ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE FAKULTA AGROBIOLOGIE, POTRAVINOVÝCH A PŘÍRODNÍCH ZDROJŮ
Katedra pedologie a ochrany půd
Vliv stanovištních faktorů na vlastnosti organické hmoty lesních půd Disertační práce
Autor: Ing. Petra Vokurková Školitel: Prof. Dr. Ing. Luboš Borůvka
2010
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma: Vliv stanovištních faktorů na vlastnosti organické hmoty lesních půd vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v seznamu použité literatury.
V Praze dne .................................
...................................................... podpis doktoranda
i
Poděkování: Především bych chtěla poděkovat svému školiteli Prof. Dr. Ing. Lubošovi Borůvkovi za vedení práce a velkou trpělivost. Děkuji rovněž všem kolegům za rady, inspiraci a vytvoření příjemného pracovního prostředí. Můj dík patří i mé rodině a Tomíkovi za nekonečnou podporu, pomoc a optimismus.
ii
Obsah Obsah ......................................................................................................................................... iii Seznam obrázků ......................................................................................................................... v Seznam tabulek ........................................................................................................................ vii 1.
Úvod ................................................................................................................................... 1
2.
Literární rešerše .................................................................................................................. 2 2.1.
Organická hmota v půdě .............................................................................................. 2
2.2.
Nadložní humus ........................................................................................................... 3
2.2.1. 2.3.
Humusové látky ........................................................................................................... 5
2.3.1. 2.3.2. 2.3.3.
4.
Huminové kyseliny .............................................................................................. 7 Fulvokyseliny ....................................................................................................... 9 Huminy ............................................................................................................... 10
2.4.
Extrakce huminových látek ....................................................................................... 10
2.5.
Hodnocení kvality půdní organické hmoty pomocí spektroskopických metod ........ 12
2.5.1. 2.5.2. 2.5.3. 3.
Formy nadložního humusu ................................................................................... 4
Běžně používané metody pro určování kvality půdní organické hmoty ............ 12 Infračervená spektroskopie ................................................................................ 13 Nukleární magnetická rezonance (NMR) .......................................................... 14
Hypotézy a cíle práce ....................................................................................................... 16 3.1.
Hypotézy.................................................................................................................... 16
3.2.
Cíle práce ................................................................................................................... 16
Materiál a metody............................................................................................................. 17 4.1.
Popis lokalit – Jizerské hory – Paličník a Smědavská hora ....................................... 17
4.1.1. 4.1.2. 4.2.
Geologie, geomorfologie a klima ....................................................................... 17 Odběr vzorků ...................................................................................................... 18
Popis lokalit - Novohradské hory - Vysoká............................................................... 24
4.2.1. 4.2.2.
Geologie, geomorfologie a klima ....................................................................... 24 Odběr vzorků ...................................................................................................... 24
4.3.
Příprava vzorků.......................................................................................................... 27
4.4.
Základní půdní charakteristiky .................................................................................. 27 iii
4.5.
Frakcionace humusových látek ................................................................................. 28
4.5.1. 4.5.2. 4.6.
Spektroskopické metody............................................................................................ 31
4.6.1. 4.6.2. 5.
Metoda dle Piccola et al. (2000)......................................................................... 28 Metoda dle Podlešákové et al. (1992) ................................................................ 30
DRIFT spektroskopie ......................................................................................... 32 NMR spektroskopie v pevné fázi ....................................................................... 33
Výsledky a diskuze........................................................................................................... 34 5.1.
Základní půdní charakteristiky .................................................................................. 34
5.2.
Porovnání jednotlivých metod separace huminových látek ...................................... 38
5.3.
Prvkové složení vyseparovaných huminových látek ................................................. 40
5.4.
Posouzení DRIFT spekter.......................................................................................... 45
5.5.
Posouzení NMR spekter ............................................................................................ 55
6.
Závěr................................................................................................................................. 63
7.
Literatura .......................................................................................................................... 67
iv
Seznam obrázků Obr. 1: Hypotetická struktura huminové kyseliny s volnými a vázanými fenolickými OH skupinami, chinony, N a kyslíkovými můstky a COOH skupinami různě vázanými na aromatické cykly (Stevenson 1994). .................................................................................................................................... 8 Obr. 2: Modelová struktura fulvokyseliny podle Schnitzera a Khana (1972). ...................................... 10 Obr. 3: Příklad DRIFT spektra fulvokyselin (vzorek 22 Paličník)........................................................ 14 Obr. 4: Příklad NMR spektra fulvokyselin (vzorek 22 Paličník) ......................................................... 15 Obr. 5: Umístění sond na vrstevnicové mapě. Vpravo nahoře jsou odběrové lokality na Paličníku, rozlišené podle druhu porostu. V levé části mapky jsou odběrové lokality na Smědavské hoře. ......... 18 Obr. 6: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Paličník 4 .................................................................... 19 Obr. 7: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Paličník 5 .................................................................... 19 Obr. 8: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Paličník 6 .................................................................... 20 Obr. 9: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Paličník 7 .................................................................... 20 Obr. 10: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 1 ................................................................ 21 Obr. 11: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 2 ................................................................ 22 Obr. 12: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 3 ................................................................ 22 Obr. 13: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 7 ................................................................ 23 Obr. 14: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 8 ................................................................ 23 Obr. 15: Umístění sond na vrstevnicové mapě transektu Vysoká ......................................................... 25 Obr. 16: Půdní profil a odběrové místo na lokalitě Vysoká 1 ............................................................... 26 Obr. 17: Půdní profil a odběrové místo na lokalitě Vysoká 3 ............................................................... 26 Obr. 18: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Vysoká 5 ................................................................... 27 Obr. 19: Schéma frakcionace humusových látek .................................................................................. 30 Obr. 20: Zobrazení FK pomocí optické mikroskopie (40krát zvětšeno), vpravo pozorováno bez mikroskopu ............................................................................................................................................ 32 Obr. 21: Zobrazení HK pomocí optické mikroskopie (40krát zvětšeno), vpravo pozorováno bez mikroskopu ............................................................................................................................................ 32 Obr. 22: Grafické porovnání metod podle Piccola et al. (2000) a podle Podlešákové et al. (1992) – hodnoty poměru HK:FK........................................................................................................................ 38 Obr. 23: Obsahy N (vlevo), C (vpravo) huminových kyselin na jednotlivých transektech (Paličník (PAL), Smědava (SME) a Vysoká (VYS)) („x“odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval)............................................................................................................... 42 Obr. 24: Obsahy N (vlevo), C (vpravo) fulvokyselin na jednotlivých transektech (Paličník (PAL), Smědava (SME) a Vysoká (VYS)) („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval)............................................................................................................... 42
v
Obr. 25: Vliv nadmořské výšky na obsah C (vlevo) a N (vpravo) u huminových kyselin ze všech tří transektů („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).... 43 Obr. 26: Vliv nadmořské výšky na poměr C/N („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval)................................................................................................... 44 Obr. 27: Vliv porostu buku (BK) a smrku (SM) na množství dusíku v HK („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval). .......................................... 45 Obr. 28: Průměrná spektra huminu (fialová), huminových kyselin (červená), fulvokyselin (modrá) z transektu Paličník (KM – intenzita v jednotkách Kubelka-Munk). .................................................... 46 Obr. 29: Průměrná spektra HK jednotlivých horizontů na Paličníku (KM – intenzita v jednotkách Kubelka-Munk). .................................................................................................................................... 48 Obr. 30: Průměrná spektra HK horizontu H a F na Vysoké (KM – intenzita v jednotkách KubelkaMunk). ................................................................................................................................................... 49 Obr. 31: Průměrná spektra HK jednotlivých horizontů na Smědavské hoře (KM – intenzita v jednotkách Kubelka-Munk). .................................................................................................................. 50 Obr. 32: Index aromaticity Iar pro jednotlivé transekty Paličník (PAL), Smědavská hora (SME) a Vysoká (VYS) („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval). ................................................................................................................................................ 51 Obr. 33: Poměry C=O pro jednotlivé transekty Paličník (PAL), Smědavská hora (SME) a Vysoká (VYS) („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval). ...... 52 Obr. 34:Vliv horizontu na index aromaticity Iar na transektu Paličník („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval). .................................................................. 53 Obr. 35: Vliv horizontu na index aromaticity Iar na transektu Smědavské hora („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval). .......................................... 53 Obr. 36: CPMAS 13C NMR spektra huminových kyselin ..................................................................... 57 Obr. 37: Vliv nadmořské výšky na stupeň aromaticity α (%), HK - huminová kyselina, F a H nadložní horizonty................................................................................................................................................ 60 Obr. 38: Vztah mezi nadmořskou výškou a stupněm aromaticity α (%)............................................... 61 Obr. 39: Vliv nadmořské výšky na index aromaticity Iar, HK - huminová kyselina, F a H nadložní horizonty................................................................................................................................................ 61 Obr. 40: Vztah mezi nadmořskou výškou a indexem aromaticity Iar ................................................... 62
vi
Seznam tabulek Tab. 1: Definice půdní organické hmoty a jejích různých složek podle Stevensona (1994)................... 6 Tab. 2: Seznam odběrových lokalit na transektu Paličník (JZ – jihozápadní, SM – smrk, BK – buk) vybraných pro studium půdní organické hmoty .................................................................................... 18 Tab. 3: Seznam odběrových lokalit na transektu Smědavská hora (S – severní, SM – smrk, BK – buk) vybraných pro studium půdní organické hmoty .................................................................................... 21 Tab. 4: Seznam odběrových lokalit na transektu Vysoká (SV – severovýchodní, SM – smrk, BK – buk) vybraných pro studium půdní organické hmoty............................................................................ 25 Tab. 5: Základní půdní charakteristiky na transektu Paličník ............................................................... 35 Tab. 6: Základní půdní charakteristiky na transektu Smědavská hora .................................................. 36 Tab. 7: Základní půdní charakterisky na transektu Vysoká .................................................................. 37 Tab. 8: Základní statistické parametry souboru dat poměru HK:FK pro metodu podle Piccola et al. (2000 )(A) a podle Podlešákové et al. (1992) (B). ............................................................................... 38 Tab. 9: Poměr C/N, množství C a N (v %) u vyseparovaných HK, FK a HU na transektu Paličník .... 41 Tab. 10: Poměr C/N, množství C a N (v %) u vyseparovaných HK, FK a HU na transektu Smědava 41 Tab. 11: Poměr C/N, množství C a N (v %) u vyseparovaných HK, FK a HU na transektu Vysoká ... 41 Tab. 12: Přibližné vlnočty absorpčních pásů půdních složek (Stevenson, 1994, He et al., 2008, Francioso et al., 2007) ........................................................................................................................... 47 Tab. 13: Základní statistické parametry sledovaných charakteristik DRIFT spekter HK pro výpočet indexu aromaticity ................................................................................................................................. 50 Tab. 14: Analýza rozptylu pro závislost Iar a poměru C=O na porostu a horizontu (P-hladina významnosti, Paličník (PAL), Smědavská hora (SME) a Vysoká (VYS)). .......................................... 54 Tab. 15: Korelační tabulka půdních vlastností a vybraných charakteristik DRIFT spekter (*, **, *** průkazná korelace na hladině významnosti α=0,05;0,01;0,001). .......................................................... 55 Tab. 16: CP MAS 13C NMR chemický posun a odpovídající typ uhlíku dle různých autorů ............... 56 Tab. 17: Relativní intenzity (v % celkové plochy) pro 13C NMR signály HK ...................................... 58 Tab. 18: Relativní intenzity v % ligninového, alifatického, aromatického C, stupně aromaticity a procentického zastoupení ligninového C z celkového množství aromatického C (P) pro
13
C NMR
signály HK............................................................................................................................................. 59
vii
1. Úvod Nadložní humus je jednou ze složek lesního ekosystému, která zásadním způsobem ovlivňuje produktivitu lesního stanoviště, a představuje část půdního profilu, která je nejsnáze ovlivnitelná a náchylná k porušení jeho stavu a dynamiky (Green et al., 1993). Druhové složení a stav lesního porostu mají zásadní vliv na kvalitu humusu (Podrázský, 2001). Proto by se mělo vybírat takové druhové složení sadby při obnově lesů, které by odpovídalo ekologii daného stanoviště. Nejvíce se projevuje kvalita nadložního humusu a organických látek na stavu a dynamice lesních ekosystémů. Humusové formy poskytují životní prostředí pro půdní organismy, které ovlivňují biogeochemické cykly v půdě. Kvalita humusu je ovlivněna stanovištními faktory. Mládková et al. (2004) uvádějí průkazný vliv faktoru nadmořské výšky. V tomto faktoru může být zahrnuta celá řada stanovištních charakteristik, jako je klima, geologické podloží, dřevinná skladba lesů, včetně odlesnění vrcholových partií hor. Lesnická opatření, jako je vápnění a antropogenní vlivy ovlivňují stav humusové vrstvy (resp. humusové formy). Například Hruška (2005) popisuje, že po aplikaci vápenatých látek může dojít ke změnám procesů mineralizace, humifikace a nitrifikace, které se projevují ve zvýšené dynamice dusíku a uhlíku a tím se může také snižovat zásoba humusu v lesní půdě. Navíc vzniká riziko, že v důsledku zrychlené mineralizace může dojít k acidifikaci spodních horizontů v důsledku vymývání bazických kationtů spolu s nitrátovými ionty. Proto je nutné porozumět tomu, jak člověkem pozměněný stav humusových forem ovlivní lesní vegetaci, půdu a následně i produktivitu a stabilitu lesních porostů. Pro tyto zásahy je důležitá znalost kvality humusu, aby se zbytečně nevynakládaly finanční prostředky na neekonomické nebo nedostatečně podložené lesnické zákroky.
1
2. Literární rešerše 2.1. Organická hmota v půdě Ačkoliv obsah organické hmoty v lesní půdě je obvykle v rozmezí 1 - 12 % hmotnosti, (Fisher a Binkley, 2000) zásadním způsobem určuje půdní produktivitu a vlastnosti. Je důležitým zdrojem živin, jako jsou dusík, fosfor a síra, i mikroživin, jako jsou bór a molybden. Obsahuje také velké množství uhlíku, který slouží jako zdroj energie pro půdní makro a mikroflóru, probíhají v ní chemické reakce, a má vliv na fyzikální vlastnosti půdy. Pevně váže kovy, slouží k udržení mikroživin kovových iontů v půdě (Prado, Airoldi, 2003). Vzhledem ke své podstatě slouží organická hmota v půdě jako pufr. Schopnost půdy zadržovat vodu významně roste s obsahem organické hmoty (Lee et al. 2003). Humusové látky také stabilizují agregáty půdních částic a zvyšují sorpci organických sloučenin do půdy. Dobrá struktura půdy je vysoce závislá na obsahu a charakteru humusu, který působí flokulaci jílových minerálů, nezbytnou pro agregaci půdních částic (Piccolo, 1996). Mikroagregáty tvořené komplexem humusových látek a jílových částic vykazují vysokou stabilitu (Brady a Weil, 1999), kdežto makroagregáty, které jsou tvořeny spíše labilní organickou hmotou (kořínky, hyfy hub, apod.) vykazují nižší stabilitu (Aoyama et al., 1999). Organická hmota zvyšuje stabilitu agregátů také díky snížení jejich smáčivosti. Smáčení půdních částic záleží na van der Waalsových a ostatních molekulárních silách (Capriel et al., 1997, Capriel, 1995). Minerální půdní částice bez povlaků organických látek mají vysokou smáčivost, ale v půdě se vyskytují zřídka. Hydrofóbní organické látky vytvářejí povlaky na půdních částicích a tím snižují přímý kontakt mezi vodou a půdními částicemi. Mezi organické látky, které se podílejí na hydrofóbních vlastnostech půd, patří malé rostlinné a mikrobiální zbytky, bakterie, volná amorfní organická hmota a organická hmota organominerálních komplexů (Chenu et al., 2000). Huminové látky v půdě silně absorbují mnoho rozpouštěných látek v půdním roztoku a mají specifickou afinitu k těžkým polyvalentním kationtům (De Paolis a Kukkonen, 1997). Některé organické sloučeniny spolupůsobí při půdotvorných procesech. Ovlivňují růst rostlin a to přímo tím, že mají vliv na příjem a rozdělení potenciálně rizikových prvků ve formě komplexů, ovlivňují sorpci iontů a procesy látkové přeměny a některé organické sloučeniny rostliny přímo přijímají. Mezi organickou hmotou a minerálním půdním podílem existuje značná interakce. To platí především pro organominerální komplexy, vznikající mezi jíly a sloučeninami huminových kyselin nebo fulvokyselin. V mnoha půdách je 50-100 % půdního organického uhlíku v komplexu s jílem. Tyto komplexy hrají roli při určování fyzikálních vlastností půdy, úrodnosti
2
půdy a stabilizaci půdní organické hmoty (Manahan, 2000). Interakcí s jíly jsou také ovlivněny syntéza, chemické reakce a biodegradace huminových látek. Vlastní humus má velký specifický povrch (800-900 m2/g) a vysokou kationtovou výměnnou kapacitu (KVK), až 150-300 mmol.100g-1 (Sotáková, 1982). Díky těmto vlastnostem zprostředkovává sorpci rostlinných živin, potenciálně rizikových prvků a organických látek (např. pesticidů). Příjem a dostupnost těchto látek je významně ovlivněna právě humusovými látkami (Sparks, 2003). Hromadění organické hmoty v půdě je významně ovlivňováno teplotou a dostupností kyslíku. S klesající teplotou klesá i rychlost biologického rozkladu, v chladnějších klimatických podmínkách dochází k pomalejšímu rozkladu a tendencím k hromadění organické hmoty v půdě.
2.2. Nadložní humus Nadložní humus je důležitý zejména v hydrologii lesních půd. Je regulátorem odtoků srážkových vod na povodích, snižuje riziko povodní v podhorských a nížinných oblastech, zachytává velké množství srážkových vod propuštěných korunami porostů a tuto vodu pomalu propouští do spodních půdních vrstev, čímž zvyšuje zásoby podzemní vody, rozhoduje o odtoku, výparu a průsaku vody (Remeš et al., 2005). Mimo jiné slouží jako zásobárna energie a uhlíku pro půdní edafon a rostliny. Má nezastupitelný význam při působení na fyzikální (zrnitost, struktura, konzistence), chemické (sorpční komplex, pH) a biologické (prostředí pro mikroorganismy) vlastnosti půdy (Baldock a Nelson, 2000). Nadložní humus je specifickou součástí lesních půd. Na jeho vlastnosti má zásadní vliv složení porostu, protože vzniká zejména z opadu rostlin, které porost tvoří (Podrázský, Remeš, 2002). Rozkladem tohoto opadu vzniká vrstva surové organické hmoty a ta je dále přetvářena na složitější organické sloučeniny, které se v průběhu času stávají humifikací složkami půdního humusu. Lesní porosty s různým dřevinným složením vytvářejí v lesních půdách různé typy humusu se specifickými vlastnostmi (Wollum, 1973). Kvantitativně i kvalitativně se tvoří jiný typ humusu z opadu jehličnatých a listnatých porostů. Opad a rozklad biomasy je hlavní cestou, jak se uhlík, dusík a další živiny dostávají zpět do půdy, a slouží jako zdroj energie pro mikroorganismy (Podrázský, 2001). Vlastní půdní humus se uplatňuje v sorpci a výměně kationtů a ovlivňuje oxidačně redukční pochody. Tvorba lesního humusu je ovšem také závislá na chemismu půdy, reliéfu (sklon, expozice, nadmořská výška), dále na klimatických poměrech (Prescott et al., 2000). Pod jehličnatými porosty se vytvářejí převážně mocnější vrstvy surového povrchového humusu s malou humifikační schopností, a to zejména u smrkových a borových monokultur, které 3
vedou především ke zvýšenému hromadění suchých surových humusů v oblastech nížin a pahorkatin, nebo k hromadění vlhkých surových humusů v horských oblastech (Albers et al., 2004). Akumulace surového humusu pod jehličnany je způsobena hlavně zvýšeným obsahem pryskyřic a vosků v jehlicích i samotnou anatomickou stavbou jehlic, což značně zvolňuje a prodlužuje mikrobiální humifikační procesy a tvoří se zde nejkyselejší humus. Okyselování půdního prostředí probíhá jako pozvolný, přirozený a dlouhodobý proces, který je důsledkem tvorby organických kyselin, ke kterému dochází v lesních půdách při rozkladu organických látek avšak často je podpořený a urychlený antropogenní činností (Hruška, Cienciala 2001).
