i
EFEK GENISTEIN TERHADAP DERAJAT ALERGI DAN KADAR IMUNOGLOBULIN E MARMUT YANG DIINDUKSI PUTIH TELUR
CITRA PRADITI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ii
ABSTRAK CITRA PRADITI. Efek Genistein Terhadap Derajat Alergi dan Kadar Imunoglobulin E Marmut yang Diinduksi Putih Telur. Dibimbing oleh HASIM dan MIN RAHMINIWATI. Penelitian tentang efek genistein terhadap derajat alergi dan kadar imunoglobulin E telah dilakukan menggunakan marmut sebagai hewan coba. Marmut dibagi ke dalam dua kelompok yaitu kelompok kontrol dan kelompok genistein. Kelompok kontrol tidak disensitisasi, sementara kelompok genistein disensitisasi selama 40 hari dengan pemberian putih telur, NaCl 0.9%, dan Al(OH)3 melalui sub kutan setiap minggu selama 30 hari, dilanjutkan dengan induksi putih telur melalui air minum pada hari ke-31 sampai hari ke-39. Hari ke40 seluruh marmut disuntik dengan serum di permukaan dorsal secara intradermal. Hari ke-42 kelompok kontrol dicekok akuades sebanyak 1 mL dan kelompok genistein dicekok dengan larutan genistein 0.014 μg/100 g bobot badan marmut dalam 1 mL akuades. Seluruh marmut kemudian diinduksi putih telur sebagai alergen dan pewarna Evan’s Blue secara intravena. Kadar imunoglobulin E diukur dari sampel darah, derajat alergi diuji dengan Anafilaksis Kutanus Pasif (AKP). Analisis AKP menunjukkan bahwa marmut kelompok kontrol dan kelompok genistein memiliki tingkat kebiruan yang sama. Hal ini didukung dengan data imunoglobulin E, sehingga dapat dikatakan bahwa pemberian genistein belum terbukti dapat mempengaruhi penurunan kadar imunoglobulin E.
iii
ABSTRACT CITRA PRADITI. The Effect of Genistein to the Degree of Allergy and Immunoglobulin E Level on Egg White-Induced Guinea Pig. Under the direction of HASIM and MIN RAHMINIWATI. Research about the effect of genistein on immunoglobulin E level has been done by using guinea pig as the murine model. Guinea pigs were divided into two groups namely control and genistein. Control group were not sensitisized, while genistein were sensitisized for 40 days by sub cutaneous injection of egg white, NaCl 0.9%, and Al(OH)3 for 30 days, continued by induced egg white in drinking water between day 31 until day 39. On day 40th all these guinea pig were injected with serum in dorsal surface. Day 42nd control group were induced orally with 1 mL aquadest, while genistein group induced orally with 1.84 μg/100 g guinea pig’s body weight in 1 mL aquadest. All guinea pigs then induced with egg white as the allergen and Evan’s Blue dye intravenously. Blood sample were taken before sensitization and after induction of egg white. Immunoglobulin E level of blood sample was calculated by ELISA method, allergic degree were measured by Pasive Cutaneous Anaphylaxis (PCA). PCA analysis shown that control group and genistein group has the equal bluish intensity. IgE level also support the PCA data, thus, it can not be stated that genistein induction alter the decrease of immunoglobulin E level.
iv
EFEK GENISTEIN TERHADAP DERAJAT ALERGI DAN KADAR IMUNOGLOBULIN E MARMUT YANG DIINDUKSI PUTIH TELUR
CITRA PRADITI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
v
Judul Skripsi Nama NIM
: Efek Genistein terhadap Derajat Alergi dan Kadar Imunoglobulin E Marmut yang Diinduksi Putih Telur : Citra Praditi : G84050138
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. drh. Hasim, DEA Ketua
Dr. drh. Min Rahminiwati, MS Anggota
Diketahui
Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus:
vi
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas izin, rahmat, dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan dari bulan Agustus 2009 ini adalah Efek Genistein terhadap Imunoglobulin E Marmut yang Diinduksi Putih Telur. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. drh. Hasim, DEA dan Ibu Dr. drh. Min Rahminiwati, MS selaku pembimbing atas bimbingan, dorongan, semangat, dan ilmu yang diberikan kepada penulis selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima hasih juga disampaikan kepada kedua orang tua yang memberikan dukungan, bantuan materi, kesabaran, kasih sayang, dan doa kepada penulis. Penulis mengucapkan terima kasih semua pegawai dan laboran di Departemen Biokimia IPB, atas segala fasilitas dan kemudahan yang telah diberikan, dan juga kepada Bianca Natania Leasa dan Nurwenda Novan Maulana atas kerjasama selama penelitian, rekan-rekan Biokimia 42, Wandi FKH 42, drh. Huda S Darusman, drh. Aulia, dan laboran FKH yang banyak membantu dalam menyempurnakan metode. Terakhir, semua pihak yang telah mendukung selama penelitian. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Maret 2010
Citra Praditi
vii
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Padang pada tanggal 11 November 1987 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Hamdi Ridzuan dan Evayenti Kadir. Tahun 2005 penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai anggota Himpunan Profesi Biokimia CREBS sebagai staf Bioanalisis pada periode 2007-2008. Tahun 2008 penulis melaksanakan praktik lapangan di PT Nutrifood Indonesia, Ciawi, Jawa Barat di bagian mikrobiologi.
viii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR.........................................................................................….ix DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................….ix PENDAHULUAN ......................................................................................……….1 TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................................…..1 Alergi .............................................................................................................…..1 Imunoglobulin E ............................................................................................…..2 Genistein .............…………………………………………………………...…..3 Histamin dan Mediator Lain ..........................................................................…..4 Marmut (Cavia porcellus)..............................................................................…..5 Putih Telur......................................................................................................…..6 Anafilaksis Pasif Kulit (AKP)......................................................................……6 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)............................................…..7 Prinsip Perhitungan IgE .................................................................................…..8 BAHAN DAN METODE..................................................................................…..8 Alat dan Bahan...............................................................................................…..8 Metode Penelitian ...........................................................................................….8 HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................................…..9 Adaptasi Marmut..........................................................................................……9 Tahap Sensitisasi................................................................................................10 Pengujian Anafilaksis Kutanus Pasif (AKP) dan Aktivitas Antialergi..............11 SIMPULAN DAN SARAN...................................................................................12 Simpulan ............................................................................................................12 Saran...................................................................................................................12 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................12 LAMPIRAN ..........................................................................................................14
ix
DAFTAR GAMBAR 1
Halaman Struktur imunoglobulin ....................................................................................3
2
Klasifikasi imunoglobulin ...............................................................................3
3
Struktur genistein..............................................................................................4
4
Struktur histamin .............................................................................................4
5
Struktur serotonin ............................................................................................5
6
Struktur prostaglandin ......................................................................................5
7
Struktur kinin ....................................................................................................5
8
Reaksi 1,2 dioksietana dengan alkalin fosfatase...............................................8
9
Data bobot badan marmut selama penelitian..................................................10
10 Hasil pengamatan uji AKP .............................................................................11
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Alur kerja penelitian .......................................................................................15 2 Tahap penghitungan IgE..................................................................................16 3 Proses pembuatan larutan sensitisasi ...............................................................17 4 Analisis statistik bobot badan marmut.............................................................18 5
Perhitungan dosis genistein .............................................................................19
6 Komposisi pakan marmut ................................................................................20 7 Daftar protein pada putih telur.........................................................................20 8 Data biologis dan fisiologis marmut................................................................21
1
