ELTE
–
1 IEX (labor gyakorlat jegyzet 2015)
Fehérjék elválasztása és tisztítása ioncserélı folyadékkromatográfiával Az ioncserélı folyadékkromatográfia a kis és nagy molekulájú, élettani fontosságú vegyületek (biopolimerek, fehérjék, peptidek, aminosavak, oligo- és polinukleotidok, nukleozidok, stb.) elválasztásának, tisztításának és azonosításának egyik leggyakrabban alkalmazott módszere. Az ioncserélı folyadékromatográfia alkalmazásának elıfeltétele, hogy a mintát alkotó összetevık szerkezetükbıl adódóan ionos, vagy ionizálható vegyületek legyenek. Az elválasztást meghatározó további fizikai-kémiai tényezık - a funkcionális (poláris) csoportok minısége és töltése, - a (makromolekula, biopolimer) izoelektromos pontja, - a pH és ionerısség változására a molekuláris töltés viszonyok változása, - az elválasztandó anyagok molekula tömege és szerkezete, - a minta oldékonysága, - az összetevık detektálhatósága és - biológiai aktivitása, stabilitása, stb. Az ioncserélı folyadékkromatográfiában alkalmazott állófázisok egy hordozó (szilikagél, polimer) szemcse felületén közvetlenül, vagy 6-8 szénatom számú térközt biztosító (spacer) szénhidrogén láncra, vagy karra (arm) kötött, pozitív, vagy negatív töltéssel rendelkezı funkciós csoportot tartalmaznak (1. ábra).
1. ábra Az ioncserélı folyadékkromatográfia álló fázisának típusai. A funkciós csoportok töltése alapján az ioncserélı álló fázisok három típusa különböztethetı meg: - Kationcserélı álló fázisok, ahol a funkciós csoport (pl. szulfonil, karbonil) töltése negatív, tehát pozitív töltéső ellenionok (kationok), ill. minta-összetevık megkötésére, cseréjére képes.
2 - Anioncserélı álló fázisok, ahol a funkciós csoport pozitív töltéső, (pl. primer, szekunder, tercier, kvaterner szubsztituált amino, vagy guanidil, imino csoportok), és az ellenion (anion), ill. a minta-összetevık negatív töltésőek. - Amfoter (kevert) típusok, amelyek komplex szerkezetében a ligandum különbözı mértékben, pozitív és negatív töltéső ionizálható funkciós csoportokat is tartalmaz. A funkciós csoportok ionizálhatóságának erıssége szerint erıs (pl. szulfonil), vagy gyenge (pl. karboxil, foszfát) kationcserélı tölteteket különböztethetünk meg. A primer, szekunder, tercier és kvaterner amino csoportokat tartalmazó anioncserélık erıssége a kötött álló fázis kémiai szerkezetével változtatható. Ilyen módon a nitrogénen szubsztituált csoportok minıségétıl (lánchossz, szerkezet) függıen a különbözı erısségő és szelektivitású anioncserélık széles skálája állítható elı. Figyelembe véve a minta összetevıinek gyenge, vagy erıs disszociációs készségét, általános szabályként megállapítható, hogy a gyengén ionizálható minták erıs, míg az erısen ionos tulajdonságú összetevık gyenge ioncserélı töltetek alkalmazásával vizsgálhatók. A korszerő ioncserélık ma már olyan, keresztkötésekkel térhálósított, makropórusos polimer szemcsékbıl állnak, amelyek szerkezetében és oldalláncain nagyszámú funkciós csoport található. Müller (1990) munkája nyomán az ún. tentacle (tapogató, csáp) elven alapuló ioncserélı töltetek új generációját fejlesztették ki (2. ábra).
