Endofita baktériumok és enterális patogén baktériumok kolonizációja növényi szövetekben Maráz Anna, Füstös Zoltán, Belák Ágnes Budapesti Corvinus Egyetem Élelmiszertudományi Kar Mikrobiológia és Biotechnológia Tanszék
HUNGALIMENTARIA 2015. 04. 22.-23.
Endofita baktériumok • Növényi endoszimbionták • Befolyásolják a növény növekedését, vitalitását • Biotikus, abiotikus stresszel és patogénekkel szenbeni védelem
Egyes baktérium sejtalkotók és tulajdonságok szerepe az endofita-növény interakcióban
Recinhold-Hurek &Hurek (2011) Curr. Opin. Plant Biol. 14, 435 - 443
Különböző baktérium nemzetségekhez tartozó endofiták hatása
Ryan et al. (2008) FEMS Microbiol Lett;278:1-9
Endofiták kimutatása, izolálása „VALÓDI TENYÉSZTHETŐ ENDOFITÁK” • Felületi fertőtlenítést követően növényi szövetekből történt izolálás • baktériumok növényi szövetekben való jelenlétének/kolonizációjának mikroszkópos igazolása • Mikroszkópos igazolást megelőzően az izolátumok csak „FELTÉTELEZETT ENDOFITÁKNAK” tekintendők
Endofiták mikroszkópos kimutatása növényi szövetekben • GFP (Green fluorescent protein) vagy RFP (Red fluorescent protein) génjének klónozása a baktérium sejtben • FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) módszerrel: rRNS-hez hibridizáló fluoreszcens oligonukleotid próbák alkalmazása
Baktériumok jelölése a GFP vagy RFP riporter gének klónozásával
MBP-GFP hybrid fehérjét expresszáló E. coli
RFP-t expresszáló P. aeruginosa Singer et al., 2010
Feilmeier et al., 2000
Endofita-növény interakció: kolonizáció kimutatása fluoreszcens protein jelöléssel
Pseudomonas putida kolonizációja nyárfa tracheában
Pseudomonas putida kolonizációja borsó gyökér kortexben
Ryan et al. FEMS Microbiol Lett 2008;278:1-9
Endofita baktériumok: •Növényi endoszimbionták Frontiers in Microbiology, •Befolyásolják a növény növekedését, vitalitását (tápanyagok, fitohormonok, 2014. 5(148): 2. antibiotikumok, stb.) •Biotikus, abiotikus stresszel és patogénekkel szenbeni védelem •Fitoremediáció xenobiotikumok lebontása •Életmódjuk (Gaiero et al., Amer. Jour. of Bot. 2013, 100(9): 1740.) :
Baktérium kolóniák a saláta endorhizoszférájában.
– Obligát – Fakultatív – Passzív
•„VALÓDI TENYÉSZTHETŐ ENDOFITÁK” = felületileg fertőtlenített szövetekből izolált + baktériumok növényi szövetekben való jelenlétének mikroszkópos igazolása • Mikroszkópos igazolást megelőzően csak „FELTÉTELEZETT ENDOFITÁKNAK” tekintendők (Rhosenblueth & Martinez-Romero, The Amer. Phytopath. Soc. 2006, 9(8): 827.) •Valódi endofita jelleg igazolása: növényi szövetekvől való kimutatásuk mikroszkóposan – GFP vagy RFP jelöléssel – rRNS-hez hibridizáló fluoreszcens –oligonukleotid próbák Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)
A/
B/
Saláta rhizoszférájában (A) és endoszférájában (B) FISH módszerrel kimutatott és konfokális lézer szkennelő mikroszkóppal CLSM) vizsgált baktérium mikrokolóniák Berg et al., (2014) Frontiers in Microbiology, 5: 2
Újabb tudományos publikációk alapján: •Humán patogének bejutása a növényi szövetekbe járvány kitörések Endofiták ↔ patogének kölcsönhatása •humán patogének gátlása biokontroll törzsekként való alkalmazhatóságuk • humán patogének bejutásának segítése élelmiszer-biztonsági kockázat