PENDAHULUAN Senyawa asing dapat menyebabkan sistem imun bereaksi secara berlebihan yang dikenal sebagai reaksi alergi atau hipersensitivitas (Manahan 2003). Kebanyakan kasus alergi disebabkan oleh serbuk sari tanaman. Selain itu, makanan seperti ikan, telur, kacangkacangan, udang, dan gandum, obat-obatan, spora, debu, dan suhu juga dapat menimbulkan reaksi alergi. Penderita alergi biasanya akan mengalami gangguan pernapasan seperti asma dan gatal-gatal. Gejala lainnya yang ditunjukkan dari reaksi alergi antara lain diare dan sakit kepala (Campbell & Farrell 2006, Opara 2002). Gejala yang ditimbulkan oleh reaksi alergi terjadi karena pembebasan beberapa jenis substansi dari sel mediator seperti histamin, serotonin, kinin, dan prostaglandin. Substansisubstansi tersebut dilepaskan oleh sel mastosit dan sel basofil ketika tubuh terpapar alergen. Histamin dan substansi lainnya dapat menimbulkan berbagai efek seperti kontraksi otot halus, pembesaran pembuluh darah, peningkatan permeabilitas kapiler, penurunan tekanan darah, dan gatal-gatal (Henson 1978, Laurence & Bennett 1996). Gejala alergi dapat terjadi dalam hitungan menit setelah tubuh terpapar alergen, seperti pada reaksi alergi yang diperantarai oleh imunoglobulin E (IgE). Beberapa gejala alergi yang lain seperti muntah, pusing, dan diare dapat terjadi dalam waktu yang lebih lama (Opara 2002). Kasus alergi dalam satu dekade terakhir ini diperkirakan para ahli telah mengalami peningkatan. Alergi susu sapi merupakan bentuk alergi makanan yang paling sering ditemukan pada anak berusia kurang dari dua tahun, dan diperkirakan 2-7,5 persen anak pada kelompok umur ini mengalami alergi protein susu sapi (Evy 2009). Peningkatan kasus ini terus terjadi karena belum ditemukannya obat yang dapat mencegah terjadinya reaksi alergi. Obat antialergi komersil yang beredar umumnya mengandung difenilamin, seproheptadin, dienhidramina, feniramina, ketotifen, dan natrium kromoglikat. Sejauh ini obat yang dapat mengurangi reaksi alergi bekerja dengan tiga jenis mekanisme yaitu menghambat histamin menempel pada reseptornya, membalikkan efek histamin, dan menghambat keluarnya histamin dari sel mastosit (Laurence & Bennet 1996). Mekanisme kerja obat komersil tersebut lebih banyak bekerja setelah tahap proliferasi sel limfosit B. Namun belum diketahui ada obat yang dapat menghambat reaksi alergi dengan cara menurunkan kadar
IgE. Selain itu zat aktif yang terkandung di dalam obat antialergi komersil tersebut merupakan bahan kimia sintetik. Sementara penelitian mengenai senyawa antialergi yang berasal dari bahan alami belum dilakukan secara mendalam. Genistein merupakan isoflavonoid glikosida paling sederhana yang terdapat di dalam tumbuhan leguminosa. Genistein sebagai isoflavonoid merupakan senyawa antara yang utama dalam sintesis senyawa isoflavonoid yang lain, dan memiliki aktivitas farmakologi yang telah diketahui seperti penghambat aktivitas enzim tirosin kinase, antikanker, dapat melawan penyakit kardiovaskular, dan memiliki aktivitas fitoesterogen (Dixon & Ferreira 2002). Sebagai senyawa yang tergolong isoflavonoid, masih banyak aktivitas genistein yang belum diketahui seperti kemampuannya sebagai antitumor, antihepatotoksik, dan antiradang. Peradangan merupakan keadaan yang terjadi ketika tubuh mengalami kerusakan yang disebabkan oleh senyawa kimia, mekanik, atau proses autoimun. (Ward 1978). Proses terjadinya radang dilakukan oleh berbagai jenis mediator. Mediator tersebut dihasilkan oleh sel mastosit, sel makrofag, sel neutrofil, sistem pembekuan darah, sistem kinin, dan sistem komplemen. Kerusakan jaringan menyebabkan sel mastosit mengalami degranulasi, kemudian melepaskan histamin dan leukotrien seperti yang terjadi pada reaksi alergi. Mediator ini menyebabkan peningkatan pasokan darah dan terjadinya akumulasi cairan tubuh pada jaringan tersebut (Kimball 1990). Dalam hal ini, baik alergi dan peradangan diperantarai oleh histamin (Rang, Dale & Ritter 1995). Penelitian ini bertujuan mengetahui kemampuan genistein sebagai antialergi dengan pendekatan senyawa isoflavonoid sebagai antiradang, melalui mekanisme penurunan kadar imunoglobulin E ketika terjadi reaksi alergi. Hipotesis penelitian ini adalah genistein dapat menghambat terjadinya reaksi alergi dilihat dari derajat alergi dan kadar imunoglobulin E sebelum dan sesudah reaksi alergi. Manfaat dari penelitian ini antara lain menjadikan genistein sebagai pilihan obat antialergi.
TINJAUAN PUSTAKA Alergi Reaksi alergi berarti reaksi sistem yang berlebihan yang disebabkan terpaparnya tubuh oleh senyawa asing dikenal dengan alergen. Senyawa
imun oleh yang asing
2
tersebut sebenarnya tidak berbahaya, namun sistem imun memberi respon yang berlebihan terhadap senyawa tersebut. Alergen yang masuk melalui saluran pernafasan seperti serbuk sari, kutu hewan, dan debu dapat menyebabkan berbagai respon alergi seperti gatal pada mata, hidung berair, mata berair, sakit kepala, iritasi mata, pembengkakan jaringan pernafasan, dan bersin (Campbell & Farrell 2006). Pada beberapa kasus, reaksi alergi dapat menimbulkan kejutan anafilaksis seperti penurunan tekanan darah mendadak, kesulitan bernafas, iritasi kulit, pingsan, dan kemungkinan kematian. Reaksi alergi umumnya terjadi akibat molekul imunoglobulin E (IgE) terikat pada sel mastosit dan sel basofil pada darah. Hal ini menyebabkan sel mastosit mengalami degranulasi dan melepaskan histamin ke dalam darah. Histamin yang dilepaskan dapat memperbesar pembuluh darah arteri dan pembuluh darah kapiler, meningkatkan permeabilitas pembuluh kapiler, dan mempersempit aliran udara pada saluran pernafasan (Kuehnel 2003). IgE sendiri dihasilkan dalam jumlah banyak ketika alergen menempel pada sel limfosit B. Hal ini menyebabkan sel limfosit B mengalami pematangan dan berubah menjadi sel plasma. Dari sel plasma ini dihasilkan IgE dalam jumlah besar (Kuby 2007). Berdasarkan waktu terpaparnya alergen dengan waktu terjadinya reaksi alergi, reaksi alergi dapat dibedakan atas dua jenis yaitu reaksi alergi cepat dan reaksi alergi tertunda. Reaksi alergi cepat terjadi dalam beberapa menit atau beberapa jam setelah tubuh yang telah disensitisasi menerima alergen. Reaksi alergi tertunda disebut demikian karena gejala alergi baru terlihat setelah beberapa hari tubuh terpapar alergen. Reaksi alergi juga dapat dibedakan menjadi empat kelompok berdasarkan mekanisme terjadinya reaksi alergi. Tiga tipe diantaranya merupakan bagian sistem imun humoral dan diperantarai oleh antibodi atau kompleks antigen-antibodi. Reaksi alergi tipe I diperantarai oleh IgE, tipe II diperantarai oleh antibodi, tipe III diperantarai oleh kompleks imun. Reaksi alergi tipe IV diperantarai oleh sel. Reaksi alergi tipe ini merupakan jenis reaksi alergi tertunda. Reaksi alergi tipe I terjadi dengan cara alergen memicu sel limfosit B untuk berubah menjadi sel plasma dan mengeluarkan IgE. IgE ini kemudian terikat dengan reseptornya pada permukaan sel mastosit dan sel basofil darah. Hal ini menyebabkan sel mastosit dan basofil mengalami degranulasi dan
mengeluarkan efektor. Reaksi alergi tipe II melibatkan antibodi untuk merusak sel asing. Mekanisme seperti ini dijalankan dengan mengaktifkan sistem komplemen, dan membentuk lubang pada sel asing. Mekanisme ini juga dapat dijalankan dengan melibatkan sel sitotoksik dan antibodi untuk menghancurkan sel asing tersebut. Pada reaksi alergi tipe III, kompleks imun yang dibentuk oleh antigen dengan antibodi menjadikan sel fagosit mengenali kompleks imun ini dan menghancurkan kompleks tersebut. Namun jika kompleks imun yang dibentuk sangat banyak, hal ini dapat membahayakan jaringan tubuh. Reaksi alergi tipe lain yaitu reaksi alergi tipe IV berjalan dengan melibatkan pelepasan sitokina. Ketika sel T pembantu mengenali antigen, sel ini akan mengeluarkan sitokina yang dapat menginduksi terjadinya reaksi peradangan yang dikenal dengan reaksi alergi yang tertunda atau reaksi hipersensitif yang tertunda. Reaksi ini ditandai dengan adanya sel penyebab radang seperti sel makrofag dalam jumlah besar (Kuby 2007). Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, reaksi alergi tipe I merupakan jenis reaksi alergi yang paling umum terjadi. Reaksi alergi yang diperantarai IgE ini terjadi dalam dua tahap yaitu tahap sensitisasi dan tahap reaksi alergi. Pada tahap sensitisasi, alergen masuk ke dalam tubuh dan MHC kelas II menyajikan alergen tersebut kepada sel T pembantu. Sel T pembantu yang kemudian terikat pada alergen akan mengalami proliferasi dan menghasilkan beberapa jenis sitokina seperti interleukin (IL)-4, IL-5, IL-10, dan IL-13. Sitokina ini kemudian memicu diferensiasi dan proliferasi sel limfosit B yang spesifik terhadap alergen. Sel limfosit B ini kemudian memproduksi IgE dalam jumlah yang besar. Antibodi yang spesifik terhadap alergen ini kemudian terikat pada reseptor IgE pada sel mastosit dan sel basofil dengan afinitas yang tinggi (Opara 2002). Jumlah reseptor IgE pada sel basofil dan sel mastosit meningkat ketika kadar IgE di dalam serum juga meningkat seperti yang terjadi pada reaksi alergi. Sel mastosit dan sel basofil dikatakan tersensitisasi ketika sel-sel tersebut memiliki reseptor IgE yang spesifik terhadap alergen pada permukaannya (Goldstein 1988). Imunoglobulin E Immunoglobulin merupakan protein yang beredar di dalam darah yang berfungsi sebagai reseptor antigen. Imunoglobulin atau antibodi dibentuk dari sel limfosit B dan T yang teraktifkan. Keberadaan imunoglobulin di dalam darah terkait dengan sistem kekebalan
3
humoral dengan cara mengikat antigen yang beredar di dalam darah. Imunoglobulin juga memiliki peran yang cukup penting dalam sistem kekebalan selular melalui beberapa cara seperti mengaktifkan sistem komplemen dan membentuk kompleks imun dengan sel patogen sehingga lebih mudah dihancurkan oleh sel fagosit (Koolman & Roehm 2005). Imunoglobulin memiliki konfigurasi struktur dasar yang sama, yaitu terdiri atas dua rantai ringan yang identik dan dua rantai berat yang identik. Rantai berat dan rantai ringan ini dihubungkan oleh ikatan disulfida. Masingmasing rantai berat dan rantai ringan memiliki daerah konstan dan daerah variabel. Daerah konstan disusun oleh 100-110 asam amino yang pola sekuensnya tetap. Daerah variabel merupakan daerah yang disusun oleh asam amino yang beragam. Daerah ini merupakan tempat terikatnya antigen. Daerah variabel ini tersusun atas kombinasi berbagai asam amino sehingga dihasilkan imunoglobulin yang dapat mengikat bermacam jenis antigen. Selain itu, imunoglobulin juga dibagi menjadi dua fragmen yaitu fragmen tempat terikatnya antigen (Fab) dan fragmen yang dapat terkristalisasi (Fc). Struktur imunoglobulin ditunjukkan pada Gambar 1. Rantai ringan dibedakan menjadi dua macam berdasarkan struktur dasar penyusun asam aminonya yaitu rantai lambda (λ), dan rantai kappa (κ) (Kayser et. al 2005). Rantai berat dapat dibedakan menjadi lima isotipe berdasarkan pola sekuens asam amino penyusun rantai berat tersebut. Kelima isotipe tersebut antara lain ά, δ, έ, γ, dan μ. Jenis isotipe pada rantai berat ini menentukan kelas dari imunoglobulin. Imunoglobulin A (IgA) memiliki isotipe ά pada rantai beratnya, IgD memiliki isotipe δ, IgE memiliki isotipe έ, IgG memiliki isotipe γ, dan IgM memiliki isotipe μ (Kuby 2007). Struktur dari isotipe imunoglobulin ditunjukkan pada Gambar 2. Daerah konstan
Daerah variabel
Daerah hipervariabel
Daerah konstan
Gambar 1 Struktur umum immunoglobulin (Koolman & Roehm 2005).
