Vol. 64, No. 2, Mei-Agustus 2015 | Hal. 95–99 | ISSN 0024-9548
Ekspresi high mobility group box 1 pada ulkus traumatikus tikus wistar dengan terapi ekstrak teripang emas (High mobility group box 1 expression on traumatic ulcer wistar rats treated with extract gold sea cucumber) Damaiyanti WD Departemen Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Hangtuah Surabaya - Indonesia
Korespondensi (correspondence): Damaiyanti WD, Departemen Biologi Oral, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Hangtuah Surabaya. Jl. Arif Rahman Hakim 150 Surabaya 60111. Email:
[email protected]
ABSTRACT Background: Traumatic ulcers is a common cases in the oral mucosa. Ulcer healing process can be influence by the presence of high mobility group box 1 (HMGB1) protein. One of composition extract gold sea cucumber is heparan sulfat, which bind to HMGB1. Through these binding it can enhance macrophage, stimulate fibroblast and collagen so the ulcer diameter will decrease. Purpose: The aim of this study was to know level of HMGB1 expressionon oral traumatic healing process Wistar rats treated with gel of extract water Sthicopus hermanii. Method: This study using Rattus norvegicus strain wistar male, aged 3months, were divided into 4 group (the group of gold sea cucumber extracts concentration 20%, 40%, 80% and a negative control group). Traumatic ulcers were induced in the lower lip mucosa with heated burnisher. Control group received no treatment, while those in the gold sea cucumber extract group received an application of the gel once a day on day 3 after injured. Samples were sacrificed on day 4. The lower lip mucosa were biopsied and processed for immunohistochemical analysis. Result: There is significant difference between all group (p < 0.05). Animals treated with water extract gold sea cucumber showed the best results regarding the median of HMGB1 score on day 4 specially in concentration 40%. Conclusion: It can be conclude that water extract Stichopus hermanii could be used to enhance the oral traumatic healing procces by increase level of HMGB1 to promote wound healing. Keywords: Traumatic ulcers; HMGB1; healing; macrophage
ABSTRAK Latar Belakang: Ulkus traumatikus adalah kasus yang biasa terjadi di rongga muut. Proses Penyembuhan ulkus dapat dipengaruhi oleh protein high mobility group box 1 (HMGB1). Salah satu komposisi dari ekstrak teripang emas adalah heparan sulfat yang berikatan dengan protein HMGB1. Melalui ikatan tersebut dapat menstimulus produksi makrofag, fibroblas, dan kolagen, sehingga ulkus dapat sembuh. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui derajat ekspresi HMGB1 pada proses penyembuhan ulkus traumatikus tikus Wistar yang diterapi dengan gel ektrak air Stichopus hermanii. Metode: Penelitian ini menggunakan Rattus norvegicus strain wistar jantan, usia 3 bulan, kemudian dibagi menjadi 4 kelompok; kelompok teripang emas kosentrasi 20%, 40%, 80% dan kelompok kontrol negatif. Ulkus dibuat dengan menginduksi bibir bawah dengan burnisher yang dipanaskan. Kelompok kontrol tidak menerima perlakuan, pada kelompok teripang diberi perlakuan gel teripang satu hari sekali pada hari ke 3 setelah perlukaan. Tikus dikorbankan pada hari ke 4, dan bibir bawah dibiopsi untuk dilakukan analisis Imunohistokimia. Hasil: Terdapat perbedaan yang signifikan antar kelompok (p < 0,05). Tikus yang diberikan ekstrak teripang emas konsentrasi 40% menunjukkan hasil terbaik, menurut median dari skor ekspresi HMGB1 pada pengamatan hari ke 4. Simpulan: Penelitian ini
96
Damaiyanti WD: Ekspresi high mobility group box 1 pada ulkus traumatikus tikus wistar Jurnal PDGI 64 (2) Hal. 95-99 © 2015
membuktikan bahwa gel ekstrak air teripang emas dapat digunakan untuk mempercepat penyembuhan ulkus traumatikus melalui peningkatan derajat ekspresi HMGB1. Kata kunci: Ulkus traumatikus; HMGB1; penyembuhan; makrofag
