ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE
Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra genetiky a šlechtění
Polymorfismus genu pro dopaminový receptor D4 u plemene border kolie Diplomová práce
Vedoucí práce: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl Autor práce: Lenka Holasová
2011
Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem svoji diplomovou práci na téma „Polymorfismus genu pro dopaminový receptor D4 u plemene border kolie“ vypracovala samostatně, s pomocí vedoucího práce doc. Dr. Ing. Pavel Vejla a konzultantky Ing. Daniely Čílové, a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţené bibliografii. V Praze dne 31. března 2011 Podpis autora práce:
Poděkování Především děkuji mým rodičům za nejdůleţítejší podporu během celého studia. Ráda bych touto formou poděkovala vedoucímu diplomové práce doc. Dr. Ing. Pavlu Vejlovi, konzultantce Ing. Daniele Čílové a Ing. Jakubovi Vaškovi za rady a odborné vedení. Děkuji všem majitelům border kolií, kteří poskytli souhlas s vyuţítím DNA jejich psa pro tuto práci, ochotně asistovali u odběru a vyplnili důleţitý dotazník. Zvláštní dík patří Vladaně Šimkové a Šárce Kejvalové za oslovování dalších účastníků studie. Ve stejné řadě děkuji svému příteli Hynkovi, který se mnou podnikal mnoho někdy nechtěných výletů za odběrem vzorku a investoval do diplomové práce hodně času a trpělivosti. Řešení diplomové práce bylo podpořeno Výzkumným záměrem FAPPZ ČZU v Praze MSM 6046070901 a grantovým projektem FRVŠ MŠMT 2730/2010.
SOUHRN Polymorfní oblast genu pro dopaminový receptor D4 (DRD4) je spojována s povahovými rysy osobnosti jako je především schopnost se soustředit a hledání nového. Dopaminové dráhy jsou součástí odměňovacího systému mozku organismu; jsou tak zapojeny do systémů motivace a dlouhodobé paměti a zúčastňují se procesu učení. Polymorfismus v genu DRD4 byl zkoumán u lidí i u mnoha plemen psů. Dvě předchozí studie se věnovaly porovnávání povahových rysů německých ovčáků a bearded kolií a jejich variantou genu DRD4. Tato práce se zaměřuje na ověření vztahu polymorfismu genu DRD4 a povahových vlastností psů plemene border kolie. Border kolie jsou proslulé svou inteligencí, vrozeným instinktem pro práci se zvířaty, ochotou těţce pracovat a fenomenální schopností spolupráce s člověkem. Tito psi byli vţdy šlechtěni pouze na základě povahy a pracovních schopností. Vzorky DNA byly získány od 100 border kolií stěrem buněk bukální sliznice. Identifikace jednotlivých alel exonu 3 genu DRD4 byla provedena pomocí PCR a kapilární gelové elektroforézy. U border kolií byly nalezeny tři různé alely 435, 447a, 498 z osmi moţných. Nejvyšší četnosti dosahovala alela 447a, coţ lze povaţovat za typické pro plemena psů pocházejících z evropského kontinentu. Sekvenační analýza nalezených alel potvrdila jejich totoţnost s publikovanými alelami. Ze stejného důvodu byla stanovena aminokyselinová sekvence části proteinu kódovaném zjištěnými alelami exonu 3 genu DRD4 a opět byla potvrzena totoţnost alel jako 435, 447a a 498. Na základě dotazníkového šetření byl charakterizován stupeň nepozornosti a aktivityimpulzivity u 89 border kolií. Dvouvýběrovým t-testem byl prokázán statisticky významný rozdíl na hladině významnosti α=0,05 ve skóre pro nepozornost u fen genotypu 447a/447a a fen genotypu s alespoň jednou alelou 498. Při ostatních šetření týkajících se skóre pro nepozornost nebyla potvrzena statisticky významná závislost na alele či genotypu, nicméně pravděpodobnost shody se pohybovala ve velmi nízkých hodnotách. Alela 447a v homozygotní sestavě prokazatelně působí na sniţování nepozornosti u border kolií, především u fen tohoto plemene. U dalších šetření týkající se aktivityimpulzivity nebyla potvrzena statisticky významná závislost. Klíčová slova: D4 dopaminový receptor, border kolie, exon 3, gen DRD4, PCR
SUMMARY The D4 dopamine receptor (DRD4) polymorphic area is associated with personality traits such especially as the ability to concentrate and novelty-seeking. Dopamine pathways are part of the brain reward system of the organism; so they are involved in the system of motivation and long-term memory and participates in the learning process. Polymorphism of the DRD4 gene has been studied in humans and many breeds of dogs. Two previous studies concentrated on comparing the personality traits of German shepherds and Bearded Collies and their DRD4 gene variant. This study aims to verify the relationship between the DRD4 gene polymorphism and personality traits of the breed border collie dogs. Border Collies are known for their intelligence, an innate instinct for working with animals, willing to work hard and a phenomenal ability to cooperate with humans. These dogs have always been bred only on the nature and working ability. DNA samples were obtained from 100 Border Collies swabbing cells from buccal mucous membrane. Identification of alleles of exon 3 of DRD4 gene was performed by PCR and capillary gel electrophoresis. Three different alleles 435, 447a, 498 of the possible eight were found in Border collies. The highest frequency reached 447a allele, which may be regarded as typical for the breed of dogs originating from the European continent. Sequencing analysis of the found alleles confirmed the identity of the alleles already published. For the same reason, the amino acid sequence of proteins encoded by the identified alleles of exon 3 of DRD4 gene was determined and the identity of the alleles as 435, 447a and 498 was once again confirmed. Based on a questionnaire survey a degree of inattention, impulsivity and activity was characterized in 89 Border Collies. Independent samples t-test confirmed a statistically significant difference in scores for inattention in females with 447a/447a genotype and females with genotype with at least one allele of the 498 on the significant level α=0.05. Statistically significant dependence result of score for inattention on allele or genotype was not confirmed for other inquiries, however, the probability of compliance varied in very low levels. The 447a allele in the homozygous group has proven to reduce the inattention of border collies, especially in females of this breed. For other inquiries concerning the activity-impulsivity was not confirmed statistically significant correlation. Key words: D4 dopamine receptor, Border collie, polymorphism, exon 3, DRD4 gene
OBSAH 1
Úvod....................................................................................................................................9
2
Cíl práce ............................................................................................................................10
3
2.1
Vědecké hypotézy, ze kterých vychází řešení diplomové práce ................................10
2.2
Konkrétní cíle pro řešení diplomové práce ................................................................11
Přehled literatury...............................................................................................................12 3.1
3.1.1
Border kolie a způsob práce se zvířaty ...............................................................12
3.1.2
Historie a chov plemene v zemi původu - Velké Británii...................................13
3.1.3
Chov border kolií v České republice ..................................................................16
3.1.4
Sporty, ve kterých border kolie zcela vynikají ...................................................18
3.1.5
Vzhled border kolií a barvy ................................................................................21
3.2
Dopamin .....................................................................................................................25
3.2.1
Historie................................................................................................................25
3.2.2
Syntéza a skladování ...........................................................................................26
3.3
Dopaminové receptory ...............................................................................................26
3.3.1
Dopaminové neurony v mozku ...........................................................................27
3.3.2
Dráhy odměny v mozku ......................................................................................28
3.3.3
Dopaminový receptor D4....................................................................................30
3.3.4
Polymorfismus genu DRD4 u psů ......................................................................31
3.4
4
Charakteristika plemene border kolie ........................................................................12
Metody molekulární biologie .....................................................................................35
3.4.1
Polymerázová řetězová reakce (PCR) ................................................................35
3.4.2
Restrikční štěpení PCR produktů ........................................................................36
3.4.3
Kapilární elektroforéza fluorescenčně značených DNA fragmentů ...................37
Materiál a metodika ..........................................................................................................41 4.1
Hodnocené genotypy..................................................................................................41
4.2
Izolace genomické DNA z buněk bukálních sliznic ..................................................41
4.3
Amplifikace Exonu 3 genu DRD4 pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) ...45
4.3.1
Pouţité primery ...................................................................................................45
4.3.2
První amplifikace - sloţení reakční směsi a podmínky ......................................45
4.3.3
Identifikace alel v lokusu DRD4 pomocí ABI PRISM 310® (Applied
Biosystems) .......................................................................................................................45 4.3.4
Druhá amplifikace - sloţení reakční směsi a podmínky .....................................46
4.4
Sekvenační analýza markeru exonu 3 genu DRD4 ....................................................48
4.4.1
Sekvenované genotypy .......................................................................................48
4.4.2
Gelová purifikace fragmentů ..............................................................................49
4.4.3
Sloţení a příprava sekvenční reakce ...................................................................49
4.4.4
Teplotní a časové podmínky při amplifikaci sekvenční reakce ..........................50
4.4.5
Přečištění sekvenční reakce ................................................................................50
4.4.6
Vlastní sekvence PCR produktů s vyuţitím genetického analyzátoru ABI
PRISM 310® Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ....................................................50 4.5
Zpracování dotazníku pro odhad psychických vlastností psů ....................................50
4.6
Bioinformatické a statistické vyhodnocení výsledků .................................................51
4.6.1
Bioinformatické databáze a programy ................................................................51
4.6.2
Statistické vyhodnocení vztahů mezi bodovým hodnocením dotazníků
a genotypem exonu 3 genu DRD4 ....................................................................................51 4.7 5
Výsledky ...........................................................................................................................54 5.1
Izolace DNA...............................................................................................................54
5.2
Detekce alel exonu 3 genu DRD4 ..............................................................................54
5.3
Výsledky sekvenační analýzy nalezených alel ..........................................................56
5.3.1
Srovnání sekvence PCR produktů námi identifikovaných alel ..........................56
5.3.2
Vyhodnocení aminokyselinové sekvence produktů genu DRD4 .......................59
5.4
6
Analýza frekvence alel lokusu DRD4 ........................................................................53
Výsledky statistického zpracování hodnot získaných z dotazníků ............................61
5.4.1
Hodnocení ADHD dotazníku..............................................................................64
5.4.2
Výsledky parametrického t-testu ........................................................................64
Diskuze .............................................................................................................................69 6.1
Soubor hodnocených jedinců .....................................................................................69
6.2
Izolace DNA...............................................................................................................70
6.3
Detekce alel exonu 3 genu DRD4 ..............................................................................71
6.4
Sekvenační analýza alel 435, 447a, 498 exonu 3 genu DRD4...................................73
6.5
Aminokyselinová sekvence exonu 3 genu DRD4 ......................................................73
6.6
Statistické zpracování dotazníků ................................................................................74
7
Závěr .................................................................................................................................80
8
Seznam literatury ..............................................................................................................83
9
Seznam pouţitých zkratek a symbolů ...............................................................................89
SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1 – Plemenný standard Příloha 2 - Odběr vzorku DNA ze sliznice dutiny ústní Příloha 3 - ADHD dotazník validovaný pro majitele psů Příloha 4 - Schéma syntézy katecholaminů Příloha 5 - Výsledky jednotlivých testování uvedených v kapitole 4.6.2 Příloha 6 – fotografie laboratoře sekvenčních analýz Katedry genetiky a šlechtění FAPPZ ČZU a přístroje ABI PRISM 100® (Applied Biosystems) Příloha 7 - Autoři fotografií
1 ÚVOD Border kolie je plemeno psa proslulé svou inteligencí, vrozeným instinktem pro práci se zvířaty a ochotou těţce pracovat. Border kolie nikdy nebyly šlechtěny pro vzhled, vţdy jen na základě povahy a pracovních schopností. Výstavní kruhy se plemeni otevřely aţ v roce 1976, po sto letech šlechtění pouze na základě pracovních schopností. V dnešní době jsou border kolie k vidění především v oblasti psích sportů jako jsou agility, dodancing, dogfrisbee, flyball a obedience, kde často o řády převyšují svými výkony ostatní plemena. Svojí schopností spolupráce s člověkem a učením se nových úkolů získaly border kolie po celém světe mnoho příznivců, kteří nechtějí pouze „psa“, ale přemýšlivého společníka. V této diplomové práci se zabývám hodnocení některých povahových vlastností jedinců plemene border kolie a srovnávám je variantou polymorfismu v genu pro dopaminový receptor D4 daných jedinců. Dopaminové receptory jsou bílkovinné struktury cytoplazmatické membrány buněk, které mají schopnost vázat hlavní katecholaminový neurotransmiter v mozku savců dopamin. Dopaminové receptory D4 se nejvíce vyskytují v čelním v oblastech mozku, které hrají důleţitou roli pro schopnost se soustředit, dále schopnost zvanou „novelty-seeking“, tedy hledání nového a které jsou součástí odměňovacího systému pro mozek organismu. Různé obměny genu pro tento receptor D4 jsou spojovány se syndromem hyperaktivity u dětí. V současné době je studiu dopaminových drah v mozku věnována velká pozornost vzhledem k návaznosti na vznik závislosti na drogách, kouření, hazardních hrách u lidí s určitými variantami genu pro dopaminové receptory. Předmětem této diplomové práce je ověřit hypotézu o vztahu mezi polymorfismem markeru exonu 3 genu pro dopaminový receptor D4 a psychickými vlastnostmi border kolií. Efekt tohoto genu se podařilo prokázat například u německých ovčáků, a to v oblasti aktivityimpulzivity, povahové sloţce, která bývá sledována při určování stupně hyperkinetického syndromu s poruchou osobnosti u dětí. Konkrétním předmětem zájmu práce se tedy stalo ověření hypotézy o vztahu polymorfismu genu pro dopaminový receptor D4 a stupněm aktivity-impulzivity a nepozornosti u sledovaných border kolií.
9
2 CÍL PRÁCE Vědecké hypotézy, ze kterých vychází řešení diplomové práce
2.1
Pro řešení diplomové práce byly vybrány vědecké hypotézy, které odpovídají aktuálním metodám molekulární genetiky pouţívaným při studiu genomu psa. Tyto hypotézy vycházejí ze studia problematiky molekulárních mechanismů souvisejících se schopností psa se soustředit a se stupněm jeho aktivity-impulzivity. Mezi nejdůleţitější vědecké hypotézy, na kterých je postaveno řešení diplomové práce, patří:
Řada psychických vlastností a schopností psů můţe být ovlivněna strukturou dopaminového receptoru
Je známá úloha dopaminového receptoru DRD4 včetně molekulární charakteristiky exonových a intronových částí genu, který tento receptor kóduje
V exonu 3 genu DRD4 byla popsána řada mutací vycházejících z opakování určitých sekvenčních motivů a tyto mutace jsou řadou autorů dávány do souvislostí psychickými vlastnostmi a schopnostmi nejen u psů, ale i u ostatních savců, včetně člověka
Konkrétně u polymorfismu psího genu DRD4 byla v exonu 3 identifikována alela 447a, která má předpokládanou souvislost s vyšší schopností psů se soustředit a současně vykazovat vyšší aktivitu
Metoda polymerázové řetězové reakce představuje účinný nástroj, kterým lze amplifikovat vybrané části genomu
Fragmentační analýza realizovaná na základě kapilární elektroforézy je vhodnou metodou pro identifikaci variability exonu 3, která vyplývá z opakování určitých sekvenčních motivů
Sekvenačními technikami je moţné ověřit skutečnou velikost amplifikovaných fragmentů
a současně
potvrdit
sekvenční
identitu
detekovaných
alelických
polymorfismů s výsledky publikovanými ve vědeckých pracích nebo v mezinárodních nukleotidových databázích
10
Konkrétní cíle pro řešení diplomové práce
2.2
Cíle pro řešení diplomové práce je moţné shrnout do následujících bodů:
Vybrat vzorek populace plemene border kolie, který bude obsahovat vyrovnaný počet psů a fen pocházejících z evropských chovatelských stanic
Izolovat vysokomolekulární genomickou DNA z buněk bukálních sliznic, která bude mít vhodnou kvalitu i kvantitu pro následné molekulární analýzy
Optimalizovat metodický postup PCR amplifikace částí exonu 3 genu DRD4
Optimalizovat fragmentační analýzu pomocí genetického analyzátoru ABI PRISM 310® (Applied Biosystems)
Vybrat fluorescenční značení primerů, které umoţní jednoznačnou identifikaci velikosti PCR amplikonů pomocí programu GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems)
Stanovit jednotlivé alelické kombinace u všech hodnocených zvířat
Optimalizovat přímou sekvenaci polymorfních alel genu DRD4 s vyuţitím genetického analyzátoru ABI PRISM 310® (Applied Biosystems)
Pomocí programu SeqScape 5.1 (Applied Biosystems) a CLC Main Workbench 6.0.1 (CLC) vyhodnotit sekvenční polymorfismy a porovnat je s jiţ publikovanými výsledky
Zpracovat populační studii, která vyjádří frekvence jednotlivých alel ve studované populaci pomocí programu Cervus 3.0.3
U všech psů provést hodnocení stupně aktivity-impulzivity a nepozornosti pomocí standardizovaného mezinárodně pouţívaného dotazníku
Pomocí parametrického t-testu zpracovat statistickou analýzu s cílem charakterizovat vztah mezi alelickými kombinacemi genu DRD4 a průměrnými hodnotami skóre pro aktivitu a impulzivitu a pro nepozornost
11
3 PŘEHLED LITERATURY 3.1
Charakteristika plemene border kolie Border kolie jsou nenápadné plemeno psa vyšlechtěné pro práci s ovcemi. Výstavní
kruhy se plemeni otevřely aţ v roce 1976, po sto letech šlechtění pouze na základě pracovních schopností. Z toho plynou typické vlastnosti border kolií po generace spolupracujících s člověkem. Border kolie je plemeno psa proslulé svou inteligencí, vrozeným instinktem pro práci se zvířaty a ochotou těţce pracovat. Tyto schopnosti byly upevňovány selekcí po mnoho generací, přičemţ border kolie nikdy nebyly šlechtěny pro vzhled (The International Sheep Dog Society, 2007). Border kolie se tradičně umisťují na prvním místě v pomyslném ţebříčku plemen psů srovnaných podle pracovní inteligence, měřené podle nutného počtu opakování nového cviku vedoucího k pochopení úkolu psem a dále podle procenta splněných známých úkolů po vydání prvního povelu (Coren, 2007). Jsou to psi workholici, milují práci, vydrţí přesně a neúnavně pracovat mnoho hodin. Ţádné jiné ovčácké plemeno si neuchovalo instinkt shánět stádo zvířat dohromady a přivádět k ovčákovi tak silně (Loučka, 2008).
3.1.1 Border kolie a způsob práce se zvířaty Práce se stádem zvířat je původním pracovním určením border kolií. Úkolem border kolie vţdy bylo najít ovce roztroušené na pastvinách, sehnat je do stáda a poté je přihnat k ovčákovi. Border kolie při této práci neštěká, ani zvířata nepohání kousáním, ovce ovládá soustředěným pohledem a pohybem těla (Obrázek č. 1). Vše je zaloţeno na principu lovu, který je u border kolií zablokován ve fázi „vystavování“, tedy v plíţivém pohybu a naprostém soustředění na kořist těsně před útokem (Mikulica, 1991; Verhoeff-Verhallen, 2002; Vejrosta, 2009). Důleţitým faktorem je při tomto stádový pud naháněných zvířat. Ve chvílích, kdy se cítí ohroţena predátorem, shluknou se do stáda aby byla méně zranitelná. Zvířata v kompaktním stádu můţe border kolie přihnat k ovčákovi nebo podle jeho povelů hnát na určená místa (Obrázek č. 2). Border kolie při přihánění zvířat neustále hlídají soudrţnost stáda z ideální vzdálenosti a jsou vţdy připraveny neposlušné jedince tělem, upřeným pohybem případně štípnutím do srsti zahnat zpět do stáda (Loučka, 2008).
12
Pasení zvířat border koliemi je záleţitost, které se věnovalo mnoho zahraničních autorů a rozhodně téma nebylo vyčerpáno. Vycvičit border kolii k perfektní práci trvá mnoho let a je zapotřebí důkladná obsáhlá teoretická příprava. Obrázek 1: Border kolie ovce ovládá soustředěným pohledem a pohybem těla
Obrázek 2: Border kolie přihání stádo k ovčákovi nebo dle povelů na určená místa
3.1.2 Historie a chov plemene v zemi původu - Velké Británii Pracovní
kolie
byla
vyšlechtěna
na
hranicích
mezi
Anglií
a
Skotskem
(The International Sheep Dog Society, 2007). Jiţ od 16. století zde ovčáci vybírali z pasteveckých psů jedince, kteří vynikali ovladatelností a prací se stádem. Hlavní náplní těchto psů nebylo hlídání stáda ovcí před divokými šelmami, tedy práce pasteveckých psů, ale rychlé sehnání a přivedení stáda k ovčákovi na základě jeho povelů (Műller, 2001). Ovčáci si
13
nejlepší psy navzájem pronajímali, zřejmě proto jsou border kolie snadno ovladatelné i cizím člověkem. Štěňata si nechávali pouze po psech s nejlepšími ovčáckými schopnostmi, nehledíce na vzhled. Pro vzájemné porovnání psů začali pořádat závody v přihánění ovcí, tzv. trialy. První zaznamenaný mezinárodní trial se konal v roce 1873 u obce Bala v Severním Walesu. William Wallace předvedl o deset let později typickou práci ovčáka s border kolií, kterou vedl na dálku pouhým sykotem a hvízdáním a gesty rukou. Do chovu byli pouštěni pouze psi s nejlepším „okem“ pro práci. V roce 1890 Adam Telfer odchoval a vytrénoval psa, který je povaţován za typického představitele plemene border kolie a zakladatele chovu. Pes se jmenoval Old Hemp (Obrázek č. 3). V této době uţ začaly vznikat první spolky sdruţující chovatele „kolií z oblasti hranic“. Označení „border kolie“ se začalo pouţívat po roce 1900. (The International Sheep Dog Society, 2007) Obrázek 3: Typický představitel plemene a zakladatel chovu pes Old Hemp
Zdroj: http://www.isds.org.uk/society/function_purpose/history.html
International Sheep Dog Society, která dodnes sdruţuje chovatele ryze pracovních borderkolií, byla zaloţena v roce 1906, v Haddingtonu, ve Skotsku (The International Sheep Dog Society, 2007). V srpnu téhoţ roku se konala první soutěţ v přihánění ovcí ve městečku Gullan. Postupně se k International Sheep Dog Society připojovaly další národy Velké Británie, v roce 1965 Irsko. V 80. letech 20. století se popularita trialů, soutěţí v pasení, rozšířila i na pevninskou část Evropy a mnoho zemí se k International Sheep Dog Society (ISDS) připojilo jako zámořští členové. Nicméně stále je ISDS nepovaţovalo za řádné členy. Teprve od roku 2004 jsou řádnými členy kromě Velké Británie a Irska také Rakousko, Brazílie, Česká republika, Itálie, Faerské ostrovy, Německo a Holandsko (The International Sheep Dog Society, 2007). Počty narozených a registrovaných štěňat klubem ISDS zobrazuje graf 1.
14
Graf 1: Počty narozených štěňat a registrovaných border kolií klubem ISDS v letech 1950 aţ 2010.
Zdroj: http://www.bcdb.info/nreg.htm
Britský Kennel Club uznal standard border kolie aţ v roce 1976, Mezinárodní kynologická federace v roce 1986 (Műller, 2001; Vejrosta, 2009; La Fédération Cynologique Internationale, 2011). Standard plemene border kolie je přílohou 1 této diplomové práce. V současné době lze border kolie ve Velké Británii chovat pod dvěma různými kluby, a to International Sheep Dog Society nebo pod Mezinárodní kynologickou federací, respektive britským Kennel Clubem. Jako jediné plemeno můţe mít border kolie ve Velké Británii dvojí registraci, jak pod Kennel Clubem, tak pod International Sheep Dog Society. Průkaz původu ISDS je uznáván Kennel Clubem, ale naopak tato cesta moţná není. I tím je vyjádřena úcta k původnímu zaměření border kolií (Loučka, 1999). Zájem o border kolie stále stoupá. Vývoj počtu nově zaregistrovaných jedinců britským Kennel Clubem je znázorněn v grafu 2.
15
Graf 2: Počet nově zaregistrovaných border kolií britským Kennel Clubem v letech 2001 - 2010 (narozená
3000
2604
2500 2010
2113
2111
2230
2247
2219
2359
2375
2356
2000 1500 1000 500
20 10
20 09
20 08
20 07
20 06
20 05
20 04
20 03
20 02
0
20 01
Počet nově zaregistrovaných jedinců
štěňata + importovaní jedinci)
Rok
Zdroj: http://www.thekennelclub.org.uk/download/5673/10-yearly-Breeds-Stats-pastoral.pdf
3.1.3 Chov border kolií v České republice První border kolii dovezl na naše území z Německa v roce 1985 ovčák a mistr republiky v pasení z roku 1984 E. Mlynarčík. Fena neměla oficiální průkaz původu, neboť FCI uznalo border kolii jako samostatné plemeno aţ v roce 1986 a byla vyuţívána pouze k pasení ovcí (Loučka, 1999). Border kolie byly zpočátku registrovány pod Klubem málopočetných plemen psů spadající pod Českomoravskou kynologickou unii (ČMKU), kdy bylo k uchovnění psa nutné předvést psa na klubové nebo speciální výstavě a pes musel získat alespoň jednou ocenění „výborný“. První border kolií oficiálně registrovanou ČMKU byla v roce 1993 fena Mobella Jackie, importovaná z Anglie, číslo dvě získal také importovaný pes Caristan Jaguar. První registrovaný vrh štěňat se narodil v chovatelské stanici Czechmate v roce 1994, bohuţel chybí údaje o štěňatech, prvním kompletně zaznamenaným vrhem je „A“ vrh chovatelské stanice Bohemia Alké z 22.4.1994 (Hanačíková, 2000). Pravidlo o předvedení border kolie na klubové výstavě a získání ocenění „výborný“ zcela odporovalo filozofii vzniku plemene border kolie a jeho určení a převáţně proto byl v roce 1999 zaloţen samostatný Border Collie Club Czech Republic (BCCCZ), který funguje dodnes a snaţí se propagovat původní pracovní určení border kolií a i další sportovní uplatnění těchto psů. BCCCZ spadá pod Českomoravskou kynologickou unii a tedy psi odchovaní pod tímto klubem získávají průkaz původu FCI. U zrodu klubu stáli především Radko Loučka, Ivo Bartek, Alexandra Grygarová, Michal Krejčí, Nikol Hanačíková, Š.