2.2.1. Formy nadložního humusu V lesnictví se používá členění forem humusu na mor, moder a mul (Macků, 1996). Ty se mohou podle způsobu vzniku dělit na anhydrogenní horizonty, vznikající na propustných půdách, které nejsou zamokřené, a horizonty hydrogenní vznikající na půdách, které jsou větší část roku zamokřené (Němeček et al., 2001). U forem nadložního humusu lze odlišit horizont opadanky – L, který je tvořen čerstvým materiálem (listí, jehličí, kůra apod.) bez známek intenzivního rozkladu, takže jeho původ je snadno rozeznatelný. Dále se nachází horizont drti – F (fermentační), který tvoří částečně rozložené organické zbytky, jež dosud neztrácejí svůj tvar a strukturu. Horizont měli - H (humifikační) je organickou vrstvou tmavě zbarvených organických látek s vysokým obsahem uhlíku, kde humifikace pokročila již do takového stupně, že struktura organických zbytků již není rozeznatelná (Němeček et al., 2001). Jak uvádí Němeček et al. (2001), mul vzniká za velmi příznivých podmínek pro rozklad a transformaci organických zbytků. Tvoří se převážně pod listnatými a smíšenými porosty v mírném až teplém klimatu, za vyrovnaných podmínek vodního režimu, na půdách dostatečně hlubokých, dobře provzdušněných a zásobených živinami. Důsledkem intenzivní činnosti zooedafonu, bakterií a aktinomycet je rychlá transformace organické hmoty. Mul je charakteristický dobře vyvinutým humózním horizontem A, který bývá černohnědý až hnědočerný. Významně se uplatňují i koprogenní exkrementy, především žížal, které přispívají k tvorbě krupnaté až drobtovité struktury svrchní části humusového horizontu, pH bývá vyšší než 5 a poměr C/N v rozmezí 10 až 20. Vznikají především huminové kyseliny (Sotáková, 1982). Pro jehličnaté lesy vyšších poloh s kyselým opadem a chladnějším a vlhkým klimatem je typický zejména mor, který vzniká za nepříznivých podmínek pro rozklad a transformaci organické hmoty na minerálně chudých půdách. Na rozkladu organické hmoty se v rozhodující 4
míře podílejí plísně a houby. Činnost zooedafonu je značně omezená, ve větší míře se vyskytují jen roztoči a chvostoskoci. Nenastává intenzivnější prohumóznění minerální části půdy. Nadložní humus se hromadí ve zplstnatělé vrstvě propletené mycelií plísní, hyfami hub a kořínky rostlin. Při částečném rozkladu opadu vznikají především fulvokyseliny, které díky své rozpustnosti migrují půdním profilem a vyvolávají podzolizaci (Němeček et al., 2001). Pro mor je typické nízké pH kolem 3,8 - 4,0 a vysoký poměr C/N 30 až 40 (Sotáková, 1982). Přechod mezi morem a mulem zaujímá moder, který vzniká v příznivějších klimatických a půdních podmínkách než v případě moru a to jak v listnatých, tak jehličnatých lesích (Macků, 1996).
Díky tomu dochází k akumulaci částečně až dobře humifikovaného organického
materiálu. Hojně se vyskytují členovci, žížaly jsou pouze ojedinělé, pH půdy může být v rozmezí 3-7 a poměr C/N se pohybuje většinou kolem 20 (Sotáková, 1982).
2.3. Humusové látky Humusové látky jsou produktem humifikace biomasy (rostlinného, živočišného a mikrobiálního původu) v půdě a ve vodě a jsou jedny z nejdůležitějších a nejběžnějších sloučenin na zemi (Green at al., 1993). Při humifikaci se část organických zbytků mineralizuje, čím mikroorganismy získávají energii. Souběžně se procesy oxidace a kondenzace tvoří nové, vysokomolekulární, tmavě zbarvené látky, uhlíkem bohatší než původní humusotvorná hmota. Nově vytvořené humusové látky mají obsah uhlíku vyšší než 45 %. Jak uvádí See a Bronk (2005), snižování poměru C/N je významným rysem přeměny rostlinné biomasy na humus prostřednictvím humifikačního procesu. Tento podíl začíná na zhruba 100/1 u čerstvé rostlinné biomasy. Během humifikace mikroorganismy přeměňují při získávání energie organický uhlík na CO2. Současně bakteriální činnost poutá vázaný dusík se sloučeninami vzniklými při rozkladných procesech. Výsledný podíl uhlík/dusík je po ukončení procesu humifikace kolem 10/1. Humus proto obsahuje vysoký podíl organicky vázaného dusíku. V Tab. 1 jsou uvedeny definice hlavních složek půdní organické hmoty. Toto dělení v podstatě odpovídá Tjurinovu schématu dělení organické hmoty na huminové látky, nehuminové látky a látky rozpustné v organických rozpouštědlech (Sotáková, 1982). Mezi nehuminové látky patří cukry, organické kyseliny, aminokyseliny, vyšší mastné kyseliny, alkoholy, aldehydy, dusíkaté sloučeniny, celulóza, chitin, lignin, bílkoviny, polysacharidy a další sloučeniny. Huminové látky se často označují jako „vlastní humus“, který je v půdě poměrně stálý a značně odolává mikrobiálnímu rozkladu (Sotáková, 1982). Nejběžnější dělení huminových látek je na základě jejich rozpustnosti v kyselinách nebo zásadách na tři hlavní skupiny: fulvokyseliny, 5
huminové kyseliny a huminy (Stevenson, 1994, Sotáková, 1982, Haes a Clapp, 2001). Ve všech případech jde o součást velice heterogenního systému a rozdíly mezi jednotlivými humusovými látkami jsou mimo jiné dány rozdílností v chemickém složení, kyselostí, úrovní hydrofobicity a asociace molekul (Stevenson, 1994). Lubal et al. (1998) popisuje humusové látky jako amorfní, částečně aromatické vysokomolekulární spirálovité polymery v globulární konformaci mající nízké pH, vysokou iontovou sílu, žluté až černé barvy, odolné vůči mikrobiálnímu rozkladu, které nemají již přesně definovatelnou chemickou stavbu a fyzikální vlastnosti. Tvoří dlouhé spirálové molekuly nebo dvoj až trojrozměrné síťové (cross-linked) makromolekuly s negativním nábojem, který vzniká ionizací kyselých funkčních skupin, například karboxylů (Sparks, 2003).
Tab. 1: Definice půdní organické hmoty a jejích různých složek podle Stevensona (1994).
Složka organické hmoty Organické zbytky Půdní biomasa Humus = půdní organická hmota Huminové látky
Nehuminové látky Humin Huminové kyseliny
Fulvokyseliny Hymatomelanové kyseliny
Definice Nerozložené části rostlinných a živočišných tkání a produkty jejich částečného rozkladu Organická hmota tvořená živými mikrobiálními tkáněmi Všechny organické látky v půdě, kromě nerozložených rostlinných a živočišných tkání, produktů jejich částečného rozkladu a půdní biomasy Řada vysokomolekulárních hnědě až černě zbarvených látek, které vznikly sekundárními syntetickými reakcemi. Tento termín je používán jako obecný název pro popis tmavě zbarvených frakcí získaných na základě jejich rozpustnosti. Tyto látky jsou charakteristické pro půdu (nebo sedimenty) a nejsou podobné biopolymerům nacházejících se v mikroorganismech nebo vyšších rostlinách Látky patřící do známých biochemických tříd, jako aminokyseliny, uhlovodíky, tuky, vosky, pryskyřice a organické kyseliny Frakce humusu (půdní organické hmoty) nerozpustná v alkalickém roztoku Tmavě zbarvený organický materiál, který může být z půdy extrahován množstvím činidel a který je nerozpustný ve zředěných kyselinách Světleji zbarvený organický materiál, který zůstává v roztoku po vysrážení huminových kyselin po okyselení Část huminových kyselin rozpustná v alkoholu
6
Stevenson
(1994)
rozlišil
pomocí
HPSEC
(High
Performance
Size
Exclusion
Chromatography) sedm odlišných molekul, které mohou být považovány za monomerní součásti huminových látek. Jedná se o kyselinu dihydroxyfenyloctovou, kyselinu gallovou, kyselinu protokatechovou, kyselinu hydrokávovou, glukosoamin, resorcin a katechin.
2.3.1. Huminové kyseliny Huminové kyseliny (HK) tvoří nejkvalitnější složku huminových látek, jsou tmavě hnědého zbarvení a hlavní složkou půdní organické hmoty, která přispívá k chemickým i fyzikálním vlastnostem půdy (Sotáková, 1982). S vápníkem a hořčíkem tvoří ve vodě nerozpustné humáty vápenaté nebo hořečnaté, které zvyšují soudržnost lehkých půd a zlepšují drobivost a zpracovatelnost těžkých půd. Jejich mimořádně významnou vlastností je také vysoká míra rezistence vůči mikrobiálnímu rozkladu a mineralizaci. Poutají také řadu rizikových prvků (Cd, Pb, Zn, Hg, aj.) do špatně rozpustných sloučenin a omezují tak jejich pohyb v půdě a příjem rostlinou. Maximální sorpční kapacitu mají v rozmezí 350500 mmol.100g-1 (Šály, 1977). V rozpustném stavu se srážejí s Ca2+, Mg2+, Fe3+, Al3+. Významnou schopností huminových kyselin je vytváření tzv. organominerálních komplexů, které vznikají různými vazbami s jílovými minerály v půdě. Tím se vytvářejí obrovské molekuly s velikým povrchem a značnou schopností poutat různé ionty - sorpční komplex. Prvkové složení HK je dusíku 2 - 6 %, a to ve formě aminové, amoniakální a N heterocyklů, 50 – 60 % uhlíku, 4 – 6 % vodíku, 30 – 35 % kyslíku a 0 – 2 % síry (Stevenson, 1994). V současné době se diskutuje o vlastní struktuře humusových kyselin. Huminové kyseliny jsou asociacemi molekul složenými především z hydrofobních složek (polymethylenové řetězce, mastné kyseliny, steroidní složky), které jsou stabilizovány v neutrálním pH hydrofobními disperzními silami. Jejich konformace se zvětšují s přibýváním intermolekulárních vodíkových můstků díky nízkému pH v průběhu jejich vzniku (Stevenson, 1994, Obr. 1). Základní strukturou jsou aromatická jádra di- nebo trihydroxyl-fenolového typu, která jsou spojena vazbami –O–, –CH2–, –NH–, –N=, –S–, a obsahující další skupiny jako volné hydroxylové, karboxylové a chinonové skupiny (C=O) (Lubal et al., 1998). Existuje několik názorů na strukturu huminových kyselin. Jak uvádí Stevenson (1994), jedna z prvních a starších teorií popisuje huminové kyseliny jako polykarboxylové kyseliny složené ze skeletu uhlíkatých aromatických jednotek (jader) vzájemně spojených alifatickými řetězci. 7
(Sacharidy)
(Peptidy)
Obr. 1: Hypotetická struktura huminové kyseliny s volnými a vázanými fenolickými OH skupinami, chinony, chinony N a kyslíkovými můstky stky a COOH skupinami různě r vázanými na aromatické cykly (Stevenson 1994). 1994)
Pro tuto polymerickou teorii svědčí sv mnoho starších prací (např.. Konovova, 1961), které poukazují na možnosti abiotického nebo i biotického shlukování jednoduchých molekul do humusu podobných struktur. struktur Amfifilní (zčásti hydrofilní, zčásti ásti hydrofobní) podstata huminových kyselin a menší velikost poukázaly na micelární (podobný membráně) membrán model tvorby humusových látek (Wershaw, 1986, 1993). Jiné studie (Puchalski et al. 1992, Engebretson a von Wandruszka, 1997, Yates, 1997) uvádějí, uvád jí, že spontánní agregace vodních huminových kyselin může že být vnitromolekulární (zahrnující jednoduché polymerní řetězce) nebo mezimolekulární (zahrnující mnohonásobné polymerní řetězce). Tyto teorie předpokládají, edpokládají, že se polymery huminových kyselin ohýbají a stáčejí stáčejí způsobem, zp který vytváříí strukturované oblasti, které lze přirovnat p k uzlům m na niti. Vnitřní Vnit část těchto uskupení je relativně hydrofobní, zatímco vnější vn část ást je hydrofilní. Struktura se podobá micele nebo ještě lépe pseudomicele, i když je omezena vnitromolekulární podstatou uspořádání ádání a polydispersitou materiálu. Piccolo (1996, 2001) ve svém konceptu „Concept of loosely-bound bound humic supramolecular associations“ popisuje huminové kyseliny jako supramolekulární strukturu relativně relativn malých bioorganických molekul (s molekulovou hmotností <1000 Da) poutaných dohromady díky disperzním silám (Van Van der Waalsova síla, π-π, a CH-π ) Jejich konformace se zvětšují zv s přibýváním ibýváním intermolekulárních vodíkových můstků m díky nízkému pH v průběhu jejich vzniku. Cui et al. (1994) a Crestini et al. (2004) uvádějí, uvád jí, že molekuly huminových kyselin 8
jsou tvořeny hydrofobními sloučeninami (dlouhými alkyl-řetězci alkanů, alkenů, mastných kyselin, sterolů, terpenů, a fenyl-alkyl zbytků vznikajících při degradaci ligninu), které umožňují jejich samosdružování do supramolekulárních struktur oddělených od vodního média a jsou schopny dlouhodobě setrvat v prostředí.
2.3.2. Fulvokyseliny Fulvokyseliny (FK) jsou výrazně mobilní, nepříliš významné při tvorbě půdní struktury, mají nižší molekulovou hmotnost ve srovnání s huminovými kyselinami, a jsou charakteristické pro kyselé půdy. Barvu mají žlutohnědou až žlutou (Sotáková, 1982). Oproti HK se vyznačují větším počtem bočních, lineárních řetězců a menším počtem aromatických jader. Jsou i snadněji hydrolyzovatelné než HK. Mají povahu aniontů a jsou hydrofilní. Kyselé skupiny podmiňují vysokou kationtovou výměnnou kapacitu až 700 mmol.100g-1 FK (Šály, 1977). Jejich soli s Ca2+, Mg2+ a Fe2+, ale i s řadou rizikových prvků jsou dobře rozpustné ve vodě. Pouze fulváty Al3+ a Fe3+ jsou při neutrální a alkalické reakci vodostálé. FK jsou vlivem silně kyselého pH (2,6 - 2,8) a dobré rozpustnosti v půdním roztoku velmi agresívní k minerálnímu půdnímu podílu. S hydroxidem železitým a hlinitým vytvářejí rozpustné komplexní sloučeniny. Tato jejich vlastnost je důležitá pro pohyb minerálních látek v půdě, významně působí v podzolizačních procesech. Jejich elementární složení je v průměru 40 – 50 % uhlíku, 4 – 6 % vodíku, 44 – 50 % kyslíku, 1 – 3 % dusíku a 0 – 2 % síry (Stevenson, 1994). Schnitzer a Khan (1972) uvádějí, že fulvokyseliny se skládají z fenolových a benzenkarboxylových kyselin vázaných dohromady vodíkovými vazbami a vytvářejících polymerickou strukturu značné stability. Charakteristickým znakem této struktury je, že se v molekulách nacházejí tzv. prázdná místa nebo díry, které poutají nízkomolekulární organické a anorganické sloučeniny jako pesticidy nebo ionty kovů (Obr. 2). Piccolo (2001) popisuje fulvokyseliny jako asociace malých hydrofilních molekul obsahující řadu kyselých funkčních skupin udržujících tyto shluky dispergované v roztoku za jakéhokoli pH.
9
Obr. 2: Modelová struktura fulvokyseliny podle Schnitzera a Khana (1972).
2.3.3. Huminy Huminy (HU) jsou složkou půdního pů humusu, která je pevně vázaná na anorganické půdní p koloidy (Haes a Clapp, 2001) 001).. Jsou podobné huminovým kyselinám, ale jsou méně mén aromatické a obsahují více polysacharidů, polysacharid , vykazují vysoký stupeň kondenzace a nehydrolyzují (Sparks, 2003). Rice a MacCarthy Carthy (1989) popisují humin jako směs s látek lipidové povahy a huminovým m kyselinám podobných látek.
2.4. Extrakce huminových látek Extrakci huminových látek lze provést různými extrakčními ními roztoky, roztoky z nichž se pak okyselením vylučují ve formě amorfních sraženin. V současné doběě je používáno mnoho extrakčních metod s různými znými modifikacemi, modifikacemi nicméně způsob sob extrakce, případně p další frakcionace a čištění ní humusových látek ovlivňuje ovliv uje výsledky dalších analýz (Valla a Krištoufková 1982). Podle vlastností extrakčního ního činidla můžeme extrakci provádětt v prostředí prost alkalickém, neutrálním nebo téměř neutrálním a kyselém. Povaha použitého extrakčního extrak činidla má také vliv na složení, vlastnosti a výtěžek výt získaných huminových látek. Jak uvádí Stevenson (1994) ideální extrakční extrak metodou je ta, která: 1) Izoluje nezměněné né huminové látky
10
2) Extrahované huminové látky, které jsou dočištěny od anorganických kontaminantů jako jíly nebo polyvalentní kationty 3) Extrakce je kompletní, to znamená, že zaručuje zastoupení frakcí v daném rozpětí molekulové hmotnosti 4) Metoda je univerzálně použitelná pro všechny půdní typy. Nejčastěji používanou metodou k separaci huminových látek je alkalická extrakce. Při alkalické extrakci je vhodné používat nižší koncentrace hydroxylových iontů použitého extrakčního činidla, protože působením hydroxylových iontů dochází ke štěpení huminových kyselin a do roztoku přecházejí také nerozložené zbytky rostlin. Nejvhodnější je použití 0,1 – 0,5 M vodného alkalického roztoku. K získání maximálního výtěžku je pak třeba extrakci několikrát opakovat. Někteří autoři (Piccolo et al., 2000, Hayes, 1985) doporučují ještě před samotnou extrakcí vymýt zředěnou kyselinou chlorovodíkovou vápenaté uhličitany a tím zvýšit účinnost extrakce. Obecně platí, že použití 0,1 – 0,5 M NaOH vede k extrakci cca 2/3 organické hmoty (Gaffney et al., 1996). Ovšem jak uvádí Stevenson (1994) použití alkalické extrakce při studiu chemické struktury má několik nevýhod: 1) alkálie částečně rozpouští minerální části matrice a ty pak kontaminují organický produkt 2) alkálie rozpouští složky rostlinných zbytků obsažených v substrátu a ty posléze tvoří směs s humifikovanou částí organické matrice 3) alkalické podmínky podporují oxidaci organických složek při kontaktu se vzduchem. Jak uvádí Brenner (1950) mohou také nastávat chemické změny v matrici způsobující kondenzaci mezi aminokyselinami a C=O skupinami aromatických aldehydů nebo chinonů za vzniku pseudohuminových sloučenin. Na množství extrahované hmoty z půd má také vliv doba prováděné extrakce. Obecně lze říct, že s rostoucí dobou extrakce a s rostoucí koncentrací NaOH roste také množství extrahované hmoty. Důsledkem toho však může být štěpení tohoto materiálu na menší frakce. Swift a Posner (1972) zjistili, že při extrakci huminových kyselin v alkalickém prostředí dochází v přítomnosti kyslíku k intenzivnějšímu štěpení. Aby se zabránilo strukturním změnám, doporučují provádět extrakci v inertní atmosféře, například v dusíku.
