Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie. Doktorský studijní program: analytická chemie

Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie Doktorský studijní program: analytická chemie Autoreferát disertační práce

Využití moderních separačních technik pro analýzu hmyzích feromonů Mgr. Petr Žáček Školitel: doc. RNDr. Ivan Jelínek, CSc. Školitel - konzultant: doc. RNDr. Irena Valterová, CSc.

Praha, 2014 1

Tato práce je založena na výsledcích obsažených v následujících publikacích: PUBLIKACE I P. Žáček, B. Kalinová, J. Šobotník, O. Hovorka, V. Ptáček, A. Coppée, F. Verheggen, I. Valterová: Comparison of age-dependent quantitative changes in the male labial gland secretion of Bombus terrestris and Bombus lucorum. Journal of Chemical Ecology 35 (2009) 698. PUBLIKACE II P. Žáček, A. Jirošová, J. Kindl, I. Valterová: Two dimensional gas chromatography as a tool for biosynthesis study of the components of the marking pheromones of the males species Bombus lucorum and th Bombus lapidarius. Book of proceedings, 4 ISC “Modern analytical chemistry”, (ISBN 978-80-903103-2-2) (2008) 36. PUBLIKACE III P. Žáček, D. Prchalová-Horňáková, R. Tykva, J. Kindl, H. Vogel, A. Svatoš, I. Pichová, I. Valterová: De novo biosynthesis of sexual pheromone in the labial gland of bumblebee males. ChemBioChem 14 (2013) 361. PUBLIKACE IV S. Jarau, P. Žáček, J. Šobotník, V. Vrkoslav, R. Hadravová, A. Coppée, S. Vašíčková, P. Jiroš, I. Valterová: Leg tendon glands in male bumblebees (Bombus terrestris): structure, secretion chemistry, and possible functions. Naturwissenschaften 99 (2012) 1039. PUBLIKACE V M. Šanda, P. Žáček, L. Streinz, M. Dračínský, B. Koutek: Profiling and characterization of volatile secretions from the European stink bug Graphosoma lineatum (Heteroptera: Pentatomidae) by two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 881-82 (2012) 69.

2

Abstrakt Komunikace zprostředkovaná chemickými sloučeninami (semiochemikáliemi) je hlavní způsob dorozumívání se u hmyzu, zvláště pak hmyzu společenského. Metody plynové chromatografie v jednorozměrném, dvourozměrném komprehensivním a preparativním uspořádání spojené s hmotnostním a/nebo elektroantenografickým detektorem byly použity ke studiu těkavých nebo středně těkavých semiochemikálií u různých druhů hmyzu. V rámci této práce byla zkoumána biosyntéza pohlavního feromonu u samců čmeláků druhů Bombus terrestris, B. lucorum a B. lapidarius pomocí aplikace předpokládaných biosyntetických prekurzorů feromonů (octan sodný, vyšší mastné kyseliny) izotopicky 2 14 značených atomy H a C. Pro tento účel bylo zkoumáno chromatografické chování a možnosti detekce izotopicky značených sloučenin v jednorozměrném a dvourozměrném komprehensivním 2 13 systému ( H, C). U všech testovaných kolon byl pro sloučeniny značené oběma izotopy potvrzen “inverzní izotopický efekt“. Vyvinuté analytické postupy byly aplikovány na reálné vzorky čmeláků. Analýza extraktů tkání čmeláků druhů B. terrestris a B. lucorum po in vitro inkubaci se značeným octanem sodným dokázala přítomnost značených metabolitů a potvrdila tak možnost de novo biosyntézy feromonu přímo v labiální žláze. Značené metabolity byly nalezeny i v případě in vivo inkubace s deuterovanými mastnými kyselinami u samců druhu B. lucorum a lapidarius. Tento experiment podpořil hypotézu, že vyšší mastné kyseliny, uložené ve formě triacylglycerolů v tukovém tělese v abdomenu, mohou být prekurzory pro biosyntézu alifatických sloučenin pohlavního feromonu. Dále byla zkoumána produkce feromonu v labiální žláze samců u druhů B. terrestris a lucorum během jejich života. Mezi oběma druhy byly nalezeny výrazné rozdíly. U samců čmeláků druhu B. terrestris je největší množství feromonu mezi pátým a desátým dnem života. V případě samců druhu B. lucorum je maximálního množství dosaženo pátý den a pak zůstává stejné až do konce života. Tyto výsledky, získané pomocí plynové chromatografie, byly podpořeny studiem ultrastruktury labiálních žláz. Byla objevena a charakterizována nová exokrinní žláza u čmeláků druhu B. terrestris. Nachází se v nohou jedinců všech tří kast – královny, dělnic a samců. Chemické složení její sekrece bylo analyzováno metodou dvourozměrné plynové chromatografie 3

s hmotnostní detekcí. Bylo zjištěno, že se skládá převážně z lineárních uhlovodíků a voskových esterů s alifatickou nebo terpenickou alkoholovou částí. Byly nalezeny rozdíly v chemickém složení této sekrece mezi jednotlivými kastami. V případě samců byl rovněž studován vývoj ve složení sekrece během života. Behaviorální experimenty nepotvrdily roli chemických sloučenin obsažených ve žláze při sexuálním chování, takže její biologická funkce je zatím nejasná. Byly analyzovány těkavé složky obranné sekrece evropského druhu ploštice Graphosoma lineatum kombinací metod mikro-extrakce na pevné fázi (SPME) s dvourozměrnou plynovou chromatografií s hmotnostní detekcí a preparativní plynové chromatografie. Bylo identifikováno 57 látek, z nichž 39 bylo u tohoto druhu nalezeno nově.

4

1. ÚVOD Chemická komunikace je u hmyzu nejrozšířenějším dorozumívacím prostředkem. Přenos informací je zprostředkován těkavými a netěkavými látkami nazývanými semio- nebo infochemikálie. Z chemického hlediska to mohou být sloučeniny nejrůznějších strukturních typů (např. alifatické látky s nasyceným nebo nenasyceným uhlovodíkovým řetězcem, terpeny, makrocykly, aromatické látky...). Zároveň mohou obsahovat různé funkční skupiny (např. hydroxylovou, karboxylovou, esterovou, etherovou, aldehydovou...) [1]. Studium struktury, funkce, původu a biologického účinku přírodních látek zprostředkovávajících druhové nebo mezidruhové interakce mezi organismy je hlavní náplní vědecké disciplíny s názvem chemická ekologie. Rozvoj tohoto relativně nového vědeckého oboru je úzce spjatý s vývojem analytických metod, zvláště metody plynové chromatografie. 2. CÍLE PRÁCE Tato dizertační práce se zabývá vývojem a aplikací metod plynové chromatografie jak v klasickém jednorozměrném uspořádání, tak preparativním a komprehensivním dvourozměrném uspořádání pro studium chemické komunikace: A) Studium biosyntézy hlavních komponent sexuálního feromonu samců čmeláků druhu Bombus lucorum (čmelák hájový), B. lapidarius (čmelák skalní) a B. terrestris (čmelák zemní). B) Chemická analýza nožní šlachové žlázy u čmeláků druhu B. terrestris. C) Chemická analýza obranné sekrece ploštice druhu Graphosoma lineatum (kněžice pásovaná) použitím nového přístupu: Headspace mikroextrakce na pevné fázi (SPME) ve spojení s dvourozměrnou komprehensivní plynovou chromatografií s hmotnostní detekcí. 3. MATERIÁL A INSTRUMENTACE Biologický materiál Samci čmeláků zkoumaných druhů (Bombus lucorum, Bombus lapidarius a Bombus terrestris) pocházeli z laboratorních chovů Přírodovědecké fakulty Masarykovy Univerzity v Brně (Česká