16
Balcarová, M. Dostálová, L.Vojtěchová, S. Sochorová (Loučka, 1999). Border kolie stále získávají na větší oblibě především díky jejich výborným predispozicím pro moderní psí sporty jako jsou agility, dogdancing atd. (Loučka, 2008). Graf č. 3 znázorňuje vývoj v počtu odchovaných štěňat a počtu vrhů s FCI registrací od roku 1994 do roku 2010 v České republice. Graf 3: Počet vrhů a narozených štěňat border kolií v České republice s FCI registrací odchovaných pod klubem BCCCZ za roky 1994-2010
805
900
Počet nar. štěňat
600
Počet vrhů
126 62
11
54
4
55
5
19
0
33
3
0
21
200 100
9
12
19
35
324
263
200
300
281
400
46
378
500
44
493
507
700
649
800
56
65
91
84
113
138
20 10
20 09
20 08
20 07
20 06
20 05
20 04
20 03
20 02
20 01
20 00
19 99
19 98
19 97
19 96
19 95
19 94
0
Zdroj: Klubové zpravodaje Borderholic 1999-2008 a Monika Švarcová, poradce chovu BCCCZ
Border kolie lze v České republice chovat i pod International Sheep Dog Society, britskou organizací, jejíţ členem je Česká republika od roku 2004 (The International Sheep Dog Society, 2001). Chov v ČR zaštiťuje Klub Pracovních Ovčáckých psů o.s. a řídí se pravidly ISDS. Chovatel například musí ţádat o originální předlohu průkazu původu ISDS, kterou sám vyplňuje. Vše je zaloţeno na poctivosti chovatele a odhadnutí pracovních schopností rodičovského páru. V rámci ISDS nejsou pořádány svody psů a bonitace ani omezení chovnosti věkem fen. Jediný poţadavek je vyšetření očních chorob PRA a CEA. Pes, který je registrován pod ISDS a je narozen mimo území Velké Británie, nemůţe nikdy získat také zápis v plemenné knize FCI (Klub pracovních ovčáckých psů České republiky, 2004). Pes se tak nemůţe zůčastnit mnoha vrcholových soutěţí pořádaných Mezinárodní kynologickou unií (FCI), kde je vyţadován oficiální průkaz původu FCI, jako například mistrovství světa v agility (Federation Cynologique Internationale, 2007).
17
Soutěţe v ovčáckém pracovním uplatnění border kolií v České republice V České republice se konají závody a zkoušky v pasení ovcí nebo jalovic border koliemi. Tyto akce zaštiťuje především Border Collie Club Czech Republic. První závodní trial se konal v Česné republice v roce 2001 ve Lhůtě u Vysokého Mýta a zúčastnilo se ho celkem 12 psů. Vítězem kategorie Trial 1 se stal pes Mouse Di Cambiano, vyšší kategorie Trial 2 fena Etna Akumulátor (Loučka, 2001). První mistrovství BCCCZ v pasení proběhlo v září 2001 a vítězem v tradičním anglickém stylu se stal pes Mouse Di Cambiano (Loučka, 2002). Mistrovství BCCCZ v pasení v roce 2010 mělo jiţ 8 účastníků v nejvyšší mistrovské kategorii.
3.1.4 Sporty, ve kterých border kolie zcela vynikají Nejčastějším uplatněním border kolií v České republice není v dnešní době přihánění hospodářských zvířat, ale především psí sporty, tedy agility, dogdancing, flyball, frisbee, obedience atd. Psí sporty jsou moderní aktivitou slouţící pro pobavení člověka a psa, zvýšení fyzické zdatnosti obou a posilnění vztahu mezi majitelem a jeho psem. Border kolie mají pro psí sporty výborné předpoklady. Jsou středně velké, úţasně rychlé, mrštné, vytrvalé, nemají srst náročnou na úpravu, ale především, jsou inteligentní. Nové cviky se učí s nadšením a velice rychle si je osvojí, coţ je předpokladem pro další trénink. 3.1.4.1 Agility Agility je parkurová soutěţ fyzicky náročná jak pro psa, tak pro psovoda, která vznikla v roce 1977. O rok později, v roce 1978, se představil na Cruftově výstavě v Londýně. Na vzniku agility a jejich propagaci mají zásluhy především Peter Lewis a John Gillbert. V roce 1996 se konalo ve Švýcarsku první Mistrovství světa FCI v agility (Divišová a kol., 2003). Agility jsou určeny pro psy všech plemen a psovody všech věkových kategorií. Jedná se o bezkontaktní sport se zvláštním důrazem na úzký a přátelský kontakt se psovodem a radost z pohybu, ve kterém pes bez vodítka a obojku překonává na povel psovoda různé překáţky. Na parkuru je od 15 do 20 standardizovaných překáţek. Pes je musí překonat v pořadí, které určuje rozhodčí, v co nejrychlejším čase a bez chyb. Psovod má moţnost si trať před závodem prohlédnout. Při závodě pak vede psa slovně nebo gesty na překáţky. Za špatné překonání překáţky následují trestné body, za fyzický kontakt psovoda se psem nebo překáţkou diskvalifikace (Federation Cynologique Internationale, 2007; Klub agility České republiky, 2009). V agility nemají border kolie absolutně konkurenci, o čemţ vypovídá graf 18
plemenné příslušnosti psů umístěných na prvních dvaceti příčkách na mistrovství FCI v agility v kategorii large, kam border kolie vzrůstem spadají (Graf č. 4) a graf plemenné příslušnosti mistrů světa v agility (Graf č. 5) od roku 1996 do roku 2010. Při soutěţích jsou na základě toho vypisovány navíc kategorie „ABC“ - any breed but collies, tedy pro všechna plemena vyjma border kolií, jako například na prestiţním Crufts Show 2011. Graf 4: Plemenná příslušnost psů umístěných na prvních dvaceti příčkách na mistrovství FCI v agility v kategorii large v letech 1996 - 2010 Australský ov čák Německý ohař Australská kelpie Španělský v odní pes Australský honácký pes Maďarská v izsla
20
Německý ov čák Bearded collie
15
Laekenois Pudl Labradorský retrív r
10
Zlatý retrív r Boxer Peso de p.M.
5
Flat coated retrív r Dobrman Malinois
20 10
20 09
20 08
20 07
20 06
20 05
20 04
20 03
20 02
20 01
20 00
19 99
19 98
19 97
0
19 96
Počet jedinců daného plemene
Chorv atský ov čák
Briard Groenendael Beauceron Terv ueren
Rok
Border collie
Graf 5: Plemenná příslušnost psů mistrů světa FCI v agility v kategorii large v letech 1996 - 2010
Tervueren 2 13%
Border Collie Tervueren
Border Collie 13 87%
19
3.1.4.2 Dogdancing Také soutěţe dogdancigu (tanec se psy, kdy se pes učí různé triky, například couvat, zvedat jednotlivé nohy, válet sudy, pracovat s rekvizitami atd.) těţko hledají plemeno psa, které by border kolie dostihlo svojí schopností učit se stále nové a nové cviky. Dogdancing se stal populárním v oblasti showbyznysu, kdy border kolie po celém světě dosahují se svými majiteli vynikajících umístění v ohromně populárních televizních talentových soutěţích. Vítězky dogdancingu na světoznámé britské výstavě Crufts 2010, fena Dapper Dame Black Chevers s majitelkou Alenou Smolíkovou, dostaly od diváků z České a Slovenské republiky podle informací Televize Nova ve finálním kole soutěţe Talentmania 2010 celkem 1 064 150 hlasů, tedy 47 % z celkového počtu zaslaných dvěma finalistům. V této soutěţi skončily na fenomenálním druhém místě . 3.1.4.3 Flyball Flyball je nový sport určený velice rychlým psům. Principem je překonání čtyř překáţek psem, doskok na mechanický box, chycení tenisového míčku vystřeleného boxem a vrácení se zpátky k psovodovi přes překáţky. Jedná se o týmový závod, kdy se na trati musí vystřídat čtyři psi za sebou. Trať je dlouhá celkem 102 stop (North American Flyball Association, 2010), tedy 31,09 metrů (Flyball Club České republiky, 2010). Světový rekord drţí Spring Loaded ze Spojených států amerických s časem 15,217 s (North American Flyball Association, 2010). Průměrná rychlost psa včetně zdrţení na boxu a překáţkách je tedy neuvěřitelných 29,5 km/h. Tento tým je sestaven ze dvou vipetů, border kolie a kříţence border kolie. Flyball se v České republice běhá od roku 2003. Drţitelem českého rekordu je tým Lavina Alfa se čtyřmi border koliemi s časem 17,51 s (Flyball Club České republiky, 2010). 3.1.4.4 Ostatní sporty Border kolie vynikají v jakýchkoli sportech, kde je potřeba rychlost, přesnost a schopnost pochopit nové povely. Za zmínku jistě stojí obedience, vysoká škola poslušnosti. V obedienci jde právě o co nejrychlejší, nejpřesnější a nejradostnější splnění předepsaných klasických cviků jakým je například chůze u nohy, aport předmětu z různých materiálů, vysílání psa do vytyčených čtverců, plnění povelů psovoda na dálku a jiné (OBEDIENCE CZ, 2010). Mistři světa v obedience z let 2008-2010 jsou border kolie. (Slovenská kynologická jednota, 2009, Dansk Kennel Klub. 2010).
20
Borderkolie se také často umisťují na prvních místech v soutěţi dogfrisbee, kdy pes chytá létající disk. Soutěţí se především ve freestylu, kdy jde o dynamickou pohybovou sestavu s házením disků psovi se zařazením obtíţných vysokých skoků a odrazů o psovoda (Obrázek č. 8), ale také na přesnost hodu na terč, či o nejdále hozený a chycený disk. Mistrem světa ve freestylu pro rok 2010 je Chuck Middleton s border kolií Bling Bling (US Disc Dog Nationals, 2010).
3.1.5 Vzhled border kolií a barvy Vzhled border kolií není dodnes jednotný. Důvodem je vyuţívání border kolií k původní ovčácké práci v podstatné míře i v současné době. Velké procento border kolií je stále chováno pouze na základě pracovních dovedností (ISDS) a nikoli podle standardu FCI. Můţeme tak vidět výstavní linie border kolií odpovídající vzhledem standardu FCI, který je uveden v příloze 1 této práce (Obrázek č. 9). Na druhé straně existují pracovní typy psů, které se od výstavního liší tak, ţe by je šlo povaţovat za jiné plemeno psa (Obrázek č. 10). ISDS rozlišuje v rámci pracovního typu další podtypy podle linie psa, ze které jedinec pochází. Nejdůleţitějším kritériem při posuzování vzhledu border kolií je pohyb, který musí být plynulý a neúnavný. Border kolie mohou mít jakoukoli barvu, nicméně nikdy nesmí na těle převaţovat bílá. Jsou známé barvy černobílá, modrobílá, hnědobílá, lila, blue-merle, redmerle, lilac-merle, australská červená, sable a všechny tyto barvy v kombinaci s pálením či tečkováním (mottle) (Mlnařík, 2006). Problematikou genetiky zbarvení srsti u psů se z obecného hlediska zabývá Dostál (2007). Barva psa má vliv na schopnost ovládání stáda ovcí. Velice tmavých psů se ovce příliš bojí, světlé respektují méně. Nejţádanějším zbarvením border kolií určených pro práci s ovcemi je černá barva s pálením a s typickými bílými znaky na ocasu a čenichu (Loučka, 2001).
21
Obrázek 4: Alena Smolíková a Dapper Dame Black Chevers vyhrály soutěţ v dogdancingu při prestiţní výstavě Cruft´s 2010
Zdroj: http://multimedia.ctk.cz/cs/foto/document/4111597/alena-smolikova-pes-soutez-talentmania
Obrázek 5: Agility. Mistryně světa 2010 Lisa Frick a pes Hoss
22
Obrázek 6: Flyball – práce psa na boxu
Obrázek 7: Flyball - pes vracející se od boxu.
23
Obrázek 8: Dogfrisbee
Obrázek 9: Titul BOB (nejlepší z plemene) na Cruft’s 2011 získala fena Goytre Valentine Promise
Zdroj: http://crufts.fossedata.co.uk/crpix/2011_BOC_BOB.jpg Obrázek 10: Vítěz World Sheep Dog Trial 2008, světový šampion v pasení - pes Aled Owen’s Roy
Zdroj: http://www.kinlochsheepdogs.com/2009%20Trials%20Gallery/4/med/Aled-Owen_s-Roy.htm
24
3.2
Dopamin Dopamin je hlavní katecholaminový neurotransmiter v mozku savců, kde kontroluje
mnoţství procesů jako například motorickou aktivitu, kognitivní funkce, emoce, motivaci, příjem potravy a endokrinní regulaci (Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Wong et al., 2000). Dopamin je uvolňován v nucleus accumbens mozku při „odměňujících“ činnostech jako je jídlo, pití, sex a další příjemné činnosti (Bressan a Crippa, 2005). Dopamin hraje také různé role při regulací funkcí v okrajových částech těla. Moduluje kardiovaskulární funkce, vylučování katecholaminů, sekreci hormonů, napětí cév, funkce ledvin a hybnost gastrointestinálního traktu (Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Wong et al., 2000). Dopaminergní cesty udrţují hodnoty krevního tlaku prostřednictvím sodíkových kanálů v tubulech nefronů (Xiaoyan et al., 2008). Porucha nebo změna dopaminových systémů způsobuje symptomy a znaky totoţné s těmi, které jsou k vidění u Parkinsonovy choroby, schizofrenii, Alzheimerovy choroby či Huntingtonovy chorey. Dopaminové receptory jsou cílem mnoha léčiv pouţívaných k léčbě psychóz, syndromu hyperaktivity a dalších. Jako velký dopaminergní stimulant funguje velká část ilegálních drog jako např. kokain a amfetamin (Jaber et al., 1996; Wong et al., 2000)
3.2.1 Historie Dopamin, resp. 3-hydroxytyramine či intropin (IUPHAR Database, 2010) byl poprvé uměle syntetizován v roce 1910 Mannichem & Jacobsohnem a Bargerem & Ewinsem (Blaschko, 1942). Pojmenování dopamin získal podle své struktury monoaminu a prekurzoru, kterým je 3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA), syntetizovaný poprvé v roce 1910 ze sazenic bobu obecného (Vicia faba). Struktura L-DOPA byla zjištěna 1913 Markusem Guggenheimem (Hornykiewicz, 2010). Dopamin se v té době povaţoval pouze za prekurzor noradrenalinu a adrenalinu (Carlsson, 1958). Funkce dopaminu jako neurotransmiteru byla poprvé prokázána v roce 1958 Arvidem Carlssonem (Carlsson, 1958; Benes, 2001). Za tento objev získal Carlsson v roce 2000 Nobelovu cenu za lékařství a fyziologii. Zájem o studium dopaminu vzrostl po zjištění, ţe degenerace substantia nigra a dopaminergních drah vedoucích přes jeho struktury jsou klíčovou poruchou pacientů s Parkinsonovou chorobou a také teoretické moţnosti léčby Parkinsonovy choroby lékem levodopa (L-DOPA), prekurzorem dopaminu (Bressan a Crippa, 2005; Hornykiewicz, 2010)
25
Obrázek 11: Strukturní vzorec dopaminu
3.2.2 Syntéza a skladování Dopamin, chemickým názvem 4-(2-aminoetyl)benzen-1,2-diol (IUPHAR Database, 2010), je syntetizován dopaminergními neurony a skladován v presynaptické části axonu v klasických vesiculech, v dendritech jak ve vesikulech, tak v hladkém endoplazmatickém retikulu (Bressan a Crippa, 2005; Sűdhof a Starke, 2008). Patří do rodiny katecholaminů. Prekurzorem dopaminu je L-DOPA, ze kterého je syntetizován pomocí enzymu L-DOPA dekarboxylázy (Blaschko, 1942). L-DOPA je syntetizován z L-tyrosinu enzymem tyrosinhydroxylázou. Dopamin je dále prekurzorem noradrenalinu, ze kterého se tvoří adrenalin (Blaschko, 1942). Schéma cesty je přílohou č. 4 této diplomové práce.
3.3
Dopaminové receptory V roce 1979 Kebabian a Calne zjistili, ţe efekt dopaminu se projeví navázáním na dva
typy receptorů, dnes známé jako D1 a D2 (Bressan a Crippa, 2005). Fyziologické působení dopaminu je zprostředkováno vícero různými receptory spřaţenými s G-proteiny, které se dělí do dvou skupin na D1-like receptory a D2-like receptory. Liší se podle toho, zda aktivují adenylátcyklázu (D1-like), kam patří receptory označované D1 a D5 a nebo adenylátcyklázu inhibují a zároveň aktivují draslíkové kanály (D2-like), kam patří receptory D2, D3, D4 (Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Wong et al., 2000; Smeets a González, 2000). Analýzou struktury genů bylo zjištěno, ţe geny pro D1 a D5 receptory neobsahují introny, zatímco gen pro D2 receptor obsahuje intronů šest, D3 obsahuje pět a gen pro receptor D4 obsahuje tři introny. Všechny dopaminové receptory patří do rodiny receptorů se sedmi membránovými doménami a vykazují značnou konzervativnost v sekvenci aminokyselin těchto domén. Skupiny receptorů se navzájem liší stavbou receptoru v cytoplazmě buňky, a to především délkou COOH konce a fosforylací třetí intracytoplazmatické kličky. Dopaminové receptory se vyskytují v mozku, míše, krevních cévách, nadledvinkách, ledvinách, sympatických gangliích a v srdci (Missale et al., 1998). 26
Obrázek 12: Struktura dopaminového receptoru
Zdroj: http://www.eje-online.org/cgi/content/full/156/suppl_1/S13
3.3.1 Dopaminové neurony v mozku Většina dopaminových neuronů se vyvinula z jediné skupiny embryonálních buněk pocházejících z místa spojení mesencephalonu a diencephalonu (Bressan a Crippa, 2005). Dopaminergní inervace předního mozku savců je tvořena malým počtem vysoce kolateralizovaných neuronů (15 000 - 20 000 na kaţdé straně mozku potkana) s perikaryony sídlícími ve ventrálním mesencephalonu ve skupinách A8 (dorzální a laterální substantia nigra), A9 (pars compacta substantia nigra) a A10 (mediální část ventrální strany tegmenta) (Schultz, 1999). Jsou tedy především součástí bazálních ganglií (Brown a Marsden, 1998). Tyto dopaminové neurony mají velice dlouhé axony a jsou rozřazovány do několika systémů podle umístění těla neuronu a zacílení axonu. Jsou známy tři hlavní dopaminergní dráhy, a to nigrostriatální, mesolimbická, mesokortikální a dále dráha tuberoinfundibulární (Missale et al., 1998; Bressan a Crippa, 2005). o Nigrostriatální systém začíná v pars compacta substantia nigra a projekuje primárně do nucleus caudatus a putamenu striata. Tento systém je spojen především s motorickými funkcemi. o Mesolimbický dopaminergní systém pochází z ventrální strany tegmenta a substantia nigra compacta a projekuje do ventrální strany striata, konkrétně ncl. accumbens 27
a čichového hrbolku (tuberculum olfactorius), ale také inervuje septum, amygdalu a hippocampus. Mesolimbický systém propojuje mozkové struktury, kde vznikají motivační pochody a učení odměňováním (reward-learning). o Mesokortikální dráhy začínají těly neuronů v mediální části ventrální strany tegmenta a projekují do prefrontální mozkové kůry, cingula a perirhinální oblasti mozkové kůry. Protoţe se dráhy mesolibmického a mesokortikálního systému překrývají, jsou často označovány souhrnným pojmenováním mesolimbokortikální systém. o Tuberoinfundibulární dráha se nachází v hypothalamu, kde vede z nucleus arcuatus hypothalami intermedia hypothalamu do eminentia mediana hypothalami v intermediu hypothalamu (Bressan a Crippa, 2005). Dopaminergní signály této dráhy tlumí sekreci prolaktinu a α-melanocyty-stimulující hormonu (Missale, 1998). Obrázek 13: Poloha středního mozku (mesencephalon), kde se nachází těla dopaminových neuronů a schéma projekcí dopaminových neuronů mesencephala. Také je schematicky zobrazena poloha tuberoinfundibulární dráhy.
Zdroj: Schultz (1999)
3.3.2 Dráhy odměny v mozku Dopaminové neurony jsou kromě volního motorického pohybu zapojeny přes dráhy mesolimbickou a mesokortikální do vyšších nervových funkcí jako je cílené chování zahrnující motivaci, učení odměnou a předvídání situace (Schultz, 1997). Schopnost předvídání situace dává organismu moţnost utéct před nebezpečím, snáze sehnat potravu a ve spojení s učením vylepšit dosavadní chování. Dopaminové neurony jsou funkční detektory
28
„dobra“ události vztahující se k předpovědi pro danou událost. Vyšlou pozitivní signál pokud vyhodnotí událost jako lepší neţ předpověď (nečekaná odměna), ţádný pokud je adekvátní předpovědi (čekaná odměna) nebo negativní pokud je událost horší nebo slabší neţ očekávaná (očekávaná a nezískaná odměna) (Schultz, 1997). Dopaminergní systém funguje především jako „upozorňovač“ na odměnu za činnost, veškeré ostatní signály spojené například s povahou odměny, vzniklou situací, učením, opravou způsobu zachování se, pohybem, musí vyhodnocovat a vykonávat ostatní mozkové systémy (Schultz, 1998). Dráhy odměny byly poprvé popsány pokusem prováděným na potkanech, kdy byla potkanům implantována do mozku elektroda do oblasti septa, corpus callosum, nucleus caudatus, tegmenta a dalších míst. Potkani si v upraveném boxu s dostatkem krmiva a vody mohli sami zmáčknutím páčky dávkovat elektrický impuls způsobující pocity blaha. Bylo zjištěno, ţe nejvíce a s nejmenšími přestávkami vyuţívali páku potkani s elektrodou zavedenou do oblasti septa a nejvíce s největšími přestávkami s elektrodou v místě tegmenta. Potkani raději stimulovali elektrodou tato místa v mozku neţ přijímali tekutiny a krmivo či vykonávali jiné aktivity (Olds a Milner, 1954). Odpovídá to současným zjištěním o blízkém propojení oblasti septa dopaminergními dráhami, výskytu dopaminových neuronů v tegmentu a funkci a účincích dopaminu (Carlsson, 1958, Jaber et al., 1996; Missale et al., 1998; Wong et al., 2000; Bressan a Crippa, 2005; Hornykiewicz, 2010). Podněty spojené s následnou (třeba pouze předpokládanou budoucí) odměnou jsou podmínkou pro zakódování události do dlouhodobé paměti (Bialleck et al., 2011). Vyřazení nigrostriátového dopaminového systém má za následek neschopnost vyuţívat dlouhodoubou paměť pohybové sekvence důleţité k získání odměny (Satoh et al., 2003). Bylo dokázáno, ţe aplikace dopaminových léků pacientům s Parkinsonovou chorobou, vykazující sníţené hodnoty uvolňování dopaminu díky degeneraci nigrostriátových drah (Bressa a Crippa, 2005), zlepšuje pacientovy paměťové schopnosti (Bialleck et al., 2011). Dopaminergní receptory jsou spojovány s abnormálním vyhledáváním odměny jako je hypersexualita, patologické hráčství, přejídání, riskantní chování a poţívání návykových drog. Toto chování se vysvětluje jako potřeba kompenzace abnormálně vyvinutého dopaminového systému odměn, který musí být více stimulován, aby poskytl obvyklý stupeň pocitu blaha (Bressan a Crippa, 2005).
