EKSPLORASI BAKTERI TANAH KAWASAN KAWAH GUNUNG DARAJAT SEBAGAI PENGHASIL ENZIM PROTEASE DAN AMILASE EXPLORATION OF SOIL BACTERIA AT THE AREA OF CRATER MOUNTAIN DARAJAT AS A PRODUCER OF THE ENZYME PROTEASE AND AMYLASE Muhammad Haqqi Taufiq Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan, Bogor ABSTRAK Penelitian mengenai bakteri tanah potensial di kawasan Gunung Darajat masih sangat terbatas, salah satunya mengenai enzim ekstraseluler seperti enzim protease dan amilase, padahal masih banyak potensi yang dapat diteliti, serta dimanfaatkan secara luas. Tujuan penelitian ini yakni untuk mengisolasi bakteri proteolitik dan amilolitik serta mengetahui karakter tiap isolatnya secara makrokopis dan mikrokopis. Metode yang digunakan secara dilution, kemudian di isolasi pada media selektif seperti starchagar dan skimmilk, dilanjutkan pemurnian serta karakterisasi tiap isolatnya. Hasil penelitian dari proses skrining dalam media starch agar dan skim milk, bahwa ditemukan 19 isolat bakteri proteolitik, namun tidak ditemukan bakteri tergolong amilolitik. Kata kunci: bakteri, isolat, proteolitik, dan amilolitik. Research on the potential of soil bacteria in the area of Mount Darajat still very limited, one of the extracellular enzymes such as protease and amylase enzymes, but there are still many potential that can be studied, and widely utilized. The purpose of this research is to isolate proteolytic and amylolytic bacteria and knowing the character of each isolates in macroscopic and microscopic. The method used in dilution, then isolated on selective media such as starch agar and skim milk, followed by purification and characterization of each isolates. The results of the screening process in starch agar medium and skim milk, that discovered 19 isolates of proteolytic bacteria, but not found classified amylolytic bacteria. Key Word: bacteria, isolate, proteolyic, and amylolytic.
PENDAHULUAN Indonesia memiliki kekayaan biodiversitas yang sangat tinggi. Indonesia juga merupakan salah satu negara yang memiliki hutan tropis di dunia, walaupun luas daratannya hanya 1.32 % dari luas daratan dipermukaan bumi, namun demikian keanekaragaman didalamnya sangat tinggi (Irwanto, 2007). Hutan adalah suatu kesatuan ekosistem berupa hamparan lahan berisi
sumber daya alam hayati (Hendarti Latifah, 2007). Hutan alam memiliki keanekaragaman jenis mikroba yang berperan dalam mempertahankan stabilitas ekosistem hutan (Widyati E., 2008). Mikroba merupakan organisme yang mempunyai niche yang sangat sempit sehingga sangat rentan terhadap perubahan lingkungan (Widyati E., 2008). Populasi mikroorganisme dalam tanah dipengaruhi
oleh beberapa faktor, meliputi; jumlah dan jenis zat hara dalam tanah, kelembaban, tingkat aerasi, suhu, pH, dan perlakuan pada tanah, seperti pemupukan (Budiyanto, 2004). Pemeliharaan mikroorganisme merupakan salah satu kunci penting di bidang mikrobiologi (Kusmiati, dan Priadi Dody, 2003). Sadar akan tingginya potensi mikroba hutan, sejalan dengan Pusat Konservasi dan Rehabilitasi (Puskonser) telah menaruh perhatian untuk membangun bank mikroba (microbial culture collection) sebagai salah satu upaya untuk mengkonservasi mikrobamikroba potensial (Puskonser, 2014). Mikroorganisme mempunyai nilai manfaat cukup tinggi serta memberi banyak keuntungan dalam bidang industri (Nadeem, dkk., 2009). Skala industri memanfaatkan mikroorganisme penghasil enzim ekstraselular baik protease maupun amilase, seperti dalam industri makanan, minuman, tekstil, kulit dan kertas, dikarenakan melalui penggunaannya, energi dapat dihemat dan ramah lingkungan (Sarah, dkk., 2009). Penelitian ini bertujuan untuk: 1) Mengisolasi bakteri tanah kawasan kawah Gunung Darajat penghasil enzim protease dan amilase; 2) Mengetahui karakter morfologi koloni dan morfologi sel isolat bakteri penghasil enzim protease dan amilase. METODE PENELITIAN Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret – April 2015, di laboratorium Mikrobiologi Hutan, Puslitbang, Departemen Kehutanan, Bogor dan di laboratorium Biologi F.MIPA, Universitas Pakuan Metode kerja pada penelitian ini dilakukan dengan cara: 1) Pengambilan sampel tanah di kawasan kawah Gunung Darajat; 2) Pembuatan media berupa media selektif dan media umum; 3) Isolasi bakteri proteolitik dan amilolitik pada media starch agar dan skim milk. 4) Skrining isolat bakteri proteolitik dan