11
V posledních letech bylo vyzkoušeno mnoho mírnějších a selektivnějších extrakčních činidel jako alternativní náhrada klasické alkalické extrakce. Mezi tyto látky lze zařadit například Na4P2O7, směsi organických rozpouštědel, zředěné směsi kyselin obsahující HF, nebo roztoky oxalátů alkalických kovů. Nevýhodou všech těchto činidel je, že jsou podstatně méně efektivní než klasická alkalická extrakce. Využívá se proto sledu extrakcí zahrnující jak extrakci v šetrnějším (např. Na4P2O7), tak i v alkalickém prostředí (Piccolo et al., 2000, Podlešáková et al. 1992). Huminové látky extrahované z půd alkalickými roztoky a následně vysrážené v kyselém prostředí obsahují značné množství anorganického podílu. Jeho obsah se pohybuje kolem 30 % (Stevenson, 1994). Obsah těchto nečistot se obvykle eliminuje opakovaným přesrážením minerálními kyselinami a následnou úpravou iontoměničem. Dá se také použít směs HF a HCl, která rozpouští hydratované jílové minerály. Vzorek je poté nutno dialyzovat několik dnů proti destilované vodě (Piccolo et al., 2000). Odstranění organických nečistot je poněkud komplikovanější, protože jsou většinou kovalentně vázány na huminové kyseliny (Stevenson, 1994). Používají se proto metody jako hydrolýza s minerálními kyselinami, gelové fitrace nebo fenolové extrakce.
2.5. Hodnocení kvality půdní organické hmoty pomocí spektroskopických metod 2.5.1. Běžně používané metody pro určování kvality půdní organické hmoty Kvalita organické hmoty je v současnosti nejčastěji hodnocena dvěma způsoby: podle poměru huminových kyselin a fulvokyselin a podle barevného kvocientu Q4/6 (Podlešáková et al., 1992). Princip frakcionace humusových látek (FK a HK) je založen na jejich rozdílné rozpustnosti při různých hodnotách pH. Humusové látky se extrahují ze zeminy roztokem hydroxidu sodného ve směsi s difosforečnanem tetrasodným. Ten se přidává k hydroxidu, protože zvyšuje výtěžnost humusových látek. Odstředěný roztok se okyselí, což vede k vysrážení huminových kyselin. Fulvokyseliny jsou v kyselém prostředí rozpustné, proto zůstanou v roztoku. Oxidimetrickým stanovením uhlíku v obou typech kyselin získáme poměr HK:FK. Barevný kvocient Q4/6 je poměr absorbancí výluhu zeminy v difosforečnanu tetrasodném při vlnových délkách 465 a 665, respektive 400 a 600 nm (Pospíšil, 1981). Čím je hodnota barevného kvocientu nižší, tím jsou vyluhované organické látky polymerovanější a z hlediska stálosti v půdě kvalitnější. Hlavní výhodou této metody je možnost práce přímo s půdním vzorkem bez nutnosti vyseparování HK a 12
FK, což zjednodušuje práci. Obecně však lze říct, že UV-VIS spektra neposkytují dostatečné množství informací o struktuře zkoumaných humusových látek.
2.5.2. Infračervená spektroskopie Infračervená (IR) spektroskopie se používá již řadu let pro získávání cenných informací o struktuře organických látek (Capriel et al., 1995). Nejvhodnější metodou se ukazuje hlavně difúzně reflexní spektroskopie s Fourierovou transformací označovaná v literatuře jako DRIFT (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy) (Baes a Bloom, 1998, Francioso et al., 1996, Schnitzer, 1971, Stevenson 1971). Tato technika poskytuje zevrubné informace a dokáže kvalitativně identifikovat funkční skupiny v molekulových komplexech obsahujících kyslík, protože polární skupiny poskytují velmi silné IR signály (Haberhauer et al., 1999). Difuzně reflexní spektra se mohou vyjadřovat v lineárních jednotkách Kubelka-Munk, které korespondují s jednotkami absorbance ve spektru měřeném KBr technikou. Poměr spekulární a reflektanční složky záření je závislý na velikosti částic záření a jejich distribuci. Pro reprodukovatelnost měření je proto důležité upravit vzorek na velikost částic 10-20 mikrometrů a definovaně plnit vzorkovací kelímek. Výhodou je rovněž horizontální, reprodukovaná linie spektra, umožňující přesnější vyhodnocování parametrů pásů spektra. A v neposlední řadě umožňuje měření vyseparovaných humusových látek v čisté podobě bez ředění KBr, které může způsobit částečný rozklad a ionizaci -COOH skupin a fenolových -OH skupin (Machovič a Novák, 1998, Baes a Bloom, 1998). Jak uvádějí Mládková et al. (2006), infračervená spektra humusových látek jsou poměrně jednoduchá s několika hůře definovatelnými pásy a se skupinou drobnějších píků (Obr. 3). Ze spekter je možné identifikovat index aromaticity, zastoupení fenolických -OH skupin, zastoupení dusíkatých funkčních skupin a jejich podíl v aromatickém jádře nebo zastoupení anorganických nečistot (silikátů). Metoda DRIFT je pro zjišťování kvality organické hmoty velice používaná, jak dokazují i jiné práce např. Mládková et al. (2006), kteří se zabývali kvalitou organické hmoty lesních půd pod smrkovými a bukovými porosty. Tyto studie ukázaly, že byly zjištěny rozdíly v intenzitách některých pásů (1514 cm-1, což jsou C=C vazby benzenových jader a 1550 cm-1, korespondujících s N-H vazbami monosubstituovaných amidů) a dále to, že huminové kyseliny a humin z O horizontů bukových porostů byly bohatší na dusíkaté funkční skupiny. Další práce zkoumají kvalitu půdních šumavských bitumenů (Machovič
13
a Novák 1998), ze zahraničních autorů lze uvést například Yariva et al. (2002), Capriela (1995, 1997) apod.
Obr. 3: Příklad DRIFT spektra fulvokyselin (vzorek 22 Paličník)
2.5.3. Nukleární magnetická rezonance (NMR) Nukleární magnetická rezonance (NMR) slouží k identifikaci a strukturní analýze organických látek obecně a tedy i k strukturní analýze humusových látek, studiu chemických dějů a rovnováh v organické chemii, studiu vodíkových vazeb (Chyba! Nenalezen zdroj odkazů.). Používá se i ke kvantitativní analýze, protože výška signálů roste s koncentrací. Příbuznou metodou je elektronová paramagnetická rezonance, která sleduje analogické vlivy na nespárované elektrony a používá se zejména ke studiu radikálů, ve kterých se tyto elektrony objevují (Klouda, 1996). NMR se používá k určování alifatických, aromatických a karboxylových skupin uhlovodíků v humusových látkách z půd, ale i z rašelin. Dále se pomocí NMR určuje stupeň humifikace organických látek (Lu et al., 2000). Atomová jádra některých prvků mají magnetický moment a ve vnějším magnetickém poli se orientují do určitých poloh, kterým odpovídají určité energetické hladiny (Klouda, 1996). Absorpcí elektromagnetického záření v oblasti krátkých rádiových vln dochází k přechodu jádra na vyšší energetické hladiny. Nenulový magnetický moment mají pouze jádra s nenulovým celkovým jaderným spinem I. Jeho hodnota souvisí s počtem protonů a 14
neutronů v jádře. Pokud je počet protonů i neutronů sudý, má jádro nulový jaderný spin (I = 0). Příkladem je např. uhlík
12
6C.
Jejich jádra jsou nemagnetická. Naproti tomu
magnetická jsou jádra prvků, u kterých je protonové nebo nukleonové číslo liché. Největší význam má vodík 11H, jehož jaderné spinové číslo je ½. Rezonanční frekvence není u všech protonů shodná. Je vždy ovlivněna nejbližším okolím sledovaného protonu v molekule, protože vliv na daný proton mají kromě vnějšího magnetického pole další blízká jádra v molekule, která mají nenulový magnetický moment. Například v brommethanu CH3CH2Br se objevují ve skupině methylové a methylenové. Proto bychom měli ve spektru najít dva signály odpovídající dvěma druhům odlišně ovlivněných protonů. Spektrum NMR je skutečně obsahuje (Obr. 4). Metodu NMR použili pro svůj výzkum např. Chen et Chiu (2003), v lesních půdách pro stanovení humusových látek např. Simpson et al. (2001), Ussiri et Johnson (2003). Keeler et al. (2006) například zkoumali podrobnou chemickou strukturu (lipidy, sacharidy, polypeptidy a také karbonylové a karboxylové funkční skupiny) huminových kyselin, fulvokyselin a huminu vyseparovaných z lesního porostu v Coloradu a zjistili, že obsah lipidů byl největší u huminových kyselin a u fulvokyselin a huminu se rovnal. Na sacharidy byly nejbohatší fulvokyseliny, méně obsahoval humin a nejmenší množství huminové kyseliny. U obsahu karbonylových a karboxylových funkčních skupin bylo pořadí následující: humin > huminové kyseliny > fulvokyseliny, ale rozdíly byly velmi malé.
Obr. 4: Příklad NMR spektra fulvokyselin (vzorek 22 Paličník)
15
3. Hypotézy a cíle práce 3.1. Hypotézy 1) Frakcionace humusových látek umožňuje separaci na jednotlivé složky, jako jsou huminové kyseliny, fulvokyseliny a humin. Výsledky různých metod jsou srovnatelné. 2) Infračervená spektroskopie podává vhodné informace o struktuře a kvalitě organické hmoty a umožňuje zhodnotit zastoupení jednotlivých funkčních skupin, podílu aromatické a alifatické části a například i zastoupení dusíku v aromatickém jádře a alifatickém zbytku. 3) Jednotlivé frakce humusových látek se liší zastoupením prvků. 4) Kvalita humusu je ovlivněna stanovištními faktory, jako je nadmořská výška, množství srážek, průměrná teplota, porostní složení. Tento vliv může být zjištěn právě pomocí frakcionace humusových látek.
3.2. Cíle práce 1) Provést frakcionaci huminových kyselin a fulvokyselin podle metodiky Piccolo et al. (2000) a dle Podlešákové et al. (1992) a srovnat výsledky těchto dvou metod. 2) Získané frakce huminových látek proměřit metodou infračervené spektroskopie (DRIFT) a získaná spektra analyzovat a porovnat. 3) Posoudit rozdíly v prvkovém složení jednotlivých frakcí huminových látek z různých lokalit. 4) Posoudit vliv nadmořské výšky, druhu porostu a místa odběru na vlastnosti a množství půdní organické hmoty.
16
4. Materiál a metody 4.1. Popis lokalit – Jizerské hory – Paličník a Smědavská hora Na základě dlouhodobých studií KPOP (např. Drábek et al. 2003, Mládková et al., 2004, Borůvka et al., 2005) a jako území, které bylo v minulosti velmi zasaženo kyselou depozicí, byly pro studium půdní organické hmoty vybrány severní svah Smědavské hory a jihozápadní svah Paličníku v Jizerských horách (Obr. 5). Obě tyto lokality byly součástí řešení výzkumného úkolu NAZV číslo 1G57073 (Faktory ovlivňující změny vlastností lesních půd v antropogenně pozměněných podmínkách). Oba transekty mají vesměs jednotné geologické podloží. Na svahu Smědavské hory bylo vytyčeno celkem 10 odběrových míst s rozsahem nadmořských výšek od 600 do 1050 m. Z toho pro analýzu půdní organické hmoty bylo vybráno 5 sond (Tab. 3, Obr. 10, Obr. 11, Obr. 12) (od 705 m do 1053 m n. m.) se stejným půdním typem, aby je bylo možno porovnat s ostatními transekty a minimalizoval se tak vliv různého půdního typu. Na Paličníku bylo odebráno také 10 ploch zahrnujících nadmořskou výšku od 610 do 940 m, pro analýzu půdní organické hmoty byly vybrány 4 sondy (Tab. 2, Obr. 6, Obr. 7, Obr. 8, Obr. 9) (od 700 m do 893m. n. m.) opět se stejným půdním typem. U každé sondy bylo popsáno druhové složení porostu (smrkové a bukové porosty), nadmořská výška, expozice a další stanovištní
podmínky.
Lokality
byly
zaměřeny
pomocí
GPS
a
fotograficky
zdokumentovány.
4.1.1. Geologie, geomorfologie a klima Jizerské hory s Ještědským hřbetem jsou horskou oblastí západních Sudet, náležející do Krkonošsko-jesenické soustavy, která svou východní třetinou zasahuje do Polska. Téměř celé území Jizerských hor tvoří biotitická krkonošsko-jizerská žula, vytvářející mohutný pluton hercynského stáří. Na severu a severozápadě lemuje žulový masiv pás svorů a ortorul, ojediněle ho prorážejí třetihorní čedičové kužely (Bukovec, Buková hora),
(Chaloupský, 1989). Ve všech sondách je geologické podloží tvořeno výrazně porfyrickou středně zrnitou žulou až granodioritem. Jizerské hory náležejí do klimatické oblasti mírně teplé (okrsek mírně teplý, velmi vlhký, vrchovinný) a chladné (okrsek mírně chladný). Vzhledem k poměrné blízkosti Atlantského oceánu a převládajícímu západnímu větrnému proudění tvoří hřbety
17
Jizerských hor značnou překážku proudům vlhkého a chladného vzduchu od oceánu, což se projevuje především vysokým množstvím dešťových a sněhových srážek. Průměrné roční srážky jsou v rozmezí 800 – 1705 mm. Průměrná roční teplota se pohybuje mezi 4,4 a 7,1 °C. V lednu od -7 do -3 °C a v červenci v rozmezí 12 – 16 °C (Vacek et al., 2003).
4.1.2. Odběr vzorků Na každé lokalitě byly vykopány půdní sondy a byly určeny a popsány půdní profily, následně půdní typ a subtyp podle platného Taxonomického klasifikačního systému půd ČR (Němeček et al., 2001). Z jednotlivých horizontů celého půdního profilu (kde to jejich mocnost dovolovala) byly odebrány vzorky k analýze (Obr. 5). Ve všech sondách je geologické podloží tvořeno výrazně porfyrickou středně zrnitou žulou až granodioritem.
4 7
6
5
8 7 3 2
1
Obr. 5: Umístění sond na vrstevnicové mapě. Vpravo nahoře jsou odběrové lokality na Paličníku, rozlišené podle druhu porostu. V levé části mapky jsou odběrové lokality na Smědavské hoře.
Tab. 2: Seznam odběrových lokalit na transektu Paličník (JZ – jihozápadní, SM – smrk, BK – buk) vybraných pro studium půdní organické hmoty Souřadnice (º)
Název
Půdní typ
s.š.
v.d.
Nadm. výška (m nad m.)
Expozice
Druh porostu
Stáří (roky)
Soubor lesních typů
4
Paličník 4
PZm
50,8694945
15,2629287
893
JZ
BK
80
6Y1
5
Paličník 5
PZm
50,8691273
15,2645348
886
JZ
SM
30-40
6Y1
6
Paličník 6
PZm
50,8683759
15,2622182
837
JZ
BK
170
6Y1
7
Paličník 7
PZm
50,8678248
15,2556280
700
JZ
SM
60
6Y1
Číslo lokality
18
Obr. 6: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Paličník 4
Obr. 7: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Paličník 5
19
Obr. 8: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Paličník 6
Obr. 9: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Paličník 7
20
Tab. 3: Seznam odběrových lokalit na transektu Smědavská hora (S – severní, SM – smrk, BK – buk) vybraných pro studium půdní organické hmoty Číslo lokality
Název
Půdní typ
1
Smědava 1
2
Smědava 2
PZm PZm
Souřadnice (º)
s.š.
v.d.
Nadm. výška (m nad m.)
Expozice
Druh porostu
Stáří (roky)
Soubor lesních typů
50,8514947
15,2412024
1053
S
SM (+kleč)
10
8Z4
50,8550911
15,2401276
1000
S
SM
10
8N2
3
Smědava 3
PZm
50,8565840
15,2398875
950
S
SM
10
8N2
7
Smědava 7
PZm
50,8597359
15,2376493
756
S
BK
150
6N3
8
Smědava 8
PZm
50,8609622
15,2367890
705
S
BK (+bříza)
150
6K1
Obr. 10: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 1
21
Obr. 11: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 2
Obr. 12: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 3
22
Obr. 13: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 7
Obr. 14: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Smědava 8
23
4.2. Popis lokalit - Novohradské hory - Vysoká V květnu roku 2007 byly odebrány půdní vzorky na výškovém transektu na severovýchodním svahu hory Vysoká (1034 m n.m.) v Novohradských horách (Obr. 15). Tato oblast byla vybrána jako srovnávací s relativně malým zatížením atmosférickou depozicí, a přitom s geologicky a morfologicky podobnými podmínkami, jaké jsou v oblasti zkoumaných transektů v Jizerských horách. Pro analýzu půdní organické hmoty byly vybrány 3 sondy s nadmořskou výškou 774 – 1073 m n. m (Obr. 16, Obr. 17, Obr. 18).
4.2.1. Geologie, geomorfologie a klima Novohradské hory a jejich podhůří jsou dva geomorfologické celky podsoustavy Šumavské hornatiny. Jsou tvořeny plochou kernou hornatinou vrásnozlomových struktur a hlubinných vyvřelin centrálního moldanubického plutonu, vzniklých vyklenutím paleogenního zarovnaného povrchu České vysočiny v jižní části a jeho následným rozlámání v jednotlivé kry vlivem tektonických pohybů v souvislosti s alpinskou orogenezí. Tímto vyklenutím byl porušen a do různých výšek přesunut původní zarovnaný povrch. Jeho stopy jsou vyznačeny zřetelnou vrcholovou hladinou v nadmořské výšce okolo 930 m n.m. Celé pohoří bylo rozčleněno poměrně hustou a téměř pravoúhlou sítí až 200 m hlubokých, sevřených údolí střední Malše a jejích přítoků v systému širokých horských hřbetů, převážně ve směru SZ-JV, a sedly oddělených vrcholů. Průměrné roční teploty jsou srovnatelné s oblastí Jizerských hor a kolísají od 6,1°C do 7,4°C. Nejstudenějším měsícem je leden, kdy průměrná teplota dosahuje -2,4°C až -3,1°C a ve výšce nad 900 m n. m. neklesá pod -4°C. Nejteplejší je červenec kdy izoterma 15°C probíhá přibližně ve výšce 700 m n. m. Roční úhrn srážek je v regionu Novohradských hor nižší než v Jizerských horách (750 - 950 mm).
