Valódi és álhyperprolactinaemia Toldy Erzsébet Vas Megye és Szombathely MJV Markusovszky Kórháza Központi Laboratórium, PTE ETK DMI Gyakorlati Diagnosztikai Tanszék, Szombathelyi Képzési Központ Endokrin betegségek laboratóriumi diagnosztikája kötelezı, szinten tartó továbbképzés, Rendezı: PTE, OTK, LMI Pécs, 2009. október 5-8. Szervezık: Prof. Dr. Kovács L. G., Prof. Dr. Ludány Andrea
A prolactin (PRL) identifikálása ☯ 1933; Riddle O., Bate R. & Dyshorn S.: „The preparation, identification and assay of prolactin- a hormone of the anterior pituitary.” American Journal of Physiology, 105, 191-216.
☯ 1972; Hwang P., Guyda H. & Friesen H.: „Purification of human prolactin.” Journal of Biological Chemistry, 247, 1955-58.
A prolactin frakciók :hypophysaer forma I. • 199 aminosav • három diszulfid-híd • a monomer forma : free PRL -bioaktivitása a legnagyobb -a keringésben ez a domináns: 85% Prehormon: proteolysis 26 KDa
S
postranslatiós 23 KDa S
Glycosilatio (25%), S phosphorilatio
További 14, 16, 22 Kda-os proteolizált formák a keringésben
A prolactin cirkuláló formái Molekulatömeg (kD)
Rogol, Suh, Von Werder, Guyda, Kiefer, Fang, Gamier:
1974-1978
200 150
Inaktív Biológiai aktivitás
100 > 150
50 0
23
Little free, monomer
50
big
big-big, Macro-PRL
Arányeltolódás a prolactin frakciókban ☯ 1974; Rogol A.D & Rosen : Elsıként jelenti, hogy a keringésben domináló PRL forma a big PRL néhány hyperprolactinaemiás betegénél. J.of Clin. Endocrinol.and Metab. 38.
☯ 1981; Whittaker : Elsıként számol be arról, hogy relevans hyperprolactinaemiában, amikor a bbPRL volt domináns, betege a terhességet komplikáció mentesen viselte.
☯ 1982; Andersen et al: bbPRL: in vivo bioinaktív, in vitro bioaktív
☯ 1985; Jackson et al: Elıször használja a macroprolactin fogalmát. J. of Clin.Endocrinol.and Metab. 61. A felismerés >20 éves; Endokrin kézikönyv: 2001-csak említi
A cirkuláló PRL molekulaformák aránya megváltozik 85 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Átlag populáció, t-yperprolactinaemia
PRL frakciók %-os aránya
SZINONIMÁK
Ábra a
Macroprolactinaemia: BiokémiaiImmunreaktív- hyperprolacPseudoKempinski elıadásból tinaemia
20 2 10 5
23 little
50
big
>150 Kd a big-big
78
Analitikai probléma: a rutinban alkalmazott immunoassay módszerek eltérı foka Monomer PRL szint: 270 mU/L Roche Elecsys 1.gen Abbott Imx ABBOTT AxSYM J & J Amerlite Bayer Immuno-1 Wallac DELFIA DPC Immulite and 2000 Roche Enzymun és Elecsys2.g J & J Vitros ECI Roche Cobas Core Bayer (Chiron Centaur, ACS:180) Beckman Access Fahie-Wilson Clin. Chem. 2000.
