Elektroforéza protein séra a mo e, imunofixace
Sérum Poznámky: Podle elektroforeogramu, p i m ení IgG (IgA, IgM) a albuminu lze pom rn esn ode íst denzitu dvou protein – albuminu (zóna albuminu) a IgG (zóna gama). V ostatních frakcích se na jejich denzit podílí minimáln dva a více protein . V t chto zónách neodlišíme asto ani isolovaný pokles/vzestup které z bílkovin. Proto je zapot ebí považovat elfo bílkovin pouze za orienta ní vyšet ení, které v ad p ípad klinickým nárok m nemusí sta it, avšak lze pomocí n j spolehliv odhadovat základní atypie celého systému. Elektroforeogramy je zapot ebí v praxi hodnotit vždy vizuáln ; jako výsledek by l léka dostávat poize popis nálezu. Denzitometrické vyšet ení není p íliš ínosné. Za fyziologických okolností tvo í 11 plasmatických protein 8 z etelných zón, další dva proteiny se uplat ují na zm nách interzón mezi albuminem a alfa1, resp. beta1 a beta2. Vzorek se aplikuje do oblasti startu, který je umíst n za místem migrace gama globulin . Vzorek migruje od katody k anod .
1
Spektrum protein v jednotlivých frakcích Frakce
Složky ve frakci
Orienta ní koncentrace
Albumin
Albumin
40 g/l
A1AT ApoA1 ORM A1ACHT
1,5 g/l 1,3 g/l 1,0 g/l 0,5 g/l
A2MG HP CRPL
1,5-10g/l 1,5 g/l 0,3 g/l
Alfa 1
Alfa 2
2
Alfa2-Beta1 interzona ( zbarveni )
hemoglobinhaptoglobinovými komplexy ( p i hemolýze )
Beta 1
TRF
Beta1-Beta2 interzona ( zbarveni )
IgA
Beta 2
ApoB C3 C4
1,2 g/l 1,2 g/l 0,3 g/l
Gama
IgG IgM CRP
12 g/l 1,5 g/l 0,005 g/l
2,5 g/l
i koncentraci > 4,0 g/l
Bližší popis jednotlivých zón: 1) zóna prealbuminu: za fyziologických okolností nebývá patrná, spíše ji vidíme i prohlížení pod šikmým úhlem. a) Zvýšení: katabolismus triglycerid – ethylismus, DM 1 dekomp b) Pokles: porucha proteosyntézy v játrech 2) zóna albuminu: zm ny koncentrace 35-45 g/l neovlivní denzitu zóny, patrné oslabení zóny (zúžení) nacházíme p i poklesu < 30g/l a) Zvýšení: anodické zneost ení a roztažení (viz dále) b) Pokles: dlouhodobý katabolismus (14 a více dn ), ztráty albuminu ledvinami a GIT c) Anodické zneost ení: vazba albuminu s bilirubinem nebo léky nebo MK. Také vliv alfa lipoproteidu (HDL) d) Bisalbuminemie: v míst albuminu jsou z etelné dv ostré linie (jde o rozdvojení albuminové zóny) – genetická determinace 3) interzóna albumin-alfa1: slabé fyziologické zbarvení je podmín no alfa1 lipoproteiny (tedy p edevším HDL). a) Zvýšení: zvýšení HDL, zvýšení orosomukoidu> 2g/l, zvýšení AFP > 1g/l b) Anodické zneost ení alfa1: katabolismus lipid nap . p i abuzu alkoholu i DM 1 dekomp. 4) alfa1: zahrnuje p edevším A1AT, který zásadn ovliv uje denzitu této zóny a) Zvýšení: akutní zán t, estrogeny, gravidita b) Pokles: katabolismus, porucha proteosyntézy. Genetická variabilita se projeví vymizením zóny a zm nou její pohyblivosti. P i nízké denzit alfa1 a nízké hodnot A1AT by m la být provedena fenotypizace A1AT. 5) interzóna Alfa1-alfa2: u zdravých je v celém rozsahu slab homogenní zbarvena a) Zvýšení: akutní zán ty, gravidita (p edevším díky zvýšení alfa1 antichymotrypsinu a Gc globulinu). Homogenní