PENGARUH KUERSETIN TERHADAP DERAJAT ALERGI DAN KADAR IMUNOGLOBULIN E PADA MARMOT YANG DIINDUKSI PUTIH TELUR
NURWENDA NOVAN MAULANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK NURWENDA NOVAN MAULANA. Pengaruh Kuersetin terhadap Derajat Alergi dan Kadar Imunoglobulin E pada Marmot yang Diinduksi Putih Telur. Dibimbing oleh HASIM dan MIN RAHMINIWATI. Kuersetin merupakan salah satu golongan flavonoid yang telah terbukti secara ilmiah sebagai antialergi dan telah ada obat sintetik dari kuersetin tersebut. Namun secara alami belum diketahui dosis terkecil yang bisa berkhasiat sebagai antialergi. Dua kelompok marmot yakni kelompok kontrol (K) dan kelompok kuersetin (Q) masing-masing diadaptasikan selama 14 hari. Setelah itu, marmot disensitisasi selama 39 hari dengan putih telur konsentrasi 2 mg/mL yang dilarutkan dengan Al(OH)3 dan buffer saline dengan cara dicekok. Tiga ekor marmot lain diadaptasikan selama 3 hari untuk uji dosis farmakologis. Ketiga marmot tersebut dicekok kuersetin dosis 13.92 mg/kg bobot badan. Hasil uji dosis farmakologis menunjukkan bahwa dosis tersebut merupakan dosis aman. Dosis itu kemudian digunakan untuk menentukan pengaruh antialerginya terhadap marmot dengan indikator berupa Evans blue (metode AKP). Hasil uji AKP menunjukkan bahwa kuersetin belum efektif mencegah terjadinya reaksi alergi. Jumlah IgE dalam serum baik sesudah maupun sebelum perlakuan menunjukkan bahwa tidak terjadi perubahan yang signifikan, yaitu < 2.4 ng/mL untuk semua kelompok perlakuan. Dengan demikian, dosis 13.92 mg/kg bobot badan belum memiliki pengaruh yang efektif sebagai antialergi.
ABSTRACT NURWENDA NOVAN MAULANA. The Effect of Quercetin to Allergic and Immunoglobulin E Level on Guinea Pigs Which Induced by Egg White. Under the direction of HASIM and MIN RAHMINIWATI. Quercetin is one of flavonoid class which has been clinically proven for allergic and also has been syntheticed. It has not researched yet to determine the smallest which can effect as antiallergic. The guinea pigs divided into two groups, control (K) and Quercetin (Q) groups. Each groups were comprised three guinea pigs and all of it were adapted for 14 days. Guinea pigs were sensitized for 39 days with egg white 2 mg/mL dissolved by Al(OH)3 as adjuvant and buffer saline by forced egg white down. While, another three guinea pigs were adapted for 3 days to determine pharmacologic dosage based Lethal Dose 50 (LD50) of Quercetin. The result of this assay showed that at dose 13.92 mg/kg body weight is safe dosage. This dosage then used for determine the effect of quercetin as antiallergy with Evans blue dye as indicator (AKP method). The result of AKP showed that quercetin has no significant effect. The concentration of Immunoglobulin E (IgE) in guinea pigs serum also same for all guinea pigs < 2.4 ng/mL. The result of this research was quercetin at dose 13.92 mg/kg body weight has no significant effect as antiallergic.
PENGARUH KUERSETIN TERHADAP DERAJAT ALERGI DAN KADAR IMUNOGLOBULIN E PADA MARMOT YANG DIINDUKSI PUTIH TELUR
NURWENDA NOVAN MAULANA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul Skripsi
Nama NRP
: Pengaruh Kuersetin terhadap Derajat Alergi dan Kadar Imunoglobulin E pada Marmot yang Diinduksi Putih Telur : Nurwenda Novan Maulana : G84051874
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. drh. Min Rahminiwati, MS. Anggota
Dr. drh. Hasim, DEA. Ketua
Diketahui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc. Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus:
PRAKATA Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Penelitian yang dipilih berjudul Pengaruh Kuersetin terhadap Derajat Alergi dan Kadar Imunoglobulin E pada Marmot yang Diinduksi Putih Telur. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang telah dilaksanakan di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia, Institut Pertanian Bogor pada bulan April sampai Oktober 2009. Penulis pada kesempatan ini menyampaikan terima kasih kepada Dr. drh. Hasim, DEA dan Dr. drh. Min Rahminiwati, MS selaku pembimbing yang telah memberikan saran, kritik, dan dukungannya. Motivasi yang telah diberikan pembimbing sangat membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan. Amin.