5

republika). Jedinci ploštice druhu Graphosoma lineatum pocházeli z přírody a byli sbíráni v okolí Prahy (Česká republika). Chemikálie Většina použitých standardů včetně sloučenin značených 13 2 izotopy C a H byla zakoupena od firmy Sigma-Aldrich (Isotech), radioaktivní octan sodný od firmy Perkin-Elmer. Látky heptyl-acetát, (E)-pent-2-enyl-acetát, (E)-hept-2-enyl-acetát, (E)-okt-2-enyl-acetát, (E)-dec-2-enyl-acetát, (E)-undec-2-enyl-acetát, a (Z)-dec-3-enyl-acetát byly zapůjčeny z Výzkumného institutu pro ochranu rostlin (IPO-DLO), Wageningen, Nizozemí. Další použité sloučeniny byly syntetizovány z příslušných prekurzorů, nebo pocházely z laboratorních zásob. Instrumentace Dvourozměrný plynový chromatograf s hmotnostním detektorem (Time Of Fligt (TOF) analyzátor) GCxGC-MS: Pegasus 4D GCxGC TOF-MS; LECO Corp., St. Joseph, MI., USA. Preparativní plynový chromatograf (Prep-GC): 6890N plynový chromatograf (Agilent Technologies) vybavený inletem s programovatelnou teplotou EPC PTV inlet (Gerstel, Mühlheim, Německo) a plamenově-ionizačním detektorem (FID). Frakce byly jímány v preparačním frakčním kolektoru (Preparative Fraction Collector, Gerstel). Jednorozměrný GC-MS: Fisons MD, Thermo scientific, USA. Plynový chromatograf spojený s elektroantenografickým detektorem GC-EAD: GC-5890A Hewlett-Packard, EAD byl tvořen tykadlem čmeláčí královny, jehož konce byly připojeny ke dvěma argentchloridovým elektrodám napojeným do AC/DC převodníku a 10XProbe (Syntech, Hilversum, Nizozemí). Detekce radioaktivity po separaci na tenké vrstvě (TLC): RITA Star nedestruktivní pozičně citlivý detektor Raytes, Straubenhard, Německo. Detekce radioaktivity v kapalných vzorcích: Tri-Carb 2900 TR spektrometr (PerkinElmer, Waltham, USA). 4. VÝSLEDKY A DISKUSE A) Studium biosyntézy hlavních komponent sexuálního feromonu u samců čmeláků druhu Bombus lucorum (čmelák hájový), B. lapidarius (čmelák skalní) a B. terrestris (čmelák zemní).

6

Samci většiny druhů čmeláků používají zvláštní způsob lákání samičky ke kopulaci, který se nazývá patrolování. To spočívá ve vytyčení teritoria a sekreci směsi látek na významné objekty v tomto teritoriu (kameny, vyšší rostliny, kmeny stromů atd.). Složky tohoto sekretu působí jako feromon lákající samičky příslušného druhu ke spáření a jeho chemické složení je druhově specifické. Samci čmeláků druhů B. lucorum a lapidarius produkují výhradně alifatické sloučeniny, nejvíce zastoupenou látkou u druhu B. lucorum je (Z)-ethyl-tetradec-9enoát (53%), u druhu B. lapidarius jsou to (Z)-hexadec-9-en-1-ol a hexadekan-1-ol (oba kolem 35%). Druh B. terrestris však obsahuje nejen alifatické (ethyl dodekanoát) ale i terpenické (2,3-dihydrofarnesol) látky, jejichž vzájemné zastoupení v sekreci se během života mění. Metodou GC-EAD byly v sexuálním feromonu určeny antenálně aktivní látky (odezva na tykadle královny). U druhu B. terrestris jich bylo nalezeno šest, u B. lucorum devět. Tyto sloučeniny byly kvantifikovány u různě starých samců pomocí GC-MS. Mezi oběma druhy byly nalezeny výrazné rozdíly. Produkce feromonu u B. lucorum začíná krátce po narození a dosahuje maxima kolem pátého dne, pak zůstává prakticky stejná až do konce života. Produkce feromonu u druhu B. terrestris začíná od druhého až třetího dne od narození a dosahuje maxima mezi pátým až desátým dnem a pak rychle klesá. Toto zjištění posléze potvrdily i výsledky z mikroskopických analýz labiálních žláz. Následný výzkum biosyntézy hlavních složek sexuálního feromonu byl založen na inkubaci samců, nebo jejich určitých tkání, se 2 14 značenými látkami ( H, C) a analýze vzniklých značených metabolitů. Hypotéza, že alifatické složky feromonu se biosyntetizují z vyšších mastných kyselin, uložených ve formě triacylglycerolů v tukovém tělese, byla podpořena in vivo inkubacemi samců s příslušnými značenými kyselinami [2]. Alternativní hypotéza, že složky feromonu jsou syntetizovány de novo přímo v labiální žláze, byla zkoumána pomocí in vitro inkubací labiálních žláz a tukových těles se značeným octanem sodným. 2

In vivo inkubace s izotopicky značenými mastnými kyselinami ( H) Nejprve byly zkoumány chromatografické vlastnosti methylesterů příslušných značených mastných kyselin v jednorozměrném a dvourozměrném komprehensivním uspořádání plynové 7

chromatografie. V případě deuterovaných látek byl u všech studovaných typů kolon (DB-5, ZB-5, BPX-50, RTX-50, DB-WAX) byl pozorován „inverzní izotopický efekt“ (značené sloučeniny eluují dříve než jejich neznačené analogy). Tento efekt byl pozorován i pro 13 methylestery značené izotopem C (tento izotop byl použit pro srovnání izotopického efektu s deuteriem) a byl přímo úměrný počtu značených atomů v molekule (Obr. 1). Ve dvourozměrném komprehensivním systému byla pozorována separace v obou 13 rozměrech. U látek značených C byla separace zanedbatelná (Obr. 2).

Obr. 1: Výřez z chromatogramů dvoudimenzionální komprehensivní separace (GCxGC) methyl-hexadekanoátu obsahujícího různé množství deuteríí v uhlovodíkovém řetězci. A) Lineární zobrazení GCxGC chromatogramu, 1:d-31-per-deuterovaný; 2:d-9; 3:d-5; 4:d-3; 5:d-0-neznačený. B) 2D zobrazení GCxGC chromatogramu. Píky zobrazené v části A) korespondují se signály v části B). [Teplotní programy: Primární pec (ZB-5, 29 m, ID 0.25 mm): 50 oC-(1min)-rychlost 2 oC /min-do 320 oC; sekundární pec (RTX-50, 1.93 m, 0.18 mm): o 5 oC vyšší teplota oproti primární peci; modulační perioda: 3s; mobilní fáze He (1 ml/min).]

Bylo pozorováno, že podle retenčního chování methylesteru 2 vzhledem k neznačenému analogu je izotopický efekt deuteria ( H) 8

13

asi třicetkrát vyšší než u C. Pro výzkum biosyntézy čmeláčího feromonu byly proto použity pouze deuterované látky.

Obr. 2: Porovnání retenčního chování methyl-hexadekanoátu-12C16 a methylhexadekanoátu-13C16 ve dvoudimenzionální komprehensivní separaci – lineární zobrazení. [Teplotní programy: primární pec (ZB-5, 29 m, ID 0.25 mm): 50 oC-(1 min)rychlost 2 oC /min-do 320 oC; sekundární pec (RTX-50, 1.93 m, 0.18 mm): o 5 oC vyšší teplota oproti primární peci; modulační perioda: 3 s; mobilní fáze He (1 ml/min).]

Při dané kombinaci primární a sekundární kolony bylo optimalizováno několik parametrů, které mohly ovlivnit celkovou separaci značených látek a jejich neznačených analogů: teplotní o program (testované rozmezí: 2-20 C/min), teplotní rozdíl mezi o primární a sekundární kolonou (testované rozmezí: 5-30 C) a délka pulsu horkého vzduchu aplikovaného v modulátoru pro desorpci analytů (testované rozmezí 0.6-1.2 s). Poslední dva parametry (teplotní rozdíl mezi primární a sekundární kolonou, a délka pulsu horkého vzduchu) mohly ovlivnit separaci jen v sekundární koloně. Bylo zjištěno, že separace izotopicky modifikovaných látek v obou dimenzích může být výrazněji ovlivněna pouze teplotním programem: čím pomalejší teplotní gradient – tím bylo dosaženo lepší celkové (v obou dimenzích) separace (nejpomalejší testovaný teplotní o gradient byl 2 C/min) (Obr. 1 a 2). 9

Pro výzkum biosyntézy byly vybrány mastné kyseliny s počtem atomů uhlíku od 12 do 18, které byly plně značené deuteriem. Perdeuterované kyseliny byly vybrány pro své výrazné retenční chování vzhledem ke svým neznačeným analogům a také kvůli možnosti citlivější detekce. Ionty 46 a 50 m/z se ukázaly jako vysoce selektivní pro deuterované alifatické látky a jejich intenzita ve spektru je přímo úměrná počtu deuterií. Roztoky deuterovaných kyselin byly injektovány do hlavy a abdomenu samců čmeláků druhů B. lucorum a lapidarius. Po 2-4 dnech inkubace byly vypitvány labiální žlázy a tuková tělesa a jejich extrakty analyzovány (Obr. 3).