zbarvení mohou také vyvolat komplexy lehkých monoklonálních et zc s albuminem a pA 6) alfa2: denzitu ovliv ují alfa2 makroglobulin a haptoglobin. Koncentrace alfa2 makroglobulinu se m ní s v kem (v pubert 2-3x roste, po 20. roku života klesá k hodnotám v d tství). a) Zvýšení: u d tí vliv alfa2 makroglobuminu (anodické zneost ení alfa2), akutní zán t i zát ž – zvýšení haptoglobinu Hemolýza – navíc ješt zneost ení alfa2-beta1 (vliv Hb-hapto komplexu) b) Pokles: hemolýza 7) interzona alfa2-beta1: barví se slab a) Zvýšení: hemolýza (Hb-hapto komplexy), migrace monoklonálních Ig všech t íd nebo volných et zc obou antigenních typ 8) beta1: hlavní bílkovinou je transferin. Hemopexin se nebarví anionickými barvivy a jeho koncentrace beta1 neovliv uje. 3
a) Zvýšení: vzestup transferinu, zvýšení vazebné kapacity Fe. Pokud se sérum dlouho skladuje migruje na anodický okraj transferinu C3 složka a klesá beta2. V p ípad vysoké koncentrace volného Hb (>1g/l - hemolýza) dojde k zesílení beta1 a zd razn ní její anodické strany. Další p inou jsou monoklonální lehké et zce – paraprotein, n kdy i paraprotein IgA. Další p inou je zvýšení betalipoprotein (LDL, VLDL). b) Pokles: katabolismus, genetické varianty transferinu (vzácné, zóna se obvykle rozd lí) 9) interzóna beta1-beta2: homogenní zbarvení bývá podmín no IgA. Kdekoliv v této zón m že být typická precipita ní linie beta lipoprotein . a) Zvýšení: zvýšení beta lipoprotein (LDL, VLDL), zvýšení IgA> 4-4,5 g/l 10)beta2: vytvá í typicky C3 složka komplementu. a) Zvýšení: kdy u obstruk ního oktetu b) Pokles: imunkomplexové choroby skladování vzork 2-3 dny p i pokojové teplot (migruje k beta1 transferinu) 11) zóna fibrinogenu: migruje p ed katodickou ástí zóny beta2 (tedy mezi beta2 a gama) a) Zvýšení: zán t b) Pokles: fibrinolýza, DIC 12)gama: anodickou ást ovliv ují IgG3, IgG4, katodickou ást ovliv ují IgG1, IgG2. Zóna by m la být homogenní. IgA se na barv zóny prakticky nepodílí. IgM migruje ke startu. a) Zvýšení: rozší ení zóny v obou sm rech, typické je pro zvýšení IgG (> 13-14 g/l, spolehliv > 18g/l), nebo polyklonální IgM (vyjíme , pouze p i hodnotách > 5g/l – jeví se jako nehomogenní závoj v oblasti startu). Samostatné zvýšení IgA se projeví v interzón beta1-beta2. Další p nou je zvýšení CRP (>0,5 g/l) nebo zvýšení myoglobinu b) Pokles: p edevším snížení IgG c) Mikroheterogenita: kolik subfrakcí na hranici rozlišovací schopnosti. inou jsou nap . p i lokalizaci v katodické ásti CIKy, další p inou že být oligoklonální syntéza protilátek (na anodické i katodické stran ), nebo polymery imumoglobulin (nap . kryoproteinemie) 13) Paraproteiny: nej ast jší jsou IgG, migrují od alfa2 až ke gama. a) IgG: vytvá ejí oboustrann dob e ohrani ené zóny, migrují od alfa2 ke gama. b) IgA: nej ast ji se vyskytují v interzón beta1-beta2. Bývají heterogenní s neostrými okraji. Projeví se asto sytým zbarvením interzóny beta1beta2 nebo zneost ením p ilehlých zón. 4
c) IgM: nej ast ji v oblasti startu, vytvá ejí ostré zóny d) IgD: jsou vzácné, vytvá ení zóny v oblasti jako IgM.