amilolitik; 5) Pemurnian dan inokulasi isolat bakteri proteolitik dan amilolitik; 6) Karakterisasi isolat bakteri proteolitik dan amilolitik. Media yang dibutuhkan pada penelitian ini yakni, milk agar (protease) dan starch agar (amilase) untuk media selektif, sedangkan nutrient agar untuk media umum. Isolasi bakteri merupakan proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Isolasi bakteri dilakukan secara aseptis untuk melindungi dari kontaminasi mikroba lain (Singleton dan Sainsbury, 2006). Proses isolasi diawali dengan mengencerkan tanah terlebih dahulu dalam larutan buffer seperti NaCl fisiologis. Pengenceran dilakukan agar bakteri yang terkandung pada tanah berpindah ke air yang selanjutnya akan proses isolasi ke dalam media buatan. Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah mikroba sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, maka semakin sedikit jumlah mikroba, dimana suatu saat didapat hanya satu mikroba pada satu tabung (Waluyo, 2004). Skrining merupakan proses memilah-milah bakteri yang tergolong proteolitik dan amilolitik dengan indikasi terbentuknya suatu zona bening di sekeliling koloni bakteri, kemudian koloni bakteri tergolong proteolitik maupun amilolitik akan dimurnikan agar dapat diketahui karakter setiap isolatnya. Hasil dari proses skrining, isolat bakteri dapat diamati karakteristik makroskopis koloni, kemudian dilanjutkan proses pemurnian dan inokulasi pada media nutrient agar miring. Pemurnian dilakukan dengan cara koloni bakteri yang tumbuh, diambil menggunakan jarum ose secara aseptis dan digoreskan pada media baru sehingga didapatkan isolat murni (Mariska Etha, dkk., 2013). Metode yang dilakukan dengan cara streak plate quadrant yakni membagi 4 bagian plate kemudian digores
secara zigzag. Prinsip ini untuk mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Isolat bakteri yang murni akan diamati karakter morfologi koloni makroskopis meliputi; warna, bentuk, ukuran, tepi, dan elevasi koloni bakteri yang dapat terlihat langsung dari plate, sedangkan untuk mengamati karakter morfologi sel mikroskopis meliputi; bentuk sel, pewarnaan Gram, pewarnaan kapsul dan pewarnaan spora, dengan terlebih dahulu dibuat preparat dengan menggunakan gelas objek. HASIL DAN PEMBAHASAN 1) Pengambilan Sampel Sampling di kawasan kawah Gunung Darajat dilaksanakan pada 15 Oktober 2014 tepatnya pukul 11.00-12.00 WIB. Sampling dilakukan jauh dan dekat perakaran tumbuhan, karena perakaran tumbuhan merupakan habitat bakteri yang bersimbiosis dengan akar tumbuhan (Widyati Enni, 2013). Rizosfir (Rhizosphere) merupakan daerah dalam tanah yang ditempati bagian dari tanaman (akar) yang berinteraksi dengan mikroba (Widyati Enni, 2013). Bakteri merupakan kelompok mikroba yang paling melimpah di rizosfir, jumlah mereka berkisar antara 10-5-10-6 organisme per gram tanah rizosfir. Hal ini karena mereka memiliki ukuran yang sangat kecil, sehingga hanya memiliki biomassa yang sangat kecil di tanah (Sylvia, 2005). Sampling titik lokasi pertama di dekat perakaran tumbuhan paku, kedua di dekat perakaran tumbuhan alang-alang, ketiga di dekat perakaran tumbuhan senduduk, dan keempat jauh dari perakaran tumbuhan