29
3.3.3 Dopaminový receptor D4 Dopaminové receptory D4 se nejvíce vyskytují v čelním laloku mozku, amygdale, hippocampu, hypotalamu a ve středním mozku (Missale et al., 1998). Receptory D4 jsou hlavně přítomny v oblastech mozku, které hrají důleţitou roli pro pozornost (Kebir a Joober, 2011). Oproti ostatním receptorům bylo D4 receptorů nalezeno v bazálních gangliích jen malé mnoţství (Missale et al., 1998). Dopaminový receptor je kódován genem Dopamine receptor D4 gene (DRD4). Nachází se na 11p chromozomu (Swanson et al., 1998). DRD4 gen vykazuje vysoký polymorfismus, je to jeden z nejvariabilnějších známých lidských genů. Většina této diverzity je výsledkem délkových a single-nukleotid polymorfismů (SNP) v rámci 48-bp dlouhých tandemových repeticí (VNTR) v exonu 3 genu DRD4 (Ding et al., 2002).. V lidském D4 receptoru existují značná variabilita ve stavbě třetí intracelulární kličky, která obsahuje repetetivní sekvence 16 aminokyselin. Různý počet opakování znamená různou stavbu receptoru. Nejčastější zastoupení v lidské populaci (60 %) má varianta se čtyřmi opakováními (Missale et al., 1998; Ding et al., 2002). Variace DRD4 genu a tedy variabilita receptoru D4 je studována ve vztahu k výskytu neuropsychických onemocnění, jako například schizofrenie (Wong et al., 2000). Jednou z nových oblastí výzkumu je hledání funkčního efektu polymorfismu třetí cytoplazmatické kličky receptoru D4 na znak osobnosti zvaný novelty-seeking („hledání nového“). Byla nalezena souvislost mezi variantou receptoru D4 se sedmi repeticemi sekvencí 16 amikonyselin (D4.7) (Missale et al., 1998) a výsledky novelty-seeking jakoţto části mnoharozměrného dotazníku zaměřeného na testování osobnosti (Ebstein et al., 1996; Benjamin et al., 1996; Noble et al., 1998). DRD4 varianta se sedmi repeticemi 7R by na základě výpočtů zaloţených na poměrně vysoké frekvenci v populaci měla být stará více neţ 300 000 let. Nicméně výpočty zaloţené na pozorované intraalelické variabilitě určují věk alely na 30 - 50 000 let. Tak velký rozdíl ve výsledku těchto dvou různých metod ukazuje na to, ţe vysoká frekvence této alely není zapříčiněna pouhým genetickýcm driftem, ale také pozitivní selekcí. Kdyby totiţ alela DRD4 7R byla původcem vlastnosti, která by části populace dávala výhodu, mohla by se tak rozšířit do současné míry (Ding et al., 2002). Pravděpodobnost vztahu mezi DRD4 a novelty-seeking je dále podpořeno studiemi dokazujícími, ţe počet opakování VNTR v exonu III DRD4 můţe ovlivnit navázání ligandu na receptor. Dále bylo dokázáno, ţe DRD4 je exprimován v limbickém systému zapojeném do poznávání a emocí, ţe pacienti s poruchou dopaminergních systémů při Parkinsonově chorobě mají nízkou schopnost pro hledání nového (Benjamin et al., 1996). Dalším důkazem 30
jsou studie provedené na myších s knock-outovaným genem DRD4 (DRD4 -/-). Takové zvíře reaguje na nové podněty podstatně méně neţ myš s DRD4 +/+ (Dulawa et al., 1999). Gen DRD4 je také asociován s častým problémem v oblasti dětské psychiatrie hyperkinetickým syndromem s poruchou osobnosti (attention deficit-hyperactivity disorder, ADHD) (Swanson et al., 1998; Faraone et al., 2005) postihujícím 3-7% školních dětí (Curatolo et al., 2010). Ačkoli je genetický podklad hyperkinetického syndromu kombinací několika dalších variant genů, na VNTR polymorfismus v exonu III DRD4 genu byla vţdy zaměřena největší pozornost vzhledem k tomu, ţe nejběţnější léčba ADHD stimulujícími látkami (jako amfetamin) působí na dopaminové systém, především D4 receptory (Swanson et al., 1998), které se vyskytují v hojné míře v cingulu mozkové kůry důleţitém pro udrţení pozornosti (Kebir a Joober, 2011). Také byl statisticky prokázán statisticky vztah mezi ADHD a chybějící alelou genu DRD4 se sedmi VNTR (Swanson et al., 1998; Noble et al., 1998; Faraone et al., 2005; Kebir a Joober, 2011). Kandidátní geny pro vznik ADHD jsou DRD4, DAT1 (gen pro proteinový dopaminový transportér, navrací dopamin zpět ze synapse do
presynaptické
části),
COMT
(gen
pro
katechol-o-metyltransferázu
degradující
katecholaminy dopamin a noradrenalin), MAOA (gen pro monoaminooxidázu deaminující katecholaminy na aldehydy), DBH (gen pro β-hydroxylázu katalyzující konverzi dopaminu na adrenalin) (Kebir a Joober, 2011). Jedinci s ADHD mají obtíţe v několika oblastech: řešení problémů, plánování, orientaci, pohotovosti, flexibilním rozpoznávání, udrţení pozornosti, utlumeních reakcích a v pracovní paměti. Také je ovlivněn motivační systém a mohou se vyskytovat motorické obtíţe jako porucha rukopisu, nemotornost (Curatolo et al., 2010). U dětí s ADHD můţeme pozorovat problémy se soustředěním na daný úkol, s nadměrnou aktivitou a impulzivitou (Drtílková et al., 2007). Genetika hraje v rozvoji ADHD klíčovou roli, heritabilita ADHD se pohybuje od 60 % do 90 % (Curatolo et al., 2010).
3.3.4 Polymorfismus genu DRD4 u psů Obdobný repetitivní polymorfismus genu DRD4 jako u lidí byl identifikován i u ostatních druhů savců, například u koní (Momozawa et al., 2005), primátů (Livak et al., 1995) a psů (Niimi et al., 1999). U hlodavců polymorfismus prokázán nebyl (O’Malley et al., 1992).
31
V prvotní studii porovnávali Niimi et al. (1999) sekvence exonu 3 genu DRD4 u dvou plemen psů – zlatých retrívrů a u plemene shiba. Byly objeveny čtyři alely lišící se počtem a pořadím 39 a 12 bp jednotek: 435, 549, 447a a 447b. Frekvence jednotlivých alel se mezi oběma plemeny významně lišila. V navazující studii rozšířili Niimi et al. (2001) spektrum plemen o šeltie a bígly. Podařilo se jim detekovat tři nové alely – 396, 486 a 498. Nejvyšší heterozygotnost vykazovalo plemeno shiba inu (53,6 %), nejniţších hodnot dosahovaly šeltie (25,0 %). Na rozdíl od evropských plemen nebyly u japonské shiby nalezeny krátké alely 396 a 435, zatímco dlouhá alela 549 se vyskytovala poměrně často. Osmou alelu 567 objevili Ito et al. (2004) a zjistili, ţe exon 3 genu DRD4 vykazoval polymorfismus u všech 23 zkoumaných plemen psů. U kaţdého plemene byl zjištěn výskyt dvou aţ sedmi alel, u ţádného z nich však nebylo přítomno všech osm. Autoři rozdělili plemena podle frekvence alel exonu 3 do dvou hlavních skupin. Do skupiny A zařadili plemena okcidentálního původu s vysokou frekvencí alel 435 a 447a. Do skupiny B náleţela orientální plemena s častým výskytem alel 447b, 498 a 549. Ito et al. (2004) poprvé zkoumali vztah mezi genetickou variabilitou a povahovými vlastnostmi psů. Hodnotili chování psů dotazníkem, který obsahoval 12 oblastí povahových rysů jako například zvykání na nového majitele, do jaké míry je pes spokojený pokud je uspokojen jeho poţadavek, do jaké míry chce být pes společně s vlastní rodinou, trénink poslušnosti, obrana teritoria, agrese ke psům, strach atd. Dotazníky vyplňovali veterináři, trenéři psů a ošetřovatelé psů, nikoli majitelé. Skupina B (vysoká frekvence alel 435 a 447a) dosahovala vyššího průměrného skóre pro agresivitu a niţšího skóre pro reaktivitu oproti skupině A. Dále se podařilo nalézt nový polymorfismus v exonu 1 zaloţený na inzerci/deleci 24 bp. Většina ze sledovaných plemen měla obě alely S i L s výjimkou Shikoku inu a Hokkaido inu, kde se vyskytovala pouze alela L.
32
Ito et al. (2004) publikovali u jednotlivých alel následující sekvence: Alela 435 podle Ito et al. (2004) 1 TTCTTCCTAC CCTGCCCGCT CATGCTGCTG CTCTACTGGG CCACGTTCCG GGGCCTGCGG 61 CGCTGGGAGG CCGCGCGTCG GGCCAAGCTG CACGGCCGGA CACCGCGCAG ACCCAGCGGC 121 CCCGGCCCGC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC GACGGCACCC CCGGCCCGCC GCCCCCCGAC 181 GGCAGCCCCG ACGGCACCTC GGACGGCACC CCCGGCCCAC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC 241 GACGGCACCC CCGGCCCGCC GCCCCCCGAC GGCAGCCCTG ATGACAACCC CCGCCCGCCG 301 CCCCCTGACA GCAGCCCTGG CCCGCCGCCC CCCGAGGTCA CCCCCGATGA CACCCCCGAC 361 GCCACACCCC GCCCCCTGCC CCCCGCCGCC GACGCCGCCG CGCCCCCCCC CGCCGACCCT 421 GCAGAGCCCC CGCGG
Alela 447a podle Ito et al. (2004) 1 TTCTTCCTAC CCTGCCCGCT CATGCTGCTG CTCTACTGGG CCACGTTCCG GGGCCTGCGG 61 CGCTGGGAGG CCGCGCGTCG GGCCAAGCTG CACGGCCGGA CACCGCGCAG ACCCAGCGGC 121 CCCGGCCCGC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCG GACGGCACCC CCAGCCCACC GCCCCCCGAC 181 GGCAGCCCCG ACGGCACCTC GGACGGCACC CCCGGCCCAC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC 241 GACGGCACCT CGGACGGCAC CCCCGGCCCG CCGCCCCCCG ACGGCAGCCC TGATGACAAC 301 CCCCGCCCGC CGACCCCTGA CAGCAGCCCT GGCCCGCCGC CCCCCGAGGT CACCCCCGAT 361 GACACCCCCG ACGCCACACC CCGCCCCCTG CCCCCCGCCG CCGACGCCGC CGCGCCCCCC 421 CCCGCCGACC CTGCAGAGCC CCCGCGG
Alela 447b podle Ito et al. (2004) 1 TTCTTCCTAC CCTGCCCGCT CATGCTGCTG CTCTACTGGG CCACGTTCCG GGGCCTGCGG 61 CGCTGGGAGG CCGCGCGTCG GGCCAAGCTG CACGGCCGGA CACCGCGCAG ACCCAGCGGC 121 CCCGGCCCGC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC GACGGCACCC CGGACGGCAC CCCCAGCCCA 181 CCGCCCCCCG ACGGCAGCCC CGACGGCACC TCGGACGGCA CCCCCGGCCC ACCGCCCCCC 241 GACGGCAGCC CCGACGGCAC CCCCGGCCCG CCGCCCCCCG ACGGCAGCCC TGATGACAAC 301 CCCCGCCCGC CGCCCCCTGA CAGCAGCCCT GGCCCGCCGC CCCCCGAGGT CACCCCCGAT 361 GACACCCCCG ACGCCACACC CCGCCCCCTG CCCCCCGCCG CCGACGCCGC CGCGCCCCCC 421 CCCGCCGACC CTGCAGAGCC CCCGCGG
33
Alela 498 podle Ito et al. (2004) 1 TTCTTCCTAC CCTGCCCGCT CATGCTGCTG CTCTACTGGG CCACGTTCCG GGGCCTGCGG 61 CGCTGGGAGG CCGCGCGTCG GGCCAAGCTG CACGGCCGGA CACCGCGCAG ACCCAGCGGC 121 CCCGGCCCGC CGCCCCCCGA CGGCAGCCCC GACGGCACCC CGGACGGCAC CCCCAGCCCA 181 CCGCCCCCCG ACGGCAGCCC CGACGGCACC TCGGACGGCA CCCCCGGCCC ACCGCCCCCC 241 GACGGCAGCC CCGACGGCAC CTCGGACGGC ACCCCCGGCC CACCGCCCCC CGACGGCAGC 301 CCCGACGGCA CCCCCGGCCC GCCGCCCCCC GACGGCAGCC CTGATGACAA CCCCCGCCCG 361 CCGCCCCCTG ACAGCAGCCC TGGCCCGCCG CCCCCCGAGG TCACCCCCGA TGACACCCCC 421 GACGCCACAC CCCGCCCCCT GCCCCCCGCC GCCGACGCCG CCGCGCCCCC CCCCGCCGAC 481 CCTGCAGAGC CCCCGCGG
Zelenou barvou v rámečku jsou označeny primery.
Khaki barvou VNTR 4 a další v pořadí touto barvou
Samotný Exon 3 genu DRD4 je vyznačen ostatními
VNTR 8
barvami.
Šedou barvou je zvýrazněn VNTR 12
Ţlutou barvou
je zvýrazněn VNTR 1 a další v pořadí
Tmavě šedou je zvýrazněn VNTR 13
VNTR 5
Světle modrou je zvýrazněn VNTR 14
Červenou barvou je zvýrazněn VNTR 2
(Číslování VNTR je převzato taktéţ z práce Ito et al.,
Růţovou barvou je zvýrazněn VNTR 3
2004)
Polymorfismus byl také nalezen v oblasti intronu 2 genu DRD4. Alely P a Q se liší inzercí/delecí 17 bp. Obě alely byly detekovány téměř u všech sledovaných 28 plemen psů a u obou poddruhů vlka – vlka mongolského (Canis lupus chanco) i vlka evropského (Canis lupus lupus). Výjimku tvořilo korejské plemeno jindo, u kterého se podařilo zaznamenat výskyt pouze alely Q. Alela P převládala převáţně u plemen okcidentálního původu a obou poddruhů vlka, kdeţto alela Q byla častěji pozorována u plemen orientálních. Alela Q vlka evropského se liší od alely Q psa jednonukleotidovou substitucí, zatímco alely P i Q vlka mongolského a psa jsou totoţné (Nara et al., 2005). To odpovídá předchozím teoriím zaloţených na studiu mitochondriální DNA, podle nichţ domestikovaný pes pochází z východní Asie (Savolainen et al., 2002). Hejjas et al. (2007b) se zaměřili na studium vztahu mezi polymorfismem exonu 3 genu DRD4 a aktivitou-impulzivitou německých ovčáků. V genotypu sledovaných psů tohoto plemene byly zjištěny alely 435 (resp. 2) a 447a (resp. 3a). Jedinci byli rozděleni na základě vlivu různorodých podmínek prostředí odchovu do dvou skupin na psy „policejní“ a psy „mazlíčky“. Pro posouzení aktivity-impulzivity a pozornosti v obou skupinách byl pouţit dotazník pro rodiče dětí s ADHD (ADHD Rating Scale) upravený a validovaný pro majitele
34
psů (Vas et al., 2007). Skóre pro aktivitu-impulzivitu u policejních německých ovčáků, kteří měli alespoň jednu alelu 447a, dosahovalo významně vyšších hodnot neţ u jedinců bez této alely. Tento rozdíl nebyl u psů zařazených do skupiny „mazlíčků“ pozorován. To můţe být způsobeno jednotnými podmínkami odchovu policejních psů (stejný druh výcviku, ustájení a obdobná úroveň stresu). U psů vychovávaných v rodinách je pravděpodobně genetický efekt polymorfismu DRD4 maskován různorodými vnějšími podmínkami prostředí, jako je například přístup majitele, kvalita výcviku a podobně. Pohlaví ani věk psů neovlivňovalo výsledné skóre získané vyhodnocením dotazníku (Hejjas et al., 2007b).
3.4
Metody molekulární biologie
3.4.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) lze provádět amplifikaci genů a dalších sekvencí DNA in vitro (Snustad a Simmons, 2009). Tuto převratnou a jednoduchou metodu navrhl v roce 1983 biochemik Kary Mullis (Mullis et al., 1986), který ji nechal následující rok patentovat a obdrţel za ni v roce 1993 Nobelovu cenu za chemii. Technika PCR výrazně urychlila pokrok ve studiu struktury genomů různých organismů. Umoţňuje specificky amplifikovat jakoukoliv oblast genomu během několika hodin, pokud známe nukleotidové sekvence leţící v blízkosti této cílové oblasti (Saiki et al., 1988). Amplifikaci obvykle provádí enzym DNA polymeráza. Významnou inovaci představovalo pouţití termostabilní Taq polymerázy izolované z termofilní gramnegativní bakterie Thermus aquaticus (Innis et al., 1988). 3.4.1.1 Princip polymerázové řetězové reakce – PCR Princip PCR popisuje řada autorů (např. Mullis et al. 1986; Saiki et al., 1988; Sambrook et al., 1989). Metoda zahrnuje tři základní kroky, které se mnohokrát opakují: denaturace templátové DNA, nasedání primerů, tzv. „annealing“, a prodluţování nově vznikajícího řetězce DNA. V prvním kroku je DNA denaturována zahřátím na 92-95°C po dobu asi 30 sekund (Snustad a Simmons, 2009). Při této teplotě se poruší vodíkové můstky a výsledkem je vznik jednořetězcových molekul DNA (Brown, 2007). Jednořetězcové molekuly DNA jsou nutným substrátem pro enzymy DNA polymerázy (Sambrook et al., 1989). Ve druhém kroku se roztok denaturované templátové DNA ochladí na teplotu přibliţně 50-60°C, coţ umoţní hybridizaci s nadbytkem syntetických oligonukleotidových 35
primerů (Snustad a Simmons, 2009). Primer je krátký fragment jednořetězcové DNA komplementární ke specifickým oblastem templátové DNA (Saiki et al., 1988). Optimální délka primerů je přibliţně 18-24 bází (Griffin a Griffin, 1994). Primer poskytuje volnou 3´ hydroxylovou skupinu potřebnou pro kovalentní navázání dalšího nukleotidu a následné prodluţování řetězce. Ideální teplota pro připojení primerů („annelační“ teplota) závisí na tom, z kolika a z jakých bázích jsou sloţeny (Snustad a Simmons, 2009). Mezi základní parametry při výběru primerů patří: unikátnost sekvence primeru v rámci zkoumané molekuly DNA, délka primeru, teplota tání a obsah C a G, stabilita na konci 3‘ primeru, tendence ke vzniku sekundárních struktur a komplementarita mezi dvěma primery (Griffin a Griffin, 1994). Ve třetím kroku zahřejeme templátovou DNA s navázanými primery na optimální teplotu pro zahájení polymerace (obvykle 72°C), coţ umoţní zabudování volných nukleotidtrifosfátů do nově vznikajícího řetězce DNA na základě komplementarity (Sambrook et al., 1989). Nyní máme čtyři vlákna molekuly DNA místo dvou původních vláken (Brown, 2007). V následujícím cyklu se denaturují produkty vzniklé v prvním cyklu replikace a proces se mnohokrát opakuje, dokud není dosaţeno poţadovaného stupně amplifikace. Amplifikace je exponenciální, jedna dvoušroubovice DNA dá po 30 cyklech vzniknout více neţ miliardě kopií sekvence DNA (Sambrook et al., 1989). Nejprve se jako replikační enzym pouţívala při PCR DNA polymeráza I z E. coli, která se během denaturačního kroku inaktivovala, a bylo nutné ji opětovně do reakce přidávat. Vylepšení přišlo s objevem termostabilních DNA polymeráz, které zůstávají během teplotně denaturačního kroku aktivní. Na rozdíl od většiny polymeráz, nemá Taq-polymeráza 3‘→ 5‘ korekční aktivitu, a tak produkuje při replikaci chyby s vyšší četností, neţ je obvyklé. Pokud je poţadována vysoká přesnost, provádí se PCR s pouţitím termostabilních polymeráz vykazujících 3‘→ 5‘ korekční aktivitu, např. Pfu (z Pyrococcus furiosus) nebo Tli (z Thermococcus litoralis). Pomocí PCR nelze účinně amplifikovat fragmenty delší neţ 35 kb (Snustad a Simmons, 2009).
3.4.2 Restrikční štěpení PCR produktů Nukleové kyseliny lze štěpit pomocí speciální skupiny enzymů nazývaných restrikční endonukleázy, jejichţ objev Smithem a Wilcoxem v roce 1970 znamenal revoluci v molekulární biologii. Mnohé endonukleázy štěpí DNA zcela náhodně, ale restrikční
36
endonukleázy typu II štěpí DNA pouze ve specifických sekvencích, tzv. restrikčních místech. Cílové místo je tvořené obvykle 4 aţ 8 nukleotidy. Tato sekvence je velmi často palindromická. Palindromem rozumíme sekvenci párů nukleotidů, které se čtou stejně dopředu i pozpátku od centrální osy symetrie. Restrikční
endonukleázy
jsou
produktem
různých
mikroorganismů,
jejichţ
biologickou funkcí je chránit genetický materiál před cizorodou DNA z jiných druhů, například před virovou DNA, kterou odbourávají. Všechna štěpná místa ve vlastní DNA jsou chráněna metylací jednoho nebo více nukleotidů v kaţdé nukleotidové sekvenci, která je rozeznávána restrikční endonukleázou daného organismu. Dodnes bylo charakterizováno a purifikováno jiţ okolo 400 restrikčních enzymů majících v molekulární biologii široké vyuţití (Brown, 2007; Snustad a Simmons, 2009). Některé typy molekulární diagnostiky jsou zaloţeny na testování přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických míst pro štěpení restrikčními enzymy v testované molekule DNA. Alelu s mutací v restrikčním místě lze od standardní alely odlišit tak, ţe se daný úsek genu amplifikuje pomocí PCR, amplifikovaná DNA se štěpí příslušným enzymem a výsledné produkty restrikčního štěpení se vyhodnotí pomocí elektroforézy na agarózovém gelu, aby se prokázalo, zda amplifikovaný fragment byl nebo nebyl štěpen (Snustad a Simmons, 2009).
3.4.3 Kapilární elektroforéza fluorescenčně značených DNA fragmentů Pojmem kapilární elektroforéza, respektive vysokoúčinná kapilární elektroforéza (High-Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) je dnes označována celá rodina elektromigračních separačních metod realizovaných v kapilárním instrumentálním formátu: zónová elektroforéza (CZE), izotachoforéza (CITP), izoelektrická fokusace (CIEF), elektroforéza v síťovacích prostředích klasických agarosových i polyakrylamidových gelů (CGE) i v kapalných síťovacích mediích (SDS-elektroforéza bílkovin), a dále kombinované elektromigrační a chromatografické techniky, elektrokinetická chromatografie (MEKC) a kapilární elektrochromatografie (CEC) (Lemos et al., 2001; Ugaz a Christensen, 2007). Kapilární elektromigrační metody jsou zaloţeny na elektroforetické pohyblivosti částic, která je definovaná jako rychlost pohybu nabitých částic v kapalném prostředí ve stejnosměrném elektrickém poli o jednotkové intenzitě. Pohyblivost iontu je přímo úměrná jeho náboji a nepřímo úměrná jeho poloměru a viskozitě roztoku (Kašička, 1997). Pohyb anorganických částic v elektrickém poli v koloidním roztoku byl pozorován jiţ v roce 1892. Brzy poté se ukázalo, ţe podobně putují i proteiny ve vodných roztocích.
