Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Telefon: +31.20.512.3599 Fax: +31.20.512.3570 E-mail:
[email protected] Honlap: www.sanquinreagents.com
M1551/ November 2007
ELISA PeliClass human IgG subclass kit
REF
M1551
A szérumban a humán IgG alosztályok kvantitatív meghatározására szolgáló ELISA készlet (hu)
Ab hu ellenes antitestek
DIL hu Hígítópuffer
RED hu Piros
WASH hu Mosópuffer
BLACK Fekete
GREEN Zöld
BUF
HRP
HUM
HRP
SEALS Öntapadós filmek
WELL
CONJ Konjugátum
STOP Leállítópuffer
SUB Alosztályok
12x8 12x8 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 50 mL 60 mL 5 mL 1.0 mL 0.5 mL 20 mL
MOU Egér
SUBS Szubsztrát
-
YELLOW Sárga
1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1 6
CONTROL Kontroll
H2O2 Hidrogén-peroxid
Humán
STOCK Törzsoldat
Cellák
REF M1800 M1801 M1802 M1803 M1804 M1805 M1806 M1808 M1810 M1809 M1807 -
CAL Kalibrátor
Puffer
Tartomány
ELISA PeliClass ELISA kit WELL a-IgG1, a-IgG2 RED BLACK WELL a-IgG3, a-IgG4 YELLOW GREEN CAL CONTROL HRP MOU Ab HUM IgG CONJ BUF WASH STOCK 1:20 BUF DIL STOCK 1:10 BUF SUBS STOCK 1:10 ABTS STOCK 1:50 H2O2 STOCK 1:100 BUF STOP SEALS
1
hu I. BEVEZETÉS A humán IgG immunglobulin négy alosztályból áll: IgG1, IgG2, IgG3 és IgG4. Az IgG alosztályok biokémiai jellemzői részletesen leírásra kerültek (1-5). Az IgG alosztályok közötti különbségek számos, biológiailag fontos funkció esetében megnyilvánulnak, mint például az antigénfelismerés, a komplementaktiváció és a sejtfelszíni receptorokhoz való kötődés. Számos tanulmány eredményei arra utalnak, hogy az IgG alosztályok kóros szérumszintjei különböző betegségekkel kapcsolatosak. Különösen a szelektív IgG2-alosztályhiány és a vírusos vagy bakteriális fertőzések iránti fokozott fogékonyság közötti kapcsolatot dokumentálták részletesen (4, 5). Visszatérő felső és alsó légúti fertőzésekben szenvedő betegek esetében alacsony szérum IgG2- vagy IgG3-koncentrációkról számoltak be. Mások összefüggést találtak a nagyon alacsony szérum IgG4-koncentrációk és a visszatérő szinopulmonális fertőzések között (6). Az IgG alosztály kóros szérumkoncentrációit figyelték meg autoimmun betegségekben, neurológiai kórképekben és HIV fertőzés esetén is (4). II. TECHNOLÓGIAI ALAPELVEK A PeliClass humán alosztály ELISA készlet „szendvics” típusú, enzimatikus immunoassay. A készlet az egyes humán IgG alosztályokra specifikus, nagyon aktív monoklonális antitestekkel bevont mikrocella-csíkokat tartalmaz. A tesztminták, valamint a kalibrátor és kontroll szérumok inkubációja a megfelelő cellákban történik. A meghatározandó IgG alosztály a szilárd fázishoz kötődik, a nem kötött IgG-t pedig mosással távolítják el a rendszerből. Ezután a cellákhoz peroxidázzal konjugált antihumán IgG antiszérumot adnak, a nem kötött konjugátumot pedig mosással távolítják el. Szubsztrátoldattal (ABTS) és H2O2-vel történő inkubációt követően a reakciót savas pufferrel állítják le. A zöld színű reakcióterméket az abszorbanciája alapján mérik, az IgG alosztály tesztmintában lévő koncentrációját pedig egy referenciagörbe értékeihez viszonyítva számítják ki. Az IgG alosztályhoz tartozó kontroll szérumot azért mérik, hogy ellenőrizzék a kalibrációs görbék validitását és az IgG-alosztály meghatározásainak pontosságát. A kalibrátor(ok)ban lévő IgG-alosztály koncentrációit a WHO 67/97 referenciakészítményből származó kalibrátor felhasználásával határozták meg. Az IgG1 esetében az 5,0 g/l-es, az IgG2 esetében a 2,6 g/l-es, az IgG3 esetében a 0,4 g/l-es, míg az IgG4 esetében a 0,5 g/l-es, javasolt célértékeket alkalmazták (7). III. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS A PeliClass humán alosztály ELISA készlet függőleges helyzetben, 2–8 °C-on tárolandó. A címkén látható lejárati dátumig használható fel. A felbontás utáni stabilitás 2–8 °C-on történő tárolás esetén minden komponensre vonatkozóan 1 hét. A szállítási körülmények eltérhetnek a tárolási körülményektől. IV. A KÉSZLET TARTALMA Lásd a terméktájékoztató elején található táblázatot. A PeliClass humán alosztály ELISA készlet minden alosztályra vonatkozóan 48 teszthez elegendő reagenst tartalmaz, beleértve a kalibrátorokat, a kontrollokat és a vak mintákat. A monoklonális antitesteket szövetkultúra-médiumból, oszlop-kromatográfia (ioncserés és affinitás-kromatográfia) segítségével tisztították. A kalibrátor és a kontroll folyékony humán szérum. V.