5
Mo Spektrum protein v jednotlivých frakcích Elfo frakce
evažující složka ve frakci
Albumin
Albumin
Alfa 1
A1AT ORM
Alfa 2
Beta 1
Beta1-Beta2 interzona
A2MG A2ZnGP A2HSGp
TRF Hb volný
Význam Selektivní gl.proteinurie p i absenci dalších
Zán tlivá onemocn ní (A2ZnGP, A2HSGp – interzona alfa1-alfa2) Neselektivní proteinurie (spole s albuminem) Tubulární proteinurie (bez albuminu, asto trf, B2M, C3) Neselektivní nebo st edn selektivní proteinurie hematurie Tubulární proteinurie (není ale podmínkou)
B2M
C3
Neselektivní proteinurie (není podmínkou)
Beta 2
Gama
IgG cystatin C
Neselektivní glomerulární proteinurie Tubulární proteinurie
kolik úvodních poznámek a základní interpretace: Citlivé barvicí metody umožní vyšet ovat mo bez zahušt ní (C-B-B). 1) albumin: asto je na anodickém okraji zneost en a protažen, nízké koncentrace se projevují jako úzké zóny. 6
a) zvýšení: mikroalbuminurie, albuminurie 2) interzóna albumin-alfa1: dominantní je orosomukoid. V mo i je dob e barvitelný. 3) alfa1: jde p edevším o A1AT. Zóna je ale na obou stranách zneost ena orosomukoidem. 4) interzóna alfa1-alfa2: u zán tlivých onemocn ní nacházíme v této interzón etelnou homogenní zónu (alfa2-Zn- glykoprotein., alfa2-Hs-glykoprotein) a. Zvýšení: zán tlivá onemocn ní 5) alfa2: u selektivních proteinurií je nález chudý. U neselektivních je z etelný (podobá se séru). U tubulárních proteinurií nacházíme 2 zony alfa2 mikroglobulin . a. Zvýšení: neselektivní proteinurie (spole s albuminem), tubulární proteinurie (bez albuminu) b. Snížení: selektivní proteinurie (pouze albumin 6) beta1: transferin je nej ast ji jedinou významnou bílkovinou. P i masivní hematurii je beta1 zvýšena díky volnému Hb. a) Zvýšení: transferinurie (neselektivní proteinurie), hematurie 7) interzóna beta1-beta2: u tubulárních proteinurií nacházíme B2M (nep ítomnost ale nevylu uje tento typ proteinurie – vliv bakterií a nízkého pH mo e). a) Zvýšení: tubulární proteinurie 8) beta2: tšinou pouze vliv C3. a. Zvýšení: neselektivní proteinurie (nemusí být pravidlem, v mo i dochází k rozpadu C3) 9) gama: stejný tvar jako v séru má tato zóna pouze v p ípad neselektivních glomerulárních proteinurií (zónu vytvá í IgG). Na konci zony se n kdy objevuje linie cystatinu C (katoda), která spole s alfa-1-MG a B2M sv í pro tubulární proteinurii. a. Zvýšení: neselektivní proteinurie, tubulární proteinurie 10) paraproteinurie: a. B-J bílkovina: atypická linie kdekoliv od alfa1 až ke katodickému konci (event. dv linie, které odpovídají monomeru a dimeru) b. i paraproteinemiích IgG, IgA, IgM, IgD obvykle zona, odpovídající séru chybí
7
Postup p i identifikaci paraproteinu: Úvod: Monoklonální gamapatie: skupina chorob, která je typická proliferací B bun k lymfocyt , který produkuje elektroforeticky a imunologicky homogenní (monoklonální) protein (M komponentu). Monoklonální paraprotein je tvo en 2 t žkými et zci 1 t ídy a 1 podt ídy a 2 lehkými et zci 1 antigenního typu. lení: lení laboratorní: 1) paraproteiny tvo ené lehkými i t žkými et zci: a. IgA-kappa, IgA-lambda, b. IgG-kappa, IgG-lambda, c. IgM-kappa, IgM-lambda, d. IgD-kappa, IgD-lambda, e. IgE-kappa, IgE-lambda 2) monomery IgM 3) paraprotein tvo ený ½ molekuly IgG 4) paraprotein tvo ený pouze lehkým i et zci kappa nebo lambda 5) paraprotein tvo ený pouze t žkými et zci gama, alfa, mí nebo delta Nejvíce myelom je IgG – 65%, poté IgA – 20%, myelomy pouze s lehkými et zci kappa a lambda tvo í asi 15%, IgD tvo í asi 0,5-1%, bilkonální MM se vyskytuje v 13%. U 80% nemocných s MM jsou v mo i lehké et zce kappa nebo lambda (B-J protein).