37
V třicátých letech dvacátého století zkonstruoval švédský elektrochemik Arne Tiselius zařízení umoţňující rozdělit proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém poli, za coţ získal v roce 1948 Nobelovu cenu. Roku 1981 Jorgenson a Lukacsová popsali separaci různých iontů (aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou elektroforézou ve velmi tenké skleněné kapiláře s vnitřním průměrem 75 μm. Účinnost separace v porovnání s velmi rozšířenou kapalinovou chromatografií byla řádově mnohem vyšší (Gaš, 2001). Zónová elektroforéza je nejjednodušší elektromigrační technikou, při které se jednotlivé ionty lišící se svými elektroforetickými pohyblivostmi oddělují v homogenním prostředí základního nosného elektrolytu (backgroud electrolyte - BGE), kterým je vodní roztok. Schéma zobrazující princip zařízení pro kapilární elektroforézu zobrazuje obrázek 14. Oba konce křemenné kapiláry jsou ponořeny do elektrodových nádobek naplněných základním elektrolytem, kterým je naplněna také kapilára. Vnitřní průměr křemenné kapiláry je obvykle 50 nebo 75 μm a její délka většinou 30 aţ 80 cm. Kapilární formát separačního prostoru dovoluje účinný odvod tepla, coţ umoţňuje pouţití vysokých intenzit elektrického pole a tím i dosaţení vysokých účinností a rychlostí separace. Miniaturizace separačního prostoru je také základem vysoké citlivosti metody. Na začátku je velmi krátký úsek kapiláry naplněn roztokem vzorku. Vstupní konec kapiláry je umístěn do nádobky se vzorkem a po určitou dobu je vytvořen rozdíl hladin mezi roztokem vzorku a roztokem nosného elektrolytu. Jakmile je vzorek zaveden do kapiláry, je konec kapiláry obsahující vzorek ponořen zpět do elektrodové nádobky a k systému je připojeno stejnosměrné elektrické pole. Sloţky vzorku lišící se svými elektroforetickými pohyblivostmi se v kapiláře pohybují různými rychlostmi směrem k detektoru a na tomto principu se od sebe oddělují. Pohyb zón vzorku v kapiláře je nejčastěji sledován pomocí „on column“ UV-VIS-absorpčního detektoru. V určitém místě kapiláry je při zvolené vlnové délce měřena absorpce záření pohybujícího se nosného elektrolytu a zón vzorků určených k analýze (Kašička, 1997). Nejčastěji bývají pouţívány laserem indukované fluorescenční systémy, kdy jsou fluorescenčně značené analyzované vzorky nasvíceny laserem. Ten excituje fluorofory značených vzorků a výsledný signál je zaznamenávám fotodetektory případně digitálními kamerami (Ugaz a Christensen, 2007). Ze získaného záznamu časového průběhu absorpce, takzvaného elektroforeogramu (Obrázek č. 15), je získána kvalitativní a kvantitativní informace o sloţení analyzovaného vzorku. Kvalita vzorku je dána migračním časem jeho „peaku“ a kvantita tohoto vzorku je přímo úměrná výšce, respektive ploše
38
„peaku“. Oboje je matematicky porovnáváno softwarem vzhledem k hodnotám hmotnostního standardu (Kašička, 1997). Obrázek 14: Schéma zařízení pro kapilární elektroforézu
Zdroj: Kašička, 1997
3.4.3.1 Kapilární gelová elektroforéza Při kapilární gelové elektroforéze se jako náplň kapiláry pouţívají roztoky polymerů, které slouţí jako molekulární síto zvyšující rozdíly mezi elektroforetickými pohyblivostmi analyzovaných částic, které jsou nuceny migrovat mezi molekulami gelu; tak je moţné lépe oddělit stejně nabité částice podle jejich velikosti. Tato metoda je pouţívána jako adekvátní metoda ke klasické gelové elektroforéze a umoţňuje oddělit vysokomolekulární biologické látky jako fragmenty DNA
na základě jejich velikosti (Lemos et al., 2001; Ugaz
a Christensen, 2007). Kapilární elektroforéza má obrovské spektrum moţností vyuţití v analytické chemii, biotechnologiích, farmaceutických a biomedicínských analýzách. Slouţí k separaci menších molekul, stanovení sacharidů, aminokyselin, proteinů, barviv, vitamínů. Kapilární elektroforézou se diagnostikuje plazma, sérum nebo moč na přítomnost určitých metabolitů nebo léků (Altria, 1999). Velkým přínosem je kapilární elektroforéza při forezních analýzách jedů a jejich metabolitů v těle. Je často vyuţívána při analýzách sloţení zadrţených drog. Je schopna zachytit ve vzorku stopy látek pouţívaných k výrobě výbušnin nebo rezidua látek po pouţití střelné zbraně (Lemos et al., 2001). Komerčně je kapilární elektroforéza vyuţívána 39
především pro detekci alel dědičných onemocnění. Pro sekvenování DNA a celých genomů de novo je kapilární elektroforéza stále nejrozšířenější metodou, ačkoli ji technicky předčily metody nové. Obrázek 15: Ilustrativní elektroforeogram kapilární gelové elektroforézy
40
4 MATERIÁL A METODIKA 4.1
Hodnocené genotypy Do sledované populace zvířat bylo zařazeno celkem 89 zástupců plemene border kolie
obou pohlaví (52 fen a 37 psů). Jedinci pocházeli z České republiky a Nizozemí. Všichni psi zařazení do studie jsou drţeni v domácnosti jako „domácí mazlíčci“. Všichni aktivně provozují některý ze psích sportů a je s nimi tedy pracováno. Abecední seznam psů, kteří se zúčastnili studie je uveden v tabulce č. 1. V tabulce jsou uvedeni i psi, kteří do sledované populace nebyli zařazeni buď z důvodu špatné kvality odebraného vzorku a nebo z důvodu nevyplnění dotazníku majitelem.
4.2
Izolace genomické DNA z buněk bukálních sliznic Vzorky DNA byly získány od 100 psů neinvazivní metodou stěrů buněk bukální
sliznice psů sterilním cytologickým kartáčkem firmy Lotus Global Co., Ltd., London. Protoţe bylo nutné zamezit kontaminaci vzorku, zvíře nesmělo před odběrem přijímat alespoň půl hodiny potravu. Kartáček byl vsunut do záhybu vnitřní strany tváře a krouţivými pohyby byla setřena epiteliální vrstva vnitřní strany tváře. Během celé doby odběru bylo s kartáčkem manipulováno asepticky a po oschnutí byl vloţen do sterilní polypropylénové zkumavky. Vzorky byly tímto způsobem uchovávány v mrazicím boxu při teplotě –20°C. Pro vlastní izolaci genomické DNA byl pouţit kit NucleoSpin® Tissue XS (Macherey-Nagel, SRN) s postupem,
který
výrobce
doporučuje
pro
41
izolaci
z
buněk
bukálních
sliznic.
Tabulka 1: Abecední seznam psů, kteří se zúčastnili studie. Kříţkem (x) je označena nedostatečná kvalita biologického materiálu k provedení fragmentační analýzy nebo nezískání dotazníku. Psi označení kříţkem nebyli zařazeni do sledované populace. Jméno Psa A´Lyric Mystique Near Future A-Berta Queen of Garden Acid Apple Koryfej Aimee Luck Speedy Dream Airin Lex Wonderfull Dream Airy Vixen Graceful Avalanche Aisha z Teneriffe Gold Aiwa Plush Berry Akihiro Hamyfa Alexa Nildanya Algida Ice Rainy Love Allegra z Nefritu Amica Mirus lumen Ammy z Teneriffe Gold Andy z Újezdského ranče Ange White Face Gasko Prim Annakim Czech Black Annie Dot Hardy Horde Anything 4U od Zlatonosné říčky Apache Ponca Graceful Avalanche Arctic Moon z Ohromujícího světa Arnika Fitmin Aron Nildanya Arrow of the Sky Bohemia Patrix Artan Heart Hola-Hopa Artusch In Love Slobberchops Arty Bačenka Ascha Stříbrný Permoník Atomic Energy Unique Forever Aymee Plush Berry Bak z Dublovické Samoty Bart Bartova Lípa Bart od Dupíků Be Free Unique Forever
fena fena pes fena fena fena fena fena pes fena fena fena fena fena pes fena fena fena fena pes pes fena pes pes pes pes pes fena fena fena pes pes pes pes
Barva černobílá černobílá černobílá hnědobílá s pálením tricolor černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá tricolor tricolor černobílá černobílá hnědobílá s pálením blue merle s pálením černobílá sable merle blue merle s pálením černobílá tricolor černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá modrobílá černobílá
Otec psa Artur Border Town AAron Bashmar Filip ze Skalistých hor Vigour Bohemia Alké Cid Akumulator Filip ze Skalistých hor Jack LOI 01/191302 Alf Border Town Never Never Land Agent Double O Seven Ritson Bohemia Alké Airin Lex Wonderfull Dream Ace del Mulino Prudenza Coudy od Ančičky Jack LOI 01/191302 Crazy Brown Gasko Prim Accord Black Chevers Chimney Sweep Aibara Idrus Bohemia Alké Bearbine Mysterious Djo Filip ze Skalistých hor Freestyler Red Sensation vom Sumelocenna Dreamer Highland Ritson Bohemia Alké Earl-Grey z Černobílých Alderaan Sgian Dubh Eyes Of The World Galaxy Maeglin Energy Wendevick Zephyr Ted from Scottish Roy vom Beutenhof Alf Border Town Duncan Bohemia Alké Dak z Nečtinského Podhradí Cassidy z Bengasu Rising Sun Spot at Narrow Lane
42
Matka Psa Tosari Flies High Bonita Chiquita od Zlatonosné říčky Airin z Paleolitu Finnty Fey Aibara Dream of Kintyre Diamond Rose Jessamine Sprite Black Chevers Atomic Energy Unique Forever Dwarf Tiny z Černobílých A´Lyric Mystique Near Future Eyes Like Appaloosa Hardy Horde Broady from the Cottage of Harmony Be Happy Od zlatonosné říčky Cranberry Hardy Horde Atomic Energy Unique Forever Cilka Slezský Hrádek Funky Akumulator Chase Rubínové srdce Ange White Face Gasko Prim Blackie Foxy Fox Jessamine Sprite Black Chevers Aries Ika Unique Forever Judy Akumulator Eyes Like Appaloosa Hardy Horde Tambhe Bohemia Alké Cat Ballow Hardy Horde Annie Lennox Tender Flash Adja Haliba Bessy Coly Queen Anet z Česalky Dwarf Tiny z Černobílých Bonny Ayky Abina Bartova Lípa Ally Dajavera Amaze By Fate Unique Forever
Izolace DNA x x x
Dotazník
Tabulka 1: Abecední seznam psů, kteří se zúčastnili studie. Kříţkem (x) je označena nedostatečná kvalita biologického materiálu k provedení fragmentační analýzy nebo nezískání dotazníku. Psi označení kříţkem nebyli zařazeni do sledované populace. Beatrice Cinderella´s Ranch Berenika Slezský Hrádek Bizzy Bee Unique Forever Black Bree Budgerigar Bond Speed Bondy Hardy Horde Bonita Chiquita od Zlatonosné říčky Bonny Boy Hardy Horde Brendy Ganden Monge C. D. od Zlatonosné říčky Calypso Carl Hardy Horde Carby Ayky Carry Ball Hardy Horde Cat Ballow Hardy Horde Cessy Irish Hafkins Clever Lady od Zlatonosné říčky Coffe Princess z Jasmínových Hor Come Back Bohemia Alké Connie Tara Tennant Corry Black z Bengasu Cranberry Hardy Horde Crazy Brown Gasko Prim Cress Glow Ambra Professional Crim Darley Arabian Dag Valiant Mintaka Dazzle Trixi z Černobílých Doreen Katemy Easy Ayky Ebony Ayky Electric Brown Gasko Prim Elegance Eysha z Bengasu Elis Ayky Elsa Foxy Fox Elton Darley Arabian Escort Ayky Eyes Like Appaloosa Hardy Horde
fena fena fena fena pes fena pes fena pes pes pes pes fena fena fena fena pes fena fena fena pes fena pes pes fena fena fena fena pes fena fena fena pes pes fena
blue merle černobílá černobílá tricolor černobílá černobílá tricolor černobílá černobílá tricolor černobílá černobílá černobílá černobílá blue merle černobílá černobílá černobílá černobílá hnědobílá černobílá hnědobílá černobílá tricolor hnědobílá černobílá černobílá hnědobílá černobílá hnědobílá s pálením černobílá hnědobílá černobílá dark sable
I´m Just Yours Gasko Prim Cid Akumulator Rising Sun Spot at Narrow Lane Jessomine Aussie Merlot Crazy Brown Gasko Prim Ike Of Magic Border's Crazy Brown Gasko Prim Earl-Grey z Černobílých Dark Devil from the Narrow Lane Ghost of Pinewood Country Ted from Scottish Roy vom Beutenhof Ghost of Pinewood Country Ghost of Pinewood Country Ethan von Waltenweiler Dark Devil from the Narrow Lane Detania Victory Nice of You to Come Bye Secret Switch Wendevick Zephyr Ghost of Pinewood Country Ghost of Pinewood Country Clan-Abby Nz's Black Magic Florey Bohemia Alké Dreamer Highland Broady from the Cottage of Harmony Cassidy Fantasy z Černobílých Atos Budgerigar Jump Jet Black Chevers Jump Jet Black Chevers Idrus Bohemia Alké Geri Foxy Fox Jump Jet Black Chevers Wendevick Usecasper Brown Dancer Gasko Prim Jump Jet Black Chevers Crazy Brown Gasko Prim
43
Qatma Bohemia Alké Briggi Foxy Fox Amaze By Fate Unique Forever Budgie Choco Silver Breeze Ange White Face Gasko Prim Blackie Foxy Fox Ange White Face Gasko Prim Accra Moonvillage Anything 4U od Zlatonosné říčky Annie Dot Hardy Horde Blondie Ayky Annie Dot Hardy Horde Annie Dot Hardy Horde Alba Okřešická Perla Anything 4U od Zlatonosné říčky Angie z Jabloňového Dvora Ofra Bohemia Alké Deuce Czechmate Babsi Foxy Fox Annie Dot Hardy Horde Tosari Flies High Gee Akumulator Ferine Bohemia Alké Cory Faith Black Chevers Henriet Czechmate Alka Dívčí Dvůr Cindy Ayky Cindy Ayky Tosari Flies High Babsi Foxy Fox Cindy Ayky Daryl Bohemia Alké Ferine Bohemia Alké Cindy Ayky Arushka Plume Hardy Horde
x x
x x x
Tabulka 1: Abecední seznam psů, kteří se zúčastnili studie. Kříţkem (x) je označena nedostatečná kvalita biologického materiálu k provedení fragmentační analýzy nebo nezískání dotazníku. Psi označení kříţkem nebyli zařazeni do sledované populace. Ezar Blue z Bengasu Ezechiel Lusika Far Far Away Hardy Horde Farra Slezský Hrádek Filip ze Skalistých Hor Flash Foxy Fox Foolish Bree Hardy Horde Forcy Run Hardy Horde Forever Free Black Chevers Gália Estrella ze Skalistých Hor Genesis ze Skalistých Hor Gentleman of Tennant Gigi Foxy Fox Great Spirit Hardy Horde Griotka Svěţí Vítr Grumble RM Sting z Černobílých Gucci Brown z Černobílých Hawkeye In Black Hardy Horde Heavenly Dot Hardy Horde Chase Rubínové srdce Immortal Beauty Z Černobílých Janek Fitmin Liza's Border Vega Blue Nice of You to Come Bye Eager Eagle Nice of You to Come Bye Simply Sarah Noemi Foxy Fox Ozzie Rubínové Srdce Petr Pan Akumulator Ritson Bohemia Alké Timothy Foxy Fox
pes pes fena fena pes pes fena pes fena fena fena pes fena pes fena pes pes pes fena fena fena pes fena fena fena fena fena pes pes pes
modrobílá černobílá černobílá blue merle černobílá černobílá tricolor černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá černobílá tricolor černobílá red merle s pálením hnědobílá s pálením černobílá černobílá tricolor blue merle černobílá blue merle blue merle australská červená černobílá černobílá černobílá blue merle černobílá
Geri Foxy Fox Elton Darley Arabian Jessomine Aussie Merlot Hector Czechmate Brown Dancer Gasko Prim Braveheart of Pinewood Country Jessomine Aussie Merlot Jessomine Aussie Merlot Laetare Be Just Berry Blue Foxy Fox Berry Blue Foxy Fox Wendevick Zephyr Arrow From The Lovely Annie Akersborg Sid ISDS 284130 Gift in Trics Gasko Prim Laetare Be Just Laetare Be Just Csóványospataki Elixir Csóványospataki Elixir Crazy Brown Gasko Prim Eyes of the World Galaxy Just the One Gasko Prim Liza's Border Q Red Nice of you to Come Bye Stormchaser Locheil Time Moves On, Bond Oodnadatta True Deal Gondor Rubínové Srdce Alf Border Town Imai Bohemia Alké Kerrybrent Nz Midnite Solo
44
Babsi Foxy Fox Bonnie Lusika Annie Dot Hardy Horde Barunka Slezský Hrádek Anelim ze Skalistých hor Glare Bohemia Alké Annie Dot Hardy Horde Annie Dot Hardy Horde Blaze Black Chevers Anelim ze Skalistých hor Anelim ze Skalistých hor Francis Foxy Fox Gay Bohemia Alké Ange White Face Gasko Prim Connie Blue Svěţí Vítr Henriet Czechmate Henriet Czechmate Annie Dot Hardy Horde Annie Dot Hardy Horde Hane Rubínové srdce Henriet Czechmate Judy Akumulator Silque Asweetie Arnpriors Come and be Nice Rhonabwy Awsome Lady, Wish Elsa Foxy Fox Gina Miveko Dyna Miveko Roxana vom Skuddenhof Simaro Angela Lansbury
x x
4.3
Amplifikace Exonu 3 genu DRD4 pomocí polymerázové řetězové
reakce (PCR) 4.3.1 Pouţité primery Pro analýzu genu DRD4 byly pouţity následující primery uvedené v tabulce 2. Jeden z pouţitých primerů z kaţdého páru byl značen fluorescenční barvou 6-FAMTM(Applied Biosystems) (Applied Biosystems). Tabulka 2: Pouţité primery Název primeru
Marker
Sekvence primeru
Zdroj
exon 3 DRD4 1.první amplifikace
D4FFAM D4DogR5A
5‘-TTCTTCCTACCCTGCCCGCTCATG-3‘ 5‘-CCGCGGGGGCTCTGCAGGGTCG-3‘
Ito et al. (2004)
exon 3 DRD4 2.první amplifikace
D4FFAM D4DogBR5A
5‘-TTCTTCCTACCCTGCCCGCTCATG-3‘ 5‘-TGGGCTGGGGGTGCCGTCC-3‘
Ito et al. (2004)
4.3.2 První amplifikace - sloţení reakční směsi a podmínky Optimalizovaná reakční směs o objemu 12,5 μl obsahovala 50 ng templátové DNA, 1,25 U Pfu polymerázy (Fermentas) a 0,1 mg BSA. Koncentrace ostatních komponent PCR reakce byla následující: 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2mM MgSO4, 250 μM dATP, 250 μM dCTP, 250 μM dTTP, 125 μM dGTP, 7deaza-dGTP 125 μM, 0,5 μM primer D4FFAM, 0,5 μM primer D4DogR5A a 2 mM tetramethylamonium oxalát (Top Bio). Amplifikace probíhala v termocykleru C1000TM Thermal Cycler (BioRad) při následujících podmínkách: 1x (98° C - 2 minuty), 35x (98° C - 30 sekund, 65° C – 1 minuta, 74° C – 1 minuta), 1x (74° C - 10 minut).
4.3.3 Identifikace alel v lokusu DRD4 pomocí ABI PRISM 310® (Applied Biosystems) Pro stanovení velikosti PCR amplikonů-jednotlivý alel markerů třetího exonu dopaminového receptoru byl pouţit genetický analyzátor ABI PRISM 310® (Applied Biosystems). Produkty amplifikace popsané v kapitole 4.3.2 byly 49x naředěny ddH2O pro kapilární elektroforézu. Z naředěného PCR produktu byl odebrán 1 µl roztoku, který byl
45
přenesen do nové zkumavky. K tomuto objemu bylo přidáno 14 µl DI formamidu pro kapilární elektroforézu (Applied Biosystems) a 0,2 µl velikostního standardu GeneScanTM 600 Liz® Size Standard (Applied Biosystems). Tento hmotnostní standard slouţí pro odečtení velikosti amplifikovaných alel. Takto připravené zkumavky s analyzovanými vzorky byly denaturovány při teplotě 95° C po dobu 5 min v termocykleru C1000 (BioRad). Po ukončení denaturace byly denaturované vzorky v termocykleru prudce ochlazeny na teplotu 4° C. Při této teplotě byly vzorky ponechány po celou dobu před vlastní fragmentační analýzou. Pro fragmentační analýzu byl pouţit modul přístroje ABI PRISM 310® (Applied Biosystems) umoţňující postupně analyzovat 96 vzorků. Tento modul je výrobcem označen jako GS STR POP4 (1ml) G5, který udává, ţe se jedná o fragmentační analýzu tandemových repeticí s polymerem POP4 a virtuálním filtrem G5. Pro nástřik vzorků byla pouţita hodnota napětí 5 kV a doba nástřiku 5 sekund. Během separace byla nastavena hodnota napětí 15 kV, teplota separace 15 °C a doba separace 33 minut. Výstupy fragmentační analýzy byly automaticky zaznamenány programem GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems). Tento program byl pouţit i pro následné odečtení velikosti amplifikovaných alel.
4.3.4 Druhá amplifikace - sloţení reakční směsi a podmínky Alela označená jako 447 představuje dvě moţné sekvence, které lze odlišit další PCR amplifikací a pouţitím jiného R primeru. Při této následné amplifikaci vznikají dva rozdílně velké produkty 168 bp (alela 447a) a 180 bp (alela 447b). Toto označení alel je rovněţ převzato z práce Ito et al. (2004). Optimalizovaná reakční směs o objemu 12,5 µl obsahovala 50 ng templátové DNA, 1,25 U Pfu polymerázy (Fermentas) a 0,1 mg BSA. Koncentrace ostatních komponent PCR reakce byla následující: 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2mM MgSO4, 250 µM dATP, 250 µM dCTP, 250 µM dTTP, 125 µM dGTP, 7-deaza-dGTP 125 µM, 0,5 µM primer D4FFAM, 0,5 µM primer D4DogBR5A a 2 mM tetramethylamonium oxalát (Top Bio). Amplifikace probíhala v termocykleru C1000 (BioRad) při následujících podmínkách: 1x (98°C - 2 minuty), 35x (98°C - 30 sekund, 70°C – 1 minuta, 74°C – 1 minuta), 1x (74°C - 10 minut) a nakonec zchlazení na 4°C. Vzorky byly analyzovány stejným postupem jako v kapitole 4.3.3.
46
Obrázek č. 16 a 17: Pouţitý termo cykler a náhled programu pro 2. amplifikaci v ovládacím panelu přístroje
47
4.4
Sekvenační analýza markeru exonu 3 genu DRD4 K sekvenační analýze námi nalezených alel jsme přistoupili z důvodu maximální
moţné identifikace nalezených alel, které odpovídaly svými velikostmi na základě fragmentační analýzy alelám 435, 447a, 498 (Ito et al., 2004). Sekvenační analýza přístrojem ABI PRISM 310® Genetic Analyzer (Applied Biosystems) a programem DNA Sequencing Analysis Software 5.1 (Applied Biosystems) umoţňuje dokonale porovnat variantu námi nalezených alel s dosavadními pracemi na toto téma (Niimi et al., 1999; Ito et al., 2004)
4.4.1 Sekvenované genotypy Pro sekvenční analýzu byly pouţity PCR produkty první amplifikace, která je popsána v kapitole 4.3.2. Všechny fragmenty byly sekvenovány od F i od R primeru. Cílem této analýzy bylo ověřit, zda skutečná velikost amplikonů odpovídá údajům, které popsali Ito et al. (2004). Dalším cílem této analýzy bylo zjistit, zda - li se amplikony o shodné velikosti neliší z hlediska sekvence nukleotidů v exonu 3 genu DRD4. Pro analýzy bylo vybráno 30 psů s různými genotypy, coţ přehledně zobrazuje tabulka č. 3. Tabulka 3: Přehled osekvenovaných vzorků a jejich genotypů
Vzorek obsahuje alelu 435
Vzorek číslo 68 24 28 42 65 70 82 84 94 100 1 56 75
Genotyp 435/435 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/498 435/498 435/498
48
447a
498
435/447a 435/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/498 447a/498
24 28 2 5 6 36 71 3 4 1 56 3 4 9 11 25 98
435/498 435/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 498/498 498/498
4.4.2 Gelová purifikace fragmentů Amplifikované fragmenty byly separovány pomocí agarózové elektroforézy (1,5% koncentrace gelu) v prostředí TBE pufru. Pro separaci byl pouţit postup, který popisuje Sambrook et al. (1989). Amplikony o poţadované velikosti byly u kaţdého genotypu po dvouhodinové separaci vyříznuty z gelu sterilním skalpelem. Délka separace dvě hodiny byla nezbytná pro to, aby u heterozygotů došlo k dokonalému oddělení obou amplikonů. Z vyříznutého fragmentu byla extrahována DNA pomocí MiniElute PCR Purification Kit (Qiagene). Pro extrakci DNA z gelu byl pouţit zcela shodný postup, který doporučuje výrobce tohoto kitu. Výsledkem této extrakce bylo získání 20 µl amplifikovaných fragmentů rozpuštěných v ddH2O určené pro kapilární elektroforézu. U kaţdého vzorku byla pomocí UV spektrofotometru (Eppendorf) stanovena koncentrace DNA. Všechny vzorky byly následně naředěny ddH2O na jednotnou koncentraci 5 ng.10-1.
4.4.3 Sloţení a příprava sekvenční reakce Pro sekvenční analýzu byl pouţit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Připravená reakční směs o celkovém objemu 20 µl obsahovala 20 ng purifikované DNA, 3,2 pmol F nebo R primeru, 2 µl Terminator Ready Reaction Mix a 4 µl 5 x Sequencing Buffer (Applied Biosystems). 49
4.4.4 Teplotní a časové podmínky při amplifikaci sekvenční reakce Pro amplifikaci byl pouţit rovněţ termocykler C1000 (BioRad). Byly pouţity následující podmínky: 1x (96 °C – 60 s), 25x (96 °C – 10 s, 50 °C – 5 s, 60 °C – 240 s). Vzorky byly následně ochlazeny na 4 °C. Pro vlastní amplifikační profil byla nastavena rychlost změny teploty 1 °C.s-1.
4.4.5 Přečištění sekvenční reakce K získané sekvenční reakci popsané v kap. 4.4.4 (objem 20 µl) byly přidány 2 µl roztoku glykogenu (koncentrace 20 ng.ml-1, Fermentas), 2 µl 3M octanu sodného a 50 µl 96% čistého etanolu. Vzorky byly promíchány a následně ponechány 15 minut při laboratorní teplotě. Následně proběhlo odstředění při 13 200 ot.min-1 po dobu 30 minut. Supernatant byl následně opatrně odsát sterilní pipetou a sediment přichycený na dně zkumavky byl opláchnut 250 µl 70% čistého etanolu. Vzorky byly odstředěny při 13 200 ot.min-1 po dobu 15 minut. Supernatant byl rovněţ opatrně odsán a opláchování a odstředění 70% etanolu bylo ještě jednou zopakováno. Získaný supernatant po odsátí etanolu byl vysušen ve vyhřívaném bloku při teplotě 50 °C po dobu 45 minut. Dokonale vysušený sediment byl rozpuštěn v 15 µl Di formamidu pro kapilární elektroforézu (Applied Biosystems).