4.2.2. Odběr vzorků Na lokalitě Vysoká byly vykopány půdní sondy na sedmi odběrových místech v různé nadmořské výšce (650 až 1000 m n.m.) a byly popsány půdní profily, následně půdní typ a subtyp podle platného Taxonomického klasifikačního systému půd ČR (Němeček et al., 2001). Z jednotlivých horizontů celého půdního profilu (kde to jejich mocnost
24
dovolovala) byly odebrány vzorky k analýze. U každé sondy bylo popsáno druhové složení porostu (smrkový s příměsí buků), nadmořská výška, expozice a další stanovištní podmínky (Tab. 4, Obr. 16, Obr. 17, Obr. 18). Lokality byly zaměřeny pomocí GPS a fotograficky zdokumentovány.
Obr. 15: Umístění sond na vrstevnicové mapě transektu Vysoká
Tab. 4: Seznam odběrových lokalit na transektu Vysoká (SV – severovýchodní, SM – smrk, BK – buk) vybraných pro studium půdní organické hmoty Souřadnice (º)
Název
Půdní typ
s.š.
1
Vysoká 1
KAd
3
Vysoká 3
KAd
5
Vysoká 5
PZm
Číslo lokality
v.d.
Nadm. výška (m nad m.)
48,71731
14,74361
1003
SV
SM/BK
70
7Y2
48,72
14,74821
873
SV
SM/BK
130
6Y2
48,72166
14,75493
774
SV
SM
120
6Y8
25
Expozice
Druh porostu
Stáří (roky)
Soubor lesních typů
Obr. 16: Půdní profil a odběrové rové místo na lokalitě lokalit Vysoká 1
Obr. 17: Půdní profil a odběrové rové místo na lokalitě lokalit Vysoká 3
26
Obr. 18: Půdní profil a místo odběru na lokalitě Vysoká 5
4.3. Příprava vzorků Odebrané vzorky byly usušeny na vzduchu za laboratorní teploty a přesáty přes síto o průměru ok 2 mm. Tím vznikla jemnozem, která byla použita pro chemické analýzy. Další úprava vzorků byla provedena podle potřeby jednotlivých laboratorních rozborů.
4.4. Základní půdní charakteristiky U všech vzorků byla stanovena aktivní i výměnná (pHH2O, pHKCl) půdní reakce. Aktivní půdní reakce byla stanovena v suspenzi s převařenou destilovanou vodou. U nadložních horizontů byl poměr zemina : převařená destilovaná voda 1 : 10, u ostatních horizontů 1 : 2. U výměnné půdní reakce byl použit výluh v 1 M KCl. Poměr zemina : extraktans byl u jednotlivých horizontů zachován jako v případě aktivní půdní reakce. Rozdílné poměry zemina : extaktans byly použity z důvodů vysoké nasáklivosti jemnozemě z nadložních horizontů. Obě půdní reakce byly proměřeny potenciometricky pomocí pH-metru inoLab s elektrodou SenTix 41.
27
Celkový obsah C, N v půdě byl stanoven metodou elementární analýzy na automatických analyzátorech LECO v laboratoři Ústavu ekologie lesa LDF MZLU v Brně (pouze obsah C a N) a v laboratoři Katedry agroenvironmentální chemie a výživy rostlin FAPPZ ČZU Praha (především organické horizonty). Obsah C, N v huminových látkách byl stanoven na analyzátoru LECO v laboratoři Neapolské univerzity (Università degli Studi di Napoli Federico II, Portici, Itálie). Rovněž byla hodnocena kvalita humusu, a to podle barevného kvocientu Q4/6, což je poměr absorbancí výluhu 0,05 M Na4P2O7 proměřeného při vlnových délkách 400 a 600 nm na spektrofotometru Hewlet Packard 8453. Kvalita humusu byla také určována i metodou DRIFT na spektrofotometru Nicolet Nexus bez ředění KBr (pracoviště KRV, FAPPZ, ČZU). CPMAS
13
C-NMR spektra byly měřena na přístroji firmy Bruker AVANCE™ 300 na
pracovišti NMR spektroskopie Neapolské univerzity (Università degli Studi di Napoli Federico II, Portici, Itálie). Sorpční charakteristiky byly stanoveny v laboratořích Výzkumného ústavu meliorací a ochrany půdy v Praze – Zbraslavi podle metodiky Podlešáková et al., (1992). Efektivní kationtová výměnná kapacita byla stanovena metodou dle Mehlicha promýváním sloupce zeminy v koloně nepufrovaným chloridem barnatým a následným vytěsněním Ba do roztoku pomocí chloridu hořečnatého. Koncentrace Ba je stanovena pomocí AAS. Současně jsou stanoveny koncentrace výměnných bazických kationů Ca, Mg, K, Na.
4.5. Frakcionace humusových látek U vybraných vzorků byla provedena frakcionace humusových látek dle metodiky Piccola et al. (2000) a dle metodiky Podlešákové et al. (1992).
4.5.1. Metoda dle Piccola et al. (2000) Tato metoda je založena na obecně používaných postupech při extrakci humusových látek na základě jejich rozdílné rozpustnosti při různém pH (Stevenson, 1994) a upravena pro co nejlepší dočištění těchto látek. Podle této metodiky byly vyseparovány tři frakce humusových látek: huminové kyseliny, fulvokyseliny a humin (Obr. 19). Na směs humusových látek se působí směsným roztokem, obsahující 0,5 M NaOH a 0,1 M Na4P2O7 (směsný roztok A). 50 g jemnozemě se s 0,5 l této směsi protřepávalo po dobu 24 28
h. Poté byla suspenze odstředěna a roztok se odlil přes skelnou vatu do srážecí nádoby, kde se prudce okyselil koncentrovanou HCl na pH 1. Sediment se protřepal s dalším 0,5 l extrakčního roztoku, ale tentokrát jen 1 h. Supernatant se odlil k již okyselenému roztoku a pH se opět upravilo na hodnotu 1. Tento postup se zopakoval ještě jednou. Přes noc se v chladu nechaly v roztoku precipitovat huminové kyseliny. Zbytek zeminy (sedimentu) se ponechal pro separaci huminu. Druhý den se od rozpuštěných fulvokyselin huminové kyseliny oddělily odstředěním a přidalo se k nim 0,5 l 0,5 M NaOH. Obě frakce bylo třeba dočistit od nečistot, proto směs huminových kyselin byla dočištěna od koextrahovaného minerálního podílu několikanásobným rozpuštěním pomocí 1 M NaOH a opětovným sražením
koncentrovanou
HCl.
Následovalo
dvoudenní
protřepávání
sražených
huminových kyselin roztokem obsahujícím 0,5% HCl a 0,5% HF (v/v). Od směsi fulvokyselin bylo třeba oddělit koextrahované organické molekuly, např. peptidy. K tomuto účelu se použila kolona s hydrofobním resinem SupeliteTM DAX-8. Poté se fulvokyseliny zneutralizovaly 1 M HCl. Po dočištění se jak fulvokyseliny, tak huminové kyseliny umístily do dialyzačních vaků a s nimi do válců s destilovanou vodou pro uvolnění chlóru ze směsi. Takto upravené humusové kyseliny se vymrazily lyofilizátorem Telstar Cryodos. Pro separaci huminu byl použit zbytek původní zeminy (sediment). Ten se nejprve promyl vodou do neutrálního pH a pak se nechal 24 h protřepávat s 200 ml 10 % HF. Kyselý roztok se odlil a zbytek se po promíchání třepal s destilovanou vodou, tato operace se prováděla, dokud odstředěný supernatant neměl pH 7. Dále se přidalo 0,5 l směsného roztoku A a postup pokračoval jako u separace huminových kyselin včetně dočištění, dialýzy a lyofilizace.
29
Jemnozem + sm směs roztoků 0,5 M NaOH a 0,1 M Na4P2O7 100g zeminy + 0,5l /24h a 0,5l/1h třepání, odstředění
Supernatant + konc. HCl
Zbytek
Okyselení na pH1, vysrážení HK, odst odstředění
Promývání destilovanou vodou do neutrálního pH, 24h třepání epání s 200ml 10% HF, odstředění odst
Supernatant = FK
Sraženina = HK
Neutralizace, separace koextrahovaných molekul hydrofobním resinem Supelite TM DAX-8, dialýza, lyofilizace
Dočištění od koextrahovaných jílů (rozpušt v 1 M NaOH (rozpuštění a srážení konc. HCl, tř třepání sraženiny 48h s 0,5% HCl +HF (v/v)), dialýza, lyofilizace
Doba extrakce je zhruba 14 dní CHK:CFK odpovídá HK:FK
Supernatant
Zbytek
Odpad
Promytí s destilovanou vodou do neutrálního pH, 24h třepání s 0,5l 0,5 M NaOH + 0,1 M Na4P2O7 , odstředění
Supernatant + konc. HCl
Zbytek
Okyselení na pH 1, vysrážení, odstředění
Odpad
Sraženina = humin
Supernatant
Dočištění od koextrahovaných jílů (rozpuštění v 1 M NaOH a srážení konc. HCl, třepání sraženiny 48h s 0,5% HCl +HF (v/v)), dialýza, lyofilizace
Odpad
Obr. 19:: Schéma frakcionace humusových látek
4.5.2. Metoda dle Podlešákové Podlešákov et al. (1992) Tato metoda vychází z prací Kononové (1963), Belčikové Bel ikové (1972) a Pospíšila (1980), kteří kte modifikovali původní vodní Tjurinovu metodu. Humusové látky se extrahují ze zeminy směsným sným
roztokem
obsahujícím
difosfore difosforečnan
tetrasodný sodný
a
hydroxid
sodný.
Difosforečnan tetrasodný sodný umožňuje umož extrahovat i bez předchozí edchozí dekalcinace značnou zna část organických látek vázaných na vápník. V takto připraveném p ipraveném výluhu se oxidimetricky stanoví uhlík humusových látek, z jiného podílu extraktu se vysrážejí huminové kyseliny a v roztoku se po jejich oddělení oddě stanoví uhlík fulvokyselin. Obsah uhlíku huminových kyselin se vypočítá z rozdílu C humusových látek a C fulvokyselin.
30
Do centrifugační nádobky se navážilo 2,5 g vzorku a přidalo se 50 ml extrakčního roztoku (směs 0,1 M Na4P2O7 a 0,1 M NaOH). Po hodinovém protřepání se směs nechala 24 hodin extrahovat a dále se přidalo 4 ml roztoku síranu sodného (nasycený roztok 150 g Na2SO4 se rozpustí v 1 l destilované vody, část síranu musí zůstat nerozpuštěná). Promísilo se a nechalo v klidu 10-15 minut. Poté se suspenze oddělila po dobu 10 min při 4000 ot. min-1 a supernatant se slil přes hustý filtr do odměrné baňky. Ke zbytku zeminy v centrifugační nádobce se přidalo dalších 10 ml extrakčního roztoku a 1 ml síranu sodného. Obsah se protřepal a po 10 minutách se opět odstředil. Supernatant se přefiltroval k prvému podílu extraktu v odměrné baňce. Celý postup se opakoval tak dlouho, až byl supernatant bezbarvý. Poté se filtrát v odměrné baňce doplnil extrakčním roztokem na 100 ml a po promísení bylo pipetováno 25 ml na stanovení huminových látek a 40 ml na stanovení fulvokyselin. 25 ml výluhu se odpařilo na minimální objem, v odparku se stanoví obsah uhlíku jeho oxidací chromsírovou směsí (0,0667 M K2Cr2O7 + koncentrovaná H2SO4) při teplotě 125˚ C s následnou potenciometrickou titrací Mohrovou solí (0,1 M Fe(NH4)2(SO4)2) do mrtvého bodu, poté se vypočte množství organického uhlíku v %. Tím se získá uhlík huminových látek CHL. Pro stanovení uhlíku fulvokyselin se použilo 40 ml výluhu, ke kterému se po kapkách přidával 1-2 ml kyseliny sírové (o koncentraci 2,5 mol.l-1). Poté se vzorek vložil na 1 h do sušárny vyhřáté na 60°C. Po vychladnutí se sraženina huminových kyselin odfiltrovala přes hustý filtr předem ovlhčený kyselinou sírovou (o koncentraci 0,025 mol.l-1). Touto kyselinou se také vymyla nádoba, ve které byly huminové kyseliny sraženy, a promýval se také filtr se sraženinou huminových kyselin, dokud neprotékal bezbarvý filtrát. Filtrát se dále doplnil v odměrné baňce destilovanou vodou na 100 ml. Poté se odpipetovala polovina filtrátu do Erlenmayerovy baňky, neutralizovala se přídavkem 0,1 M NaOH a odpařila téměř k suchu. K odparku se přidalo 10 ml chromsírové směsi a obsah uhlíku se opět stanovil jeho oxidací chromsírovou směsí (0,0667 M K2Cr2O7 + koncentrovaná H2SO4) při teplotě 125˚ C s následnou potenciometrickou titrací Mohrovou solí (0,1 M Fe(NH4)2(SO4)2) do mrtvého bodu. Tím byl získán uhlík fulvokyselin CFK. Uhlík huminových kyselin se určil z rozdílu obsahu uhlíku huminových látek a obsahu fulvokyselin.
4.6. Spektroskopické metody Zlyofilizované suché vzorky (Obr. 20, Obr. 21) vyseparované pomocí metody Piccola et al. (2000) byly umístěny do exsikátoru s P2O5 z důvodu zabránění přístupu vzdušné 31
vlhkosti, která by mohla ovlivnit měření (DRIFT spektroskopie, NMR), a následně byly měřeny těmito metodami.
4.6.1. DRIFT spektroskopie Vzorky se ve formě vloček analyzovaly pomocí difúzně reflexní infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (DRIFT) na spektrofotometru Nicolet Nexus bez ředění KBr. U výsledných spekter bylo hodnoceno zastoupení hlavních funkčních skupin a složek.
Obr. 20: Zobrazení FK pomocí optické mikroskopie (40krát zvětšeno), vpravo pozorováno bez mikroskopu
Obr. 21: Zobrazení HK pomocí optické mikroskopie (40krát zvětšeno), vpravo pozorováno bez mikroskopu
32
4.6.2. NMR spektroskopie v pevné fázi CPMAS (Cross Polarization Magic Angle Spinning)
13
C-NMR spektra byla měřena na
přístroji firmy Bruker AVANCE™ 300, s 4 mm Wide Bore MAS sondou, pracující na 13C resonanční frekvenci 13 kHz. Měření bylo provedeno na Neapolské univerzitě (Università degli Studi di Napoli Federico II, Portici, Itálie). Vzorky huminových kyselin, fulvokyselin a huminu byly uloženy do 4 mm zirkoniových kyvet s Kel-F víčky. 1000 snímků společně s 3782 referenčními body bylo získáno v čase 25 ms, recyklační prodlevě 2.0 s, kontaktním čase 1 ms. Pro vyhodnocení naměřených spekter byl použit software Topspin 1.3 firmy Bruker.
33
5. Výsledky a diskuze 5.1. Základní půdní charakteristiky Základní půdní charakteristiky uvádějí Tab. 5, Tab. 6, Tab. 7. Z uvedených údajů je zřejmé, že se na všech třech transektech jedná o velmi až extrémně kyselou půdu. Výměnné pH se na Paličníku pohybuje od 2,7 do 4,1, na Smědavské hoře od 2,9 do 4,0. Transekt Vysoká má rozmezí hodnot výměnné půdní reakce dokonce ještě nižší, od 2,4 do 2,8. Tyto nízké hodnoty mohou být dány vysokým obsahem především jednodušších organických kyselin, hlavně fulvokyselin vznikajících rozkladem půdní organické hmoty (Pavlů, Rohošková, 2007). Podle ukazatele kvality humusu se jedná většinou o půdy s nízkou kvalitou humusu, což je ovšem pro lesní půdy typu podzol či kambizem dystrická charakteristické (Němeček et al., 2001). Ve svrchních horizontech jsou hodnoty Q4/6, vyšší což může naznačovat, že ještě nejsou dostatečně vyvinuty vysokomolekulární látky typu huminových kyselin, jejichž vyšší obsahy mají největší podíl na snižování hodnoty tohoto ukazatele. Poměr C/N lze hodnotit jako optimální. Čím nižší tento poměr je, tím vyšší je stupeň humifikace. Ovšem Hruška et al. (2001) uvádějí, že pokud je poměr C/N pod 25, může docházet k vyplavování minerálního dusíku hlavně v jehličnatých porostech. Fischer a Binkley (2000) také uvádějí, že poměr C/N záleží na stupni rozkladu humusotvorného materiálu a obvykle bývá od 20 do 150. V mladých porostech bývá vyšší a se stářím porostu se poměr C/N snižuje. V porostu s vysokým stupněm humifikace může klesnout až pod 12 (Fischer a Binkley, 2000). Množství organické hmoty ovlivňuje kationtovou výměnnou kapacitu, proto je kationtová výměnná kapacita nejvyšší v horizontech F, H a směrem do hloubky se snižuje. Pouze u transektu Vysoká je výrazný rozdíl mezi organickými a minerálními horizonty.
34
Tab. 5: Základní půdní charakteristiky na transektu Paličník číslo n.v. půdní typ porost orientace sondy
4
5
6
7
700
837
886
893
PZm
PZm
PZm
PZm
SM
BK
SM
BK
horizont
pHH2O
pHKCl
Q4/6
C%
N%
C/N
KVK cmol/kg
F
3,58
2,74
11,82
39,40
2,23
17,67
26,05
H
3,69
2,84
10,31
22,60
1,69
13,37
21,07
Bhs
3,64
2,99
8,83
20,50
1,51
13,58
12,07
Bs
4,53
4,19
6,68
7,60
0,31
24,52
12,74
F
4,49
3,02
9,24
41,90
2,73
15,35
20,80
H
3,98
3,04
17,00
30,60
1,36
22,50
15,61
Bhs
3,70
3,15
11,82
12,40
0,49
25,31
13,09
Bs1
4,17
3,63
8,38
9,60
0,54
17,78
12,03
Bs2
4,38
3,85
8,33
9,80
0,46
21,30
9,33
F
4,04
2,97
7,22
40,60
1,99
20,40
24,15
H
3,69
2,92
9,42
29,40
1,79
16,42
27,03
Ep
3,84
3,25
4,88
6,10
0,33
18,48
8,60
Bhs
4,02
3,47
5,79
11,20
0,66
16,97
9,05
F
3,80
3,02
16,62
44,60
1,37
32,55
20,39
H
3,08
3,14
7,71
41,10
1,88
21,86
22,14
Bhs
3,68
3,15
6,04
8,40
1,21
6,94
10,39
Bs1
3,93
3,23
9,12
10,60
1,29
8,22
14,80
Bs2
4,13
3,40
8,73
6,30
0,56
11,25
12,13
C
4,20
3,63
6,61
6,10
0,59
10,34
9,92
JZ
JZ
JZ
JZ
35
Tab. 6: Základní půdní charakteristiky na transektu Smědavská hora číslo n.v. půdní typ porost orientace horizont sondy
1
2
3
7
8
700
750
950
1000
1053
PZm
PZm
PZm
PZm
PZm
BK
BK
SM
SM
SM
pHH2O
pHKCl
Q4/6
C%
N%
C/N
KVK cmol/kg
F
4,10
3,13
7,19
49,36
1,64
30,10
24,00
H
4,10
3,34
8,98
40,90
2,51
16,29
12,92
Bhs
3,96
3,37
6,65
27,00
1,79
15,08
4,81
Bs
4,46
4,01
7,43
14,00
1,15
12,17
3,89
F
3,89
2,89
11,53
38,91
1,96
19,85
22,25
H
3,85
3,02
6,20
30,16
2,38
12,67
11,91
Ah
3,76
3,13
4,12
37,64
3,61
10,43
8,47
Ep
3,95
3,33
8,42
8,54
0,99
8,63
7,13
Bs
4,48
3,98
8,92
7,34
1,67
4,40
Nest.
