OPTIMALISASI pH PRODUKSI ENZIM AMILASE BAKTERI ENDOFITIK Pseudomonas stutzery LBKURCC46 Marsiti1, Silvera Devi2, Saryono2 1
Mahasiswa Program Studi S1 Kimia 2 Bidang Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Kampus Bina Widya Pekanbaru, 28293, Indonesia
[email protected] ABSTRACT
Amylase is an hydrolase enzyme which hydrolyze starch into maltose and glucose. Amylase has been produced by Pseudomanas stutzery LBKURCC45, LBKURCC46, and LBKURCC55, the endophytic bacteria. Amylase activity was determined based on the reducing sugars formed from starch hydrolisis by amylase with the DNS (dinitrosalicylic acid) method on a UV-Vis spectrophotometer at 540 nm. The highest amylase activity at pH 7.0, 40°C and agitation of 120 rpm was shown by LBKURCC46 bacteria. Furthermore, the optimization of amylase production by LBKURCC46 bacteria was conducted at various pHs (6.0; 6.5; 7.0; 7.5). The results showed that the optimum activity was 27.5308 x 10-3 U/mL at pH 6.5. Keywords : Amylase, DNS, Pseudomanas stutzery RINGKASAN Amilase adalah enzim hidrolase yang menghidrolisis amilum menjadi maltosa dan glukosa. Produksi enzim amilase dilakukan terhadap Pseudomanas stutzery LBKURCC45, LBKURCC46, dan LBKURCC55 yang merupakan bakteri endofitik strain lokal. Aktivitas amilase yang dihasilkan dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk dari proses hidrolisis substrat amilum oleh enzim amilase dengan metode DNS (asam dinitrosalisilat), menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540 nm. Analisis aktivitas amilase tertinggi dari ketiga bakteri endofitik yang diproduksi pada pH 7,0 suhu 40°C dan agitasi 120 rpm diperoleh bakteri LBKURCC46. Selanjutnya dilakukan optimalisasi produksi enzim amilase bakteri LBKURCC46 pada variasi pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5). Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim amilase optimum diperoleh pada pH 6,5 sebesar 27,5308 x 10-3 U/mL. Kata kunci : Amilase, DNS, Pseudomanas stutzery PENDAHULUAN Enzim amilase merupakan enzim ekstraselular yang memecah ikatan α-1,4 secara acak dari bagian dalam pada
molekul amilum dan menghasilkan produk dengan berat molekul yang lebih rendah seperti maltosa dan glukosa (Lily, 2012; Melliawati, 2006). Enzim amilase memiliki nilai komersial tinggi, 1
sehingga banyak digunakan dalam berbagai bidang industri seperti industri pati, alkohol, kertas, tekstil, pangan dan industri farmasi (Sebayang, 2005., Karri et al., 2014). Dalam industri pangan, enzim amilase dimanfaatkan untuk hidrolisis pati dan hasil hidrolisisnya dapat digunakan untuk produksi sirup glukosa yang mempunyai tingkat kemanisan relatif tinggi, serta untuk pembuatan roti, dan makanan bayi (Setiasih et al., 2006). Salah satu sumber enzim yang banyak di gunakan adalah dari mikroba, terutama berasal dari kultur Aspergillus, Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Rhizopus dan Streptomyces (Pandey et al., 2000) dan pada tahun 2012 Robi’a juga berhasil menemukan beberapa bakteri endofitik yang mampu menghasilkan enzim amilase. Bakteri endofitik adalah bakteri yang hidup dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan tanaman inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba endofitik yang juga mampu menghasilkan senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya, hal ini diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inang kepada mikroba endofitik (Radji, 2005) Bakteri endofitik Pseudomanas stutzery LBKURCC45, LBKURCC46 dan LBKURCC55 yang telah diisolasi dari umbi tanaman dahlia (Dahlia variabilis) oleh robi’a (2012) menunjukkan bahwa bakteri ini mampu menghasilkan enzim amilase dengan cara menghidrolisis amilum yang ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni bakteri. Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan produksi
enzim amilase dari bakteri endofitik Pseudomonas stutzery LBKURCC45, dan LBKURCC46, LBKURCC55 menentukan aktivitas amilase yang dihasilkannya. Salah satu isolat yang menghasilkan aktivitas enzim amilase tertinggi dilakukan optimalisasi pH, suhu dan agitasi. METODE PENELITIAN a.
