Ekotoxikologie Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta
Katedra analytické chemie RNDr. R. Čabala, Dr. ZS 2006 - 20013
5. Ekotoxikologické výzkumné a testovací metody Všeobecné principy Výzkumné systémy Standardizace
Testy toxicity pro vodní systémy Baktérie Řasy Nálevníci a vířníci Ryby
Testy toxicity pro půdní ekosystémy Mikrobiální Vyšší rostliny Žížaly Ptáci
Ekotoxikologické hodnocení systémů ŽP Hranice vypovídací schopnosti testů toxicity ZS 2013
Ekotoxikologie
2
Ekotoxikologické testy Všeobecné principy Základní rozpor ekotoxikologie se zabývá všemi stupni ekosystému ekotoxikologické testy (biotetsy) prováděny na vybraných organismech koncepčně se má postihnout komplexnost ekosystému na základě několika testů Praktické ekotoxikologické testy předepsány zákony pro přihlašování, evidenci a klasifikaci chemikálií prováděny na organizmech, které se snadno chovají v laboratoři (baktérie, řasy, vyšší rostliny, červi, hmyz, korýši, ryby, obojživelníci, ptáci) měřené parametry: odbourávání, rozšiřování, akumulace a působení chemikálií pro závěrečné hodnocení rizik se používá kombinace testů na organizmech různých trofických úrovní celkem registrováno 80 - 100 ekotoxikologických testů (OECD a národní úřady ochrany přírody) ZS 2013
Ekotoxikologie
3
Ekotoxikologické testy OECD předpisy pro ekotoxikologické testy (Organization for Economic Co-operation and Development)
Chemical Testing Programme - 1979/80, Premarket Testing Programme, Guidelines for Testing of Chemicals, GLP Přesný popis testu: organizmus, podmínky, průběh, vyhodnocení Testovací rozsah produkované množství (REACH) Typ testu
Fyzikálněchemické vlastnosti
Odbourávání a akumulace
ZS 2013
Číslo OECD
Metoda
101
Absorpční spektra
102, 103, 104
Bod tání, bod varu, tlak nasycených par
105, 106
rozpustnost ve vodě, adsorpce a desorpce
107, 117
Rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (Kow)
111
Závislost hydrolýzy na pH
112
Disociační konstanta ve vodě
301, 302
Biodegradace
304
Biodegradace v půdě
305
Bioakumulace v rybách
306
Biodegradace ve vodě Ekotoxikologie
4
Ekotoxikologické testy OECD předpisy pro ekotoxikologické testy - ekotoxicita Číslo 201
Zelené řasy: zpomalení růstu - akutní (primární producent)
202
Daphnia magna: znehybnění - akutní, reprodukce - chronický (primární konzument)
203
Ryby: akutní (sekundární a terciární konzument)
204
Ryby: prodloužená (14 dní, sekundární a terciární konzument)
205
Ptáci: akutní orální (terciární a kvartérní konzument)
206
Ptáci: reprodukce (terciární a kvartérní konzument)
207
Žížaly: akutní (sekundární konzument)
208
Vyšší rostliny: zpomalení růstu - akutní (primární producent)
209
Aktivní kal z ČOV: zpomalení respirace - akutní (destruenti)
210
Ryby: ELST, ranná vývojová stadia
211
Daphnia magna: reprodukce - chronický
212
Ryby: krátkodobé u embrya a larvy
213, 214 215 216, 217 ZS 2013
Metoda
Včela medonosná: akutní orální a kontaktní toxicita (primární konzument) Ryby: růst u mladých Půdní mikroorganizmy: N- a O-transformace (destruenti) Ekotoxikologie
5
Ekotoxikologické testy Trofická pozice v ekotoxikologii často používaných organizmů Systém
Vodní
Půdní
ZS 2013
Organizmus
Pozice
Baktérie
Vibrio fischeri, Pseudomonas, smíšené populace
destruenti
Zelené řasy
Raphidocelis subcapitata
primární producenti
Perloočko
Daphnia magna
primární konzumenti
Ryby
Oncorhynchus mykiss, teplotně adaptované
sekundární konzumenti
Baktérie
-
destruenti
Vyšší rostliny
jedno- a dvojděložné
primární producenti
Žížaly
Eisenia foetida
primární konzumenti
Členovci: chvostoskoci
Collembola
primární konzumenti
Obratlovci
ptáci a savci
sekundární a terciární konzumenti
Ekotoxikologie
6
Ekotoxikologické testy Testy toxicity pro vodní systémy Testovaný parametr
Organizmus Baktérie
Zelené řasy Vodní rostliny Vířníci Červi Mlži Korýši Hmyz
Ryby
Linie rybích buněk ZS 2013