Gambar 2 Klasifikasi immunoglobulin (Koolman & Roehm 2005). Secara umum imunoglobulin memiliki fungsi sebagai pertahanan tubuh secara humoral, namun dengan adanya kelas-kelas imunoglobulin memberikan fungsi dan karakteristik yang berbeda pada setiap kelasnya. IgA merupakan antibodi yang menjadi pertahanan tubuh pertama terhadap serangan bakteri dan virus. IgA banyak terdapat pada air liur, air mata, mukosa bronkus, dan mukosa saluran pencernaan. IgE diketahui berperan penting melindungi tubuh dari serangan parasit, dan juga memegang peranan penting dalam reaksi alergi (Berg, Stryer & Tymaczko 2007). IgG merupakan imunoglobulin yang paling banyak terdapat di dalam darah. Selain di dalam darah, IgG juga terdapat di cairan interestial. IgM merupakan antibodi pertama yang dibentuk setelah tubuh terpapar antigen, dan IgM yang baru dibentuk terdapat di permukaan sel limfosit B. IgM yang terbentuk berikutmya dikeluarkan sebagai pentamer. Fungsi IgD belum diketahui dengan pasti (Koolman & Roehm 2005). Jenis imunoglobulin yang mengindikasikan terjadinya reaksi alergi adalah IgE. Kadar IgE di dalam serum sebesar 0.3 μg/ml. Namun ketika terjadi reaksi alergi, kadar IgE serum akan meningkat (Kuby 2007). Berdasarkan sejarahnya, IgE merupakan jenis imunoglobulin yang paling terakhir ditemukan, yaitu ketika Prausnitz dan Küstner melakukan percobaan mengenai anafilaksis pasif kulit. Aktivitas biologis IgE diketahui dapat terikat pada sel basofil dan sel mastosit. Ikatan ini terjadi antara reseptor pada permukaan sel mastosit dengan bagian epsilon dari fragmen Fc dari IgE. Hal ini menyebabkan sel mastosit terstimulasi untuk tergranulasi dan mengeluarkan beberapa mediator seperti histamin. Pelepasan mediator ini yang mengakibatkan terjadinya reaksi alergi (Kimball 1990). Genistein Senyawa isoflavonoid fitoesterogen seperti genistein dan daidzein yang berasal dari
4
kacang kedelai merupakan esterogen nonsteroid yang memiliki berbagai potensi terutama bagi kesehatan tubuh manusia. Kebanyakan isoflavonoid seperti genistein dan daidzein ditemukan dalam bentuk glikosidanya dalam tanaman. Namun ketika tanaman tersebut diolah menjadi produk pangan dengan perlakuan berbeda, maka jenis isoflavonoid yang ditemukan pun berbeda. Seperti pada kacang kedelai yang tidak mengalami fermentasi mengandung isoflavonoid dalam bentuk β-glukosida, dan sebagian kecil berupa isoflavonoid teresterifikasi dengan asam malonat atau asam asetat. Sementara produk pangan dari kacang kedelai yang difermentasi kebanyakan mengandung isoflavonoid yang tidak terkonjugasi (Wiseman 2006). Struktur genistein ditunjukkan pada Gambar 3. Kebanyakan isoflavonoid yang ditemukan memiliki aktivitas antimikrobial yang memiliki spektrum luas. Hal ini diduga menjadi salah satu cara tanaman melawan penyakit. Selain itu genistein juga memiliki potensi sebagai estrogen estradiol disebabkan oleh struktur cincin fenolnya dan jarak antara gugus hidroksilnya. Hal ini menjadikan genistein dapat terikat pada reseptor estrogen. Beberapa penelitian terdahulu juga menyebutkan bahwa genistein berpotensi mencegah terjadinya kanker dan dapat mengurangi resiko kanker. Dalam hal ini genistein diduga menghambat pertumbuhan sel sehingga mencegah terjadinya kanker. Peran genistein yang lain dalam bidang kesehatan yaitu genistein dapat menghambat oksidasi lipoprotein densitas rendah (LDL) sehingga mencegah penyakit kardiovaskular (Dixon & Ferreira 2002). Beberapa jenis flavonoid seperti flavonoid C-glikosida memiliki efek terhadap leukosit darah dan sel endothelial sel dan juga sebagai antiradang. Peradangan itu sendiri disebabkan oleh peningkatan permeabilitas jaringan endothelial dan akumulasi leukosit darah yang menyebabkan edema. Beberapa jenis flavonoid dapat dihubungkan dengan kemampuan senyawa flavonoid itu sendiri terhadap kemampuan menghambat beberapa enzim yang terkait dengan aktivasi sel seperti fosfodiesterase, kinase, dan topoisomerase. Enzim fosfodiesterase terlibat pada tahap awal terjadinya radang, sehingga aktivitas flavonoid C-glikosida dalam menghambat aktivitas enzim tersebut dapat menjadi dasar dalam pengobatan respon peradangan (Veitch & Grayer 2006).
Gambar 3 Struktur genistein (Dixon & Ferreira 2002). Histamin dan Mediator Lain Histamin merupakan mediator utama yang dilepaskan ketika terjadi reaksi alergi. Dalam keadaan normal, histamin berperan sebagai perantara dalam proses sekresi pada beberapa kelenjar. Selain itu histamin berperan dalam mengatur mikrosirkulasi pada kebanyakan sel yang berada di dekat pembuluh darah. Histamin juga dapat berperan sebagai hormon lokal yaitu dengan menjadi senyawa yang meneruskan sinyal dari sel yang melepaskan histamin ke sel yang berada di sekitarnya. Histamin juga mempengaruhi sekresi cairan pencernaan dengan mempengaruhi sel parietal untuk mengeluarkan ion hidrogen ketika histamin mencapai reseptornya pada permukaan sel parietal (Laurence & Bennet 1997). Struktur histamin ditunjukkan pada Gambar 4. Histamin banyak ditemukan di sel mastosit dan sel darah putih basofil. Histamin ditemukan di sel mastosit paru-paru, saluran pencernaan, dan kulit dalam konsentrasi yang paling besar. Ketika tubuh terpapar antigen melalui kulit, paru-paru, atau masuk ke dalam aliran darah pada individu yang telah tersensitisasi, sel mastosit akan segera mengalami degranulasi dan melepaskan histamin. Histamin ini kemudian berinteraksi dengan reseptor histamin yang ada pada membran jaringan tertentu sehingga dihasilkan gejala alergi (Hitner & Nagle 1999, Henson 1978). Efek histamin dapat dikendalikan dengan tiga cara yaitu menggunakan obat yang efeknya berlawanan dengan efek histamin, mencegah histamin mencapai reseptornya pada jaringan, dan mencegah dilepaskannya
Gambar 4 Struktur histamin (Lehninger, Nelson & Cox 2004).
