MS/MS mérésekkel igazoltuk.

74


A IV.8 ábrán a IV.6 Ábra tömegspektrumának többszörös töltésű glikopeptid ionjainak dekonvolúció után kapott, letisztultabb spektrumát látjuk, ami a glikopeptidek móltömegeit mutatja. Az egyes tömegek a III. glikozilációs helyhez

tartozó glikoformáinak

móltömegeloszlását reprezentálják. Észrevehetjük, hogy a kérdéses glikopeptidek peptidrésze (a III. glikozilációs ponttal) az aminosav-szekvencia [46-63]-s darabja, ami tartalmaz egy kihagyott hasítási helyet. Az 55-ös lizin közvetlenül az 54-es glikozilációt viselő aszparagin mellett található, és valószínűsíthetjük, hogy a tripszin a nagy térkitöltésű oligoszacharidok miatt nem fért a lizinhez. Ez a probléma, bár igen gyakran előfordul, általában megnehezíti a glikoproteinek vizsgálatát. Szerencsére a peptidszekvenciát tömege alapján és tandem tömegspektrometriával is azonosítani tudtuk. A tömegmérés alapján javasolt glikopeptidek szerkezeteket MS/MS mérésekkel is igazoltuk. Példaként 18,4 percnél eluálódó, IV-TetraS3 szerkezetű és m/z 1286,6 (4+) tömegű glikopeptid ion MS/MS spektrumát látjuk a IV.9 ábrán. Mikor egy glikopeptidet CID körülmények között fragmentálunk, tipikusan a peptidhez kötődő GlcNAc és a hozzá kapcsolódó következő GlcNAc egység közötti kötés hasadásával egy karakterisztikus peptid+GlcNAc ion keletkezik [99, 100]. Ebből a peptid tömegét úgy kapjuk meg, hogy a GlcNAc egység tömegét (203,1) levonjuk a kérdéses ionból, és a kapott tömegből azonosítjuk a peptidet az elméleti triptikus fragmensek közötti kereséssel. Jóllehet számos hasadási út létezik, a fragmentáció mindig megáll a peptid+GlcNAc fragmentumnál, aminek tömegét könnyen azonosíthatjuk. A IV.9 Ábra felső, teljes tartományt bemutató MS/MS spektrumán az oligoszacharidokból származó mono-, di- és triszacharid diagnosztikus oxóniumionok dominálnak, megfeleltetve a GlcNAc (204,1), NeuAc-H2O (274,1), NeuAc (292,1), GalGlcNAc (366,1) és

NeuAc-Gal-GlcNAc (657,2) szerkezeteknek (tömegeknek). A

nagytömegű többszörösen töltött glikopeptid fragmensionok kisebb intenzitással jelentkeznek az m/z 1000-2100 tartományban. Az említett stabilabb (peptid+GlcNAc) iont meglehetősen nagy intenzitással m/z 1060-nál találjuk +2 töltéssel. A glikopeptid szénhidrát részei általában NeuAc (sziálsav) és NeuAc-Gal-GlcNAc triszacharid egység (ami megfelel egy sziálsavval növelt antennának) vesztéssel fragmentálódik, információt szolgáltatva az oligoszacharid összetételéről. A kromatogram összes glikopeptidre utaló csúcsát így elemeztük végig, és nagyszámú AGP glikopeptid szerkezetet azonosítottunk. Az eredményeket az 1. Táblázatban foglaltam össze.

75


C18, 300um, normal, 20 V cone, 5 V coll. E. AGP_121105_survey_b 84 (19.735) Sm (Mn, 3x1.00); Cm (82:102)

2: TOF MSMS 1287.18ES+ 257

100

Intenzitás, %

MSMS 1286.6(4+): IV 1, IV2- TetraS3

%

QDQCIYNTTYLNVQR

0 100

m/z 200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

2000

2100

C18, 300um, normal, 20 V cone, 5 V coll. E. AGP_121105_survey_b 84 (19.735) Sb (1,40.00 ); Sb (1,40.00 ); Sm (Mn, 3x1.00); Sm (Mn, 3x1.00); Cm (82:102)

2: TOF MSMS 1287.18ES+ 13.8

100

Intenzitás, %

pep

pep pep

pep

pep

%

pep

0

m/z 1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

2000

2100

m/z, amu

NeuAc,

Gal,

GlcNAc,

Man

IV. 9 Ábra A 18,4 percnél eluálódó IV-TetraS3 glikopeptid 1286,6 (4+) ionjának MS/MS spektruma

A vizsgálatból kiderült, hogy 8,8 percnél eluálódó glikopeptideket tartalmazó kromatográfiás csúcs (lásd IV.5b ábrán) kétfajta (II, V-ös pozíció), majdnem együtt eluálódó glikopeptid sorozatot tartalmaz, amelyek peptidrésze nagyon rövid és szerkezetileg hasonló. Ezen kromatográfiás csúcsból vett teljes tömegspektrum a IV.10 ábrán látható. A II. glikozilációs pozíciót tartalmazó peptid a [34-39] aminosav-szekvenciának felel meg, melynek tömege 795,3 Da, míg a V. glikozilációs helyet tartalmazó peptid a [84-90]-es fehérjerészlet 774,4 Da tömeggel.

76


I. glikozilációs pozíció 19,5 perc

21,3 perc

26,6 perc

28,7 perc

II. glikozilációs pozíció 8,8 perc

III. glikozilációs pozíció 42,8 perc

IV. glikozilációs pozíció 18,4 perc

18,4 perc

V. glikozilációs pozíció 8,8 perc

Glikánok BiS2 TriS1 TriS2 TriS2F1 TriS3 TriS3F1 TetraS3 ORM1 S/ORM2 A [5-20]cam TriS2 M=1752,98 TriS3 TriS3F1 ORM1 F1/F2 [8-24] BiS2 M=1779,01 TriS2 TriS2F1 TriS3 TriS3F1 TetraS3 ORM1 F1/F2 [5-24]cam TriS2 M=2124,41 TriS3 TriS3F1 [34-39] BiS2 M=795,34 TriS2 TriS3 TriS3F1 [40-63] (1 kihagyott hasítási hely) BiS2F1 M=2894,44 TriS2 TriS3 TriS3F1 TetraS2 TetraS3 TetraS3F1 TetraS4 TetraS4F1 ORM1 [69-83]cam TriS2 M=1914,89 TriS2F1 TriS3 TriS3F1 TetraS2 TetraS2F1 TetraS3 TetraS3F1 TetraS4 TetraS4F1 TetraS4F2 PentaS3 PentaS3F1 PentaS4 PentaS4F1 HexaS3 HexaS4 HexaS4F1 ORM 2 [69-83]cam TriS1F1 M=1919,86 TriS2 TriS3 TriS3F1 TetraS2 TetraS2F1 TetraS3 TetraS3F1 TetraS4 TetraS4F1 TetraS4F2 PentaS3 PentaS3F1 PentaS4 HexaS3 HexaS4 ORM1[84-90] TriS3 M=774,36 TriS3F1 TetraS2 TetraS2F1 TetraS3 TetraS3F1 TetraS4 TetraS4F1 TetraS4F2 PentaS3 PentaS4 HexaS4 Peptid szekvencia ORM1 S/ORM2 A [8-20] M=1408,66

Mért tömeg 1205,61(3+)/1807,07(2+) 1230,28(3+) 995,74(4+)/1327,35(3+) 1032,26(4+)/1376,07(3+) 1068,54(4+)/1424,41(3+) 1105,01(4+)/1473,11(3+) 1160,10(4+)/1546,39(3+) 1082,11(4+)/1442,41(3+) 1154,90(4+)/1539,49(3+) 1191,42(4+)/1588,24(3+) 997,30(4+)/1329,36(3+) 1088,60(4+)/1451,22(3+) 1125,11(4+)/1499,90(3+) 1161,42(4+)/1548(3+) 1197,96(4+)/1596,84(3+) 1252,74(4+)/1669,85(3+) 1174,95(4+)/1566,16(3+) 1247,71(4+)/1663,3(3+) 1284,22(4+)/1712,01(4+) 1001,36(3+) 1123,12(3+) 1220,16(3+)/915,32(4+) 1268,88(3+)/951,83(4+) 1312,98(4+) 1367,69(4+) 1440,44(4+)/1152,63(5+) 1476,97(4+) 1458,94(4+) 1531,66(4+)/1225,72(5+) 1568,40(4+) 1604,5(4+)/1283,99(5+) 1641,15(4+) 1122,83(4+)/1496,44(3+) 1159,19(4+) 1195,61(4+)/1593,45(3+) 1231,92(4+)/1642,24(3+) 1213,88(4+)/1618,2(3+) 1250,48(4+)/1666,75(3+) 1286,60(4+)/1715,44(3+) 1323,24(4+)/1764,04(3+) 1359,74(4+)/1812,63(3+) 1395,93(4+)/1861,11(3+) 1432,55(4+) 1377,94(4+)/1836,74(3+) 1414,53(4+) 1451,01(4+)/1934,38(3+) 1487,59(4+) 1469,22(4+) 1542,10(4+) 1578,50(4+) 1087,86(4+) 1123,82(4+)/1498,00(3+) 1196,60(4+)/1595,19(3+) 1233,12(4+))/1644,02(3+) 1215,14(4+) 1251,87(4+) 1287,88(4+)/1716,95(3+) 1324,45(4+)/1765,75(3+) 1360,71(4+)/1813,91(3+) 1397,47(4+) 1434,10(4+) 1379,46(4+) 1416,09(4+) 1452,03(4+) 1471,01(4+) 1543,86(4+) 1213,55(3+)/910,37(4+) 1262,21(3+) 1237,79(3+) 1286,53(3+) 1335,27(3+) 1383,89(3+) 1074,52(4+)/1432,37(3+) 1111,03(4+)/1481,10(3+) 1147,57(4+)/1529,73(3+) 1456,85(3+) 1165,82(4+)/1554,17(3+) 1257,08(4+)

Elméleti tömeg 1205,26(3+)/1807,39(2+) 1230,28(3+) 995,48(4+)/1326,97(3+) 1031,99(4+)/1375,66(3+) 1068,25(4+)/1424,00(3+) 1104,76(4+)/1472,69(3+) 1159,53(4+)/1545,71(3+) 1081,72(4+)/1141,97(3+) 1154,50(4+)/1539,00(3+) 1191,01(4+)/1587,89(3+) 997,19(4+)/1329,26(3+) 1088,47(4+)/1450,97(3+) 1124,99(4+)/1499,66(3+) 1161,25(4+)/1548,00(3+) 1197,76(4+)/1596,68(3+) 1252,53(4+)/1669,71(3+) 1174,58(4+)/1565,77(3+) 1247,35(4+)/1662,80(3+) 1283,87(4+)/1711,49(3+) 1001,04(3+) 1122,75(3+) 1219,78(3+)/915,088(4+) 1268,47(3+)/951,602(4+) 1312,32(4+) 1367,09(4+) 1439,86(4+)/1152,09(5+) 1476,38(4+) 1458,37(4+) 1534,14(4+)/1225,11(5+) 1567,66(4+) 1603,92(4+)/1283,34(5+) 1640,43(4+) 1122,20(4+)/1495,93(3+) 1158,71(4+) 1194,97(4+)/1592,96(3+) 1231,49(4+)/1641,65(3+) 1213,48(4+)/1617,63(3+) 1249,99(4+)/1666,32(3+) 1286,26(4+)/1714,67(3+) 1322,77(4+)/1763,36(3+) 1359,03(4+)/1811,71(3+) 1395,54(4+)/1860,39(3+) 1432,06(4+) 1377,54(4+)/1836,38(3+) 1414,05(4+) 1450,31(4+)/1933,42(3+) 1486,83(4+) 1468,82(4+) 1541,39(4+) 1578,11(4+) 1087,18(4+) 1123,44(4+)/1497,59(3+) 1196,21(4+)/1594,62(3+) 1232,73(4+)/1643,31(3+) 1214,72(4+) 1251,24(4+) 1287,50(4+)/1716,33(3+) 1324,01(4+)/1765,02(3+) 1360,27(4+)/1813,36(3+) 1396,79(4+) 1433,30(4+) 1378,78(4+) 1415,29(4+) 1451,56(4+) 1470,06(4+) 1543,09(4+) 1212,79(3+)/909,84(4+) 1261,47(3+) 1237,46(3+) 1285,15(3+) 1334,50(3+) 1383,18(3+) 1073,90(4+)/1431,53(3+) 1110,41(3+)/1480,22(3+) 1146,92(4+)/1528,90(3+) 1456,21(3+) 1165,19(4+)/1553,24(3+) 1256,46(4+)

1.Táblázat Rapigest SF-el denaturált, tripszinnel hasított AGP glikopeptidjeinek azonosított szerkezetei. cam: karbamido-metil csoport

77



8,8 perc

AGP_121105_survey 446 (9.204) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (444:446)

1: TOF MS ES+ 161

100

Intenzitás, %

II. és V. glikozilációs pozíció

%

V-TetraS44+

II-TriS33+

V-TetraS43+

NeuAc-GalGlcNAc+H +

V-TriS33+ V-TriS3F13+ II-BiS23+ 4+ 3+ II-TriS3 II-TriS2 V-TetraS33+

V-TetraS4F13+ II-TriS32+

0 200

m/z 300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

m/z, amu

IV. 10 Ábra A 8,8 perchez tartozó kromatográfiás csúcsból vett ESI-tömegspektrum, ami a II. és az V. glikozilációs pozíciót tartalmazó glikopeptidek sorozatát reprezentálja. A glikopeptidek szerkezetét elméleti molekulatömegük alapján, valamint MS/MS mérésekkel igazoltuk.