Alat yang digunakan
Alat-alat yang yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: timbangan analitik, mikropipet, jarum ose, Autoklaf (All American Model No. 2X), Waterbath (Grand Instrument Type SUB 28), Incubator (Memmert), pH meter (Hanna Instrument H18014), Vortex (H-VM-300), Shaking Incubator (manufacturer of Lab, Ind. Dan Vac Instrument), Spektrofotometer UV-VIS (Thermo Scientific Model Genesys 10S) dan peralatan gelas lainnya, sesui dengan prosedur kerja. b. Bahan yang digunakan Isolat bakteri endofitik Pseudomonas stutzery LBKURCC45, LBKURCC46 dan LBKURCC55 yang merupakan koleksi Laboratorium Enzim, Fermentasi dan Bio Molekuler FMIPA UR. Bahan-bahan kimia yang digunakan yaitu akuades, aluminium foil, Nutrient agar (Merck, No. cat. 1.05450.0500), Nutrient broth (Merck, No. cat. 1.05443.0500), NaN3, filter glass fiber (Whatman GF/C), glukosa, amilum, buffer posfat, reagen Dinitrosalisilat (DNS) dan bahan-bahan lain yang digunakan adalah bahan tingkat analisis sesui metoda kerja. 2
c.
Peremajaan bakteri
Media Nutrien Agar (NA) miring disterilisasi menggunakan autoklaf dengan tekanan 15 lb, suhu 121°C selama 20 menit. Kemudian masingmasing kultur stok isolat Pseudomonas stutzery LBKURCC45, LBKURCC46 dan LBKURCC55 diambil satu ose secara aseptis dari stok Nutrient broth (NB) dan diinokulasikan kedalam media NA dan diberi label, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dalam inkubator. d. Pembuatan endofitik
inokulum
bakteri
Bakteri hasil peremajaan diambil satu ose secara aseptis dan dimasukkan kedalam 50 mL media cair NB. Kemudian diinkubasi dalam shaking incubator dengan kecepatan agitasi 120 rpm pada suhu 40oC selama 12 jam. Suspensi bakteri ini digunakan sebagai starter, selanjutnya dilakukan pengukuran OD (Optical Density) menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 660 nm. e.
Pembuatan media cair produksi enzim amilase
untuk
Produksi enzim amilase digunakan media NB mengandung amilum 1% (w/v). Pseudomonas Stutzery dari masing-masing kultur yang telah diremajakan, diambil 10% kemudian diinokulasi dalam 100 mL media produksi NB mengandung amilum 1% (w/v) dan diinkubasi dalam shaker incubator pada 120 rpm dan suhu 40°C selama 12 jam (Sarah, et al., 2010). Setelah 12 jam, media kultur yang berisi ekstrak kasar enzim didinginkan pada suhu 4°C selama kurang lebih 1
jam, kemudian disentrifugasi 9500 rpm selama 15 menit (Sumrin et al., 2011). Ekstrak kasar enzim disaring dengan filter glass fiber (Whatman GF/C). Ekstrak kasar yang diperoleh diambil dengan mikropipet untuk di uji aktivitas enzimnya. Jika enzim tidak langsung digunakan untuk analisis aktivitas enzim, maka ditambahkan NaN3 hingga konsentrasi larutan menjadi 0,02% (w/v) kedalam setiap larutan ekstrak kasar enzim amilase. f.
Penentuan aktivitas enzim amilase menggunakan metode DNS
Tabung uji, kontrol dan blanko dilakukan secara bersamaan. Tabung uji diisi dengan 1,0 mL substrat amilum 1%, tabung kontrol dibiarkan kosong sedangkan blanko diisi dengan 2,0 mL buffer posfat 0,05 M pH 7,0. Ketiga tabung dimasukkan ke dalam waterbath dan diinkubasi pada suhu 40°C selama 5 menit. Setelah diinkubasi selama 5 menit, ke dalam tabung uji dan kontrol masing-masing ditambahkan 1,0 mL ekstrak kasar enzim dan diinkubasi kembali dalam waterbath dengan suhu 40°C selama 15 menit. Setelah diinkubasi selama 15 menit, masing-masing tabung (uji, kontrol dan blanko) ditambahkan 2,0 mL DNS dan pada tabung kontrol ditambahkan 1,0 mL substrat amilum 1%, kemudian ketiga tabung ini dimasukkan kedalam waterbath pada suhu 100°C selama 10 menit. Selanjutnya larutan didinginkan dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm (Anam, 2010). Bakteri yang menghasilkan aktivitas enzim amilase tertinggi dilakukan optimalisasi pH untuk produksi enzim amilase.