R = -COOH, -SO3H
R = CONHR’
R = -CONHR’ 2. ábra. A „tentacle” típusú ioncserélı álló fázisok szerkezete. A tentacle-típusú ioncserélık alkalmazásának egyik elınye, hogy a számos funkcionális csoportot tartalmazó flexibilis láncok (tentacles) a biopolimerekkel, fehérjékkel az áramló fázis terében lépnek kölcsönhatásba. Így a makromolekulák nem kerülnek közel a hordozó szemcsék felületéhez ahol másodlagos, irreverzibilis kölcsönhatások kialakulásával részben, vagy teljesen denaturálódhatnak A tentacle ioncserélık másik jelentıs elınye, hogy a fajlagos kötı kapacitásuk a konvencionális (elsı generációs) ioncserélıkkel
3 szemben lényegesen (átl. kb 10-szer) nagyobb. A biomolekulák konformációját megtartó kíméletes tentacle ioncserélıknél a visszanyerés lényegesen jobb, a veszteség kisebb és javul az elválasztás szelektivitása, mert az ioncsere egyensúlyi reakciói gyorsabbak és a csúcsok uszály (tailing) képzıdése kisebb mértékő. Az ioncserélı folyadékkromatográfia általános követelménye, hogy az áramló fázis a detektálási móddal kompatíbilis legyen, illetıleg az ioncserélıvel (irreverzibilis) komplexeket képezı vegyületeket (pl. többértékő fémsók) ne tartalmazzon. Az ioncserélı folyadékkromatográfia elválasztó képességét (szelektivitását) alapvetıen az áramló fázisa három fıbb tulajdonsága határozza meg: 1. Az áramló fázis kémhatása és ion minısége, amely a kation-, illetıleg anion-cserélı folyadékkromatográfiás elválasztásokhoz megfelelı pH tartományban az 1. és 2. Táblázatokban feltüntetett puffer rendszerekkel biztosítható. Az áramló fázis pH-jának és a pufferek minıségének meghatározó szerepe van: a) az ioncsere egyensúlyi fázisában az ioncserélı töltésének és a megfelelı ellenion (ion környezet) kialakításában, illetıleg a kemoszorpció optimális körülményeinek biztosításában, b) az elválasztandó anyag(ok) (pl. fehérjék) pozitív, vagy negatív töltésének kialakításában, és c) az ioncsere pH-val modulált elúciós fázisában az elválasztandó vegyületek és az ioncserélı között az ionos kölcsönhatások szelektív megváltoztatásában. d) Az áramló fázisban alkalmazott pufferek ion minısége esetenként fajlagos hatással van az elválasztás szelektivitására (pl. az elválasztás (1,3-bis [tris-(hidroximetil) metilamino] propánnal (Bis-tris-propán) megvalósítható, míg foszfát pufferrel nem). 2. Az áramló fázis ionerıssége (I) az ioncsere kölcsönhatásainak, a disszociációs egyensúlyoknak és erısségüknek változtatásával, végsı soron az elválasztandó anyagok kötıdésének erısítésével, vagy gyengítésével (leszorításával) a deszorpció során az ioncserélı kromatográfia kifejlesztésének egyik legfontosabb moduláló tényezıje. Az I értéke az alábbi összefüggésbıl számítható, ahol:
1 I = ∑ ci ⋅ z i2 2 ci – Az i-edik ion koncentrációja, zi2– Az i-edik ion töltés számának négyzete. Hangsúlyozni kell, hogy az ionerısség nem azonos a gyakran feltüntetett molaritással (kivéve az egy vegyértékő ion párokat pl. NaCl). Az ioncserélı folyadékkromatográfiában az ionerısség a meghatározó paraméter és többértékő puffereknél a fenti összefüggéssel kell számítani. 3. Az áramló fázis polaritása az ionos kölcsönhatások (disszociáció fokának) változtatásával az ioncserélı kromatográfia egyik lényeges tényezıje. A rendszerint vizes
4 áramló fázis polaritásának csökkentése vízzel elegyedı szerves oldószerekkel, (pl. metanol, acetonitril) számos komplex elválasztási feladatban lehetıséget ad az elválasztás szelektivitásának érzékeny módosítására. A 3. ábra az ioncserélı folyadékkromatográfia munkafolyamatának négy egymással összefüggı lépését mutatja.