IV1, IV2IV1, IV2-TetraS4 TetraS34+

C18, 300um, normal, 20 V cone, 5 V coll. E. AGP_121105_survey 698 (18.521) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (697:700)

18,4 perc

100

4+ 1: TOF MS ES+ 291

IV1, IV2-TetraS34+


AGP_121105_normal 988 (18.397) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (985:992)

IV1 és IV2 glikozilációs pozíció

IV1, IV2TriS34+

TOF MS ES+ 883

100

%

0

m/z

Intenzitás, %

1286

1287

1288

1289

1290

1291

%

IV1, IV2TriS33+

IV1, IV2TetraS33+ IV1, IV2TetraS43+

0 200

m/z 300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

m/z, amu

IV. 11 Ábra A 18,4 perchez tartozó kromatográfiás csúcsból vett ESI-tömegspektrum, ami a IV (IV1 és IV2 a két variánsnak felel meg) glikozilációs pozíciót tartalmazó glikopeptidek sorozatát reprezentálja. A glikopeptidek szerkezetét elméleti molekulatömegük alapján, valamint MS/MS mérésekkel igazoltuk.

Tanulmányozva a 18,4 percnél eluálódó kromatográfiás csúcsot, újabb nehézségbe ütköztünk (IV. 11 Ábra). Ez a csúcs tartalmazta azokat a glikopeptideket, amelyek az AGP 78


IV. glikozileződési helyét viselik, ám ez a [69-83] peptidrészlet a két fő genetikai variánsban eltérő aminosavakat foglal magában, ami 4 Da tömegkülönbséggel jelentkezik. A két variáns általában kb. 2:1 intenzitásarányban volt jelen a spektrumokban, ahogy a IV.11 Ábra felső sarkában a IV1,IV2-TetraS3 glikopeptid esetében látszik (mivel +4 és +3 töltéssel voltak detektálhatók, a 4 Da különbség a +4 töltésű ionok esetében 1 tömegegység különbséget jelentett, és az izotópcsúcsok miatt nem váltak el egymástól). Ez az intenzitásbeli különbség azt sejteti, hogy a két genetikai variáns az ORM1 és ORM2 is kb. 2:1 arányban expresszálódik. Továbbá az is megfigyelhető, hogy a glikopeptid tartalmú csúcsok közül ez volt a legintenzívebb (IV.5b Ábra), és a belőle kapott tömegspektrumban már a glikopeptidek ionjai dominálnak (főként +4, +3 töltöttségű, tri- és tetraantennáris, nagy sziálsavtartalmú glikánokat tartalmazók). C18, 300um, normal, 20 V cone, 5 V coll. E.

MSMS 1161,4(4+)

AGP_121105_survey 599 (26.588) Sb (1,40.00 ); Sm (Mn, 3x1.00); Cm (592:621) 100

2: TOF MSMS 1161.86ES+ 56.9

IF1/F2(8-24)-TriS3

Pep

Pep

Pep

QIPLCANLVPVPITNATLDQITGK Pep Pep

Intenzitás, %

Pep

%

Pep

0

m/z 900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

2000

2100

m/z, amu NeuAc,

Gal,

GlcNAc,

Man

IV.12 Ábra A 26,6 percnél eluálódó IF1, F2(8-24)-TriS3 glikopeptid 1161,4(4+) ionjának MS/MS spektruma

Az AGP triptikus emésztményét az eddig tárgyalt módon elemezve, sikeresen megtaláltuk és azonosítottuk a II, III, IV és V glikozilációs helyeket tartalmazó glikopeptideket, nem úgy az I helyen glikozilált peptidet. Másrészről viszont a glikopeptideket jelző kromatogramon (IV.5b Ábra) számos, a karakterisztikus ionok szerint glikopeptidet tartalmazó, de tömegük alapján addig ismeretlen csúcsokat találtunk. Tömegük 79


meghatározása és kiegészítő a MS/MS analízisük után azt találtuk, hogy ezek a glikopeptidek tartalmazzák az I glikozileződési helyet (15-ös Asn-t). Az értékelés összetettsége ebben az esetben két tényezőből származott. Az első, az ismert genetikai polimorfizmus okozta különbség az I glikozilációs helyet tartalmazó peptidek között, ami miatt már a peptidek hossza sem egyforma, 4 aminosav eltérés tapasztalható (az [1-20] és [1-24] szekvenciák, megfelelnek az ORM1*S/ORM2*A és ORM1*F1/ORM1*F2 variánsoknak). Másodszor, olyan peptiddarabokra bukkantunk, amelyek azt mutatták, hogy az AGP mintánk két olyan polipeptid-szekvencia keveréke, amelyek N-terminális végéről négy, illetve hét aminosav hiányzik. Az N-terminális aminosavak hiányának eredetét, illetve okát nem tanulmányoztuk, csak valószínűsíteni tudtuk, hogy az AGP kereskedelmi eredete, esetleg kezelése közbeni szerkezetváltozás/degradálódás eredménye lehet. Az I glikozilációs helyet az N-terminális triptikus peptid tartalmazza, így vizsgálatunkban összesen négy darab ilyet találtunk, amelyeket a következőképp jelöltünk: I2(5-20), I1(5-24), I2(8-20) és I1(8-24). Az ezekhez tartozó glikopeptid csúcsok elég intenzíven jelentkeznek a IV.5b ábrán látható kromatogramon. MS/MS spektrumaik közül az IF1,

F2(8-24)-TriS3

fragmentációját mutatom be a IV.12 ábrán.

Ezen variánsok glikozilációs mintázata igen hasonló volt (1. Táblázat). Ezzel a módszerrel a glikopeptid tartalmú kromatográfiás csúcsokat, a bennük található komponensek szerkezeteit azonosítottuk, az AGP öt glikozilációs pozícióját maradéktalanul megtaláltuk, és összesen kb. 80 AGP glikopeptidet találtunk, amely kb. háromszorosa az irodalomban eddig találtaknak. Az eredményeket az 1. Táblázatban foglaltam össze. Az AGP emésztése és HPLC-MS analízise során tapasztalt anomáliák a komplex glikoproteinek vizsgálatára jellemzők és sokszor előfordulnak. Ennek okai lehetnek: egyrészt a kihagyott hasítási helyek, amelyeket a közeli nagy térkitöltésű oligoszacharidok takarnak el, másrészt a peptidláncot és a szénhidrát tartalmat érintő nagyfokú heterogenitás, valamint az együtt eluálódó komponensek. Az azonosított glikopeptidek relatív intenzitásait alapul véve, AGP glikozilációs mintázatának szemikvantitatív meghatározását is megkíséreltük, amit a 13. ábrán szemléltetünk. Amikor több genetikai variáns is képvisel egy glikozilációs helyet, például az I és IV pozíciók esetében, figyelembe véve azok glikozilációs mintázatának hasonlóságát, glikopeptidjeik relatív intenzitásait átlagoltuk.

A bemutatott eredmények jó egyezést

mutatnak a korábban tapasztaltakkal [40, 72, 74], amelyek például az I és II pozíciókban a kisebb elágazottságú, míg a III és IV és V helyzetben a nagyobb számú elágazást (antennát) tartalmazó oligoszacharidok jelenlétét javasolja. Eredményeink szerint az I és a II glikozilációs helyek oligoszcharid eloszlása nagyon hasonló, ahol a TriS3 triantennáris glikán 80


van jelen a legnagyobb arányban. A III és IV pozíció már egész más eloszlást mutat, itt a tetraantennáris oligoszacharid szerkezetek (TetraS3 és TetraS4) uralkodnak. Az V helyzetben pedig a TetraS4

dominál. Az egy vagy két GlcNAc-Gal egységgel (antennával)

meghosszabbított, nagyfokú elágazottságot eredményező szerkezetek a IV és V pozícióban jelennek meg. Az AGP itt bemutatott, kapcsolódási hely szerinti specifikus glikozileződése kapcsolatban lehet például a háromdimenziós szerkezetével (egyes glikoziláló enzimek korlátozottan férnek a polipeptidlánc egyes szakaszaihoz). A kapcsolódási hely szerinti specifikus glikoziláció befolyásolhatja az AGP biológiai funkcióját vagy akár a szervezet patofiziológiai állapotára is utalhat.

81


70

I.Glikozilációs pozíció

Rel.intenzitás, %

60 50 40 30 20 10 0

60

II. Glikozilációs pozíció

Rel. Intenzitás, %

50

40 30 20

10 0 30

III. Glikozilációs pozíció

Rel. Intenzitás, %

25 20 15 10 5 0

25

IV. Glikozilációs pozíció

Rel. Intenzitás, %

20

15 10

5 0 50

V. Glikozilációs pozíció

Rel. Intenzitás, %

40

30

20

10

HexaS4

HexaS4F1

HexaS3

PentaS4

PentaS4F1

PentaS3

PentaS3F1

TetraS4F2

TetraS4

TetraS4F1

TetraS3

TetraS3F1

TetraS2

TetraS2F1

TriS3

TriS3F1

TriS2

TriS2F1

TriS1

TriS1F1

BiS2

BiS2F1

0

IV.13 Ábra Az AGP öt glikozileződési pontján a különböző glikánok relatív intenzitásai. Ha egy glikozileződési helyzetben a glikopeptid több genetikai variánsa is előfordul, a relatív intenzitásaikat átlagoltuk.

82


IV.4.2 Humán szérum AGP oligoszacharidjaink MALDI-TOF MS és statisztikai vizsgálata tumoros és egészséges mintákban

Számos, közelmúltban napvilágot látott tanulmány és vizsgálat utal arra, hogy a plazmában található glikoproteinek oligoszacharid-szerkezetének változásai (elágazottság, fukóz-, sziálsavtartalom változása) összefüggésbe hozhatók különböző fiziológiás és/vagy kóros folyamtokkal. Munkánk során célunk volt MALDI-TOF tömegspektrometriás módszerrel azokat a változásokat kimutatni, amelyek a szérum AGP glikánszerkezetében egyes daganatos megbetegedések (ováriumtumor, limfoma) hatására következnek be.

A

munka szoros kutatói együttműködés keretében készült. Az AGP minták szérumból történő kinyerése, tisztítása valamint PNG-áz F enzimes emésztése és származékolása az Országos Onkológiai Intézet Biokémiai Osztályán zajlottak, míg csoportunk a tömegspektrometriás méréseket és értékelést végezte. Munkánk során különböző tumoros betegségekben (ováriumdaganat, limfóma) szenvedő egyének és egészséges kontrollok szérumából izolált, PNG-áz F enzimmel hasított AGP minták oligoszacharid szerkezetét vizsgáltuk. Ezeknek a rákbetegségeknek egyelőre nincs jól használható markere, még az ováriumtumorra használt CA125 is elég gyenge specificitással rendelkezik, ezért önmagában nem igazán alkalmas markernek. Emiatt egyre nagyobb igény merül fel ezen a területen is a megfelelő specifitással rendelkező biomarkerek felkutatásának [101]. IV.4.2.1 Humán szérum AGP N-glikánjainak MALDI-MS vizsgálata A szérum AGP-t, valamint annak származékolt és tisztított N-glikánjait 12 egészséges és 31 tumoros (16 ováriumtumor, 15 limfóma) betegből az Országos Onkológiai Intézet Biokémiai Osztálya állította elő számunkra. Az antranilsavas származékképzésre elősorban az Onkológi Intézet által végzett HPLC vizsgálatokhoz volt szükség (érzékenyebb fluorimetriás detektálhatóság céljából), azonban azt tapasztaltuk korábbi MS mérések során (és az irodalomban is ez áll), hogy a 2-aminobenzoesavval történő reduktív aminálás után jelentősen megnőtt a glikánok ionizálhatósága MALDI-TOF körülmények között. A derivatizált oligoszacharidok MALDI-TOF analízisét pozitív és negatív módban is elvégeztük. A „hotspot” jelenség nem volt jellemző, a kristályok felületéről megfelelő minőségű spektrum volt felvehető.