3
g.
Optimalisasi pH produksi enzim amilase
HASIL DAN PEMBAHASAN a.
Isolat bakteri yang menghasilkan aktivitas enzim amilase tertinggi diambil 10% dan dimasukkan kedalam 50 mL media produksi enzim dengan variasi pH media (6,0; 6,5; 7,0 dan 7,5), kemudian diinkubasi dalam shaking incubator pada 120 rpm dan suhu 40°C selama 12 jam. Selanjutnya media yang berisi ekstrak kasar enzim tersebut didinginkan pada suhu 4°C dalam lemari pendingin, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 9500 rpm (Sumrin et al., 2011). Ekstrak kasar enzim disaring dengan filter glass fiber (Whatman GF/C). Ekstrak kasar enzim amilase yang diperoleh ditentukan aktivitasnya.
Penentuan aktivitas enzim amilase tertinggi dari bakteri LBKURCC45, LBKURCC46 dan LBKURCC55
Aktivitas ekstrak kasar enzim amilase yang dihasilkan dari ketiga isolat ditentukan berdasarkan jumlah gula pereduksi yang dihasilkan dari reaksi antara amilase dengan amilum 1% sebagai substratnya tiap satuan waktu. Kadar gula pereduksi ditentukan dengan metode DNS (Dinitrosalisilyc acid). Hasil aktivitas amilase dari ketiga isolat pada pH 7,0 suhu 40°C dan agitasi 120 rpm dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Aktivitas ekstrak kasar enzim amilase yang dihasilkan dari tiga isolat Pseudomonas stutzery pada pH 7 media produksi Isolat
Aktivitas Enzim Amilase x 10-3 (U/mL)
LBKURCC45
10,8642
LBKURCC46
15,1851
LBKURCC55
9,6296
Data aktivitas ekstrak kasar enzim amilase yang diperoleh menunjukkan bahwa isolat Pseudomonas stutzery LBKURCC46 menghasilkan aktivitas enzim amilase tertinggi sebesar (15,1851 x 10-3) U/mL dibandingkan dua isolat lainnya. Sehingga untuk optimalisasi pH, suhu dan agitasi produksi enzim amilase digunakan isolat Pseudomonas stutzery LBKURCC46.
b. Penentuan pH optimal untuk produksi enzim amilase dari isolat LBKURCC46 Produksi enzim amilase dari isolat bakteri LBKURCC46 dilakukan dengan variasi pH media produksi yaitu 6,0; 6,5; 7,0; dan 7,5 menggunakan buffer posfat 0,05 M pada suhu 40°C dan agitasi 120 rpm. Dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Aktivitas ekstrak kasar enzim amilase yang dihasilkan dari Pseudomonas stutzery LBKURCC46 pada variasi pH media produksi Variasi pH
Aktivitas Enzim Amilase x 10-3 (U/mL)
6,0
7,5308
6,5 7,0
27,5308 15,1851
7,5
5,5555
4
Tabel 2 menunjukkan bahwa semakin tinggi pH maka aktivitas enzim semakin meningkat, setelah pH optimum aktivitas enzim mulai menurun dengan kenaikan pH. Menurut Asnani dan Puji (2009) perubahan pH atau pH yang tidak sesuai akan menyebabkan rusaknya struktur sekunder dan tersier (denaturasi) pada enzim. Perubahan pH ini menyebabkan berubahnya struktur katalitik pada permukaan enzim sehingga akan berpengaruh terhadap bagian aktif enzim untuk membentuk kompleks enzim substrat. Penyebab lain turunnya aktivitas enzim menururt Nisa et al. (2013) adalah perubahan muatan enzim beserta substratnya. Hal ini terjadi karena adanya perubahan sifat ionik yang terdapat pada gugus karboksil dan gugus amino pada enzim. Perubahan muatan pada enzim dapat mempengaruhi aktivitas enzim, pada nilai pH rendah enzim mengalami protonasi dan kehilangan muatan negatifnya. Hal yang sama pada pH tinggi substrat akan terionisasi dan kehilangan muatan positifnya. KESIMPULAN Aktivitas enzim amilase masingmasing isolat Pseudomonas stutzeri pada kondisi fermentasi pH 7,0 suhu 40°C dan agitasi 120 rpm yaitu LBKURCC45 sebesar (10,8642 x 10-3) U/mL, LBKURCC46 sebesar (15,1851 x 10-3) U/mL dan LBKURCC55 sebesar (9,6296 x 10-3) U/mL, jadi isolat yang memiliki aktivitas enzim amilase tertinggi adalah bakteri Pseudomonas stutzery LBKURCC46. Hasil optimalisasi produksi enzim amilase diperoleh pada pH 6,5 sebesar (27,5308 x 10-3) U/mL.
UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapakan terima kasih kepada Ibu Dra. Silvera devi, Sy, M.Si dan Bapak Prof. Dr. Saryono, M.Si yang telah berkenan membimbing dan memotivasi serta membantu penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. DAFTAR PUSTAKA Anam, K. 2010. Laporan Praktikum Mikrob dan Potensinya, Produksi Enzim Amilase. Bioteknologi Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor, Bandung. Asnani, A dan Puji, L. 2009. Aktivitas Amilase, Lipase dan Protease dari Cacing Peryonic excavates. Jurnal Molekul. 4: 115-121. Karri, S., Sridhar, G, T., Renuka dan Sunny, D. 2014. Screening and Production Optimisation of αamylase from Aspergillus Strains by Using Solid State Fermentation. International Journal of Current Microbiology and Appliyed Sciences. 3(4): 623-631. Lily, M.K., Ashutosh ,B., Kamlesh K.B., dan Koushalya D. 2012. Production, Partial Purification and Characterization of α-Amilase from High Molecular Weight Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (HMWPAHs) Degrading Bacillus subtilis BMT4i (MTCC 9447). Turkish Journal of Biochemistry. 37(4): 463–470. Melliawati, R., Ricky S, S., and Bambang, S. 2006. Pengkajian Kapang Endofit Dari Taman Nasional Gunung Halimun Sebagai 5
Penghasil Glukoamilase. Berk. Panel. Hayati. 12: 19-15. Nisa, K., Wuryanti dan Taslimah. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Amobilisasi α-amilase dari Aspergillus niger FNCC 6018. Chem Info. 1:141-149.
Prosiding Kimia FMIPA. Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya. Sebayang, F., Nisa, K., Wuryanti dan Taslimah. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Amobilisasi αamilase dari Aspergillus niger FNCC 6018. Chem Info. 1:141-149.
Pandey, A., Nigam, P., Soccol, C.R., Soccol, V.T., Singh, D., dan Mohan, R. 2000. Advances in Microbial Amylases. Biotechnol. Appl. Biochem. 31: 135-152.
Setiasih, S., Budiasih, W., dan Trismilah. 2012. Karakterisasi Enzim α-Amilase Ekstrasel dari Isolat Bakteri Termofil SW2. Jurnal Kimia Indonesia. 1(1): 22-27.
Robi’a. 2012. Skrining Bakteri Endofitik dari Umbi Tanaman Dahlia (Dahlia variabilis). Skripsi. FMIPA Universitas Riau, Pekanbaru.
Sumrin, A., Waqar, A., Bushra, I., Muhammad, T.S., Sana, G., Humera, K., Imran S., Shah, J., Sultan, A., Mureed, H., dan Sheikh, R. 2011. Purification and Medium Optimization of α-amilase from Bacillus subtilis 168. African Journal of Biotechnology. 21192129.
Sarah., Surya, R.P., dan Herdayanto, S.P., 2010. Isolasi α-Amilase Termostabil dari Bakteri Termofilik Bacillus stearothermophilus.
6