Enterális patogének leveles zöldségekben: a kontamináció útjai
Martinez-Vaz et al., 2014
Leveles zöldségek és csírák fogyasztásához kapcsolódó, enterális baktériumok által okozott járványok 2006-2012 között
Baktérium törzs
Termék típusa
Év
Esetszám
Ország
Escherichia coli O157:H7
Spenót
2012
33
USA
E. coli O26
Lóhere csíra
2012
29
USA
E. coli O157:H7
Római saláta
2011
60
USA
E. coli O104
Görögszéna mag
2011
4,075
Salmonella enterica sv. Enteritidis
Lucerna csíra
2011
25
USA
E. coli O145
Saláta
2010
27
USA
S. enterica sv. Newport
Lucerna csíra
2010
44
USA
S. enterica sv. SaintPaul
Lucerna csíra
2009
228
USA
S. enterica sv. Bovismorbificas
Lucerna mag
2009
42
Finnország
E. coli O157:H7
Saláta
2007
50
Grönland, Hollandia
S. enterica sv. Stanley
Lucerna csíra
2007
44
Sédország
S. enterica sv. Weltevreden
Lucerna csíra
2007
45
Norvégia, Dánia, Finnország
E. coli O157:H7
Spenót
2006
205
USA
E. coli O157:H7
Saláta
2005
135
Svédország
Németo., Franciao., USA
Martinez-Vaz et al., 2014
Humán patogének megtelepedését és kolonizációját elősegítő molekuláris mechanizmusok
Rhizoszférához és filloszférához történő tapadás elősegítése felületi adhéziós faktorokkal és biofilm képzéssel (1. és 2. lépés) Növényekben való túlélés/szaporodás stresszválasz indukcióval és a fehérje szintézisben, energiaképzésben és metabolizmusban fontos gének alulszabályozása (3. lépés)
Martinez-Vaz et al., 2014
E. coli sejtek megtapadása friss salátaleveleken
Levél felületén megtapadó enteropatogén E. coli (EPEC) sejtek. Immunofluoreszcensen festett mikroszkópos kép. Piros E. coli sejtek, filamentumok (zöld).
Sztóma zárósejteken és a sztóma alatti üregekben megtapadó enteroaggregativ E. coli (EAEC) sejtek
Berger et al., (2010) Environ. Microbiol.,12:2385–2397
Patogének és endofiták kölcsönhatása salátalevélen
Zöld (GFP-vel jelölt) S. enterica sv. Montevideo sejtek aggregációja salátalevél felületén
A/ Zöld (GFP-vel jelölt) Erwinia herbicola és kék (CFP-vel jelölt) S. enterica sv. Montevideo sejtek ko-aggregációja salátalevél felületén B/ Elpusztiult (piros) S. enterica sejtek Egyes endofiták (pl. E. herbicola, Ps. syringae) védelmet nyújtottak a patogén számára, mások (pl. Ps. fluorescens) pedig negatív hatással volt! Pozza-Carionet al. (2013) Phytopathol. 103:341
Patogének (S. enterica, E. coli O157:H7) megtelepedése és bejutása lucerna csírába
E. coli O157:H7 mikrokolóniák (zöld) lucerna csírán (106- 108 sejt/g). 2-5 nap múlva 103- 106 sejt/g endofitaként szaporodott! Teplitski et al., 2009, Curr. Opinion Biotechn. 20:166
VBNC E. coli sejtek indukciója salátaleveleken
Stresszhatás vizsgálata E. coli O157:H7 törzsekkel (Dinu et al.,2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:8295) : •Szuboptimális hőmérsékleten (16 oC-on) jó szaporodás •Stresszelt körülmények között (8 oC-on) a populációk egyrésze VBNC állapotba került • Nagyobb sejtsűrűség esetén a VBNC sejtek aránya kisebb volt, mint kisebb sejtsűrűségnél •Csak VBNC sejteket tartalmazó populáció esetén a verotoxin termelés még 3 napig kimutatható volt.