4.4.6 Vlastní sekvence PCR produktů s vyuţitím genetického analyzátoru ABI PRISM 310® Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Pro sekvenování byl nastaven sekvenční modul KB_310_POP6_BDTv3_50std.mob. Pro separaci byl pouţit polymer POP6 (Applied Biosystems) a kapilára se čtecí délkou 50 cm. Pro nástřik vzorku bylo pouţito napětí 2,5 kV a doba 30 s. Vlastní separace probíhala při napětí 12,2 kV, teplotě 50 °C po dobu 120 minut. Získaná data byla automaticky zaznamenána počítačem a připravena pro vyhodnocení programem DNA Sequencing Analysis Software 5.1 (Applied Biosystems).
4.5
Zpracování dotazníku pro odhad psychických vlastností psů Pro posouzení aktivity-impulzivity a nepozornosti sledovaných jedinců byl pouţit
ADHD dotazník validovaný pro majitele psů (Vas et al., 2007), který obsahoval celkem 13 poloţek. Sedm z nich se týkalo posouzení aktivity a impulzivity (např. „Můj pes je divoký,
50
hůře ovladatelný, kdyţ vyrazí vpřed, je těţké ho udrţet“) a zbylých šest souviselo s nepozorností (např. „Je snadné upoutat pozornost mého psa, ale brzy ztratí zájem“). Majitel psa ohodnotil pozorovanou frekvenci projevů daného chování na stupnici 0 – 3. Skóre pro aktivitu-impulzivitu bylo vypočítáno jako součet majitelem uvedených hodnot u poloţek č. 4, 5, 6, 8, 9 11 a 13 a skóre pro nepozornost bylo dáno součtem hodnot u zbývajících poloţek č. 1, 2, 3, 7, 10 a 12. Dotazník byl majitelům odesílán v elektronické podobě emailem nebo v papírové formě poštou. Přesné znění dotazníku je přílohou 3 této práce.
4.6
Bioinformatické a statistické vyhodnocení výsledků
4.6.1 Bioinformatické databáze a programy Informace o sekvencích studovaných genů byly získány z mezinárodní databáze NCBI (National Center for Biotechnology Information) volně dostupné na internetové adrese http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Pro stanovení velikosti amplikonů byl pouţit GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems). Pro získání vstupních sekvenčních dat byl pouţit program DNA Sequencing Analysis Software 5.1 (Applied Biosystems). Pro porovnání sekvencí hodnocených markerů byl pouţit program BioEdit verze 7.0.9.0 (CIT). Program CLC Main Workbench 6.0.1 jsme pouţili pro grafické srovnání nalezených sekvencí alel s dříve publikovanými pracemi Ito et al. (2004). Pomocí programu Cervus 3.0.3 (Kalinowski et al., 2007) byla provedena deskriptivní statistika hodnotící variabilitu exonu 3 genu DRD4. Byl stanoven stupeň očekávané (HE) a pozorované (HO) heterozygotnosti. Hodnota HE je teoretická hodnota frekvence heterozygotů, která by v populaci nastala při dosaţení rovnováţného stavu podle Hardy-Weinbergova zákona.
4.6.2 Statistické vyhodnocení vztahů mezi bodovým hodnocením dotazníků a genotypem exonu 3 genu DRD4 Pro zjištění statistické významnosti rozdílů získaných průměrných skóre pro aktivituimpulzivitu a nepozornost byl pouţit parametrický t-test. Vyhodnocení bylo provedeno pomocí programu STATISTICA 9.1. Parametrickým t-testem jsme porovnávali výsledná skóre zvlášť pro aktivitu-impulzivitu a pro nepozornost následujících dvojic skupin (Tabulka č. 4). Skupiny byly vybrány na základě zjištěných genotypů a na základě pohlaví psů.
51
Tabulka 4: Testované skupiny parametrickým t-testem. Pod pojmem „psi“ jsou myšleni jedinci samčího pohlaví. „Fenami“ jsou myšleny samice. „Všichni“ znamená zástupci obou pohlaví, tedy všichni sledovaní jedinci.
Číslo testování
1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 9
SKUPINA A
n
všichni s genotypem 447a/447a všichni s alespoň jednou alelou 447a všichni s genotypem 447a/447a všichni s genotypem 447a/447a všichni s alespoň jednou alelou 435 všichni s alespoň jednou alelou 498 všichni s genotypem 435/447a všichni s alespoň jednou alelou 498 psi s genotypem 447a/447a feny s genotypem 447a/447a psi s alespoň jednou alelou 447a feny s alespoň jednou alelou 447a psi s genotypem 447a/447a feny s genotypem 447a/447a feny s genotypem 447a/447a feny s genotypem 435/447a feny s genotypem 447a/447a feny s genotypem 435/498 feny s genotypem 435/498 feny s alespoň jednou alelou 498 psi s alespoň jednou alelou 498 všichni homozygoti, nezáleţí na typu alely feny homozygoti, nezáleţí na typu alely psi homozygoti, nezáleţí na typu alely feny s genotypem 447a/447a psi
49 83 49 49 13 30 9 30 24 25 35 48 24 25 25 8 25 3 3 19 11
SKUPINA B všichni ostatní všichni ostatní všichni s genotypem 447a/498 všichni s genotypem 435/447a všichni ostatní všichni ostatní všichni s genotypem 447a/498 všichni s genotypem 447a/447a ostatní psi ostatní feny ostatní psi ostatní feny psi s genotypem 447a/498 feny s genotypem 447a/498 feny s genotypem 435/447a ostatní feny feny s genotypem 435/498 ostatní feny feny s genotypem 447a/498 feny s genotypem 447a/447a psi s genotypem 447a/447a
n 40 6 25 9 76 59 25 49 13 27 2 4 10 15 8 44 3 49 15 25 24
52 všichni heterozygoti, nezáleţí na typu alely
37
26 feny heterozygoti, nezáleţí na typu alely
26
26 psi heterozygoti, nezáleţí na typu alely 25 psi s genotypem 447a/447a 37 feny
11 24 52
Poznámka: Statistická analýza byla provedena mezi všemi uvedenými testovanými skupinami zvířat bez ohledu na počet jedinců ve skupině. Tyto výsledky budou rovněţ prezentovány v další části diplomové práce. Vzhledem k tomu, ţe u testování číslo 2, 4, 7, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20 se vyskytovaly výrazně rozdílné počty hodnocených zvířat, nebudou tato hodnocení povaţována ze reprezentativní a diskuse diplomové práce bude zaměřena na testování s vyrovnaným, reprezentativním počtem zvířat.
52
4.7
Analýza frekvence alel lokusu DRD4 Pomocí programu Cervus 3.0.3 (Kalinowski et al., 2007) byla provedena deskriptivní
statistika hodnotící variabilitu exonu 3 genu DRD4. Byl stanoven stupeň očekávané (HE) a pozorované (HO) heterozygotnosti. Hodnota HE je teoretická hodnota frekvence heterozygotů, která by v populaci nastala při dosaţení rovnováţného stavu podle HardyWeinbergova zákona.
53
5 VÝSLEDKY 5.1
Izolace DNA Z původně odebraných 100 vzorků se podařilo extrahovat DNA v dostatečné kvalitě
vhodné ke kapilární gelové elektroforéze z 92 vzorků. Parametry kvality i kvantity DNA získané izolací z buněk bukální sliznice byly následující. Při namátkovém fotometrickém měření za pouţití UV spektrofotometru GeneQuant RNA/DNA Calculator (Pharmacia Biotech, Velká Británie) byla průměrná výtěţnost DNA z jednoho stěru u plemene border kolie 2310 ng DNA (Vk = 5,1 %). Průměrný poměr absorbancí A260/A280 byl 1,87 (Vk = 4,9 %). Parametry charakterizující kvantitu a kvalitu DNA nebyly blíţe statisticky ověřeny, protoţe tuto část řešení práce lze povaţovat za zcela standardní předpoklad nezbytný pro následující analýzy.
5.2
Detekce alel exonu 3 genu DRD4 Po první amplifikaci byla pomocí kapilární gelové elektroforézy přístrojem ABI
PRISM 310® (Applied Biosystems) zjištěna přítomnost alel o velikosti 435 bp, 447 bp a 498 bp. Alely kaţdého genotypu byly odečítány jednotlivě v programu GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems), Pomocí tohoto programu je moţno určit velikost jednostlivých alel porovnáním s hmotnostním standardem. Celkem bylo nalezeno 6 kombinací alel, a to 435/435, 435/447, 435/498, 447/447, 447/498, 498/498. Na následujících obrázcích jsou zobrazeny ektroforeogramy vzorků obsahující zjištěné kombinace alel. Obrázek 18: Výstupy programu Gene Mapper 4.1 zobrazující detekci alel 435, 447 a 498 genu DRD4
54
Pro odlišení alely 447a a 447b byla provedena další PCR amplifikace při pouţití jiného R-primeru. Při této amplifikaci mohou vzniknout dva různé produkty 168 bp (odpovídá alele 447a) nebo 180 bp (alela 447b). V námi sledované populaci se vyskytovala pouze varianta o velikosti 168 bp; výsledek zobrazují následující elektroforeogramy. Tabulka č. 6 v kapitole 5.4 nastiňuje výčet všech nalezených genotypů u námi sledované populace border kolií. Obrázek 19: Výstupy programu Gene Mapper 4.1 při odlišení alel 447a a 447b, zobrazující fragment velikosti 168 bp, jedná se tedy o vzorky obsahující pouze alelu 447a.
55
5.3
Výsledky sekvenační analýzy nalezených alel Abychom mohli ověřit skutečnou totoţnost nalezených alel a porovnat s dosavadními
pracemi na toto téma (Niimi et al., 1999; Ito et al., 2004), přistoupili jsme k sekvenování alel odpovídajících svými velikostmi na základě výsledků fragmentační analýzy alelám 435, 447a a 498 (Niimi et al., 1999; Ito et al., 2004). Důleţitým bodem bylo především potvrzení identifikace alely 447a od alely 447b. Námi provedená sekvenační analýza alel 435, 447a a 498 potvrdila jiţ publikované výsledky v práci Ito et al. (2004) uvedeným v kapitole 3.4.1.
5.3.1 Srovnání sekvence PCR produktů námi identifikovaných alel V rámci námi sledované populaci border kolií bylo osekvenováno 13 vzorků obsahujících alelu 435 ve třech různých genotypech, devět vzorků obsahujících alelu 447a, také ve třech různých genotypech a osm vzorků obsahujících alelu 498 rovněţ ve třech různých genotypech. Přehled osekvenovaných vzorků a jejich genotypů zobrazuje tabulka č. 3 v kapitole 4.4.1. Srovnání sekvencí s dříve publikovanými bylo provedeno programem NCBI Blast. Porovnání námi zjištěné sekvence alely 447a a publikované sekvence alely 447b (Ito et al., 2004) bylo provedeno v programu CLC Main Workbench 6.0.1. Alela 447a nalezená v našem souboru border kolií skutečně odpovídá sekvencí alele 447a publikovené Ito et al. (2004). Grafické znázornění tohoto srovnání a námi zjištěné sekvence alel 435, 447a a 498 ukazuje následující obrázek.
56
Obrázek 20: Námi zjištěné sekvence alel 435, 447a, 498 a srovnání námi zjištěné sekvence alely 447a proti publikované (Ito et al., 2004) sekvenci alely 447b – 1. část
57
Obrázek 20: Námi zjištěné sekvence alel 435, 447a, 498 a srovnání námi zjištěné sekvence alely 447a proti publikované (Ito et al., 2004) sekvenci alely 447b – 2. část
58
5.3.2 Vyhodnocení aminokyselinové sekvence produktů genu DRD4 Programem CLC Main Workbench 6.0.1 byla stanovena sekvence aminokyselin části proteinu kódovaném zjištěnými alelami genu DRD4. Sekvence proteinů jednotlivých alel byly porovnány s publikovanými výsledky. Zároveň bylo graficky znázorněno porovnání produktu alely 447a a 447b (Obrázek č. 21). Aminokyselinová sekvence zjištěných alel 435, 447a, 498 se shoduje s dříve publikovanými výsledky (Ito et al., 2004). Obrázek 21: Aminokyselinová sekvence námi zjištěných alel 435, 447a, 498 a dále porovnání alely 447a s publikovanou sekvencí alely 447b (Ito et al., 2004)
Aminokyseliny jsou popsány písmenkovým zápisem: Glycin Gly (G), Alanin Ala (A), Valin Val (V), Leucin Leu (L), Isoleucin Ile (I), Kyselina asparagová Asp (D), Asparagin Asn (N), Kyselina glutamová Glu (E), Glutamin Gln (Q), Arginin Arg (R), Lysin Lys (K), Histidin His (H), Fenylalanin Phe (F), Serin Ser (S), Threonin Thr (T), Tyrozin Tyr (Y), Tryptofan Trp (W), Methionin Met (M), Cystein Cys (C), Prolin Pro (P)
59
Pomocí programu CLC Main Workbench 6.0.1 byla rovněţ provedena biochemická analýza aminokyselinové sekvence části proteinu kódovaném exonem 3 genu DRD4. U alely 435 je velikost této sekvence 7 369,551 Da, její izoelektrický bod je 3,41 a alifatický index 3,718. U alely 447a je velikost této sekvence 7 763,886 Da, její izoelektrický bod je 3,38 a alifatický index 3,537. U alely 447b (Ito et al., 2004) je velikost této sekvence 7 769,935 Da, její izoelektrický bod je 3,38 a alifatický index 3,537. U alely 498 je velikost této sekvence 9 302,456 Da, její izoelektrický bod je 3,3 a alifatický index 2,929. Dále byla spočítána distribuce aminokyselin v části proteinu kódovaném dotyčnými alelami a porovnána s frekvencí těchto aminokyselin v proteinech savců. Výsledky ukazuje následující tabulka. Tabulka 5: Distribuce aminokyselin v části proteinu kódovaném alelami 435, 447a, 447b a 498 a frekvence těchto aminokyselin v genomu savců alela aminokyselina Alanine (A) Cysteine (C) Aspartic Acid (D) Glutamic Acid (E) Phenylalanine (F) Glycine (G) Histidine (H) Isoleucine (I) Lysine (K) Leucine (L) Methionine (M) Asparagine (N) Proline (P) Glutamine (Q) Arginine (R) Serine (S) Threonine (T) Valine (V) Tryptophan (W) Tyrosine (Y)
435 Frekvence
447a Frekvence
447b Frekvence
498 Frekvence
Frekv. u savců
0,000 0,000 0,167 0,013 0,000 0,167 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,013 0,449 0,000 0,013 0,090 0,077 0,013 0,000 0,000
0,000 0,000 0,171 0,012 0,000 0,159 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,012 0,415 0,000 0,012 0,110 0,098 0,012 0,000 0,000
0,000 0,000 0,171 0,012 0,000 0,159 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,012 0,439 0,000 0,012 0,098 0,085 0,012 0,000 0,000
0,000 0,000 0,172 0,010 0,000 0,172 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,010 0,424 0,000 0,010 0,101 0,091 0,010 0,000 0,000
0,070 0,023 0,048 0,067 0,039 0,067 0,025 0,047 0,056 0,100 0,023 0,037 0,060 0,045 0,054 0,079 0,054 0,062 0,013 0,029
60
5.4
Výsledky statistického zpracování hodnot získaných z dotazníků Pro vyhodnocení vlivu jednotlivých alel markeru exonu 3 genu DRD4 na chování
dotyčných psů bylo nutné zpracovat dotazník zmíněný v kapitole Materiál a metody, který je přílohou č. 3 této práce. Z celkového počtu 100 odebraných vzorků bylo získáno 97 vyplněných dotazníků. Kvalitní DNA se podařilo extrahovat z 92 vzorků, ke kterým se podařilo získat 89 vyplněných dotazníků. Přehled výsledných skóre ADHD dotazníků a zjištěných genotypů zobrazuje tabulka 6, kde jsou údaje seřazeny podle nalezeného genotypu. Seznam psů, kteří se zúčastnili této studie je uveden abecedně v kapitole 4. Část majitelů si přála uvést výsledné skóre pouze anonymně, z těchto důvodů budou v následující tabulce uvedeni jednotliví psi pod anonymními kódy. Tabulka 6: Přehled analyzovaných genotypů a výsledných skóre ADHD dotazníků
Kód psa BOC01 BOC02 BOC03 BOC04 BOC05 BOC06 BOC07 BOC08 BOC09 BOC10 BOC11 BOC12 BOC13 BOC14 BOC15 BOC16 BOC17 BOC18 BOC19 BOC20 BOC21 BOC22 BOC23 BOC24 BOC25 BOC26 BOC27
GENOTYP exon 3 genu DRD4
Skóre pro AKTIVITUIMPULZIVITU
435/435 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/447a 435/498 435/498 435/498 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a
Skóre pro NEPOZORNOST 8 4 6 7 7 11 11 11 13 14 4 9 12 2 2 3 4 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6
61
8 0 2 3 5 2 3 9 9 7 3 6 7 1 3 4 2 0 0 1 1 2 4 1 1 1 2
Tabulka 6: Přehled analyzovaných genotypů a výsledných skóre ADHD dotazníků
BOC28 BOC29 BOC30 BOC31 BOC32 BOC33 BOC34 BOC35 BOC36 BOC37 BOC38 BOC39 BOC40 BOC41 BOC42 BOC43 BOC44 BOC45 BOC46 BOC47 BOC48 BOC49 BOC50 BOC51 BOC52 BOC53 BOC54 BOC55 BOC56 BOC57 BOC58 BOC59 BOC60 BOC61 BOC62 BOC63 BOC64 BOC65 BOC66 BOC67 BOC68 BOC69 BOC70 BOC71 BOC72 BOC73 BOC74 BOC75 BOC76 BOC77
447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/447a 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498 447a/498
6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 10 11 11 12 12 12 13 13 13 15 19 X 0 2 2 3 4 5 6 7 7 7 7 7 8 8
62
3 3 6 6 7 9 0 1 3 3 3 4 5 0 1 1 3 6 6 7 10 4 6 6 2 7 8 2 6 7 4 4 6 8 7 X 0 2 5 1 2 9 7 3 4 4 4 7 1 1
Tabulka 6: Přehled analyzovaných genotypů a výsledných skóre ADHD dotazníků
BOC78 BOC79 BOC80 BOC81 BOC82 BOC83 BOC84 BOC85 BOC86 BOC87 BOC88 BOC89 BOC90 BOC91 BOC92
447a/498 8 447a/498 8 447a/498 9 447a/498 9 447a/498 9 447a/498 11 447a/498 12 447a/498 12 447a/498 13 447a/498 17 447a/498 20 447a/498 X 447a/498 X 498/498 6 498/498 8 X = u daného jedince se nepodařilo získat vyplněný dotazník
2 3 3 6 11 4 3 13 3 11 18 X X 7 6
V rámci všech hodnocených vzorků border kolií byly detekovány celkem 3 alely, a to 435, 447a a 498. Alely byly nalezeny jak v homozygotních sestavách 435/435 (n=1), 447a/447a (n=50), 498/498 (n=2), tak v heterozygotních sestavách 435/447a (n=9), 435/498 (n=3) a 447a/498 (n=27). Celkem bylo tedy zjištěno šest různých genotypů: 435/435 435/447a 435/498 447a/447a 447a/498 498/498. Terminologie označování alel podle jejich velikosti je převzata z práce Ito et al. (2004) a na základě výsledků sekvenační analýzy doplněna o alelu 435. Získaná data byla zpracována programem Cervus 3.0.3 (Kalinowski, 2007). Výsledky hodnocení jsou prezentovány v tabulce 7. Pozorovaná heterozygotnost odpovídá očekávané heterozygotnosti, která by nastala při platnosti Hardy-Weinbergova zákona. Tabulka 7: Relativní frekvence alel a heterozygotnost markeru exonu 3 genu DRD4 u sledovaných jedinců plemene border kolie n 89
435
Frekvence alel 447a
498
HE
0.0787 0.7416 0.1798 0.4139 n = počet genotypovaných jedinců
HO 0.4157
HE = očekáváná heterozygotnost, HO = pozorovaná heterozygotnost
63
5.4.1 Hodnocení ADHD dotazníku Ke statistickému zpracování se podařilo získat 89 vyplněných dotazníků (96,7 %) z celkového počtu 92 moţných, coţ je počet psů, u kterých jsme zjistili genotyp. Skóre pro aktivitu-impulzivitu a nepozornost bylo vypočítáno u 52 fen a 37 psů. Všichni sledovaní psi ţijí v domácnosti svých majitelů. Tabulka číslo 8 charakterizuje výsledná skóre obou pozorovaných vlastností. Tabulka 8: Parametry výsledných skóre pro aktivitu-impulzivitu a nepozornost získané pomocí ADHD dotazníku Parametr Skóre pro aktivitu-impulzivitu Skóre pro nepozornost xmin 0 0 xmax 20 18 X 8,0225 4,3933 s 3,6431 3,2705 Vk [%] 45,4113 74,4425 xmin = nejniţší získané skóre, xmax = nejvyšší získané skóre, X = aritmetický průměr, s = směrodatná odchylka, Vk = variační koeficient
5.4.2 Výsledky parametrického t-testu Během řešení diplomové práce byla provedena analýza výsledných skóre pro aktivituimpulzivitu a pro nepozornost pomocí dvouvýběrového t-testu, který pouţili také Hejjas et al. (2007b). Analyzované byly všechny skupiny psů uvedené v tabulce 4 v kapitole 4.6.2 bez ohledu na počet jedinců v testované skupině. Výsledky analýzy zobrazuje tabulkový přehel uvedený v příloze 5 této práce. V diskusi budou diskutována pouze šetření s reprezentativním počtem jedinců ve skupinách, a to skupiny s více neţ deseti jedinci. Výsledky testování byly taktéţ zobrazeny graficky. Zde uvádíme krabicové grafy prvních osmi statistických testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro aktivitu-impulzivitu a nepozornost.
64
Graf 6: Krabicové grafy u statistického testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro aktivitu-impulzivitu – 1.část
65
Graf 7: Krabicové grafy u statistického testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro aktivitu-impulzivitu – 2.část
66
Graf 8: Krabicové grafy u statistického testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro nepozornost – 1.část
67
Graf 9: Krabicové grafy u statistického testování, které vykazovaly největší rozdíly v průměrném skóre pro nepozornost – 2.část
68
6 DISKUZE 6.1
Soubor hodnocených jedinců Dostatečný počet jedinců ve sledovaném souboru je zásadní pro správné statistické
hodnocení vlivu polymorfismu genu na sledované povahové rysy. V případě psů plemene border kolie jsem se většinou setkávala s ochotou majitele poskytnout vzorek svého psa pro tuto práci, s velkým zájmem o téma moţného vlivu genů na povahu jedince a o výsledky svého psa. Nicméně i tak bylo potřeba majitelům vše několikrát vysvětlovat z důvodu jejich obav o zneuţití vzorku. Další obavou bylo veřejné prezentování výsledků a strach z poškození dobrého jména chovatelské stanice. Tomu jsme předešli prezentací výsledků anonymní formou. V prvotních studiích zaměřených na téma polymorfismu exonu 3 genu DRD4 u psů bylo genotypováno 34 psů (19 zlatých retrívrů, 15 shiba inu) (Niimi et al., 1999). V následujícíh pracech se čísla souborů zvyšovala. Niimi et al. (2001) genotypovali 102 psů, z toho 38 bíglů, 40 šeltií, 11 zlatých retrívrů a 13 shiba inu. Ito et al. (2004) analyzovali vzorky 1535 jedinců 23 různých plemen, z čehoţ největší četnost zastoupení mělo plemeno shiba inu (192 jedinců), zlatý retrívr (174 jedinců), bígl (142 jedinců), labradorský retrívr (134 jedinců a maltézský psík (126 jedinců). Hejjas et al. (2007a) sledovali variabilitu genu DRD4 u 497 jedinců čtyř plemen psů (belgický ovčák tervueren, malinois, groenandael a německý ovčák) a 22 zástupců vlka evropského (Canis lupus). První studie zaměřená na hledání vztahu mezi polymorfismem genu dopaminového receptoru DRD4 a povahovými vlastnostmi psů pracovala s 241 jedinci plemene německý ovčák, ke kterým bylo získáno 189 vyplněných dotazníků podle Vas et al. (2007). Čtyřicetšest procent těchto oklasifikovaných německých ovčáků patřilo policejním psovodům. Variabilita sledovaného markeru nebyla dosud u plemene border kolie hodnocena. Při řešení této práce se podařilo získat vzorky celkem 100 jedinců plemene border kolie, narozených v České republice nebo v Nizozemí, a to především při příleţitosti soutěţí agility, flyballu nebo klubové výstavy. Kvalitní DNA se podařilo extrahovat z 92 vzorků. Pro hodnocení vztahu mezi polymorfismem exonu 3 genu DRD4 a psychickými vlastnostmi psů bylo potřeba získat majitelem vyplněný ADHD dotazník validovaný pro psy (Vas et al., 2007), coţ se podařilo u 97 jedinců ze sta. Do naší studie bylo zapojeno 92 psů, ke
69
kterým bylo získáno 89 dotazníků (96,7 %). Hejjas et al. (2007b) měli k dispozici tato data o 189 německých ovčácích z celkového počtu 241 (78 %).