F
3,85
3,23
15,72
37,64
2,03
18,54
22,85
H
4,04
3,33
6,50
39,26
1,36
28,87
11,66
A(E)
4,10
3,57
7,74
25,37
0,87
29,16
7,91
Bhs (G)
4,33
3,77
7,95
10,48
1,94
5,40
3,90
F
4,38
3,23
12,27
39,67
2,56
15,50
27,76
H
3,91
3,35
6,43
32,36
2,99
10,82
13,61
Ep
4,33
3,61
5,09
12,48
1,49
8,38
2,87
B (G)
4,39
3,78
4,63
7,81
1,21
6,45
Nest.
F
3,99
3,23
19,67
28,19
2,74
10,29
23,60
H
3,97
3,27
8,65
27,46
1,68
16,35
5,01
Ep
4,11
3,42
4,70
15,76
1,32
11,94
12,28
Bs
4,26
3,62
4,38
8,47
0,67
12,64
Nest.
S
S
S
S
S
36
Tab. 7: Základní půdní charakterisky na transektu Vysoká číslo sondy
1
3
5
n.v.
1003
873
774
půdní typ
PZm
KAd
KAd
porost
SM/BK
SM/BK
SM
orientace
SV
horizont
pHH2O
pHKCl
Q4/6
C%
N%
C/N
KVK (cmol/kg)
F
1,94
3,22
8,03
48,00
2,20
21,82
37,14
H
1,89
3,07
9,37
40,90
1,71
23,92
38,39
Ep
2,43
3,03
5,93
8,40
0,36
23,33
12,48
Bhs
2,51
3,13
6,73
11,30
0,57
19,82
17,63
Bs
2,92
3,56
7,46
8,80
0,39
22,56
14,15
F
2,38
3,59
9,42
40,90
1,94
21,08
31,34
H
2,48
3,60
7,13
24,00
1,31
18,32
27,01
Bv1
3,39
3,92
7,90
3,90
0,29
13,45
7,65
Bv2
3,54
4,31
10,29
3,10
0,22
14,09
6,35
F
2,41
3,67
8,62
43,40
1,83
23,72
33,26
H
2,56
3,61
7,80
17,10
0,93
18,39
22,20
Bv
3,30
3,84
17,55
2,20
0,14
15,71
5,66
SV
SV
37
5.2. Porovnání jednotlivých metod separace huminových látek Pro porovnání metod frakcionace byl vybrán poměr HK:FK. Hodnoty tohoto poměru se pohybovaly od 0,35 do 3,00, přičemž vyšší poměr HK:FK může poukazovat na výraznou převahu huminových kyselin. Také Mládková a Rohošková (2007) uvádějí výrazný nadbytek vyseparovaných HK oproti FK, který neodpovídá obecně akceptovaným tvrzením o nekvalitním humusu lesních půd s výrazným přebytkem fulvokyselin. Vysvětlují to tím, že podle ligninové teorie dochází demetylací, oxidací a kondenzací dusíkatých sloučenin k přeměně ligninu na huminové kyseliny. Původní nerozložený lignin se při separaci chová obdobně jako huminové kyseliny, je tedy rozpustný v alkáliích a vysráží se v kyselém prostředí. (Mládková a Rohošková, 2007). Základní statistické parametry tohoto poměru získaného z obou metod frakcionace ukazuje Tab. 8.
Tab. 8: Základní statistické parametry souboru dat poměru HK:FK pro metodu podle Piccola et al. (2000 )(A) a podle Podlešákové et al. (1992) (B).
Metoda průměr sm. odchylka koef. variance % min. max. rozsah
A 1,56 0,29 0,19 1,12 1,96 0,84
B 1,32 0,71 0,54 0,35 3,00 2,65
Piccolo
Podlešáková
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Obr. 22: Grafické porovnání metod podle Piccola et al. (2000) a podle Podlešákové et al. (1992) – hodnoty poměru HK:FK
Vzhledem k tomu, že se rozptyly jednotlivých metod významně liší, byl pro porovnání metod použit neparametrický Mann-Whitneyův test. Tento test statisticky potvrdil, že mezi porovnávanými metodami není statisticky významný rozdíl (P = 0,09). Nicméně z Obr. 22 vyplývá, že metoda podle Piccola et al. (2000) má menší rozptyl a tím ji lze tedy považovat za přesnější. Metoda podle Podlešákové vychází z prací Kononové (1963) a Belčikové (1972), které modifikovaly původní Tjurinovu metodu. Jak uvádí Pospíšil (1980) tato metoda umožňuje stanovit dvě frakce humusových látek:
38
1) volné humusové látky, tj. huminové kyseliny a fulvokyseliny (HK a FK), získané přímou extrakcí zeminy hydroxidem sodným (modifikace podle Podlešákové používá směsný roztok Na4P2O7 o koncentraci 0,1 M a NaOH o koncentraci 0,1 M) označované jako 1. HK a 1. FK 2) humusové látky vázané na Ca, Mg a popřípadě na Al, extrahovatelné 0,1M NaOH po dekalcinaci zeminy 0,1M H2SO4 označované jako 2. HK a 2. FK. Duchaufour a Gaiffe (1993) dokonce uvádí tří skupiny huminových kyselin a to: 1) volné huminové kyseliny a vázané na mobilní formy sesquioxidů 2) huminové kyseliny vázané na Ca2+ 3) huminové kyseliny vázané na Fe a Al oxidy a hydratované oxidy Vzhledem k tomu, že při frakcionaci metodou podle Piccola et al. (2000) se používá obdobný extrakční roztok (0,5 NaOH a 0,1 M Na4P2O7), lze předpokládat, že se vyseparují všechny výše uvedené skupiny huminových kyselin a fulvokyselin. Rozdíl tedy může nastat při konečném dočišťování jednotlivých frakcí od organických a anorganických
kontaminantů.
Piccolo
huminové
kyseliny
dočišťuje
pomocí
několikanásobného rozpuštění 0,1 M NaOH a opětovným srážením koncentrovanou HCl a dalším dočištěním pomocí 0,5% HCl + 0,5% HF. Také fulvokyseliny jsou odděleny od nečistot. Metoda, kterou uvádějí Podlešáková et al. (1992) dočištění neumožňuje. Proto byl také k hodnocení vybrán poměr HK:HK, protože by nečistoty v DRIFT spektrech huminových kyselin překrývaly pásy důležité pro posouzení rozdílů jednotlivých absorpčních pásů. Podle metodiky Podlešákové et al. (1992) byly takto vyseparované HK i FK zneutralizovány a roztok byl odpařován do minimálního objemu. Toto odpařování je velice náročné, neboť je třeba minimalizovat objem, ale vzorek nevysušit do podoby takzvaného xerogelu. Takto přesušený vzorek je pak nesnadno oxidován chromsírovou směsí a měření je zatíženo chybou. Se stejným problémem se ve své práci potýkala i Mládková (2006). Pro následné stanovení uhlíku HK a FK a poměru HK:FK je v případě metody dle Podlešákové et al. (1992) zvolena oxidimetrická metoda, která byla po optimalizaci navážky použita i pro metodu dle Piccola et al. (2000). Zde se vyskytl problém, protože žádný ze vzorků nebyl dostatečně zoxidován 10 ml chromsírové směsi (0,0667 M K2Cr2O7 + koncentrovaná H2SO4), které jsou uvedeny v metodice. Bylo proto nutné použít od 15 ml do 30 ml této směsi, což ovšem neodpovídá požadavkům na nízkou spotřebu chromsírové směsi při zachování přesnosti měření obsahu oxidovatelného uhlíku 39
oxidimetrickou metodou. To poukazuje na to, že pro velký obsah organické hmoty není tato metoda úplně vhodná pro stanovení obsahu organického uhlíku huminových látek v lesních půdách. Bylo by proto vhodné ověřit obě metody a stanovení organického uhlíku v huminových kyselinách pomocí oxidimetrické metody také u orných půd a jejich výsledky porovnat. Jak uvádí Valla a Krištoufková (1982) způsob extrakce, případně další frakcionace a čištění humusových látek a způsob stanovení uhlíku je faktorem velmi silně ovlivňujícím výsledky dalších analýz. Množství používaných extrakčních postupů je navíc komplikováno celou řadou modifikací, což značně znesnadňuje vzájemné srovnání výsledků s literaturou. Hranice mezi huminovými kyselinami a fulvokyselinami je proto u odlišných extrakčních způsobů různá (Valla a Krištoufková, 1982).
5.3. Prvkové složení vyseparovaných huminových látek Separace huminových kyselin, fulvokyselin a huminu byla provedena podle metodiky Piccola et al. (2000). U všech vyseparovaných huminových frakcí byl změřen obsah C a N a vypočítán poměr C/N. Fulvokyseliny na Paličníku obsahují dusíku od 1,35 % do 3,45 %, uhlíku od 29,36 % do 34,18 % a poměr C/N je v rozmezí hodnot 9,91 až 21,75. Huminové kyseliny mají tento poměr od 6,74 do 23,90 a dusíku obsahují od 2,31 % do 6,2 %, zatímco množství uhlíku je mezi 41,80 % a 59,21 %. Humin má obsah uhlíku od 47,42 % do 50,59 %, dusíku od 1,69 % do 2,04 % a poměr C/N je v rozsahu hodnot 24,80 až 28,06 (Tab. 9). Na dalším transektu Jizerských hor na Smědavě bylo u měřených fulvokyselin zjištěno 27,66 % až 39,3 % uhlíku; 3,41 % až 5,32 % dusíku a poměr C/N se vyskytoval v rozmezí hodnot 6,75 až po 8,11. U huminových kyselin byl tento poměr mezi 12,31 a 21,55. Množství dusíku se pohybovalo v rozmezí hodnot 2,3 % až 3,95 % a obsah uhlíku byl naměřen mezi 46,22 % až 61,19 %. U huminu byl poměr C/N od 13,81 do 17,12; procentické zastoupení uhlíku od 51,54 do 56,35 a dusíku bylo 3,01 % až 4,08 % (Tab. 10). Na Novohradském transektu Vysoká je u fulvokyselin poměr C/N od 4,93 do 11,98; u huminových kyselin 16,25 až 23,40 a u huminu 16,69 až 18,27. Množství uhlíku mají fulvokyseliny od 27,7 % do 29,46 %, huminové kyseliny 51,25 % až 59,01 % a humin obsahuje uhlíku mezi 33,21 až 41,97 procenty. Dusík je ve fulvokyselinách zastoupen od 2,46 % až po 5,62 %, v huminových kyselinách od 2,19 % po 3,26 % a v huminu od 1,87 % do 2,36 % (Tab. 11). 40
Tab. 9: Poměr C/N, množství C a N (v %) u vyseparovaných HK, FK a HU na transektu Paličník FK HK HU Paličník N% C% C/N N% C% C/N N% C% průměr 2,39 31,60 14,93 4,06 52,15 15,61 1,87 49,34 sm. odchylka 1,05 2,43 6,12 1,97 9,16 8,59 0,18 1,69 koef. variace % 0,44 0,08 0,41 0,49 0,18 0,55 0,09 0,03 min. 1,35 29,36 9,91 2,32 41,80 6,74 1,69 47,42 max 3,45 34,18 21,75 6,20 59,21 23,90 2,04 50,59 rozsah 2,10 4,82 11,84 3,88 17,41 17,16 0,35 3,17
C/N 26,54 1,64 0,06 24,80 28,06 3,26
Tab. 10: Poměr C/N, množství C a N (v %) u vyseparovaných HK, FK a HU na transektu Smědava FK HK HU Smědava N% C% C/N N% C% C/N N% C% průměr 4,56 33,48 7,42 3,03 52,01 17,99 3,43 53,66 sm. odchylka 1,01 5,83 0,68 0,84 8,04 4,97 0,57 2,46 koef. variace % 0,22 0,17 0,09 0,28 0,15 0,28 0,17 0,05 min. 3,41 27,66 6,75 2,30 46,22 12,31 3,01 51,54 max 5,32 39,32 8,11 3,95 61,19 21,55 4,08 56,35 rozsah 1,91 11,66 1,36 1,65 14,97 9,24 1,07 4,81
C/N 15,84 1,78 0,11 13,81 17,12 3,31
Tab. 11: Poměr C/N, množství C a N (v %) u vyseparovaných HK, FK a HU na transektu Vysoká FK HK HU Vysoká N% C% C/N N% C% C/N N% C% 4,24 28,84 7,75 2,80 54,41 19,91 2,07 36,45 průměr 1,62 0,99 3,73 0,55 4,08 3,58 0,26 4,81 sm. odchylka 0,38 0,03 0,48 0,20 0,07 0,18 0,12 0,13 koef. variace % 2,46 27,70 4,93 2,19 51,25 16,25 1,87 33,21 min. 5,62 29,46 11,98 3,26 59,01 23,40 2,36 41,97 max 3,16 1,76 7,05 1,07 7,76 7,15 0,49 8,76 rozsah
C/N 17,58 0,81 0,05 16,69 18,27 1,58
Obecně se dá říci, že v huminových kyselinách se nachází více uhlíku než ve fulvokyselinách. Ve srovnání se Stevensonem (1994), který uvádí u HK množství C% od 53,8 do 58,7 procent, jsou zjištěné hodnoty převážně nižší. Stejně tak je tomu u FK, kde naměřené množství uhlíku ani nedosahuje hodnot uváděných Stevensonem (1994) (C% FK 40,7 % - 50,6 %). Obsah dusíku se u HK pohybuje v rozmezí od 2,8 do 4,06 %, což se shoduje s hodnotami uváděnými Stevensonem (1994), které jsou v rozmezí 0,8 – 4,3 %. Fulvokyseliny mají množství dusíku o něco vyšší od 2,39 po 4,56 % (Steveson, 1994 uvádí 0,9 – 3,3 %). K podobným hodnotám jako ukazují Tab. 9, Tab. 10, Tab. 11 došli i Shirshova et al. (2006), kteří analyzovali huminové kyseliny z lesa v oblasti New Hampshire, USA, nebo také Barančíková et al. (1997), kteří zkoumali huminové kyseliny z půd Slovenska.
41
Nejnižší množství N ve fulvokyselinách je na Paličníku a naopak je zde výrazně nejvyšší poměr C/N. Na Smědavské hoře a Paličníku jsou hodnoty obdobné. Dusíku v FK je nejméně na Vysoké a nejvíce na Smědavské hoře. V HK je dusíku nejvíce na Paličníku a nejméně na Vysoké, naopak je zde v HK nejvíce uhlíku. Paličník a Smědavská hora vykazují velice podobné hodnoty. Poměr C/N u HK je nejvyšší na Vysoké a nejnižší na Paličníku. U huminu je nejnižší množství C na Vysoké a nejvyšší na Smědavské hoře. Dusíku je nejvíce na Smědavě a nejméně na Paličníku. Poměr C/N je také výrazně nejvyšší na Paličníku. Při porovnání množství C a N huminových kyselin a fulvokyselin na jednotlivých transektech, zjistíme, že v případě huminových kyselin nebyl prokázán žádný statisticky významný rozdíl mezi množstvím uhlíku ani dusíku na jednotlivých transektech (Obr. 23), pouze trend, že huminové kyseliny na Paličníku obsahují více dusíku i uhlíku.
4,1
57 55
3,7 53 3,3
51 49
2,9
47 2,5
45 N% PAL HK
N% SME HK
N% VYS HK
C%PAL HK
C%SME HK
C%VYS HK
Obr. 23: Obsahy N (vlevo), C (vpravo) huminových kyselin na jednotlivých transektech (Paličník (PAL), Smědava (SME) a Vysoká (VYS)) („x“odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
6,6
39 36
5,6
33 4,6 30 3,6
27
2,6
24 N% PAL FK
N% SME FK
N% VYS FK
C% PAL FK
C% SME FK
C% VYS FK
Obr. 24: Obsahy N (vlevo), C (vpravo) fulvokyselin na jednotlivých transektech (Paličník (PAL), Smědava (SME) a Vysoká (VYS)) („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
42
U složení fulvokyselin byl nalezen statisticky významný rozdíl pouze u dusíku na transektu Paličník (Obr. 24). Množství uhlíku ve fulvokyselinách se mezi jednotlivými transekty statisticky významně neliší.
69
6,3
64 5,3
59 C%
N%
54
4,3
49 3,3
1053
1003
893 1000
886
873
837
774
700
750
2,3
1053
1003
893
1000
886
873
774
837
750
39
700
44
Obr. 25: Vliv nadmořské výšky na obsah C (vlevo) a N (vpravo) u huminových kyselin ze všech tří transektů („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
Obr. 25(vlevo) ukazuje, že množství uhlíku zastoupeného v huminových kyselinách má trend se až na výjimky (při 774, 873 a 1053 m n. m.) se stoupající nadmořskou výškou zvyšovat, což ve své práci uvádějí i Martin et al. (1998). Nižší množství uhlíku v nadmořské výšce 1053 m může být způsobeno tím, že se jedná o odběrové místo s velice mladým smrkovým porostem (stáří v době odběru cca 10 let, viz Obr. 10), kde může přetrvávat efekt odlesnění, který nepříznivě ovlivňuje pedochemické vlastnosti stanoviště nadměrnou mineralizací humusu (Fisher a Binkley, 2000). Vyšší nadmořské polohy vykazují nižší zastoupení dusíku (Obr. 25 vpravo), což může souviset s vyšším množstvím srážek a jeho následným vyplavováním půdním profilem.
