Elektrofiziológiai vizsgálómódszerek alkalmazása a sejtek elektromos tevékenységének kutatásában
A kezdetek 1. 1935-1952 A klasszikus membrán biofizika megteremtése membránpermeabilitás kinetikája, membránfehérjék szerepe, MÉG NINCS INFORMÁCIÓ az ioncsatornákról Kenneth Cole, Howard Curtis (US) Alan Hodgkin, Andrew Huxley, Bernard Katz (UK) tintahal óriás axon, passzív membrántulajdonságok, akciós potenciál terjedése a membráningerlékenység ion elmélete
1
A voltage-clamp módszer megszületése Az AP kialakulásának és terjedésének vizsgálata megerősítette a membráningerlékenység ionális teóriáját. Cél olyan kutatómódszer kidolgozása, amely lehetővé teszi az ioncsatornák izolált vizsgálatát. 1949 Marmont, Cole 1949, 1952 Hodgkin, Huxley, Katz VOLTAGE CLAMP MEGSZÜLETETT a sejtekben a transzmembrán-feszültség experimentális kontrollja megoldódott
Mi akkor a megoldás? x1 E'
I'
E
xA
I
Command
műveleti erősítő Ahogy a membránpermeabilitás változik az erősítő azonnal működésbe lép megváltoztatva a külső elem paramétereit, ezáltal biztosítva a konstans transzmembrán-potenciál fenntartását.
e+
+
e−
−
e0
e0=A(e+- e-)
2
Értelmezés, csak a biztonság kedvéért Az AP kialakulásának és terjedésének vizsgálata során áraminjekció az igy kialakult transzmembrán feszültség mérése tulajdonképpen ez Current-clamp Ezzel szemben az ionáramok vizsgálata során a folyamat fordított a transzmembrán feszültség egy adott szinten tartása ionok átlépése a sejtmembránon (a töltések elmozdulása pedig áramot hoz létre, ionáram) ez pedig a Voltage-clamp
Microelectrodes Micreoelectrodes convert ionic current in solution into electron current in wires. silver wire
copper wire
glass capillary tube filled with electrolyte solution
They are made of materials that can participate in a reversible reaction with one of the ions in the solution. The most frequently used electrode material in electrophysiology is a silver (Ag) wire coated with a composite of Ag and silverchloride (AgCl).
3
Microelectrodes
Sharp microelectrodes
Blunt tip microelectrode
- very small tip diameter ( 0.01-0.1µm) - these are used to penetrate the cell membrane
- the tip diameter is about 1-5 µm, blunt end - these electorde are sealed against the membrane of a cell.
Sharp microelectrodes
Standard intracellular microelectrodes that are used to penetrate the cell membrane. - very small tip diameter ( 0.01-0.1µm) - these are used to penetrate the cell membrane - these are used for membrane potential measurements - must be filled with a highly concentrated electrolyte solution, usually 2–4 M salt (KCl). The high electrolyte concentration reduces the electrode resistance. This minimizes the rectifying current flow, lowers voltage noise and provides wider recording bandwidth.
4
Microelectrode with blunt tip
These electorde are sealed against the membrane of a cell and used for used for patch-clamp experiments - the tip diameter is about 1-5 µm - thick glass wall (0.2–0.3 mm) generates lower electrical noise and increases bluntness at the tip thereby preventing penetration into the cell during seal formation. - The composition of the pipette solution depends on the type of measurement being made. Patch micropipettes are usually filled with a solution that is iso-osmotic to cell cytoplasm to allow current measurements in the absence of bulk water flow.
Az elektróda elkészítése Üvegelektróda típusok: - boroszilikát általánosan használt a jó seal-képzés miatt, olvadáspontja ~780 oC vékony falú (200-300 µm) – alacsony ellenállású elektródákhoz (1-5 MΩ) vastag falú (500-600 µm) – nagy ellenállású elektródákhoz (3-10 MΩ) – alacsonyabb a zaj és stabilabb a seal -kvarc a legalacsonyabb zajjal és a legstabilabb seal-képzéssel bíró üveg, magas olvadáspont, 1580 oC drága
5
Horizontal puller
Vertical puller
a. b.
A mikroelektróda feltöltése A mikorelektróda mérőrendszerhez csatlakoztatása
erősítő mikroelektróda
preparátum
oszcilloszkóp számítógép
6
Good and bad seals.
This intracellular electrode is measuring the resting potential of a cell whose membrane contains only open K+ channels. As the seal resistance Rs increases, the measurement approaches the value of EK.
Good and bad seals.
In a patch recording, currents through the seal also flow through the measuring circuit, increasing the noise on the measured current.
7
Újabb technikák 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
single-channel AP-clamp oocyte-clamp agyszelet macro (giant) patch perforated patch bilayer kombinált patch-rövidülés kombinált patch-fluo
Újabb technikák: AP-clamp During AP clamp: 1. Peak ICa lower and occurs later. 2. Fast activation, but the driving force for Ca2+ is initially low because Em is close the reversal potential for ICa 3. As Em falls the driving force apparently increases faster than the channels inactivate, producing a larger current at later times during AP. 4. NOTE: When the APs are very long ICa can be largely inactivated during the cytosolic Ca2+ transient, but then recover as [Ca2+]i declines. This sort reactivation of ICa during long APs may be the molecular basis of EADs and the arrhythmogenic sequences thereof.
8