Bogor, Maret 2010
Nurwenda Novan Maulana
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 11 November 1987 sebagai anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan ayah Juanda Ganda Permana dan ibu Nuryati Nilawidyanti. Tahun 2005 penulis lulus dari SMAN I Jampangkulon dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada program mayor-minor dan masuk Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Selama kuliah di Institut Pertanian Bogor, penulis pernah melakukan Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium Bioproses Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) bagian Bioteknologi, Cibinong, selama periode Juli sampai September 2008. Selain itu, penulis juga pernah aktif dalam organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai ketua divisi kerohanian Community of Research and Education in Biochemistry (CREB’s) pada periode 2006-2007, wakil ketua CREB’s 2008-2009, dan badan pengawas CREB’s 2009-2010 dan pada tahun 2009 menulis karya ilmiah yang berjudul Pengaruh Kuersetin terhadap Derajat Alergi dan Kadar Imunoglobulin E pada Marmot yang Diinduksi Putih Telur.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ....................................................................................... vi DAFTAR GAMBAR ...................................................................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................
vi
PENDAHULUAN ........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Alergi ................................................................................................. Mekanisme Alergi ............................................................................... Imunoglobulin ..................................................................................... Histamin dan Antihistamin .................................................................. Marmot (Cavia porcellus) ................................................................... Kuersetin ............................................................................................ Anafilaksis Kutanus Pasif (AKP) ........................................................
1 2 3 4 4 5 6
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan..................................................................................... Metode Penelitian ................................................................................
6 6
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengujian Dosis Farmakologis ............................................................ Adaptasi Marmot (Cavia porcellus) ..................................................... Pengaruh Sensitisasi terhadap Bobot Marmot ...................................... Anafilaksis Kutanus Pasif .................................................................... Analisis Imuglobulin E (IgE) ...............................................................
8 8 9 10 10
SIMPULAN DAN SARAN ........................................................................
11
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
11
LAMPIRAN ................................................................................................
13
DAFTAR TABEL Halaman
1
Data biologi marmot .............................................................................
5
2
Perbandingan intensitas warna hasil uji AKP .......................................
10
3
Perbandingan hasil analisis IgE sebelum dan sesudah sensitisasi ..........
11
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Mekanisme alergi .................................................................................
3
2
Molekul imunoglobulin ........................................................................
3
3
Marmot (Cavia porcellus) ....................................................................
5
4
Struktur kuersetin .................................................................................
6
5
Grafik pengukuran bobot badan selama dua minggu terakhir adaptasi ..
9
6
Grafik bobot badan masa adaptasi dan masa sensitisasi ........................
9
7
Hasil uji AKP kelompok kontrol ..........................................................
10
8
Hasil uji AKP kelompok kuersetin .......................................................
10
9
Marmot normal ....................................................................................
10
10
Darah yang tercampur dengan pewarna Evans blue ..............................
11
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1
Alur kerja pengujian dosis farmakologis (uji pendahuluan) ...................
14
2
Alur kerja penelitian ..............................................................................
15
3
Proses pengambilan putih telur secara aseptik ......................................
16
4
Alur kerja sensitisasi ............................................................................
17
5
Alur kerja uji anafilaksis kutanus pasif .................................................
18
6
Prosedur penggunaan kit chemiluminescent immunometric assay IMMULITE 2000 .......................................................................
19
7
Tabel perhitungan dosis farmakologis yang digunakan .........................