PENDAHULUAN Ulkus traumatikus merupakan kasus yang sering terjadi pada penyakit mulut, terdapat 15 pasien dengan ulkus traumatikus dari 26 pasien yang menggunakan alat ortodonsi pada Februari–Juli 2007 RSGM FKG Unair.1 Penyembuhan luka secara singkat meliputi proses inflamasi, diikuti oleh proses fibrosis atau fibroplasia, dan remodeling jaringan.2 Mukosa rongga mulut adalah salah satu bagian yang paling rentan terjadi luka, dapat disebabkan oleh trauma atau proses imunologi yang disebut dengan ulser.3 Karakteristik dari ulser yaitu tereksposnya jaringan ikat dapat menyebabkan rasa nyeri dan seringkali mengakibatkan kesulitan berbicara, makan maupun menelan.4 Proses penyembuhan luka terjadi melalui beberapa tahap biologis yang kompleks. Penyembuhan ini dapat dilihat secara histologis dengan indikator angiogenesis, kepadatan serabut kolagen yang dihasilkan oleh fibroblas pada jaringan ikat baru.2 Beberapa yang mempengaruhi proses angiogenesis dan sintesis kolagen diantaranya growth factor, nutrisi, komponen inflamasi dan sitokin.5 Salah satu komponen yang memiliki pengaruh terhadap pembentukan angiogenesis dan kolagen adalah HMGB1, mediator inflamasi ini dapat menginduksi ekspresi dari platelet derivided growth factor (PDGF) dan vascular endothelial growth factor (VEGF) pada berbagai jaringan sehingga pembuluh darah baru dapat terbentuk.6 HMGB1 mempengaruhi pembentukan kolagen melalui toll like receptor 4 (TLR 4), dan receptor for advance glycation end product (RAGE). 6,7 HMGB1 disintesis oleh makrofag, kehadiran makrofag atau sel radang kronis dapat dideteksi pada hari ke 4 setelah perlukaan.8 Level serum HMGB1 mencapai puncak pada hari ke 4 setelah injuri.6 Indonesia merupakan negara penghasil teripang terbesar di dunia teripang emas (Stichopus hermanii) biasanya diformulasikan menjadi lotion atau salep topikal. 9 Penelitian menggunakan sulfated glikosaminoglikan (sulfated GAGs) dari
ekstrak teripang emas menunjukkan peningkatan penyembuhan melalui percepatan kontraksi luka full thicknes pada kulit tikus.10 Beberapa GAGs antara lain heparin, heparin sulfat dan hyaluronan atau hyaluronic acid (HA) yang merupakan kunci dari proses biologis seperti: a) stabilisator, kofaktor dan atau ko-reseptor untuk growth factor, sitokin dan kemokin; b) sebagai regulator aktifitas enzim; c) molekul signaling terhadap respon kerusakan seluler seperti luka, infeksi dan tumorgenesis.11 Kandungan lain teripang emas yang diduga mempunyai pengaruh terhadap penyembuhan luka adalah omega 3.9 Omega 3 berperan sebagai imunomodulator inflamasi dapat meningkatkan regulasi produksi kolagen.12 Teripang emas dengan berbagai kandungannya telah terbukti secara empiris sejak dulu telah digunakan sebagai pengobatan luka. Berdasarkan hal tersebut peneliti ingin mengetahui pengaruh pemberian secara topikal ekstrak air teripang emas terhadap ekspresi HMGB1 sebagai mediator inflamasi yang berperan pada penyembuhan luka ulkus traumatikus pada mukosa mulut tikus wistar.
BAHAN DAN METODE Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris. Rancangan penelitian yang dipergunakan adalah rancangan Randomized Post test only control group design. Besar sampel pada penelitian ini 5 sampel tikus Wistar untuk setiap kelompok sehingga diperoleh sampel keseluruhan adalah 20 sampel tikus Wistar, perhitungan ini dilakukan setelah dilakukan penelitian pendahuluan.13 Penelitian ini telah disetujui oleh komisi etik Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Hangtuah. Bahan dan alat yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak air teripang emas yang diperoleh melalui metode freeze dried, PEG 400:4000, povidine iodine 0,12%, buffer formalin, Spirtus, antibodi sekunder HMGB1, immuno staining kit, burner, Burnisher, mikroskop, program optilab.