6.2
Izolace DNA Vzorky byly odebrány metodou stěru buněk z bukální sliznice psů pomocí sterilního
cytologického kartáčku. Tato metoda byla vybrána z několika důvodů. Odběr nevyţaduje asistenci veterinárního lékaře, je zcela neinvazivní, je časově nenáročný, odběr lze provádět kdekoli v terénu a k odběru je nutné jen minimální vybavení. Nicméně tento způsob odběru vyţaduje výbornou socializaci zvířete, dobrou ovladatelnost a krotkost. Psi plemene border kolie toto vše splňují; standard plemene border kolie vyţaduje výbornou ovladatelnost, poslušnost a striktně zakazuje agresi. Naprostá většina zvířat snášela stěr bez problémů, často nebyla nutná další asistence. Stěry vzorků byly prováděny na závodech agility, na klubové výstavě, na závodech ve flyballu, po dohodě s majiteli u nich doma nebo na smluveném místě. Podmínkou bylo zamezit zvířeti alespoň půl hodiny před odběrem přijímat potravu, aby nedošlo ke kontaminaci vzorku. Jinou vhodnou metodou, která by připadala v úvahu, je izolace DNA z chlupových cibulek. Odběr chlupů by měl být teoreticky jednodušší zejména u méně krotkých zířat. Tuto metodu jsme nezvolili vzhledem k malé výtěţnosti získané DNA oproti stěru buněk bukální sliznice. Největší výtěţnosti se dosahuje při izolaci DNA ze vzorků krve. Odběr však smí provádět pouze veterinární lékař a jde o invazivní metodu, která čato psa stresuje a je malá pravděpodobnost, ţe by majitel s odběrem krve pro nekomerční účel souhlasil. V úvahu by přicházelo vyuţít část krve původně odebrané k léčebně-diagnostickým účelům. Další moţností získání vzorku krve u border kolií je vyuţít hromadných odběrů vzorků krve při bonitacích nebo jiných příleţitostech, které jsou zasílány komerčním společnostem k diagnostice markerů genu pro onemocnění CEA, CL. Hejjas et al. (2007b) izolovali DNA pouze z buněk bukální sliznice získaných stěrem pomocí cytologického kartáčku. Ito et al. (2004) a Niimi et al. (2004) vyuţili vzorky jak buněk bukální sliznice, tak i vzorky krve, Niimi et al. (1999) pouţívali metodu krevního odběru. Oberbauer et al. (2003) ověřovali moţnost vyuţití odstřiţených kusů drápů a zjistili, ţe poskytují mnoţství DNA dostatečné pro tisíce PCR reakcí a navíc se původní tkáň snadno skladuje.
70
Pro vlastní izolaci genomické DNA byl pouţit kit NucleoSpin® Tissue XS (Macherey-Nagel, SRN) s postupem doporučeným výrobcem. Tato metoda je poměrně rychlá a DNA získaná tímto způsobem byla pouţitelná pro následující PCR analýzy a vykazovala výborné parametry kvality i kvantity. Navíc zaručuje na rozdíl od tradiční fenolchloroformové purifikační metody sterilitu a stabilní sloţení pouţitých roztoků. Ito et al. (2004) a Niimi et al. (1999, 2004) pouţili kit QIAamp (Quiagen, USA). Hejjas et al. (2007b) izolovali DNA pomocí kitu Gentra DNA Purification kit. Z počtu 100 vzorků se podařilo extrahovat DNA v dostatečném mnoţství a kvalitě z 92 vzorků. Důvodem byla špatná kvalita některých vzorků způsobená pravděpodobně přepravou vzorků od majitele dopravní společností, nevhodně naplánovaná na konci pracovního týdne, takţe vzorky byly před laboratorním zpracováním skladovány dva dny při pokojové teplotě. Tento problém se týkal sedmi dotyčných vzorků. U osmého vzorku pravděpodobně došlo k získání malého počtu buněk při stěru bukální sliznice. Psi nezařazení do studie z tohoto důvodu jsou přehledně uvedeni v kapitole 4.2.
6.3
Detekce alel exonu 3 genu DRD4 K detekci alel byla pouţita kapilární gelová elektroforéza přístrojem ABI PRISM 310®
(Applied Biosystems). Niimi et al. (1999, 2001) pouţili k detekci alel separaci na agarózovém gelu a následně sekvenaci PCR produktů přístrojem 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division, USA). Ito et al. (2004) vzorky také sekvenovali, a to přístrojem ABI3100 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division , USA). Hejjas et al. (2007a; 2007b) pouţili k detekci alel separaci elektroforézou na agarózovém gelu a vizualizaci ethidium bromidem. Z pohledu přesnosti detekce alel se zdá být rozhodně nejlepší kombinace separace fragmentů na gelu a jejich sekvenace, kterou vyuţili Ito et al. (2004) a Niimi et al. (1999, 2001). Detekce alel zaloţená pouze na separaci na agarózovém gelu můţe být nedostačující při odlišení alel 447a a 447b. Z osmi známých alel exonu 3 genu DRD4 se u border kolií podařilo fragmentační analýzou detekovat celkem tři alely, a to alely 435, 447a a 498. Ito et al.(2004) pozorovali u kaţdého z 23 hodnocených plemen výskyt dvou aţ sedmi alel, u ţádného ale nebylo přítomno všech osm. Nejvíce různých alel bylo přítomno u plemene shiba, maltézský psík a velškorgi, a to sedm (Ito et al., 2004). Japonské plemeno shiba je známé svojí vysokou genetickou diverzitou (Niimi et al., 2001). Nejméně různých alel bylo nalezeno u papillonů, a to dvě (Ito
71
et al., 2004). Z pohledu počtu alel se zdá být variabilita tohoto lokusu u border kolií průměrná. Pozorovaná heterozygotnost (0,4157) byla téměř totoţná s očekávanou hodnotou (0,4139), která by nastala při platnosti Hardy-Weinbergova zákona. V práci Ito et al. (2004), která se zabývá rozdíly v distribuci alel exonu 3 genu DRD4 u 23 plemen psů, se hodnoty očekávané heterozygotnosti pohybovaly od 0,149 do 0,745. Výsledek téměř ideální heterozygotnosti je nejpravděpodobněji výsledkem šlechtění border kolií na základě pracovních schopností v pasení ovcí, kdy jsou dodnes do chovu zařazováni i jedinci bez průkazu původu, kteří prokáţou výjimečné pracovní schopnosti (The International Sheep Dog Society, 2007). Ve srovnání s hodnotami zjištěnými u border kolií uvádíme hodnoty zjištěné v práci Jeţková (2010), kdy pozorovaná heterozygotnost (0,4495) alel exonu 3 genu DRD4 byla niţší neţ očekávaná hodnota (0,4675). Jedním z příčin tohoto výsledku můţe být tzv. bottleneck efekt (efekt hrdla láhve), při kterém dochází k silnému poklesu genetické proměnlivosti v důsledku dramatického sníţení velikosti populace k němuţ u plemene bearded kolie došlo po druhé světové válce. V rámci všech hodnocených vzorků DNA border kolií byly detekovány celkem tři alely, 435, 447a, 498. Nejvyšší frekvenci výskytu vykazovala alela 447a (0,7416), následována alelou 498 (0,1798) a v minoritním zastoupení byla alela 435 (0.0787). Ito et al. (2004) přisuzují plemenům s vysokou frekvencí alel 435 a 447a okcidentální původ. Orientální plemena mají podle něj vyšší zastoupení alel 447b, 498 a 549. Všeobecně se předpokládá, ţe významným střediskem domestikace ovcí byla Střední Asie, je tedy moţné, ţe psi doprovázející starověké pastevecké kmeny během migrace na západ se tak mohli dostat aţ do Velké Británie a dát původ i border koliím určeným pro práci s ovcemi. Vzhledem k tomu, ţe neexistují záznamy o tom, ţe by border kolie pocházely určitým kříţením orientálních plemen psů, můţeme vyšší výskyt alely 498 přisuzovat i způsobu chovu border kolií. Po staletí byly do chovu připouštěni psi na základě pracovních schopností a nikoli na základě původu nebo vzhledu, proto je moţné původ alel hledat i v jiném plemeni psů jako jsou kolie, bearded kolie a další ovčácká plemena. Nejpodobnější výskyt a frekvenci alel jako jsme nalezli u border kolií zjistil Ito et al. (2004) u plemene šeltie, které vzniklo také ve Velké Británii. Bearded kolie, které mnoho staletí sháněly dobytek na stejném území jako border kolie, měly podle práce Jeţková (2010) nejčastěji zastoupeny alely 447a (0,7110) a 435 (0.1376). Alela 498 byla zastoupena frekvencí 0,0688. Důvodem výskytu právě takového zastoupení alel genu pro dopaminový receptor D4 u border kolií by mohl být jejich částečný vliv na povahové vlastnosti psů, schopnost učit se 72
nové věci a tím těmto psům dávat jistou selektivní výhodu. V praxi se tato výhoda mohla projevit tak, ţe byli do chovu pouţívání psi, kteří byly bystřejší, vnímavější, ovladatelnější a kteří pracovali s větší chutí po mnoho hodin. V této práci jsme získali vzorky převáţně od psů, kteří se nevěnují práci na farmě, ale jsou chováni jako mazlíčci a jejich vrozená touha po činnosti je směrována na psí sporty. V této oblasti chovu border kolií nejsou psi selektováni na základě pracovních vlastností. I v dnešní době ale fungují ve velké míře chovy border kolií pro pracovní uplatnění na farmách s ovcemi. Zde jsou psi, kteří nepracují, špatně se učí, kteří nemilují pracovní kontakt s člověkem, okamţitě prodáni jako mazlíčci. Bylo by velice zajímavé provést podobnou studii v dostatečně velkých populacích border kolií, a to jak úspěšně pracujících, které se osvědčily a byly tedy zařazeny do chovu, tak těch, kteří byli pro povahové vlastnosti vyřazeny. Ito et al. (2004) dále uvádějí, ţe skupina s vyšší četností alel 447b, 498 a 549 dosahovala vyššího průměrného skóre pro agresivitu a niţšího skóre pro reaktivitu neţ skupina s vysokou frekvencí alel 435 a 447a. V tomto případě lze s autorem souhlasit, protoţe podle plemenného standardu mají být border kolie výborně ovladatelné, ţivé, pozorné, poslušné a inteligentní. Nesmí být ani nervózní ani agresivní. Ţádný z hodnocených psů navíc neprojevil při odběru vzorků bukální sliznice sebemenší náznak agresivity.
6.4
Sekvenační analýza alel 435, 447a, 498 exonu 3 genu DRD4 K sekvenaci PCR produktů jsme přistoupili z důvodu přesného ověření totoţnosti
nalezených alel vzhledem k publikovaným sekvencím (Niimi et al., 1999; Ito et al., 2004). Zvláště nás zajímalo stoprocentní odlišení alel 447a a 447b a sekvence alely 435. Grafickým srovnáním byla zjištěna shoda s dříve publikovanými výsledky, proto lze s jistotou konstatovat, ţe se u námi sledované populace border kolií vyskytly tři alely, a to 435, 447a, 498. Označení alel na základě jejich velikosti je převzato z práce Ito et al. (2004).
6.5
Aminokyselinová sekvence exonu 3 genu DRD4 Pro dodatečné ověření výsledků fragmentační analýzy jsme programem CLC Main
Workbench 6.0.1 stanovili sekvenci aminokyselin části proteinu kódovaném zjištěnými alelami exonu 3 genu DRD4. Sekvence je zobrazena v kapitole 5.3.2 a odpovídá výsledkům práce Ito et al. (2004). Frekvence výskytu jednotlivých aminokyselin v alelách byla srovnávána s frekvencí aminokyselin v proteinech savců. Frekvence se lišily z důvodu malé
73
velikosti srovnávaného kódovacího úseku genu (78 aţ 99 bp exonu 3 genu DRD4) oproti průměrným velikostem kódujících úseků pro všechny doposud známé proteiny savců.
6.6
Statistické zpracování dotazníků Pro posouzení povahových vlastností border kolií byl pouţit ADHD dotazník
upravený a validovaný pro majitele psů (Vas et al., 2007), který byl pro stejný účel pouţit i v pracích Hejjas et al. (2007a) a Hejjas et al. (2007b). Průměrné skóre pro aktivituimpulzivitu dosahovalo hodnoty 8,022 a průměr skóre pro nepozornost byl 4,393. Hejjas et al. (2007b) uvádí průměrné skóre pro aktivitu-impulzivitu u německých ovčáků 7,9±0,4, přičemţ skóre policejních psů bylo o něco vyšší neţ u psů mazlíčků. Průměrné skóre pro nepozornost uvádějí 4,7±0,3. V tomto ohledu můţeme konstatovat, ţe se hodnoty u border kolií výrazně nelišily, spíše odpovídaly skóre policejních německých ovčáků uvedených v práci Hejjas et al. (2007b). V práci zaměřené na stejné téma u plemene bearded kolie byly výsledky průměrného skóre pro aktivitu-impulzivitu 6,908 a průměrné skóre pro nepozornost 4,678 (Jeţková, 2010). Ve srovnání s bearded koliemi vykazují border kolie vyšší stupeň aktivityimpulzivity a menší stupeň nepozornosti. Nicméně je nutné dodat, ţe v práci Jeţková (2010) bylo získáno 65 dotazníků oproti 89 dotazníkům v této práci. Odpovědi dotazníku jsou také ovlivněny vztahem majitele a jeho psa a jejich čas strávený při posuzovaných činnostech. Jinak bude svého psa znát majitel výstavního plemene a jinak majitel, který se psem kaţdý den aktivně pracuje nebo cvičí. V tomto ohledu jsou majitelé border kolií výjimeční a vhodní pro naše studie, neboť border kolie vyţadují neustálé zaměstnání a s tímto faktem si plemeno border kolie vybírají lidé aktivní, zvídaví, otevření všem novým činnostem. Hejjas et al. (2007b) rozdělili hodnocené německé ovčáky na dvě skupiny na základě vlivu podmínek prostředí chovu na psy policejní a psy mazlíčky. V tomto ohledu nebylo nutné border kolie dělit na dvě skupiny, neboť všechny ţijí v domácnostech svých majitelů a byly odchovávané za podobných podmínek. Hejjas et al. (2007b) zaznamenali významně vyšší skóre pro aktivitu-impulzivity u policejních německých ovčáků, kteří měli alespoň jednu alelu 447a. Tento rozdíl nebyl u psů zařazených do skupiny „mazlíčků“ pozorován, coţ si vysvětlují působením různorodých vnějších podmínek prostředí, jako je například přístup majitele, kvalita výcviku a podobně. U policejních psů jsou často podmínky odchovu i výcviku jednotné. V následující studii provedené na belgických ovčácích se však vliv genotypu na výsledné skóre pro aktivituimpulzivitu ani nepozornost neprokázali (Hejjas et al., 2007a).
74
Porovnání výsledných skóre aktivity-impulzivity u border kolií Z kapitoly Výsledky 5.4.2 a tabulkového přehledu v příloze 5 je patrné, ţe nebyly na hladině významnosti α=0,05 pozorovány významné rozdíly mezi testovanými skupinami psů. Tento výsledek bylo moţné předpokládat, protoţe povahové vlastnosti psů je poměrně obtíţné jednoznačně charakterizovat bodovým skóre stanoveným na základě dotazníku a současně je nutné si uvědomit, ţe výsledné chování kaţdého jedince nebude ovlivněno pouze mutací jediného genu. Hejjas et al. (2007b) sice prokázali statisticky průkazný vliv detekovaného genotypu na výsledné hodnoty dotazníkového šetření. Jejich práce je však jediná tohoto druhu, která statistickou průkaznost potvrdila. V diskuzi diplomové práce se nyní zaměřím na hodnocení rozdílů u takových skupin psů, kde minimální počet jedinců v porovnávané skupině byl deset. Důvody toho, ţe se v diskuzi nebudu zmiňovat o málopočetných skupinách jsou uvedeny jiţ v kapitole Výsledky. Největší rozdíl v bodovém skóre pro aktivitu-impulzivitu byl získán u testování 5, ve kterém byly porovnáváni všichni jedinci s alespoň jednou alelou 435 vůči všem ostatním genotypům bez ohledu na jejich pohlaví. Skupina zvířat s alespoň jednou alelou 435 vykázala průměrnou hodnotu aktivity-impulzivity 9,000, naopak zbývající genotypy měly průměrnou hodnotu 7,886 (příloha 5). Pravděpodobnost shody těchto dvou průměrů dosáhla hodnoty p=0,298. Hejjas et al. (2007b) pro hodnocení efektu alel vytvořili částečně odlišné skupiny. Do skupiny jedinců s alelou 435 zařadil pouze homozygoty 435/435, které porovnával s genotypy 435/447a a 447a/447a. V diplomové práci jsem takovéto roztřídění nemohla provést, protoţe alelickou kombinaci 435/435 u hodnocených border kolií měl pouze jeden jedinec. Při porovnání mnou získaných výsledků se nepotvrdilo, ţe jedinci s alelou 435 vykazují niţší průměrnou hodnotu skóre pro aktivitu-impulzivitu oproti ostatním genotypům. V hodnocené populaci border kolií byla rovněţ detekována alela 498 (tabulka 6). Hejjas et al. (2007b) tuto alelu u souboru německých ovčáků nezjistili. Ze statistického testování číslo 22, ve kterém byli porovnáváni všichni psi (samci) s alespoň jednou alelou 498 oproti všem psům s genotypem 447a/447a, byly zjištěny relativně vyšší rozdíly na úrovni aktivity-impulzivity.
Pravděpodobnost
shody
průměrných
hodnot
skóre
u
těchto
porovnávaných skupin dosahovala hodnot p=0,372 (příloha 5). Skupina psů s homozygotní sestavou 447a/447a vykazovala vyšší průměrnou hodnotu aktivity-impulzivity oproti psům s alespoň jednou alelou 498. Hejjas et al. (2007b) ve své práci zdůrazňují, ţe jedinci s alespoň jednou alelou 447a, kteří plní funkci u policie, vykazují vyšší hodnoty aktivity-impulzivity. Naopak Ito et al. (2004) předpokládají, ţe alela 498, která je charakteristická zejména pro 75
některá primitivní asijská plemena psů, můţe mít souvislost s vyšší agresivitou. V diplomové práci jsem prokázala, ţe alela 498 není typická pouze pro asijská plemena. Problematiku výskytu alely 498, která u psů způsobila mírné sníţení skóre pro aktivitu-impulzivitu, jsem jiţ diskutovala v předcházející části kapitoly. Pokud bylo provedeno porovnání bodových skóre aktivity-impulzivity všech jedinců bez ohledu na pohlaví s alespoň jednou alelou 498 oproti zbývajícím genotypům, byly naopak zjištěny minimální diference získaných skóre. Pravděpodobnost shody dosahovala hodnot p=0,967. Tento výsledek svědčí tomu, ţe alela 498, kterou Ito et al. (2004) povaţují za zodpovědnou pro agresivní chování psů, nebude hrát významnou roli při stupni aktivity-impulzivity. Další vyšší rozdíly v hodnotách průměrné aktivity-impulzivity byly zjištěny při porovnávání heterozygotních a homozygotních sestav genu DRD4. Tento způsob statistického vyhodnocení nepouţili ani Hejjas et al. (2007a, 2007b). Ze statistického testování 24 bylo zjištěno, ţe při porovnávání jakýchkoli homozygotních fen vůči všem heterozygotním fenám je pravděpodobnost shody p=0,339. Průměrná hodnota skóre aktivity-impulzivity u homozygotních fen byla niţší ve srovnání s heterozygotními fenami. Přestoţe na základě hodnocení homozygotnosti jednoho genu nelze usuzovat na inbreední původ těchto zvířat, je však moţné tvrdit, ţe homozygotní jedinci se vyštěpí na základě kříţení geneticky příbuzných jedinců z hlediska alel pro dopaminový receptor DRD4. Tento závěr potvrzuje i statistické testování 25, kde byli porovnáváni homozygotní psi (samci) s heterozygotními psy (samci). U opačného pohlaví byl zjištěn zcela opačný výsledek. Homozygotní jedinci vykazovali nepatrně vyšší průměrnou hodnotu skóre pro aktivitu-impulzivitu. Tento výsledek u samců je zřejmě ovlivněn i efektem pohlaví při porovnávání bodových skóre aktivity-impulzivity (testování číslo 9, příloha 5). Pravděpodobnost shody mezi průměrnými hodnotami skóre pro aktivity-impulzivitu všech psů (samců) a fen bez ohledu na jejich genotyp sice nebyla statisticky průkazná, ale dosáhla hodnoty p=0,384. Tato pravděpodobnost shody je pátá nejniţší v rámci všech reprezentativních statistických testování (příloha 5). Psi (samci) získali průměrnou hodnotu bodového skóre pro aktivituimpulzivitu 8,308 a feny 7,622. Přestoţe tyto výsledky nejsou statisticky průkazné na hladině významnosti α=0,05, je moţné vyvodit hypotézu, ţe mírné zvýšení aktivity-impulzivity u samců můţe být ovlivněno pohlavím, které způsobuje vyšší dráţdivost samců. Pokud se na tuto hypotézu díváme z pohledu rozdílů mezi samci a samicemi s homozygotními sestavami 447a/447a, tak tento výsledek není moţné potvrdit. Důkazem je statistické testování číslo 26, ve kterém průměrné hodnoty skóre pro aktivitu-impulzivitu se shodovaly mezi fenami a psy s pravděpodobností p=0,939 (příloha 5). Z tohoto výsledku je moţné usuzovat na to, ţe 76
rozdíly v aktivitě-impulzivitě mezi psy a fenami zřejmě nebudou způsobeny přítomností alely 447a. Tomuto výsledku nasvědčuje i práce Hejjas et al. (2007b), kteří rovněţ u genotypů 447a/447a nezjistili statisticky průkazné rozdíly mezi psy a fenami. Porovnání výsledných skóre nepozornosti u border kolií Výrazně vyšší rozdíly oproti aktivitě-impulzivitě byly zjištěny při hodnocení bodových skóre pro nepozornost. V rámci těchto statistických testování byla zjištěna pomocí t-testu výrazně niţší pravděpodobnost shody porovnávaných genotypů. Tento výsledek je moţné odůvodnit tím, ţe pro chovatele je mnohem snadnější posoudit stupeň nepozornosti psa oproti stupni jeho aktivity-impulzivity. Z přílohy 5 vyplývá, ţe u statistického testování číslo 21, kde byly porovnávány všechny feny s alespoň jednou alelou 498 oproti homozygotním fenám 447a/447a, byly zjištěny statisticky významné rozdíly na hladině významnosti α=0,05. Porovnávané průměry se shodovaly pouze s pravděpodobností p=0,043. Přičemţ feny s alespoň jednou alelou 498 vykazovaly průměrné skóre pro nepozornost 5,316 a feny s genotypem 447a/447a pouze 3,16. Vzhledem k tomu, ţe Hejjas et al. (2007b) u hodnocených psů alelu 498 nezjistili, není moţné tento výsledek s nimi diskutovat. Jediná práce, která přiřazuje k alele 498 určité povahové vlastnosti, je studie Ito et al. (2004). Tito autoři se domnívají, ţe alela 498 je charakteristická pro poměrně agresivní plemena psů. Příčiny výskytu této alely u plemene border kolie jiţ byly diskutovány v předchozí části této kapitoly. Zajímavé je však zjištění statistického testování číslo 22 (příloha 5), kde byly porovnávány stejné genotypy, ale u psůsamců. V tomto případě rozdíly nebyly statisticky průkazné a pravděpodobnost shody dosahovala hodnoty p=0,653. Přestoţe tyto rozdíly nebyly statisticky průkazné, rovněţ i samci s alespoň jednou alelou 498 vykazovali mírně vyšší hodnotu průměrného skóre pro nepozornost (5,0) oproti samcům s genotypem 447a/447a (4,5). Ze statistického testování 1 (příloha 5) vyplývá, ţe poměrně velké rozdíly mezi průměrným skóre nepozornosti (p=0,065) byly zjištěny rovněţ mezi jedinci s genotypem 447a/447a a ostatními genotypy bez ohledu na pohlaví. Tento rozdíl nelze sice povaţovat za statisticky významný na hladině významnosti α=0,05, ale z hlediska hodnocených dat se jednalo o druhou nejvyšší zjištěnou diferenci. Homozygoti 447a/447a vykazovali niţší stupeň skóre pro nepozornost oproti ostatním genotypům (příloha 5). Hejjas et al. (2007b) ve svých analýzách zařadili do jedné skupiny všechny psy, kteří měli alespoň jednu alelu 447a. O této alele se domnívali, ţe působí pozitivně na sniţování nepozornosti. Tento výsledek byl
77