GFP-vel jelölt E. coli O157:H7 A/ VBNC sejtek saláta levélen B/ Keresztmetszet, ami mutatja a sejtek felüle lokalizáltságát
Potenciális endofita baktériumok izolálása talaj- és vízkulturás Capsicum annum var. grossum HO és KPA fajtákból Vizsgált izolátumok száma Összesen
170
1. Gram +/-
101 Gram (-)
69 Gram (+)
2. Fenotípus
82 csoport
56 csoport
3. Molekuláris tipizálás
49 csoport
51 csoport
4. Identifikálás - biodiverzitás
Nemzetség/ek (izolátumok száma): Pseudomonas (17) Rhizobium (12) Stenotrophomonas (5) Leclercia (3) Enterobacter (2) Brevundimonas (1) Cedecea/Enterobacter/Leclercia (1) Chryseobacterium (1) Delftia (1) Deinococcus (1) Limnohabitans (1) Pantoea/Curtobacterium (1) Pantoea (1) Ochrobactrum (1) Cupriavidus (1)
Azonosítás: Pseudomonasok esetében rpoB gén alapján
Minden más esetben 16S rDNS alapján, az EzTaxon adatbázis segítségével
Nemzetség/ek (izolátumok száma): Bacillus (12) Microbacterium (9) Paenibacillus (5) Staphylococcus (5) Brevibacillus (4) Micrococcus (4) Curtobacterium (3) Kocuria (2) Rothia (2) Clavibacter (1) Cohnella (1) Leucobacter (1) Leifsonia (1) Lysinibacillus (1)
Paprika mag csírázási teszt Kontroll sp. Eredmények 23 Gram (-) Pseudomonas Pseudomonas sp. izolátum esetén Pseudomonas koreensis
Ezen határ alatt nagyvalószínűséggel már nem Endofita
Pseudomonas hunanensis Rhizobium sp. Pseudomonas brassicacearum Chryseobacterium hispalense Curtobacterium/Pantoea sp. Rhizobium sp. Leclercia adecarboxylata Pseudomonas sp. Enterobacter sp. Pseudomonas composti Pseudomonas sp. Brevundimonas sp. Enterobacter/Cedecea sp. Limnohabitans sp. Rhizobium sp. Pantoea brenneri Pseudomonas sp. Stenotrophomonas sp. Delftia sp. Cupriavidus campinensis
SE-PR-K-6 SE-PR-K-15 SE-PR-K-23 SE-PR-K-19 SEF-SR-K-3 SEF-PR-K-15 FP-BSK-K-1 FP-BBI-H-2 FP-BSK-K-3 SEF-PR-K-12 SEF-PR-K-8 SEF-PR-K-16 HP-BBI-K-3 SEF-L-H-4 FP-BTI-H-1 SEF-PR-K-4 SE-PR-H-9 SEF-PR-H-13 FP-BBI-H-3 SEF-PR-K-2 SE-PR-K-9 SE-PR-K-12 SE-PR-H-20
Erős stimulálás
159 144 138 123 117 115 114 112 111 Gyengébb 111 stimulálás 110 99 99 Neutrális 94 92 91 88 Enyhe 78 gátlás 77 73 59 Erős gátlás 49 43 Izolátumok 0
50
100
150
Kontrollhoz viszonyított csírázás (%)
200
70 86 Enterobacter spp. (2 darab) 98 Leclercia adecarboxylata SEF-PR-K-12 SEF-PR-K-7 SEF-PR-H-10 Cedecea/Enterobacter/Leclercia sp. SEF-PR-K-4 100 Pantoea brenneri FP-BBI-H-3 Pantoea/Curtobacterium sp. FP-BBI-H-2 Stenotrophomonas sp. SE-PR-K-9
Filogenetikai törzsfa
100 74 18
Cupriavidus campinensis SE-PR-H-20 Limnohabitans sp. SE-PR-H-9 100 100 Delftia sp. SE-PR-K-12 Pseudomonas composti HP-BBI-K-3
38 100
99 100 100
Stenotrophomonas rhizophila SE-SR-K-16 SE-PR-H-6 SE-PR-H-11 Stenotrophomonas sp. SE-PR-K-11 81 0.002