43
25 20
C/N
15 10 5
1053
1003
1000
893
886
873
837
774
750
700
0
Obr. 26: Vliv nadmořské výšky na poměr C/N („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
Z Obr. 26 je patrný trend, že poměr C/N se v závislosti na nadmořské výšce zvyšuje. Znamenalo by to, že huminové kyseliny z vyšších, vlhčích a chladnějších nadmořských výšek jsou méně humifikované než z nižších, teplejších poloh, což potvrzují i jiní autoři (Martin et al., 1998). Tuto skutečnost uvádí i Hargitai (1994), který potvrdil, že stupeň humifikace souvisí s roční průměrnou teplotou (čím nižší teplota, tím nižší stupeň humifikace). Hruška (2001) poukazuje na to, že nejen způsob a intenzita hospodaření v lesním porostu se může odrážet na úrovni a stavu humusu (velikosti poměru C/N) a zásobení ekosystému živinami. Poukazuje také na klimatické změny, které ovlivňují rychlost mineralizace půdní organické hmoty (uvolňování dusíku a ostatních živin do půdního roztoku ve formě přístupné rostlinám). Cerli et al. (2008) také studovali vliv věku porostu na hodnotu poměru C/N u huminových kyselin ve smrkových porostech ve Švédsku. Zjistili, že nejvyšší hodnoty poměru C/N mají huminové kyseliny v mladém porostu, což by se potvrzovalo, protože porost v nadmořské výšce 1000 a 1053 m n. m. měl v době odběru stáří 10 let (viz Obr. 10 a Obr. 11). Hodnota poměru C/N z nadmořské výšky 837 m n. m. by také svědčila o mladém porostu, což tedy nesouhlasí, protože v době odběru měl stáří 170 let, nicméně se jedná o odběrové místo s porostem buku, obdobně je tomu v případě nadmořské výšky 1003 m n. m., kde se vyskytuje smíšený les (smrk - buk).
44
4,2 3,9 N%
3,6 3,3 3 2,7 BK
SM
POROST Obr. 27: Vliv porostu buku (BK) a smrku (SM) na množství dusíku v HK („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
V huminových kyselinách bylo zjištěno větší množství dusíku pod bukovými porosty (Obr. 27) v horizontech F a H, které jsou nejvíce ovlivněny porostem a jeho opadem. K podobnému zjištění dospěl i Berg (2000), který ve své práci uvádí, že buk v lesích západní Evropy má opad více bohatý na dusík a lignin než buk. K podobnému zjištění dospěli i Albers et al. (2004)
5.4. Posouzení DRIFT spekter Infračervenými spektry se sledují vibrační, rotační a rotačně-vibrační pohyby molekul. Při interpretaci infračervených spekter sledujeme tři hlavní charakteristiky: polohu a tvar absorpčních pásů, počet pásů a jejich intenzitu. Jak potvrzují některé další práce, např. Mládková et al. (2006), spektra fulvokyselin nejsou vhodným ukazatelem kvalitativních vlastností půdní organické hmoty pro své málo výrazné pásy, které jsou z hlediska posouzení kvality organické hmoty důležité. Spektra huminových kyselin a huminu jsou z tohoto pohledu lepší, protože mají řadu méně intenzivních pásů, které se dají lépe identifikovat. Nejstabilnější frakcí humusových látek je humin, který je pevně vázán na minerální podíl půdy. Jeho DRIFT spektra jsou velice podobná jako DRIFT spektra huminových kyselin (Obr. 28). Největší rozdíl se ukazuje v pásech spekter naměřených pod 1000 cm-1, kde se mohou projevit různé nečistoty především minerálního původu. Další nevýhodou je jeho
45
malá výtěžnost při extrakci. Proto pro hodnocení kvality organické půdní hmoty byly dále použity pouze spektra huminových kyselin.
110
100
90
Kubelka-Munk
80
70
60
50
40
30
20 10 4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
Wavenumbers (cm-1)
Obr. 28: Průměrná spektra huminu (fialová), huminových kyselin (červená), fulvokyselin (modrá) z transektu Paličník (KM – intenzita v jednotkách Kubelka-Munk).
V Tab. 12 jsou uvedeny vlnočty absorpčních pásů pro některé anorganické a organické půdní složky. Různí autoři (např. Stevenson, 1994, He et al., 2008, Francioso et al., 2007) uvádějí odlišné vlnočty absorpčních pásů různých funkčních skupin, proto tyty hodnoty jsou pouze přibližné. Jak je patrno z Obr. 29, Obr. 30, Obr. 31, spektra sledovaných transektů jsou podobná, to znamená, že huminové kyseliny z transektů Paličník, Smědavská hora a Vysoká mají velmi podobnou strukturu a obsahují podobné funkční skupiny. Ve všech třech případech lze nalézt široký pás kolem oblasti 3300 cm-1 až 3400 cm-1. Tento pás je charakteristický pro vazebné vibrace -OH skupin karboxylových kyselin, fenolů, alkoholů a vazebné vibrace N-H skupin aminů a amidů. Dále se u všech spekter vyskytuje širší pás slabší intenzity 3070 cm-1 až 3090 cm-1, který by mohl náležet vibracím aromatických C-H vazeb. Jak uvádí Senesi a Loffredo (1998), velmi malá intenzita tohoto pásu by mohla být dána zakrytím širším absorpčním pásem -OH skupin nebo by zde mohla probíhat substituce aromatických kruhů makromolekul huminových kyselin.
46
Tab. 12: Přibližné vlnočty absorpčních pásů půdních složek (Stevenson, 1994, He et al., 2008, Francioso et al., 2007)
Vlnočet (cm-1)
Složka Organická vazebné O-H vibrace karboxylových kyselin, fenolů a alkoholů N-H vibrace aminů a amidů vibrace aromatických C-H vazebné vibrace alifatických C-H vazeb vazebné C=O vibrace karboxylových kyselin, amidů, ketonů a solí karboxylových kyselin asymetrické COO- vibrace symetrické COO- vibrace aromatické C=C vazebné vibrace C-H asymetrické deformační vibrace -CH2- a - CH3vazebné C-O vibrace, deformační vibrace O-H v –COOH C-O vibrace polysacharidů
3500-3200 3400-3200 3150-3000 2970-2820 1750-1630 1650-1540 1450-1360 1600, 1512 1465-1440 1250-1200 1170-950
Anorganická Jílové minerály a oxidy O-H vazebné vibrace strukturního OH (stretching) O-H vazebné vibrace strukturního OH (bending) Si-O-Si vazebné vibrace Sorbovaná voda O-H vazebné vibrace (stretching) O-H vazebné vibrace (bending) Karbonáty Fosfáty Sulfáty
3750-3300 950-820 1200-970 3600-3300 1650-1620 1600-1300, 900-670 1300-850 600-550, 1200-1100 680-600
Dále se ve všech spektrech objevují výrazné ostré pásy při intenzitě kolem 2920 cm-1 a menší kolem 2840 - 2850 cm-1, které náleží symetrickým a asymetrickým vibracím C-H vazeb v CH2 a CH3 skupinách. U sledovaných transektů se nacházejí konkrétně v oblasti 2847 – 2849 cm-1 a mají výrazně slabší intenzitu u organických horizontů F a H než u minerálních horizontů, což je dobře vidět na Obr. 31 a Obr. 29. Dále lze pozorovat široký pás velmi slabé intenzity v oblasti 2620 cm-1 až 2630 cm-1, který přísluší O-H vazebným vibracím vodíkových vazeb (Bellamy, 1975), ten se nachází opět ve všech spektrech. U všech sledovaných transektů se také nachází další soubor úzkých pásů v oblasti kolem 1721 cm-1 odpovídající vazebným C=O vibracím -COOH skupin (Senesi a Loffredo, 1998, MacCarthy a Rice, 1985). Ostrý výrazný soubor píků nacházející se v oblasti při vlnové délce 1652 cm-1 a 1647 cm-1 je přednostně přiřazován vibracím aromatických C=C, korespondují však také s C=O vibracemi konjugovaných vazeb chinonů a ketonů a 47
C=O stretching vibracemi alkenů, mohou také ukazovat na přítomnost vnitřních vodíkových vazeb karbonylových skupin (Bellamy, 1975). Většinou jsou ovšem zastíněny vibracemi C=O amidů, nearomatických dvojných vazeb apod. Důležité pásy v oblasti 1540 a 1510 cm-1, které odpovídají vibracím aromatických C=C vazeb, deformačním vibracím N-H vazeb a vibracím C=N vazeb sloužící k určení stupně aromaticity jsou ve spektrech huminových kyselin méně intenzivní. Další pás kolem oblasti 1413 až 1420 cm1
náleží vibracím alifatických C-H skupin. U spekter z Paličníku a Smědavské hory se
vyskytují pásy kolem 1260 cm-1, které jsou u transektu Vysoká mírně posunuty do oblasti 1270 cm-1, korespondující s vibracemi C-O a deformačními vibracemi O-H skupin vazeb COOH skupin a vibracemi C-O aryletherů a fenolů. Pásy kolem vlnové délky 1100-1000 cm-1 jsou většinou přisuzovány vibracím polysacharidů a Si-O-Si vazebným vibracím (Stevenson a Goh, 1974). Pravděpodobnější ale je, že se jedná o příměs z pyrofosfátu, který vytváří organické komplexy s extrahovanými humusovými látkami a kovy a není zcela odstraněn při dialýze (Francioso et al., 1998).
Obr. 29: Průměrná spektra HK jednotlivých horizontů na Paličníku (KM – intenzita v jednotkách KubelkaMunk).
48
Pro hodnocení DRIFT spekter HK byly zjišťovány intenzity (aI) následujících pásů: alifatického CH2 a CH3 (2930 a 2850 cm-1), vztažených k základní linii nastavené od 3010 do 2820 cm-1, pásu aromatických C=C (1514 cm-1) vztaženému k základní linii od 1525 do 1495 cm-1, pásu karboxylových skupin (1729 cm-1) a také pásu chinonů (1670 cm-1) vztažených k základní linii od 1820 do 1560 cm-1 (Tab. 13). Intenzity těchto pásů byly zjišťovány pro výpočet:
indexu aromaticity Iar =
a poměru C=O =
aI2930aI2850
aI2930aI2850C C1514
intenzita C O1729
(Mládková et al., 2006)
(Mládková a Rohošková, 2007)
intenzita C O1670
Obr. 30: Průměrná spektra HK horizontu H a F na Vysoké (KM – intenzita v jednotkách Kubelka-Munk).
49
Obr. 31: Průměrná spektra HK jednotlivých horizontů na Smědavské hoře (KM – intenzita v jednotkách Kubelka-Munk).
Jak uvádí Mládková et al. (2006), vyšší hodnota Iar svědčí o vyšším zastoupení alifatické části huminových kyselin a naopak. Nižší hodnota poměru C=O svědčí o vyšším zastoupení chinonů a vyšší naopak o vyšším zastoupení C=O vazeb -COOH skupin, ketonů a aldehydů. Základní statistické parametry charakteristik DRIFT spekter huminových kyselin jsou uvedeny v Tab. 13.
Tab. 13: Základní statistické parametry sledovaných charakteristik DRIFT spekter HK pro výpočet indexu aromaticity
HK Smědava ukazatel průměr var.koef % sm. odchylka minimum maximum rozsah
al2930
al2850
al2930+al2850
C=C1514
Iar
C=O1729
C=O1670
poměr C=O
20,72
12,74
33,46
6,22
0,83
64,07
46,05
1,34
12,97
8,53
21,29
5,24
0,09
42,52
27,75
0,19
0,63
0,67
0,64
0,84
0,11
0,66
0,60
0,14
2,26
1,91
4,17
1,20
0,77
11,94
10,25
1,16
32,65
22,39
55,04
10,81
0,96
115,71
77,79
1,51
30,39
20,48
50,87
9,61
0,19
103,77
67,54
0,35
50
HK Paličník al2930+al2850 C=C1514
ukazatel
al2930
al2850
průměr var.koef % sm. odchylka minimum maximum rozsah
20,85
12,47
33,33
4,54
0,86
72,81
54,14
1,45
15,57
10,12
25,60
4,01
0,08
44,00
40,54
0,25
0,75
0,81
0,77
0,88
0,09
0,60
0,75
0,17
2,43
1,26
3,69
0,18
0,75
13,34
9,15
0,77
47,51
29,80
77,31
12,91
0,98
137,47
151,19
1,75
45,08
28,54
73,62
12,73
0,23
124,13
142,04
0,98
ukazatel
al2930
al2850
al2930+al2850
C=C1514
Iar
C=O1729
C=O1670
poměr C=O
průměr var.koef % sm. odchylka minimum maximum rozsah
25,35
17,40
42,75
12,49
0,79
84,61
51,58
1,64
8,24
6,26
14,31
7,89
0,08
15,74
8,70
0,18
0,33
0,36
0,33
0,63
0,10
0,19
0,17
0,11
16,75
9,30
26,05
1,69
0,72
61,51
40,68
1,51
38,90
27,23
66,13
25,47
0,94
102,37
62,71
1,98
22,15
17,93
40,08
23,78
0,22
40,86
22,03
0,47
Iar
C=O1729 C=O1670 poměr C=O
HK Vysoká
Hodnoty indexu aromaticity jsou u transektů Smědava a Paličník velmi podobné a naznačují vyšší podíl alifatické části ve struktuře studovaných huminových kyselin. Novohradský transekt Vysoká má hodnoty indexu aromaticky poněkud nižší oproti Jizerským horám, i když statisticky neprůkazně (Obr. 32). Nižší hodnoty Iar na transektu Vysoká mohou naznačovat souvislost s genetickým půdním typem, vzhledem k tomu, že na obou Jizerských transektech byly sondy určeny jako podzoly modální, kdežto na transektu Vysoká převládají kambizemě dystrické.
0,9
0,86
0,82
0,78
0,74 Iar PAL
Iar SME
Iar VYS
Obr. 32: Index aromaticity Iar pro jednotlivé transekty Paličník (PAL), Smědavská hora (SME) a Vysoká (VYS) („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
51
Poměr C=O je o něco vyšší u transektu Vysoká, což naznačuje vyšší zastoupení C=O vazeb karboxylových skupin, ketonů a aldehydů oproti zastoupení C=O vazeb chinonů. Statistickou analýzou nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl, jak ukazuje Obr. 33. 1,9
1,7
1,5
1,3
1,1 poměr C=O PAL
poměr C=O SME
poměr C=O VYS
Obr. 33: Poměry C=O pro jednotlivé transekty Paličník (PAL), Smědavská hora (SME) a Vysoká (VYS) („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
Dále bylo zkoumáno, zda je index aromaticity Iar a poměr C=O na sledovaných lokalitách ovlivněn porostem (buk/smrk) a horizontem. Pomocí analýzy rozptylu nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl podle typu porostu (Tab. 14). Ke stejnému závěru došli ve své práci i Mládková et al. (2006), kteří hodnotili rozdíly v Iar u smrkových a bukových porostů v Jizerských horách. Analýza rozptylu ale statisticky průkazně potvrdila, že v jednotlivých horizontech se Iar liší a to na transektu Paličník (Obr. 34) a Smědavská hora (Obr. 35), transekt Vysoká nebyl hodnocen z důvodu malého počtu dat z minerálních horizontů.
52
1,05 1,0 0,95 Iar 0,9 0,85 0,8 0,75 B
Ep horizont
F
H
Obr. 34:Vliv horizontu na index aromaticity Iar na transektu Paličník („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
1,05 1 0,95 Iar 0,9 0,85 0,8 0,75 B
Ep
F
H
horizont Obr. 35: Vliv horizontu na index aromaticity Iar na transektu Smědavské hora („x“ odpovídá aritmetickému průměru a chybové úsečky znázorňují 95% LSD interval).
Z Obr. 34, Obr. 35 vyplývá, že na obou transektech je obdobná situace. Látky s vyšším podílem aromatické složky zůstávají v organických horizontech, zatímco více alifatické složky migrují půdním profilem, což by souhlasilo s procesem podzolizace, kterým se půda na obou transektech vytvořila.
53
Tab. 14: Analýza rozptylu pro závislost Iar a poměru C=O na porostu a horizontu (P-hladina významnosti, Paličník (PAL), Smědavská hora (SME) a Vysoká (VYS)). Iar PAL
Iar SME
poměr C=O PAL
poměr C=O SME
poměr C=O VYS
horizont
P
0,03
0,04
0,44
0,67
0,68
porost
P
0,40
0,65
0,16
0,49
0,43
Pro další studium půdní organické hmoty by bylo vhodné zjistit intenzity následujících pásů: 1085 cm -1 (polysacharidy a jejich deriváty), 1277 cm -1 (karboxyly), 1424 cm -1 (CO a O-H vazby fenolů a alkoholů), 1460 cm -1 (alifatické C-H vazby), 1550 cm -1 (N-H vazby monosubstituovaných amidů), 1600 cm -1 (aromatické C=C vazby), 1675 cm-1 (chinony a ketony) a 1740 cm -1 (estery). Bohužel se tyto vazby většinou vyskytují v oblastech překrytých jinými pásy, proto jejich správné odečtení je složité, s podobným problémem se ve své práci potýkají i Mládková a Rohošková (2007), které uvádějí, že se původní nerozložený lignin chová při separaci huminových látek obdobně jako HK, tedy je rozpustný v alkáliích a vysráží se v kyselém prostředí, a předpokládají, že jeho spektrum má podobné polohy intenzivních pásů jako HK a tedy se ovlivňují. Pro zjištění závislostí parametrů DRIFT spekter Iar a C=O a stanovených půdních charakteristik byla provedena korelační analýza (Tab. 15). Na základě výsledků lze konstatovat, že index aromaticity koreloval záporně s celkovým množstvím organického uhlíku v půdě, kationtovou výměnnou kapacitou, a celkovým množstvím dusíku v půdě. Znamenalo by to tedy, že půdy s vyšším zastoupením aromatické části huminových kyselin (tedy jejich vyšším stupněm humifikace), mají vyšší zastoupení organického uhlíku, dusíku a vyšší kationtovou kapacitu. Dále lze vyvodit, že při vyšších hodnotách indexu aromaticity, by měla být méně kyselá půdní reakce. Přímá korelace byla také nalezena u C=O poměru a množstvím uhlíku, což by tedy znamenalo, že v půdách s vyšším zastoupením relativního množství karboxylových skupin, by měl být vyšší obsah humusu. Naopak nepřímá korelace byla nalezena u poměru C=O a půdní reakce. Z toho lze vyvodit, že půdy s větším podílem C=O vazeb karboxylových skupin než chinonových skupin mohou mít kyselejší půdní reakci. To by se dalo vysvětlit kyselým charakterem COOH skupin.