5
histamin dari sel mediator. Obat yang biasa dikenal dengan antihistamin dapat menghalangi histamin mencapai reseptornya pada jaringan sehingga efek histamin dapat dihindari melalui mekanisme kompetitif (Laurence & Bennett 1997). Obat yang berfungsi mencegah sel mastosit mengeluarkan histamin dikenal dengan obat antialergi. Cromolyn sodium merupakan satusatunya obat yang dapat mencegah lepasnya histamin dari sel mastosit secara selektif. Obat ini digolongkan sebagai obat profilaksis karena obat ini mencegah awal terjadinya gejala alergi dengan cara dikonsumsi sebelum histamin dilepaskan dari sel mastosit. Cromolyn sodium yang berbentuk serbuk dapat mencapai sel mastosit pada paru-paru sebelum antigen menginduksi reaksi alergi (Hitner & Nagle 1999). Serotonin merupakan asam amino vasoaktif yang ditemukan di sel mastosit tikus dan mencit, dan pada platelet. Fungsi serotonin belum diketahui dengan jelas, namun serotonin diketahui dapat meningkatkan permeabilitas vaskular, pembesaran pembuluh kapiler, dan kontraksi otot halus (Henson 1978). Serotonin diduga berperan sebagai perantara reaksi peradangan, menyebabkan muntah dan berhalusinasi (Rang, Dale & Ritter 1995). Struktur serotonin ditunjukkan pada Gambar 5. Mediator reaksi alergi tidak hanya berupa hormon atau asam amino, namun juga asam lemak seperti prostaglandin. Prostaglandin merupakan asam lemak yang mengandung 20 atom karbon dan memiliki cincin 5-karbon internal (Lieberman, Marks & Smith 2007). Senyawa turunan asam arakhidonat ini tergolong asam lemak tak jenuh yang diproduksi dari fosfolipid membran (Kimball 1990). Mediator yang disintesis di semua jenis sel pada mamalia ini mempunyai kemampuan menginduksi radang dengan cara memperbesar pembuluh darah sehingga terjadi pembengkakan dan kemerahan (Glew 2006). Prostaglandin tersebar di berbagai jaringan dan berperan dalam kontraksi dan relaksasi otot halus, serta agregasi platelet (Henson 1978). Struktur prostaglandin dijabarkan pada Gambar 6. Kinin merupakan suatu peptida yang juga merupakan mediator dalam reaksi alergi. Jenis kinin yang diproduksi adalah bradikinin dan lisilbradikinin. Kedua peptida tersebut berperan dalam meningkatkan permeabilitas vaskular, dan menyebabkan penurunan tekanan darah serta kontraksi otot halus (Henson 1978). Bradikinin sebagai salah satu
contoh peptida kinin mampu menginduksi kontraksi otot halus pada saluran pencernaan secara perlahan. Selain itu bradikinin dapat menyebabkan pelepasan adrenalin dari adrenal medulla, dan menyebabkan akumulasi leukosit yang merupakan respon peradangan (Pugh 1982). Struktur kinin ditunjukkan pada Gambar 7.
Gambar 5 Struktur serotonin (Lehninger, Nelson & Cox 2004).
Gambar 6 Struktur prostaglandin (Lehninger, Nelson & Cox 2004).
Gambar 7 Struktur kinin (Lehninger, Nelson & Cox 2004). Marmut (Cavia porcellus) Marmut (Cavia aperea porcellus) tergolong ke dalam kelompok hewan pengerat, dibawah sub-orde Hystricomorphs. Sebagai hewan pengerat, marmut memiliki gigi permanen yang berbentuk seperti pahat dan terus tumbuh selama masa hidupnya. Data biologis marmut ditunjukkan pada Lampiran 8. Marmut berbeda dari hewan pengerat lainnya. Kaki dan tubuhnya yang pendek membuat marmut dapat berlari dengan cepat, namun tidak secepat hewan pengerat lainnya. Hewan tidak berekor ini memiliki kelenjar minyak pada bagian punggung bawahnya
6
yang digunakan untuk menandai daerah tertentu. Perbedaan utama antara marmut dengan hewan pengerat pada umumnya adalah masa kehamilan marmut yang cukup panjang (Dallas 2000). Marmut merupakan hewan herbivora yang menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk menggigit rumput. Hewan ini memiliki kebiasaan makanan yang buruk. Perubahan yang kecil pada sistem pemberian makanannya dapat menyebabkan marmut berhenti makan pada waktu yang cukup lama. makanan yang dianjurkan bagi marmut adalah makanan yang mengandung serat tinggi. Kekurangan serat akan menyebabkan marmut mengunyah rambutnya sendiri. Marmut tidak memiliki enzim yang dapat mengubah glukosa menjadi vitamin C. Oleh karena itu vitamin C dibutuhkan dalam asupan makanan marmut. Dosis vitamin C yang dianjurkan adalah 10 mg/kg bobot badan marmut. Namun angka ini dapat meningkat tiga kali lipat selama masa kehamilan. Vitamin C juga dapat diberikan melalui air minum sebanyak 1g/L air minum. Kekurangan vitamin C pada marmut dapat menyebabkan anoreksia, dehidrasi, kesembuhan luka terhambat, gigi berubah warna menjadi coklat, dan peradangan sementara pada sendi (Bassert & McCurnin 2006). Putih Telur Putih telur atau albumin merupakan substansi kenyal yang mengisi telur sebanyak 58% sampai 60% dari berat telur total. Putih telur mengandung protein sebesar 10%, dan air sebesar 88% serta karbohidrat, lemak, dan komponen minor lainnya sebanyak 2%. Protein yang terkandung di dalam albumen antara lain adalah ovalbumin, ovomucin, ovotransferrin, dan ovomucoid. Ovalbumin merupakan komponen protein yang paling banyak terdapat pada putih telur. Ovalbumin merupakan protein globular yang dapat dikristalkan. Protein ini menjadi sumber asam amino paling besar bagi embrio yang terdapat di dalam telur. Ovalbumin juga memiliki aktivitas antibakteri yaitu sebagai protease inhibitor. Ketika albumen dipanaskan sampai dengan suhu 60˚C atau 140˚F akan memadat dan mengalami koagulasi. Ovomucin merupakan protein lain yang terdapat di dalam putih telur. Putih telur mentah bersifat kental disebabkan oleh adanya protein ini, selain itu ovomucin juga memberikan sifat penstabil pada busa putih telur yang bermanfaat dalam pembuatan kue.