Damaiyanti WD: Ekspresi high mobility group box 1 pada ulkus traumatikus tikus wistar Jurnal PDGI 64 (2) Hal. 95-99 © 2015
Waktu penelitian mulai dari bulan Januari 2014–Juli 2014 yang berlokasi di Lab. Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya, Lab. Penelitian dan Konsultasi Industri Surabaya, Lab Patologi Anatomi GDC RS Dr. Soetomo Surabaya, Lab. Biokimia, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembuatan gel ekstrak teripang emas melalui modifikasi penelitian Muryani. PEG 400 dan PEG 4000 dilelehkan dalam cawan porselin diatas penangas air dengan perbandingan 1:2, setelah cair atau leleh, basis dituang dalam ekstrak teripang emas dan diaduk sampai homogen. Kemudian ditambah sisa basis sedikit demi sedikit sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan yaitu 80%, 40%, dan 20% kemudian diaduk sampai terbentuk massa gel yang halus dan homogeny, kemudian gel dikemas dalam wadah tertutup rapat.14 Gel ekstrak teripang emas dengan konsentrasi masing-masing 80%, 40% dan 20% disiapkan untuk diapliksasikan pada ulser sebanyak 0,1 mg untuk masing-masing kelompok perlakuan (kontrol negatif). Setelah ulser terbentuk maka diberi ekstrak teripang emas berturut-turut pada kelompok I 0,1 mg konsentrasi 80%; kelompok II 0,1 mg konsentrasi 40%; kelompok III 0,1 mg konsentrasi 20%, dan pada kelompok kontrol negatif tidak diberikan perlakuan (kontrol negatif). Persiapan pembuatan preparat immunohistokimia diawali dengan memotong mukosa bibir bawah tikus yang telah dikorbankan pada hari ke 4, dengan mengikutkan jaringan normal tikus. Kemudian dilanjutkan teknik proses jaringan dengan metode parafin, dan dilakukan pemotongan dengan rotary microtome sehingga didapatkan sayatan jaringan yang ditempelkan pada glass obyek dan siap diwarnai. Pewarnaan menggunakan teknik imunohistokimia dengan monoklonal antibodi primer yaitu murine monoklonal antibodi terhadap molekol HMGB1 dan antibody sekunder yang telah dibiotinasi.15 Sel positif HMGB1 yang ditandai dengan warna coklat tua, melalui 5 lapang pandang. Dengan pembesaran 400´ menggunakan mikroskop Olympus CX-21 dengan program optilab, pembesaran 400´. Pada preparat sediaan dihitung dengan teknik proportion
97
Ekspresi HMGB1 ditunjukan dengan nilai skoring inten Tabel 1. Skor median HMGB1 16 dikalikan berdasarkan pada Kelompok penelitian Liu Kelompokmengenai ekspresi
Kelompok
Kontrol imunohistokimia. konsentrasi 20% > median <= median
6Data 9
yang3bersifat 12
konsentrasi konsentrasi 40% 80% ordinal statistik 11 maka uji 5 4 10
perbedaan antar kelompok dilakukan uji beda kruskal Walis didap
terdapat perbedaan antar kelompok. Untuk melihat perbedaan antar m
maka dilanjutkan uji Mann-Whitney. score dan intensity scoredengan yang merupakan modifikasi 16 Berdasarkan uji bedaHMGB1. menggunakan Mann-Whitney (Tab dari penelitian skoring ekspresi
kelompok konsentrasi 40% memiliki ekpresi HMGB1 tertingg
HASILkelompok lain.