54
Tab. 15: Korelační tabulka půdních vlastností a vybraných charakteristik DRIFT spekter (*, průkazná korelace na hladině významnosti α=0,05;0,01;0,001). C% C%
**, ***
C/N
KVK
Iar
N%
pHH2O
pHKCl
poměr C=O
Q4/6
0,451*
0,690***
-0,625***
0,753***
-0,605***
-0,503*
0,760*
0,321
0,496*
-0,203
-0,181
-0,312
-0,265
0,075
0,611**
-0,450*
0,271
-0,747***
-0,734***
0,452*
0,327
-0,538**
0,427*
0,289
0,154
-0,253
-0,364
-0,282
-0,094
-0,098
0,646***
-0,371
-0,156
-0,485*
-0,224
C/N
0,451*
KVK
0,690***
0,496*
Iar
-0,625***
-0,203
-0,450*
N%
0,753***
-0,181
0,271
-0,538**
pHH2O
-0,605**
-0,312
-0,747***
0,427*
-0,364
pHKCl
-0,503*
-0,265
-0,734***
0,289
-0,282
0,646***
Poměr C=O
0,760*
0,075
0,452*
0,154
-0,094
-0,371
-0,485*
Q4/6
0,321
0,611**
0,327
-0,253
-0,098
-0,156
-0,224
0,038 0,038
5.5. Posouzení NMR spekter U vybraných vzorků huminových kyselin a fulvokyselin (z transektu Paličník vzorky číslo 20, 28, 21, 34, 37, 36, z transektu Smědavská hora číslo 61, 91 a z Vysoké číslo 3, 4, 5, 6) z horizontů F a H byly změřeny CP MAS
13
C NMR v pevné fázi (Obr. 36). Ta se ukázala
jako ne příliš vhodná pro fulvokyseliny z důvodu jejich velké hygroskopicity. V Tab. 16 jsou uvedeny oblasti chemických posunů
13
C NMR spekter, které vycházejí z prací
různých autorů (Garcia et al., 1991, Baldock et al., 1997, Conte et al., 2004, Bartoszek et al., 2008, Barančíková et al., 1997, Keeler et al., 2006, Malcom, 1990). Složení huminových kyselin bylo určeno podle relativní plochy signálů regionů chemického posunu (Tab. 17). Stupeň aromaticity byl vypočítán podle Barančíkové et al. (1997): ΣC arom. α= *100 (%). ΣC arom. ΣC alif.
Čím vyšší je hodnota α, tím více aromatických skupin obsahují huminové kyseliny, oproti indexu aromaticity Iar zjištěným pomocí DRIFT spekter, kde jeho vyšší hodnoty poukazují na vyšší zastoupení alifatické části.
55
Tab. 16: CP MAS 13C NMR chemický posun a odpovídající typ uhlíku dle různých autorů
Organická doména alkyl
O-alkyl
aryl karboxyl
Oblast chem. posunu (ppm)
alifatický uhlík (-CH3, -CH2) - biopolymery, proteiny methoxyl (-OCH3) C-O uhlovodíků, C-2, C-3, C-4,C-5 a C-6 nekrystalických součástí celulózy anomerický uhlík polysacharidů a C-1 uhlík celulozy nebo ligninu nesubstituovaný a alkyl substituovaný aromatický C, aromatické ligniny ligniny, fenoly, uhlík etherů nebo aminů uhlík v karboxylech v aromatických a alifatických skupinách, uhlík v amidických skupinách
56
0-45 45-64
0-108 Σ alif. uhlík
64-90
C alif. %
90-108 108-146 142-162 162-190
108-162 Σ aromatický uhlík C arom. %
Obr. 36: CPMAS 13C NMR spektra huminových kyselin
57
Obecně se dá říci, že všechna spektra HK poskytují signály s měnící se intenzitou a tvarem ve stejných nebo velice podobných oblastech chemického posunu. Ve všech spektrech huminových kyselin se nachází ostrý úzký signál výrazné intenzity v oblasti 045 ppm (s vrcholem v 30 ppm), který ukazuje, že se na alifatické struktuře HK podílejí především dlouhé řetězce mastných kyselin (Xiaoli et al., 2008). Signál v oblasti 56 ppm a 72 ppm, který je nejvíce intenzivní ve vzorcích VYS3 a HK91, náleží aromatickým methoxy skupinám a O-alkyl skupinám (Hatcher et al., 1980). Tvar signálu v 56 ppm může naznačovat vyšší obsah terciárních O-alkyl skupin a spojovacích řetězců uhlíku ligninu (Xiaoli et al., 2008), což by vypovídalo o tom, že se s HK skutečně část ligninu vyseparuje při extrakci. Spektrální rozsah v oblasti aromatických uhlíkových vazeb ukazuje na množství substituentů vázajících se na aromatické kruhy. Vrchol signálu v oblasti 130 ppm je způsoben aromatickými a nenasycenými vazbami, zatímco signál s vrcholem při 150 ppm, přísluší uhlíku vázanému na fenoly a další aromatické cykly substituované uhlíkem, kyslíkem nebo dusíkem. Vzhledem k tomu, že se ve spektrech vyskytují jak methoxy signály v oblasti 56 pmm tak fenolický signál v oblasti kolem 150 ppm, dá se předpokládat, že predominantní aromatickou strukturou HK byl lignin (Xiaoli et al., 2008). V oblasti karboxylového a karbonylového uhlíku signál v oblasti 172 ppm ukazuje vysoký obsah karboxylového uhlíku včetně karboxylových kyselin (Xiaoli et al., 2008) (Tab. 17). Tab. 17: Relativní intenzity (v % celkové plochy) pro 13C NMR signály HK % celkové plochy Vzorek/ppm
0-45
45-64
64-90
90-108
108-146
142-162
162-190
HK61
55,67
11,59
7,07
1,53
10,94
1,93
11,26
HK20
48,02
10,82
12,98
3,52
12,31
3,32
9,03
HK28
52,18
10,89
7,41
2,63
13,44
3,18
10,27
HK21
50,55
10,31
9,75
1,83
13,99
2,57
10,99
HK4
48,28
9,74
8,95
3,69
15,09
3,29
10,94
HK3
27,43
12,78
19,79
11,67
11,49
7,31
9,51
HK34
44,99
11,04
6,43
3,05
17,74
3,33
13,41
HK37
43,24
10,45
6,12
1,29
19,92
3,07
15,9
HK36
31,16
12,04
16,77
5,03
18,39
6,66
9,95
HK91
40,92
10,02
9,18
1,82
21,12
4,37
12,56
HK5
33,28
11,14
13,38
4,11
19,05
7,21
11,83
HK6
32,86
10,56
9,27
2,46
24,59
6,01
14,25
58
Jak uvádějí Schulten a Schnitzer (1995) důležitým kvalitativním parametrem získaným z 13
C NMR spekter je podíl aromatické a alifatické části huminových kyselin (Tab. 17).
Aromatická část huminových kyselin působí na stabilitu půdních agregátů a může významně ovlivňovat obsah a poutání živin a tím např. jejich KVK (Beyer et al., 1993). Dalším důležitým parametrem, který se dá zjistit z
13
C NMR spekter je stupeň
aromaticity α (Tab. 18). Nejvyšší stupeň aromaticity má vzorek HK6 (horizont H, půdní typ KAd), α = 35,69 % a nejnižší HK61 (horizont F, půdní typ PZm), α = 14,50 %. Barančíková et al. (1997), kteří ve své práci hodnotili půdy Slovenska, uvádějí pro KAd hodnotu stupně aromaticity o něco vyšší, α = 43,1 %, nicméně se jedná o orné půdy a neuvádějí, z jaké jsou nadmořské výšky. Znamená to, že v analyzovaných huminových kyselinách převládá alifatická část, což potvrzují i jejich DRIFT spektra, kde s nadmořskou výškou stoupá index aromaticity Iar (Obr. 39, Obr. 40; koef. korelace 0,67, P ‹ 0,01). Pokud porovnáme nadmořskou výšku a hodnoty α, zjistíme, že spolu velice dobře záporně korelují (koef. korelace je -0,85, P = 0,01; viz Obr. 38, Obr. 39). Znamená to, že se stoupající nadmořskou výškou klesá stupeň aromaticity huminových kyselin (Obr. 37).
Tab. 18: Relativní intenzity v % ligninového, alifatického, aromatického C, stupně aromaticity a procentického zastoupení ligninového C z celkového množství aromatického C (P) pro 13C NMR signály HK C lig. (%)
C alifat. (%)
C arom. (%)
stupeň arom. α (%)
P (%)
HK61
1,93
75,86
12,87
14,50
13,04
HK20
3,32
75,34
15,63
17,18
17,52
HK28
3,18
73,11
16,62
18,52
16,06
HK21
2,57
72,44
16,56
18,61
13,43
HK4
3,29
70,66
18,38
20,64
15,18
HK3
7,31
71,67
18,80
20,78
28,00
HK34
3,33
65,51
21,07
24,34
13,65
HK37
3,07
61,10
22,99
27,34
11,78
HK36
6,66
65,00
25,05
27,82
21,00
HK91
4,37
61,94
25,49
29,15
14,63
HK5
7,21
61,91
26,26
29,78
21,54
HK6
6,01
55,15
30,60
35,69
16,42
Vzorek
59
Další zajímavou informací, která se dá zjistit z
13
C NMR spekter, je procentické zastoupení
uhlíku aromatických ligninových vazeb z celkového množství uhlíku aromatických vazeb, značené jako P (%) (Gonet et al., 2008):
P
C lig.
Carom. Clig.
*100 (%)
Malé intenzity signálu v oblasti ligninového uhlíku ukazují na menší přítomnost nerozloženého ligninu a celulózy v struktuře huminových kyselin, které poukazují na jejich chemické stáří. Na základě zjištěných hodnot P, lze usuzovat, že organické horizonty analyzovaných půd vykazují obecně nižší stupeň humifikace.
40
1200
35
1000 800
25 20
600
15
400
metry nad mořem
stupeň aromaticity
30
10 200
5 0
0
stupeň aromaticity nadmořská výška (m)
číslo vzorku, horizont Obr. 37: Vliv nadmořské výšky na stupeň aromaticity α (%), HK - huminová kyselina, F a H nadložní horizonty
60
stupeň aromaticity
stupeň aromaticity = 69,8326 - 0,0559064*nadmořská výška 38 34 30 26 22 18 14 700
750
800
850
900
950
1000
nadmořská výška (m n. m.) Obr. 38: Vztah mezi nadmořskou výškou a stupněm aromaticity α (%).
Také Gonet et al., (2008) ve své práci hodnotí procentické zastoupení uhlíku aromatických ligninových vazeb z celkového množství uhlíku aromatických vazeb a došli k závěru, že huminové kyseliny nadložních organických horizontů lesních půd vykazují nižší stupeň humifikace než huminové kyseliny z hlubších vrstev. Toto srovnání se bohužel nedá ověřit,
1,2
1200
1,0
1000
0,8
800
0,6
600
0,4
400
0,2
200
0,0
0
metry nad mořem
stupeň aromaticity
z toho důvodu, že vzorky HK analyzovaných pomocí 13C NMR byly pouze z horizontů F a H.
index aromaticity nadmořská výška (m)
číslo vzorku, horizont Obr. 39: Vliv nadmořské výšky na index aromaticity Iar, HK - huminová kyselina, F a H nadložní horizonty
61
Iar = 0,39459 + 0,000568002*nadmořská výška 1 0,9
Iar
6 0,9 2 0,8 8 0,8 4
0,
8 0,7 6
70
75
0
0
80 85 90 95 nadmořská 0 0výška (m 0 n. m.) 0
Obr. 40: Vztah mezi nadmořskou výškou a indexem aromaticity Iar
62
100 0
6. Závěr V práci byl hodnocen vliv stanovištních faktorů na půdní organickou hmotu pomocí difúzně reflexní infračervené spektroskopie a
13
C CPMAS nukleární magnetické
rezonance. Dále byly porovnány metody frakcionace humusových látek a zjištěno a posouzeno množství C a N v jednotlivých frakcích. Jako zájmové území byly vybrány dva transekty v Jizerských horách (Paličník a Smědavská hora), které byly v minulosti silně zasaženy negativními vlivy lidské činnosti, a jako srovnávací lokalita byl vybrán transekt Vysoká v Novohradských horách, který byl v minulosti pouze slabě zasažen antropogenní činností. Frakcionace humusových látek na jednotlivé složky jako jsou huminové kyseliny, fulvokyseliny a humin, je možná různými extrakčními postupy. Nicméně všechny tyto postupy jsou založeny na rozdílné rozpustnosti humusových látek při různém pH. Proto by výsledky těchto metod měly být porovnatelné. V současné době je používáno mnoho extrakčních metod s různými modifikacemi, avšak způsob extrakce, případně další frakcionace a čištění humusových látek ovlivňuje výsledky dalších analýz. Pro frakcionaci humusových látek byly použity metoda dle Piccola et al. (2000) a metoda dle Podlešákové et al. (1992).
Podle metodiky Piccola et al. (2000) byly vyseparovány tři frakce
huminových látek, huminové kyseliny, fulvokyseliny a humin, podle metodiky Podlešákové et al. (1992) pouze dvě frakce, a to huminové kyseliny a fulvokyseliny. Pro zjištění množství uhlíku fulvokyselin a huminových kyselin byla podle metodiky Podlešákové et al. (1992) použita oxidimetrické stanovení. Zde se vyskytl problém, protože množství chromsírové směsi uvedené metodikou pro zoxidování organického uhlíku bylo nedostatečné a muselo se použít dvojnásobné i vyšší množství uvedené směsi. Bylo by proto vhodné obě metody ověřit např. na orné půdě, pro kterou se oxidimetrické stanovení uhlíku běžně používá. Pro hodnocení obou metod frakcionace byl použit poměr HK:FK, a to z toho důvodu, že metoda dle Podlešákové et al. (1992) neumožňuje oproti Piccolově et at. (2000) dočištění těchto frakcí. Pokud by se pro hodnocení použila například difúzně reflexní infračervená spektroskopie (která je v této práci použita dále), byly by důležité pásy vypovídající o vlastnostech jednotlivých frakcí překryty anorganickými a organickými nečistotami. Hodnoty poměru HK:FK se pohybovaly od 0,35 do 3,00, přičemž vyšší poměr HK:FK poukazuje na výraznou převahu huminových kyselin. To ovšem neodpovídá obecnému tvrzení o nekvalitním humusu lesních půd v kyselém půdním prostředí. Dalo by se to odůvodnit tím, že se s huminovými kyselinami 63
může vyseparovat i část nerozloženého ligninu, který se při separaci chová obdobně jako huminové kyseliny, je tedy rozpustný v alkáliích a vysráží se v kyselém prostředí. Při statistické analýze bylo zjištěno, že mezi oběma zvolenými metodami není statisticky významný rozdíl. Nicméně při porovnání hodnot rozptylů vyplývá, že metoda podle Piccola et al. (2000) má menší rozptyl a tím ji lze tedy považovat za přesnější. Ve všech frakcích huminových látek vyseparovaných podle metodiky Piccola et al. (2000) byl změřen obsah C a N a vypočítán poměr C/N. V huminových kyselinách bylo zjištěno nejvíce uhlíku na Vysoké, Paličník a Smědava vykazovaly obdobné hodnoty. Nejméně dusíku bylo v HK na Vysoké a nejvíce na Paličníku. Ve fulvokyselinách bylo nejvíce uhlíku na Smědavě a nejméně na Vysoké. Dusíku obsahovaly FK nejméně na Paličníku, přičemž na Smědavě a Vysoké bylo naměřeno podobné množství. Množství dusíku a uhlíku v HK se na jednotlivých transektech statisticky průkazně neliší. Množství uhlíku v HK mělo trend se se stoupající nadmořskou výškou zvyšovat. Vyšší nadmořské polohy vykazovali nižší zastoupení dusíku, což by mohlo souviset s vyšším množstvím srážek a následným vyplavováním dusíku půdním profilem. Bylo zjištěno, že poměr C/N se s rostoucí nadmořskou výškou zvyšuje (i když statisticky neprůkazně). Znamenalo by to, že huminové kyseliny z vyšších, vlhčích a chladnějších nadmořských výšek byly méně humifikované než z nižších, teplejších poloh. Větší obsah dusíku v HK byl zjištěn v bukových porostech (oproti smrku). Z naměřených DRIFT spekter vyextrahovaných humusových látek se pro hodnocení kvalitativních charakteristik organické hmoty jako nejvhodnější ukázala spektra huminových kyselin. DRIFT spektra fulvokyselin měla ve svých relativně širokých pásech zahrnuty méně výrazné pásy, které jsou z hlediska posouzení kvality důležité. DRIFT spektra huminu byla velmi podobná jako spektra HK, problém však byl s jeho nízkou výtěžností při extrakci a vysokou pravděpodobností kontaminace minerálním podílem. Huminové kyseliny z transektů Paličník, Smědavská hora a Vysoká mají velmi podobnou strukturu a obsahují podobné funkční skupiny. Rozdíl se projevil v intenzitě pásů v oblasti 2847 – 2849 cm-1, které mají výrazně slabší intenzitu u organických horizontů F a H než u minerálních horizontů. Pro další hodnocení DRIFT spekter byl použit index aromaticity Iar, který udává, jaké je zastoupení alifatické části z celkového množství uhlíku. Hodnoty indexu aromaticity jsou u transektů Smědavská hora a Paličník velmi podobné a naznačují vyšší podíl alifatické části ve struktuře studovaných huminových kyselin. Novohradský transekt Vysoká má hodnoty indexu aromaticky poněkud nižší oproti Jizerským horám, i když statisticky neprůkazně. Nižší hodnoty Iar na transektu Vysoká mohou naznačovat 64
souvislost s genetickým půdním typem, vzhledem k tomu, že na obou Jizerských transektech byly sondy určeny jako podzoly modální, kdežto na transektu Vysoká převládají kambizemě dystrické. Pomocí statistických metod nebylo zjištěno, že by výši Iar ovlivňoval druh porostu. Další charakteristikou, jež byla použita pro hodnocení DRIFT spekter, byl poměr C=O (poměr vazeb C=O karboxylových skupin a vazeb C=O chinonů). Tento poměr C=O je o něco vyšší u transektu Vysoká, což naznačuje vyšší zastoupení C=O vazeb -COOH skupin, ketonů a aldehydů oproti C=O vazeb chinonů. Statistickou analýzou nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl. Na základě výsledků korelační analýzy lze konstatovat, že index aromaticky koreloval záporně s celkovým množstvím organického uhlíku v půdě, kationtovou výměnnou kapacitou, a celkovým množstvím dusíku v půdě. Znamenalo by to tedy, že půdy s vyšším zastoupením aromatické části huminových kyselin (tedy jejich vyšším stupněm humifikace), mají vyšší zastoupení organického uhlíku, dusíku a vyšší kationtovou kapacitu. Nepřímá korelace byla nalezena u poměru C=O a půdní reakce. Z toho lze vyvodit, že půdy s větším podílem C=O vazeb karboxylových skupin než chinonových skupin mohou mít kyselejší půdní reakci. To by se dalo vysvětlit kyselým charakterem COOH skupin. Měření 13C CPMAS NMR spekter bylo provedeno na souboru vzorků z transektů Paličník, Smědavská hora a Vysoká a to pouze v organických horizontech F a H, které tvoří vrstvu nadložního humusu a mohou být tedy nejvýrazněji ovlivněny faktory, jako jsou srážky, opad nebo antropogenní acidifikace. Spektra huminových kyselin poskytovala signály s mírně se měnící intenzitou a tvarem ve stejných oblastech chemického posunu. Ve všech analyzovaných vzorcích huminových kyselin převládal uhlík alifatické části, což potvrzují nízké hodnoty stupně aromaticity α. Dále bylo zjištěno, že stupeň aromaticity koreloval s nadmořskou výškou. Znamená to tedy, že se stoupající výškou byly huminové kyseliny méně
aromatické,
měly vyšší
zastoupení
alifatické
části,
což
se
shoduje
s
výsledky difúzně reflexní infračervené spektroskopie, kde se stoupající nadmořskou výškou stoupaly hodnoty Iar. Dále bylo z
13
C NMR spekter vypočítáno procentické
zastoupení uhlíku aromatických ligninových vazeb z celkového množství uhlíku aromatických vazeb. Malé intenzity signálu v oblasti ligninového uhlíku ukazují na menší přítomnost nerozloženého ligninu a celulózy v struktuře huminových kyselin. Na základě množství uhlíku aromatických ligninových vazeb, lze usuzovat, že organické horizonty analyzovaných půd vykazují obecně nižší stupeň humifikace, což potvrzují i nižší hodnoty stupně aromaticity.