0
PRL mU/L 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Macroprolactinaemia prevalenciája • Normál populációban - Nık:
~2,00 %
- Férfiak: ~0,02 % (Ichihara 1990 (Japán), Bjoro 1995 (Skandinávia))
• Hyperprolactinaemiában (reproduktív korú nık: 3%, sec. am. 15%)
21-26 % (Fahie-Wilson, Leslie, Bjoro, Smith, Strachan 1995-2003.) 36-46 % (Viera 1998, Hauche 2002)- válogatott minták. • Terhességben: 3- 8 % (Pascoe-Lira, 2001) • Gyermek és pubertás korban: kevés adat
Intraindividuális variációk, genetikus faktorok • 42 macroprolactinaemiás beteg nyomonkövetése 2-7 évig: intraindividuális variáció rendkívül széles (Vallette-Kasic et al 2002)
• A macroprolactinaemiások elsıfokú rokonai között : 10% -os gyakorisággal találtak nagyon magas bbPRL szintet- az eredményük egy valós, de gyenge családi társulást igazol. (Leite et al 1992)
Hazai adat: macroprolactinaemia gyakorisága 1 051 hyperprolactinaemiás (>700 mU/L) szérum
Macroprolactinaemia recovery: <40% 21-23% n=215
77-79%
Tényleges Hyperprolactinaemia recovery: >60%
(Toldy, Lıcsei, Góth, Szabolcs, Kovács GL. 2005)
Macroprolactinaemia és az életkor N=720 >45 év (n=105)
37%*
31-45 év (n=215)
23%* * p <0,001
16-30 év (n=400) 0%
14%
5%
10% 15% 20% 25% 30% 35% 40%
A macroprolactinaemia gyakorisága (Toldy, Lıcsei, Góth, Szabolcs, Kovács GL. 2005)
Összefüggés a macroprolactinaemia gyakorisága és a szérum összes PRL szintje között N=215
Gyakoriság (%)
60 50 40 30
Soong et al 1982: Hasonló megállapítást tett kiegészítve azzal, ezekben az esetekben a bromocriptin hatástalan, viszont a mellékhatás kifejezettebb
20 10 0
700-2000 2000-3000 3000-5000
>5000
Szérum összes PRL szintek mU/L Toldy, Lıcsei, Góth, Szabolcs, Kovács, 2004: Orv.Hetilap., 2005: Endocrine
A macroprolactin szerkezete 1.) PRL-IgG komplexek - macroprolactin molekula-IgG 150-170 KDa - gyakori forma: 24-86%
2.) Monomer PRL -aggregátumok - nem tartalmaznak IgG-t - ritkák: >170 KDa, - de lehet 200-600 KDa –glycosilált forma ? - a proteint kódoló gén DNS szekvenciáján nem találtak mutációt! (Carlson 1992, Hattori 1996.)
IgG
Az IgG tartalmú macroprolactin szerkezete IgG S S S
IgG
• Localisatiója:
S
IgG S S S S S IgG
-intravascularis, -CSF-ben nincs • Clearence: -csökkent
S S IgG
IgG S
Prolactin-autoantitest I. • Izotípusa: fıként IgG , de leírtak már IgM, IgA-izoformát is
• Szubtípusa: - heterogének, de pár estben csak IgG4-et igazoltak ⇒ krónikus Ag stimulusra utal. • komplexben foglalt monomer PRL : - serin -phosphorilált, és -dephosphorilált izoformák, - az acidikus isoform (dihidrogén phosphatot köt meg): krónikus antigen stimulusa kifejezettebb. (Hattori et al 2005.).
Prolactin-autoantitest II. • Nagyon alacsony affinitású: Ka= 3,2 ±4,2* 106 L/mol • Nagy kapacítású: - in vivo kevésbé disszociál, - in vitro az assay-ben használt Ab affinitása sokkal nagyobb a PRL auto-antitestnél !!! Eltérı antitesteket használó módszerek, eltérıen mérik a bbPRL-t
Prolactin-autoantitest III. • Hattori munkacsoportja korábbi (1992-97) közleményeikben leírják: - a PRL autoantitest assay függıen okoz pseudohyperprolactinaemiát, - ezt I-125-el jelölt PRL felvétellel igazolták. - Ugyanakkor hangsúlyozzák: nem minden esetben igaz az a hypothesis, hogy a bbPRL zömét a PRLAb komplex teszi ki!
PRL és autoimmunitás
• A PRL nem csak a hypophysisben, extrahypophyseálisan is pl. placenta) és az immunsejtekben is termelıdik. • Endokrin/parakrin PRL stimulálja az immunsejteket (Th1 és Th2) azáltal, hogy a PRL-receptoraikhoz kötıdnek. • Az autoimmun betegségekhez gyakran magas PRL szint társul. De Bellis A et al: Prolactin and autoimmunity.Pituitary, 2005, 8: 25-30)
Autoimmun betegségekmacroprolactinaemia összefüggései ☯ SLE-ben : -emelkedett PRL szintek és ezzel együtt különbözı autoantitestek (PRL-, Tg-, TPO-, RF-Ab) emelkedett szintjei mérhetık (Kramer C et al. 2005.) - SLE aktivitása és a PRL-Ab jelenléte között inverz korrelációt találtak (Garcia M et al Lupus, 2004: 13;)
-Terhes SLE-ésben a terhesség kimenetelére nézve prognostikus marker a bbPRL (LeandosMiranda et al Lupus, 2007, 16.)