2) Isolasi Proses isolasi dilakukan dengan mengencerkan tanah dari pengencer 10-1 sampai 10-5, ditumbuhkan pada media selektif skim milk dan starch agar. Metode yang digunakan dalam isolasi tersebut adalah metode tuang (pour plate) dengan menuangkan 1 mL dari setiap pengencer ke dalam plate berisi media selektif. Gorlach L., dan Continho (2007) menyatakan bahwa keberadaan bakteri di alam sangat dipengaruhi oleh berbagai faktor fisik, dan khemis termasuk ketersediaan nutrien, bahan organik, kelembaban, dan temperatur. Media harus diperhatikan derajat keasamannya, karena jika media terlalu asam maupun terlalu basa akan mengubah proses metabolisme organisme didalamnya dan tentunya akan mempengaruhi laju pertumbuhan organisme bahkan dapat mengakibatkan organisme itu mati (Fardiaz, 1987). Pada proses isolasi dalam media skim milk untuk setiap cawan petri diberi kode Dr1 (tanah jauh dari perakaran tumbuhan), Dr5 (tanah dekat dari perakaran senduduk), Dr9 (tanah dekat dari perakaran alang-alang), dan Dr12 (tanah dekat dari perakaran paku). Koloni bakteri tumbuh pada media skim milk (Gambar 1), didominasi koloni bakteri berwarna putih (248 koloni) sedangkan sisanya berwarna, krem (121 koloni), jingga (104), dan kuning (2 koloni). Adapun bentuk koloni sirkuler (467 koloni) begitu dominan dibandingkan bentuk koloni tidak beraturan (8 koloni), sedangkan ukuran koloni kecil (318 koloni) lebih dominan dibandingkan ukuran sedang (154 koloni) dan hanya sedikit ukuran koloni besar (3 koloni). Tepi koloni sedikit saja yang berombak (8 koloni) dan hampir keseluruhan utuh (467 koloni), sedangkan elevasi koloni bervariasi baik rata (242 koloni) maupun cembung (233 koloni).
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
warna bentuk ukuran tepi elevasi
Gambar 1. Histogram Karakter Koloni Pada Media Skim Milk Proses isolasi pada media strach agar, untuk setiap cawan petri diberi kode dR1 (tanah jauh dari perakaran tumbuhan), dR5 (tanah dekat perakaran senduduk), dR9 (tanah dekat perakaran alang-alang), dR12 (tanah dekat perakaran paku). Hasil isolasi menunjukkan bakteri mampu hidup di media starch agar, karena substrat yang akan diubah pada metabolisme glukosa tersebut salah satunya adalah pati (Purwoko, 2009). Koloni bakteri yang tumbuh (Gambar 2) didominasi warna putih (167
koloni), krem (132 koloni), sedangkan hanya beberapa saja berwarna merah (5 koloni). Adapun bentuk koloni sirkuler sangat dominan (272 koloni) dibandingkan bentuk koloni tidak beraturan (32 koloni). Ukuran koloni kecil begitu dominan (237 koloni) dan sisanya ukuran koloni sedang (67 koloni) dan hanya sedikit koloni ukuran besar (7 koloni). Tepi koloni mayoritas utuh (279 koloni) dan sisanya berombak (32 koloni). Elevasi koloni beragam baik elevasi rata (152 koloni) maupun elevasi cembung (159 koloni).
300 250 200 warna
150
bentuk
100
ukuran
50
tepi
0
elevasi
Gambar 2. Histogram Karakter Koloni Pada Media Starch Agar
3) Skrining Pada (Gambar 3) menunjukkan jumlah bakteri penghasil enzim protease pada media skim milk ditemukan dengan terbentuknya zona bening di sekeliling koloni bakteri walaupun relatif sedikit, namun pada media starch agar tidak ditemukan bakteri penghasil enzim amilase. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tanah kawasan kawah Gunung Darajat lebih mampu mendegradasi protein dibandingkan amilum atau pati. 500 450 400
zona bening
350 300 250 200
tumbuh, tidak terbentuk zona bening
150 100 50 0 skim milk
starch agar
Gambar 3. Histogram Jumlah Koloni Bakteri Pada Media Selektif Menurut Fardiaz (1987) mikroba yang memproduksi enzim ekstraseluler jika ditumbuhkan pada media yang mengandung substrat yang dapat dihidrolisis akan mengeluarkan enzim tersebut di sekitar koloninya dan akan menghidrolisa subtrat di sekeliling koloni. Dari hasil skrining proteolitik pada media skim milk ditemukan 19 isolat bakteri proteolitik dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni. Ditemukan 11 isolat bakteri pada Dr5, 2 isolat bakteri pada Dr9, dan 6 isolat bakteri pada Dr12. Dari hasil tersebut terbukti bahwasannya bakteri tersebut mampu untuk mendegradasi senyawa protein menjadi molekul-molekul sederhana seperti asam