Obr. 3: Příklad chromatogramu extraktu labiální žlázy samce čmeláka druhu B. lucorum, který byl inkubovaný in vivo s [d27]-tetradekanovou kyselinou. [Teplotní programy: primární pec (DB-5, 30 m, ID 0.25 mm): 40 oC-(2 min)-rychlost 5 oC /min-do 320 oC (5 min); sekundární pec (BPX-50, 1.79 m, ID 0.1 mm): o 5 oC vyšší teplota oproti primární peci; modulační perioda: 3 s; mobilní fáze He (1 ml/min).]

Bylo zjištěno, že samci čmeláků obou zkoumaných druhů modifikovali aplikované deuterované kyseliny na nejvíce zastoupené složky feromonu s výjimkou těch, které čmeláci neumí syntetizovat – polynenasycené mastné kyseliny. Dokonce byly pozorovány metabolity s prodlouženým uhlovodíkovým řetězcem. Nebyly zaznamenány kvalitativní rozdíly metabolitů mezi aplikacemi do hlavy nebo 10

abdomenu. Dále nebyly nalezeny deuterované metabolity s kratším řetězcem, než obsahovala aplikovaná kyselina, což je pravděpodobně důsledek izotopického efektu deuteria. 2

14

In vitro inkubace se značeným octanem sodným ( H, C) Vypitvané labiální žlázy a tuková tělesa samců čmeláků druhů B. lucorum a terrestris byly inkubovány s octanem sodným značeným 2 14 izotopy H a C. 14 Tkáně inkubované s radioaktivním C byly extrahovány nepolárními rozpouštědly a tyto extrakty byly separovány pomocí 14 chromatografie na tenké vrstvě (TLC). Metabolity obsahující izotop C byly analyzovány pozičně-citlivým detektorem radioaktivity a také pomocí preparativní plynové chromatografie. V případě tukového tělesa byla u obou druhů detekována radioaktivita ve volných mastných kyselinách, tri- a diacylglycerolech a uhlovodících. V případě labiálních žláz byla radioaktivita pozorována ve třídách sloučenin, které jsou v labiální žláze přirozeně přítomné (B. terrestris: terpenické alkoholy, volné mastné kyseliny, estery a uhlovodíky; B. lucorum: volné mastné kyseliny, estery, aldehydy a uhlovodíky). Inkubace labiálních žláz byly následně zopakovány s použitím perdeuterovaného octanu sodného a metabolity byly analyzovány použitím GCxGC-MS. V případě samců čmeláků druhu B. lucorum nebyly deuterované metabolity v extraktech labiálních žláz nalezeny, naproti tomu u samců B. terrestris byly detekovány sloučeniny, jejichž hmotnostní spektra ukazovala, že obsahují různý počet deuteríí na různých místech v molekule. Tímto experimentem tak byla potvrzena de novo biosyntéza terpenických (Obr. 4) i alifatických složek feromonu.

11

Obr. 4: Příklad hmotnostního spektra de novo biosyntetizované sloučeniny. Hmotnostní spektrum 2,3-dihydrofarnesolu (DHF) nalezeného v extraktu labiální žlázy B. terrestris po inkubaci s perdeuterovaným octanem sodným. A) Směsné hmotnostní spektrum DHF obsahujícího různé množství atomů deuteria v různých částech molekuly; B) Hmotnostní spektrum nedeuterovaného DHF. Průměrný počet deuterií v molekule DHF je patrný z rozdílů molekulových iontů.

B) Chemická analýza sekrece nožní šlachové žlázy u čmeláků druhu B. terrestris. Nožní šlachová žláza je nově objevená exokrinní žláza čmeláků druhu B. terrestris, vyskytující se u královen, dělnic a samců ve všech šesti nohách. Byla studována její ultrastruktura včetně sekrečních buněk. Chemické složení její sekrece bylo studováno metodou GCxGC-MS. Analýza ukázala, že obsahuje převážně lineární uhlovodíky s nasyceným a nenasyceným uhlovodíkovým řetězcem. U samců se navíc nacházejí voskové estery obsahující alifatickou a terpenickou alkoholovou část. Distribuce uhlovodíků jednotlivých délek se ve všech kastách lišily. Pomocí derivatizace s dimethyl disulfidem byla určena poloha dvojné vazby v nenasycených uhlovodících, které byly přítomny v sekreci v největším množství. Bylo zjištěno, že v případě samců se dvojná vazba nachází téměř výhradně v poloze 9, zatímco u dělnic a 12

královen se nachází v různém zastoupení ve více polohách. Tyto rozdíly mezi samci a ostatními kastami naznačovaly, že v případě samců může být sekrece spojena se sexuálním chováním, proto se další studie zaměřily na sledování vývoje množství sekrece v průběhu života samců. Další analýzy dokázaly, že její obsah ve žláze během života stoupá. Podíl této žlázy na sexuálním chování samců se však v biologických testech nepotvrdil a její funkce tak zůstává u všech kast nejasná. Zvažuje se však možnost, že látky produkované žlázou slouží ke značkování navštívených květů při hledání potravy. C) Chemická analýza obranné sekrece ploštice druhu Graphosoma lineatum (kněžice pásované) pomocí nové metody: Headspace mikroextrakce na pevné fázi (SPME) ve spojení s dvoudimenzionální komprehensivní plynovou chromatografií s hmotnostní detekcí. Ploštice druhu Graphosoma lineatum, patřící do rozsáhlé čeledi Heteroptera, vylučují v případě útoku z metathorakální žlázy páchnoucí sekreci [3]. Cílem této práce bylo analyzovat těkavé složky této sekrece použitím vzorkovací metody SPME ve spojení s GCxGC-MS. Jako nejvhodnější fáze pro SPME se ukázala komerčně dostupná směs polymerů divinylbenzen/karboxen/polydimethylsiloxan (DVB/CAR/PDMS). Dále byla optimalizována doba extrakce pomocí nejvíce zastoupených látek v sekreci. Extrakční čas 15 minut byl vybrán jako kompromis mezi citlivostí a dobou analýzy. Následnou chemickou analýzou látek odebraných z headspace nad podrážděnou plošticí pomocí SPME bylo identifikováno 57 látek, z nichž 39 bylo u tohoto druhu nalezeno poprvé (Obr. 4A) [4,5]. Pomocí metod preparativní GC a nukleární magnetické rezonance byla v této práci opravena struktura látky dříve identifikované podle hmotnostního spektra jako 5-ethylfuran-2(5H) [4] na (E)-4-oxohex-2-enal (Obr. 4B,C).

13

Obr. 4: A) Chromatogram rekonstruovaný z analytických iontů identifikovaných látek obranné sekrece dospělého samce ploštice druhu G. lineatum; B) Hmotnostní spektrum izolovaného (E)-4-oxohex-2-enalu; C) Hmotnostní spektrum syntetizovaného 5-ethylfuranu-2(5H); čísla píků odpovídají názvům látek v tabulce identifikovaných sloučenin v příslušném článku (Table 1). [Teplotní programy: primární pec (DB-5, 30 m, ID 0.25 mm): 50 oC-(2 min)-rychlost 10 oC /min-do 300 oC (10 min); Sekundární pec (BPX-50, 1.79 m, ID 0.1 mm): o 5 oC vyšší teplota oproti primární peci; Modulační perioda: 3 s; mobilní fáze He (1 ml/min).]

5. ZÁVĚRY V rámci této práce byly zkoumány možnosti analýzy značených látek pomocí GCxGC-MS, preparativní GC a radioanalytických metod, a vyvinuté metody byly posléze aplikovány pro výzkum biosyntézy sexuálního feromonu u samců čmeláků druhů Bombus lucorum, B. lapidarius a B. terrestris. Výsledky podpořily hypotézu, že mastné 14

kyseliny mohou být prekurzory pro biosyntézu alifatických složek sexuálního feromonu u samců druhu B. lucorum a B. terrestris. Dále byla potvrzena de novo biosyntéza alifatických i terpenických složek feromonu přímo v labiální žláze u druhu B. terrestris a podpořena u B. lucorum. Rovněž byla charakterizována nová exokrinní žláza v nohou čmeláků druhu B. terrestris. Metodou GCxGC-MS bylo analyzováno chemické složení její sekrece u královen, dělníků a samců. Použitím nového přístupu - headspace SPME ve spojení s GCxGC-MS - byly analyzovány těkavé složky obranné sekrece ploštice druhu Graphosoma lineatum. Kombinací metod preparativní GC a NMR byla opravena dříve chybně určená struktura jedné významné složky této sekrece [4]. Tato práce byla finančně podporována z následujících zdrojů: Nadace Česká Věda 203/09/1446; granty Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy č. 2B06007 a MSM 0021620857; grant Technologické agentury České republiky TA01020969

6. POUŽITÁ LITERATURA [1]

W. Francke, S. Schulz, Comprehensive Natural Products 8, Elsevier Science Ltd., Oxford, 1999, p. 191.

[2]

B.S. Lanne, G. Bergstrom, A.B. Wassgren, B. Tornback, Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology 88 (1987) 631.