TOVÁBBI SZÜKSÉGES ANYAGOK A mosó-, hígító- és szubsztrátpufferek hígításához desztillált víz. A térfogatok pontos kiméréséhez pipettázó eszközök. Inkubátor (37 ± 2 °C). Standard ELISA mosó vagy 500 ml-es műanyag adagolópalack a csíkok automata vagy kézi mosásához. Standard ELISA leolvasó az abszorbancia méréséhez 414 vagy 405 nm-en. Logaritmikus-lineáris milliméterpapír.
VI. A TESZTMINTA KEZELÉSE Csak szérumminták tesztelhetők. A mintáknak a lehető legfrissebbeknek vagy fagyasztva tároltnak kell lenniük. A mintákat a használat előtt manuálisan hígítani kell (lásd a VII., AZ ASSAYPROTOKOLL című részt). VII. AZ ASSAY-PROTOKOLL Hagyja, hogy a reagensek felvegyék a szobahőmérsékletet (18–25 °C), és alaposan keverje fel őket. Kerülje a buborék- és habképződést. Javasoljuk, hogy minden mintát, kontrollt és kalibrátorhígítást két példányban teszteljen. 1. MIKROTITER LEMEZ A PeliClass humán IgG alosztály ELISA készlet flexibilitása lehetővé teszi, hogy a lemezek egyes részeit különböző alkalmakkor használhassák. A műanyag tasak kibontása előtt számolja ki, hogy hány csík szükséges a kívánt számú minta teszteléséhez, és adjon hozzá még 14 cellát a kalibrátorok, kontrollok és vak minták két példányban történő vizsgálatához. Vegye ki azokat a csíkokat a lemez keretéből, amelyeket nem fog használni, és csomagolja vissza őket a szárítószert tartalmazó műanyag tasakba, majd tárolja azt 2–8 °C-on. 2. A PUFFEREK ELŐKÉSZÍTÉSE Mosópuffer: Készítse elő a mosópuffert úgy, hogy a mosópuffer-koncentrátumot tartalmazó palackban található teljes mennyiséget 950 ml desztillált vízhez adja. A felhígított mosópuffer 2–8 °C-on tárolandó, és 1 hétig marad stabil. Megjegyzés: A koncentrált puffer sókristályokat tartalmazhat. A vizsgálathoz megfelelő koncentrációjú puffer elkészítése előtt GYORSAN melegítse föl a koncentrált puffert 37 °C-osra, hogy a kristályok feloldódjanak. Hígítópuffer: Számítsa ki a szükséges hígítópuffer mennyiségét (körülbelül 2 ml hígítatlan puffer mikrocella-csíkonként), és készítsen a teszteléshez megfelelő koncentrációjú oldatot a puffer tízszeres mennyiségű desztillált vízben történő felhígításával. 3. A KALIBRÁTOR ÉS KONTROLL SZÉRUMOK ELŐKÉSZÍTÉSE A koncentrációkat illetően lásd a mellékelt terméktájékoztató 2. és 3. táblázatát. Kalibrátor: (Lásd a mellékelt terméktájékoztató 1. táblázatát) Címkézzen fel egy 10 ml-es csövet az „1:500” felirattal, illetve nyolc 3 mles csövet a „Kal1-től Kal8-ig” terjedő feliratokkal. 2
Pipettázzon 4,99 ml hígítópuffert a 10 ml-es, csőbe és adjon hozzá 10 µl-nyi kalibrátorszérumot (kezdeti, 1:500 arányú hígítás). Pipettázzon 1,9 ml hígítópuffert a „Kal1” címkéjű csőbe, és 1,0-1,0 ml-t a „Kal2–Kal8” feliratú csövekbe. Pipettázzon 100 µl 1:500 hígítású kalibrátort a „Kal1” jelű csőbe, és ebből a csőből készítsen hét, kétszeres hígítási sort úgy, hogy az előző hígításból 1,0 ml-t a következő „Kal” csőbe pipettáz. Válassza ki az egyes IgG alosztályokhoz tartozó kalibrátorhígítási sort: IgG1 1:80 000 -1:1 280 000 IgG2, IgG3 és IgG4 1:10 000 -1:160 000. Kontroll: Címkézzen fel egy csövet az „1:500” felirattal, illetve két 3 ml-es csövet az „1:30 000” (az IgG2, 3, 4 esetében) és az „1:240 000” (az IgG1 esetében) feliratokkal. Az 1:500 címkéjű csőbe pipettázzon 4,99 ml hígítópuffert és 10 µl kontroll szérumot. Az 1:30 000 címkéjű csőbe pipettázzon 885 µl hígítópuffert és 15 µl, 1:500 arányú hígított oldatot. Az 1:240 000 címkéjű csőbe pipettázzon 875 µl hígítópuffert és 125 µl, 1:30 000 arányú hígított oldatot. Készítsen el egy 3 ml-es csövet 1 ml hígítópufferrel vak mintának. 