amino (Rakhmawati A., dan Yulianti E., 2012). Hasil penelitian menujukkan bahwa bakteri proteolitik ditemukan pada tanah didekat perakaran tumbuhan sedangkan tidak ditemukan bakteri proteolitik pada tanah yang jauh dari perakaran tumbuhan. Hal ini menunjukkan Adanya suplai makanan dari tumbuhan, mengakibatkan aktivitas mikroba di rizosfir jauh lebih tinggi dibanding lingkungan tanah yang jauh dari akar tumbuhan, sehingga bakteri dapat menggunakan kasein lebih cepat yang terkandung pada media skim milk. Fujiwara dan Yamamoto (1987) menyatakan bahwa medium yang mengandung kasein, merupakan substrat yang baik untuk mengisolasi bakteri penghasil enzim protease ekstraseluler. Menurut Pakpahan (2009) kasein merupakan protein susu yang terdiri dari fosfoprotein yang berikatan dengan kalsium membentuk garam kalsium yang disebut kalsiun kalseinat. Dengan adanya enzim protease ekstraseluler bakteri, kasein ini akan dihidrolisis menjadi peptidapeptida dan asam amino yang larut. Hilangnya partikel kasein dalam media skim milk ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni. Pada media starch agar bakteri yang tumbuh, secara keseluruhan tidak dapat menunjukkan adanya zona bening di sekeliling koloni bakteri dengan demikian, maka tidak ditemukannya bakteri amilolitik. Kemampuan bakteri tumbuh pada starch agar menunjukan dapat menggunakan pati, akan tetapi belum sampai terbentuk zona jernih karena proses degradasi belum sampai tahap glukosa (Rakhmawati A., dan Yulianti E., 2012). Untuk memecah pati menjadi glukosa sedikitnya memerlukan 3 enzim, yaitu α-amilase, β-amilase dan βglukosidase. α-amilase akan memecah ikatan α-1,4 menghasilkan glukosa, maltosa dan dekstrin. β-amilase akan memecah pati dari ujung nonreduksi menjadi β-maltosa dan dekstrin. Sedangkan β-glukosidase akan memecah
ikatan β-1,6 pada rantai cabang dan dekstrin menjadi glukosa (Purwoko, 2009). 4) Pemurnian Pemurnian isolat bakteri dilakukan dengan streak plate quadrant yakni dengan membagi 4 bagian plate, kemudian dilakukan goresan zigzag secara aseptis pada cawan berisi media nutrient agar. Proses pemurnian dilakukan 2 sampai 3 kali, dan setiap isolat bakteri murni proteolitik diberi kode DR-P-1 sampai DR-P-19 pada cawan. 5) Karakterisasi Karakteristik makroskopis koloni isolat bakteri proteolitik dari 19 isolat ditemukan 2 warna yakni, 13 isolat berwarna krem dan 6 isolat berwarna putih. Bentuk koloni bakteri proteolitik menunjukkan 19 isolat berbentuk sirkuler, adapun ukuran koloni bakteri proteolitik dari 19 isolat ditemukan 2 bentuk yakni, 14 isolat berukuran kecil sedangkan 5 isolat berukuran sedang. Tepi koloni bakteri proteolitik ditemukkan 19 isolat bertepi utuh atau sirkuler, adapun elevasi koloni bakteri proteolitik dari 19 isolat menunjukkan bahwa 10 isolat bertepi cembung dan 9 isolat bertepi rata. Adapun karakteristik mikroskopis sel isolat bakteri proteolitik dari 19 isolat yakni, ditemukan 18 isolat berbentuk kokus dan 1 isolat berbentuk basil. Dan dari 19 isolat bakteri proteolitik tidak ditemukan isolat bakteri membentuk kapsul maupun membentuk spora. SIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa; 1. Isolasi bakteri dari tanah kawasan kawah Gunung Darajat berhasil dilakukan, yakni sebanyak 19 isolat bakteri proteolitik, namun tidak ditemukan bakteri tergolong amilolitik. 2. Karakteristik morfologi makroskopis koloni isolat bakteri proteolitik diketahui; 7 isolat berwarna krem,