Fosforeskující baktérie (Vibrio fischeri) Smíšené populace Pseudomonas putida Scenedesmus subcapitatus Raphidocelis subcapitata Okřehek menší (Lemna minor) Rotifera - Brachyonus sp. Kroužkovci, máloštětinatci (Tubifex tubifex) Slávička mnohotvárná (Dreissena polymorpha) Slávka jedlá (Mytilus edulis) Perloočko (Daphnia magna, D. pulex) Žábronoška solná (Artemia salina) Pakomár (Chironomus tentans) Pstruh (Oncorhynchus mykiss) Jelec jesen (Leuciscus idus) Živorodka duhová (Poecilia reticulata)
bioluminiscence inhibiční testy aktivovaných kalů zpomalení dýchání a růstu růst zpomalení buněčného dělení příjem 14C fluorescence chlorofylu růst akutní toxicita akutní toxicita sedimentu akutní a chronická toxicita nehybnost (24 h) reprodukce (14, 21 dní) akutní toxicita larev akutní toxicita sedimentu akutní toxicita
Danio pruhované (Brachydanio rerio)
prodloužená toxicita (14 dní) ELST chronická toxicita (LCT)
buňky pojivových tkání - RTG-2, R1, BF-2 jaterní buňky - PLHC-1, RTL-W1
cytotoxicita, indukce proteinů
Ekotoxikologie
7
Ekotoxikologické testy Biotesty Analytické metody, které používají živé organizmy nebo jejich společenstva definovaným způsobem k měření reakcí vyvolaných expozicí chemikáliím Sledované parametry: akutní - mortalita, chronické - specifické vlastnosti Cíle zjištění, charakterizace a hodnocení ekotoxicity chemikálií, jejich směsí a vzorků ŽP definice tříd nebezpečnosti pro ŽP charakterizace a hodnocení rizik chemikálií pro ŽP
Fáze ekotoxikologických testů 1.Příprava testu
shromáždění základních fyzikálně-chemických dat: rozpustnost, stabilita, tlak nasycených par, Kow, Koc, H výběr analytické metody
2.Předtest
určení koncentračního rozmezí: LC0 a LC100
3.Test
4 - 5 koncentrací mezi LC0 a LC100
4.Vyhodnocení a sepsání zprávy ZS 2013
vyhodnocení závislosti účinku na koncentraci (logit nebo probit) - výpočet EC50 Ekotoxikologie
8
Ekotoxikologické testy Standardizace biotestů Cíl standardizace: zajistit reprodukovatelnost testů (konstantní citlivost organizmů) Parametry testů
1. Výběr organizmu genetická jednotnost úplná - klony (lze dodržet jen u některých organismů - bakterie, členovci, řasy) podobná - stejný chov vývojové stádium - stejná velikost, stejná strava prostředí - z nezatížených biotopů, aklimatizované 2. Délka testu (dle periody růstu, doby generace a životního cyklu) akutní: 24, 48, 96 h chronické: 21-28 dní, celý životní cyklus (life cycle - LC) ZS 2013
Ekotoxikologie
9
Ekotoxikologické testy Standardizace biotestů 3. Provedení statické: látka přidána do systému na začátku testu, dávka není obnovována
Kontinuální uspořádání
pokles koncentrace látky v průběhu testu - odbourávání, sorpce, těkání vhodné pro krátké akutní testy, nevhodné pro chronické testy
polo-průtokové: testovaná látka periodicky přidávána do systému se současnou výměnou média
nevhodné pro velmi nestálé a těkavé látky
průtokové: kontinuální dávkování látky do konstantního toku čerstvého média ZS 2013
pro chronické testy Ekotoxikologie
10
Ekotoxikologické testy Testy toxicity pro vodní systémy Počet druhů žijících na Zemi: 20 - 30 milionů Povrch Země: 70 % voda ~ 70 - 80 % druhů organizmů význam pro život
BAKTÉRIE Destruenti - zodpovědné za odbourávání organické hmoty v půdě, vodě, sedimentech, aktivovaných kalech (ČOV) Prokaryonta - ochranný efekt buněčné membrány - často méně citlivé než Eukaryonta - výkonné adaptační mechanizmy Krátký generační čas a rychlý metabolizmus - rychlé odpovědi na chemikálie Měřené parametry: růst, dýchání (spotřeba O2, NO3-, org. látek), inhibice enzymů, bioluminiscence Test inhibice dýchání u aktivovaného kalu (OECD 209) akutní působení chemikálií na aerobní mikroorganizmy v a.kalu biologického stupně ČOV, měří se změny rychlosti dýchání (spotřeba O2) a. kalu, které jsou úměrné látkové výměně - relativně málo citlivý ZS 2013
Ekotoxikologie
11
Ekotoxikologické testy MICROTOX - Akutní test toxicity (BioFix® Lumi) Salinní bakterie Vibrio fischeri při nerušeném metabolizmu vykazuje bioluminiscenci (luciferáza v dýchacím cyklu) redukce intenzity biolouminiscence vlivem působení škodliviny změna koreluje s toxicitou škodliviny často jako screening test vzorky: chemikálie, jejich směsi, odpadní vody, extrakty sedimentů a půd dobře reprodukovatelný pro rozpustné látky s nespecifickými účinky EC50 dobře korelují s testy na perloočkách (R2 = 0,7 - 0,9) MUTATOX - Test mutagenity Mutovaná forma Vibrio fischeri - ztráta bioluminiscence zpětná mutace působením mutagenů - návrat schopnosti bioluminiscence ZS 2013