Protein lain yang terdapat di dalam putih telur adalah ovotransferin atau conalbumin yang mempunyai kemampuan untuk mengikat ion logam, dan avidin yang dapat mengikat biotin. Lisozim juga ditemukan di dalam putih telur, dan berfungsi menghancurkan dinding sel bakteri. Protein lain seperti ovomucoid juga terdapat di dalam putih telur, dan protein ini bertindak sebagai inhibitor tripsin dengan cara memperlambat dan menghambat masuknya bakteri ke dalam telur, sehingga dapat melindungi embrio. Komposisi protein di dalam putih telur dijabarkan dalam Lampiran 7. Putih telur mengandung karbohidrat dalam jumlah yang sangat kecil. Setengah dari karbohidrat ini berupa glukosa bebas dan sisanya sebagai glikoprotein yang mengandung manosa dan galaktosa (Osuga & Feeney 1977). Anafilaksis Pasif Kulit (AKP) Pemberian alergen kepada suatu hewan percobaan dalam selang waktu tertentu akan memberikan respon imun yang disebut dengan anafilaksis. Seperti pemberian 1 mg ovalbumin kepada marmut normal tidak akan memberikan efek yang berbahaya terhadap marmut tersebut. Namun ketika marmut diberikan lagi ovalbumin dengan dosis yang sama setelah 14 hari, pemberian alergen ini dapat mematikan marmut tersebut. Respon marmut terhadap pemberian ovalbumin yang kedua merupakan salah satu contoh reaksi anafilaksis. Setelah menerima ovalbumin yang kedua, marmut bernapas lebih cepat dan terjadi penurunan tekanan darah secara drastis. Hal ini terjadi karena vasodilatasi, kenaikan permeabilitas pembuluh darah kapiler, dan kontraksi otot halus. Anafilaksis jenis ini dikenal dengan respon anafilaksis sistemik. Berbeda dengan anafilaksis sistemik, anafilaksis lokal hanya terjadi di organ atau jaringan tertentu. Respon anafilaksis dapat dipindahkan ke hewan lain melalui serum. Percobaan ini pertama kali dilakukan oleh Praustnitz dan Küstner pada tahun 1921. Uji anafilaksis yang dilakukan Praustnitz dan Küstner dikenal dengan uji P-K dan uji ini telah digunakan secara luas dalam bidang diagnosis. Dalam uji ini, serum dari individu yang alergi diinduksi ke kulit resipien normal. Setelah beberapa jam, substansi yang diduga alergen diinduksikan ke individu normal yang telah diberi serum individu alergi di tempat penyuntikan yang sama. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pembengkakan
7
dan kemerahan, yang berarti individu normal menjadi alergi. Uji anafilaksis pasif kulit merupakan uji PK yang mengalami modifikasi. Uji anafilaksis pasif kulit dilakukan untuk menguji apakah serum yang tersensitisasi mengandung IgE yang spesifik terhadap alergen yang diberikan. Uji ini didasarkan pada reaksi antibodi yang bersifat heterositotropik, yaitu antibodi yang berasal dari suatu spesies terikat pada sel mastosit dan sel basofil dari spesies lain. Dalam uji ini, serum manusia yang telah disensitisasi disuntikkan ke kulit marmut yang telah dicukur. Setelah 24 jam penyuntikan, antigen disuntikkan secara intravena bersama dengan marker seperti pewarna Evan’s blue. Pewarna Evan’s blue dapat bersirkulasi di dalam pembuluh darah. Ketika antigen dipaparkan kepada marmut tersebut, sel mastosit akan melepaskan substansi vasoaktif yang dapat meningkat permeabilitas pembuluh darah kapiler, sehingga pewarna tersebut keluar dari pori-pori pembuluh darah dan mewarnai jaringan. Selain dapat bersirkulasi di dalam darah, pewarna ini juga dapat berikatan dengan serum albumin, sehingga ketika pewarna ini keluar dari pembuluh darah akan terlihat bulatan berwarna biru pada tempat yang disuntikkan serum. Respon ini menunjukkan hasil positif. Reaksi ini dapat mendeteksi 0.1 μg antibodi dari serum (Kimball 1990). Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Metode Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) saat ini sangat banyak digunakan untuk mengetahui keberatan antigen atau antibodi tertentu. Metode ini memanfaatkan kemampuan antibodi untuk terikat pada antigen yang spesifik pada permukaan plastik (Kayser 2005). Selain memanfaatkan kemampuan fiksasi antibodi dengan antigen, metode ini juga menggunakan konjugat yang merupakan antibodi sekunder yang telah dikonjugasikan dengan suatu enzim. Prinsip pengujian antigen atau antibodi dengan metode ELISA adalah antigen yang telah menempel pada permukaan plastik akan berikatan dengan antibodi yang spesifik. Konjugat kemudian ditambahkan dan akan berikatan dengan antibodi primer. Enzim ini kemudian akan bereaksi dengan substrat yang tidak berwarna dan menghasilkan produk yang berwarna sehingga dapat dihitung dengan alat pembaca ELISA. Enzim yang sudah sering digunakan dalam metode ELISA antara lain alkalin fosfatase, horseradish
peroksidase, dan β-galaktosidase (Kuby 2007). Metode ELISA sudah banyak dimodifikasi sehingga memudahkan deteksi maupun pengukuran kualitatif dan kuantitatif antigen dan antibodi. Saat ini terdapat tiga jenis ELISA yaitu ELISA tidak langsung, ELISA kompetitif, dan Sandwich ELISA. Perbedaan ketiga jenis ELISA ini terletak pada sampel yang ingin diukur atau dideteksi, yaitu antigen atau antibodi. Salah satu jenis ELISA adalah ELISA tidak langsung yang dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi pada serum sampel. Dalam metode ini, serum yang berisi antibodi yang ingin diuji ditambahkan dalam sumur yang telah berisi antigen yang sesuai dengan antibodi yang ingin diuji. Antibodi yang terdapat di dalam serum sampel akan berikatan dengan antigen pada dinding sumur, sementara antibodi yang tidak terikat akan terbuang pada tahap pencucian. Kemudian ditambahkan konjugat yang spesifik terhadap antibodi yang ingin diuji. Konjugat yang tidak menempel akan terbuang pada tahap pencucian. Selanjutnya substrat yang tidak berwarna ditambahkan sehingga dapat bereaksi dengan enzim yang terikat pada konjugat dan dihasilkan produk berupa kompleks berwarna yang dapat dihitung intensitas warnanya. Metode ELISA jenis lain yaitu ELISA kompetitif, digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen tertentu. Dalam metode ini, antibodi ditambahkan ke dalam larutan sampel yang berisi antigen. Kemudian larutan ini ditambahkan ke dalam sumur yang berisi antigen yang ingin diuji pada dindingnya. Jika antigen pada larutan sampel terdapat dalam jumlah yang besar, maka antibodi akan lebih sedikit terikat pada antigen yang terdapat pada dinding sumur. Tahap selanjutnya seperti yang dilakukan pada metode ELISA tidak langsung yaitu penambahan konjugat dan substrat, serta pengukuran intensitas warna pada sumur. Dalam hal ini, semakin banyak antigen terdapat di dalam larutan sampel, maka absorbannya semakin sedikit. Teknik ELISA yang lain adalah Sandwich ELISA yang dapat digunakan untuk mengukur antigen. Pada teknik ini, antibodi sudah menempel pada vial yang telah disiapkan. Sampel yang berisi antigen akan berikatan dengan antibodi tersebut. Setelah tahap pencucian, konjugat ditambahkan ke dalam vial tersebut sehingga konjugat dapat berikatan dengan antigen. Kemudian seperti pada metode ELISA lainnya, ditambahkan
8
substrat dan diukur intensitas warna yang terjadi (Kuby 2007). Prinsip Perhitungan IgE Kadar IgE pada serum marmut dihitung dengan perangkat Immulite 2000. Perangkat ini menyediakan komponen yang digunakan selama analisis seperti buffer, substrat, kontrol, dan reagen. Prinsip analisis yang dilakukan kurang lebih sama dengan prinsip ELISA, yaitu dengan memanfaat ikatan imunoglobulin dengan alergen yang spesifik. Jenis ELISA yang digunakan adalah ELISA tidak langsung. Butiran yang digunakan dalam analisis merupakan konjugat yang telah dilabel enzim alkalin fosfatase. Substrat yang digunakan adalah 1,2 dioksietana. Substrat 1,2 dioksietana dihidrolisis melalui proses defosforilasi oleh alkalin fosfatase sehingga menghasilkan produk anion metastabil. Produk ini merupakan fragmen dari senyawa yang menghasilkan cahaya pendar (Juo 2001). Reaksi antara 1,2 dioksietana dengan alkalin fosfatase terlihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Reaksi 1,2 dioksietana dengan alkalin fosfatase.
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan selama penelitian antara lain adalah kandang marmut individual, syringe 1 mL dan 3 mL, sonde oral, vial, sentrifus klinis (DAMON/IEC division), inkubator (MEMMERT), vorteks, pipet mikro (Eppendorf), tip pipet mikro, gelas piala, autoklaf (TOMY ES-315), dan pencukur rambut. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian antara lain marmut jantan, pakan marmut (PT Indofeed, merk K3), genistein sintesis (Sigma Aldrich G6649), larutan NaCl 0.9%, Al(OH)3, putih telur, pewarna Evan’s Blue (Sigma Aldrich), eter, kapas, akuades, alkohol 70%, dan kit penentuan total IgE “Immulite 2000”.
Metode Penelitian Aklimatisasi (Adaptasi) Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah marmut jantan berumur 8-10 minggu dengan bobot 250-300 gr sebanyak 6 ekor. Marmut dikelompokkan menjadi 2 kelompok masing-masing terdiri atas 3 ekor marmut. Kelompok tersebut adalah kelompok kontrol (K) dan kelompok genistein (G). Kelompok kontrol tidak diberi perlakuan apapun selain induksi putih telur melalui intravena pada reaksi alergi, sedangkan kelompok genistein diberi perlakuan putih telur melalui sub kutan pada sensitisasi, diberi larutan genistein secara oral, dan putih telur secara intravena pada reaksi alergi. Selain marmut yang dibagi kedalam kedua kelompok tersebut, digunakan juga 3 ekor marmut untuk penentuan dosis genistein yang akan digunakan pada marmut kelompok G. Proses aklimatisasi dilakukan dengan penempatan marmut pada kandangnya sesuai dengan kelompok perlakuannya. Kandang terbuat dari plastik berbentuk bak, dan diberi penutup dari kawat, serta diletakkan pada rak yang terbuat dari kayu. Setiap kandang diberi serbuk kayu. Aklimatisasi dilakukan selama 2 bulan dan dibagi ke dalam 2 tahap yaitu adaptasi pakan berupa pellet yang dicampur dengan rumput, dan adaptasi pakan dengan pemberian pellet secara keseluruhan. Selama 6 minggu pertama masa adaptasi marmut diberi pakan berupa pellet yang dicampur rumput dengan rasio antara pellet terhadap rumput ditingkatkan setiap harinya. Adaptasi dilanjutkan 2 minggu kemudian dengan pemberian pakan berupa pellet secara keseluruhan. Pakan diberikan secara ad libitum dan air minum serta serbuk kayu diganti setiap hari. Bobot badan marmut dicatat setiap hari.