[3]

J.R. Aldrich, Annual Review of Entomology 33 (1988) 211.

[4]

K. Stránský, I. Valterová, K. Ubik, J. Čejka, J. Křeček, HrcJournal of High Resolution Chromatography 21 (1998) 475.

[5]

D. Djozan, T. Baheri, R. Farshbaf, S. Azhari, Analytica Chimica Acta 554 (2005) 197.

15

CURRICULUM VITAE Jméno: Datum narození: Místo narození: Státní příslušnost: Národnost: Adresa: E-mail:

Mgr. Petr Žáček 10.2.1982 Zlín ČR moravská Horní Lhota 152, 763 23, Horní Lhota u Luhačovic [email protected]

Vzdělání 2006 – nyní

Postgraduální studium v oboru Analytická chemie Disertační práce: “Využití moderních separačních technik pro analýzu hmyzích feromonů“, Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze, Státní závěrečná zkouška byla složena v září 2011. Dizertační práce byla vypracována v týmu Infochemikálií na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie věd České republiky (ÚOCHB AV ČR).

2001 – 2006

Magisterské studium v programu Analytická chemie. Diplomová práce: “Analytické problémy studia hydroxamových kyselin“, Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze. Diplomová práce byla vypracována na oddělení Analytické chemie na ústavu Chemických procesů Akademie věd České republiky (ÚCHP AV CR).

1997 – 2001

Všeobecné, Gymnázium Zlín Lesní čtvrť, maturitní zkouška z chemie, fyziky, českého a anglického jazyka.

16

Zaměstnání 2006 – nyní ÚOCHB AV ČR, vědecký tým Infochemikálií, postgraduální student. 2003 – 2006

ÚCHP AV CR, technik na oddělení Analytické chemie.

Další znalosti Jazyky: English (FCE level) Výpočetní technika: MS Windows, Office, Řidičské oprávnění: B Zájmy Hudba (klarinet), sport (fotbal, běh, jízda na kole).

17

PUBLIKACE V IMPAKTOVANÝCH ČASOPISECH A.Buček, H. Vogel, P. Matoušková, D. Prchalová, P. Žáček, V. Vrkoslav, P. Šebesta, A. Svatoš, U. Jahn, I. Valterová, I. Pichová: The role of desaturases in the biosynthesis of marking pheromones in bumblebee males. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (2013) 724. P. Žáček, D. Prchalová-Horňáková, R. Tykva, J. Kindl, H. Vogel, A. Svatoš, I. Pichová, I. Valterová: De novo biosynthesis of sexual pheromone in the labial gland of bumblebee males. ChemBioChem 14 (2013) 361. S. Jarau, P. Žáček, J. Šobotník, V. Vrkoslav, R. Hadravová, A. Coppee, S. Vašíčková, P. Jiroš, I. Valterová: Leg tendon glands in male bumblebees (Bombus terrestris): structure, secretion chemistry, and possible functions. Naturwissenschaften 99 (2012) 1039. J. Kindl, P. Jiroš, B. Kalinová, P. Žáček, I. Valterová: Females of the bumblebee parasite, Aphomia sociella, excite males using a courtship pheromone. Journal of Chemical Ecology 38 (2012) 400. M. Šanda, P. Žáček, L. Streinz, M. Dračínský, B. Koutek: Profiling and characterization of volatile secretions from the European stink bug Graphosoma lineatum (Heteroptera: Pentatomidae) by twodimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 881-82 (2012) 69. R. Hanus, J. Šobotník, J. Krasulová, P. Jiroš, P. Žáček, B. Kalinová, K. Dolejšová, J. Cvačka, T. Bourguignon, Y. Roisin, M.J. Lacey, D. Sillam-Dusses: Nonadecadienone, a new termite trail-following pheromone identified in Glossotermes oculatus (Serritermitidae). Chemical Senses 37 (2012) 55. M.J. Lacey, E. Semon, J. Krasulová, D. Sillam-Dusses, A. Robert, R. Cornette, M. Hoskovec, P. Žáček, I. Valterová, C. Bordereau: Chemical communication in termites: syn-4,6-dimethylundecan-1-ol as trail-following pheromone, syn-4,6-dimethylundecanal and (5E)-2,6,1018

trimethylundeca-5,9-dienal as the respective male and female sex pheromones in Hodotermopsis sjoestedti (Isoptera, Archotermopsidae). Journal of Insect Physiology 57 (2011) 1585. P. Žáček, B. Kalinová, J. Šobotník, O. Hovorka, V. Ptáček, A. Coppee, F. Verheggen, I. Valterová: Comparison of age-dependent quantitative changes in the male labial gland secretion of Bombus terrestris and Bombus lucorum. Journal of Chemical Ecology 35 (2009) 698. B. Kalinová, J. Kindl, P. Jiroš, P. Žáček, S. Vašíčková, M. Buděšínský, I. Valterová: Composition and electrophysiological activity of constituents identified in male wing gland secretion of the bumblebee parasite Aphomia sociella. Journal of Natural Products 72 (2009) 8. 15

P. Žáček, A. Dransfeld, O. Exner, J. Schraml: N NMR chemical shifts of ring substituted benzonitriles. Magnetic Resonance in Chemistry 44 (2006) 1073. KONFERENČNÍ PŘÍSPĚVKY J. Krasulová, R. Hanus, D. Sillam-Dusses, P. Žáček, P. Jiroš, J. Šobotník, B. Kalinová, Z. Bosáková, I. Valterová: Analytical methods Used in the Studies on Chemical Ecology of Termites. Book of th proceedings, 8 ISC “Modern analytical chemistry”, (ISBN 978-807444-017-5) (2012) 1. L. Kaluža, J. Sýkora, J. Karban, P. Žáček, Z. Vít, M. Zdražil: Hydrodesulfurization of Model Feed Containing Olefins over Al2O3, TiO2, and ZrO2 Supported Transition Metal Sulfides. European Congress of Chemical Engineering /8./, Berlin (Germany), 25.-29.9. 2011. L. Kaluža, J. Sýkora, J. Karban, P. Žáček, Z. Vít, M. Zdražil: Effect of Support on Activity of Transition Metal Sulfides in Hydrogenation of 1Methylcyclohexene Parallel with Hydrodesulfurization of 1Benzothiophene. 42. Symposium Catalysis, Prague (Czech Republic) 1.-2.11. 2010. P. Žáček, R. Tykva, J. KindI, I. Valterová: In vitro incubation of the 19

labial gland and fat body of the bumblebee males Bombus terrestris 14 with [1,2- C]acetate and analysis of the metabolites. Book of th proceedings, 6 ISC “Modern analytical chemistry”, (ISBN 978-807444-005-2) (2010) 92. P. Žáček, A. Jirošová, J. Kindl, I. Valterová: Two dimensional gas chromatography as a tool for biosynthesis study of the components of the marking pheromones of the males species Bombus lucorum and th Bombus lapidarius. Book of proceedings, 4 ISC “Modern analytical chemistry”, (ISBN 978-80-903103-2-2) (2008) 36. L. Kaluža, J. Sýkora, J. Karban, P. Žáček, Z. Vít, M. Zdražil: Parallel Hydrogenation of 1-Methylcyclohexene and Hydrodesulphurization of 1-Benzothiophene over Transition Metal Sulphides Supported on Al2O3, TiO2 and ZrO2. International Symposium on the Molecular Aspects of Catalysis by Sulfides /5./, Copenhagen (Denmark), 30.5.3.6. 2010. PLAKÁTOVÁ SDĚLENÍ D. Prchalová, P. Žáček, I. Valterová, I. Pichová: Biosynthesis of terpenic compounds in marking pheromone blend of Bombus terrestris. th 28 ISCE Annual Meeting, Vilnius, (Lithuania) 22.-26.7. 2012. I. Valterová, B. Kalinová, J. Kindl, P. Jiroš, P. Žáček: Chemical and acoustic communication in pre-mating behavior of Aphomia Sociella. th 26 ISCE Annual Meeting, Tours, (France) 31.7.-4.8. 2010. P. Žáček, R. Tykva, Jiří Kindl, I. Valterová: De novo biosynthesis study of the sexual pheromone of the bumblebees males Bombus lucorum th and Bombus terrstris. 6 International Symposium on Molecular Insect Science, Amsterdam (Nederland) 2.-5.10 2011. P. Žáček, R. Tykva, Jiří Kindl, I. Valterová: De novo biosynthesis study of the components of marking pheromone of bumblebee males (Bombus lucorum and Bombus terrestris) by means of in vitro 14 th incubation with [1,2- C]acetate uptake. 27 ISCE Annual Meeting, Tours, (France) 31.7.-4.8. 2010. 20