Ekotoxikologie
12
Ekotoxikologické testy
Salinní baktérie Vibrio fischeri vykazující bioluminiscenci
Reaktivace Příprava základního roztoku, úprava pH
Příprava suspenze bakterií Příprava testovacích roztoků
Stanovení počáteční luminiscence
Přídavek škodliviny začátek testu
Inkubace 10-30 min
Stanovení konečné luminiscence ZS 2013
Ekotoxikologie
13
Ekotoxikologické testy ŘASY(OECD 201) Snadno a rychle rostoucí řasy Růstové křivky - závislost hustoty buněk v kultivačním roztoku na době kultivace v čistém médiu v médiu se škodlivinou Měření počtu buněk manuálním počítáním pod mikroskopem fotometricky - s rostoucím počtem buněk roste (Lambert-Beerův z.) absorbance při 578 nm fluorescence chlorofylu
Růstová křivka
Vyhodnocení růstových křivek rychlost růstu Závislost rychlosti růstu na koncentraci chemikálie hodnoty EC0, EC50, EC100 ZS 2013
Ekotoxikologie
14
Ekotoxikologické testy
Růst řas Chlorella vulgaris
Růst řas Chlorella vulgaris v přítomnosti Cd (10 mol/l Cd2+) a kontrola
Fosforescence chlorofylu - s rostoucím vlivem škodliviny roste poškození buněk a tím roste její intenzita Metabolické využití 14CO2 - měření radioaktivity buněk - s jeho poklesem roste toxicita ZS 2013
Ekotoxikologie
15
Ekotoxikologické testy ŘASY - Inhibice růstu (OECD 201) Srovnání růstových křivek mezi zatíženými a kontrolními kulturami srovnání rychlostí růstu
Kmenová kultura
Příprava testovacích roztoků Předkultura (3 dny) Určení počtu buněk
Chlorella vulgaris
Průběh testu Expozice 24/48/72 hod
Určení počtu buněk ZS 2013
Ekotoxikologie
16
Ekotoxikologické testy KORÝŠI (Crustacea) Sladkovodní zooplankton 3 hlavní skupiny: Vířníci (Rotaria), Perloočka (Cladocera) a Klanonožci (Copepoda)
Hrotnatka velká (Daphnia magna, OECD 202)
dospělec 5-6 mm aktivní pohyb - jinak klesá ke dnu rozmnožování partenogeneze klony (značná variabilita citlivosti) sexuální trvanlivá, vysoce odolná vajíčka pro přezimování citlivá na pH - pod pH 5 se nevyskytuje filtruje potravu - zelené řasy (> 1 m)
Chronický test (14 - 21 dní)
NOEC hodnoty pro reprodukci (počet mladých jedinců), mortalitu, dobu vyvedení potomstva průtokové či polo-průtokové provedení
ZS 2013
Ekotoxikologie
17
Ekotoxikologické testy Hrotnatka velká (Daphnia magna, perloočko, vodní blecha)
Akutní test (OECD202) počítání nehybných (15s) jedinců po 24/48 hodinách působení chemikálie (ve tmě)
Nastavení pH
Kmenová kultura
500 g Cd2+
4
Příprava sady testovacích roztoků
Chov testovacích jedinců
Začátek testu Expozice 24/48 h
Počítání nepohyblivých jedinců ZS 2013
Ekotoxikologie
Kontrola pH a O2 18
Ekotoxikologické testy Žábronoška solná (Artemia salina) slaná a brakická voda snadný chov z trvanlivých vajíček (líhnutí po 24 hod ve slané vodě) mortalita po 24 hod - výtečný screening test ArtoxKit M™
ZS 2013
Ekotoxikologie
19
Ekotoxikologické testy Sladkovodní mikrozooplankton - 2 hlavní třídy
Nálevníci (Ciliophora)
živí se bakteriemi působením škodlivin omezují příjem potravy nárůst bakteriálních kolonií - parametr toxického účinku
Vířníci (Rotifera)
známo asi 1270 druhů živí se nanoplanktonem - filtrují vodu rozmnožování partenogeneze klony používané k testům sexuální - tvorba trvanlivých a odolných vajíček (cyst) pro přezimování RotoKit M™ - Brachionomus plicatilis vícekomorová destička inkubace 24 hod určení mortality screeningový test
ZS 2013
Ekotoxikologie
Brachionomus plicatilis 20
Ekotoxikologické testy PLŽI (Gastropoda)
Akvarijní chov
Písečník novozélandský
Potamopyrgus antipodarum
(Potamopyrgus antipodarum) sladká a brakická voda, sediment vzorky ŽP reprodukční toxicita a estrogenní účinky Test mortalita po 4/8 týdnech reprodukční výkon
ZS 2013
Vzduch
Příprava testovacího media
60 jedinců
Začátek testu Krmení Výměna testovacího media
Expozice 4(8) týdnů
20 šneků Odstranění a odpočet mrtvých šneků Konec testu
Ekotoxikologie
Omráčení 2% MgCl2
Vyhodnocení 21