4. A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE Hígítsa fel a tesztmintákat a hígítópufferrel a kontroll szérum esetében alkalmazott protokoll szerint. A megadott tartományokon (lásd a mellékelt terméktájékoztató 1. táblázatát) kívül eső eredmények esetében a tesztet meg kell ismételni egy másik hígítású mintával. 5. ELSŐ MOSÁSI LÉPÉS A szükséges mikrocellákat mossa le négyszer a lemezkeretben a mosópufferrel. Kézi mosás esetén teljesen töltse fel a cellákat mosópufferrel (> 300 µl), majd öntse ki, és ismételje meg ezt az eljárást háromszor. Végül a celláknak teljesen üresnek kell lenniük. A következő reagenst azonnal a cellákba kell adagolni; ne hagyja, hogy szárazon álljanak hosszabb ideig. 6. ELSŐ INKUBÁLÁSI LÉPÉS Adjon 100 µl hígított kalibrátort, kontrollt, mintát és vak mintát a megfelelő cellákba. Fedje be a mikrotiter lemezt öntapadós filmmel, majd finoman rázza össze a széle ütögetésével néhány másodpercig, hogy a cellák tartalma összekeveredjen. 1 óráig inkubálja 37 °C-on. Közvetlenül a mosás előtt készítse el a következő inkubációs reagenst a 8. pontban leírtak szerint. 7. MÁSODIK MOSÁSI LÉPÉS Szívja le a felülúszót a cellákból, és mossa meg a lemezt az 5. pontban leírtak szerint. 8. INKUBÁLÁS HRP-KONJUGÁLT, HUMÁN IgG-ELLENES ANTITESTTEL Hígítsa fel a konjugátumot 1:500 arányban úgy, hogy 30 µl konjugátumot 14,97 ml hígítópufferhez pipettáz. Hígítsa tovább a konjugátumot: 1:3000 arányban úgy, hogy az 1:500 hígítású oldatból 1,2 ml-t 6,0 ml hígítópufferhez pipettáz. 1:2000 arányban úgy, hogy az 1:500 hígítású oldatból 2,0 ml-t 6,0 ml hígítópufferhez pipettáz. 1:1000 arányban úgy, hogy az 1:500 hígítású oldatból 3,5 ml-t 3,5 ml hígítópufferhez pipettáz. Adjon: az 1:500 hígítású oldatból 100 µl-t az anti-IgG1 mikrocella-csíkokhoz; az 1:3000 hígítású oldatból 100 µl-t az anti-IgG2 mikrocella-csíkokhoz; az 1:2000 hígítású oldatból 100 µl-t az anti-IgG3 mikrocella-csíkokhoz; az 1:1000 hígítású oldatból 100 µl-t az anti-IgG4 mikrocella-csíkokhoz. Fedje be a lemezt öntapadós filmmel, majd finoman rázza össze a széle ütögetésével néhány másodpercig, hogy a cellák tartalma összekeveredjen. 1 óráig inkubálja 37 °C-on. Közvetlenül a mosás előtt készítse el a következő inkubációs reagenst a 10. pontban leírtak szerint. 9. HARMADIK MOSÁSI LÉPÉS Szívja le a felülúszót a cellákból, és mossa meg a lemezt az 5. pontban leírtak szerint. 10. INKUBÁLÁS ABTS-SZUBSZTRÁTTAL Számítsa ki a szubsztrátoldat kívánt mennyiségét (mikrocella-csíkonként körülbelül 0,9 ml szükséges). Adjon 200 µl hidrogén-peroxid törzsoldattal és 400 µl ABTS törzsoldattal ekvivalens mennyiséget 20 ml-nyi, a teszteléshez megfelelő koncentrációjú szubsztrátpufferhez (2 ml szubsztrát törzsoldat + 18 ml desztillált víz). Adagoljon 100 µl szubsztrátoldatot az összes cellába. Finoman rázza össze a mikrotiter lemezt a széle ütögetésével néhány másodpercig, hogy a cellák tartalma összekeveredjen. Inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten (18–25 °C). 