Berdasarkan hasil pengamatan dan perhitungan ekpresi HMGB1 daerah ulkus traumatikus Tabel 2. Hasilpada uji Mann-Whitney antar kelompok Kelompok Kelom hari ke 4 setelah perlukaan.Kelompok Pada masing-masing konsentrasi 20% konsentrasi konsentr kelompok kontrol, perlakuan ekstrak teripang emas 40% Kelompok Kontrol 0,25didapatkan hasil 0,005 0.8 konsentrasi 20%, 40%, dan 80% sebagaiKelompok berikut (Tabel 1). 0 0,1 konsentrasi 20%didapatkan median dengan Pada Tabel 1, Kelompok pada kelompok 40%, karena skor tertinggi 0,0 40% medianKonsentrasi menunjukkan nilai tengah maka hal ini memperlihatkan persebaran skor tertinggi ada pada Gambaran histopatologi HMGB dengan kelompok 40%, berikutnya pada kelompok 80%, pengecatan 20% dan kelompok kontrol. menghitung ekspresi HMGB1 pada pengamatan hari ke 4 (Gambar 1
A
B
C
D
1. A) Gambaran IHC padakontrol; kelompok kontrol; B) gambaran IHC GambarGambar 1. A) Gambaran IHC pada kelompok B) gambaran 20%; C) gambaran IHC pada kelompok konsentrasi 40%; D) IHC pada kelompok konsentrasi 20%; C) gambaran IHC pada kelompok konsentrasi 40%; D) gambaran konsentrasi 80%. 5
Tabel 2. Hasil uji Mann-Whitney antar kelompok Kelompok Kontrol Kelompok konsentrasi 20% Kelompok Konsentrasi 40%
Kelompok konsentrasi 20% 0,25 -
menggunakan
Kelompok konsentrasi 40% 0,005 0 -
Kelompok konsentrasi 80% 0,838 0,161 0,008
98
Damaiyanti WD: Ekspresi high mobility group box 1 pada ulkus traumatikus tikus wistar Jurnal PDGI 64 (2) Hal. 95-99 © 2015
Ekspresi HMGB1 ditunjukkan dengan nilai skoring intensitas dan proposi yang dikalikan berdasarkan pada penelitian Liu 16 mengenai ekspresi HMGB1 dengan teknik imunohistokimia. Data yang bersifat ordinal maka uji statistik menggunakan non parametrik. Melihat perbedaan antar kelompok dilakukan uji beda kruskal Walis didapatkan kesimpulan bahwa terdapat perbedaan antar kelompok. Untuk melihat perbedaan antar masing-masing kelompok maka dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney. Berdasarkan uji beda menggunakan MannWhitney (Tabel 2) menunjukkan pada kelompok konsentrasi 40% memiliki ekpresi HMGB1 tertinggi dibandingkan dengan kelompok lain. Gambaran histopatologi HMGB dengan pengecatan IHC, digunakan untuk menghitung ekspresi HMGB1 pada pengamatan hari ke 4 (Gambar 1).
PEMBAHASAN High Mobility Protein Box 1 (HMGB1) biasanya berikatan dengan DNA di dalam inti sel, namun sel monosit dan makrofag dapat mengeluarkan HMGB1 secara aktif. HMGB1 bertindak sebagai sitokin merangsang respons inflamasi dalam berbagai jenis sel termasuk monosit, makrofag, neutrofil, sel dendritik termasuk menginduksi migrasi sel.17 Pemilihan perawatan dengan aplikasi topikal dari gel ekstrak air Teripang Emas untuk terapi pada ulkus traumatikus pada hewan coba, dipilih karena sifat dari mukosa rongga mulut yang mudah dijangkau, memiliki suplai darah yang baik, dan terhindar dari metabolism pertama dihati.18 Keuntungan dari gel dibandingkan dengan bentuk sediaan topikal lainnya yaitu memungkinkan pemakaian yang merata dan melekat dengan baik, mudah digunakan, mudah meresap, dan mudah dibersihkan oleh air.19 Aplikasi topikal ekstrak air teripang emas pada pengamatan hari ke 4 (Tabel 2) menunjukkan ekspresi HMGB1 pada kelompok konsentrasi 40%, memiliki perbedaan yang bermakna, dibandingkan kelompok konsentrasi 20%, kelompok konsentrasi 80%, dan kelompok kontrol. Hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa pemberian topikal ekstrak air teripang emas dapat meningkatkan ekspresi HMGB1 terutama pada kelompok konsentrasi 40%. Berdasarkan literatur ekstrak air teripang emas memiliki kandungan glikosaminoglikan (GAGs) Terdapat dua tipe GAGs yaitu sulfated GAGs