83


6000

[TriS3F1 + Na] +

Intensity, cps

5000 Pozitív ionizáció

a BiS2

[TriS3F1-H+2Na] + 3000

[TriS3F1-2H+3Na]+ 2000

8000

cps Intensity, cps Intenzitás,

4000

1000

TriS3F1

6000

0 TriS3 2900

3000

3100

3200

3300

m/z, amu 4000

TriS2F1 TriS2

BiS1

TetraS4 TetraS3F1

BiS2F1

TetraS3

2000

TetraS4F1 TetraS4F2

0 1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

m/z, amu

Negatív ionizáció 3000

b

PentaS4 HexaS3 PentaS4F1

HexaS4F1 HexaS4

BiS2 TriS3F1 TriS3

50000

Intensity, cps Intenzitás, cps

HexaS4F2

PentaS4F2

60000

4000

40000

4250

4500

4750

m/z, amu

30000

TetraS4 TriS2F1 TriS2

20000

BiS1

TetraS3F1

TetraS4F1

TetraS3

BiS2F1

TetraS4F2

10000

0 1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

m/z, amu

:NeuAc,

:Gal,

:GlcNAc,

: Man,

: Fuc

IV.14 Ábra Limfómás betegekből származó AGP oligoszacharidok a) pozitív ionizációs módban, ill. b) negatív ionizációs módban felvett MALDI-TOF-MS spektrumainak összehasonlítása

Pozitív módban, az N-glikánok egyszeresen töltött Na-adduktjai ([M+Na]+) jelentek meg legintenzívebben. (Megjegyzésként említem, hogy a mintában akár igen kis mennyiségben található só szennyezők is elegendőek ezen ionok képződéséhez. Köztudott, 84


hogy a szénhidrátok fémionaffinitása igen nagy, ezért általában nem protonaddicíóval, hanem Na+, NH4+ illetve K+ ion felvételével ionizálódnak, nemcsak MALDI, hanem elektrospray körülmények között is.) Savas karakterű oligoszacharidok esetében, több nátriumion is kapcsolódhat a glikánokhoz, ami [M+Na]+, [M-H+2Na]+, [M-2H+3Na]+ stb. adduktionok sorozatát eredményezi. Tapasztalataink szerint ezekben legfeljebb annyi Na+ ion kapcsolódhat az oligoszacharidokhoz, ahány savas cukor (sziálsav) található a láncvégeken. Példaként egy tipikus, pozitív módban felvett MALDI-MS felvételt láthatunk a IV.14 Ábra felső részén, amin egy limfómás betegből származó AGP minta antranilezett glikánjainak spektrumát mutatom be. Összehasonlításként ugyanennek a mintának a negatív ionizációs módban felvett spektrumát látjuk a IV.14 Ábra alsó részén. Ebben az esetben a letisztultabb és intenzívebb csúcsokat kaptunk, ami minden esetben [M-H]- ionokat jelent. Nátriummal képzett adduktionjaik is megjelenhetnek [M+nNa-(n+1)H]- formában, amelyek intenzitása lényegesen kisebb a pozitív spektrumon tapasztalt klaszterekkel szemben. Ezért a negatív módban mért spektrumok értékelése egyszerűbb és pontosabb. A spektrumok értékelésénél az egyes molekulaionok intenzitásához a hozzátartozó adduktionok intenzitásait is hozzáadtuk (ahogy az a kísérleti részben szerepel). A MALDI-TOF-MS vizsgálatok során a kapott spektrumokból az N-glikánok szerkezetét molekulatömegük alapján azonosítottuk. Később MS/MS felvételeket is készítettünk a szerkezetek bizonyítására (ESI-QTOF nagyfelbontású készüléken). Az Nglikánok elnevezése az előző, gikopeptides témakörben ismertetett, Dage és munkatársai [39] által javasolt nomenklatúra alapján történt. Penta és Hexa elnevezést akkor használtunk, amikor a tetraantennáris szerkezetek antennáinak végeire további, egy illetve kettő laktózamin (Gal-GlcNAc) egység kerül. A MALDI-MS spektrumok értékeléséből a legtöbb mintában összesen 34 különböző glikánszerkezetet azonosítottunk; valamint néhány további szerkezet is előfordult egyes esetekben

kis

intenzitással, ezekkel

azonban nem

foglalkoztunk. Az

azonosított

komponensek, negatív és pozitív módban megjelenő (legintenzívebb) molekulaionjainak elméleti tömegei, valamint relatív intenzitásaik a 2. Táblázatban találhatók.

85


Molekulatömeg (antranilsavas derivatizálás után) Glikán szerkezetek

Glikánok jelölése Bi BiS1 BiS1F1 BiS2 BiS2F1 Tri TriS1 TriS1F1 TriS2 TriS2F1 TriS3 TriS3F1 TriS3F2 TetraF1 TetraS1 TetraS1F1 TetraS2 TetraS2F1 TetraS3 TetraS3F1 TetraS4 TetraS4F1 TetraS4F2 PentaS2 PentaS3 PentaS3F1 PentaS4 PentaS4F1 PentaS4F2 HexaS3 HexaS3F1 HexaS4 HexaS4F1 HexaS4F2

negatív módban [M-H]1761,64 2052,90 2199,04 2344,16 2490,30 2126,98 2418,23 2564,38 2709,49 2855,64 3000,75 3146,89 3293,04 2638,46 2783,57 2929,71 3074,83 3220,97 3366,09 3512,23 3657,35 3803,49 3949,63 3440,17 3731,43 3877,57 4022,68 4168,83 4314,97 4096,76 4242,91 4388,02 4534,16 4680,31

:NeuAc,

:Gal,

pozitív módban [M+Na]+ 1785,64 2076,89 2223,04 2368,15 2514,30 2150,97 2442,24 2588,38 2733,49 2879,63 3024,75 3170,89 3317,03 2662,45 2807,57 2953,71 3098,83 3244,97 3390,09 3536,23 3681,34 3827,49 3973,63 3464,17 3755,42 3901,57 4046,68 4192,82 4338,97 4120,76 4266,90 4412,02 4558,16 4704,30

:GlcNAc,

Negatív ionizációval mért glikánok átlagolt relatív intenzitásai

1,49 10,41 0,59 17,56 1,65 1,74 7,07 2,69 10,91 3,78 14,07 5,75 0,07 0,54 3,13 0,69 4,49 0,91 5,11 1,54 2,96 1,25 0,27 0,27 0,28 0,02 0,23 0,12 0,04 0,14 0,01 0,14 0,04 0,04

ováiumtumor 0,65 11,94 1,19 26,17 2,08 0,57 3,74 2,19 7,98 6,45 10,08 8,59 0,14 0,40 0,95 0,35 2,22 1,45 3,63 2,84 2,72 1,94 0,67 0,11 0,15 0,07 0,16 0,13 0,08 0,19 0,02 0,08 0,03 0,01

: Man,

: Fuc

normál

Pozitív ionizációval mért glikánok átlagolt relatív intenzitásai

limfóma

normál

0,26 8,37 0,98 26,17 2,23 0,44 2,63 1,67 7,29 5,81 13,27 10,97 0,19 0,26 0,44 0,27 1,82 0,94 4,16 3,03 3,87 2,84 1,00 0,14 0,07 0,02 0,16 0,17 0,10 0,25 0,00 0,08 0,04 0,05

7,15 9,16 0,45 16,20 2,91 5,92 6,28 2,50 9,60 2,90 12,42 4,60 0,07 1,17 3,18 0,50 3,48 0,72 4,55 1,32 2,18 0,57 0,15 0,24 0,34 0,01 0,29 0,05 0,20 0,30 0,09 0,25 0,05 0,24

ováriumtumor 6,13 10,16 0,78 23,35 1,92 2,21 1,94 1,77 6,62 5,25 10,96 9,66 0,11 0,64 0,73 0,18 1,17 0,92 4,02 2,98 3,62 2,90 1,01 0,01 0,01 0,01 0,08 0,15 0,07 0,26 0,01 0,14 0,02 0,20

limfóma 5,16 10,67 0,93 22,36 1,82 1,98 2,63 2,35 7,10 5,56 11,02 8,76 0,15 0,47 0,75 0,21 1,46 0,88 4,31 3,13 3,78 2,60 0,92 0,00 0,00 0,00 0,12 0,18 0,10 0,22 0,00 0,16 0,03 0,17

2.Táblázat Normál kontroll, ováriumtumoros és limfómás betegekből származó AGP glikánok pozitív és negatív ionizációval mért molekulaionjainak tömege valamint átlagolt relatív intenzitásai.

Az azonosítás elsősorban molekulatömeg alapján történt, az oligoszacharidok sztereokémiai

viszonyait, elágazottságát,

fukózkapcsolódási

helyét

nem

vizsgáltuk.

Eredményeink megbízhatóságát néhány mintán elvégzett pontos tömeg és MS/MS méréssel igazoltuk. A pontostömeg mérése során a mért tömegek 5 ppm pontossággal egyeztek az elméleti tömeggel; míg a tandem MS/MS mérések során a várt, jellegzetes cukoregységek és antennák hasadását tapasztaltuk. A 2. Táblázatban megtaláljuk továbbá az egészséges, limfómás és ováriumtumoros mintákból származó, mért oligoszacharid csúcsok átlagolt relatív intenzitásait. Az egyszerűség és áttekinthetőség kedvéért, valamint, hogy lehetővé váljon a minták összehasonlítása, az adott mintában található glikánok összintenzitásást 100%-nak vettük. Az eredmények reprodukálhatósága több tényezőből tevődik össze. A spektrumok (csúcsok relatív intenzitásainak) szórása rendkívül nagy még egy csoporton belül is (lásd pl. a IV.14b és IV.15c ábrán két limfómás beteg spektruma). 86


TriS3

BiS2

Normál kontroll

40000

intensity, cps

Intenzitás, cps

35000

a)

30000

TriS3F1

25000 20000

TriS2

TetraS4

TetraS3

15000 TriS2F1

BiS1

TetraS4F1

TetraS2 TetraS3F1

10000 BiS2F1

TetraS4F2

5000 0 1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

m/z, amu 35000

BiS2

b)

Ováriumtumor

intensity, cps

Intenzitás, cps

30000 25000 TriS3 TriS3F1

BiS1

20000 15000

TriS2 TriS2F1

TriS1F1 BiS2F1 TriS1

10000

TetraS2

BiS1F1

TetraS4 TetraS3 TetraS3F1 TetraS4F1

5000 0 1500

TetraS4F2

2000

2500

3000

3500

4000

4500

m/z, amu BiS2

intensity, cps

Intenzitás, cps

50000

Limfóma

c)

40000 TriS3F1 TriS3

30000

BiS1 TriS2F1 TriS2

20000

TetraS3 TetraS4 TetraS3F1

TriS1F1 BiS2F1

TetraS2

TetraS4F1

10000

0 1500

TetraS4F2

2000

2500

3000

3500

4000

4500

m/z, amu

:NeuAc,

:Gal,

:GlcNAc,

: Man,

: Fuc

IV.15 Ábra a) Egészséges kontrollból, valamint b) ováriumtumoros és c) limfómás betegből származó AGP oligoszacharidok negatív ionizációval kapott MALDI-MS spektruma

A három csoport (ováriumtumor, limfóma, egészséges kontroll) közötti, MS eredményeken alapuló eltérések reprezentálására három jellemző MALDI spektrumot mutatok be a 15. ábrán. Ha összehasonlítjuk a IV.14b és IV.15c ábrán található spektrumokat, 87


ahol két limfómás eset AGP glikáneloszlása látszik, szembetűnőek az individuális különbségek (az oligoszacharidok intenzitásait tekintve). Ez az egyének közötti, jelentősen nagy variabilitás is rámutat további, statisztikai értékelések szükségességére, amely mindezeket figyelembe véve megbízhatóan képes különbségeket tenni a különböző patofiziológiás csoportok között. A kapott eredményeinkből az alábbi következtetéseket vonhatjuk le: (1) Mindegyik mintában nagyszámú komplex glikán szerkezetet azonosítottunk. Mindezek jó egyezést mutattak a korábbi megfigyelésekkel [71, 83] amelyek az AGP oligoszacharidjainak igen nagyfokú heterogenitására utalnak. (2) A spektrumokon a BiS2 glikán dominált minden esetben (2.Táblázat), és ennek a komponensnek a relatív intenzitása tumoros mintákban meg is növekedett (átlagban majdnem 50%-kal). Tumoros esetekben a fukozilált oligoszacharidok intenzitása emelkedett leginkább a tri- és tetraantennáris szerkezetek esetében (TriS2F1, TriS3F1, TriS3F2, TetraS3F1, TetraS4F1, és TetraS4F2) (3) Penta és Hexa típusú, vagyis a láncvégeken meghosszabbított glikánokat (NAclaktózamin,

Gal-GlcNAc

egységekkel

növelt)

is

észletünk,

amelyek

az

átlagos

glikoproteinekben nem fordulnak elő. Noha kis intenzitással, de mindegyik spektrumban szerepeltek ezek a komponensek. (4) Más glikoproteinre jellemző, további nagy-mannóztartalmú vagy hibrid típusú oligoszacharidokat nem észleltünk. (5) A sziálsavas glikánok glikozilációs mintázata pozitív és negatív módban – néhány kivételtől (Bi, Tri, TetraF1) eltekintve – hasonlónak tekinthető. Megjegyzésként, a pozitív és negatív ionok intenzitásainak nem szükséges egyformának (vagy hasonlónak sem) lenni. Ez a kvalitatív egyezés is azt sugallja, hogy a diszkrimináló hatásoknak, amelyek rendszerint eltérnek pozitív és negatív ionizáció során, nincs jelentős befolyásoló hatása a relatív intenzitásokra. Ez pedig maga után vonja azt is, hogy a táblázatban szereplő relatív intenzitás adatok nem különbözhetnek jelentősen az adott glikánok koncentrációarányaitól. Bár, fontos hangsúlyozni, hogy a tömegspektrumokon mért intenzitásarányokat nem lehet teljesen megfelelteni a valós koncentrációarányoknak. A következőkben, elsőként a negatív módban kapott adatokkal dolgoztunk, segítségükkel hasonlítottuk össze a csoportokat. A pozitív módban mért adatokat feldolgozva, hasonló eredményeket értünk el, de azokról a dolgozat keretein belül nem esik szó.

88


IV.4.2.2 Fukozilációs- és antenna-index Korábbi glikozilációs vizsgálatok azt mutatták ki, hogy a fukoziláció valamint a glikánok elágazottságának mértéke összefüggésbe hozható egyes patofiziológiás állapotokkal [76, 79]. Rydén és munkatársai az AGP fukozilációjának tanulmányozása során lektin immun-affinitási vizsgálatokon alapuló, ún. AGP fukozilációs indexet vezetett be (fukozilált AGP koncentrációja/AGP szérumkoncentráció), amit májzsugorodásban szenvedő betegek AGP fukoziláltsági mértékének jellemzésére, illetve diagnosztikus próbaként történő bevezetésére használták [80]. Ennek analógiájára, mi is bevezettünk egy tömegspektrometriás eredményeken alapuló fukozilációs indexet, hogy ily módon, más megközelítésből is jellemezhessük az eddig tárgyalt (két rákos csoport, egy egészséges kontroll csoport) mintáinkat. A fukozilációs index (FucMS) megadja az egyes oligoszacharidok átlagos fukóztartalmát. Számítása a 2. Táblázat adataiból az alábbi képlet alapján történt:

1xGlikánF1+ 2xGlikánF2 FucMS = Glikán



(1.)

ahol a GlikánF1 jelöli azoknak az oligoszacharidoknak a szumma (relatív) intenzitását, amelyek egy darab fukózt, a GlikánF2 pedig amelyek kettő darab fukózegységet tartalmaznak. A ΣGlikán az összes oligoszacharid csúcs összegzett relatív intenzitását jelöli (esetünkben a normalizálás miatt ez 100).