Penentuan Dosis Farmakologis Genistein Marmut jantan sebanyak 3 ekor dicekok dengan genistein dengan konsentrasi 0.014 μg /100 g bobot badan marmut. Konsentrasi genistein ini didapatkan berdasarkan kadar genistein yang terdapat di dalam kacang kedelai terfermentasi, dan berdasarkan jumlah kacang kedelai yang boleh dikonsumsi dalam sehari. Kadar genistein ini dikonversi berdasarkan angka indeks terapi pada marmut. Marmut diamati selama 1x24 jam setelah dicekok. Pengamatan dilakukan melalui pemantauan terhadap persen kematian marmut setelah 24 jam dicekok genistein. Perhitungan dosis dijabarkan pada Lampiran 5.
9
Sensitisasi Marmut (Malo & Morin 1986) yang Dimodifikasi Sebelum sensitisasi dilakukan terhadap marmut (hari ke-0), terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel darah marmut dari jantung sebanyak 1.5 mL untuk analisis kadar IgE. Sensitisasi dilakukan terhadap marmut kelompok genistein. Marmut dalam kelompok tersebut disuntik secara sub kutan dengan putih telur 1μg sebagai alergen dan 1.5 mg Al(OH)3 sebagai adjuvant dan dilarutkan dalam NaCl 0.9% 0.2 mL untuk setiap 100 g bobot badan marmut. Pembuatan larutan sensitisasi dilakukan secara aseptik. Sensitisasi dilakukan sekali dalam dua minggu selama 30 hari (hari ke-1 dan hari ke15). Sensitisasi kemudian dilanjutkan pada hari ke-31 sampai hari ke-39 dengan cara marmut diinduksi secara oral dengan larutan putih telur di dalam air minum dengan konsentrasi 2 mg/mL. Uji Anafilaksis Kutanus Pasif (Bakara 2002) Hari ke-40 setelah sensitisasi, dilakukan uji AKP dengan penyuntikan sebagian dari serum yang didapatkan pada hari ke-0 secara intradermal. Serum tersebut diencerkan dengan NaCl 0.9% dengan perbandingan 1:1. Larutan ini kemudian disuntikkan pada marmut yang sama dengan donor serum sebanyak 0.05 mL secara intradermal di bagian permukaan dorsal yang telah dicukur bulunya. Penyuntikan ini dilakukan di tiga lokasi yang berbeda. Reaksi positif dari uji AKP diamati setelah 48 jam penyuntikan serum, yaitu ketika dilakukan uji reaksi alergi. Reaksi AKP diamati 24 jam setelah uji reaksi alergi tersebut melalui tingkat kebiruan di bawah kulit marmut. Pengujian Genistein sebagai Antialergi (Bakara 2002) Marmut kelompok K dan G dicekok dengan akuades dan larutan genistein pada jam ke-47 setelah penyuntikan serum pada pengujian AKP. Marmut kelompok K dicekok dengan akuades sebanyak 1 mL, dan marmut kelompok G dicekok dengan genistein sebanyak 0.014 μg/100 g bobot badan marmut yang dilarutkan dalam 1 mL akuades. Satu jam setelah pencekokan, yaitu pada jam ke-48 setelah penyuntikan serum pada uji AKP, marmut diuji reaksi alergi dengan cara disuntikkan 1 mg putih telur sebagai alergen di dalam 2 mL pewarna Evan’s Blue 0.5% melalui pembuluh vena jugularis dan aorta comunis.
Setelah reaksi alergi terjadi yang ditandai adanya warna kebiruan dibawah kulit marmut, dilakukan pengambilan darah dari marmut sebanyak 1.5 mL (hari ke-42). Sampel darah diambil dari jantung , lalu serum darah dipisahkan dan disimpan di dalam inkubator 4°C sampai digunakan untuk pengukuran kadar IgE. Penghitungan Kadar Imunoglobulin dari Serum (Kuby 2007). Serum marmut yang diambil sebelum sensitisasi dan setelah pengujian reaksi alergi dihitung kadar IgE secara kuantitatif dengan kit chemiluminescent immunometric assay. Kit ini terdiri atas butiran yang merupakan konjugat enzim yang spesifik terhadap sampel IgE, standar, reagen, dan kontrol. Butiran konjugat dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian sampel, kontrol, reagen, dan air dipipet ke dalam tabung reaksi tersebut. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada inkubator bersuhu 37˚C. Isi tabung reaksi kemudian dicuci. Substrat dioksietana kemudian ditambahkan ke dalam setiap tabung reaksi. Setelah reaksi pendaran terjadi, intensitas pendaran itu dikalkulasi secara kuantitatif dengan Photomultiplier Tube. Rancangan Percobaan (Mattjik 2002) Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor dengan dua kelompok perlakuan dan tiga kali ulangan. Analisis data menggunakan ANOVA dengan model rancangan sebagai berikut: Yij = μ + τi + εij Keterangan: μ = Pengaruh rataan umum τi = Pengaruh perlakuan ke-i, i = 1,2 εij = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1,2,3 i = 1 adalah kontrol i = 2 adalah genistein
HASIL DAN PEMBAHASAN Adaptasi Marmut Hewan coba yang digunakan pada penelitian adalah marmut. Marmut dipilih karena marmut memiliki respon imun yang baik dan kulit marmut yang halus sehingga memudahkan pengamatan reaksi alergi. Selain itu kulit marmut juga tipis sehingga pengamatan terhadap jaringan dibawah kulit marmut mudah dilakukan.
10
Hewan coba diadaptasikan sebelum perlakuan dengan tujuan membiasakan marmut dengan kondisi kandang, dengan pakan yang akan diberikan, dan menyeragamkan pola makan marmut. Masa adaptasi sendiri dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama dilakukan dengan pemberian pakan berupa campuran pellet dengan rumput dengan tujuan membiasakan marmut dengan jenis pakan yang akan digunakan selama penelitian, karena sebelum masa adaptasi marmut dibiasakan mengonsumsi rumput. Penggantian jenis pakan dilakukan secara perlahan dengan mencampurkan pellet dengan rumput dengan rasio pellet terhadap rumput yang ditingkatkan setiap harinya, sampai akhirnya marmut mengonsumsi pellet secara keseluruhan, kemudian masa adaptasi dilanjutkan ke dalam tahap kedua setelah marmut mengonsumsi pellet secara keseluruhan, dan tahap ini dilakukan selama 2 minggu. Peralihan jenis makanan marmut ini tidak dapat dilakukan secara tiba-tiba karena marmut sangat sensitif terhadap perubahan jenis pakannya, sehingga dapat menyebabkan diare dan kematian. Marmut diberikan pakan berupa pellet yang komposisinya diketahui serta mengandung vitamin C sehingga tidak mengganggu metabolisme marmut. Komposisi pakan dijabarkan pada Lampiran 6. Selama masa adaptasi dan perlakuan, dilakukan penimbangan bobot badan marmut setiap harinya. Perubahan bobot badan marmut dijabarkan pada Gambar 9. Berdasarkan gambar tersebut terlihat bahwa bobot badan marmut kelompok kontrol menurun pada dua minggu pertama masa perlakuan dan marmut kelompok genistein mengalami penurunan selama tiga minggu pertama. Penurunan bobot badan kedua kelompok perlakuan marmut ini awalnya disebabkan oleh stress yang dialami marmut karena pengambilan darah pada hari ke-0 yang dilakukan dari jantung. Pengambilan darah dari jantung kurang dianjurkan pada tahap ini karena sangat mempengaruhi tingkat stress hewan. Namun pengambilan darah dari tempat lain seperti paha cukup sulit karena ukuran pembuluh darah yang kecil sehingga menyulitkan pengambilan darah dalam jumlah besar. Selain itu mekanisme sensitisasi juga berpengaruh terhadap penurunan bobot badan marmut. Dapat dilihat bahwa marmut kelompok kontrol mengalami peningkatan pada minggu kedua, sementara marmut kelompok genistein masih tetap mengalami penurunan bobot sampai minggu ketiga,
karena pada minggu ketiga ini marmut kelompok genistein masih menerima induksi putih telur secara sub kutan. Penempatan marmut dalam kelompok kontrol dan kelompok genistein dilakukan secara acak. Berdasarkan uji statistik dengan perangkat lunak SPSS 13.0 diketahui bahwa bobot badan marmut dalam satu kelompok maupun antar kelompok perlakuan tidak berbeda nyata (p>0.05). Uji statistik dicantumkan dalam Lampiran 4.