21
8
Uji statistik bobot badan marmot ..........................................................
22
9
Uji statistik kadar IgE serum ...............................................................
23
10
Kandungan nutrisi pakan formula (pelet) marmot dari indo feed ...........
23
11
Data bobot badan marmot ....................................................................
24
PENDAHULUAN Effendi (2003) memperkenalkan istilah alergi untuk suatu keadaan yang disebabkan oleh reaksi imunologi spesifik yang ditimbulkan oleh alergen. Dengan berkembangnya biologi molekuler dewasa ini, Effendi mengungkapkan bahwa pada keadaaan alergi, akan dilepas mediatormediator inflamasi oleh sistem kekebalan diantaranya adalah histamin dan sitokina. Prevalensi alergi dari tahun ke tahun menunjukkan peningkatan yang cukup signifikan di hampir semua negara sehingga penyakit alergi mulai menjadi masalah kesehatan yang serius. Data dari Organisasi Alergi Sedunia World Allergy Organization (WAO) menunjukkan makin meningkatnya penderita penyakit ini. Tidak kurang 22% penduduk dunia terkena alergi. Oleh karena itu, WAO menganjurkan agar Hari Alergi Sedunia yang jatuh setiap tanggal 8 Juli digunakan untuk mengingatkan masyarakat terhadap bahaya yang disebabkan oleh alergi (Baratawidjaja 1976). Menurut Baratawidjaya (1976), sekitar 40 persen kasus alergi berkembang menjadi asma. Dari 150 juta orang di seluruh dunia yang menderita asma, sekitar 180.000 orang di antaranya meninggal dunia setiap tahun. Di Indonesia, penderita asma diperkirakan mencapai 8,2 %, hidung alergi 17,5 %, dan eksim 2,5 % sampai 4 %. Pada tahun 1974, dari 1526 penderita yang dirawat di bagian penyakit dalam FKUI/RSCM Jakarta 97 orang adalah penderita asma bronkial dan dari jumlah tersebut 7 orang meninggal dunia. Berkaitan dengan penyakit alergi dengan prevalensinya yang semakin meningkat, Buhler dan Miranda (2000), mengatakan bahwa saat ini flavonoid menjadi bahan yang sangat menarik untuk diteliti karena kemampuannya dalam menjaga kesehatan manusia. Komposisi flavonoid dalam beberapa spesies buah-buahan yang berbeda sangat beragam. Antosianin adalah pigmen yang memberikan warna pada buah seperti warna merah, biru, dan ungu. Antosianin utama dalam buah-buahan adalah antosianidin yang memiliki enam glikosida yang tersebar dan umumnya berkontribusi dalam pigmentasi buah. Sianidin adalah golongan antosianidin yang paling umum, yang lainnya adalah delpinidin, peonidin, pelargonidin, petonidin, dan malvidin. Dari golongan flavonol, kuersetin, kaemferol, mirisetin, dan isoramnetin adalah yang paling umum
ditemukan dalam buah, dan kuersetin adalah flavonol yang lebih dominan. Menurut Buhler & Miranda (2000), flavonoid telah dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antivirus, antialergi, antiinflamasi, antitumor dan aktivitas antioksidan. Kuersetin merupakan golongan flavonoid yang banyak ditemukan dalam buah-buahan. Di Indonesia, penelitian mengenai kuersetin pun belum banyak dilakukan. Telah tersedia obat antialergi yang berasal dari kuersetin namun penelitian ini akan mengarah pada kuersetin alami yang berasal dari buah-buahan. Penelitian ini bertujuan menentukan dosis kuersetin paling rendah yang aman dan memiliki efek sebagai antialergi serta melihat pengaruhnya dalam mencegah alergi dengan melihat jumlah IgE yang disekresi oleh sel plasma. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif pencegahan alergi yang alami bagi masyarakat sehingga obat antialergi sintetik bisa dikurangi.