Pseudomonas spp. (17 darab)
72
67
Stenotrophomonas spp. (5 darab)
64
Deinococcus sp. SEF-SR-H-1 Brevundimonas sp. FP-BTI-H-1 Rhizobium sp. SEF-L-H-4 Rhizobium tibeticum SEF-SR-K-5 Rhizobium sp. SEF-SR-K-3 Ochrobactrum sp. FP-BBI-K-6
Pseudomonas sp. SE-PR-K-15 SE-PR-K-16 SE-L-H-1 Pseudomonas koreensis SE-PR-K-23 SE-PR-H-18 65 45
53 46
98 77
Rhizobium spp. (9 darab) 100 Cohnella ginsengisoli SE-SR-K-17 77 59 Paenibacillus sp. SEF-S-H-4 75 Paenibacillus sp. SEF-SR-K-1 98 Paenibacillus spp. (2 darab) 99 Paenibacillus chondroitinus SE-SR-K-1 Brevibacillus sp. SE-SR-K-14 SE-SR-K-2 SE-SR-K-13 SE-PR-K-13 Lysinibacillus halotolerans SE-SR-K-10 100 Staphylococcus spp. (5 darab)
74 72 82
Bacillus spp. (12 darab) 98 51 96
100
65
Pseudomonas koreensis SE-PR-K-29 SE-PR-H-2 Pseudomonas sp. SEF-PR-K-8
42 75
Pseudomonas sp. SE-PR-H-2
Pseudomonas brassicacearum subsp. neoaurantiaca SEF-PR-K-15
Pseudomonas sp. SE-PR-H-1-K Pseudomonas sp. SEF-PR-K-2
Bacillus aryabhattai SE-PR-H-5-1 SE-PR-K-27 SE-PR-K-7 SE-PR-K-24
75
Bacillus marisflavi SEF-L-K-1 Pseudomonas sp. SE-PR-K-6 SE-PR-H-1 Bacillus sp. SE-SR-K-8 SE-SR-K-5 SE-SR-K-3 SE-PR-H-8 Bacillus sp. S-K-S-2 Bacillus safensis SE-PR-K-19 SEF-L-H-1 Pseudomonas hunanensis 91 Bacillus sp. SE-L-K-1 100
Pseudomonas SE-PR-H-4
Rothia amarae SEF-S-K-10 0.005 Rothia tarrae SEF-S-K-2 0.005 Kocuria palustris SE-SR-K-6-K SE-SR-K-7-K Micrococcus yunnanensis SE-SR-K-2-K SE-SR-K-4-K SE-SR-K-1-K SEF-S-K-6 100 Curtobacterium spp. (3 darab) 84
84
Clavibacter sp. FP-BTI-K-2 Leucobacter tardus HP-BSK-H-1 Leifsonia sp. SEF-SR-K-2
56 Microbacterium spp. (9 darab) 88 99 Chryseobacterium hispalense FP-BSK-K-1 0.1
Pseudomonas protegens SE-S-K-2
Microbacterium sp. SEF-S-H-7 SEF-S-H-5 Microbacterium testaceum FP-BTI-K-1A FP-BTI-K-1 Microbacterium esteraromaticum SE-L-K-5 Microbacterium sp. HP-BBI-K-4 48 Microbacterium sp. HP-BSK-H-2 SEF-PR-H-9 SE-L-H-2
Színkódok: • Kiválasztott törzsek • Faji szinten azonosított törzsek • Potenciálisan új fajok 0.001
FISH TECHNIKA ALKALMAZÁSA Oligonucleotid PRÓBÁK Arb© szoftver Cél izolátum
Chryseobacterium hispalense Pseudomonas composti
Specifikus próbák Gram negatív izolátumokra Izolátum Próba kód név_pozició (E. coli-ban)
Szekvencia 5'-3’ (Hosszúság nukleotidban)
Fluorofor jelölés 5' végen
FP-BSK-K-1 Chryseo_643
TCAACCTCACTCAAGACACGCA (22)
Cyber 3
HP-BBI-K-3 Pseudo_828
GTACTCAAGGTACCCAACGGC (21)
Cyber 3 és Fluorescein
Általános próbák Legtöbb baktériumra (90%)
EUB338 I
GCTGCCTCCCGTAGGAGT (18)
Fluorescein
Planctomycetales (69%)
EUB338 II
GCAGCCACCCGTAGGTGT (18)
Fluorescein
Verrucomicrobiales (93%)
EUB338 III
GCTGCCACCCGTAGGTGT (18)
Fluorescein