P. Žáček, R. Tykva, Jiří Kindl, I. Valterová: Biosynthetic studies: In vitro incubation of the labiál gland and fat body of the bumblebee 14 males (Bombus lucorum and Bombus terrestris) with [1,2- C]acetate th uptake. 26 ISCE Annual Meeting, Neuchâtel, (Switzerland) 23.-27.8. 2009 P. Jiroš, B. Kalinová, J. Kindl, P. Žáček, I. Valterová: Bee moth th Aphomia sociella and scent of host bumblebee nest. 26 ISCE Annual Meeting, Neuchâtel, (Switzerland) 23.-27.8. 2009 P. Žáček, A. Luxová, J. Kindl, I. Valterová: Biosynthetic studies of the male marking pheromone of bumblebees species Bombus lucorum th and B. lapidarius. 4 IUSSI European Meeting, La Roche-en-Ardenne, (Belgium), 30.8.-4.9. 2008 P. Žáček, A. Luxová, J. Kindl, I. Valterová: Biosynthetic studies of the male marking pheromone of bumblebees species Bombus lucorum th and B. lapidarius. 24 Anniversary Meeting of ISCE, State college, Pennsylvania (USA) 17.-22.08 2008 P. Jiroš, B. Kalinová, J. Kindl, P. Žáček, J. Cvačka, S. Vašíčková, I. Valterová: Wing glands secretion of the bee moth Aphomia sociella. th 24 Anniversary Meeting of ISCE, State college, Pennsylvania (USA) 17.-22.08 2008 P. Žáček, A. Luxová, J. Kindl, O. Hovorka, I. Valterová: Výzkum biosyntézy složek samčích značkovacích feromonů čmeláků druhů Bombus lucorum a Bombus lapidarius. VII. Mezioborové setkání mladých biologů, biochemiků a chemiků (Sigma-Aldrich). Žďárské Vrchy (Czech Republic) 10.-13.06. 2008. Poster was among top 5 posters. P. Žáček, I. Valterová, B. Kalinová, J. Šobotník, O. Hovorka, V. Ptáček: Changes in the composition of the labiál gland secretion dutiny rd the life of Bombus lucorum. 23 ISCE Annual Meeting, Jena (Germany), 22.-26.7. 2007

21

Charles University in Prague, Faculty of Science Department of Analytical Chemistry

Ph.D. study program: Analytical Chemistry Summary of the Ph.D. Thesis

Use of the modern separation techniques for the analysis of insect pheromones Mgr. Petr Žáček

Supervisor: doc. RNDr. Ivan Jelínek, CSc. Supervisor - consultant: doc. RNDr. Irena Valterová, CSc.

Prague, 2014

1

This thesis is based on the results presented in publications listed below: PUBLICATION I P. Žáček, B. Kalinová, J. Šobotník, O. Hovorka, V. Ptáček, A. Coppee, F. Verheggen, I. Valterová: Comparison of age-dependent quantitative changes in the male labial gland secretion of Bombus terrestris and Bombus lucorum. Journal of Chemical Ecology 35 (2009) 698. PUBLICATION II P. Žáček, A. Jirošová, J. Kindl, I. Valterová: Two dimensional gas chromatography as a tool for biosynthesis study of the components of the marking pheromones of the males species Bombus lucorum and th Bombus lapidarius. Book of proceedings, 4 ISC “Modern analytical chemistry”, (ISBN 978-80-903103-2-2) (2008) 36. PUBLICATION III P. Žáček, D. Prchalová-Horňáková, R. Tykva, J. Kindl, H. Vogel, A. Svatoš, I. Pichová, I. Valterová: De novo biosynthesis of sexual pheromone in the labial gland of bumblebee males. ChemBioChem 14 (2013) 361. PUBLICATION IV S. Jarau, P. Žáček, J. Šobotník, V. Vrkoslav, R. Hadravová, A. Coppee, S. Vašíčková, P. Jiroš, I. Valterová: Leg tendon glands in male bumblebees (Bombus terrestris): structure, secretion chemistry, and possible functions. Naturwissenschaften 99 (2012) 1039. PUBLICATION V M. Šanda, P. Žáček, L. Streinz, M. Dračínský, B. Koutek: Profiling and characterization of volatile secretions from the European stink bug Graphosoma lineatum (Heteroptera: Pentatomidae) by two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 881-82 (2012) 69.

2

Abstract Communication mediated by chemical compounds (semiochemicals) is the most important way of information transfer in insects, especially in the social species. Gas chromatographic methods (one-dimensional, two-dimensional comprehensive, and preparative arrangement) coupled with mass spectrometric and/or electroantennographic detector were used for volatile or semivolatile semiochemicals analysis in various insect species. In this Thesis, biosynthesis of the bumblebee male sex pheromone in species Bombus terrestris, B. lucorum, and B. lapidarius was studied using putative biosynthetic precursors (sodium acetate, 2 14 fatty acids) labeled with H and C. For the purpose of labeled volatile metabolites analysis, a method of separation and detection of isotopically labeled compounds in two-dimensional comprehensive gas 2 13 chromatography was studied ( H, C). An “inverse isotope effects” was confirmed for compounds labeled with both isotopes in all examined types of columns. Concerning the biological samples, analysis of in vitro incubated tissues with labeled sodium acetate showed that pheromone components are synthesized de novo in the labial gland in B. terrestris and B. lucorum. Nevertheless, experiments of in vivo incubation of deuterated fatty acids confirmed biotransformation of the precursors into main pheromone components in B. lucorum and B. lapidarius. These results supported the hypothesis that the fatty acids, stored in fat body as triacylglycerols, are precursors for the aliphatic pheromonal components biosynthesis. Changes of pheromone production during life were studied in B. terrestris and B. lucorum. Significant differences were found between these two species. Pheromone production reaches a maximum between the day 5 and 10 of life in B. terrestris males and then rapidly decreases. In the case of B. lucorum, the maximum is achieved on the day 3 and stays constant over the rest of life. The gas chromatographic results were confirmed by an ultrastructural study of the pheromone gland tissue. A new exocrine gland located in legs of bumblebee males, queens, and workers was discovered in B. terrestris species. Components of the glandular secretion were analyzed by means of comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with mass detection. The secretion consists mostly of linear hydrocarbons and wax esters with aliphatic or terpenic alcohols. Differences in the 3

secretion composition among castes were found. Furthermore, dynamics of the secretion production was studied in males. Its function in mating behavior was suggested, but this has not been confirmed by behavioral experiments. Thus, the biological function remains unclear. Volatile components of a defensive secretion of the European stink bug Graphosoma lineatum were studied. A method combining the headspace solid-phase microextraction (SPME) sampling procedure and comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with mass detector as well as preparative gas chromatography was used for chemical analyses. There were 57 compounds identified, 39 of them have not been described in the G. lineatum secretion before.

4

1. INTRODUCTION Chemical communication is the most common way of communication in insects. The information transfer is mediated by volatile or semivolatile compounds often called semiochemicals or infochemicals. From the chemical point of view, the semiochemicals involve compounds of various structural types (e.g. aliphatic saturated/unsaturated compounds, terpenes, macrocycles, aromatic compounds...). The communication compounds may further contain various types of functional groups (e.g. alcoholic-, carboxylic-, esteric-, etheric-, aldehydic- ...) [1]. Study of the structure, function, origin, and significance of naturally occurring compounds that mediate inter- and intraspecific interactions between organisms is the main objective of the scientific discipline of chemical ecology. The development of this scientific discipline is closely linked with inventions and further development of gas chromatographic methods. 2. Aims of the study This thesis deals with development and application of gas chromatographic methods in their classical one-dimensional as well as preparative and comprehensive two-dimensional arrangement for the chemical communication research in the following studies: A) Biosynthetic study of the main components of the sex pheromone of bumblebee males’ in Bombus lucorum, B. lapidarius, and B. terrestris species. B) Chemical analysis of the leg tendon gland secretion in B. terrestris species. C) Chemical analysis of the defensive secretion of a stink bug Graphosoma linneatum using a new approach: Headspace solid-phase microextraction in a connection with two-dimensional comprehensive gas chromatography with mass spectrometric detection. 3. MATERIALS AND INSTRUMENTATION Biological material Bumblebee males of all examined species (Bombus lucorum, Bombus lapidarius, and Bombus terrestris) were obtained from laboratory colonies from the collaborating laboratory in the Faculty of Science of Masaryk University in Brno (Czech Republic).