TINJAUAN PUSTAKA Alergi Alergi adalah suatu proses inflamasi yang tidak hanya berupa reaksi cepat dan lambat tetapi juga merupakan proses inflamasi kronis yang kompleks yang dipengaruhi faktor genetik, lingkungan dan pengontrol internal. Zat yang menjadi penyebab alergi disebut dengan alergen. Alergen di dalam makanan dapat berupa protein, glikoprotein atau polipeptida dengan berat molekul lebih dari 18.000 dalton, tahan panas dan tahan enzim proteolitik (Hasyimi et al. 1992). Terdapat empat tipe hipersensitivitas (alergi), yaitu: Tipe I ( IgE-mediated hypersensitivity), tipe II ( Antibody-mediated hypersensitivity), tipe III ( Immune complexmediated hypersensitivity), dan tipe IV ( delayed type hypersensitivity) (Wild 2006). Ciri dari tipe I yaitu IgE berikat dengan sel mast dan membentuk ikatan silang dengan alergen menyebabkan degranulasi dan pelepasan mediator seperti histamin. Tipe reaksi ini bisa terlihat pada anafilaksis. Ciri dari hipersensitivitas tipe II yaitu antibodi secara langsung melawan permukaan sel dari antigen dan menyebabkan destruksi sel terebut melalui aktivasi komplemen atau toksisitas selular bergantung antibodi melalui aktivasi sel natural killer (NK). Tipe ini terjadi pada transfusi darah penyakit hemolisis pada kelahiran. Ciri tipe III yaitu prapembentukan komplek imunitas disimpan dalam jaringan dan menyebabkan aktivasi
2
komplemen dan lokalisasi inflamasi yang mengakibatkan kerusakan jaringan. Tipe ini terjadi pada glomerolunefritis dan rematoid arthritis. Ciri dari hipersensitivitas tipe IV yaitu T limfosit tersensitisasi pada kontak kedua dengan antigen menyebabkan pelepasan sitokina yang mengaktivasi makrofag dan T sitotoksik dan mengakibatkan inflamasi yang terlokalisasi serta kerusakan jaringan. Tipe ini terjadi pada penolakan transplantasi organ (Wild 2006). Beberapa pengujian bisa dilakukan untuk mendiagnosis alergi dan tes pada kulit (skin test) merupakan pemeriksaan yang sangat sederhana untuk mendiagnosis alergi. Dengan memberikan zat-zat tertentu pada kulit seseorang, dapat diketahui zat yang merupakan alergen pada orang tersebut. Zat dalam jumlah kecil disuntikkan dan bila terjadi pembengkakan atau terjadi dermatitis pada bagian yang diberi suntikan, maka zat tersebut merupakan alergen (Ryan 2007). Zat yang paling sering menyebabkan alergi adalah serbuk tanaman, jenis rumput tertentu, jenis pohon yang berkulit halus dan tipis, serbuk spora, penisilin, makanan laut, telur, kacang panjang, kacang tanah, kacang kedelai dan kacang-kacangan lainnya, susu, jagung dan tepung jagung, sengatan serangga, bulu binatang, kecoa, debu dan kutu. Selain itu, yang juga tidak kalah sering adalah zat aditif pada makanan, penyedap, pewarna dan pengawet (Ryan 2007). Mekanisme Alergi Mekanisme alergi didominasi oleh sel mastosit yang mendapat paparan dari alergen kemudian akan melepaskan antibodi berupa IgE. Pelepasan IgE akan memicu degranulasi dan mengakibatkan pengeluaran histamin, leukotrien dan mediator lainnya dalam jumlah banyak. Dari sinilah muncul reaksi alergi. Reaksi alergi berbeda-beda, tergantung pada tempat terjadinya reaksi. Pada saluran cerna, akan menyebabkan peningkatan sekresi cairan dan gerak peristaltik yang berakibat terjadinya mual, muntah dan diare. Pada saluran pernafasan, aktivasi sel mast ini menyebabkan penurunan diameter saluran nafas, dan peningkatan sekresi mukus yang berakibat produksi lendir dan munculnya batuk. Di pembuluh darah, reaksi alergi menimbulkan kenaikan aliran darah dan permeabilitas. Dari perubahan ini akan didapati edema, inflamasi, dan peningkatan aliran limpa (Rengganis et al. 2004)