Ekotoxikologické testy Chovná líheň vajíček
HMYZ (Insecta) Pakomár Chironomus riparius
Navážka sedimentu
Vylíhnutí po 2-3 dnech
zástupce bentických organizmů větší část života v sedimentu hydrofobnější látky vázané na sediment chronické a akutní testy test - sledované parametry
1. stadium larev
Přídavek kultivačního media
20 larev
7 dní provzdušnění Začátek testu bez provzdušňování
• účinnost líhnutí • rychlost vývoje • poměr pohlaví • plodnost • počet vajíček na snůšku
1 den Začátek provzdušňování 28 dní expozice
Chironomus riparius Líhnutí imag Určení pohlaví
Přestěhování imag ZS 2013
Ekotoxikologie
Určení počtu vajíček v líhni 22
Ekotoxikologické testy RYBY (Pisces) Známo asi 20000 druhů - významná složka lidské stravy Zástupci mnoha trofických úrovní: primární, sekundární a terciární konzumenti
Testy převážně na ranných vývojových stádiích - mladé ryby 3 - 8 cm Zástupce našeho ekosystému: pstruh obecný (Salmon trutta), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) Teplotně adaptované druhy: krátký generační čas, snadná kultivace
Akutní toxicita (OECD 203 Fish, Acute Toxicity Test) Mortalita po 24, 48, 96 hod, přímo - LC0 a LC100, LC50 ze závislosti účinku na koncentraci, na jeden test potřeba 50-80 ryb
Chronická toxicita 14-28 dní, určení NOEC, měří se: vzhled (změny zabarvení), příjem potravy, chování (způsob plavání - on-line videokamerou a vyhodnocení), hematologické a histopatologické parametry (tkáně uhynulých zvířat), funkční změny (inhibice a indukce enzymů - např. acetylcholinesteráza) ZS 2013
Ekotoxikologie
23
Ekotoxikologické testy Druhy ryb často používané v testech toxicity
ZS 2013
Druh
Velikost (cm)
Teplota vody (°C)
Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss)
4-8
13-17
Danio pruhované (Brachydanio rerio)
2,5-3,5
20-24
Jelec jesen (Leuciscus idus)
4-8
20-24
Kapr obecný (Caprinus carpio)
4-8
20-24
Živorodka duhová (Poecilia reticulata)
2-4
20-24
Pimephales promelas
3-7
20-24
Halančík japonský (Oryzias latipes)
2-7
20-24
Ekotoxikologie
24
Ekotoxikologické testy Druhy ryb často používané v testech toxicity Pimephales promelas Pstruh obecný (Salmo trutta)
Jelec jesen (Leuciscus idus)
Živorodka duhová (Poecilia reticulata) Halančík japonský (Oryzias latipes)
ZS 2013
Ekotoxikologie
25
Ekotoxikologické testy Testy na ranných vývojových stadiích (Early Life Stage Tests - ELST) Účinky chemikálií na ranná vývójová stadia organizmů Ranná stadia zvláště citlivá - oplozené vajíčko, embryonální stadia vývoje, larva s vaječným váčkem, aktivně se živící larva Sledované parametry podíl vylíhnutých larev, vývojové deformace, růst, mortalita, neobvyklé chování Dobrá vypovídací hodnota u nespecificky působících látek alifatické, aromatické a chlorované uhlovodíky, alkoholy, étery, ketony, aldehydy a nitrosloučeniny
Provedení (OECD 210 - ELST) polostatické či průtokové uspořádání, začátek - oplozená vajíčka, konec - larva před úplnou resorpcí vaječného váčku, pstruh - 50 dní/10°C, ostatní ryby 8-10 dní/21-24°C, 2 paralelní vzorky po 30 vajíčcích, 5 koncentrací mezi LC0 a LC100 a kontrola ZS 2013
Ekotoxikologie
26
Ekotoxikologické testy
Testy na životním cyklu (Life Cycle Test) Chronické působení látek po dobu celého životního cyklu - účinky na rozmnožování, plodnost a kvalitu potomstva Životní cyklus embryo (1. generace) až larva s vaječným váčkem (2. generace) Organizmy vířníci, korýši, šneci, žáby a ryby - krátký životní cyklus (LC) Sledované parametry podíl vylíhnutých larev, jejich růst a mortalita, produkce vajíček, podíl oplodněných vajíček - LOEC, NOEC Provedení 12-52 týdnů, průtokové uspořádání, teplotně adaptované ryby s krátkým LC Vysoké náklady - provádí se jen u produkčně významných chemikálií ZS 2013
Ekotoxikologie
27
Ekotoxikologické testy NOEC hodnoty v LCT pro Danio pruhované (Danio rerio) Látka
Testovací koncentrace (mg/l)
F1-generace ranné stádium (mg/l)
Juvenilní (mg/l)
Dospělí (mg/l)
F2-generace ranné stádium (mg/l)
Atrazin
0,1-1-10
0,1
-
1,0
1,0
4-Nitrofenol
0,1-1-5
5,0
-
5,0
0,1
3,4-Dichloranilin
0,002-0,02-0,2
0,02
-
0,02
0,002
Lindan