dan nonsulfated GAGs. Sulfated GAGs antara lain kondroitin sulfat, dermatan sulfat, keratan sulfat, heparan sulfat dan heparin, sedang golongan nonsulfated GAGs antara lain hyaluronic acid yang penting untuk respon sel terhadap ektraseluler growth factor, contohnya FGF. Peningkatan FGF, VEGF, dan PDGF oleh makrofag memicu peningkatan proliferasi fibroblas dan angiogenesis. Hal ini diregulasi oleh keberadaan CD44/ Heparan Sulfat Proteoglikan (HSPG) dan syndecan 2 yaitu reseptor GAGs pada makrofag teraktivasi.2,20 HMGB1 yang dilepaskan secara aktif dan pasif akan berikatan dengan heparan sulfat bagian dari glikosaminoglikan yang kemudian dapat meningkatkan kemotaksis makrofag, pada penelitian yang lain menyebutkan bahwa ikatan HMGB1 dan heparan sulfat mengawali proses kemotaksis dari makrofag, sehingga growth factor seperti FGF yang dibutuhkan dapat teraktivasi.6 Glikosaminoglikan pada extracellular matrix (ECM) salah satunya heparin sulfat sangat penting untuk pengikatan dengan HMGB1. Penurunan heparin sulfat secara farmakologi membuktikan penurunan HMGB1.17 Kerusakan sel dapat memicu pelepasan HMGB1 secara pasif, sedangkan makrofag akan secara aktif melepaskan HMGB1. Kompleks ikatan antara HMGB1, RAGE dan GAGs akan memicu reaksi inflamasi, dan memanggil Growth factor dan substansi lain yang mengawali dan mempercepat pembentukan formasi jaringan granulasi.17 Reseptor HMGB1 antara lain toll like receptor (TLR) 2, TLR 4 dan receptor for advance glycation end product (RAGE).6 RAGE sebagai protein transmembran, diekspresikan pada sel epitel alveolar, leukosit, sel endotel dan neuron. Pada beberapa penelitian dilaporkan HMGB1 dan RAGE berikatan dengan heparin sulfat membentuk suatu kompleks. Sinyal HMGB1 bergantung pada ikatannya dengan heparin sulfat. Sedangkan RAGE aktivitasnya bergantung pada ikatannya dengan permukaan sel proteoglikan.17 HMGB1 meningkatkan migrasi beberapa sel pada area inflamasi, terutama makrofag. HMGB1 secara signifikan meningkatkan kemotaksis dari makrofag, dan menginduksi ekspresi dari VEGF. VEGF adalah growth factor angiogenesis yang berperan penting pada penyembuhan.7 Teripang emas mengandung glikosaminoglikan (GAGs) diantaranya heparin sulfat. Heparin sulfat akan berikatan dengan HMGB1 dapat bertindak sebagai pemicu VEGF sehingga angiogenesis dapat
Damaiyanti WD: Ekspresi high mobility group box 1 pada ulkus traumatikus tikus wistar Jurnal PDGI 64 (2) Hal. 95-99 © 2015
terjadi.17 VEGF merupakan suatu faktor angiogenik yang kuat, menyebabkan pembentukan pembuluh darah yang makin banyak sehingga mempercepat penyembuhan luka.2 Berdasarkan penelitian dapat dibuktikan bahwa penggunaan teripang sebagai biomaterial dapat meningkatkan ekspresi HMGB1 pada proses penyembuhan luka ulkus traumatikus pada mukosa rongga mulut. Berdasarkan pembahasan di atas dapat disimpulkan bahwa terdapat peningkatan ekspresi HMGB1 yang diberi perlakuan aplikasi topikal gel ekstrak teripang emas dibanding kelompok kontrol. Namun perbedaan bermakna didapatkan pada kelompok ekstrak teripang emas konsentrasi 40%.