Fuc MS eloszlása Átlagolt Fuc MS <0,15 0,15-0,22 0,22-0.29 0,29-0,36 >0,36 0,204 3 3 6 0 0 Egészséges 0,295 0 3 5 5 3 Ováriumtumor 0,319 0 1 4 4 6 Limfóma Fuc MS

3.Táblázat Az AGP oligoszacharidok relatív intenzitásaiból (az 1.egyenlet alapján) számított fukózindexei (FucMS). A táblázat bemutatja a három csoporthoz (egészséges, ováriumtumoros, limfómás) tartozó átlagolt értékeket, valamint az individuális fukózindexeik szerinti eloszlásokat.

Az általunk vizsgált egyedi mintákban a fukózindex értéke 0,07 és 0,46 között volt. Az egyes csoportok mintáinak fukózindex értékeit átlagoltuk, amit a 3. Táblázatban foglaltuk össze. A fukoziláció mértéke (átlagolt FucMS) egészséges kontroll csoportban a 89


legalacsonyabb (0,204) és jelentősen nagyobb ováriumtumoros (0,295) és limfómás esetekben (0,319).

Ez jó egyezést mutat azokkal az megfigyelésekkel, amelyek a daganatos

megbetegedések során történő fukoziláció mértékének növekedését írták le [75]. Az eredmények jelentős szórást mutatnak az egyedi minták között, ezért a kapott FucMS intervallumot öt tartományra osztottuk (0,07 egység különbségekkel), a mintákat pedig ezen csoportokba osztottuk (3. Táblázat). Jelentős átfedés tapasztalható az egészséges és tumoros csoportokban, de az is megfigyelhető, hogy például azok, akiknek nagyobb a fukózindexük (pl. több mint 0,29) nagyobb valószínűséggel tartoznak a daganatos csoportba, mint például akiknek a fukózindex értéke alacsony (például kisebb, mint 0,22), amelyek nagyobb valószínűséggel egészségesek. Bár az általunk bevezetett fukózindex (FucMS) mutat egy kisebb diszkrimináló jelleget, önmagában azonban valódi diagnózisra nem alkalmas. A fukózindex analógiájára „antenna” indexet is (BraMS, branching index) definiáltunk, ami az AGP oligoszacharidok elágazódásának mértékére jellemző, és az átlagos antennaszámot foglalja magába. Számítása a 2.Táblázat értékei alapján a következő képlettel történik:

"Bi" 2+"Tri" 3+"Tetra" 4+"Penta"5+"Hexa"6 Glikán BraMS = (2.)



ahol Bi, Tri, Tetra, Penta és a Hexa stb. bi-, tri- stb. antennáris szerkezetek intenzitásainak összegét jelenti, míg a ∑Glikán a mintában található összes glikán összintenzitása (esetünkben a 2. Táblázatban található relatív intenzitások összege 100). Az antennaindex (BraMS) értéke 2,6–3,1 volt, az egyes csoportokra számított átlagértéküket a 4.Táblázatban találjuk.

Bra MS

Átlagolt BraMS

Egészséges Ováriumtumor Limfóma

2,923 2,777 2,833

<2,7 0 3 2

BraMS eloszlása 2,7-2,8 2,8-2,9 2,9-3,0 1 4 5 5 6 2 3 5 4

>3,0 2 0 1

4.Táblázat Az AGP oligoszacharidok relatív intenzitásaiból (a 2. egyenlet alapján) számított antennaindexei (BraMS). A táblázat bemutatja a három csoporthoz (egészséges, ováriumtumoros, limfómás) tartozó átlagolt értékeket, valamint individuális antennaindexeik szerinti eloszlásokat.

90


Az előzőekhez hasonlóan ezt az intervallumot is öt tartományra osztottuk, és a mintákat eszerint osztottuk fel. Az egészséges és a limfómás csoport nagyon hasonló eredményt hozott, azonban az ováriumtumor esetében kisebb értékeket tapasztaltunk. A fukózindexhez hasonlóan, az antenna index értéke nagymértékben függhet patofiziológiás állapotoktól, azonban gyakorlati alkalmazhatósága, mint betegség marker, csak korlátozott.

IV.4.2.3 Az AGP oligoszacharid eloszlásának lineáris diszkriminancia vizsgálata Az előzőekben meghatározott fukóz- és antennaindex egyszerű paraméterek az oligoszacharid-mintázat jellemzésére. Az összes adat (a 34 glikoforma relatív intenzitása) figyelembevétele azonban meglehetősen komplex feladat, értelmezéséhez érdemes tehát valamilyen kemometriás/statisztikai módszert alkalmazni. Napjainkban a potenciális biomarkerek kutatása nagymértékben támaszkodik statisztikai analízisekre. A tömegspektrometriás mérések (és egyéb technikák, például NMR, IR spektroszkópia, HPLC) által szolgáltatott nagymennyiségű adatot többnyire valamilyen kemometriás módszerrel értékelik [67, 102], amelyek közül a lineáris diszkrimancia analízist (LDA) választottuk. Az LDA ilyen célból történő alkalmazása igen gyakori. Az LDA egy ún. felügyelt alakfelismerési módszer, ami azt jelenti, hogy a csoportokat ismerjük az analízis előtt. Kiszámítja a különböző osztályokhoz tartozás valószínűségét és olyan diszkrimináló teret (lineárisan korrelálatlan új tengelyek által kifeszített tér) keres, ahol az osztályok a lehető legjobban elkülönülnek egymástól, majd megbecsüli, hogy egy új objektum melyik osztályba tartozik a legnagyobb valószínűséggel. A módszer tulajdonképpen a főkomponenselemzéshez (Principal Component Analysis, PCA) hasonlít. A PCA szintén egy adatstrukúraelemző módszer, melynek során az eredetileg korrelált független változók lineáris kombinációiként új korrelálatlan független változókat hozunk létre. Az új független változókat nevezzük főkomponenseknek. Az LDA tehát szintén az eredeti független változók helyett azok lineáris kombinációit használja fel arra, hogy létrehozza a diszkrimináló teret, és az egyes csoportok közti varianciát igyekszik maximalizálni. Így jutunk az ún. kanonikus változókhoz (az eredeti változók lineáris kombinációi), amelyek értékeit root-oknak nevezzük, és számuk eggyel kevesebb a csoportok számánál. Az első kanonikus változónak van a legnagyobb szerepe az osztályok elkülönítésében, a másodiknak a második legnagyobb, stb. Az LDA-t arra is használják, hogy felismerje, melyek azok a változók, amelyek a 91


leginkább felelnek a csoportok közti különbségekért (változó kiválasztás). A módszerrel továbbá az ismert (tanuló vagy tréning) objektumokból egy olyan modell építhető, amelynek segítségével egy előrejelzést tehetünk az ismeretlen mintákra, esetekre. A helyesen besorolt objektumok aránya (%-ban kifejezve) mutatja az osztályozás hatékonyságát. Hogy a kapott modell előrejelzésre is alkalmazható legyen, az eredmények validálása (kereszt-ellenőrzése) szükséges. A MALDI-TOF MS analízisek során meghatározott és azonosított 34 glikán relatív intenzitását a 2. Táblázat tartalmazza. Az LDA modell számításánál a pozitív és negatív módban mért relatív intenzitásokkal számoltunk. Ez a 34 glikán intenzitás (adott egyéneknek megfelelve) alkotta a változókat; a betegcsoportok (egészséges, limfómás és ováriumtumoros) pedig az osztályokat definiálták. Összesen 43 különböző esetből (12 egészséges önkéntes, 15 limfómás és 16 ováriumtumoros beteg) származó minta MALDI-MS eredményeit értékeltük LDA-val. A LDA első lépéseként a változók nagy számát (43 mintához 34 változó) kellett lecsökkenteni, hogy elkerüljük az esetleges túlillesztés lehetőségét. Ezt azzal küszöböltük ki, hogy megvizsgáltuk, hogy a dimenzionalitás (d, ami a változók számával egyenlő) túllépi -e a (n-g)/3 tört értékét, ahol n az esetek száma (itt 43) és g a csoportok száma (itt 3) [103]. Esetünkben ennek a törtnek az értéke 14.3, tehát a modellben tartott változók számának ennél kell kisebbnek lennie. Másrészről szándékunk is volt azoknak a változóknak a kiválasztása, amelyek a csoportok elkülönüléséért felelősek. Ezt a szelektálást az ún. lépésenkénti előreirányuló változóbevonással (forward stepwise variable selection) hajtottuk végre. Ebben a funkcióban a program (STATISTICA) lépésről lépésre történő változóbevonással építi a modellt. (Mindegyik lépésben megvizsgálja a modellben lévő változókat, becslést tesz, hogy ezek közül melyek azok, amelyek a csoportok közötti diszkriminációhoz legjobban hozzájárulnak. Ezeket a változókat a modellben tartja, és továbbmegy a következő lépésre, újabb változót von be, átvizsgálja a kapott modellt stb.) Ezzel a módszerrel a bevitt adatainkból a program hét változót (glikánstruktúrát) választott ki, amelyek a hozzájuk tartozó F-értékeikkel legyütt az 5. Táblázatban találhatók. A számítógépes program által felsorolt eredmények (változókhoz számolt különböző paraméterek) közül mi az F-hányadosokat (Fisher) vettük figyelembe. (A Fisher (F) értékek az osztályok közötti és az osztályokon belüli variancia hányadosát jelenetik, és nagyságuk tájékoztat bennünket az osztályok közötti különbséget leginkább magyarázó változók kilétéről).

92


Glikánok Fisher (F) érték TetraS3 3,445 TetraS4 4,880 TetraS4F1 8,231 PentaS3F1 9,819 PentaS4F2 4,836 HexaS3F1 4,393 HexaS4F1 4,191 5. Táblázat A 7/34 LDA módszer változókiválasztás (forward stepwise variable selection) során kapott hét változója, a hozzátartozó F-értékekkel.

Ha megnézzük a szelektált változókat, láthatjuk, hogy a program a nagyobb elágazottságú, Tetra, Penta, és Hexa-antennás, magas sziálsavtartalmú, többnyire fukozilált szerkezeteket

tartotta

következtetéseket

bent

a

modellben.

természetesen

nem

Eredményünkből

vonhatunk

le

(pl.

messzemenő egy-egy

biológiai

kiválasztott

glikánszerkezethez bármilyen funkció/marker jelleg kötése). Ezt egyrészt a kis mintaszám, másrészt a szelektált glikánok (a Tetrákat kivéve) kis intenzitása, ill. nem túl megbízható meghatározása miatt sem tehetjük meg. Azonban korábbi megfigyelésekkel, irodalmi adatokkal

összehasonlítva

óvatos

konklúziókat

tehetünk.

Ezek

szerint

tumoros

megbetegedések esetén emelkedett fukóz-, és sziálsavtartalmat [71] Lewis X antigén megjelenését tapasztaltak, ami eredményeinkkel összevethető. A kiválasztott 7 oligoszacharid elágazottságának mértékével (lehetséges Lewis X antigén beépülés), és a nagyobb sziálsavtartalom megjelenésével (előző következménye is lehet) beleillik az eddig tapasztaltak sorába. Az így kapott modellt következetesen 7/34 módszernek neveztük el. Látható, hogy a kiválasztott változók száma jóval a túlillesztés elkerülése érdekében javasolt dimenzionalitás alatt van, ami növeli annak a megbízhatóságát, hogy a kapott eredmény “valós”. A három csoport (normál kontroll, ováriumtumoros, limfómás) AGP glikánjainak MALDI-MS-el meghatározott adatain (relatív intenzitásain) végzett LDA eredményét a IV.16 Ábrán láthatjuk.

93


4 Egészséges kontroll Ovárium tumor Limfóma

3

ROOT 2

2

1

0

-1

-2

-3 -5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

ROOT 1

IV.16 Ábra A diagram a 7/34 LDA módszer alkalmazásának erdeményeként kapott 43 egyedi minta (egészséges, ováriumtumoros, limfómás) AGP oligoszacharidjaik relatív intenzitásán alapuló elkülönülését ábrázolja

A kanonikus változók (más néven root-ok, itt a hét kiválasztott változó lineáris kombinációi) egymás függvényében történő ábrázolása szemléletes képet ad a három csoport elkülönülésére. Jól látható, hogy a normál kontroll és a tumoros betegek pontjai jól elválnak egymástól, amelyekért az első root (root1) a felelős; míg a két daganatfajta csoportjai, – bár tapasztalunk kisebb átfedést az ovárium daganatos és a limfómás esetek között– de a második (root2) mentén szintén jól elkülönünek. Az ábrán látható csoportosítás számszerű eredményét, vagyis a klasszifikációs mátrixot a 6. Táblázat (felső része) tartalmazza. A módszer a minták 88,4%-át

helyesen

csoportosította

(ami

az

egész

adatmátrixra

vonatkozó,

teljes

klasszifikáció). Az egyes csoportokat tekintve, az egészséges kontrollcsoportra ez 100%, a limfómás esetekre nézve 86,7% míg az ováriumtumoros mintákra 81,2%-os volt a klasszifikáció. A hibás osztályba sorolások a daganatos esetekben történtek. Az ováriumtumoros mintákból 3 darabot a limfómásokhoz sorolt; 2 limfómás estet viszont az ováriumtumorosokhoz klasszifikált.