3. ábra. Az ioncserélı kromatográfia munkafolyamatai 1. Az egyensúlyi állapot beállítása, vagy ekvilibrálás az ioncserélı folyadékkromatográfia munkafolyamatának elsı és egyik legfontosabb lépése, amely az elméletileg megtervezett és kiválasztott töltetet (erıs, vagy gyenge, anion- vagy kationcserélı) az optimált körülményeket (puffer, pH, ionerısség, stb.) biztosító áramló fázis (eluens A) alkalmazásával a minta elválasztandó összetevıinek megkötésére elıkészíti. Az ioncserélı töltet egyensúlyi állapotának beállítására (kondicionálására) általában 3-5 oszloptérfogat eluens átmosása szükséges. Az egyensúlyi állapot beállításának praktikus szempontja, hogy a komplex (biológiai) mintákban jelenlévı, szennyezı (ballaszt) és a módszer kapacitását, felbontóképességét zavaró anyagok még az érdemi elválasztási folyamat elıtt (gradiens elúció) eltávolíthatók és az ekvilibráló eluenssel leoldhatók. Ez lényegében az oszlopon végrehajtható minta elıkészítési lépésnek (SPE – clean up) is tekinthetı. 2. A kemoszorpció során az egyensúlyi áramló fázisban oldott mintát a töltetre felvisszük (minta adagolás-injektálás), melynek során a minta vizsgálandó összetevıi a tölteten megkötıdnek. Ezután az oszlopot 2-3 térfogatnyi eluenssel átáramoltatjuk, és a nem kötıdı (egyéb, szennyezı) anyagokat leoldjuk. A kemoszorpció körülményeit optimálisan megválasztva az ioncserélı kromatográfia un. „bekoncentráló” módszernek tekinthetı (selective enrichment) és így viszonylag kevéssé érzékeny a minta térfogatára. Esetenként (pl. igen híg hatóanyagot tartalmazó mintáknál) 5-10-szeres oszloptérfogatú minta is alkalmazható. Az oszlopra maximálisan felvihetı vizsgálandó anyag mennyiségét (térfogat, koncentráció) az ioncserélı töltet un. fajlagos kötési kapacitása (célvegyület mM-mg/g töltet) szabja meg. Ezt a un. „áttörési” anyagmennyiséget (térfogat vagy koncentráció értéket) az elızetes vizsgálatok során meg kell határozni.
5 3. A deszorpció (leoldás, elució, elválasztás) az ioncserélı folyadékkromatográfia leglényegesebb lépése, amely az áramló fázis tulajdonságainak, elsısorban az ionerısség, pH és a polaritás szisztematikus megváltoztatásával lehetıséget ad töltetrıl az elválasztandó vegyületek (csoportok) szelektív leoldására (frakcionálására). A deszorpció technikailag két módon, izokratikus és/vagy gradiens elúcióval valósítható meg (4. ábra). A deszorpció legegyszerőbb formája az izokratikus elució, ahol az áramló fázis összetétele (pH, ionerısség, polaritás) az elúció során állandó, de az egyensúlyi körülményektıl eltérı lehet. Az izokratikus elucióval számos egyszerő csoport elválasztási feladat megoldható. Összetett anyagkeverékek frakcionálásának optimális körülményeit elsı lépésben az áramló fázis összetételének szisztematikus, lépcsızetes izokratikus változtatásával határozhatjuk meg (4. ábra – B diagram). Ezt követıen kerülhet sor komplex (lineáris, konvex, konkáv) gradiens elúciós programok tervezésével és alkalmazásával az érdemben vizsgálandó vegyületek részletesebb elválasztására (4. ábra – C és D diagramok). Az 5. ábra a lineáris gradiens elució során a gradiens iránytangensének hatását mutatja az elválasztásra. 4. A töltet regenerálása lényegileg az áramló fázis összetételének erélyes megváltoztatásával (magas ionerısség, pH, adalékok, stb.) az erısen kötıdı (szennyezı) anyagok eltávolítására és az oszloptöltet tisztítására irányul. A körfolyamat végét az oszlop ismételt felhasználását elıkészítı egyensúlyba állítás képezi.
Jel (AU)
I pH
A
B C
D
V0 (t0)
Elúciós térfogat (idı)
4. ábra. A gradiens elució formái az ioncserélı kromatográfiában. A minta szennyezı (ballaszt) anyagainak (A) lemosása után az összetevık az eluens tulajdonságainak (I, pH, polaritás) változtatásával izokratikus-lépcsızetes (B), lineáris, konvex, konkáv (C), vagy összetett (D) gradiens elúciós programokkal választhatók el.