lení klinické: 1) paraprotein maligní (MMG) a. nej ast jší je mydlím, incidence 3-4/100000, tvo í 1% všech malignit, na hematologických malignitách se podílí 15%, v 90% se vyskytuje jako mnoho etný mydlím, ve 3% jako solitární, ve 4% jako extramedulární plasmocytom, ve 2% jako leukemická varianta b. m. Waldenstrom c. maligní lymfom d. CLL e. Choroby t žkých et zc f. Amloidoza prim. i sek. 2) paraprotein nejasného významu (MGUS) a. incidence se zvyšuje s v kem, nad 50 let je výskyt asi 1%, nad 70 let asi 5%, nad 80 let i 10% b. koncentrace IgG<30 g/l, IgA<20g/l, exkrece lehkých et zc v mo i/24 hod je < 0,5g/24 hod, plasmocyty ve d eni< 10% c. paraproteiny mohou být i p echodné d. MGUS je pot eba kontrolovat 2-4x ro Laboratorní pr kaz: Používá se elfo na agaróze nebo acetátcelulóze, umožní kvantifikovat i M gradienty<0,25-1g/l.
8
Zásady: 1) p i elektroforéze nejsme obvykle schopni odlišit paraproteiny v oblasti alfa2beta 2) proto je zapot ebí p i podez ení na paraprotein provést p ímo imunofixaci (A,G,M,K,L) – tzv. IF Penta 3) pro kvantifikaci paraproteinu je jednozna doporu ováno denzitometrické vyšet ení, p i lokalizaci v oblasti alfa2-beta je však výsledek významn zkreslen jinými proteiny 4) v t chto p ípadech je nezbytná kvantifikace pomocí imunoturbidimetrie. Bohužel je problém s kalibrátory a diagnostickými soupravami – nemusí v bec monoklon bílkovin zachytit). 5) V celém pr hu monitorování pacienta je zapot ebí používat stejnou (jednu) metodu 6) P i koncentraci paraproteinu v séru > 60 g/l je zapot ebí provést ed ní 1/1 FR 1/1 7) Pokud nalezneme v mo i/séru pouze linii kappa/lambda musíme vždy provést následnou fixaci s protilátkami IgE/IgD. 8) Mo by m la být zahušt ná nebo speciální barvení
Metodika platná pro Nemocnici Prost jov 1) pokud léka vyžaduje paraprotein provedeme ihned imunofixaci. V elektroforéze totiž nemusí být PP z etelný 2) pokud je hodnotícím pracovníkem OLM vysloveno podez ení na PP je autmaticky provedena imunofixace a stanovení kappa a lambda free 3) k imunofixaci se snažíme získat i mo a kontaktujeme ihned indikujícího léka e 4) imunofixace se rutinn provádí s antiséry IgG, IgA, IgM, kappa, lambda (sérum i mo , mo nezahuš ujeme, barvení CBB) 5) v p ípad , že je IF negativní s IgG, A nebo M, ale pozitivní s kappa i lambda provedeme ihned fixaci s IgE a IgD. 6) Ode et M komponenty (koncentrace) provádíme na monitoru po íta e oproti pravítku ve stupních šedi (zbarvení) 7) IF provádíme podle klinických pot eb, nejmén asto 1x m sí
9