Listeria és E. coli specifikus próbák Listeria spp., kivéve L. grayi
Lis-637
CACTCCAGTCTTCCAGTTTCC (21)
Listeria versengő
Lis-comp
CACTCCAGTCTCCCAGTTTCC
E. coli/ Shigella
Ec/Sh_453
GCAAAGGTATTAACTTTACTCCC (23) Fluorescein
(21)
Fluorescein -
Próbák specifikusságának vizsgálata színtenyészeteken • Specifikusság vizsgálata Chryseo_643-próbára, FA: 25% Chryseobacterium FP-BSK-K-1 sejtek EUBmix- Fl Chryseo_643- Cy3 E. coli sejtek Pseudomonas HP-BBI-K-3 sejtek EUBmixFl Chryseo_643- Cy3 EUBmix- Fl Chryseo_643- Cy3 Listeria monocytogenes sejtek EUBmixFl Pseudomonas fluorescens sejtek Pseudomonas mendocina sejtek Chryseo_643EUBmix-Cy3 Fl EUBmix- Fl Chryseo_643- Cy3 Chryseo_643- Cy3
Próbák optimalizálása és alkalmazhatósága színtenyészeteken • Specifikusság vizsgálata Pseudo_828-próbára, FA: 25%
Chryseobacterrium FP-BSK-K-1 sejtek EUBmix- Fl Pseudo_828 - Cy3
Pseudomonas HP-BBI-K-3 sejtek EUBmix- Fl Pseudo_828- Cy3
Pseudomonas fluorescens sejtek Listeria monocytogenes sejtek EUBmix- Fl EUBmix- Fl Pseudo_828 - Cy3 Pseudo_828 - Cy3
E. coli sejtek EUBmix- Fl Pseudo_828- Cy3
Pseudomonas mendocina sejtek EUBmix- Fl Pseudo_828 - Cy3
Chryseobacterium hispalense FP-BSK-K-1 vizsgálata növényi szövetben
108 sejt/ml
104 sejt/ml
FISH Chryseo_643 próba, CLFM alkalmazása
PCR-es MÓDSZEREK Specifikus primerek tervezése endofita izolátumokra és patogénekre Mega6© szoftver segítségével Cél izolátum/ baktérium
Forw. Primer Szekvencia 5'-3' név_poz.
Rev. Méret Primer Szekvencia 5'-3' (bp) név_poz.
Chryseobacterium Chr22F TGCGTGTCTTGAGTGAGGTTGA 22 sp. FP-BSK-K-1 (Chr643_revcomp) Pseudomonas sp. Pse393F GCCGTTGGGTACCTTGAGTA HP-BBI-K-3 (Mod_Pse828_revcomp) Listeria spp., kivéve L. grayi
27F (meglévő) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
E. coli/ Shigella
27F (meglévő) AGAGTTTGATCATGGCTCAG
20
20
Chr818R TACGGTCACCGACTTCAGGTAC
PCR Méret termék (bp) méret (bp) 22
797
20 Pse618R GCAGCACCTGTGTCTGAGTT
Lis659R CACTCCAGTCTTCCAGTTTC
226 20
659
(Mod_Lis-637) 20
Ec/Sh473 AAAGGTATTAACTTTACTCCCT 22 R (Mod_Ec/Sh_453)
466
Endofiták és patogének növénybe jutásának vizsgálata Paprikamag fertőzése baktérium szuszpenzióval
Csíráztatás
Növénynevelés hidrokultúrában
Kb. 30 cm-es növényből és tápfolyadékból mintvétel
Baktériumok kitenyésztése és kimutatása PCR-es és FISH módszerrel
A két Endofita és két „patogén” kimutatása a paprikából kitenyésztett baktériumokból I. Baktérium telepek izolálása a fertőtlenített palántákból és a tápfolyadékukból (89 telep)
II. Fenotípusos csoportosítás (10 fenocsoport)
III. RAPD-PCR két primerrel
EC/II/1/2 és NS/SZ/5/2
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
A munka az OTKA 101716 projekt támogatásával valósult meg.