Gambar 9 Data bobot badan marmut selama masa adaptasi (sebelah kiri garis hitam) dan selama penelitian (sebelah kanan garis hitam). Kontrol ( ) dan genistein ( ). Tahap Sensitisasi Selama masa sensitisasi marmut diberikan putih telur sebagai alergen karena kandungan ovalbumin pada putih telur yang tinggi. Hal ini dilakukan berdasarkan penelitian yang dilakukan Albertine et al (2002) bahwa pemberian ovalbumin pada mencit dapat meningkatkan kadar IgE secara signifikan. Sementara Al(OH)3 digunakan sebagai adjuvat karena gugus hidroksil yang ada pada senyawa ini menjadikan Al(OH)3 sebagai senyawa pengemulsi yang lebih baik dibandingkan dengan Al(PO)4. Selain itu NaCl 0.9% digunakan dalam penelitian ini sebagai pelarut. Pemberian putih telur secara berulang pada tahap sensitisasi bertujuan menjadikan sel mastosit marmut menjadi lebih sensitif terhadap paparan putih telur, sehingga ketika terjadi paparan ulang putih telur terhadap marmut, akan terjadi reaksi alergi. Hal ini dapat dilihat dari timbulnya bercak kemerahan pada marmut kelompok kuersetin (Maulana 2010) akibat pemberian putih telur pada hari ke-29. Pernyataan ini diperkuat oleh penelitian yang dilakukan Leasa (2010)
11
bahwa pemberian putih telur pada marmut memberikan respon alergi pada uji AKP. Pengujian Anafilaksis Kutanus Pasif (AKP) dan Aktivitas Antialergi Dosis genistein yang digunakan dalam penelitian ini didapatkan dari kadar genistein yang terdapat di dalam kacang kedelai terfermentasi yaitu 2580 ng dalam setiap 1 g kacang kedelai terfermentasi (Osuga & Feeney 1977). Angka ini dikalikan dengan bobot kacang kedelai yang boleh dikonsumsi oleh manusia dalam sehari yaitu 20-50 mg (Anderson & Wolf 1995). Berdasarkan dosis tersebut angka ini dikonversi dengan indeks terapi marmut yaitu 0.031 (Barnes & Praget 1982). Perhitungan dosis dicantumkan pada Lampiran 5. Persen kematian marmut yang diamati setelah 24 jam pencekokan genistein dengan dosis dari perhitungan diatas sebesar 0%, sehingga dapat dikatakan bahwa dosis genistein pada tahap ini cukup aman untuk digunakan pada perlakuan. Pengujian dosis farmakologis ini dilakukan dengan tujuan mengurangi galat kematian marmut pada masa perlakuan akibat dosis yang terlalu tinggi. Untuk menguji reaksi alergi, marmut kelompok kontrol dan kelompok genistein yang telah dicekok disuntikkan putih telur yang dicampurkan dengan pewarna Evan’s Blue 0.5% dengan tujuan memicu terjadinya reaksi alergi dengan induksi alergen berupa putih telur. Pewarna Evan’s Blue digunakan untuk menentukan apakah reaksi alergi benar benar terjadi atau tidak. Ketika terjadi reaksi alergi, histamin dilepaskan sehingga terjadi dilatasi pembuluh darah yang mengakibatkan permeabilitasnya meningkat. Hal ini memungkinkan pewarna Evan’s Blue yang disuntikkan pada intravena keluar dari pembuluh darah dan mewarnai jaringan dibawah kulit, yang diamati pada uji AKP. Dalam uji AKP, marmut disuntikkan serum pada permukaan punggung yang telah dicukur bulunya bertujuan memudahkan pengamatan. Pewarna Evan’s Blue yang dilepaskan ketika terjadi reaksi alergi dapat mewarnai serum yang disuntikkan tersebut sehingga tingkat alergi dapat dihitung berdasarkan diameter bulatan biru pada lokasi penyuntikan serum. Namun berdasarkan pengamatan yang dilakukan tidak terlihat adanya bulatan biru yang spesifik pada permukaan dorsal marmut. Hal ini disebabkan oleh alergi yang terjadi pada marmut sudah bersifat sistemik sehingga pewarna Evan’s Blue tidak hanya mewarnai serum, akan tetapi
seluruh jaringan di bawah kulit marmut. Selain itu pewarna Evan’s Blue diberikan dalam volume yang berlebihan, sehingga pewarna ini tidak hanya mewarnai serum albumin yang disuntikkan pada permukaan dorsal marmut, namun mewarnai seluruh jaringan. Oleh karena itu pengamatan terhadap derajat alergi diamati berdasarkan intensitas warna biru di bawah kulit marmut tersebut. Berdasarkan hasil pengamatan, intensitas warna biru pada permukaan dorsal marmut kelompok kontrol dengan kelompk genistein relatif sama (Gambar 10). Dari pengamatan tersebut dapat dikatakan bahwa pemberian genistein pada marmut yang disensitisasi dapat mengembalikan respon alergi dari marmut kelompok tersebut seperti marmut kelompok normal. Hal ini didukung dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh (Leasa 2010) yang menunjukkan bahwa intensitas kebiruan pada marmut kelompok negatif yang hanya disensitisasi tanpa diberi senyawa flavonoid lebih tinggi jika dibandingkan dengan marmut kelompk genistein. Sehingga dapat dikatakan bahwa induksi genistein dapat mengembalikan respon alergi pada keadaan normal seperti tidak mengalami alergi. Intensitias warna kebiruan dibawah kulit marmut dijabarkan pada Tabel 1. Pengukuran kadar IgE dari serum darah hari ke-0 dan hari ke-42 dilakukan dengan metode ELISA karena ELISA dapat
a b Gambar 10 Hasil pengamatan uji AKP (a) kontrol (b) genistein. Tabel 1 Data intensitas kebiruan pada marmut Kelompok
Kontrol
Genistein
Keterangan: + = sedikit biru ++ = cukup biru +++ = sangat biru
Ulangan 1 2 3 1 2 3
Intensitas kebiruan ++ ++ ++ ++ ++ ++
12
mendeteksi protein yang spesifik seperti IgE. Selain itu ELISA dapat mendeteksi IgE dengan konsentrasi 3.1-800 ng/ml serum. Namun analisis IgE yang dilakukan di laboratorium Prodia tidak menunjukkan nilai yang signifikan antara kedua sampel tersebut.Baik sampel darah marmut yang belum disensitisasi dan sampel darah yang telah disensitisasi tidak menunjukkan perbedaan yang spesifik pada kadar IgE-nya. Kedua sampel tersebut menunjukkan nilai IgE < 2.4 ng/mL. Hasil ini kemungkinan disebabkan oleh jumlah IgE dalam sampel yang sangat kecil sehingga sulit dideteksi oleh alat. Pewarna yang diberikan melalui pembuluh darah marmut ikut mewarnai sampel darah yang diambil sehingga menyulitkan pengukuran IgE. Oleh karena itu serum darah diencerkan dengan NaCl 0.9% sebanyak 60 kali. Pengenceran dilakukan sampai warna serum darah ini sama dengan warna serum darah normal. Pengenceran ini menyebabkan kadar IgE yang kecil menjadi semakin tidak terukur secara spesifik. Oleh karena itu pengaruh genistein sebagai antialergi tidak dapat diamati. Data IgE dari serum darah dicantumkan pada Tabel 2. Tabel 2 Hasil analisis IgE sebelum dan sesudah sensitisasi Kelompok Kontrol
Genistein
Ulangan 1 2 3 1 2 3
Sebelum sensitisasi < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL
Setelah sensitisasi < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Perhitungan dosis farmakologis genistein menunjukkan bahwa dosis 0.014 μg/100 g bobot badan marmut aman untuk marmut. Uji AKP yang dilakukan terhadap marmut menunjukkan bahwa pemberian genistein setelah sensitisasi pada kelompok genistein membuat respon alergi marmut kembali seperti normal seperti marmut kelompok kontrol. Kadar IgE yang diukur dari serum darah hari ke-0 dan hari ke-42 tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kedua kelompok. Sehingga dapat disimpulkan bahwa genistein dengan dosis 0.014 μg/100 g bobot badan marmut tidak memberikan pengaruh sebagai antialergi.
Saran Penggunaan hewan coba yang lain disarankan untuk penelitian lanjutan agar memudahkan proses pengambilan sampel darah dan memungkinkan pengambilan sampel darah yang lebih banyak sehingga kadar IgE dapat diukur. Selain itu dosis farmakologis sebaiknya diuji dalam beberapa dosis yang berbeda, serta volume pewarna Evan’s Blue yang digunakan tidak terlalu banyak. Uji validasi metode juga sebaiknya dilakukan sebelum penelitian antialergi dilaksanakan.
DAFTAR PUSTAKA Albertine et al. 2002. Temporal correlation of measurements of airway hyperresponsiveness in ovalbuminsensitized mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283:219-233. Anderson RL, Wolf WJ. 1995. Compositional changes in isoflavones related to soybean processing. J. Nutr. 125 (Suppl):581-588. Bakara TLM. 2002. Kajian aktivitas antialergi ekstrak paria (Momordica charantia L.) pada mencit dan sel mastosit [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Barnes JM, Paget GE. 1982. Toxicity test. Di dalam: Laurence DR, Bacharach, editor. Evaluation of Drug Activities: Pharmacometrics. London: Academic Pr. hlm 161-162. Bassert JM, McCurnin DM. 2006. Clinical Textbook for Veterinary Technicians Sixth Edition. St. Louis: Elsevier Saunders. Berg JM, Tymaczko JL, Stryer L. 2007. Biochemistry Sixth Edition. New York: W.H. Freeman. Bellanti JA. 1987. Introduction to immunology. Di dalam: Bellanti JA, editor. Immunology. Ontario: W. B. Saunders; Hlm 36-38. Campbell MK, Farrell SO. 2006. Biochemistry Fifth Edition. Belmont : Thomson Brooks/Cole. Dallas S. 2003. Animal Biology and Care. Oxford: Blackwel Science. Dixon RA, Ferreira D. 2002. Genistein. Phytochemistry. 60:205-211.