Reaksi alergi yang kompleks dapat digambarkan sebagai berikut: reaksi diawali dengan paparan terhadap alergen yang ditangkap oleh Antigen Presenting Cells (APC) lalu dipecah menjadi peptida-peptida kecil, diikat molekul Major Histocompatibility Complex II (MHC II), bergerak ke permukaan sel dan dipresentasikan ke sel T helper-2 (Th-2). Sel Th-2 diaktifkan dan memproduksi sitokinasitokina antara lain Interleukin-4 (IL-4) dan IL-13 yang memacu pengalihan produksi IgG ke IgE oleh sel B, terjadi sensitisasi sel mastosit dan basofil, sedangkan IL-5 mengaktifkan eosinofil yang merupakan sel inflamasi utama dalam reaksi alergi. Selain itu, sel juga melepas mediator sitokina yang juga menimbulkan gejala alergi (Kuby 1997). Saluran nafas atas maupun bawah menunjukkan gambaran infiltrasi sel inflamasi yang sama, yaitu melibatkan sel Th-2, sel mastosit, basofil, eosinofil, IgE, mediator kimia seperti histamin, leukotrien dan molekul adhesi, sitokina seperti IL-4, IL-5, IL-13, dan Granulocyte Monocyte Colony Stimulating Factor (GM-CSF). Antara gen dan lingkungan terjadi sinergi dan lingkungan menentukan ekspresi penyakit alergi. Studi epidemiologi secara konsisten menunjukkan bahwa asma dan rinitis alergi sering ditemukan bersamaan pada satu penderita, sehingga dianggap merupakan satu penyakit saluran nafas (Kuby 1997). Menurut Rengganis et al. (2004) respon imun yang muncul dalam reaksi alergi melalui dua tahap, yaitu tahap sensitisasi alergen dan tahap elisitasi. Tahap sensitisasi muncul ketika tubuh memproduksi antibodi IgE yang spesifik terhadap alergi. Tahap sensitisasi ini juga disebut dengan tahap induksi, yang merupakan kontak pertama dengan alergen (yaitu ketika mengkonsumsi makanan penyebab alergi, jika alergen berasal dari makanan yang dikonsumsi). Tahap yang kedua adalah fase elisitasi. Fase ini terjadi jika terdapat paparan ulang dari alergen. Ketika terpapar dengan makanan (penyebab alergi) yang sama, protein akan mengikat molekul di sel mediator yaitu sel basofil dan sel mastosit. Gambar 1 menunjukkan bahwa sensitisasi dimulai ketika ada kontak pertama alergen dengan sel B yang akan memproduksi IgE. IgE tersebut akan mengaktivasi sel mastosit. Ketika terjadi kontak kedua, IgE akan membentuk ikatan silang dengan alergen. Selanjutnya sel mastosit teraktivasi akan mengeluarkan
3
mediator-mediator yang akan memicu terjadinya reaksi alergi. Tahap elisitasi, tubuh mengeluarkan molekul yang menyebabkan inflamasi seperti leukotrien dan histamin. Efek yang timbul serta keparahan alergi dipengaruhi oleh konsentrasi dan tipe alergen, rute paparan, dan sistem organ yang terlibat (misalnya kulit, saluran cerna, saluran pernapasan, dan darah). Sensitisasi
Alergen
Sel B dan sel T
+
Produksi IgE Elisitasi
IgE Alergen
+
+
Sel mast
Sel mast teraktivasi
Pelepasan mediator Reaksi Gambar 1 Mekanisme alergi. Imunoglobulin Imunoglubulin (Ig) merupakan suatu protein yang terdiri atas lima kelas. Kelima kelas imunoglobulin mempunyai struktur dasar molekul yang sama, yang pada pemeriksaan mikroskop elektron berbentuk Y. Sistem imunitas yang diperantarai imunoglobulin (Ig) dikenal sebagai imunitas humoral. Imunoglobulin G (IgG) adalah imunoglobulin yang paling banyak terdapat dalam tubuh manusia, terutama setelah respon imun sekunder. Imunoglobulin M sering disebut makroglobulin, hal ini disebabkan karena (IgM) mempunyai berat molekul yang besar,yaitu 935kDa (Gambar 2). Imunoglobulin ini (IgM) didapat pada respon imun primer dalam waktu yang relatif singkat dari imunoglobulin G (IgG). Karena imunoglobulin M (IgM) memiliki peran penting dalam membunuh bakteri dalam darah dan mempunyai sifat aglutinasi dan sitolitik, sehingga IgM merupakan pertahanan tubuh yang penting dalam mengatasi infeksi. Pada keadaan normal kadar imunoglobulin G (IgG) dalam serum manusia berkisar 800 - 1600 mg/dL dan kadar imunoglobulin M (IgM) berkisar 50 -200 mg/dL (Hasyimi et al. 1992).