☯ RA-ban (Ram S. et al.2004): : összes PRL ⇑ oka ⇒ szabad-PRL ⇑ nem a bbPRL! Magasabb PRL szintőeknek nagyobb a steroid dosis igényük (Rovensky et al. Clin. Endocrinol. 2009: 70). ☯ Immundeficiencia (Ram S. et al.2004): -HIV+ és HIV- csoport összes PRL szintje között nincs különbség, viszont a pozitív esetek szabad PRL szintje alacsonyabb ⇒ bbPRL ⇑
[Prolactin-autoantitest]-komplex • A komplexet összetartó erık: - nem kovalens kötés (Hattori et al. 1996-7, Carlson et al 1992) • Különbözı behatásokra adott válasz: - a többszöri lefagyasztásra és felengedésre rezisztens, de csak a szérumok és a nem túl nagy molekulatömegő bbPRL esetében , - a bb-PRL preparátumok, valamint a rendkívül nagy molekulatömegő bbPRL-aggregátumok nem!
A szérumban lévı proteinek jelenléte megvédik a molekulát a disszociációtól. Ok: eltérı kötések, eltérı ionerısség
A macroprolactin biológiai aktivitásának vizsgálata in vitro bioassay-vel (Nb2, lactogen aktivítás: Schepper et al EJE 2003;149:201-7 Összesen 50 macroprolactinaemiás szérumot vizsgáltak • PRL-IgG complex okozta macroprolactinaemia: - a lactogen activitás az immunoreactiv PRL szinttel szignifikáns korrelációt mutatott (r=0.64 p< 0.00001) • Az IgG nélküli PRL aggregátumok okozta macroprolactinaemiában: - a lactogen aktivítás: a kalkulált szabad PRL-el mutatott pozitív korrelációt. -Hattori N. et al. : In vitro Nb2-bioassay-ben a higítás miatt a disszociáció kifejezettebb (Clin. Endocrinol. 2008, 68)
A macroprolactinaemia klinikai validítása a kétféle macroprolactin között Schepper et al EJE 2003;149:201-7 50 hyperprolactinaemiás eset domináns macroprolactinaemiával • PRL-IgG komplex okozta hyperprolactinaemia (n=46) : idiopathiás hyperprolactinemia : 35 (76%)
• PRL aggregatum okozta hyperprolactinaemia (n=4) : 3-nak gyógyszer provokálta hyperprolactinemiája volt.
Vezetı klinikai tünetek elıfordulása p < 0.01
Frequency %
45 40 35 30 25 20
macroprolactinaemia tényleges hyperprolactinemia
p < 0.01
15 10 5 0
N.S.
Galactorrhea
Infertility
Amenorrhea
Morphologiai abnormalitások az MRI leletekben N=123 p<0.05 macroprolactinaemia
80
tényleges hyperprolactinemia
60
p<0.05
40 20 és Eg y
éb
el té r
a oa
ac r M
ic ro M
de no m
ad en om
iv
a
0 N eg at
Gyakoriság %
100
Macroprolactinaemiában a prolactin pulzatilis és diurnális ritmusa nem olyan kifejezett (Andersen 1982, Jackson 1985)
430 320 220
Vacsora
Elalvás Ébredés Reggeli
Monomer PRL molekula dominanciájakor:
PRL mU/L
550
Ebéd
110 0
12
18
24
06 h
PRL fiziológiás emelkedésével járó állapotokban: • A menstruációs ciklus folyamán: - Fraser, Larrea et al. (1989); középidıben ill. lutealis fázisban: összes PRL ⇑, big-big PRL ⇑
free PRL ⇑ - egyforma arány
• Terhesség - Whittaker 1981, Andersen et al. 1982; Az összes PRL ⇑ ⇑ ⇑ macroprolactinaemiában vs. free PRL ⇑ - Hattori et al 1996;
A trimesterek növekedtével a big-big PRL és a free PRL nı , de arányában a bb PRL ⇑ ⇑ A monomer PRL szint a terhesség során nem különbözik jelentısen azon terhesek értékétıl, akik macroprolactinaemiások.