11. AZ ENZIMATIKUS REAKCIÓ LEÁLLÍTÁSA Adjon 50 µl leállítóoldatot az összes cellába. 12. A LEMEZ LEOLVASÁSA 1 órán belül olvassa le a lemezt ELISA leolvasóval (lehetőség szerint) 414 vagy 405 nm-en. VIII. EREDMÉNYEK ÉS AZ ADATOK ÉRTELMEZÉSE Jegyezze fel az egyes cellákhoz tartozó, (lehetőség szerint) 414 vagy 405 nm-en mért abszorbanciaértékeket, a kettős mérések értékeinek pedig vegye az átlagát. Minden minta esetében a kettős mérések értékei nem különbözhetnek 15%-nál nagyobb mértékben az átlagértéktől. Ha ez a feltétel nem teljesül, meg kell ismételni a tesztelést. Ábrázolja a kalibrátorok átlagos abszorbanciaértékeit (y tengely) a hozzájuk tartozó alosztály-koncentrációk (ng/ml-ben, x tengely) függvényében logaritmikus-lineáris milliméterpapíron, és rajzolja be a legjobban illeszkedő görbét. A kontroll szérum IgG-alosztály-koncentrációinak a mellékelt terméktájékoztató 3. táblázatában megadott tartomány(ok)on belül kell esniük. Az egyes minták átlagos abszorbanciaértékeit vigye át a referenciagörbére. Azokat a mintákat, amelyekhez tartozó átlagos abszorbanciaértékek kívül esnek a referenciagörbe hígításain, megfelelően fel kell hígítani. A tesztmintában talált IgG-alosztály-koncentráció értékeléséhez hasonlítsa össze a kapott koncentrációkat az IgG alosztályok normálértékeivel (lásd a X. REFERENCIATARTOMÁNYOK című részt). IX. MÉRÉSI TARTOMÁNYOK A készletspecifikus mérési tartományokkal kapcsolatban tájékozódjon a mellékelt terméktájékoztató 1. táblázatából.
3
X. REFERENCIATARTOMÁNYOK Az IgG alosztályok referenciatartományai (g/l) egészséges, kaukázusi rasszba tartozó egyének szérummintáiban (8). A többi populáció esetében külön referenciatartományokat kell figyelembe venni. Életkor 0 1 4 6 1 1½ 2 3 4 6 9 12 >
XI. a
b
1 4 6 12 1½ 2 3 4 6 9 12 18 18
hónap hónap hónap hónap év év év év év év év év év
IgG1 2,4 – 10,6 1,8 – 6,7 1,8 – 7,0 2,0 – 7,7 2,5 – 8,2 2,9 – 8,5 3,2 – 9,0 3,5 – 9,4 3,7 – 10,0 4,0 – 10,8 4,0 – 11,5 3,7 – 12,8 4,9 – 11,4
IgG2 0,87 – 4,1 0,38 – 2,1 0,34 – 2,1 0,34 – 2,3 0,38 – 2,4 0,45 – 2,6 0,52 – 2,8 0,63 – 3,0 0,72 – 3,4 0,85 – 4,1 0,98 – 4,8 1,06 – 6,1 1,50 – 6,4
IgG3 0,14 – 0,55 0,14 – 0,70 0,15 – 0,80 0,15 – 0,97 0,15 – 1,07 0,15 – 1,13 0,14 – 1,20 0,13 – 1,26 0,13 – 1,33 0,13 – 1,42 0,15 – 1,49 0,18 – 1,63 0,20 – 1,10
IgG4 0,04 – 0,56 <0,03 – 0,36 <0,03 – 0,23 <0,03 – 0,43 <0,03 – 0,62 <0,03 – 0,79 <0,03 – 1,06 <0,03 – 1,27 <0,03 – 1,58 <0,03 – 1,89 0,03 – 2,10 0,04 – 2,30 0,08 – 1,40
SPECIFIKUS TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK Reprodukálhatóság IgG-alosztály-koncentráció
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
assayen belüli variabilitás (%)
4
3
4
2
assayek közötti variabilitás (%)
2
2
7
7
A PeliClass humán IgG-alosztálykészlet összehasonlítása a Mancini tesztkészlettel. A szérumok IgG1-, IgG2-, IgG3- és IgG4-koncentrációit ELISA assayjel határozták meg, és összehasonlították a Mancini teszt esetében kapott megfelelő értékekkel. A következő korrelációkat állapították meg: IgG alosztály
lineáris regressziós egyenes
korreláció
IgG1
Y = 0,90X – 0,29
0,97
IgG2
Y = 1,01X – 0,17
0,93
IgG3