65
Infračervená spektroskopie stejně tak jako nukleární magnetická rezonance poskytují důležité informace z hlediska vlastností a kvality půdní organické hmoty, přičemž
13
C
CPMAS NMR metoda ukazuje informace velice podrobné, které by bylo vhodné do budoucna rozšířit i o vzorky z jednotlivých horizontů celých půdních profilů, včetně horizontů minerálních. Dále by bylo zajímavé použít
27
Al MAS NMR pro zjištění
relativního množství a vlastností hliníku přímo v jednotlivých frakcích huminových látek. Ze stanovištních faktorů se nejvíce projevila nadmořská výška, kde bylo prokázáno, že s jejím stoupáním klesá aromaticita huminových kyselin a klesá relativní množství dusíku v HK, což by mohlo naznačovat souvislost také s teplotou a úhrnem srážek. Porostem byl ovlivněn pouze obsah dusíku v huminových kyselinách pod bukovým porostem, což by bylo vhodné ověřit na větším množství vzorků přímo se zaměřením na tuto problematiku. Mezi transekty v Jizerských horách a transektem v Novohradských horách nebyly nalezeny žádné statisticky průkazné rozdíly, proto by se dalo usuzovat, že všechny tři transekty vykazují obdobné podmínky pro tvorbu a vlastnosti půdní organické hmoty ať již byly ovlivněny antropogenní nebo přirozenou acidifikací.
66
7. Literatura Albers, D., Migge, S., Schaefer, M., Scheu, S. (2004): Decomposition of beech leaves (Fagus sylvatica) and spruce needles (Picea abies) in pure and mixed stands of beech and spruce. Soil Biol. Biochem.36: 155-164. Aoyama, M., Angers, D. A., N'Dayegamiye, A. (1999): Particulate and mineral-associated organic matter in water-stable aggregates as affected by mineral fertilizer and manure applications. Canadian Journal of Soil Science, 79: 295-302. Baes, A., Bloom, P. R. (1989): Difuse reflectance and transmission Fourier transform infrared (DRIFT) spectroscopy of humic and fulvic acids. Soil Sci. Soc. Am. J. 53: 695-700. Baldock, J. A., Nelson, P. N. (2000): Soil Organic Matter. In: Sumner, M. E. (ed): Handbook of soil science, Soil Chemistry, Section B, CRC Press Book 1-71 s. Baldock, J. A., Oades, J. M., Nelson, P. N., Skene T. M., Golchin, A., Clarke, P. (1997): Assesing the extent of decomposition of natural organic materials using solid state 13
C-NMR spectroscopy. Aust. J. Soil Res., 35: 1061-1083.
Barančíková, G., Senesi, N., Brunetti, G. (1997): Chemical and spectroscopic characterization of humic acids isolated from different Slovak soil types. Geoderma, 78: 251 - 266. Bartoszek, M., Polak, J., Sulkowski, W. W. (2008): NMR study of the humification process during sewage sludge treatment. Chemosphere, 73: 1565-1470. Belčiková, N., P. (1972): Metody izučenia organičeskogo věščestva počvy. Organičeskoje věščestvo cellinych počv. Moskva, 224-233. Bellamy, J. (1975): The infrared spectra of complex molecules, 3rd ed., vol. 1. Chapman and Hall, London. Berg, B. (2000): Litter decomposition and organic matter turnover in northern forest soil. Forest Ecol. Management, 133: 13 – 20. Beyer, L., Schulten, H. R., Frőd, R., Irmler, U. (1993): Formation and properties of organic matter in a forest soil as repeale by its biological aktivity, wet chemici analysis, CP MAS
13
C-NMR spectroscopy and pyrolysis-field ionization mass
spectrometry. Soil Biol. Biochem. 25: 587-596. Borůvka, L., Mládková, L., Drábek, O. (2005): Factors of spatial distribution of forest floor characteristics in two areas with different anthropogenic inputs. In: Hůnová, I.,
67
Ostatnická, J., Dostálová, Z., Navrátil, T. (eds.): Acid Rain 2005, 7th International Conference on Acid Deposition, Prague, June 12-17, 2005. Conference Abstracts. ČHMÚ, Praha. 256 s. Brady, N. C., Weil, R.R. (1999): The nature and properties of soil. Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River. 881s. Brenner, J. M. (1950): Isolation of humic substances. J. Soil Sci. 1:198. Capriel, P. (1997): Hydrophobicity of organic matter in arable soils: influence of management. European J. Soil Sci., 48: 457-462. Capriel, P., Beck, T., Barchet, H., Gronholz, J., Zachman, G. (1995): Hydrophobicity of the organic matter in arable soils. Soil Biol. and Biochem., 27:1453-1458. Cerli, C., Celi, L., Kaiser, K., Guggenberger, G., Johansson, M. B., Cignetti, A., Zanini, E. (2008): Changes in humic substances along an age semence of Norway spruce stands planted on former agricultural land. Org. Geochem. 39: 1269-1280. Chaloupský, J. (1989): Geologický vývoj, Krkonošský národní park. Ed. B. Sýkora, Praha, SZN: 11 – 18. Chen, J. S., Chiu C. Y. (2003): Characterization of soil organic matter in different particle size fractions in humid subalpine soils by CP/MAS
13
C NMR. Geoderma, 117: 129-
141. Chenu, C., Le Bissonnais, Y., Arrouays, D. (2000): Organic matter influence on clay wettability and soil aggregate stability. Soil Science Society of America Journal, 64: 1479-1486. Conte, P., Spaccini, R., Piccolo, A. (2004): State of the art of CPMAS
13
C-NMR
spectroscopy applied to natural organic matter. Prog. Nucl. Manage. Reson. Spectrosc., 44: 215-223. Crestini, C.; Pastorini, A.; Tagliatesta, P. (2004): Metallophorphyrins immobilized on montmorillonite as biomimetic catalysts in the oxidation of lignin model compounds. J. Mol. Catal. A – Chem., 208: 195-202. Cui, F., Wijesekera, T., Dolphin, D., Farrel, R., Skerker. P. (1993): Biomimetic degradation of lignin. J. Biotechnol., 30: 15-26. De Paolis, F., Kukkonen, J. (1997): Binding of organic pollutants to humic and fulvic acids: Influence of pH and the structure of humic material. Chemosphere, 34: 16931704. Engebretson, R. R., von Wandruszka, R. (1997): The effect on molecular size on humic acid association. Org. Geochem., 27: 759-767. 68
Fisher, R. F., Binkley, D. (2000): Ecology and management of forest soils. John Wiley and sons, 3rd edition, USA, 490 p. Francioso, O., Ciavatta, C., Tugnoli, V., Sanchez-Cortez, S., Gessa, C. (1998): Spectroscopic characterization of pyrophosphate incorporation during extraction of peat humic acids. Soil. Sci. Soc. Am. J., 62: 181-187. Francioso, O., Ferrari, E., Saladini, M., Montecchio, D., Gioacchini, P., Ciavatta, C. (2007): TG-DTA, DRIFT and NMR chatacterisation of humic-like fractions from olive wastes and amended soil. J. Hazard. Mater., 149: 408-417. Francioso, O., Sànchez – Cortés S., Tugnoli, V., Ciavatta, C., Sitti, L., Gesta, C. (1996): Infrared, Raman, and nuclear magnetic resonance (1H,
13
C and
31
P) spectroscopy in
the study of fractions of pest humic acids. Appl. Spectrsc., 50: 1165-1174. Gaffney, J., Marley, N., Clark, S. (1996): Humic and Fulvic Acids: Isolation, Structure, and Environmental Role. American Chemical Society, Washington D. C. Garcia, C., Hernandez, T., Costa, F. (1991): Changes in carbon fractions during composting and maturation if organic Wales. Environ. Manage., 15: 433-439. Green, R. N., Trownbridge, R. L., Klinka, K. (1993): Towards a taxonomic classification of humus forms. Forest Science, 39, Monograph, 29: 49 p. Haberhauer, G., Gerzabek, M. H. (1999): DRIFT and transmission FT-IR spectroscopy of forest soils: an approach to determine docomposition processes of forest litter. Vib. Spectrosc., 19: 413-417. Haes, M. H. B., Clapp, C. E. (2001): Humic substances: consideration of composition, aspect of structure and environmental influences. Soil Sci., vol. 199, No 11: 723737. Hatcher, P. G., VanderHart, D. L., Earl, W. L. (1980): Use of solid-state
13
C NMR in
structural studies of HA and HU from Holocene sediments. Org. Geochem., 2: 8792. He, M., Shi, Y., S., Lin, Ch. (2008): Characterization of humic acids extracted from the sediments of the various rivers and lakes in China. J. of Environ. Sci., 20: 12941299. Hruška, J., Cienciala, E. (eds.) (2005): Dlouhodobá acidifikace a nutriční degradace lesních půd – limitující faktor současného lesnictví, druhé vydání, Česká geologická služba, Praha, 159 s. Hruška, J., Cienciala, E., Moravčík, P., Navrátil, T., Hofmeister, J. (2001): Dlouhodobá acidifikace a nutriční degradace lesních půd. Lesnická práce, roč. 80, č. 12. 69
Keeler, C., Kelly, E. F., Maciel, G. E.: (2006): Chemical – structural information from solid state
13
C NMR studies of a suite of humic materials from a lower montane
forest soil, Colorado, USA. Geoderma, 130: 124-140. Klouda P. (1996): Moderní analytické metody. Nakladatelství Pavel Klouda Ostrava, 209 s. Kononova, M. M. (1961): Soil organic matter. Its Nature, Its Role in Soil Formation in Soil and Fertility. Pergamon Press, New York. Kononova, M., M. (1963): Organičeskoje věščestvo počv. M. L., Izd. AV SSSR, Moskva. Lee, H. S., Kima, C. G., Yoon, T. I. (2003): Comment on ‘‘the interaction of humic substances with cationic polyelectrolytes’’. Wat. Res., 37: 715–716. Lu X. Q., Hanna J. V., Johnson, W. D. (2000): Source indicators of humic substances: an elemental composition, solid state
13
C CP/MAS NMR and Py-GC/MS study. Appl.
Geochem., 15: 1019-1033. Lubal, P., Široký, D., Fetsch, D., Havel, J. (1998): The acidobasic and complexation ions. Talanta, 47: 401-412. MacCarthy, P., Rice, J., A. (1985): Spectroscopics methods (other than NMR) for determining functionality in humic substances. In: Aiken G., R. et al. (eds.): Humic substances in soil, sediment and water. John Wilwy and Sons, Inc. New York. 527559. Machovič, V., Novák, F. (1998): Difúzně-reflexní infračervená spektroskopie půdních bitumenů z oblasti Šumavy, Chemické listy, 92: 151-156. Macků, J. (1996): Humus forms in the classification of forest soils, Lesnictví - Forestry, 42 (5): 221-228. Malcom, M. L. (1990): The uniqueness of humic substances in each soil, stream, and marine environments. Anal. Chim. Acta. 232: 19-30. Manahan, S. E. (2000): "FRONTMATTER" Environ. Chem. CRC Press LLC, Boca Raton. Martin, D., Srivastava, P. C., Ghosh, D., Zech, W. (1998): Characteristic of humic substances in cultivated and natural forest soils of Sikkim. Geoderma, 84: 345-362. Mládková, L. (2006): Určování poměru HK:FK u organických horizontů lesních půd s využitím lyofilizace. Závěrečná zpráva interního grantu č. IG 8/2005, Praha. Mládková, L., Borůvka, L., Drábek, O. (2004): Vztahy stanovištních faktorů a vybraných forem hliníku v horizontu O lesních půd Jizerských hor. Pedologické dny 2004, Sborník z konference na téma PEDODIVERZITA, ČZU, Praha: 192 s. 70
Mládková, L., Rohošková, M. (2007): Specifika studia huminových kyselin lesních půd a půd rekultivovaných výsypek. Sborník z konference ČPS a SPS, Rožnov pod Radhoštěm. Mládková, L., Rohošková, M., Borůvka, L. (2006): Methods for the assessment of humic substances quality in forest soils. Soil and Water Res. 1: 3-9. Němeček J., Macků J., Vokoun J., Vavříček D., Novák P. (2001): Taxonomický klasifikační systém půd České Republiky, Praha. 78 s. Piccolo, A., (1996): Humus and soil conservation. In: Piccolo, A., (Ed.) Humic Substances in Terrestrial Ecosystems, Elsevier, Amsterdam. 225–264. Piccolo, A., (2001): The supramolecular structure of humic substances. Soil Sci., 166: 810-832. Piccolo, A., Celano, G., Conte, P. (2000): Methods of isolation and characterization of humic substances to study their interactions with pesticides. Proceedings of conference Pesticide/Soil Interactions, Paris: 103-116. Podlešáková, E., Němeček, J., Sirový, V., Lhotský, J., Macurová, H., Ivánek, O., Bumerl, M., Hudcová, O., Voplakal, K., Hálová, G., Blahovec, F. (1992): Rozbory půd, vod a rostlin. VÚMOP, Praha. 259 s. Podrázský, V. (2001): Možnosti revitalizace lesních půd imisních oblastí. ČZU Praha: 56 s. Podrázský, V., Remeš, J. (2002): Dopad pěstování stanoviště nepůvodních dřevin na stav humusových forem v nivě Jalového potoka – černokostelecká oblast. In: Zprávy lesnického výzkumu. Sv. 47, č. 1/2002. VÚLHM Jíloviště-Strnady Pospíšil, F. (1980): Obsah a složení humusu v půdách Českých zemí. Studie ČSAV č. 14, Academia, Praha. Pospíšil, F. (1981): Group and fractional composition of the humus of different soils. In: Transactions of the Fifth International Soil Science Conference, Vol. 1. Research Institute for Soil Improvement, Prague: 135-138. Prado, A. G. S., Airoldi, C. (2003): Humic acid-divalent cation interactions. Thermochim. Acta, 405: 287-292. Prescott, C. E., Maynard, D. G., Laiho, R. (2000): Humus in northern forest: friend or foe? Forest Ecol. Manage. 133: 23-36. Puchalski, M. M., Morra, M. J., von Wandruszka, R. (1992): Fluorescence quenching of synthetic organic compounds by humic materials. Environ. Sci. Technol., 26: 17871792.
71
Remeš, M., Menšík, L., Fabiánek, T., Kulhavý, J., Drápelová, I. (2005): Srovnání humusových poměrů pod porosty s různou dřevinnou skladbou, III. Konference ČPS – Ochrana a využívání půdy v podhorských oblastech. Nové Hrady, Sborník z konference, Jihočeská univerzita, České Budějovice: 173-180. Rice, J. A., MacCarthy, P. (1989): Isolation of humin by liquid-liquid partitioning. Sci. Total. Environ. 81/82: 61-69. Rice, J. A., MacCarthy, P. (1985): Statistical avaluation of the elemental composition of humic substances. Org. Geochem. Vol. 17, Issue 5: 635-648. Šály, R. (1977): Lesnícke pôdoznalectvo. Zvolen: VŠLD, 2. vyd., 380 s. Schnitzer, M, Khan, S. U. (1972): Humic substances in the Environment. Marcel Dekker, New York. Schnitzer, M. (1971): Characterization of humic constituents by spectroscopy. In A. D. McLaren and Skujins (eds) Soil Biochem: 2, Marcel Dekker, New York. 60-95. Schulten, H. R., Schnitzer, M. (1995): Three-dimensional models for humic acids and soil organic matter. Naturwissenschaften. 82: 487-498. See, J. H., Bronk, D. A. (2005): Changes in C/N ratio and chemical structures of estuarine humic substances during aging. Marine Chem., 97: 334-346. Senesi, N., Loffredo, E. (1998): The chemistry of soil organic matter. In: Sparks, D.L. [ed.]: Soil physical chemistry. CRC Press LLC, 409 s. Simpson, A. J., Burdon, J., Graham, C. L., Hayes, M. H. B., Spencer, N. (2001): Interpretation of heteronuclear and multidimensional NMR spectroscopy of humic substances. Eur. J. Soil Sci., 52: 495-509. Sotáková, S. (1982): Organická hmota a úrodnosť pôdy, první vydání, Príroda, Bratislava, 234 s. Spaccini, R., Mbagwu, J. S. C., Conte, P., Piccolo, A. (2006): Changes of humic substances characteristics from forested to cultivated soils in Ethiopia. Geoderma, 132, 9-19. Spaccini, R., Piccolo, A., Haberhauer, G., Gerzabek, M. H. (2000): Transformation of organic matter from maize residues into labile and humic fractions of three European soils as revealed by
13
C distribution and CPMAS-NMR spectra. Eur. J.
Soil Sci., 51: 583–594. Sparks, D. J. (2003): Environmental Soil Chemistry. London: Academic Press, Second Edition, 352 pp. ISBN 0-12-656446-9.
72
Stevenson, F. J. (1994): Humus Chemistry: Genesis, composition, reactions, John Wiley and Sons, New York: 495 p. Stevenson, F. J., Goh, K. M. (1971): Infrared spectra of humic acids and related substances. Geochim. Cosmochim. Acta 35: 471-483. Stevenson, F.J.,Goh K.M.(1974): Infrared spectra of humic acids: Elimination of interference due to hygroscopic monture and structural ganges accompaying heathing with KBr. Soil. Sci. 117:34-41. Swift, R. S., Posner, A. M. (1972): Autooxidation of humic acids under alkalic conditions. J. Soil Sci. 23, 381 – 393. Ussiri, D. A. N., Johnson, Ch. E. (2003): Characterization of organic matter in a northern hardwood forest soil by
13
C NMR spectroscopy and chemical methods. Geoderma,
111: 123-149. Vacek, S., Vančura, K., Zingari, P. C., Jeník, J., Simon., Smejkal, J. (2003): Horské lesy České republiky, Ministerstvo zemědělství ČR: 315 s. Valla, M., Krištoufková, S. (1982): Extrakce humusových látek z půdy. Sborník Vysoké školy zemědělské v Praze, řada A, 36. Wershaw, R. L. (1986): A new model for humic materials and their interactions with hydrophobic organic chemicals in soil–water or sediment–water system. J. Contam. Hydrol., 1: 29-45. Wershaw, R. L. (1993): Model for humus in soils and sediments. Environ. Sci. Technol., 27: 814-816. Wollum, A. G. (1973): Characterization of the forest forest flor in stands along a moisture gradient in Southern New Mexico. Am. Soil. Sci. 37: 637-640. Xiaoli, Ch., Shimaoka, T., Qiang, G., Youcai, Z. (2008): Characterization of humic and fulvic acids extracted from landfill by elemental composition, 13C CP/MAS NMR and TMAH-Py-GC/MS. Waste Manage. 28: 896-903. Yates, L. M. III., Engebretson, R. R., Haakenson, T. J., von Wandruszka, R. (1997): Immobilization of aqueous pyrene by dissolved humic acid. Anal. Chim. Acta, 356: 295-300. Yariv S., Gross H. (2002): Organo-Clay Complexes and Interactions. Marcel Dekker, New York,: 344-461.
73