94


Csoportok Egészséges Ováriumtumor Limfóma Összesen

Csoportok Egészséges Ováriumtumor Limfóma Összesen

Minták száma 12 16 15 43

Klasszifikáció (%) 100,0 81,3 86,6 88,4

osztályozott csoportok Egészséges Ováriumtumor Limfóma 12 0 0 0 13 3 0 2 13 12 15 16

Klasszifikáció (%) 92,9 74,3 71,4 79,5

előrejelzett (teszt) csoportok Egészséges Ováriumtumor Limfóma 26 1 1 0 26 9 3 7 25 29 33 35

6. Táblázat Az AGP oligoszacharidok MALDI-TOF MS-el vizsgált eredményeinek LDA klasszifikációs mátrixa. A táblázat tartalmazza továbbá a módszer előrejelzőképességét mutató (keresztvalidálás után kapott) klasszifikációs mátrixot is.

A 7. Táblázat ugyanezen 7/34 módszer (modell) orvosi-diagnosztikai területen használatos értékelési módszereit alkalmazva, a szenzitivitást (érzékenység) és a specifitást (fajlagosság) tartalmazza [104]. A szenzitivitás annak a valószínűsége, hogy a teszt egy beteget pozitívnak talál (betegnek diagnosztizál); míg a specificitás annak a valószínűsége, hogy a teszt egy egészségeset negatívnak talál (egészségesnek diagnosztizál).

osztályozott csoportok

szenzitivitás

specifitás

tumoros betegek vs. egészségesek limfóma vs. összes ováriumtumor vs. összes

100 87,5 81,3

100 89,3 92,6

előrejelzett (teszt) csoportok

szenzitivitás

specificitás

tumoros betegek vs. egészségesek limfóma vs. összes ováriumtumor vs. összes

95,7 71,4 74,3

92,9 84,1 87,3

7. Táblázat Az LDA 7/34 módszer szenzitivitás és specificitás értékei, amit a 6. táblázat adataiból számítottunk ki.

95


Ha a módszerünkkel a tumoros betegek (limfómát és ováriumtumort együtt tárgyalva) és az egészségesek közötti különbségtételt vesszük figyelembe, kiváló (100%) eredményt kapunk. Hasonlóan a limfómás és ováriumtumoros esetek szelektív diagnosztizálására is nagyon jó értékeket kaptunk (81-92% közöttiek). Az LDA számítások (csaknem) legfontosabb része, a kapott modell validálása, amellyel meghatározzuk a módszerünk prediktív/előrejelző képességét. A validálási módszerek közül az egyik elterjedt, ún. belső validálási módszert, a keresztellenőrzést (crossvalidation) választottuk. Ebben az esetben a változókiválasztást és a paraméterbecslést a teljes adatkészlettel végezzük el, majd felosztjuk az adatkészletünket 1/3-2/3 arányban teszt és betanuló készletre (minden csoportot 1/3-2/3 arányban random módon osztunk fel). A validálandó módszert a betanuló szetten alkalmazzuk; elvégezzük az LDA-t a teszt készletet kihagyva, majd a ennek a felhasználásával jelezzük azokat előre. Ezt a folyamatot az adatkészlet nagyságától függően többször megismételhetjük egymás után más-más felosztással, és az eredményt átlagoljuk. A keresztellenőrzés során 29 mintát véletlenszerűen választottunk ki betanuló készletnek (a 43 minta 2/3-a), és a korábban kiválasztott hét változó felhasználásával elvégeztük az LDA-t. A többi 14 mintát ismeretlennek vettük (teszt szet), majd ezen minták helyes vagy hibás klasszifikálása határozta meg az LDA módszer valós prediktív képességét. Ezt az eljárást hétszer egymás után elvégeztük, különböző, véletlenszerűen kiválasztott betanuló-teszt készletekkel, és az eredményüket átlagoltuk. Ennek eredményét a 6. táblázat alsó felében találjuk. A modell előrejelző képessége egyértelműen mindig kisebb, mint a teljes adathalmazra számolt klasszifikáció (kevesebb adatból indulunk ki). Esetünkben a validálás végeredményeként a modellünknek prediktív ereje a 79,5%-os volt, ami a 88,4%-os teljes klasszifikációval összemérhető szám. Az így előrejelzett csoportokra is kiszámoltuk a szenzitivitást és a specificitást (7. táblázat alsó része). Látható, hogy daganatok diagnosztizálására (tumoros betegek vs. egészséges kontroll) ez meglehetősen magas, 90 % feletti értékeket ad (95,7% szenzitivitás és 92.8% specifitás). Limfóma és ováriumtumorra szelektív diagnosztikai szenzitivitásra már kicsit kisebb (71 és 74 %), specifitására azonban kicsit magasabb (84 és 87 %) értékeket kaptunk, ami alapján mondhatjuk, hogy modellünk orvosdiagnosztiai jelentőséggel bírhat. A limfóma azonosítása különösképpen fontos, mivel tudomásunk szerint még nincs specifikus markere. Másrészről az LDA 7/34 módszerrel kapott eredményeink az ováriumtumor jelenlegi diagnosztikus markerével (CA125) történő együttes vizsgálata, az eddigieknél megbízhatóbb tesztekhez vezethet.

96


Számos egyéb módon is elvégeztük az LDA vizsgálatokat, amelyek ehhez többékevésbé hasonoló eredményt produkáltak. Például a kiválsztott hét változó helyett egy kevéssel több, kilenc változót alkalmazva az LDA csoportosításnál, a teljes klasszifikáció mértéke csak kismértékben emelkedett (89%), míg a modell előrejelzőképessége ugyanakkora maradt (79%). Amikor csak három (TetraS4, TetraS4F1 és PentaS3F1 glikánok) változóval hajtottuk végre a számítást, a klasszifikáció (76%) és a predikciós érték (65%) éppenhogy elégségesnek mondható volt. 3

2

ROOT 2

1

0

-1

-2

Egészséges kontroll Ováriumtumor Limfóma

-3

-4 -6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

ROOT 1

IV.17 Ábra A diagram a 43 egyedi minta (AGP oligoszacharidjaik relatív intenzitásán alapuló) elkülönülését mutatja, amit a 7/68 LDA módszer alkalmazásának eredményeként kaptunk

Egy másik megközelítésben, a negatív és pozitív ionizációs módban mért glikánokat (relatív intenzitásokat) egymástól külön kezeltük, és a mintaszám meghagyásával a változók számát duplájára emeltük (negatív és pozitív módban mért adatokat össezvontuk egy táblázatba), ami 68 változót jelentett. A program ebben az esetben is hét változót válaszott ki (automatikusan) az előzőekben ismertetett lépésenkénti előreirányuló változóbevonásos módszerrel. Az így kapott modell/módszer (7/68) kis mértékben eredményezett csak jobb csoportosítást (90% klasszifikáció, 80% prediktív képesség). Szemléltetésnek a 7/68 módszer eredménye a 17. ábrán látható.

97


Összehasonlításként a kiindulási adatainkból (43 eset, 34 változóval) többször, véletlenszerűen kiválasztottunk hét változót, amellyel elvégeztük az LDA-t. Ezek kevés sikerrel jártak, kicsi csoportosítási értékekkel, és átlapoló csoportokkal (nem mutatom be). Ez is mutatja, hogy az LDA módszer sikeres alkalmazásához elkerülhetetlen a helyes változók kiválasztása.

IV.5 A IV. fejezet összefoglalása Az humán szérum AGP tömegspektrometriás vizsgálata során a következő eredményeket kaptuk: 1. Sikeresen alkalmaztunk egy új felületakív anyagot az AGP tripszines hidrolíziséhez, melynek eredményeként a proteolízis az eddigieknél jóval sikeresebb volt. 2. A kapott igen komplex peptid-glikopeptid keveréket capHPLC-ESI-QTOF technikával vizsgáltuk, és a glikopeptideket szelektíven (karakterisztikus oxóniumionjaik segítségével) detektáltuk. Ezzel a technikával meghatároztuk az AGP N-glikánjainak kapcsolódási pont szerinti eloszlását, és az irodalomban eddig található glikopeptidek számánál kb. háromszor több AGP glikopeptid struktúrát (kb. 80) azonosítottunk, amelyek szerkezetét MS/MS mérésekkel igazoltunk. Eredményeinkből megállapítottuk, hogy az egyes glikozileződési pontok oligoszacharid eloszlása jelentősen eltérő. Az I és II kapcsolódási helyek főleg tri-antennáris, míg a III, IV és az V glikozileződési pontokon tetra-antennáris komplex oligoszacharidok dominálnak. A IV és V pozícióban további N-acetil-laktózamin (Gal-GlcNAc) egységek beépülését tapasztaltuk, ami még elágazottabb illetve még hosszabb láncokat tartalmazó cukrok jelenlétét igazolja. 3. Az AGP glikozilációs mintázatának a lehasított oligoszacharidok szintjén történő tanulmányozása során az AGP-ről hidrolizált és antranilsavval származékolt N-glikánok MALDI-TOF MS szerkezetvizsgálatát valósítottuk meg. Nagyszámú (43) egyedi minták (egészséges kontroll, limfómás és ováriumtumoros esetek) AGP glikánjainak vizsgálatára volt lehetőségünk, amit az Országos Onkológiai Intézet biztosított számunkra. A minták MALDITOF MS analízise során megfigyelhető volt, hogy az egészségesekkel összehasonlítva a nagyobb elágazásszámú tetra-antennáris és a fukózt tartalmazó molekulák aránya magasabb volt a kóros minták esetében.

98


4. A MALDI-TOF MS technikával 34 különböző glikánstruktúrát azonosítottunk a mintákban (mind pozitív mind negatív ionizációs módban), melyek szerkezetét MS/MS felvételekkel és pontos tömegméréssel is igazoltunk. 5. A MALDI vizsgálatokból származó relatív intenzitás adatokból fukóz- és antennaindexet definiáltunk, amelyek alapján már bizonyos mértékű elválás tapasztalható volt az egyes csoportok között, ám potenciális biomarkerként történő alkalmazásukhoz ez még kevésnek bizonyul. 6. A kapott eredmények statisztikai (LDA) analízisét is elvégeztük, amelyek biztató eredményeket hoztak; a három csoport jól elkülönült egymástól (88% teljes klasszifikáció). A keresztellenőrzés (validálás) is azt mutatta, hogy a módszerünknek megfelelő az előrejelző képessége: a tumoros és egészséges minták megkülönböztetéséhez 96%-os szelektivitás és 93%-os specifitás tartozik. A limfóma azonosítására számolt értékek is biztatóak (72% szelektivitás és 84% specificitás).

IV.6 Referenciák a IV. fejezethez 1. 2. 3. 4.

5. 6.

7.

8.

9.

10.

11.

Sharon, N. and H. Lis, Glycosciences - Status and Perspectives. Glycoproteins: structure and function, ed. H.G.a.S. Gabius. 1997, Washington: Chapman & Hall. 133 -162. Hounsell, E.F., M.J. Davies, and D.V. Renouf, O-linked protein glycosylation structure and function. Glycoconjugate J., 1996. 13(1): p. 19-26. Morelle, W., K. Canis, F. Chirat, V. Faid, and J.C. Michalski, The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics, 2006. 6(14): p. 3993-4015. Hofsteenge, J., D.R. Muller, T. Debeer, A. Loffler, W.J. Richter, and J.F.G. Vliegenthart, New-Type of Linkage between a Carbohydrate and a Protein - C-Glycosylation of a Specific Tryptophan Residue in Human Rnase U-S. Biochemistry, 1994. 33(46): p. 13524-13530. Shiyan, S.D. and N.V. Bovin, Carbohydrate composition and immunomodulatory activity of different glycoforms of alpha(1)-acid glycoprotein. Glycoconjugate J., 1997. 14(5): p. 631-638. Elliott, M.A., H.G. Elliott, K. Gallagher, J. McGuire, M. Field, and K.D. Smith, Investigation into the Concanavalin A reactivity, fucosylation and oligosaccharide microheterogeneity of alpha(1)-acid glycoprotein expressed in the sera of patients with rheumatoid arthritis. J. Chromatogr. B, 1997. 688(2): p. 229-237. Poland, D.C.W., W. Kulik, W. van Dijk, M.M. Hallemeesch, C. Jakobs, and K. de Meer, Distinct glycoforms of human alpha(1)-acid glycoprotein have comparable synthesis rates: a C-13 valinelabelling study in healthy humans. Glycoconjugate J., 2003. 20(2): p. 99-105. Kratz, E., D.C.W. Poland, W. van Dijk, and I. Katnik-Prastowska, Alterations of branching and differential expression of sialic acid on alpha-1-acid glycoprotein in human seminal plasma. Clin. Chim. Acta, 2003. 331(1-2): p. 87-95. Majewski, W., M. Laciak, M. Kapcinska, i.R. Staniszewsk, and A. Mackiewicz, N-glycoforms of serum alpha-1-acid glycoprotein in patients with lower limb chronic arterial ischaemia. Int. J. Angiol., 2003. 12: p. 96 – 102. Olewicz-Gawlik, A., I. Korczowska-Lacka, J.K. Lacki, K. Klama, and P. Hrycaj, Fucosylation of serum alpha(1)-acid glycoprotein in rheumatoid arthritis patients treated with infliximab. Clin. Rheumatol., 2007. 26: p. 1679-1684. Ryden, I., G. Skude, A. Lundblad, and P. Pahlsson, Glycosylation of alpha 1-acid glycoprotein in inflammatory disease: Analysis by high-pH anion-exchange chromatography and concanavalin A crossed affinity immunoelectrophoresis. Glycoconjugate J., 1997. 14(4): p. 481-488.