berbentuk sirkuler, ukuran kecil, tepi, elevasi cembung, 3 isolat berwarna krem, berbentuk sirkuler, ukuran kecil, tepi utuh, elevasi rata, 3 isolat berwarna putih, berbentuk sirkuler, ukuran kecil, tepi utuh, elevasi rata, 2 isolat berwarna krem, berbentuk sirkuler, ukuran sedang, tepi utuh, elevasi cembung, 2 isolat berwarna putih, berbentuk sirkuler, ukuran sedang, tepi utuh, elevasi rata, 1 isolat berwarna krem berbentuk sirkuler, ukuran sedang, tepi utuh, elevasi rata, dan 1 isolat berwarna putih, berbentuk sirkuler, ukuran kecil, tepi utuh, elevasi cembung. 3. Karakteristik morfologi mikroskopis sel isolat bakteri proteolitik diketahui; 18 isolat berbentuk kokus, Gram positif, tidak berkapsul, tidak berspora, dan 1 isolat berbentuk basil, Gram positif, tidak berkapsul, tidak berspora. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai kemampuan aktifitas isolat bakteri proteolitik serta identifikasi bakteri proteolitik sehingga dapat diketahui nama spesies dan hubungan kekerabatannya. DAFTAR PUSTAKA Budiyanto, M.A.K. 2004. Mikrobiologi Terapan. Malang: Universitas Muhammadiyah Press. Fardiaz, S. 1987. Mikrobiologi Pangan I. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Fujiwara, N. dan Yamamoto, K. 1987. “Production of Alkalin Protease in Low Cost Medium by Alkalophilic Bacillus sp. and Properties of the Enzyme”. Jurnal Fernment. Technol., (Vol 3). No.65 Japan. Hal: 345-348. Gorlanch Lira, dan Continho. 2007. “Population Dynamics And Extracelular Enzymes Actyvity Of Mesophilic And Thermophilic
Bacteria Isolated From Semi-Arid Soil Of Northestren Brazil”. Brazilian Jurnal of Microbiology. No.38 Brazil. Hal: 135-141
Rehabilitasi, Departemen Kehutanan.
.
Hendarti Latifah. 2007. Menepis Kabut Halimun. Jakarta: Yayasan Obor Indonesia. Hal: 17.
Rakhmawati Anna, dan Yulianti Evi. 2012. “Eksplorasi Bakteri Termofilik Pasca Erupsi Merapi Sebagai Penghasil Enzim Ekstraselular”. Jurnal Penelitian Saintek (April, XVII). No.1 Yogyakarta: Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Yogyakarta.
Irwanto. 2007. Analisis Vegetasi Untuk Pengelolaan Kawasan Hutan Lindung Pulau Marsegu, Kabupaten Seram Bagian Barat, Provinsi Maluku. Tesis. Yogyakarta: Program Pascasarjana Universitas Gajah Mada. Kusmiati, dan Priadi Dody. 2003. “Kriopreservasi Bakteri Selulolitik Bacillus pumilus dengan Krioprotektan Berbeda”. Jurnal BioSMART (April, V).. No.1 Bogor: Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI. Hal: 21. Marista Etha, Khotimah Siti, dan Linda Riza. 2013. “Bakteri Pelarut Fosfat Hasil Isolasi Dari Tiga Jenis Tanah Rhizofer Tanaman Pisang Nipah (Musa paradisaca var. Nipah) Di Kota Tangerang”. Jurnal Protobiont (Maret, II). No.2 Pontianak: Program Studi Biologi FMIPA Universitas Tanjungpura. Hal: 93-101. Nadeem M.T., Butt M.S., Anjum F.M. dan Asgher M. 2009. “Improving Bread Quality by Carboxymethyl Cellulase Application”. Jurnal International Agri Bio. Faisalabad: Department of Biochemistry, University of Agriculture Pakistan. Hal: 727–730. Puskonser, 2014. Pengelolaan Koleksi dan Pengembangan Database Mikroba Hutan Tropika Indonesia. Bogor: Pusat Penelitian dan Pengembangan Konservasi dan
Sarah, Putra S., dan Putro H. 2009. “Isolasi α-amilase Termostabil Dari Bakteri Termofilik”. Prosiding Kimia (Maret, 2) No.2 Surabaya: Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Sylvia, D., Fuhrmann, J., Hartel, P. dan Zuberer, D. 2005. Principles and Applications of Soil Microbiology. Pearson Education Inc.NewJersey. Waluyo Lesmana. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang: Universitas Muhammadiyah Press. Widyati Enny. 2008. “Peranan Mikroba Tanah Pada Kegiatan Rehabilitasi Lahan Bekas Tambang”. Jurnal Info Hutan (Agustus, V). No.2 Bogor: Pusat Litbang Hutan dan Konservasi Alam, Departemen Kehutanan. Hal: 151. Widyati Enny. 2013. “Memahami Interaksi Tanaman – Mikroba”. Jurnal Info Hutan (Februari, VI). No.1 Bogor: Pusat Litbang Hutan dan Konservasi Alam, Departemen Kehutanan. Hal: 13-20