0,04-0,08-0,11-0,13-0,15
0,11
0,08
0,04
0,08
Danio rerio
ZS 2013
Ekotoxikologie
28
Ekotoxikologické testy In-vitro testy (testy na buněčných kulturách) Testování chemikálií na rybách - etické a ekonomické problémy Švýcarsko r. 2001 - 8000 ryb Německo r. 1991 - 200000 ryb Vývoj in-vitro metod - výzkum základních molekulárně-biologických buněčných procesů - i pro klasickou toxikologii - Bílá kniha EU (2001) přednost před klasickými in-vivo testy (v celkovém hodnocení rizik jsou ale nezastupitelné) Buněčné kultury monovrstvy nebo roztoky v živných roztocích (10% telecí sérum) teploty 18-30°C původ buněk: pojivové tkáně (fibroblasty) žábry játra - důležitá role při detoxifikaci škodlivin Sledované parametry - poškození buněk specifické biochemické reakce - akutní toxicita mutagenita indukce bílkovin - Cytochrom P450 závislé monooxygenázy, MT, stresové proteiny, endokrinní efekty ZS 2013
Ekotoxikologie
29
Ekotoxikologické testy Buněčné kultury
Primární buňky Pochází z odkrvených tkání ryb uvolnění proteolytickými enzymy frakcionace jednotlivých druhů buněk kultivace, naředění tetsy Omezená kultivační doba rychlá ztráta metabolické aktivity Vyšší variabilita výsledků variabilita citlivosti dárcovských ryb
Buněčné linie - kontinuální Dlouhodobá kultivační doba několik generací udržují si vlastnosti primárních buněk ZS 2013
Ekotoxikologie
30
Ekotoxikologické testy Buněčné kultury
Buněčné linie - trvalé Původ pojivová tkáň nebo epitel embryonální nebo nádorové buňky Neomezená kultivační doba Příklady nomenklatury buněčných linií RTG-2 ... Rainbow trout gonads PLHC-1 ... Poecliopsis lucida Hepatocarcinom Využití buněčných linií - v rámci cytotoxických měření akutní testy toxicity chemikálií a jejich směsí aditivní, synergické a antagonistické efekty testy vzorků ŽP - odpadní vody, sedimenty, aktivní kaly QSAR - korelace cytotoxicity a akutní toxicity s fyzikálně-chemickými vlastnostmi látek měření specifických biochemických parametrů - indukce proteinů apod. ZS 2013
Ekotoxikologie
31
Ekotoxikologické testy Měření buněčné vitality a toxicity Měřené parametry buněčná morfologie, ulpívání buněk na stěnách, cytotoxicita (NR- a MTT-testy) Cytotoxicita vybarvování buněk reakcemi s barevnými činidly v mikrotitračních destičkách
Test s neutrální červení (Neutral Red Test) Princip zdravé buňky se barví difúzí neutrální červení (NR) kation NR se váže na záporně nabitá místa buněčné a lysozomové membrány - lysozomy se barví červeně při poškození membrány přestává buňka přijímat NR závislost intenzity barvy na toxickém účinku látky ZS 2013
Ekotoxikologie
32
Ekotoxikologické testy
Příjem neutrální červeni (% kontroly)
Buněčná toxicita organocínových sloučenin (NR-Test)
Chlorid cíničitý
Chlorid tributylcínu
Chlorid butylcínu
Tetrabutylcín Oxid bis(tributylcínu)
Chlorid dibutylcínu
Koncentrace (mol/l) ZS 2013
Ekotoxikologie
33
Ekotoxikologické testy Test s MTT (MTT-Test)
Buněčná toxicita [ log (1/EC50)]
Test inhibice enzymů v mitochondriích MTT ... 3-(4,5-Dimethyl-1,3-thiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid slabě žluté barvivo Princip barvivo je přijímáno živými buňkami v mitochondriích přeměněno sukcinátdehydrogenázou na sytě modrou nerozpustnou formu (Formazan) poškozené buňky barvivo netransformují - mitochondrie Organo-Sn se nebarví spektrometrické stanovení modré barvy mitochondrií v mikrotitračních destičkách Fenoly intenzita vybarvení koreluje s toxicitou látky Korelace in-vitro toxicity (PLHC-1) a akutní toxicity u ryb ZS 2013
Ekotoxikologie
Akutní toxicita [ log (1/LC50)]
34
Ekotoxikologické testy Měření akutní toxicity provedená na liniích rybích buněk Buněčná linie
Druh ryby
R1 (fibroblasty) RTG-2 (fibroblasty)
Pstruh
D-11 (fibroblasty)
Testovaný parametr
Látky a vzorky
morfologie, růst, přilnavost buněk, vyloučení trypanové modři, vylučování laktátdehydrogenázy
kovy (Cu, Zn, Cd, Pb, Hg), EDTA, tenzidy, odpadní vody
příjem thymidinu, přilnavost buněk, buněčná smrt, NR- a KV-test
PAH, kovy (Cd, Pb, Cr, Cu), tenzidy, fenoly, anilin, extrakty sedimentu
NR- a KV-test
tenzidy, fenoly, anilin, kovy (Cd, Cu, Cr)