v podstatě potvrzen i při řešení diplomové práce, přestoţe experimenty byly provedeny s jiným plemenem psů. V diplomové práci jsem se zaměřila rovněţ na hodnocení vlivu alelické kombinace 447a/447a u fen oproti ostatním fenám. Pro skóre nepozornosti tyto rozdíly sice nebyly statisticky průkazné na hladině významnosti α=0,05, přesto získaná pravděpodobnost shody p=0,068 odpovídala třetím nejvyšším rozdílům v rámci všech reprezentativních statistických testování uvedených v příloze 5. I u fen bylo zjištěno výrazně niţší skóre pro nepozornost (3,16) u genotypu 447a/447a oproti zbývajícím fenám (4,889). Tento výsledek je rovněţ v souladu se závěry, které publikovali Hejjas et al. (2007b). Stejný typ analýzy (statistické hodnocení 10, příloha 5) byl proveden rovněţ u psů samců. I v tomto případě samci s genotypem 447a/447a měli niţší skóre pro nepozornost (4,5) oproti ostatním samcům (5,538). Tyto rozdíly však vykazovaly menší diferenci, pravděpodobnost shody byla rovna 0,328. Z tohoto výsledku lze vyvodit hypotézu, ţe efekt alely 447a na schopnost se soustředit při práci byl výrazně vyšší u fen neţ u psů. Rozdíl mezi fenami a psy však nelze zobecnit z hlediska praxe chovatelů a cvičitelů border kolií, protoţe u tohoto specializovaného plemene nebyly nikdy zjištěny rozdíly ve schopnosti se soustředit odvíjející se od příslušnosti k pohlaví. Ze statistických hodnocení uvedených v příloze 5 je rovněţ zřejmý vliv přítomnosti alely 498 na stupeň hodnocené nepozornosti. Získané výsledky není moţné porovnat s jinými autory, protoţe u psů jimi hodnocených se tato alela nevyskytovala. Ze statistického hodnocení 8, ve kterém byla porovnávána nepozornost u zvířat s alespoň jednou alelou 498 a všech homozygotů s alelami 447a/447a, je patrné, ţe pravděpodobnost shody dosáhla pouze hodnot p=0,069. Tento výsledek sice není statisticky průkazný na hladině významnosti α=0,05, ale přesto lze konstatovat, ţe jedinci s alespoň jednou alelou 498 vykazovali výrazně vyšší skóre pro nepozornost (5,2) oproti ostatním genotypům (3,816). Tento výsledek lze porovnat pouze se závěry Ito et al. (2004), kteří předpokládají, ţe alela 498 je častější u psů s vyšším stupněm agresivity. Absence agresivity u plemene border kolie jiţ byla popisována a diskutována v předchozí části diplomové práce. Přesto je však moţné hledat souvislosti mezi výskytem této alely, která je dle Ito et al. (2004) charakteristická pro asijská plemene s malou schopností komunikace s člověkem, a mezi sníţenou pozorností border kolií nesoucích tuto alelu oproti ostatním. Ze statistického hodnocení 15 (příloha 5), ve kterém byly porovnávány z hlediska nepozornosti všechny feny s genotypem 447a/498 se všemi homozygotními fenami 447a/447a rovněţ vyplývá, ţe přítomnost alely 498 zvyšovala skóre pro nepozornost (5,267) oproti homozygotním fenám 447a/447a (3,16). Tento výsledek 78
odpovídá závěrům, které jsem diskutovala v předchozím odstavci. Pokud z pohledu tohoto hodnocení byla provedena statistická analýza u psů (samců), která je prezentována testováním 14 v příloze 5, byly oproti fenám zjištěny výrazně menší diference mezi porovnávanými skupinami. Pravděpodobnost shody průměrných skóre pro nepozornost u psů byla rovna p=0,795. Tento výsledek můţe částečně podporovat jiţ vyřčenou teorii, ţe pozitivní efekt alely 447a na schopnost border kolií udrţet pozornost, je výrazně vyšší u fen neţ u psů. Tomuto závěru svědčí i výsledek statistického hodnocení 26, ve kterém bylo porovnáváno průměrné skóre pro nepozornost mezi fenami s genotypem 447a/447a psy (samci) s genotypem 447a/447a. Pravděpodobnost shody průměrných skóre dosáhla pouze hodnoty p=0,078. Tento rozdíl není statisticky významný na hladině významnosti α=0,05, ale přesto je moţné konstatovat, ţe průměrné skóre fen (3,16) bylo niţší oproti průměrnému skóre psů (4,5). Tento výsledek je moţné konfrontovat se závěry, které publikovali Hejjas et al. (2007b). Tito autoři zjistili, ţe pravděpodobnost shody průměrných skóre psů a fen byla rovna p=0,955. Je však nutné podotknout, ţe tito autoři se ve své analýze zabývali porovnáním psů a fen nejenom s homozygotním genotypem 447a/447a. Další moţný důvod rozdílu jsou specifické vlastnosti německých ovčáků, které Hejjas et al. (2007b) pouţili pro své experimenty. V této části diplomové práce budou diskutována taková statistická testování, která pro skóre nepozornosti vykazovala minimální diference. Z testování 20 uvedeného v příloze 5, ve kterém byly porovnávány všechny feny s genotypem 435/498 s fenami s genotypem 447a/498 vyplývá, ţe pravděpodobnost shody průměrných skóre dosáhla hodnoty 0,982. Tento typ porovnání genotypů nebylo moţné provést u psů (samců), protoţe u nich se tyto alelické kombinace nevyskytovaly v reprezentativním počtu. Přesto je tento výsledek u fen důkazem toho, ţe pokud je k alele 498 v genotypu připojena alela 435 nebo alela 447a, nelze nalézt vliv na výsledné průměrné skóre pro nepozornost. Zajímavý výsledek vyplývá z porovnání statistických testování 11 a 17. Testování 11 (příloha 5) jiţ bylo diskutováno v předchozí části kapitoly. Vyplynul z něj u fen pozitivní efekt homozygotní sestavy 447a/447a na sníţení průměrného skóre pro nepozornost. Tyto homozygotní feny byly ve statistickém testování porovnávány s fenami ostatních genotypů. Ve statistickém testování 17 byly s ostatními fenami porovnávány heterozygotní feny 435/447a. V tomto případě však průměrné hodnoty skóre pro nepozornost se shodovaly s vysokou pravděpodobností p=0,871 (příloha 5). Tento výsledek by mohl podpořit jiţ dříve vyslovenou hypotézu, ţe alela 447a v homozygotní sestavě u fen působí pozitivně na sníţení průměrné hodnoty skóre pro nepozornost. 79
7 ZÁVĚR Pro řešení diplomové práce bylo získáno celkem 92 vzorků buněk bukální sliznice od psů plemene border kolie v dostatečné kvalitě (38 vzorků od psů, 54 vzorků od fen). Izolace vysokomolekulární genomické DNA z buněk bukálních sliznic pomocí setu NucleoSpin® Tissue XS (Marchery-Nagel, SRN) se ukázala být vhodnou metodou získání DNA v dostatečné kvalitě a kvantitě pro následnou detekci polymorfismu genu DRD4. Pro amplifikaci PCR markeru jednotlivých alel exonu 3 genu DRD4 byla pouţita Pfu polymeráza v kombinaci s 7-deaza-dGTP, coţ se ukázalo být nutné pro amplifikaci fragmentu s tendencí vytvářet sekundární struktury. Pro odlišení polymorfismu v rámci alely 447 byla nutná druhá amplifikace, kde byl s úspěchem pouţit jiný reversový primer. Primery pouţité při PCR reakcích byly fluorescenčně značeny barvou 6FAMTM(Applied Biosystems), coţ umoţnilo následnou detekci a identifikaci velikosti PCR amplikonů proti hmotnostnímu standardu nesoucím odlišnou barvu LIZ® programem GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems). Detekce jednotlivých alel genu DRD4 byla provedena metodou kapilární gelové elektroforézy přístrojem ABI PRISM 310® (Applied Biosystems). U plemene border kolie byly nalezeny celkem tři alely 435, 447a a 498 genu DRD4 v šesti různých genotypech: 435/435, 435/447a, 435/498, 447a/447a, 447a/498, 498/498. Pro přesnou identifikaci nalezených alel byla provedena jejich sekvenační analýza. Fragmenty PCR byly nejprve purifikovány pomocí agarózové elektroforézy, následně z nich byla extrahována DNA pomocí MiniElute PCR Purification Kit (Qiagene). Pro sekvenační analýzu byl pouţit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Všechny tyto postupy se ukázaly jako velice vhodné a úspěšné. Následná sekvenace byla provedena taktéţ přístrojem ABI PRISM 310® (Applied Biosystems) za pomocí softwaru DNA Sequencing Analysis Software 5.1 (Applied Biosystems). Sekvenované alely byly programem CLC Main Workbench 6.0.1 (CLC) porovnány graficky s jiţ publikovanými výsledky. Ve všech třech typech námi nalezených alel se sekvence shodovala s dříve publikovanými výsledky. Byla tak přesně ověřena totoţnost především alely 447a proti publikované sekvenci alely 447b. V rámci hodnoceného vzorku populace border kolií byly nalezeny celkem tři alely genu DRD4, přičemţ největší frekvenci výskytu zjištěné programem Cervus 3.0.3 vykazovala alela 447a, alela 498 byla zastoupena méně a alela 435 minoritně. Vysoká četnost alely 447a odpovídá původu plemene pocházejícího z evropského kontinentu. Do následujících 80
statistických studií bylo zařazeno 89 psů, ke kterým majitelé psů ochotně vyplnili ADHD dotazník validovaný pro majitele psů. Programem Statistica 9.1 byly zpracovány parametrické t-testy výsledných skóre aktivity-impulzivity a nepozornosti pro 27 testovaných skupin psů vytvořených na základě zjištěných genotypů a příslušnosti k pohlaví. Výsledky námi provedené statistické analýzy je moţné shrnout do následujících bodů:
Aktivita-impulzivita
nebyly statisticky prokázány významné rozdíly na úrovni výsledných skóre pro aktivitu-impulzivitu mezi testovanými skupinami na hladině významnosti α=0,05
nebylo potvrzeno, ţe jedinci s alelou 435 vykazují niţší průměrnou hodnotu skóre pro aktivitu-impulzivitu oproti ostatním genotypům (p=0,298)
alela 498 nemá ve sledované populaci border kolií vliv na stupeň aktivity-impulzivity (p=0,967)
na stupeň aktivity-impulzivity nemá vliv ani homozygotní sestava 447a/447a, coţ potvrdilo srovnání skóre těchto jedinců se skóre jedinců s ostatními genotypy (p=0,519)
homozygotní jedinci bez ohledu na typ alely vykazovali nepatrně vyšší průměrnou hodnotu skóre pro aktivitu-impulzivitu oproti heterozygotním jedincům, hodnoty ale nebyly statisticky průkazné na hladině významnosti α=0.05
samci border kolií vykazovali vyšší hodnoty skóre aktivity-impulzivity neţ feny, výsledky ale nebyly statisticky průkazné průkazné na hladině významnosti α=0,05; zároveň byl vyvrácen efekt pohlaví na výši aktivity-impulzivity testováním fen homozygotů 447a/447a a psů stejnýcho homozygotů, kde byla výsledná hodnota p=0,939
Nepozornost
Alela 447a v homozygotní sestavě 447a/447a působí pozitivně na sniţování nepozornosti u border kolií, především u fen tohoto plemene
Feny s alespoň jednou alelou 498 měly statisticky průkazně (p=0,043) vyšší skóre pro nepozornost neţ feny s genotypem 447a/447a U stejného testování samců tento rozdíl pozorován nebyl (p=0,653); i tak samci s alelou 498 vykazovali vyšší skóre pro nepozornost oproti samcům 447a/447a
81
Byly zjištěny velké rozdíly mezi průměrnými skóre nepozornosti mezi jedinci s genotypem 447a/447a a ostatními jedinci (p=0,065) a zároveň mezi jedinci s genotypem 447a/447a a jedinci s alespoň jednou alelou 498 (p=0,069), coţ potvrzuje teorii o pozitivním vlivu homozygotní sestavy alely 447a na sniţování nepozornosti u border kolií.
Feny s genotypem 447a/447a měly taktéţ výrazně niţší skóre pro nepozornost oproti ostatním fenám (p=0,068). U stejného testování samců border kolií byly zjištěny menší diference (p=0,328), nicméně stále psi genotypu 447a/447a vykazovali niţší skóre pro nepozornost proti ostatním psům. Zároveň při testování fen 435/447a proti ostatním fenám byla pravděpodobnost shody p=0,871. Tento výsledek podporuje závěr, ţe alela 447a působí na sniţování nepozornosti pouze v homozygotní sestavě.
Největší shoda byla nalezena v hodnotách skóre pro nepozornost fen 435/498 a fen 447a/498, a to p=0,982. Lze tedy konstatovat, ţe heterozygotní sestava má stejný vliv na stupeň nepozornosti v přítomnosti alely 447a jako ostatní heterozygotní sestavy. Vysoký výskyt alely 447a můţe být vysvětlován i jako následek selekce border kolií
zaloţené na pracovních schopnostech. V následných studiích doporučuji zaměřit se především na populaci border kolií pocházející z pracovních chovů. Border kolie v pracovních chovech jsou do chovu zapojovány nebo vyřazovány pouze na základě pracovních schopností. Z toho důvodu by bylo zajímavé podobnou studii provést ve skupině border kolií, které úspěšně pracují na farmách, a ve skupině, které byly vyřazeny z chovu pracovních psů na základě povahy a pracovních vlastností a tyto dvě skupiny porovnat.
82
8 SEZNAM LITERATURY Altria, K.D. 1999. Overview of capillary electrophoresis and capillary electrochromatography. Journal of Chromatography A, 856, 443-463. Benes, F.M. 2001. Carlsson and the discovery of dopamine. Trends in Pharmacological Sciences, 22 (1), 46-47. Benjamin, J., Li, L., Patterson, C., Greenberg, B. D., Murphy, D. L., & Hamer, D. H. 1996. Population and familial association between the D4 dopamine receptor gene and measures of Novelty Seeking. Nature Genetics, 12 (1), 81-84. Bialleck, K.A., Schaal, H.P., Kranz, T.A., Fell, J., Elger, C.E., Axmacher, N. 2011. Ventromedial prefrontal cortex activation is associated with memory formation for predictable rewards. PloS ONE, 6(2), e16695. Blaschko, H. 1942. The activity of l(-)-DOPA decarboxylase. The Journal Of Physiology, 101, 337349. Bressan, R.A., Crippa, J.A. 2005. The role of dopamine in reward and pleasure behaviour – review of data from preclinical research. Acta Psychiatr Scand, 111 (Suppl. 427), 14–21. Brown, P., Marsden, C.D. 1998. What do the basal ganglia do? The Lancet, 351, 1801-04. Brown, T. A. 2007. Klonování genů a analýza DNA: Úvod, Univerzita Palackého v Olomouci, Olomouc, 389 s. ISBN: 978-80-244-1719-6 Carlsson, A., Lindqvist, M., Magnusson, T., Waldeck, B. 1958. On the presence of 3-hydroxytyramine in brain. Science, 127 (3296), 471. Coren, S. 2007. Inteligence psů, Práh, 319 s. ISBN: 978-80-7252-186-9 Curatolo, P., D’Agati, E., Moavero, R. 2010. The neurobiological basis of ADHD. Italian Journal of Pediatrics, 36 (1), 79. Dansk Kennel Klub. 2010. World Dog Chow 2010 - Obedience World Championship [online]. Vystaveno 2010 [cit. 15. března 2011]. Dostupné na
. Deutscher Verband der Gebrauchshundsportvereine. 2010. Agility World Championship 2010 Results [online]. Vystaveno 2010 [cit. 11. března 2011]. Dostupné na . Ding, Y. C., Chi, H. C., Grady, D. L., Morishima, A., Kidd, J. R., Kidd, K. K., Flodman, P., Spence, M. A., Schuck, S., Swanson, J. M., Zhang, Y., Moyzis, R. K. 2002. Evidence of positive selection acting at the human dopamine receptor D4 gene locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99 (1), 309-314. Divišová, K., Podešťová, M., Benda, J. 2003. AGILITY První krůčky, Nakladatelství PLOT, Praha, 153 s. Dostál, J. 2007. Genetika a šlechtění psů, Dona, České Budějovice, 260 s. ISBN 978-80-7322-104-1
83
Drtílková, I., Šerý, O., Balaštíková, B., Theiner, P., Uhrová, A., Ţáčková, M. 2007. Hyperkinetická porucha / ADHD, Galén, Praha, 268 s. Dulawa, S. C., Grandy, D. K., Low, M. J., Paulus, M. P., Geyer, M. A. 1999. Dopamine D4 Receptorknock-out mice exhibit reduce exploration of novel stimuli. Journal of Neuroscience, 19 (21), 9550-9556. Ebstein, R. P., Novick, O., Umansky, R., Priel, B., Osher, Y., Blaine, D., Bennett, E. R., Nemanov, L., Katz, M., Belmaker, R. H. 1996. Dopamine D4 receptor (DRD4) exon III polymorphism associated with the human personality of Novelty Seeking. Nature Genetics, 12 (1), 78-80. Faraone, S. V., Perlis, R. H., Doyle, A. E., Smoller, J. W., Gorlanick, J. J., Holmgren, M. A., Sklar, P. 2005. Molecular genetics of attention-deficit/hyperactivity disorder. Biological Psychiatry, 57, 1313-1323. Federation Cynologique Internationale. 2007. Agility regulations of the Federation Cynologique Internationale
[online].
Vystaveno
9.1.2007
[cit.
6.
března
2011].
Dostupné
na
. Flyball Club České republiky. 2010. Pravidla flyballu [online]. Vystaveno 10. ledna 2010 [cit. 15. března 2011]. Dostupné na . Gaš, B. 2001. Kapilární elektroforéza - Separační analytická metoda pro věk mikročipů. Vesmír, 80 (7), 370-372. Griffin, H. G., Griffin, A. M. 1994. PCR Technology – Current Innovations, PCR Press, London, p. 370. Hanačíková, N. 2000. Dílčí plemenná kniha ČMKU pro border collie, Borderholic, 5, 15-19 Hejjas, K., Vas, J., A., Kubinyi, E., Sasvari-Szekely, M., Miklosi, Ronai, Z. 2007a. Novel repeat polymorphisms of the dopaminergic neurotransmitter genes among dogs and wolves. Mammalian Genome, 18 (12), 871-879. Hejjas, K., Vas, J., Topal, J., Szantai, E., Ronai, Z., Szekely, A., Kubinyi, E., Horvath, Z., SasvariSzekely, M., Miklosi, A. 2007b. Association of polymorphisms in the dopamine D4 receptor gene and the activity-impulsivity endophenotype in dogs. Animal Genetics, 38 (6), 629-633. Hillebrand, L. 2000. LHB Agility - uitslagen [online]. Vystaveno 2000-2011 [cit. 15. března 2011]. Dostupné na < http://www.lhbsystems.nl/uitslagen/default.asp>. Hornykiewicz, O. 2010. A brief history of levodopa. J Neurol, 257 (Suppl 2), 249–S252. Innis, M. A., Myambo, K. B., Gelfand, D. H., Brow, M. A. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85 (24), 9436-9440.
84
Ito, H., Nara, H., Inoue-Murayama, M., Shimada, M. K., Koshimura, A., Ueda, Y., Kitagawa, H., Takeuchi, Y., Mori, Y., Murayama, Y., Morita, M, Iwasaki, T., Ota, K., Tanabe, Y., Ito, S. 2004. Allele Frequency Distribution of the Canine Dopamine Receptor DR Gene Exon III and I in 23 Breeds. Journal of Veterinary Medical Science, 66 (7), 815-820. Jaber, M., Robinson, S.W., Missale, C., Caron, M.G.1996. Dopamine receptors and brain function. Neuropharmacology, 35(11), 1503-19. Jeţková, J. 2010. Hodnocení genetické variability plemene bearded kolie pomocí molekulárních markerů. Diplomová práce. Česká zemědělská univerzita v Praze. Agronomická fakulta. Praha. 85 s. Kalinowski, S.T., Taper, M.L., Marshall, T.C. 2007. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology, 16, 1099-1006. Kašička, V. 1997. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod. Chemické Listy, 91 (5), 320-329. Kebir, O., Joober, R. 2011. Neuropsychological endophenotypes in attention-deficit/hyperactivity disorder: a review of genetic association studies [online]. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience. Vystaveno 16. března 2011 [cit. 21. března 2011]. Dostupné na . Klub agility České republiky. 2009. Řád agility České republiky [online]. Vystaveno 1.1.2009 [cit. 6. března 2011]. Dostupné na . Klub pracovních ovčáckých psů České republiky. 2004. Chov pod ISDS - Informace [online]. Vystaveno
2004
[cit.
7.
března
2011].
Dostupné
na
La Fédération Cynologique Internationale, 2011. Nomenclature des races [online]. Vystaveno 1998 2010 [cit. 27. února 2011]. Dostupné na . Lemos, N.P., Bartolotti, F., Manetto, G., Anderson, R.A., Cittadini, F., Tagliaro, F. 2001. Capillary electrophoresis: a new tool in forensic medicine and science. Science & Justice, 41, 203-210. Livak, K. J., Rogers, J., Lichter, J. B. 1995. Variability of dopamine D4 receptor (DRD4) gene sequence within and among nonhuman primate species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92 (2), 427-431. Loučka, R. 1999. Úvodní slovo, Borderholic, 1999 (2), 1-3. Loučka, R. 2001. Pasení s klubem BCCCZ, Borderholic, 2001 (9), 1-3. Loučka, R. 2008. Pasení se psem, Svaz chovatelů ovcí a koz v ČR, Brno, 88 s. Mikulica, V. 2004. Poznej svého psa, Dialog, Litvínov, 305 s. ISBN: 80-85843-00-5 Missale, C., Nash, S. R., Robinson, S. W., Jaber, M., Caron, M. G. 1998. Dopamine Receptors: From structure to function. Physiological Reviews, 78 (1), 189-225.
85
Mlnařík, J. 2006. Czech Database Of Border Collie [online]. Vystaveno 2006 [cit. 21. března 2011]. Dostupné na . Momozawa, I., Takeuchi, Y., Kusunose, R., Kikusui, T., Mori, Y. 2005. Association between equine temperament and polymorphism in dopamine D4 receptor gene. Mammalian Genome, 16, 538534. Műller, H. A. 2001. Border kolie, Timy, spol. s.r.o., Bratislava, 124 s. ISBN: 80-8065-014-4 Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., Erlich, E. 1986. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 51 (1), 263-273. Nara, H., Inoue-Murayama, M., Koshimura, A., Sugiyama, A., Muryama, Y., Maejima, M., Ueda, Y., Ito, H., Randi, E., Kim, H., Ha, J., Kitawaga, H., Takeuchi, Y., Mori, Y., Iwasaki, T., Morita, M., Ota, K., Ito, S. 2005. Novel polymorphism of the canine dopamine receptor D4 gene intron II region. Animal Science Journal, 76 (1), 81-86. Niimi, Y., Inoue-Murayama, M., Kato, K., Matsuura, N., Murayama, Y., Ito, S., Momoi, Y., Konno, K., Iwasaki, T. 2001. Breed Differences in Allele Frequency of the Dopamine Receptor D4 Gene in Dogs. The Journal of Heredity, 92 (5), 433-436. Niimi, Y., Inoue-Murayama, M., Murayama, Y., Ito, S., Iwasaki, T. 1999. Allelic variation of the D4 dopamine receptor polymorphic region in two dog breeds, Golden Retriever and Shiba. Journal of Veterinary Medical Sciences, 61 (12), 1281-1286. Noble, E.P., Ozkaragoz, T.Z., Ritchie, T.L., Zhang, X., Belin, T.R., Sparkes, R.S. 1998. D2 an D4 dopamine receptor polymorphisms and personality. American Journal of Medical Genetics (Neuropsychiatric Gen.), 81 (3), 257-267. North American Flyball Association, 2010. Flyball Rulebook [online]. Vystaveno 2005, poslední revize
16.
prosince
2010
[cit.
15.
března
2011].
Dostupné
na
. Oberbauer, A.M., Grossman D.I., Eggleston, M. L., Irion, D. N., Schaffer, A. L., Pedersen, N. C., Belanger, J. M. 2003. Alternatives to Blood as a Source of DNA for Large-scale Scanning Studies of Canine Genome Linkages. Veterinary Research Communications, 27 (1), 27-38. OBEDIENCE CZ. 2010. Zkušební řád & pravidla obedience v České republice (3. verze) studies [online].
Vystaveno
2010
[cit.
21.
března
2011].
Dostupné
na
<
http://www.obedience.cz/pravidla/ >. Olds, J., Milner, P. 1954. Positive reinforcement produced by electrical stimulation of septal area and other regions of rat brain. Journal of Comparative and Physiological Psychology, 47, 419-427. O'Malley, K. L., Harmon, S., Tang, L., Todd, R. D. 1992. The rat dopamine D4 receptor: sequence, gene structure and demonstration of expression in the cardiovascular system. The New Biologist, 4 (2), 136-146.
86
Petitdidier, J.P. 1999. Résultats Individuel Standard et parcours [online]. Vystaveno 1999 [cit. 11. března 2011]. Dostupné na . Raita-aho, T. 1998. FCI World Championchip 1996 - Results [online]. Vystaveno 28.1.1998 [cit. 11. března 2011]. Dostupné na . Raita-aho, T. 1998. Results of Maxi (Standard) Individuals in Finnish of FCI World Championchips. October 1998 in Maribor, Slovenia [online]. Vystaveno 29.10.1998 [cit. 11. března 2011]. Dostupné na . Saiki, R. K., Gelfand, D., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., A., Erlich H. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239 (4839), 487-491. Sambrook, J., Maniatis, T., Fritsch, E. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. (Second edition), Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, p. 1659. Satoh, Tak., Matsumoto, N., Nakai, S., Satoh, Tat., Minamimoto, T., Kimura, M. 2003. Dopamine neurons encode teaching signals for learning reward-based decision strategy. International Cpngress Series, 1250, 311-318. Savolainen, P., Zhang, Y. P., Luo, J., Lundeberg, J., Leitner, T. 2002. Genetic evidence for an East Asian origin of domestic dogs. Science, 298 (5598), 1610-1613. Seamans, J. 2007. Dopamine anatomy. Scholarpedia, 2(6), 3743. Schultz, W. 1997. Dopamine neurons and their role in reward mechanisms. Current Opinion in Neurobiology, 7, 191-197. Schultz, W. 1999. The reward signal of midbrain dopamine neurons. News Physiol. Sci., 14, 249-255. Schultz, W., Dayan, P., Montague, P.R. 1997. A neural substrate of prediction and reward. Science, 275 (5306), 1593-1599. Slovenská kynologická jednota. 2009. World Dog Show 2009 - Obedience výsledky celkové [online]. Vystaveno 2009 [cit. 15. března 2011]. Dostupné na . Smeets, W.J.A.J., González, A. 2000. Catecholamine systems in the brain of vertebrates: new perspectives through a comparative approach. Brain Research Reviews, 33, 308–379. Smith, H. O., Wilcox, K. 1970. Restriction endonuclease from Haemophilus influenzae. Journal of Molecular Biology, 51 (2), 379-391. Snustad, D. P., Simmons, M. J. 2009. Genetika, Masarykova Univerzita, Brno, 864 s. ISBN 978-80210-4852-2 Sűdhof, T.C., Starke, K. 2008. Handbook of experimental pharmacology: Pharmacology of neurotransmital release, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, p. 582.