13
Evy. 15 Jan 2009. Waspadai alergi susu sapi. Kompas: 14 (kolom 3). Goldstein B. 1988. Theoretical Immunology Part One. Perelson AS, editor. New Mexico: Addison Wesley. Glew RH. 2006. Lipid metabolism II: pathways of metabolism of special lipids. Di dalam: Devlin TM, editor. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations Sixth Edition. New Jersey: John Wiley & Sons Pub; Hlm 730. Henson PM. 1993. Mekanisme injuri jaringan yang dihasilkan oleh reaksi imunologik. Di dalam: Bellanti JA, editor. Imunologi III. Yogayakarta: UGM Pr. Hitner H, Nagle B. 1999. Basic Pharmacology Fourth Edition. Columbus: McGraw-Hill Kayser et. al. 2005. Medical Microbiology. Stuttgart: Thieme Verlag. Kimball JW. 1990. Introduction to Immunology Third Edition. New York: Macmillan. Koolman J, Rohm KH. 2005. Color Atlasof Biochemistry Second Edition, Revised and enlarged. New York: Thieme Stuttgart. Kuby J. 2007. Immunology Fifth Edition. New York: W.H. Freeman. Kuehnel W. 2003. Color Atlas of Cytology, Histology, and Microscopic Anatomy Fourth Edition Revised and Enlarged. New York: Thieme Stuttgart. Laurence DR, Bennet PN. 1996. Clinical Pharmacology Seventh Edition. New York: Churchill Livingstone. Leasa BN. 2010. Pengaruh pemberian putih telur terhadap reaksi alergi pada marmut [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Lehninger A, Nelson D, Cox MM. 2004. Lehninger Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman. Lieberman M, Marks AD, Smith C. 2007. Mark’s Essentials Of Medical Biochemistry A Clinical Approach. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins. Juo RR. 2001. Chemiluminescent detection with 1,2 dioxetane substrate. IVD Technology. 1 April 2001. [terhubung berkala] http://www. devicelink.com
/ivdt/archieve/01/04/002.html Desember 2009]
[7
Malo C, Morin CL. 1986. Establishment of an animal model of ovalbumin sensitized mouse to study protein induced enteropathy. Gut. 27:1298-1305. Manahan SE. 2003. Toxicological Chemistry and Biochemistry Third Edition. Florida: CRC Pr IIC. Maulana NN. 2010. Pengaruh kuersetin terhadap derajat alergi dan kadar immunoglobulin E marmut yang diinduksi putih telur [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Opara E. Food allergy. 2002. Di dalam: Calder PC, Field CJ, Gill HS, editor. Nutrition and immune Function. New York: CABI; Hlm 315-320. Osuga DT, Fenney RE. 1977. Egg protein. Di dalam: Whileker JR dan Tannenbaum SR, editor. Food Proteins. West Port: AVI Pub. hlm 209-266. Pugh DM. 1982. The hormones V: mediators of allergy, anapgylaxis, inflammation, pain, and shock. Di dalam: Brander GC, Pugh DM, Bywater RJ, editor. Veterinary Applied Pharmacology & Therapeutics Fourth Edition. London: Cassei Ltd; Hlm 87-92. Rang HP, Dale MM, Ritter JM. 1995. Pharmacology. London: Churchill Livingstone. Solleveld HA et al. 1986. Breeding, housing, and care of laboratory animals. Di dalam: World Animal Science. Amsterdam: Elsevier. hlm 18-19. Veith NC, Grayer RJ. 2006.Flavonones and dihydrofavonols. Di dalam: Anderson ØM, Markham KR, editor. Flavonoids Chemistry, Biochemistry, and Application. Florida: CRC Pr. Ward PA. 1978. Mechanism of tissue injury. Di dalam: Bellanti JA, editor. Immunology. Ontario: W. B. Saunders; hlm 283-284. Wiseman P. 2006. Isoflavonoids and human health. Di dalam: Anderson ØM, Markham KR, editor. Flavonoids Chemistry, Biochemistry, and Application. Florida: CRC Pr.
14
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Alur kerja penelitian 6 ekor marmut jantan
Kelompok Kontrol (n=3)
Kelompok Genistein (n=3)
Adaptasi 14 hari
Pengambilan darah (hari ke-0)
Induksi putih telur 1 μg + 1.5 mg AL(OH)3 + 0.2 mL NaCl 0.9% / 100 gr bb marmut Sub kutan pada hari ke-1 dan hari ke-15 (sensitisasi)
Induksi putih telur dalam air minum 2 mg/mL pada hari ke-30 sampai hari ke-39 (sensitisasi)
Penyuntikan serum dalam NaCl 0.9 % 1:1 intradermal pada hari ke-40 (uji AKP)
Pencekokan akuades 1 mL
Pencekokan genistein 0.014μg/ 100 g bb marmut dalam 1 mL akuades
Induksi putih telur 2 mg dalam Evan’s Blue 0.5% 2 mL intravena pada hari ke42 (uji reaksi alergi)
Pengambilan darah (hari ke-43)
Pengamatan AKP
16
Lampiran 2 Tahap penghitungan IgE
Butiran konjugat dimasukkan ke dalam sumur
Sampel dipipet ke dalam sumur
Inkubasi pada suhu 37°C Cairan di dalam sumur dicuci dengan wash buffer
Substrat dioksietana ditambahkan ke dalam sumur
Pembacaan intensitas pendaran
17
Lampiran 3 Proses pembuatan larutan sensitisasi
Putih telur diisolasi dari telur mentah secara aseptik
Putih telur ditempatkan pada gelas piala steril
Putih telur dilarutkan dalam NaCl 0.9% steril dengan pengenceran 10 kali
Larutan putih telur dipipet ke dalam tabung reaksi berisi Al(OH)3 dalam NaCl 0.9%
Vorteks selama 30 detik
Injeksi sub kutan pada marmut
18
Lampiran 4 Analisis statistik bobot badan marmut
Descriptives respon 95% Confidence Interval for Mean kontrol genistein
N 3 3
Mean 293.3333 299.6667
Std. Deviation 43.03874 50.63925
Std. Error 24.84843 29.23658
Lower Bound 186.4192 173.8718
Upper Bound 400.2475 425.4615
Minimum 267.00 267.00
Maximum 343.00 358.00
Total
6
296.5000
42.17464
17.21772
252.2404
340.7596
267.00
358.00
Test of Homogeneity of Variances respon Levene Statistic .199
df1
df2 1
Sig. .679
4
ANOVA respon Sum of Squares Between 60.167 Groups Within Groups 8833.333 Total 8893.500
Mean Square
df 1
60.167
4 5
2208.333
F .027
Sig. .877
19
Lampiran 5 Perhitungan dosis genistein
Kadar genistein dalam kacang kedelai terfermentasi = 2580 ng/ g kacang kedelai Batas aman konsumsi kacang kedelai per hari = 25-50 g Kadar genistein yang dikonsumsi per hari = 2580 ng/ g kacang kedelai x 50 g kacang kedelai = 129.000 ng genistein = 129 μg 129 μg = konsumsi genistein untuk 70 kg manusia Konsumsi genistein / kg manusia = = 1.84 μg/ kg bobot badan manusia Konversi konsumsi genistein ke marmut: Konsumsi genistein / kg manusia x indeks terapi marmut = = 0.057 μg/ 400 g bobot badan marmut = 0.014 μg/ 100 g bobot badan marmut
20
Lampiran 6 Komposisi pakan marmut Kandungan pakan Protein kasar Lemak Serat kasar Abu Protein yang dapat dicerna Nutrien total yang dapat dicerna (termasuk vitamin C) Kalsium Fosfor
Persentase 18 % 4% 13% 9% 13% 70% 0.8% 0.6%
Lampiran 7 Daftar protein dalam putih telur (Osuga & Fenney 1977) Protein Ovalbumin Ovotransferrin Ovomucoid G2G3 Ovoglobulin Ovomucin Lisozim Ovoinhibitor Ovoflavoprotein Ovomakroglobulin Avidin kristalin
% dalam putih telur 54.0 12.0 11.0 8.0 3.5 3.4 1.5 0.8 0.5 0.05 0.05
Fungsi Inhibitor enzim Pengikat besi Menghambat tripsin Pembentuk busa Pembentuk viskositas Menghancurkan bakteri Inhibitor serin protease Pengikat riboflavin Antigen kuat Pengikat biotin Inhibitor protease
21
Lampiran 8 Data fisiologis dan biologis marmut (Solleveld 1986) Parameter Masa hidup (tahun) Suhu tubuh Detak jantung (detak/menit) Tingkat pernafasan ( nafas/menit) Tekanan darah arteri (kPa) Diastolik Sistolik Jumlah sel darah merah (per 106 /μl) Jumlah sel darah putih (per 103 /μl) Hematokrit (%) Hemoglobin (g %) Nomor diploid kromosom Bobot dewasa (g) Umur dewasa (minggu) Jantan Betina Masa kehamilan (hari)
Marmut 6-8 37.4-39.4 150-300 69-150 5.87 13.20 4.5-7.0 4-11 39-47 12.0-15.0 64 75-100 8-10 4-5 60-72