99


12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19. 20.

21.

22. 23.

24.

25. 26. 27. 28. 29. 30.

31.

Sei, K., M. Nakano, M. Kinoshita, T. Masuko, and K. Kakehi, Collection of alpha(1)-acid glycoprotein molecular species by capillary electrophoresis and the analysis of their molecular masses and carbohydrate chains - Basic studies on the analysis of glycoprotein glycoforms. J. Chromatogr. A, 2002. 958(1-2): p. PII S0021-9673(02)00353-9. Wang, L.J., F.X. Li, W. Sun, S.Z. Wu, X.R. Wang, L. Zhang, D.X. Zheng, J. Wang, and Y.H. Gao, Concanavalin A-captured glycoproteins in healthy human urine. Mol. Cell. Prot., 2006. 5(3): p. 560562. Uematsu, R., J. Furukawa, H. Nakagawa, Y. Shinohara, K. Deguchi, K. Monde, and S.I. Nishimura, High throughput quantitative glycomics and glycoform-focused proteomics of murine dermis and epidermis. Mol. Cell. Prot., 2005. 4(12): p. 1977-1989. Demelbauer, U.M., M. Zehl, A. Plematl, G. Allmaier, and A. Rizzi, Determination of glycopeptide structures by multistage mass spectrometry with low-energy collision-induced dissociation: comparison of electrospray ionization quadrupole ion trap and matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole ion trap reflectron time-of-flight approaches. Rapid Comm. Mass Spectrom., 2004. 18(14): p. 1575-1582. Kaji, H., H. Saito, Y. Yamauchi, T. Shinkawa, M. Taoka, J. Hirabayashi, K. Kasai, N. Takahashi, and T. Isobe, Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat. Biotechnol., 2003. 21(6): p. 667-672. Geng, M., X. Zhang, M. Bina, and F. Regnier, Proteomics of glycoproteins based on affinity selection of glycopeptides from tryptic digests. J. Chromatogr B - Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 2001. 752(2): p. 293-306. Morris, H.R., M.R. Thompson, D.T. Osuga, A.I. Ahmed, S.M. Chan, J.R. Vandenheede, and R.E. Feeney, Antifreeze Glycoproteins from Blood of an Antarctic Fish - Structure of Proline-Containing Glycopeptides. J. Biol. Chem., 1978. 253(14): p. 5155-5162. Harvey, D.J., Electrospray mass spectrometry and fragmentation of N-linked carbohydrates derivatized at the reducing terminus. J. Am. Chem. Soc., 2000. 11(10): p. 900-915. Weiskopf, A.S., P. Vouros, and D.J. Harvey, Electrospray ionization-ion trap mass spectrometry for structural analysis of complex N-linked glycoprotein oligosaccharides. Anal. Chem., 1998. 70(20): p. 4441-4447. Weiskopf, A.S., P. Vouros, and D.J. Harvey, Characterization of oligosaccharide composition and structure by quadrupole ion trap mass spectrometry. Rapid Comm. Mass Spectrom., 1997. 11(14): p. 1493-1504. Reinhold, V.N., B.B. Reinhold, and C.E. Costello, Carbohydrate Molecular-Weight Profiling, Sequence, Linkage, and Branching Data - Es-Ms and Cid. Anal. Chem., 1995. 67(11): p. 1772-1784. Harvey, D.J., Analysis of Carbohydrates and Glycoconjugates by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: An Update for 2003-2004. Mass Spectrom. Rev., 2009. 28(2): p. 273-361. Hashir, M.A., G. Stecher, and G.K. Bonn, Identification of low molecular weight carbohydrates employing new binary mixtures for matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Comm. Mass Spectrom., 2008. 22(14): p. 2185-2194. Mechref, Y. and M.V. Novotny, Structural investigations of glycoconjugates at high sensitivity. Chem. Rev., 2002. 102(2): p. 321-369. Dell, A. and H.R. Morris, Glycoprotein structure determination mass spectrometry. Science, 2001. 291(5512): p. 2351-2356. Harvey, D.J., Identification of protein-bound carbohydrates by mass spectrometry. Proteomics, 2001. 1(2): p. 311-328. Kuster, B., T.N. Krogh, E. Mortz, and D.J. Harvey, Glycosylation analysis of gel-separated proteins. Proteomics, 2001. 1(2): p. 350-361. Packer, N.H. and M.J. Harrison, Glycobiology and proteomics: Is mass spectrometry the Holy Grail? Electrophoresis, 1998. 19(11): p. 1872-1882. Apffel, A., J. Chakel, S. Udiavar, W.S. Hancock, C. Souders, and E. Pungor, Application of Capillary Electrophoresis, High-Performance Liquid-Chromatography, Online Electrospray Mass-Spectrometry and Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization-Time of Flight Mass-Spectrometry to the Characterization of Single-Chain Plasminogen-Activator. J. Chrom. A, 1995. 717(1-2): p. 41-60. Rajan, N., A. Tsarbopoulos, R. Kumarasamy, R. Odonnell, S.S. Taremi, S.W. Baldwin, G.F. Seelig, X.D. Fan, B. Pramanik, and H.V. Le, Characterization of Recombinant Human Interleukin-4 Receptor from Cho Cells - Role of N-Linked Oligosaccharides. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995. 206(2): p. 694-702.

100


32.

33. 34.

35.

36.

37.

38. 39.

40. 41.

42. 43.

44.

45.

46. 47. 48.

49. 50.

51.

52.

53.

Ashton, D.S., C.R. Beddell, D.J. Cooper, S.J. Craig, A.C. Lines, R.W.A. Oliver, and M.A. Smith, MassSpectrometry of the Humanized Monoclonal-Antibody Campath 1h. Anal. Chem., 1995. 67(5): p. 835842. Zaia, J., R. Boynton, D. Heinegard, and F. Barry, Posttranslational modifications to human bone sialoprotein determined by mass spectrometry. Biochemistry, 2001. 40(43): p. 12983-12991. Sottani, C., M. Fiorentino, and C. Minoia, Matrix performance in matrix-assisted laser desorption/ionization for molecular weight determination in sialyl and non-sialyl oligosaccharide proteins. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1997. 11(8): p. 907-913. Pitt, J.J. and J.J. Gorman, Oligosaccharide characterization and quantitation using 1-phenyl-3-methyl5-pyrazolone derivatization and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Biochem., 1997. 248(1): p. 63-75. Juhasz, P., C.E. Costello, and K. Biemann, Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization MassSpectrometry with 2-(4-Hydroxyphenylazo)Benzoic Acid Matrix. J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 1993. 4(5): p. 399-409. Feng, R. and Y. Konishi, Analysis of Antibodies and Other Large Glycoproteins in the Mass Range of 150000-200000 Da by Electrospray Ionization Mass-Spectrometry. Anal. Chem., 1992. 64(18): p. 2090-2095. Wilm, M. and M. Mann, Analytical properties of the nanoelectrospray ion source. Anal. Chem., 1996. 68(1): p. 1-8. Dage, J.L., B.L. Ackermann, and H.B. Halsall, Site localization of sialyl Lewis(x) antigen on alpha(1)acid glycoprotein by high performance liquid chromatography electrospray mass spectrometry. Glycobiology, 1998. 8(8): p. 755-760. Juhasz, P. and S.A. Martin, The utility of nonspecific proteases in the characterization of glycoproteins by high-resolution time-of-flight mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom., 1997. 169: p. 217-230. Ling, V., A.W. Guzzetta, E. Canovadavis, J.T. Stults, W.S. Hancock, T.R. Covey, and B.I. Shushan, Characterization of the Tryptic Map of Recombinant-DNA Derived Tissue Plasminogen-Activator by High-Performance Liquid-Chromatography Electrospray Ionization Mass-Spectrometry. Anal. Chem., 1991. 63(24): p. 2909-2915. Burlingame, A.L., Characterization of protein glycosylation by mass spectrometry. Curr. Opin. Biotechnol., 1996. 7(1): p. 4-10. Carr, S.A., M.J. Huddleston, and M.F. Bean, Selective Identification and Differentiation of N-Linked and O-Linked Oligosaccharides in Glycoproteins by Liquid-Chromatography Mass-Spectrometry. Protein Sci., 1993. 2(2): p. 183-196. Huddleston, M.J., M.F. Bean, and S.A. Carr, Collisional Fragmentation of Glycopeptides by Electrospray Ionization Lc Ms and Lc Ms Ms - Methods for Selective Detection of Glycopeptides in Protein Digests. Anal. Chem., 1993. 65(7): p. 877-884. Wuhrer, M., M.I. Catalina, A.M. Deelder, and C.H. Hokke, Glycoproteomics based on tandem mass spectrometry of glycopeptides. J. Chromatogr. B - Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2007. 849(1-2): p. 115-128. Wuhrer, M., A.M. Deelder, and C.H. Hokke, Protein glycosylation analysis by liquid chromatographymass spectrometry. J. Chromatogr B - Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 2005. 825(2): p. 124-133. Jiang, H., H. Desaire, V.Y. Butnev, and G.R. Bousfield, Glycoprotein profiling by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 2004. 15(5): p. 750-758. Zhang, H., X.J. Li, D.B. Martin, and R. Aebersold, Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat. Biotechnol., 2003. 21(6): p. 660-666. Morelle, W. and J.C. Michalski, Glycomics and mass spectrometry. Curr. Pharm. Des., 2005. 11(20): p. 2615-2645. Merry, A.H., D.C.A. Neville, L. Royle, B. Matthews, D.J. Harvey, R.A. Dwek, and P.M. Rudd, Recovery of intact 2-aminobenzamide-labeled O-glycans released from glycoproteins by hydrazinolysis. Anal. Biochem., 2002. 304(1): p. 91-99. Yamamoto, K., K. Hamase, and K. Zaitsu, 2-amino-3-phenylpyrazine, a sensitive fluorescence prelabeling reagent for the chromatographic or electrophoretic determination of saccharides. J. Chromatogr. A, 2003. 1004(1-2): p. 99-106. Jackson, P. and G.R. Williams, Polyacrylamide-Gel Electrophoresis of Reducing Saccharides Labeled with the Fluorophore 8-Aminonaphthalene-1,3,6-Trisulfonic Acid - Application to the Enzymological Structural-Analysis of Oligosaccharides. Electrophoresis, 1991. 12(1): p. 94-96. Anumula, K.R. and P. Du, Characterization of carbohydrates using highly fluorescent 2-aminobenzoic acid tag following gel electrophoresis of glycoproteins. Anal. Biochem., 1999. 275(2): p. 236-242.

101


54.

55.

56. 57. 58.

59. 60.

61.

62.

63.

64. 65.

66.

67.

68.

69.

70.

71. 72. 73. 74. 75.

Anumula, K.R. and S.T. Dhume, High resolution and high sensitivity methods for oligosaccharide mapping and characterization by normal phase high performance liquid chromatography following derivatization with highly fluorescent anthranilic acid. Glycobiology, 1998. 8(7): p. 685-694. Rudd, P.M., C. Colominas, L. Royle, N. Murphy, E. Hart, A.H. Merry, H.F. Hebestreit, and R.A. Dwek, A high-performance liquid chromatography based strategy for rapid, sensitive sequencing of N-linked oligosaccharide modifications to proteins in sodium dodecyl sulphate polyacrylamide electrophoresis gel bands. Proteomics, 2001. 1(2): p. 285-294. Rudd, P.M. and R.A. Dwek, Rapid, sensitive sequencing of oligosaccharides from glycoproteins. Curr. Opin. Biotechnol., 1997. 8(4): p. 488-497. Kotani, N. and S. Takasaki, Analysis of 2-aminobenzamide-labeled oligosaccharides by high-pH anionexchange chromatography with fluorometric detection. Anal. Biochem., 1998. 264(1): p. 66-73. Wuhrer, M., C.A.M. Koeleman, C.H. Hokke, and A.M. Deelder, Nano-scale liquid chromatographymass spectrometry of 2-aminobenzamide-labeled oligosaccharides at low femtomole sensitivity. Int. J. Mass Spectrom., 2004. 232(1): p. 51-57. Beavis, R.C. and B.T. Chait, High-Accuracy Molecular Mass Determination of Proteins Using MatrixAssisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Anal. Chem., 1990. 62(17): p. 1836-1840. Finke, B., M. Mank, H. Daniel, and B. Stahl, Offline coupling of low-pressure anion-exchange chromatography with MALDI-MS to determine the elution order of human milk oligosaccharides. Anal. Biochem., 2000. 284(2): p. 256-265. Mohr, M.D., K.O. Bornsen, and H.M. Widmer, Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization MassSpectrometry - Improved Matrix for Oligosaccharides. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1995. 9(9): p. 809-814. Papac, D.I., A. Wong, and A.J.S. Jones, Analysis of acidic oligosaccharides and glycopeptides by matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem., 1996. 68(18): p. 3215-3223. Powell, A.K. and D.J. Harvey, Stabilization of sialic acids in N-linked oligosaccharides and gangliosides for analysis by positive ion matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1996. 10(9): p. 1027-1032. Ciucanu, I. and F. Kerek, A Simple and Rapid Method for the Permethylation of Carbohydrates. Carbohydr. Res., 1984. 131(2): p. 209-217. Mills, P.B., K. Mills, N. Mian, B.G. Winchester, and P.T. Clayton, Mass spectrometric analysis of glycans in elucidating the pathogenesis of CDG type IIx. J. Inherit. Metab. Dis., 2003. 26(2-3): p. 119134. Morelle, W., C. Flahaut, J.C. Michalski, A. Louvet, P. Mathurin, and A. Klein, Mass spectrometric approach for screening modifications of total serum N-glycome in human diseases: application to cirrhosis. Glycobiology, 2006. 16(4): p. 281-293. Kyselova, Z., Y. Mechref, M.M. Al Bataineh, L.E. Dobrolecki, R.J. Hickey, J. Vinson, C.J. Sweeney, and M.V. Novotny, Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. Journal of Proteome Research, 2007. 6(5): p. 1822-1832. Thomsson, K.A., H. Karlsson, and G.C. Hansson, Sequencing of sulfated oligosaccharides from mucins by liquid chromatography and electrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal. Chem., 2000. 72(19): p. 4543-4549. Kawasaki, N., M. Ohta, S. Hyuga, M. Hyuga, and T. Hayakawa, Application of liquid chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography with tandem mass spectrometry to the analysis of the site-specific carbohydrate heterogeneity in erythropoietin. Anal. Biochem., 2000. 285(1): p. 82-91. Schmid, K., P. Baumann, W.E. Müller, C.B. Eap, and J.P. Tillement, Alpha1-acid glycoprotein. Genetics, Biochemistry, Physiological Functions, and Pharmacology, ed. A.R.L. Inc. 1989, New York. 7-22. Ceciliani, F. and V. Pocacqua, The acute phase protein alpha 1-acid glycoprotein: A model for altered glycosylation during diseases. Curr. Prot. Pep. Sci., 2007. 8(1): p. 91-108. Fournier, T., N. Medjoubi-N, and D. Porquet, Alpha-1-acid glycoprotein. Biochim. Biophys. Acta, Protein Struct. Mol. Enzymol., 2000. 1482(1-2): p. 157-171. Dente, L., U. Ruther, M. Tripodi, E.F. Wagner, and R. Cortese, Expression of Human Alpha-1-Acid Glycoprotein Genes in Cultured-Cells and in Transgenic Mice. Gene Dev., 1988. 2(2): p. 259-266. Treuheit, M.J., C.E. Costello, and H.B. Halsall, Analysis of the 5 Glycosylation Sites of Human Alpha1-Acid Glycoprotein. Biochem. J, 1992. 283: p. 105-112. Van Dijk, W., E.C.M. Brinkman-Van der Linden, and E.C. Havenaar, Glycosylation of alpha(1)-acid glycoprotein (orosomucoid) in health and disease: Occurrence, regulation and possible functional implications. Trends Glycosci. Glyc., 1998. 10(53): p. 235-245.