DAFTAR PUSTAKA 1. Lestari F. Prevalensi trumatik ulcer karena piranti ortodonti cekat pada pasien di kamar terima rumah sakit gigi dan mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga (Periode Pebruari-Juli 2007). Surabaya: Universitas Airlangga; 2007. 2. Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Robbins and Contran: pathologic basis of disease. 8th ed. Philadephia: Elsevier Saunders Inc; 2010. p. 91–105. 3. Martins MD, Fernandes KPS, Pavesi VC, França CM, Mesquita-Ferrari RA, Bussadori SK. Healing properties of papain-based gel on oral ulcers. Braz J Oral Sci 2010; 10(2): 120–3. 4. Duarte C-M-E, Quirino M-R-S, Patrocínio M-C, Anbinder a-L. Effects of Chamomilla recutita (L.) on oral wound healing in rats. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2011; 16(6): e716–21. 5. Triyono B. Perbedaan tampilan kolagen di sekitar luka insisi pada tikus wistar yang diberi infiltrasi penghilang nyeri levobupivakain dan yang tidak diberi levobupivakain suatu studi histokimia. Semarang: Universitas Diponegoro; 2005. 6. Nadatani Y1, Watanabe T, Tanigawa T, Ohkawa F, Takeda S, Higashimori A, Sogawa M, Yamagami H, Shiba M, Watanabe K, Tominaga K, Fujiwara Y, Takeuchi K, Arakawa T. High-mobility group box 1 inhibits gastric ulcer healing through toll-like receptor 4 and receptor for advanced glycation end products. PLoS One 2013; 8(11): 1–13. 7. Dai S, Sodhi C, Cetin S, Richardson W, Branca M, Neal MD, Prindle T, Ma C, Shapiro RA, Li B, Wang JH, Hackam DJ. Extracellular high mobility group box-1 (HMGB1)
99
inhibits enterocyte migration via activation of toll-like receptor-4 and increased cell-matrix adhesiveness. J Biol Chem 2010; 285(7): 4995–5002. 8. Andrassy M, Volz HC, Igwe JC, Funke B, Eichberger SN, Kaya Z, Buss S, Autschbach F, Pleger ST, Lukic IK, Bea F, Hardt SE, Humpert PM, Bianchi ME, Mairbäurl H, Nawroth PP, Remppis A, Katus HA, Bierhaus A. Highmobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart. Circulation 2008; 117(25): 3216–26. 9. Arylza IS. Teripang dan bahan aktifnya. Oseana 2009; xxxiv: 9–17. 10. Masre S, Yip G, Sirajudeen K, Ghazali F. Wound healing activity of total sulfated glycosaminoglycan (GAG) from Stichopus vastus and Stichopus hermanni integumental tissue in rats. Int J Mol Med Adv Sci 2010; 6(4): 49–53. 11. Trowbridge JM, Gallo RL. Dermatan sulfate: new functions from an old glycosaminoglycan. Glycobiology 2002; 12(9): 117R–25R. 12. Watkins B, Li Y LH, Seifert M. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and skeletal health. Exp Biol Med 2001; 226: 485–97. 13. Sudibyo. Metodologi penelitian aplikasi penelitian bidang kesehatan. Surabaya: Unesa University Press; 2013. 14. Muryani E. Pengaruh Kombinasi Peg 400 dan Peg 4000 sebagai basis salep terhadap sifat fisik dan kecepatan pelepasan benzokain. 2007. 15. Sudiana IK. Teknologi ilmu jaringan dan imunohistokimia. Surabaya: Sagung Seto; 2004. h. 36–44. 16. Liu F, Zhang Y, Peng Z, Gao H, Xu L, Chen M. High expression of high mobility group box 1 (hmgb1) predicts poor prognosis for hepatocellular carcinoma after curative hepatectomy. J Transl Med 2012; 10(1): 135. 17. Xu D, Young J, Song D, Esko JD. Heparan sulfate is essential for high mobility group protein 1 (HMGB1) signaling by the receptor for advanced glycation end products (RAGE). J Biol Chem 2011; 286(48): 41736–44. 18. Hearnden V, Sankar V, Hull K, Juras DV, Greenberg M, Kerr AR, Lockhart PB, Patton LL, Porter S, Thornhill MH. New developments and opportunities in oral mucosal drug delivery for local and systemic disease. Adv Drug Deliv Rev 2012; 64(1): 16–28. 19. Herdiana Y. Formulasi gel undesilenil fenilanin dlam aktivitas sebagai pencerah kulit. Karya Ilmiah. 2007. 20. Taylor KR, Gallo RL. Glycosaminoglycans and their proteoglycans: host-associated molecular patterns for initiation and modulation of inflammation. FASEB J 2006; 20(1): 9–22. 21. Azeez S, Amudhan S, Adiga S, Rao N, Rao N. Wound healing profile of areca catechu extracts on different wound models in wistar rats. Kuwait Med J 2007; 39: 48–52.