6 Az ioncserélı kromatográfia gyakorlatilag minden olyan folyadékkromatográfiás készülékkel (rendszerrel) elvégezhetı, amely programozott (manuális) üzemmódban lehetıséget ad két (három) oldószerelegybıl a gradiens elúció megvalósítására. A folyadékkromatográf vázlatos felépítését és mőködési elvét a 6. ábra szemlélteti
Jel (AU)
I pH
X
Y
A-gradiens
YAB XAB B-gradiens Elúciós térfogat (idı)
5. ábra. Lineáris gradiens elúció iránytangensének hatása az ioncserélı kromatográfia elválasztó képességére. XAB és YAB a minta összetevıinek (X, Y) elúciós paraméterei az A és B gradiens programokon.
A feladat: Csoportos foglalkozás keretén belül középnyomású ioncserélı folyadékkromatográfiás rendszer (FPLC) vázlatos felépítésének, szerkezeti elemeinek és mőködési elvének részletes ismertetése. Anioncserélı (TMAE) kromatográfiás oszlopon, egyidejő pH és ionerısség gradiens elució alkalmazásával humán szérum fehérjék (albumin és AGP) preparatív és analitikai elválasztása. Minta injektálás, és komplex (összetett, lineáris gradiens) elúciós program használatával kromatográfiás felvételek leképezése és kiértékelése. A retenciós idık reprodukálhatóságának és hibájának (RSD) számítása. Különbözı iránytangenső lineáris gradiens elúciós programok hatásának vizsgálata az elválasztandó fehérjék retenciójára és az elválasztás szelektivitására. A jegyzıkönyvben szerepeljen: 1. A folyadékkromatográf felépítésének és mőködési elvének vázlata. 2. A fehérjék és az ioncserélı állófázis között létrejövı reakciók egyenletei. 3. A retenciós idık függése a gradiens elúció iránytangensétıl. 4. Na2HPO4 puffer oldat ionerısségének (I) számítása.
7
1. Táblázat
A kationcserélı kromatográfiában használt pufferek
Puffer
pKa
Foszfát
2,12 7,21 12,32 3,06 4,74 6,40 3,75 4,20 4,75 4,75 5,69 6,15 6,62 6,80 6,80
Citrát Formiát Szukcinát Acetát N-Metil piperazin Malonát 2-(N-morfolino)etán szulfonsav (MES) N-(2-acetamido) iminodiecetsav (ADA) Piperazin-1,4 bis (2-etán szulfonsav) (PIPES) (1,3-Bis [tris-(hidroximetil) metilamino] propán (Bis-tris-propán) 3-(N-morfolino) propánszulfonsav (MOPS) HEPES Borát Glicilglicin
pH tartomány 1,1-3,1 6,7-7,6 11,8-12 2,4-3,4 3,7-5,7 4,4-6,4 3,8-4,3 4,3-4,8 4,8-5,2 4,5-5,0 5,0-6,0 5,5-6,7 5,8-6,9 5,9-7,1 6,4-7,3
7,20 7,55 9,35 3,14 8,25
6,5-7,5 7,6-8,2 8,2-10,2
2. Táblázat Az anioncserélı kromatográfiában használt pufferek Puffer Bis tris-(hidroximetilamino) metán (1,3-Bis [tris-(hidroximetil) metilamino] propán (Bis-tris-propán) Trietanolamin Tris-hidroximetilamino metán N-Metil dietanolamin Dietanolamin 1,3 Diaminopropán Etanolamin 2-(Ciklohexilamino) etánszulfonsav (CHES) 3-(Ciklohexilamino) propánszulfonsav (CAPS) Foszfát
pKa 6,50 6,80
pH tartomány 5,8-6,4 6,4-7,3
7,80 8,16 8,54 8,90 8,54 10,47 9,50 9,50 10,40
7,3-7,7 7,6-8,0 8,0-8,5 8,4-8,8 8,5-9,0 9,8-10,3 9,0-9,5 8,9-10,2 9,7-10,6
12,3
11,08-12,0
8
Eluens
A
A pumpa Mágneses keverı Eluens
B
Ioncserélı oszlop
UV detektor
Minta adagoló (Fractogel TMAE)
Frakcionált gyüjtés
B pumpa Vezérlı egység Programozás Integrátor
Detektor jel
6. ábra. Ioncserélı folyadékkromatográfiás rendszer vázlatos felépítése.