5

Live, wild stink bugs of the species Graphosoma lineatum were collected near Prague (Czech Republic). Chemicals 13 Most of the used standards including compounds labelled with C and 2 H isotopes were purchased from Sigma-Aldrich (Isotech). Radioactive sodium acetate was purchased from Perkin Elmer. Heptyl acetate, (E)-pent-2-enyl acetate, (E)-hept-2-enyl acetate, (E)-oct-2-enyl acetate, (E)-dec-2-enyl acetate, (E)-undec-2-enyl acetate, and (Z)-dec-3-enyl acetate, were obtained from the Research Institute for Plant Protection (IPO-DLO, Wageningen, The Netherlands). Other compounds were synthesized from appropriate precursors, or available from laboratory supplies. Instrumentation Two-dimensional comprehensive gas chromatography coupled with mass detector (Time Of Flight (TOF) mass analyzer) GCxGC-MS: Pegasus 4D; LECO Corp., St. Joseph, MI., United States. Preparative gas chromatograph: 6890N gas chromatograph (Agilent) equipped with a liquid nitrogen cooled EPC PTV inlet (Gerstel, Mühlheim, Germany) and a FID detector. Fractions were collected in Preparative fraction collector (Gerstel). One-dimensional GC-MS: Fisons MD, Thermo scientific, United States. Gas chromatography coupled with electroantennographic detector GC-EAD: GC-5890A Hewlett-Packard, EAD consisted of a bumblebee queen antenna connected via two glass Ag/AgCl elecrodes to a universal AC/DC 10XProbe (Syntech, Hilversum, The Nederlands). Radioactivity detector for thin layer chromatography (TLC): RITA Star non-destructive position-sensitive detector Raytest, Straubenhard, Germany. Detection of radioactivity in the liquid samples: Tri-Carb 2900 TR spectrometer (PerkinElmer, Waltham, United States).

6

4. RESULTS AND DISCUSSION A) Biosynthesis study of the main components of the sex pheromone of bumblebee males species Bombus lucorum, B. lapidarius, and B. terrestris. Males of the most bumblebee species (genus Bombus) exhibit a mating strategy unique in contrast to other social bees. They patrol regular circuits and pause on some prominent objects, such as tree trunks, flowers or stones. At these sites males secrete a mixture of compounds (pheromone), released from labial gland, that attracts conspecific females for mating. This secretion is species specific. Male sex pheromones of B. lucorum and lapidarius species contain exclusively aliphatic compounds with ethyl (Z)-tetradec-9-enoate (53%) and (Z)-hexadec-9-en-1-ol + hexadecane-1-ol (both 35%) being the most abundant components, respectively. B. terrestris males produce both aliphatic (ethyl dodecanoate) and terpenic (2,3-dihydrofarnesol) compounds; composition of the pheromone components differs within the male’s lifespan. Method of GC-EAD was performed to determine antennally active compounds from the secretion. There were six and nine compounds selected in B. terrestris and B. lucorum species, respectively. These compounds were quantified in the males of different age by GC-MS. Considerable differences were found between the examined species. The pheromone production in B. lucorum starts shortly after eclosion and reaches a maximum within three days. The labial gland content remains relatively constant over the adult life of the males. On the other hand, in B. terrestris species the production starts between the second and the third day and reaches a maximum between fifth and tenth days. Then, the labial gland content decreases sharply. A microscopy of the labial gland confirmed the results from the GC-MS analysis. Biosynthesis research strategy was based on incubation of the 2 14 males (or particular tissues) with labeled compounds ( H, C) and analysis of the labeled metabolites. In vivo incubation of labeled fatty acids was used to support hypothesis that fatty acids, stored in fat body in a form of triacylglycerols, can be precursors of aliphatic pheromone components [2].

7

In vitro incubation of labeled sodium acetate was used to support hypothesis that pheromone components are synthesized de novo in the labial gland. 2

In vivo incubation with labeled fatty acids ( H) Chromatographic properties of the labeled fatty acid methyl esters were examined using the gas chromatography in the one-dimensional and two-dimensional comprehensive settings. An ”inverse” isotopic effect (labeled compounds elute earlier then their non-labeled analogs) was observed for all examined stationary phases (DB-5, ZB-5, 13 BPX-50, RTX-50, DB-WAX) for deuterium and also C (used for comparative purposes). The isotopic effect is linearly proportional to the number of the labeled atoms in the molecule (Fig. 1). In case of the two-dimensional comprehensive separation system, the separation was observed in both dimensions. Nevertheless, the separation was 13 negligible for C labeled compounds (Fig. 2).

Fig. 1: Chromatograms of the two dimensional comprehensive separation of the methyl hexadecanoates containing various number of deuterium atoms in the carbon chain. A) Linear visualization of the GC×GC chromatogram, 1:d31-per-deuterated; 2:(13,13,14,14,15,15,16,16,16)-d9; 3:(15,15,16,16,16)-d5; 4:(16,16,16)-d3;

8

5:d0-unlabeled. B) Contour plot visualization of the GCxGC chromatogram. The peaks displayed in part A) correspond with the spots in the contour plot chromatogram in part B). [Primary oven (ZB-5, 29 m, ID 0.25 mm): 50 oC (held for 1 min)-rate 2 oC/min-to 320 o C; secondary oven (RTX-50, 1.93 m, ID 0.18 mm): 5 oC incremented with respect to the primary oven; modulation period: 3s; mobile phase He (1 ml/min).]

2

The isotopic effect of the deuterium ( H) was observed to be 13 approximately thirty times higher in comparison to the C isotope according to the retention behavior of the labeled compound towards to the unlabeled analog. For the biosynthesis research only deuterated compounds were used due to the better separability towards 13 non-labeled analogs in comparison to the C labeled compounds.

Fig. 2: Comparison of the retention behavior of the methyl-hexadecanoate-12C16 and methyl-hexadecanoate-13C16 in the two dimensional comprehensive separation – linear vizualization. [Primary oven (ZB-5, 29 m, ID 0.25 mm): 50 oC (held for 1 min)-rate 2 oC/min-to 320 oC; secondary oven (RTX-50, 1.93 m, ID 0.18 mm): 5 oC incremented with respect to the primary oven; modulation period: 3 s; mobile phase He (1 ml/min).]

For a given combination of primary and secondary column few parameters that could influence the separation were examined: o temperature program (range: 2-20 C/min), secondary oven 9

o

temperature increment (range: 5-30 C) and hot pulse duration (range: 0.6-1.2 s). The last two parameters (secondary oven temperature increment and hot pulse duration) may only affect separation in the secondary oven. However, it appeared that separation of the isotopically modified compounds in both dimensions can be significantly changed by a temperature program adjustment only: the slower temperature gradient was applied – the better total separation (in both columns) was achieved (the slowest temperature gradient o tested was 2 C)(Fig. 1 and 2). Fully-deuterated fatty acids of various carbon chain lengths (C12–C18) were selected for the bumblebee males’ sexual pheromone biosynthesis research due to their chromatographic behavior towards to the non-deuterated (native) analogs. Furthermore, detection of the labeled compounds in mass spectrometric detector significantly increases with number of isotopic atoms in the molecule. Ion fragments m/z 46 and 50 were observed to be highly selective to all of the deuterated aliphatic compounds. Their intensity in the mass spectrum is proportional to the number of deuteriums in the molecule. Solutions of deuterated fatty acids were injected into the head capsules and abdomen of the bumblebee males’ species B. lucorum and lapidarius. After 2-4 days of incubation, labial glands and fat bodies were dissected, extracted with hexane, and analyzed (Fig. 3).

10

Fig. 3: Example of chromatogram of the labial gland extract of a B. lucorum male that was incubated in vivo with tetradecanoic acid-d27. [Primary oven (DB-5, 30 m, ID 0.25 mm): 40 oC (held for 2 min)-rate 5 oC/min-to 320 oC (held for 5 min); secondary oven (BPX-50, 1.79 m, ID 0.1 mm): 5 oC incremented with respect to the primary oven; modulation period: 3 s; mobile phase He (1 ml/min).]