102


76.

77. 78.

79.

80.

81.

82.

83.

84.

85.

86.

87.

88.

89. 90.

91.

92. 93. 94.

Brinkman-van der Linden, E.C.M., P.F. de Haan, E.C. Havenaar, and W. van Dijk, Inflammationinduced expression of sialyl Lewis(x) is not restricted to alpha(1)-acid glycoprotein but also occurs to a lesser extent on alpha(1)-antichymotrypsin and haptoglobin. Glycoconjugate J., 1998. 15(2): p. 177182. Mackiewicz, A. and K. Mackiewicz, Glycoforms of Serum Alpha-1-Acid Glycoprotein as Markers of Inflammation and Cancer. Glycoconjugate J., 1995. 12(3): p. 241-247. Poland, D.C.W., C.G. Schalkwijk, C.D.A. Stehouwer, C.A.M. Koeleman, B. van het Hof, and W. van Dijk, Increased alpha(3)-fucosylation of alpha(1)-acid glycoprotein in Type I diabetic patients is related to vascular function. Glycoconjugate J., 2001. 18(3): p. 261-268. BrinkmanVanderLinden, E.C.M., E.C. Havenaar, E.C.R. VanOmmen, G.J. VanKamp, L.J.G. Gooren, and W. VanDijk, Oral estrogen treatment induces a decrease in expression of sialyl Lewis x on alpha(1)-acid glycoprotein in females and male-to-female transsexuals. Glycobiology, 1996. 6(4): p. 407-412. Ryden, I., P. Pahlsson, A. Lundblad, and T. Skogh, Fucosylation of alpha 1-acid glycoprotein (orosomucoid) compared with traditional biochemical markers of inflammation in recent onset rheumatoid arthritis. Clin.Chim. Acta, 2002. 317(1-2): p. PII S0009-8981(01)00803-8. Van Dijk, W., C. Koeleman, B.V. Hof, D. Poland, C. Jakobs, and J. Jaeken, Increased alpha 3fucosylation of alpha 1-acid glycoprotein in patients with congenital disorder of glycosylation type IA (CDG-Ia). FEBS Lett., 2001. 494(3): p. 232-235. Van den Heuvel, M.M., D.C.W. Poland, C.S. De Graaff, E.C.M. Hoefsmit, P.E. Postmus, R.H.J. Beelen, and W. Van Dijk, The degree of branching of the glycans of alpha(1)-acid glycoprotein in asthma - A correlation with lung function and inflammatory parameters. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2000. 161(6): p. 1972-1978. Kremmer, T., E. Szollosi, M. Boldizsar, B. Vincze, K. Ludanyi, T. Imre, G. Schlosser, and K. Vekey, Liquid chromatographic human serum acid and mass spectrometric analysis of alpha-1-glycoprotein. Biomed. Chromatogr., 2004. 18(5): p. 323-329. Hashimoto, S., T. Asao, J. Takahashi, Y. Yagihashi, T. Nishimura, A.R. Saniabadi, D.C.W. Poland, W. van Dijk, H. Kuwano, N. Kochibe, and S. Yazawa, alpha(1)-acid glycoprotein fucosylation as a marker of carcinoma progression and prognosis. Cancer, 2004. 101(12): p. 2825-2836. Kremmer, T., M. Boldizsar, J. Kovacs, E. Paulik, K. Bencsik, and B. Szajani, Determination and Analysis of Human Serum Alpha-1-Acid Glycoprotein by Liquid-Chromatographic Methods. J. Liq. Chromatogr., 1995. 18(6): p. 1207-1218. Logdberg, L. and L. Wester, Immunocalins: a lipocalin subfamily that modulates immune and inflammatory responses. Biochim. Biophys. Acta, Protein Struct. Mol. Enzymol., 2000. 1482(1-2): p. 284-297. Nagy, K., K. Vekey, T. Imre, K. Ludanyi, M.P. Barrow, and P.J. Derrick, Electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry of human alpha-1-acid glycoprotein. Anal. Chem., 2004. 76(17): p. 4998-5005. Higai, K., Y. Aoki, Y. Azuma, and K. Matsumoto, Glycosylation of site-specific glycans of alpha(1)acid glycoprotein and alterations in acute and chronic inflammation. Biochim. Biophys. Acta, Gen. Subj., 2005. 1725(1): p. 128-135. Anumula, K.R., Advances in fluorescence derivatization methods for high-performance liquid chromatographic analysis of glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem., 2006. 350(1): p. 1-23. Kuster, B., A.P. Hunter, S.F. Wheeler, R.A. Dwek, and D.J. Harvey, Structural determination of Nlinked carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry following enzymatic release within sodium dodecyl sulphate polyacrylamide electrophoresis gels: Application to species-specific glycosylation of alpha(1)-acid glycoprotein. Electrophoresis, 1998. 19(11): p. 19501959. Mechref, Y., A.G. Baker, and M.V. Novotny, Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of neutral and acidic oligosaccharides with collision-induced dissociation. Carbohydr. Res., 1998. 313(3-4): p. 145-55. Viseux, N., X. Hronowski, J. Delaney, and B. Domon, Qualitative and Quantitative Analysis of the Glycosylation Pattern of Recombinant Proteins. Anal. Chem., 2001. 73(20): p. 4755-4762. Molnárné, Sz. É. A humán szérum alfa 1-savanyú glikoprotein oligoszacharid-szerkezetének vizsgálata PhD Disszertáció,. 2007, Budapest: Eötvös Lóránd Tudomány Egyetem. Stover, T., J.V. Amari, I. Mazsaroff, M. Gilar, Y.Q. Yu, and J.C. Gebler, Novel characterization tool for Mab digestion - Technical note: RapiGest SF denaturant tool for improved trypsin digestion of monoclonal antibodies. Genet. Eng. News, 2003. 23(17): p. 48-49.

103


95.

96.

97.

98.

99. 100.

101. 102.

103. 104.

Yu, Y.Q., M. Gilar, P.J. Lee, E.S.P. Bouvier, and J.C. Gebler, Enzyme-friendly, mass spectrometrycompatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem., 2003. 75(21): p. 6023-6028. Nomura, E., K. Katsuta, T. Ueda, M. Toriyama, T. Mori, and N. Inagaki, Acid-labile surfactant improves in-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel protein digestion for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric peptide mapping. J. Mass Spectrom., 2004. 39(2): p. 202-207. Imre, T., G. Schlosser, G. Pocsfalvi, R. Siciliano, S.É. Molnárné, T. Kremmer, A. Malorni, and K. Vékey, Glycosylation site analysis of human alpha-1-acid glycoprotein (AGP) by capillary liquid chromatography - electrospray mass spectrometry. J. Mass Spectrom, 2005. 40(11): p. 1472-1483. Conboy, J.J. and J.D. Henion, The Determination of Glycopeptides by Liquid-Chromatography MassSpectrometry with Collision-Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 1992. 3(8): p. 804814. Jiang, H., H. Desaire, V.Y. Butnev, and G.R. Bousfield, Glycoprotein profiling by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 2004. 15(5): p. 750-758. Ritchie, M.A., A.C. Gill, M.J. Deery, and K. Lilley, Precursor ion scanning for detection and structural characterization of heterogeneous glycopeptide mixtures. J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 2002. 13(9): p. 1065-1077. Voorzanger-Rousselot, N. and P. Garnero, Biochemical markers in oncology. Part I: molecular basis. Part II: clinical uses. Cancer Treatm. Rev., 2007. 33: p. 230-283. Héberger, K., E. Csomós, and L. Simon-Sarkadi, Principal component and linear discriminant analyses of free amino acids and biogenic amines in hungarian wines. J. Agric. Food. Chem., 2003. 51: p. 80558060. Defernez, M. and E.K. Kemsley, The use and misuse of chemometrics for treating classification problems. Trends Anal. Chem., 1997. 16: p. 216-224. Kazmierczak, S.C., Statistical techniques for evaluating the diagnostic utility of laboratory tests. Clin. Chem. Lab. Med., 1999. 37: p. 1001-1009.

104

V. Tézisek

V. Tézisek 1. Megvalósítottuk a BLG és a cisz-parinársav nemkovalens komplexének specifikus, 1:1 sztöchiomatriájú kötődésének ESI-MS módszerrel történő kimutatását. A kötés specificitását kompetitív kötődési kísérletekkel igazoltuk, amelyekben a különböző szénatomszámú telített és telítetlen zsírsavak jelenléte mellett vizsgáltuk a BLG-cPA komplexet. A kapott eredményekből megállapítottuk, hogy a legintenzívebb komplexeket minden esetben a BLG-cPA eredményezte. A BLG-hez történő kiemelkedő kötődési tulajdonságáért valószínű, hogy a cPA megfelelő mérete, láncvégi karboxilcsoportja, valamint konjugált kettőskötésrendszere a felelős. 2. Limitált tripszinolízises mintaelőkészítést tömegspektrometriás analízissel kombinálva sikerült olyan módszert kidolgoznunk, amellyel a BLG molekula egy olyan részletéhez jutottunk, amely közvetlenül részt vesz a komplexképzésben. A kapott fehérjefragmentum szerkezetét azonosítottuk; ez a diszulfidhíddal összekötött [4170]S-S[149-162] fragmens az intakt molekulához hasonlóan komplexálta a cPA-t. 3. Új módszert dolgoztunk ki a rendkívül heterogén szerkezetű AGP glikozilációs pontok szerinti oligoszacharid eloszlásának tanulmányozására. A tripszines emésztés mintaelőkészítési lépésében elsőként alkalmaztunk sikeresen egy új, addig többnyire csak membránfehérjékhez használt felületaktív anyagot (RapiGest SF), aminek eredményeként a proteolízis az eddigieknél jóval sikeresebb volt. 4. A kapott rendkívűl komplex peptid-glikopeptid keveréket nanoHPLC-ESI-QTOF technikával

vizsgáltuk,

és

a

glikopeptideket

szelektíven

(karakterisztikus

oxóniumionjaik segítségével) detektáltuk, amivel megvalósítottuk az AGP N-glikánok eloszlásának kapcsolódási pont szerinti meghatározását. A módszerrel az irodalomban eddig található glikopeptidek számánál kb. háromszoros mennyiségű AGP glikopeptid struktúrát (kb. 80) azonosítottunk, amelyek szerkezetét MS/MS mérésekkel igazoltunk. Eredményeinkből megállapítottuk, hogy az egyes glikozileződési pontok oligoszacharid eloszlása jelentősen eltérő, ami a molekula szerkezeti változatosságát tovább növeli. Az I és II kapcsolódási helyek főleg tri-antennáris, míg a III, IV és az V glikozileződési pontokon tetra-antennáris komplex oligoszacharidok dominálnak. A IV és V pozícióban további N-acetil-laktózamin (Gal-GlcNAc) egységek beépülését 105

V. Tézisek

tapasztaltuk, ami még nagyobb mértékű elágazást, ill. még hosszabb lánckat tartalmazó glikánok jelenlétét igazolja. 5. Az AGP glikozilációs mintázatának a lehasított oligoszacharidok szintjén történő tanulmányozása során az AGP-ről hidrolizált és antranilsavval származékolt Nglikánjainak MALDI-TOF-MS szerkezetvizsgálatát valósítottuk meg. A módszerrel nagyszámú (43) egyedi minta (egészséges kontroll, limfómás és ováriumtumoros esetek) AGP N-glikánjait vizsgáltuk meg, amelyekből 34 különböző glikánstruktúrát azonosítottunk. A minták tömegspektrometriás analízise során megfigyelhető volt, hogy az egészségesekkel összehasonlítva a tumoros minták esetében a nagyobb elágazásszámú tetra-antennáris és a fukózt tartalmazó molekulák aránya magasabb volt. 6. Az AGP oligoszacharidok MALDI-MS analíziséből származó relatív intenzitás adatokból fukóz- és antennaindexet definiáltunk, amelyek alapján a fukózindex bizonyos mértékű elkülönülést mutatott az egyes csoportok között. Az átlagos fukózindex az ováriumtumoros és limfómás csoportokban 45, illetve 60%-al volt nagyobb az egészséges csoportban. 7. A kapott eredmények kemometriás (LDA) analízisét is elvégeztük, amelyek biztató eredményeket hoztak; az adathalmazon mért relatív oligoszacharid intenzitások alapján a három csoportot jól elkülönült egymástól (88% klasszifikáció). A keresztellenőrzés (validálás) is azt mutatta, hogy a módszerünknek megfelelő az előrejelző képessége: a daganatos és egészséges minták megkülönböztetéséhez 96%os szelektivitás és 93%-os specificitás tartozik. A limfóma azonosítására számolt értékek is biztatóak voltak (72 % szelektivitás és 84% specificitás).