BF-2 (fibroblasty)
Lepomis macrochirus
přilnavost buněk, NR- a MTT-test, buněčné proteiny
PCB, DDT, PAH, Heptachlor, Aldrin, toluen, fenoly, kovy, alkylbenzeny, organokovy, extrakty sedimentu
FMH (fibroblasty)
Pimephales promelas
NR- a MTT-test, buněčné proteiny
organokovy, PCB, PAH, fenoly, DDT, Chlordan
NR- a MTT-test, buněčné proteiny, příjem bromdeoxyuridinu
Organo-Sn, kovy (Cu, Cd, Zn, Co, Pb, Ni), fenoly, alkylbenzeny, tenzidy, pesticidy, extrakty vzorků ŽP
PLHC-1
P.lucida
(NR-test: neutrální červení, KV-test: krystalovou violetí, MTT-test: tetrazoliem) ZS 2013
Ekotoxikologie
35
Ekotoxikologické testy Vypovídací hodnota in-vitro testů omezená - chybí vliv celého metabolizmu screeningové testy - selekce problematických látek pro in-vivo testy Zkoušky vzorků ŽP velká propustnost vzorků a úspora nákladů a ryb studie na 400 vzorcích - 87% shoda in-vitro testů a akutních testů toxicity na rybách falešné pozitivní a falešné negativní výsledky nezbytnost in-vivo testů pro výsledné hodnocení rizik chemikálií pro mnoho látek - dobrá korelace mezi fyzikálně chemickými vlastnostmi a jejich toxicitou - log Kow a cytotoxicita in-vitro
Chronické parametry toxicity prakticky pouze na jaterních buňkách s permanentní metabolickou aktivitou indukce bílkovin, metabolizace škodlivin, indukce cytochrom P450 aktivity ZS 2013
Ekotoxikologie
36
Ekotoxikologické testy Výhody a hranice in-vitro testů Výhody Dobrá korelace cytotoxicity fibroblastů a hepatogenních buněk s akutní toxicitou u ryb Rostoucí úloha těchto testů při hodnocení rizik spojených s chemikáliemi - ekonomické a etické důvody Objasnění biochemických mechanizmů Nevýhody nepoužitelné na studium specifického působení chemikálií na vybrané tkáně farmakokinetiku omezeně použitelné na chronickou toxicitu
ZS 2013
Ekotoxikologie
37
Ekotoxikologické testy Výhody a hranice in-vitro metod ve srovnání s in-vivo metodami Výhody
Nevýhody
Kontrolovatelný a standardizovaný testovací materiál
Chybějící celkový vliv metabolizmu
Malá variabilita a vysoká reprodukovatelnost
Není zahrnut celkový osud látky v organizmu Často malá metabolická aktivita
Studium mechanizmů toxicity
Špatně pozorovatelné chronické působení
Nízké náklady při velkém počtu vzorků - Měřitelné pouze nominální a nikoliv screening reálné koncentrace látek Ochrana zvířat - etika
ZS 2013
Nelze studovat bioakumulaci
Ekotoxikologie
38
Ekotoxikologické testy Testy toxicity pro půdní systémy Půdní ekosystémy a testy jejich toxicity - málo prozkoumané Půda a sediment - vysoká sorpční kapacita pro: nepolární látky látky kladně nabité kationty těžkých kovů Přístupy testování půdy a sedimentů - testy celé půdy biologicky dostupných částí půdní eluáty pórová (intersticiární) voda vodné extrakty organické extrakty (dosud není přesně známa vypovídací hodnota těchto testů) ZS 2013
Ekotoxikologie
39
Ekotoxikologické testy Negativní vlivy na půdu vhodné pro testy funkce půdy ~ úrodnost - převažující přístup hodnocení vlivů struktura půdy = složení a výskyt jednotlivých druhů organizmů v půdě četnost skupin organizmů v nezatížené půdě 60% houby, 25% baktérie, 12% žížaly, zbytek - mnohonožky, řasy, chvostoskoci, hlístice, prvoci atd. často zanedbávaný aspekt Oba přístupy nelze provádět najednou i když se tyto vlivy doprovázejí! Nedostatečnost funkčního srovnání: produkce CO2 × nitrifikace všechny heterotrofní organizmy dýchají - produkují CO2 - efekt se projeví pouze při masivním zatížení pouze dvě skupiny nitrifikačních bakterií - Mikrosomas a Nitrobacter nitrifikační aktivitu lze snadno zcela potlačit již malým zásahem
ZS 2013
Ekotoxikologie
40
Ekotoxikologické testy Testy toxicity půd založeny na testech na vybraných půdních organizmech většina testů není standardizována a validována většina standardních OECD testů je pro půdu jen omezeně použitelná #205, 206, 401, 402, 403 pouze dvě metody skutečně relevantní - #207 (žížaly), #208 (inhibice růstu vyšších rostlin) mnoho testů s bezobratlými ve vývoji: vnitro- a mezidruhové rozdíly nedostatek chronických testů (vyšší vypovídací hodnota oproti akutním)