It was found that bumblebee males of both examined species were able to modify each type of applied deuterated fatty acids into the most abundant pheromone components; with exception of those that bumblebees are unable to synthesize (polyunsaturated fatty acids). Furthermore, deuterated metabolites with prolonged carbon chain were observed. No qualitative differences were observed between applications to the head or to the abdomen. Nevertheless, no deuterated metabolites with shorter carbon chain than the applied fatty acid were detected, probably due to the isotopic effect of the deuterium atoms. 2

14

In vitro incubation with labeled sodium acetate ( H, C) Dissected labial glands and fat bodies of B. lucorum and B. terrestris 2 14 males were incubated with sodium acetate labeled with H or C.

11

14

The tissues incubated with C labeled acetate were extracted with non-polar solvents and separated by means of thin layer 14 chromatography. The C containing metabolites were analyzed by position-sensitive radioactivity detector and preparative gas chromatography. In the case of fat body, a portion of radioactivity was incorporated into free fatty acids, triacylglycerols, diacylglycerols, and hydrocarbons in both species. In the case of labial glands, radioactivity was observed in the classes of compounds that naturally occur in the labial glands (B. terretris: terpenic alcohols, free fatty acids, esters, and hydrocarbons; B. lucorum: free fatty acids, esters, and hydrocarbons). To confirm the results, the incubation experiment of labial glands with perdeuterated sodium acetate was performed, and the labeled metabolites were analyzed using GCxGC-MS. No deuterated metabolites were found in the case of B. lucorum species. In B. terrestris labial gland extracts, compounds containing various number of deuterium in various positions in the molecule were found. Mass spectrum of the deuterated compounds confirmed de novo biosynthesis of the terpenic (Fig. 4) and aliphatic pheromone components.

Fig. 4: An example of mass spectrum of de novo biosynthesized compound. Mass spectra of 2,3-dihydrofarnesol (DHF) found in the B. terrestris labial gland extracts. The

12

LG was incubated with sodium acetate-d3. A) Mass spectrum of DHF containing deuterium randomly distributed within the molecule; B) Mass spectrum of native DHF. See the molecular masses of both types of DHF.

B) Chemical analysis of the secretion of the leg tendon gland in bumblebees of B. terrestris species. A leg tendon gland is a recently discovered exocrine gland in B. terrestris. The gland is located in all six legs in queen, workers, and males. An ultrastructure study of the gland including secretion cells was performed. Chemical composition of the secretion was studied using GCxGC-MS. It was found that the secretion mostly consists of linear hydrocarbons with both saturated and unsaturated carbon chain. In the case of males, wax esters with both aliphatic and terpenic alcohols were observed. Significant differences were observed in distribution of hydrocarbons of various carbon chain lengths among castes. Positions of the double bonds in the most abundant unsaturated hydrocarbons were determined using GCxGC-MS after derivatization with dimethyl disulfide. It was found that double bond in unsaturated hydrocarbons in males is almost exclusively present in position 9, while distribution of the double bonds positions was observed in queens and workers. These differences between males and other castes suggested that the males’ tendon gland secretion is involved in sexual behaviour and dynamics of the secretion production within the life was studied. Nevertheless, behavioral experiments were inconclusive. Tendon gland is a probable source of footprint compounds.

C) Chemical analysis of the defensive secretion of a stink bug species Graphosoma linneatum using a new approach: Head space solid-phase microextraction (SPME) in connection with two-dimensional comprehensive gas chromatography with mass detection. The stink bug Graphosoma lineatum belongs to the largest family Heteroptera. In the event of an attack, the stink bugs release a foul odor from the metathoracic glands. The aim of this work was to analyze volatiles of the defensive secretion using headspace solid13

phase microextraction (SPME) sampling method and two-dimensional comprehensive gas chromatography coupled with mass detection (GCxGC-MS). The commercially available mixture of polymers Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) was selected as the most suitable solid-phase for SPME. The trapping duration was optimized using the presumed most abundant compounds in the secretion and 15 minutes of the extraction time was chosen as the compromise between sensitivity and the analysis time. In the subsequent chemical analysis of the headspace of the disturbed stink bugs, 57 volatiles were identified in the defensive mixture, 39 of them have not been described before in the G. lineatum species [4,5] (Fig. 4A). A structure, previously assigned to 5-ethylfuran2(5H)-one according to mass spectrum [4], was identified as (E)-4-oxohex-2-enal in this work using a method of preparative GC and nuclear magnetic resonance (NMR) (Fig. 4B,C).

14

Fig. 4: A) An analytical ion chromatogram contour of the defensive secretion of an adult G. lineatum male; B) Mass spectrum of the isolated (E)-4-oxohex-2-enal; C) Mass spectrum of the synthesized 5-ethylfuran-2(5H)-one; the numbered peaks relate to the ID numbers of the compounds listed in the paper (Table 1). [Primary oven (DB-5, 30 m, ID 0.25 mm): 50 oC (held for 2 min)-rate 10 oC/min-to 300 oC (held for 10 min); secondary oven (BPX-50, 2.0 m, ID 0.1 mm): 5 oC incremented with respect to the primary oven; modulation period: 3 s; mobile phase He (1 ml/min).]

5. CONCLUSIONS Methods of labeled metabolite analysis using GCxGC-MS, preparative GC, and radioanalytical techniques were developed and applied for sex pheromone biosynthesis of bumblebee males’ species Bombus lucorum, B. lapidarius and B. terrestris research in this work. The results supported hypothesis that fatty acids may be precursors for 15

aliphatic components biosynthesis in B. lucorum and B. lapidarius. De novo biosynthesis of the sexual pheromone in the labial gland was confirmed for B. terrestris species and supported for B. lucorum. A new exocrine gland was characterized in B. terrestris species. Chemical composition of the glandular secretion in queens, workers and males was determined using GCxGC-MS. Defensive secretion of stink bug Graphosoma lineatum was analyzed using a new approach: SPME sampling method followed by analysis using GCxGC-MS. Moreover, a structure of a previously described compound was corrected using preparative GC and NMR [4].

This thesis was done in scope of the research plan of the grant of the Technology Agency of the CR TA01020969 and the financial support from Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic, projects MSM 0021620857 and 203/09/1446.

6. REFERENCES [1]

W. Francke, S. Schulz, Comprehensive Natural Products 8, Elsevier Science Ltd., Oxford, 1999, p. 191.

[2]

B.S. Lanne, G. Bergstrom, A.B. Wassgren, B. Tornback, Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology 88 (1987) 631.

[3]

J.R. Aldrich, Annual Review of Entomology 33 (1988) 211.

[4]

K. Stránský, I. Valterová, K. Ubik, J. Čejka, J. Křeček, HrcJournal of High Resolution Chromatography 21 (1998) 475.

[5]

D. Djozan, T. Baheri, R. Farshbaf, S. Azhari, Analytica Chimica Acta 554 (2005) 197.

16

CURRICULUM VITAE Name: Date of Birth: Place of Birth: Nationality: Address: E-mail:

Mgr. Petr Žáček 10.2.1982 Zlín ČR Horní Lhota 152, 763 23, Horní Lhota u Luhačovic [email protected]

Education 2006 – now

Ph.D. study in program Analytical Chemistry Ph.D. thesis: “Use of the modern separation techniques for the analysis of insect pheromones“, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague, final exams passed in September 2011. The thesis was developed in the Infochemicals team of the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic (IOCB AV CR).

2001 – 2006

Master study in program Analytical Chemistry Master thesis: “Analytical problems in the study of hydroxamic acids“, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague. The thesis was developed in the Analytical department of the Institute of Chemical Process Fundamentals of the Academy of Sciences of the Czech Republic (ICPF AV CR).

1997 – 2001

Grammer School in Zlín Graduated in Physics, Chemistry, Czech and English Language.

Employment 2006 – now

IOCB AV CR, Infochemicals team, PhD. student.

2003 – 2006

ICPF AV CR, technician in the Analytical department. 17

Other skills Languages: English (FCE level) PC: MS Windows, Office, Driver license: B Hobby Music (clarinet), sports (football, jogging, cycling).