106

VI. Közlemények Az értekezés alapjául szolgáló, saját közlemények:

I.

Tímea Imre, Ferenc Zsila and Pál T. Szabó, Electrospray mass spectrometric investigation of the binding of cis-parinaric acid to bovine beta-lactoglobulin and study of the ligand-binding site of the protein using limited proteolysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2003. 17(22): p. 2464-2470. (IF: 2,789)

II.

Tímea Imre, Gitta Schlosser, Gabriella Pocsfalvi, Rosa Siciliano, Éva MolnárSzöllősi, Tibor Kremmer, Antonio Malorni, Károly Vékey, Glycosylation site analysis of human alpha-1-acid glycoprotein (AGP) by capillary liquid chromatography electrospray mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 2005. 40(11): p. 14721483. (IF:3,574)

III.

Tímea Imre, Tibor Kremmer, Károly Héberger, Éva Molnár-Szöllősi, Krisztina Ludányi, Gabriella Pócsfalvi, Antonio Malorni, László Drahos, Károly Vékey, Mass spectrometric and linear discriminant analysis of N-glycans of human serum alpha-1acid glycoprotein in cancer patients and healthy individuals, Journal of Proteomics 2008. 71(2): p. 186-197. (2008-ban indult IF-os folyóirat)

A doktori munkához kapcsolódó további közlemények:

1.

Zsila, F., T. Imre, P.T. Szabó, Z. Bikádi and M. Simonyi, Induced chirality upon binding

of

cis-parinaric

acid

to

bovine

beta-lactoglobulin:

spectroscopic

characterization of the complex. Febs Letters, 2002. 520(1-3): p. 81-87.

2.

Kovári, J., T. Imre, P. Szabó and B.G. Vértessy, Mechanistic studies of dUTPases. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004. 23(8-9): p. 1475-1479.

3.

Kovári, J., O. Barabás, E. Takács, A. Békési, F. Dubrovay, V. Pongrácz, I. Zagyva, T. Imre, P. Szabó and B.G. Vértessy, Altered active site flexibility and a structural metal-binding site in eukaryotic dUTPase - Kinetic characterization, folding, and

107

crystallographic studies of the homotrimeric Drosophila enzyme. Journal of Biological Chemistry, 2004. 279(17): p. 17932-17944.

4.

Kremmer, T., E. Szöllősi, M. Boldizsár, B. Vincze, K. Ludányi, T. Imre, G. Schlosser and K. Vékey, Liquid chromatographic human serum acid and mass spectrometric analysis of alpha-1-glycoprotein. Biomedical Chromatography, 2004. 18(5): p. 323329.

5.

Nagy, K., K. Vékey, T. Imre, K. Ludányi, M.P. Barrow and P.J. Derrick, Electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry of human alpha-1-acid glycoprotein. Analytical Chemistry, 2004. 76(17): p. 4998-5005.

6.

Szöllősi, T., T. Kremmer, K. Ludányi, T. Imre, G. Schlosser, M. Boldizsár, B. Vincze and K. Vékey, A novel method for the separation and purification of human serum acid

alpha-1-glycoprotein.

Liquid

chromatographic

and

mass

spectrometric

investigation of tryptic fragments. Chromatographia, 2004. 60: p. S213-S219. A doktori munkához nem kapcsolódó (válogatott) közlemények: 1. Novák T., Keglevich Gy., Imre T., Bakó P., Újszászy K., Ludányi K., Tőke L.: Foszfonoalkil oldalláncot tartalmazó azakoronák szintézise és komplexképzési tulajdonságainak a vizsgálata, Magy. Kém. Folyóirat, 105, 16 (1999) 2. Keglevich, G., T. Novák, T. Imre, P. Bakó, L. Tőke, K. Újszaszy and K. Ludányi, Synthesis and cation binding ability of azacrown ethers with phosphine or phosphine oxide side chain. Heteroatom Chemistry, 1999. 10(7): p. 573-576.

3. Novák, T., P. Bakó, T. Imre, G. Keglevich, A. Dobó and L. Tőke, Synthesis and cation binding ability of the phosphonoalkyl- and phosphinoylalkyl derivatives of monoaza-18-crown-6. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2000. 38(1-4): p. 435-443

108

4. Keglevich, G., T. Novák, P. Bakó, T. Bakó, T. Imre and L. Tőke, The synthesis and utilization of azacrown ethers with phosphorus function in the side chain. Phosphorus Sulfur and Silicon and the Related Elements, 2002. 177(8-9): p. 1995-1995.

5. Keglevich, G., L. Nyulászi, T. Chuluunbaatar, B.A. Namkhainyambuu, K. Ludányi, T. Imre and L. Tőke, endo and exo Ring fusion in the Diels-Alder reaction of 1-(2,4,6trialkylphenyl)3-methylphospholes with maleic acid derivatives. Tetrahedron, 2002. 58(49): p. 9801-9808.

6. Keglevich G, Sipos M, Lengyel D, Forintos H, Körtvélyesi T, Imre T, Tőke L Synthesis of 1-aryl-1,2,3,4,5,6-hexahydrophosphinine 1-oxides Synthetic Communications, 2004. 4 (22): p. 4159-4169

7. Keglevich

G,

Sipos

M,

Körtvélyesi

T,

Imre

T,

Tőke

L,

1,2,3,4,5,6-

Hexahydrophosphinine 1-oxides with an exocyclic P-function at position 3: diastereoselective synthesis, stereostructure and conformation Tetrahedron Letters 2005. 46 (10): p. 1655-1658. Munkánkból tartott előadások:

1.

Imre Tímea, Zsila Ferenc, Simonyi Miklós, Szabó Pál: β-laktoglobulin és ciszparinársav nem-kovalens komplexképzésének vizsgálata ESI-tömegspektrometriás módszerrel, Peptidkémiai Munkabizottsági Ülés, Balatonszemes, 2002. május 29-31.

2.

Imre Tímea, Zsila Ferenc, Simonyi Miklós, Szabó Pál: A β-laktoglobulin és ciszparinársav nemkovalens komplexképzésének tömegspektrometriás vizsgálata, V. Doktori Kémiai Iskola, Királyrét, 2002. május 21-22.

3.

Imre Tímea, Ludányi Krisztina, Schlosser Gitta, Kremmer Tibor, Szöllősi Éva, Vékey Károly: Human szérum AGP tömegspektrometriás vizsgálata; Peptidkémiai Munkabizottság és az Nukleotidkémiai Munkabizottsági együttes tudományos ülése 2003. május 26-28., Balatonszemes

109

4.

Imre Tímea, Ludányi Krisztina, Kremmer Tibor, Molnárnlé Szöllősi Éva, Vékey Károly, Human szérum AGP tömegspektrometriás vizsgálata, Tömeg - és molekulaspektrometria

alkalmazási

lehetőségei

az

orvosi

diagnosztikában;

Szakmai

Szeminárium, Budapest MTA KKKI 2004. április 14.

5.

Imre Tímea, Ludányi Krisztina, Kremmer Tibor, Molnárné Szöllősi Éva, Vékey Károly; A humán szérum alfa-1-savas glikoprotein oligoszacharidjainak MALDI-MS vizsgálata; Analitikai Vegyészkonferencia. Balatonföldvár, 2004. június 30.- július 2.

Munkánkból született poszter bemutatók: 1. Tímea Imre, Ferenc Zsila, Miklós Simonyi, Pál T. Szabó: Investigation of binding cis-parinaric acid to bovine β-lactoglobulin by electrospray ionization and matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry 20th Informal Meeting on Mass Spectrometry, Fierra di Primiero, Italy (2002). 2. Imre Tímea, Vértessy Beáta, Zsila Ferenc, Szabó Pál: Fehérjék kötőhelyének tömegspektrometriés

vizsgálata

limitált

tripszines

hidrolzissel,

METT

Elválasztástudományi Vándorgyűlés, Lillafüred 2002. október 16-18. 3. Tímea Imre, Krisztina Ludányi, Gitta Schlosser, Tibor Kremmer, Éva Szöllősi, Károly Vékey: Investigation of oligosaccharides of human serum alpha-1-acidglycoprotein by MALDI-TOF MS, 21st Informal Meeting on Mass Spectrometry, Antwerp, 11-15 May, 2003. 4. Imre Tímea, Zsila Ferenc, Szabó Pál: Béta-laktoglobulin kötőhelyének limitált tripszinolízises vizsgálata electrospray ionizációs tömeg-spektrometriás technikával Magyar Kémikusok Egyesülete, „Vegyészkonferencia 2003”, Hajdúszoboszló 2003. június 26-28., 5. Tímea Imre; Ferenc Zsila, Pál T. Szabó: Electrospray mass spectrometric investigation of binding cis-Parinaric acid to bovine beta-lactoglobulin and studying the ligand-binding site of the protein using limited proteolysis, 16th International Mass Spectrometry Conference, Edinburgh, 31 Aug - Sept. 5, 2003. 110

6. T. Kremmer, M. É. Szöllősi, B. Vincze, M. Boldizsár, K. Ludányi, K. Vékey, T. Imre, G. Schlosser: RP-HPLC and Mass Spectrometry of Tryptic Fragments Derived from Human Serum AGP. 5th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods, Siófok, 3-5th September, 2003.

7. Tímea Imre, Krisztina Ludányi, Tibor Kremmer, Éva Szöllősi, Károly Vékey; MALDI-TOF MS investigation of the oligosaccharide content of human serum alpha1-acid-glycoprotein; 22nd Informal Meeting on Mass Spectrometry; Tokaj, Hungary 2-6 May, 2004. 8. Molnár-Szöllősi É., Imre T., Ludányi K., Kremmer T., Vékey K.: Humán szérum savanyú α1 glikoprotein oligoszacharid-tartalmának elválasztása és vizsgálata daganatos megbetegedésekben, METT Elválasztástudományi Vándorgyűlés, Hévíz, 2004. szeptember 22-24. 9. Imre T., Ludányi K., Molnárné Szöllősi É., Kremmer T., Pócsfalvi G., Malorni A., Vékey K. Humán szérum alpha-1-savas glikoprotein (AGP) glikozilációs pozícióinak felderítése

RP

capLC-QTof

MS

technikával

METT

Elválasztástudományi

Vándorgyűlés, Hévíz, 2004. szeptember 22-24. 10. Molnár-Szöllősi Éva, Imre Tímea, Ludányi Krisztina, Vékey Károly, Kremmer Tibor: Humán szérum savanyú α1-glikoprotein szerkezeti mikroheterogenitásának vizsgálata, MKE „Vegyészkonferencia 2005”, Hajdúszoboszló, 2005. június 28-30. 11. Molnár-Szöllősi Éva, Imre Tímea, Pulay Tamás, Rosta András, Schneider Tamás, Vékey Károly, Kremmer Tibor: A humán szérum savanyú α1-glikoprotein oligoszacharid szerkezetének vizsgálata daganatos megbetegedésekben, Magyar Onkológusok Társaságának XXVI. Kongresszusa, Budapest, 2005. november 3-5. 12. É. Molnár-Szöllösi, T. Imre, T. Kremmer, B. Vincze, K. Vékey, A. Rosta, T. Pulay, T. Schneider: Functional proteomics of human serum alpha-1-acid glycoprotein. 19th 111

Meeting of the European Association for Cancer Research (EACR 2006), Budapest, Hungary,1-4th July, 2006. 13. Tímea Imre, Károly Héberger, László Drahos, Tibor Kremmer Éva Szöllősi, Gabriella Pócsfalvi, Károly Vékey, Mass spectrometric and statistical analysis of Nglycans of human serum alpha-1-acid glycoprotein from cancer patients and healthy individuals, Conferentia Chemometrica, Budapest, Hungary, September 2-5, 2007.

112

NYILATKOZAT

Alulírott Imre Tímea, kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést magam készítettem és abban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, amelyet szó szerint, vagy azonos tartalomban, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen, a forrás megadásával megjelöltem.

aláírás

Budapest, 2009.05. 07.

113

Fehérjék nemkovalens komplexképzésének és glikozilációjának tömegspektrometriás vizsgálata

Recommend Documents