• Szoptatás – Jackson 1985, Fraser 1989 összes PRL ⇑ ⇑ ⇑ (30‘ után: 2-szeres mU/L) , big-big PRL --, monomer PRL ⇑ ⇑ ⇑
Hyperprolactinaemiát okozó gyógyszerek hatására: a monomer PRL nı meg a bbPRL nem változik ☯ Neurolepticumok, Antiepileptikumok ☯ Antidepresszánsok ☯ Dopamin antagonisták ☯ Narcoticumok ☯ Antihypertensivumok (methyldopa, Ca2+ csatorna blokkolók pl. verapamil) ☯ Hormonok, hormon hatású szerek: E2, TRH, inzulin, cyprosteron acetát
Dopamin agonisták: bromocriptin hatás macroprolactinaemiában Egy egyszeri dosisra (2,5-5 mg) adott válasz macroprolactinaemiában - 5-6 óra múlva- csekély változás (Hattori: 1994, Bonhoff:1995) - monomer PRL ⇓ ⇓ (82%), bbPRL ⇓ (21%) Fraser et al (1989) Hosszabb ideig adott dosis: (Hattori: 1996, Heaney: 1999, Fabre 1997, Valette-Kasic , Olukoga 2002)
- eredmények következetesen csökkenést igazolnak a bbPRL-ben is, bár a csökkenés nem olyan kifejezett, mint a nem macroprolactinaemiások között. Fahie-Wilson et al Annals of Clin. Biochem. 2005; 42: 175-92
bbPRL-eliminálásának analitikai lehetıségei Gél diffúziós kromatográfia referencia módszer, de nem rutin
Protein A precipitációs módszer rutinban alkalmazható, 90%-os hatásfok
Polyethylene glycol (PEG) precipitáció rutinban jól alkalmazható, megfelelı cut-off mellett 100%-os hatásfok
Ultrafiltrációs módszer rutinban jól alkalmazható, 100%-os hatásfok, drága
PEG módszer korlátai : • nem quantitatív H2O
H2O
I S g S S S S G S S S
I g G
H2O
PE G
I g G
I g G
S S
I gS G
I g G
H 2O
PEG
I gS G
• nem specifikus precipitáció PEG
H 2O
• nem minden módszerhez használható (MEIA, ACS, Immulite)
H 2O
PE G
• csak az Ab-PRL komplexet csapja ki • nem tudjuk pontosan, a monomer PRL szintek referencia értékét
Nincs definiálva a PRL ref. tartománya a bbPRL meghatározása után: 169 PEG kezelt minta PRL lelete három módszerrel mérve normal
30
MPRL
tHPRL
30% 20%
ECMA-I
ECLMA-II
0% ECLMA-I EC LMA-II
C LMA
N=129
40%
10% 0
N=42
50%
N=55
5
60%
12 27
10
70% N=153
15
80%
15
20
N=71
90%
Distribution of cases %
Fequency of MPRL (%)
100% 25
C LMA
Nincs meghatározva a PEG kezelt mintákból mért PRL referencia tartománya
Visszanyerési százalék p<0,001 p<0,001 90 visszanyerési százalék
88 86 84 82 80 78 76 74 72 ECLMA I
ECLMA II
CLMA
A klinikai csoportok PRL átlagértékei a PEG kezelést követıen ECLMA I
ECLMA II
CLMA
**** ** **
HPRL valószínő
** **
n=70
HPRL nem valószínő
n=45 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
PEG kezelést követı PRL szintek **Szignifikánsabb (p<0,0001) magasabb PRL szintek a nagy klinikai valószínőségő csoportban
Következtetések • A PEG kezelést követı monomer PRL koncentrációk módszerfüggı különbsége jelentıs, hiszen terápiás konzekvenciája van. • Az eltérı módszerekkel mért biológiailag aktív PRL értékek harmonizálást igényelnek. • A gyártóknak a PRL szintek referencia tartományát a bbPRL eliminálását követıen is meg kellene határoznia.