Mikrobiální testy (houby a baktérie) zástupce destruentů - 85% půdní biomasy výchozí princip: korelace mikrobiální aktivity s kvalitou (vitalitou) půdy měřený pokles půdní aktivity je mírou jejího zatížení obecně nepříliš citlivé neodrážejí obrovskou biodiverzitu půdy ZS 2013
Ekotoxikologie
41
Ekotoxikologické testy Mikrobiální testy
Test půdního dýchání a odbourávání látek
měření produkce CO2 během 30 dní - použití 14C-acetátu měření produkce 14CO a úbytku 14C-acetátu 2 nezachycuje selektivní vlivy na organizmy ani vývoj rezistence
Test produkce amoniaku a nitrifikace
měření produkce anorganického N z půdní biomasy - schopnost velkého množství mikroorganizmů měření tvorby NO3- z NH3 - selektivní pro dva druhy mikroorganizmů
Měření celkové enzymatické aktivity
enzymy relevantní pro mikroorganizmy: ureázy, dehydrogenázy, fosfatázy inkubace enzymového substrátu homogenně smíšeného s půdou ve tmě při 20°C - tvorba enzymatických produktů a jejich spektrofotometrické stanovení malá reprodukovatelnost a omezená vypovídací hodnota - přílišná variabilita vlastností půdy
ZS 2013
Ekotoxikologie
42
Ekotoxikologické testy Testy na vyšších rostlinách Používané rostliny Jednoděložné - rýže, pšenice, oves Dvouděložné - řepka, hořčice, ředkvičky, řepa Ostatní - rajčata, luštěniny Parametry testů redukce růstu naklíčených semen růst nadzemních a kořenových částí rostlin po 14 dnech průměrná hmotnost čerstvé biomasy (OECD 208) Relativně necitlivý Zohledňuje pouze ranná vývojová stadia
ZS 2013
Ekotoxikologie
43
Ekotoxikologické testy Růstový test s Okřehkem menším
Kmenová kultura
(Lemna minor) Příprava testovacích roztoků
Princip Ovlivnění růstu škodlivinami
Předkultura
Měřené parametry snížená produkce biomasy čerstvá a suchá biomasa zmenšení rozměru snížení obsahu chlorofylu
5 kolonií po 2 rostlinách
Odpočet rostlin a jejich plochy Začátek testu
CCD kamera
7 dní expozice
Extrakce
Lemna minor
Odpočet rostlin
Určení plochy rostlin
Stanovení chlorofylu
Stanovení sušiny ZS 2013
Ekotoxikologie
44
Ekotoxikologické testy Testy na žížalách (Eisenia foetida) OECD 207 Nejdůležitější test pro půdy Příjem škodlivin celým povrchem těla
Adaptace na testovací podmínky
Namíchání testovací půdy
7 dní 10 jedinců
Příprava testovací půdy
Princip měření akutní toxicity v definované půdě Začátek testu
Měřené parametry přírůstek hmotnosti mortalita plodnost
Krmení
Odstavení
Akutní - 4 týdny Chronický - více než 4 - 8 týdnů ZS 2013
4 týdny expozice Tvorba kokonů
Odběr dospělců a vyhodnocení
Vyhodnocení mláďat Ekotoxikologie
45
Ekotoxikologické testy Test na žížale Lumbricus rubellus
Naplnění, stanovení vody
(příbuzná Eisenii foetida)
Odpočet jedinců Zásobní roztok
Princip sledování únikového chování ze zatížené oblasti
Aplikace Cd Homogenizace 80 jedinců
Měřené parametry počet jedinců mimo zamořenou oblast
Nanesení startovací plochy
Začátek testu Expozice 7 dní
Odpočet ZS 2013
Ekotoxikologie
46
Ekotoxikologické testy Test na háďátku Caenorhabditis elegans Sediment
Suspenze bakterií
0,5 g
0,5 ml
J1-červi Příprava červů
Princip Ovlivnění růstu a reprodukce Měřené parametry délka těla (kolem 1 mm) podíl plodných jedinců
Převrstvení sedimentu bakteriální suspenzí
10 J1-červů
Začátek testu 72 h inkubace 60°C Sediment a červi
Konec testu: usmrcení a zabarvení Odlití supernatantu
Vyhodnocení
Promísení a centrifugace ZS 2013
Ekotoxikologie
47
Ekotoxikologické testy Test na Salmonella typhimurium
Noční kultura
(umu-test)
Příprava vzorků
Princip umuC-gen mutant baktérie (TA 1535/pSK1002) genotoxické látky indukují aktivitu jinak inaktivního umuC-genu zvýšená produkce b-galaktozidázy katalýza tvorby barviva z přidaného substrátu spektrofotometrické stanovení rostoucí intenzita zabarvení koreluje s rostoucí genotoxicitou
Nastavení počtu buněk ředění 1 h, 37°C Začátek testu Inkubace 2 h, 37°C
Přeočkování, zředění 1:10 Inkubace 2 h, 37°C Odečet buněk
Měření absorbance 30 min, 28°C Přeočkování, buněčná lyze a přídavek látky ZS 2013
Ekotoxikologie
Přídavek stop-činidla 48
Ekotoxikologické testy Test na Krásnoočku štíhlém Vz.