87
Swanson, J.M., Sunohara, G.A., Kennedy, J.L., Regino, R., Fineberg, E., Wiga, T., Lerner, M., Williams, L., LaHoste, G.J., Wigal, S. 1998. Association of the dopamine receptor D4 (DRD4) gene with a refined phenotype of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD): a familybased approach. Molecular Psychiatry, 3, 38-41. The International Sheep Dog Society. Associate Societies [online]. Vystaveno 2007, poslední revize 8. prosince
2010
[cit.
7.
března
2011].
Dostupné
na
. The International Sheep Dog Society. History - Early Beginnings [online]. Vystaveno 2007, poslední revize
8.
prosince
2010
[cit.
30.
ledna
2011].
Dostupné
na
. The International Sheep Dog Society. The Dog [online]. Vystaveno 2007, poslední revize 8. prosince 2010
[cit.
30.
ledna
2011].
Dostupné
na
. The International Union of Basic and Clinical Pharmacology. 2010. Database: IUPHAR-DB Ligand: 940 [online]. Vystaveno 2010 [cit. 16. března 2011]. Dostupné na . Ugaz, V.M., Christensen, J.L. 2007. Electrophoresis in Microfluidic Systems,in Hardt, S., Schönfeld , F., (eds.), Microfluidic Technologies for Miniaturized Analysis Systems, Springer Science+Business Media, LLC, New York, pp. 393-438. ISBN 978-0-387-28597-9 US Disc Dog Nationals. 2010. Results. [online]. Vystaveno 20. října 2010 [cit. 15. března 2011]. Dostupné na . Vas, J., Topal, J., Pech, E., Miklosi, A. 2007. Measuring attention deficit and activity in dogs: A new application and validation of a human ADHD questionnaire. Applied Animal Behavior Science, 103 (1-2), 105-117. Vejrosta, F. Historie border collie [online]. Vystaveno 1. prosince 2009 [cit. 30. ledna 2011]. Dostupné na . Verhoeff -Verhallen, E. 2002. Border Kolie, Rebo Productions, Čestlice, 127 s. Wong, A.H.C., Buckle, C.E., Van Tol, H.H.M. 2000. Polymorphisms in dopamine receptors: what do they tell us? European Journal of Pharmacology, 410 (2-3), 183-200. Xiaoyan, W., Villar, V. A. M., Armando, I., Eisner, G.M., Felder, R.A., Jose , P.A. 2008. Dopamine, kidney, and hypertension: studies in dopamine receptor knockout mice. Pediatric Nephrology, 23, 2131–2146.
88
9 SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ ADHD
hyperkinetický syndrom s poruchou pozornosti
BCCCZ
Border Collie Club Czech Republic
BOB
best of breed, nejlepší z plemene, titul zadávaný na výstavách
bp
počet párů bází v molekule nukleové kyseliny
CEA
Collie eye anomaly, anomálie oka kólií, dědičná nemoc, hypoplazie choroidey oka
CL
Neuronal Ceroid Lipofuscinosis
COMT
gen pro katechol-o-metyltransferázu degradující katecholaminy dopamin a noradrenalin
ČMKU
Českomoravská kynologická unie
DAT1
gen pro proteinový dopaminový transportér, navrací dopamin zpět ze synapse do presynaptické části
dATP
deoxyadenosin-5’-trifosfát
DBH
gen pro β-hydroxylázu katalyzující konverzi dopaminu na adrenalin
dCTP
deoxycitidin-5’-trifosfát
ddH20
dvakrát deionizovaná voda
dGTP
deoxyguanosin-5’-trifosfát
DNA
deoxyribonukleová kyselina
DRD4
gen pro dopaminový receptor D4
dTTP
deoxytymidin-5’-trifosfát
FCI
Mezinárodní kynologická federace (Fédération Cynologique Internationale)
F-primer
přímý primer, forwardový
HE
očekávaná heterozygotnost
HO
pozorovaná heterozygotnost
ISDS
International Sheep Dog Society
L-DOPA
3,4-dihydroxyfenylalanin
MAOA
gen pro monoaminooxidázu deaminující katecholaminy na aldehydy
PCR
polymerázová řetězová reakce
Pfu
termostabilní polymeráza pocházející z Pyrococcus furiosus
PRA
progresivní retinální atrofie, dědičná nemoc, odumírání fotoreceptivních buněk sítnice 89
R-primer
zpětný primer, reversový
Taq
termostabilní polymeráza pocházející z Thermus aquaticus
TBE
tris-borátový pufr (Sambrook et al., 1989)
UV
ultrafialový
VK
variační koeficient
VNTR
variabilní počet tandemových repetic
90
PŘÍLOHY Příloha 1 - Plemenný standard plemene border kolie FCI Standard N° 297 / 28.10.2009 / GB BORDER COLLIE ZEMĚ PŮVODU : Velká Británie. DATUM PUBLIKACE PLATNÉHO ORIGINÁLNÍHO STANDARDU : 24.06.1987. POUŢITÍ : Ovčácký pes. KLASIFIKACE FCI :
Skupina 1 – Psi ovčáci a honáčtí (kromě psů švýcarských salašnických) Sekce 1 – Ovčáci S pracovní zkouškou
CELKOVÝ VZHLED: Pes dobrých proporcí a ladných rysů ukazujících kvalitu, půvab a dokonalou vyváţenost, které ve spojení s dostatečnou tělesnou stavbou demonstrují jeho výkonnost. Sklon k robustnosti i k přílišné lehkosti je neţádoucí. DŮLEŢITÉ PROPORCE : Délka čenichu a mozkovny je přibliţně stejná. Délka těla je mírně větší, neţ je výška v kohoutku. POVAHA : Vytrvalý ovčácký pes k tvrdé práci u stáda, výborně ovladatelný, ţivý, pozorný, poslušný a inteligentní. Nesmí být ani nervózní ani agresivní. HLAVA MOZKOVNA : Lebka : Dosti široká, týlní hrbol nevýrazný. Stop : Velmi výrazný. LÍCNÍ ČÁST : Nos : Nos černý, u hnědých a čokoládově zbarvených jedinců smí být hnědý. U modrých psů by měl být břidlicové barvy. Dobře vyvinuté nosní dírky. Čenich : Čenich se směrem k nosu zuţuje, je středně krátký a silný. Čelisti/zuby : Silné zuby a čelisti s dokonalým pravidelným a úplným nůţkovým skusem. To znamená, ţe řezáky horní čelisti těsně přesahují řezáky spodní čelisti, přičemţ jsou vsazeny kolmo do čelisti. Líce : Líce nejsou ani plné, ani zaoblené. Oči : Posazené daleko od sebe, oválného tvaru, středně velké. Barva hnědá, jen u merle zbarvených psů mohou být jedno nebo obě oči zcela, nebo částečně modré. Jemný, bystrý, pozorný a inteligentní výraz. Uši : Středně velké a středně silné, nasazené dostatečně daleko od sebe. Jsou neseny vztyčeně nebo polovztyčeně. Při naslouchání jsou výrazně pohyblivé. KRK : Dobré délky, silný a svalnatý, mírně klenutý a rozšiřující se směrem k lopatkám. TRUP : Atletický vzhled. Mírně delší, neţ je výška v kohoutku. Bedra : Široká a svalnatá, ne však vystouplá. Hrudník : Hluboký a poměrně široký s dobře klenutými ţebry.
OCAS : Středně dlouhý, svým posledním obratlem dosahující minimálně k hleznu. Je nízko nasazený, dobře osrstěný, směrem ke špičce se stáčí vzhůru a doplňuje tak ladnou linii a vyváţenost psa. Při vzrušení můţe být vztyčen, nikdy však není nesen nad hřbetem. KONČETINY PŘEDNÍ ČÁST TĚLA : Hrudní končetiny jsou při pohledu zpředu rovnoběţné. Kosti jsou pevné, ne však mohutné. Lopatky : Uloţeny vzad. Lokty : Přiléhají k tělu. Zápěstí: Při pohledu z boku mírně šikmé. Přední tlapky : Oválného tvaru s vysokými polštářky, pevné a dobře stavěné. Prsty klenuté a těsně navzájem přiléhající. Drápky krátké a silné. ZADNÍ ČÁST TĚLA : Široká a svalnatá v profilu ladně přecházející k nasazení ocasu. Stehna : dlouhá, silná a svalnatá. Kolena : Dobře zaúhlená. Hlezení kloub: Pevný, hluboce uloţený. Zápěstí : Od hlezna k zemi jsou zadní nohy stavěny z pevných při pohledu zezadu rovnoběţných kostí. Zadní tlapky : Oválného tvaru s vysokými polštářky, pevné a dobře stavěné. Prsty klenuté a těsně navzájem přiléhající. Drápky krátké a silné. CHŮZE/POHYB: Volný, plynulý a neúnavný. Nízko zvedané tlapky vzbuzují dojem, ţe je pes schopen pohybovat se nenápadně a velmi rychle. SRST OSRSTĚNÍ : Dvě varianty : Středně dlouhé a Krátké. U obou variant je krycí srst hustá a střední textury s měkkou a hustou podsadou, která vytváří výbornou ochranu proti povětrnostním vlivům. U středně dlouhé varianty vytváří bohatá srst hřívu, kalhoty a prapor. V obličejové části, na uších, na hrudních končetinách (s výjimkou praporců) a na pánevních končetinách od hlezen k zemi má být srst krátká a hladká. BARVA : Dovoleno je mnoţství barev, přičemţ nikdy nesmí převládat bílá. VÝŠKA A VÁHA : Ideální výška v kohoutku : Psi : 53 cm (21 palců), Feny : o něco méně. VADY : Kaţdá odchylka od výše uvedených poţadavků musí být povaţována za vadu a posouzení její závaţnosti musí být přímo úměrné stupni odchylky, jejímu vlivu na zdraví a pohodu psa a na jeho schopnost vykonávat jeho tradiční práci. VYŘAZUJÍCÍ VADY : Agresivní nebo příliš bázlivý. Z chovu má být vyřazen kaţdý pes, který zřetelně vykazuje abnormality fyzické nebo v chování. POZNÁMKA : Psi mají mít dvě zřetelně normální varlata, plně sestouplá v šourku.
Příloha 2 - Odběr vzorku DNA ze sliznice dutiny ústní Odběr vzorku DNA ze sliznice dutiny ústní se provádí stěrem sliznice vnitřní strany tváře psa. Provádí se v dostatečném časovém odstupu od posledním příjmu krmiva aby nedošlo ke kontaminaci vzorku. Rukou odtáhneme koutek pysků psa, vloţíme sterilní kartáček tak, aby se dotýkal pouze bukální sliznice, pysk psa přidrţujeme zvenku rukou tak aby tvořil záhyb pro kartáček a pohybujeme kartáčkem cca 10 vteřin tam a zpět a zároveň s ním otáčíme.
Kartáček následně vyndáme tak aby nedošlo ke kontaminaci vzorku a konec kartáčku s nanesenými bukálními buňkami odštípneme do připravené zkumavky.
Příloha 3 - ADHD dotazník validovaný pro majitele psů
Dotazník pro majitele psů, kterým byl odebrán vzorek DNA Otázky v dotazníku jsou zaměřeny na schopnost psa se soustředit a jeho aktivitu a impulzivitu.
Jméno psa (dle PP): ................. Pohlaví: □ pes □ fena Prosím vyznačte jak často projevuje Váš pes následující chování: 1.
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
11. 12 13
Datum narození psa: .................
Můj pes má potíţe s učením, protoţe je nepozorný nebo je jeho pozornost snadno odvedena jinými podněty: Je snadné upoutat pozornost mého psa, ale brzy ztratí zájem: Soustředit se na cvik nebo hru je pro mého psa obtíţné: Můj pes opouští místo, kde měl zůstat: Můj pes neumí být v klidu, je těţké ho uklidnit: Můj pes je neposedný: Zdá se, ţe pes často neposlouchá, i kdyţ ví, ţe na něj někdo mluví: Můj pes je divoký, hůře ovladatelný, kdyţ vyrazí vpřed, je těţké ho udrţet: Můj pes by si pořád hrál a běhal: Lehké úkoly vyřeší můj pes snadno, ale často má problémy se sloţitými cviky, i kdyţ je zná a často s ním byly procvičovány: Ve vykonávání cviků selhává, protoţe má tendenci reagovat zbrkle: Pozornost mého psa můţe být snadno rozptýlena Neumí čekat, protoţe nemá kontrolu nad sebou samým:
Nikdy
Občas
Často
Velmi často
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0 0
1 1
2 2
3 3
0 0
1 1
2 2
3 3
0
1
2
3
0 0
1 1
2 2
3 3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
Příloha 4 - Schéma syntézy katecholaminů
Zdroj: http://www.wikipedia.org
Příloha 5 - Výsledky jednotlivých testování uvedených v kapitole 4.6.2 – 1. část 1
Skupina A:
všichni s genotypem 447a/447a
Skupina B:
všichni ostatní
2
Skupina A: všichni s alespoň jednou alelou 447a Skupina B: všichni ostatní
aktivita-impulzivita
aktivita-impulzivita
t
-0,647177 průměr A
7,795918 průměr B
8,300000
t
0,130949 průměr A
p
0,519221 sm.odch A
3,322772 sm.odch B 4,026833
p
0,896118 sm.odch A 3,713672 sm.odch B 2,714160
nepozornost
8,036145 průměr B
7,833333
nepozornost
t
-1,86782 průměr A
3,816327 průměr B
5,100000
t
-1,38251 průměr A
p
0,065153 sm.odch A
2,666720 sm.odch B 3,801484
p
0,170353 sm.odch A 3,324280 sm.odch B 1,722401
3
Skupina A:
všichni s genotypem 447a/447a
4
Skupina B: všichni s genotypem 447a/498
6,166667
Skupina A: všichni s genotypem 447a/447a Skupina B: všichni s genotypem 435/447a
aktivita-impulzivita 7,795918 průměr B
4,265060 průměr B
aktivita-impulzivita
t
-0,263988 průměr A
8,040000
t
-1,270000 průměr A
p
0,792544 sm. odch. A 3,322772 sm.odch B 4,513683
p
0,209300 sm.odch A 3,322772 sm.odch B 3,427827
t
-1,54710 průměr A
3,816327 průměr B
5,080000
t
-0,62830 průměr A
p
0,126223 sm.odch A
2,666720 sm.odch B 4,348563
p
0,532400 sm.odch A 2,666720 sm.odch B 3,244654
nepozornost
5
9,333333
nepozornost
Skupina A: všichni s alespoň jednou alelou 435 Skupina B:
7,795918 průměr B
6
všichni ostatní
3,816327 průměr B
4,444444
Skupina A: všichni s alespoň jednou alelou 498 Skupina B: všichni ostatní
aktivita-impulzivita
aktivita-impulzivita
t
1,047500 průměr A
9,000000 průměr B
7,855263
t
-0,041259 průměr A
p
0,297800 sm.odch A
3,291403 sm.odch B 3,693973
p
0,967184 sm.odch A 4,258865 sm.odch B 3,326830
nepozornost t
0,62990
p
0,530400 sm.odch A
7
průměr A
4,923077 průměr B
8,000000 průměr B
8,033898
nepozornost 4,302632
t
1,67640
2,956956 sm.odch B 3,330745
p
0,097250 sm.odch A 4,012051 sm.odch B 2,769859
Skupina A: všichni s genotypem 435/447a
8
Skupina B: všichni s genotypem 447a/498
0,779500 průměr A
9,333333 průměr B
p
0,441400 sm.odch A
5,200000 průměr B
3,983051
Skupina A: všichni s alespoň jednou alelou 498 Skupina B: všichni s genotypem 447a/447a
aktivita-impulzivita t
průměr A
aktivita-impulzivita 8,040000
t
0,237723 průměr A
3,427827 sm.odch B 4,513683
p
0,812728 sm.odch A 4,258865 sm.odch B 3,322772
nepozornost
8,000000 průměr B
7,795918
nepozornost
t
-0,39870 průměr A
4,444444 průměr B
5,080000
t
1,84238
průměr A
5,200000 průměr B
p
0,692800 sm.odch A
3,244654 sm.odch B 4,348563
p
0,069269 sm.odch A 4,012051 sm.odch B 2,666720
3,816327
Příloha 5 - Výsledky jednotlivých testování uvedených v kapitole 4.6.2 – 2. část 10
Skupina A:
všichni psi s genotypem 447a/447a
Skupina B:
všichni ostatní psi
11
aktivita-impulzivita t
0,570155 průměr A
p
0,572215 sm.odch A
Skupina A: všechny feny s genotypem 447a/447a Skupina B: všechny ostatní feny aktivita-impulzivita
7,833333
průměr B
7,230769
t
-0,943841 průměr A
2,987898
sm.odch B
3,218536
p
0,349789 sm.odch A
nepozornost
7,760000
průměr B
8,814815
3,677409
sm.odch B
4,323790
nepozornost
t
-0,99230 průměr A
4,500000
průměr B
5,538462
t
-1,86790 průměr A
3,160000
průměr B
4,888889
p
0,327861 sm.odch A
2,889260
sm.odch B
3,306947
p
0,067642 sm.odch A
2,303620
sm.odch B
4,060441
12
Skupina A: všichni psi s alespoň jednou alelou 447a
13
Skupina B: všichni ostatní psi aktivita-impulzivita
Skupina A: všechny feny s alespoň jednou alelou 447a Skupina B: všechny ostatní feny aktivita-impulzivita
t
0,293527 průměr A
7,657143
průměr B
7,000000
t
0,029564 průměr A
8,312500
průměr B
8,250000
p
0,770853 sm.odch A
3,114887
sm.odch B
1,414214
p
0,976532 sm.odch A
4,105815
sm.odch B
3,304038
t
-1,27189 průměr A
7,500000
t
-0,87715 průměr A
3,937500
průměr B
5,500000
p
0,211799 sm.odch A
0,707107
p
0,384600 sm.odch A
3,503228
sm.odch B
1,732051
nepozornost
14
nepozornost
4,714286
průměr B
3,054133
sm.odch B
Skupina A: všichni psi s genotypem 447a/447a
15
Skupina B: všichni psi s genotypem 447a/498 aktivita-impulzivita
Skupina A: všechny feny s genotypem 447a/447a Skupina B: všechny feny s genotypem 447a/498 aktivita-impulzivita
t
0,793900 průměr A
7,830000
průměr B
6,900000
t
-0,750100 průměr A
7,760000
průměr B
8,800000
p
0,433100 sm.odch A
2,987900
sm.odch B
3,446400
p
0,457900 sm.odch A
3,677400
sm.odch B
5,073700
nepozornost
nepozornost
t
-0,26140 průměr A
4,500000
průměr B
4,800000
t
-0,18258 průměr A
3,160000
průměr B
5,266800
p
0,795500 sm.odch A
2,889300
sm.odch B
3,425400
p
0,075800 sm.odch A
2,303600
sm.odch B
4,978000
16
Skupina A: všechny feny s genotypem 447a/447a
17
Skupina B: všechny feny s genotypem 435/447a aktivita-impulzivita
t
0,917900 průměr A
p
0,365700 sm.odch A
9,125000
průměr B
3,603100
sm.odch B
Skupina A: všechny feny s genotypem 435/447a Skupina B: všechny ostatní feny aktivita-impulzivita
7,760000
t
0,621000 průměr A
9,125000
průměr B
8,159100
3,677400
p
0,537400 sm.odch A
3,603100
sm.odch B
4,114000
nepozornost t
0,71430
průměr A
p
0,480400 sm.odch A
nepozornost
3,875000
průměr B
3,160000
t
-0,16290 průměr A
3,875000
průměr B
4,091000
2,949000
sm.odch B
2,303600
p
0,871200 sm.odch A
2,949000
sm.odch B
3,522800
Příloha 5 - Výsledky jednotlivých testování uvedených v kapitole 4.6.2 – 3. část 18
Skupina A: všechny feny s genotypem 447a/447a
19
Skupina B: všechny feny s genotypem 435/498 aktivita-impulzivita
t
0,253150 průměr A
p
0,802200 sm.odch A
Skupina A: všechny feny s genotypem 435/498 Skupina B: všechny ostatní feny aktivita-impulzivita
8,330000
průměr B
7,760000
t
0,011263 průměr A
4,041500
sm.odch B
3,677400
p
0,991059 sm.odch A
nepozornost
8,333333
průměr B
8,306122
4,041452
sm.odch B
4,063066
nepozornost
t
0,66280 průměr A
5,333333
průměr B
3,979592
t
0,66280 průměr A
5,333333
průměr B
3,979592
p
0,510503 sm.odch A
2,081666
sm.odch B
3,479043
p
0,510503 sm.odch A
2,081666
sm.odch B
3,479043
20
Skupina A: všechny feny s genotypem 435/498
21
Skupina B: všechny feny s genotypem 447a/498 aktivita-impulzivita
Skupina A: všechny feny s alespoň jednou alelou 498 Skupina B: všechny feny s genotypem 447a/447a aktivita-impulzivita
t
-0,148869 průměr A
8,333333
průměr B
8,800000
t
0,734096 průměr A
8,684211
průměr B
7,760000
p
0,883517 sm.odch A
4,041452
sm.odch B
5,073742
p
0,466969 sm.odch A
4,679181
sm.odch B
3,677409
t
0,02236 průměr A
5,266667
t
2,08770 průměr A
5,315789
průměr B
3,160000
p
0,982438 sm.odch A
4,978047
p
0,042929 sm.odch A
4,447879
sm.odch B
2,303620
nepozornost
22
nepozornost
5,333333
průměr B
2,081666
sm.odch B
Skupina A: všichni psi s alespoň jednou alelou 498
23
Skupina B: všichni psi s genotypem 447a/447a aktivita-impulzivita
Skupina A: všichni homozygoti, nezáleţí na typu alely Skupina B: všichni heterozygoti, nezáleţí na typu alely aktivita-impulzivita
t
-0,905325 průměr A
6,818182
průměr B
7,833333
t
-0,775663 průměr A
7,769231
průměr B
8,378378
p
0,371856 sm.odch A
3,280798
sm.odch B
2,987898
p
0,440051 sm.odch A
3,233497
sm.odch B
4,172338
nepozornost
nepozornost
t
0,45393 průměr A
5,000000
průměr B
4,500000
t
-1,35112 průměr A
4,000000
průměr B
4,945946
p
0,652849 sm.odch A
3,316625
sm.odch B
2,889260
p
0,180161 sm.odch A
2,700762
sm.odch B
3,908296
24
Skupina A: feny homozygoti, nezáleţí na typu alely
25
Skupina B: feny heterozygoti, nezáleţí na typu alely aktivita-impulzivita
t
-0,964715 průměr A
p
0,339331 sm.odch A
7,769231
průměr B
3,603417
sm.odch B
Skupina A: psi homozygoti, nezáleţí na typu alely Skupina B: psi heterozygoti, nezáleţí na typu alely aktivita-impulzivita
8,846154
t
0,449012 průměr A
7,769231
průměr B
7,272727
4,406289
p
0,656191 sm.odch A
2,888705
sm.odch B
3,495452
nepozornost
nepozornost
t
-1,69514 průměr A
3,269231
průměr B
4,846154
t
-0,40793 průměr A
4,730769
průměr B
5,181818
p
0,096269 sm.odch A
2,324783
sm.odch B
4,134657
p
0,685808 sm.odch A
2,892164
sm.odch B
3,487641
Příloha 5 - Výsledky jednotlivých testování uvedených v kapitole 4.6.2 – 4. část 26
Skupina A: všechny feny s genotypem 447a/447a
9
Skupina B: všichni psi s genotypem 447a/447a aktivita-impulzivita
t
-0,076425 průměr A
p
0,939406 sm.odch A
Skupina A: všichni psi Skupina B: všechny feny aktivita-impulzivita
7,760000
průměr B
7,833333
t
0,874426 průměr A
3,677409
sm.odch B
2,987898
p 0,384294 sm.odch A
nepozornost
8,307692
průměr B
7,621622
4,022186
sm.odch B
3,040023
4,057692
průměr B
4,864865
3,415153
sm.odch B
3,038294
nepozornost
t
-1,79883 průměr A
3,160000
průměr B
4,500000
t
-1,14963 průměr A
p
0,078468 sm.odch A
2,303620
sm.odch B
2,889260
p 0,253447 sm.odch A
Příloha 6 – fotografie laboratoře sekvenčních analýz Katedry genetiky a šlechtění FAPPZ ČZU a přístroje ABI PRISM 100® (Applied Biosystems)
Příloha 7 - Autoři fotografií Následující fotografie byly pouţity se svolením autorů. Obrázek 1 - autor Ivan Linhart Obrázek 2 - autor Milena Topinková Obrázky 5, 6, 7, 8, 9 - autor Tomáš Seeman