Y = 0,91X + 0,00
0,99
IgG4
Y = 0,96X – 0,03
0,98
Megjegyzés: A teszt specifikus teljesítményjellemzői esetében bemutatott értékek tipikus eredményeket reprezentálnak, és nem tekinthetők a készlet esetében jellemző értékeknek. XII. KORLÁTOZÁSOK 1. A felhasználónak megfelelő képzésben kell részesülnie, és ismernie kell az ELISA assayeket és teszteljárásokat. 2. Nagymértékben hemolizált vagy lipémiás mintákat nem szabad használni. A reumafaktort vagy egyéb keringő immunkomplexeket tartalmazó, illetve magas bilirubin-koncentrációjú minták esetében váratlan eredmények születhetnek. Ezeket a mintákat más módszerrel kell analizálni. 3. A – például paraproteinek miatt – tartományon kívül eső értékű minták mérését meg kell ismételni különböző hígításokkal. 4. Az IgG alosztályok egyikének alacsony koncentrációjára vonatkozó lelet sohasem elegendő a pontos diagnózis felállításához, hanem az immunrendszer működésének zavarára utaló jelként kell értékelni, ami további kivizsgálást igényel. 5. Mindig kell kontroll szérumot is használni, a kalibrációs görbék validitásának ellenőrzéséhez. Ha a kontroll eredménye a tartományon kívül esik, a tesztminták eredményei nem megbízhatóak. A tesztet meg kell ismételni. 6. A különböző sarzsokból származó reagensek nem cserélhetők fel egymással. 7. A reagensmaradékokat (pl. a holttérfogatban lévő mennyiséget) nem szabad összekeverni a frissen kinyitott fiolák tartalmával. 8. A kupakok és a fiolák nem cserélhetők össze. A kupakokat csak a megfelelő fiolára szabad visszahelyezni. 9. Annak ellenére, hogy a humán kalibrátor és kontroll szérumokat az EU GMP irányelvei szerint megvizsgálták és nem reaktívnak találták specifikus, betegségterjesztő ágensek markereire vonatkozóan, minden humán eredetű komponenst potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. 10. Tartósítószer: Thiomersal® 0,001%. 11. A keresztkontamináció elkerülése érdekében az ELISA eljárás minden inkubálási/fixálási lépése során új öntapadós filmet kell használni a lemezeken. Ne használjon alumíniumfóliát. 12. A keresztkontamináció elkerülése érdekében az anyagok minden átvitele során eldobható pipettahegyeket kell használni. 13. A készlet használatakor minden alkalommal friss hígításokat kell készíteni a kalibrátorokból, a konjugátumból és a pufferekből. 14. Ne használjon a készlethez mellékelttől eltérő reagenseket és mikrotiter-csíkokat. 15. A nátrium-azid inaktiválja a HRP-t, ezért ne használjon nátriumazid-tartalmú oldatokat, és ne adjon nátrium-azidot a biztosított pufferekhez. 16. A hulladékok ártalmatlanításának a laboratóriumi előírásoknak megfelelően kell történnie.
4
XIII. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
IRODALOMJEGYZÉK Shakib, F. (Editor), Monograph in Allergy, Karger A.G., 19 (1986). Shakib, F. (Editor), The human IgG subclass, Pergamon Press (1990). Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8:26 (1989). Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 81:357 (1990). Hamilton, R.C., Clin. Chem., 33:1707 (1987). Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., 124:94 (1981). Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 150 119 (1985) Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 52:561-67 (1994).
5