18

SELECTED PUBLICATIONS IN THE IMPACTED JOURNALS A.Buček, H. Vogel, P. Matoušková, D. Prchalová, P. Žáček, V. Vrkoslav, P. Šebesta, A. Svatoš, U. Jahn, I. Valterová, I. Pichová: The role of desaturases in the biosynthesis of marking pheromones in bumblebee males. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (2013) 724. P. Žáček, D. Prchalová-Horňáková, R. Tykva, J. Kindl, H. Vogel, A. Svatoš, I. Pichová, I. Valterová: De novo biosynthesis of sexual pheromone in the labial gland of bumblebee males. ChemBioChem 14 (2013) 361. S. Jarau, P. Žáček, J. Šobotník, V. Vrkoslav, R. Hadravová, A. Coppee, S. Vašíčková, P. Jiroš, I. Valterová: Leg tendon glands in male bumblebees (Bombus terrestris): structure, secretion chemistry, and possible functions. Naturwissenschaften 99 (2012) 1039. J. Kindl, P. Jiroš, B. Kalinová, P. Žáček, I. Valterová: Females of the bumblebee parasite, Aphomia sociella, excite males using a courtship pheromone. Journal of Chemical Ecology 38 (2012) 400. M. Šanda, P. Žáček, L. Streinz, M. Dračínský, B. Koutek: Profiling and characterization of volatile secretions from the European stink bug Graphosoma lineatum (Heteroptera: Pentatomidae) by twodimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 881-82 (2012) 69. R. Hanus, J. Šobotník, J. Krasulová, P. Jiroš, P. Žáček, B. Kalinová, K. Dolejšová, J. Cvačka, T. Bourguignon, Y. Roisin, M.J. Lacey, D. Sillam-Dusses: Nonadecadienone, a new termite trail-following pheromone identified in Glossotermes oculatus (Serritermitidae). Chemical Senses 37 (2012) 55. M.J. Lacey, E. Semon, J. Krasulová, D. Sillam-Dusses, A. Robert, R. Cornette, M. Hoskovec, P. Žáček, I. Valterová, C. Bordereau: Chemical communication in termites: syn-4,6-dimethylundecan-1-ol as trail-following pheromone, syn-4,6-dimethylundecanal and (5E)-2,6,10trimethylundeca-5,9-dienal as the respective male and female sex 19

pheromones in Hodotermopsis sjoestedti (Isoptera, Archotermopsidae). Journal of Insect Physiology 57 (2011) 1585. P. Žáček, B. Kalinová, J. Šobotník, O. Hovorka, V. Ptáček, A. Coppee, F. Verheggen, I. Valterová: Comparison of age-dependent quantitative changes in the male labial gland secretion of Bombus terrestris and Bombus lucorum. Journal of Chemical Ecology 35 (2009) 698. B. Kalinová, J. Kindl, P. Jiroš, P. Žáček, S. Vašíčková, M. Buděšínský, I. Valterová: Composition and electrophysiological activity of constituents identified in male wing gland secretion of the bumblebee parasite Aphomia sociella. Journal of Natural Products 72 (2009) 8. 15

P. Žáček, A. Dransfeld, O. Exner, J. Schraml: N NMR chemical shifts of ring substituted benzonitriles. Magnetic Resonance in Chemistry 44 (2006) 1073.

PROCEEDINGS J. Krasulová, R. Hanus, D. Sillam-Dusses, P. Žáček, P. Jiroš, J. Šobotník, B. Kalinová, Z. Bosáková, I. Valterová: Analytical methods Used in the Studies on Chemical Ecology of Termites. Book of th proceedings, 8 ISC “Modern analytical chemistry”, (ISBN 978-807444-017-5) (2012) 1. L. Kaluža, J. Sýkora, J. Karban, P. Žáček, Z. Vít, M. Zdražil: Hydrodesulfurization of Model Feed Containing Olefins over Al2O3, TiO2, and ZrO2 Supported Transition Metal Sulfides. European Congress of Chemical Engineering /8./, Berlin (Germany), 25.-29.9. 2011. L. Kaluža, J. Sýkora, J. Karban, P. Žáček, Z. Vít, M. Zdražil: Effect of Support on Activity of Transition Metal Sulfides in Hydrogenation of 1-Methylcyclohexene Parallel with Hydrodesulfurization of 1-Benzothiophene. 42. Symposium Catalysis, Prague (Czech Republic) 1.-2.11. 2010. P. Žáček, R. Tykva, J. KindI, I. Valterová: In vitro incubation of the 20

labial gland and fat body of the bumblebee males Bombus terrestris 14 with [1,2- C]acetate and analysis of the metabolites. Book of th proceedings, 6 ISC “Modern analytical chemistry”, (ISBN 978-807444-005-2) (2010) 92. P. Žáček, A. Jirošová, J. Kindl, I. Valterová: Two dimensional gas chromatography as a tool for biosynthesis study of the components of the marking pheromones of the males species Bombus lucorum and th Bombus lapidarius. Book of proceedings, 4 ISC “Modern analytical chemistry”, (ISBN 978-80-903103-2-2) (2008) 36. L. Kaluža, J. Sýkora, J. Karban, P. Žáček, Z. Vít, M. Zdražil: Parallel Hydrogenation of 1-Methylcyclohexene and Hydrodesulphurization of 1-Benzothiophene over Transition Metal Sulphides Supported on Al2O3, TiO2 and ZrO2. International Symposium on the Molecular Aspects of Catalysis by Sulfides /5./, Copenhagen (Denmark), 30.5.3.6. 2010.

POSTERS D. Prchalová, P. Žáček, I. Valterová, I. Pichová: Biosynthesis of terpenic compounds in marking pheromone blend of Bombus terrestris. th 28 ISCE Annual Meeting, Vilnius, (Lithuania) 22.-26.7. 2012. I. Valterová, B. Kalinová, J. Kindl, P. Jiroš, P. Žáček: Chemical and acoustic communication in pre-mating behavior of Aphomia Sociella. th 26 ISCE Annual Meeting, Tours, (France) 31.7.-4.8. 2010. P. Žáček, R. Tykva, Jiří Kindl, I. Valterová: De novo biosynthesis study of the sexual pheromone of the bumblebees males Bombus lucorum th and Bombus terrstris. 6 International Symposium on Molecular Insect Science, Amsterdam (Nederland) 2.-5.10 2011. P. Žáček, R. Tykva, Jiří Kindl, I. Valterová: De novo biosynthesis study of the components of marking pheromone of bumblebee males (Bombus lucorum and Bombus terrestris) by means of in vitro 14 th incubation with [1,2- C]acetate uptake. 27 ISCE Annual Meeting, Tours, (France) 31.7.-4.8. 2010. 21

P. Žáček, R. Tykva, Jiří Kindl, I. Valterová: Biosynthetic studies: In vitro incubation of the labiál gland and fat body of the bumblebee 14 males (Bombus lucorum and Bombus terrestris) with [1,2- C]acetate th uptake. 26 ISCE Annual Meeting, Neuchâtel, (Switzerland) 23.-27.8. 2009 P. Jiroš, B. Kalinová, J. Kindl, P. Žáček, I. Valterová: Bee moth th Aphomia sociella and scent of host bumblebee nest. 26 ISCE Annual Meeting, Neuchâtel, (Switzerland) 23.-27.8. 2009 P. Žáček, A. Luxová, J. Kindl, I. Valterová: Biosynthetic studies of the male marking pheromone of bumblebees species Bombus lucorum th and B. lapidarius. 4 IUSSI European Meeting, La Roche-en-Ardenne, (Belgium), 30.8.-4.9. 2008 P. Žáček, A. Luxová, J. Kindl, I. Valterová: Biosynthetic studies of the male marking pheromone of bumblebees species Bombus lucorum th and B. lapidarius. 24 Anniversary Meeting of ISCE, State college, Pennsylvania (USA) 17.-22.08 2008 P. Jiroš, B. Kalinová, J. Kindl, P. Žáček, J. Cvačka, S. Vašíčková, I. Valterová: Wing glands secretion of the bee moth Aphomia sociella. th 24 Anniversary Meeting of ISCE, State college, Pennsylvania (USA) 17.-22.08 2008 P. Žáček, A. Luxová, J. Kindl, O. Hovorka, I. Valterová: Výzkum biosyntézy složek samčích značkovacích feromonů čmeláků druhů Bombus lucorum a Bombus lapidarius. VII. Mezioborové setkání mladých biologů, biochemiků a chemiků (Sigma-Aldrich). Žďárské Vrchy (Czech Republic) 10.-13.06. 2008. Poster was among top 5 posters. P. Žáček, I. Valterová, B. Kalinová, J. Šobotník, O. Hovorka, V. Ptáček: Changes in the composition of the labiál gland secretion rd dutiny the life of Bombus lucorum. 23 ISCE Annual Meeting, Jena (Germany), 22.-26.7. 2007

22