Clinical data of women with simultaneous macroprolactinemia and true hyperprolactinaemia (8/59; 15%) Patient Age Clinical findings (y)
1 2 3 4 5 6 7 8
PRL in PRL after PEG PRL Pituitary MRI Drug treatment native serum precipitation recovery mIU/L mIU/L %
22 Raromenorrhea, 2838 breast discomfort 43 Regular menses, 2194 headache 54 Headache, prior 6153 uterus extirpation 28 Alopecia, hirsutism, 1652 infertility 28 Oligomenorrhea, 6006 infertility 24 Acne, alopecia, 2228 raromenorrhea 31 Raromenorrhea, 2000 galactorrhea 25 PCOS*, oligo1546 menorrhea *PCOS polycystic ovaries syndrome
1002
35
microadenoma
bromocriptine
570
26
microadenoma
bromocriptine
898
15
normal
bromocriptine
662
40
normal
bromocriptine
706
12
normal
estrogen
780
35
normal
estrogen
800
40
normal
estrogen
550
38
normal
none
A hyperprolactinaemia kivizsgálásának algoritmusa A PRL szint meghaladja a referencia tartományt PRL szint mérés, PEG kezelés után, a PRL szint és visszanyerési százalékának (PRL%) meghatározása
1.
A PEG kezelés után a PRL magas és a PRL% >50 Tényleges hyperprolactinaemia
>1000 mU/l
sella MR
700-1000 mU/l Fiziológiás és iatrogen tényezık kizárása után , ha a magas PRL szint többször elıfordul, MR elvégzése javasolt
2.
A PEG kezelés után a PRL magas és a PRL% <50
3.
Ha a PEG kezelés után a PRL normális és a PRL%: <50
Tényleges hyperprolactinaemia és macroprolactinaemia együttes elıfordulása >1000 mU/l
sella MR
700-1000 mU/l
Macroprolactinaemia Nincs teendı. (Autoimmun betegség fennállta mérlegelendı)
Fiziológiás és iatrogen tényezık kizárása után, ha a magas PRL szint többször elıfordul, MR elvégzése javasolt
(Endokrin Útmutató: 2008. Toldy E. és Lıcsei Z.)
Macroprolactinaemia összefüggése más hormonleletekkel • Hypothalamikus eredet:
• Macroprolactinaemia
Monomer PRL: ⇑⇑
Monomer PRL: norm.
Ösztradiol :
FSH, LH :
⇓
⇓ v. –
Ösztradiol :
⇑-
FSH, LH :
⇑-
bb PRL : ⇑⇑
Suliman et al 2003.
Saját tapasztalatunk Vas megyében 214 macroprolactinaemiás eset közül 32 beteg fölöslegesen részesült bromocriptin terápiában
Why is this clinically important problem still so little known 8-15 years after it was first described? Although were described several years ago: • 1974
The heterogeneity of PRL -Suh, Allolio, Jackson
•1992-95
The anti-PRL antibodies, big-big PRL -Suh, Allolio, Jackson
“one reason is that a number of relevant advances in this field have been published in specialised laboratory-journals” Fabio Cattaneo at al. Swiss Med. 2001.131.
Big Prolactin ? ☯ Sokkal kevesebbet tudunk róla,mint a bbPRL-rıl. ☯ Nem tisztázott: prohormon dimer? : PRL-protein komplex? 32 Kda binding proteinhez kötıdik 36%-a ☯ A big PRL jelenléte összefüggést mutat a bbPRL-el. ☯Eltér a bbPRL-tıl, mivel hı-stresszre monomer formává alakul
Big Prolactin? Triton et al 1998. – 4 esetismertetése • Hyperprolactinaemia klinikai jelei hiányoztak 3 esetben, amikor a big PRL volt a domináns (>70%) • A big PRL bioaktív in vitro bio-assay-ben. • Lisurid eltolja a big PRL → big-big PRL konverziót. • Lehetıség: a big-big PRL → big PRL keletkezik • Jelentettek már akromegáliás esetet, ahol a domináns frakció a big PRL volt.
Köszönet a megtisztelı figyelemért!