(Euglena gracilis) Kmenová kultura
Princip pokles schopnosti a rychlosti pohybu, změny tvaru buňky korelují s rostoucím působením chemikálie vyhodnocování videokamerou
Předkultura
K. Nastavení pH
Příprava testovacích roztoků
Euglena gracilis
Začátek testu Inkubace 24 h
Plnění kyvety
Měření ZS 2013
Ekotoxikologie
49
Ekotoxikologické testy Testy na ptácích Zástupci terciárních a kvartérních konzumentů Nejlepší by byli draví ptáci (špička potravního řetězce) - obtížný chov Snadno chovatelní: perličky, holubi, bažanti, husy Akutní: LD50 po 5 dnech orálního dávkování (OECD 205) Subakutní: NOEL po 5 dnech orálního dávkování, Měřené parametry: hmotnostní přírůstek, příjem potravy, enzymová aktivita Reprodukční studie, OECD 206: NOEL 20 dní orální dávkování snůška vajec uměle inkubována do vylíhnutí kuřata sledována 14 dní Měřené parametry: počet vajec, počet vylíhnutých vajec, tloušťka skořápek (DDT), úmrtnost embryí a kuřat Relativně necitlivé vůči látkám typu DDT ZS 2013
Ekotoxikologie
50
Ekotoxikologické testy Ekotoxikologické hodnocení sedimentu Hodnocení kontaminovaných částí ŽP Sedimenty a půda - dekontaminace a bioremediace starých zátěží nutnost kontroly toxicity, stupně vyčištění a účinnosti čistících metod existuje málo spolehlivých metod určení fyzikálně-chemických vlastností rozdělení velikosti částic, pH, TOC, ... ekologická hodnocení popis složení a biodiverzity bentosu testy jednotlivými organizmy - soudobé metody hodnocení Stupňové hodnocení sedimentu - pragmatický způsob hodnocení Stupně metody: fyzikálně-chemická charakterizace chemická analytika kritických škodlivin - těžké kovy, PAH, ... screeningové biotesty - MicroTox, extrakty, pórová voda, ... biotesty ekotoxicity sedimentu pakomáří larvy, Tubifex t. Dafnie, růstový test řas, rybí buněčné linie, ... ZS 2013
Ekotoxikologie
51
Ekotoxikologické testy Testování eluátů a extraktů ze sedimentů Resuspenzní efekt - přirozený jev v přírodě - vodné extrakty pevné fáze Biologicky dostupné složky sedimentu ~ vodné extrakty Celkový (totální) obsah ~ extrakty organickými činidly Pórová voda sedimentu zřídka lze přímo testovat - anoxické podmínky provzdušnění - vypadávání oxidů Fe a Mn - okluze a sorpce těžkých kovů Hodnocení sedimentu - nutnost kombinace více testů - důvody: variabilita složení a vlastností variabilita expozičních cest variabilita citlivosti organizmů Nárůst využití biomarkerů - včasné rozpoznání chronických efektů indukce CytP450-monooxygenáz v játrech ryb žijících u dna kontaminace PAH ZS 2013
Ekotoxikologie
52
Ekotoxikologické testy Hranice vypovídací hodnoty testů toxicity Testy toxicity - momentální pohled na části ŽP a možnost jejich ohrožení
neúplná přenositelnost laboratorních výsledků na ekosystém závislost ekotoxického působení na nenapodobitelných abiotických a biotických podmínkách často nižší reálné in-situ účinky než v laboratoři - snížení biologické dostupnosti
Význam a důležitost správné interpretace výsledků - zahrnout všechny dostupné faktory
Hodnocení ekologické toxicity chemikálií a vzorků ŽP - pragmatický přístup umožňuje odhalit včas problémové látky - jednoduchá kritéria a testy Jednoduchost testů a kritérií - nevýhody: nedostatečná charakteristika látky/vzorku na základě EC50, LC50 - žádné informace o toxikokinetice a citlivosti největší problém ŽP - chronické efekty - nedostatek testů principiální mezidruhová nepřenositelnost výsledků testů - nezbytnost více testů přenos z individua na ekosystém - veliká nejistota způsobená nepřímými efekty ZS 2013
Ekotoxikologie
53