Secara umum imunoglobulin memiliki fungsi sebagai pertahanan tubuh secara humoral, namun dengan adanya kelas-kelas imunoglobulin memberikan fungsi dan karakteristik yang berbeda pada setiap kelasnya. IgA merupakan antibodi yang menjadi pertahanan tubuh pertama terhadap serangan bakteri dan virus. IgA banyak terdapat pada air liur, air mata, mukosa bronkus, dan mukosa saluran pencernaan. IgE diketahui berperan penting melindungi tubuh dari serangan parasit, dan juga memegang peranan penting dalam reaksi alergi. IgG merupakan imunoglobulin yang paling banyak terdapat di dalam darah. Selain di dalam darah, IgG juga terdapat di cairan interstial. IgM merupakan antibodi pertama yang dibentuk setelah tubuh terpapar antigen, dan IgM yang baru dibentuk terdapat di permukaan sel limfosit B. IgM yang terbentuk berikutmya dikeluarkan sebagai pentamer. Fungsi IgD belum diketahui dengan pasti (Koolman & Rohm 2005). Jenis imunoglobulin yang mengindikasikan terjadinya reaksi alergi adalah IgE. Kadar IgE di dalam serum sebesar 0.5 µg/mL. namun ketika terjadi reaksi alergi, kadar IgE serum akan lebih meningkat (Kuby 2007). Berdasarkan sejarahnya, IgE merupakan imunoglobulin yang paling terakhir ditemukan, yaitu ketika Prausnitz dan Küstner melakukan percobaan mengenai anafilaksis kutanus pasif. Aktivitas biologis IgE diketahui dapat terikat pada sel basofil dan sel mastosit. Ikatan ini terjadi antara reseptor pada permukaan sel mastosit dengan bagian epsilon dari fragmen Fc dari IgE. Hal ini menyebabkan sel mastosit terstimulasi untuk tergranulasi dan mengeluarkan beberapa mediator seperti histamin (Kuby 2007).
Gambar 2 Molekul imunoglobulin (Koolman & Rohm 2005).
4
Histamin dan Antihistamin Histamin merupakan senyawa normal yang ada dalam jaringan tubuh (sel mastosit dan basofil) yang berperan terhadap berbagai proses fisiologis penting yaitu mediator kimia yang dikeluarkan pada fenomena alergi seperti rinitis, asma, urtikaria, pruritis dan anafilaksis. Sumber histamin dalam tubuh adalah histidin yang mengalami dekarboksilasi (Rhoades et al. 1975). Antihistamin adalah zat yang mampu menghambat kerja dari histamin (Rhoades et al. 1975). Antihistamin biasanya digunakan untuk mengobati reaksi alergi yang disebabkan oleh tanggapan berlebihan tubuh terhadap alergen (penyebab alergi). Efek histamin adalah pada organ sasaran, langsung atau tidak langsung terhadap aktivasi berbagai sel inflamasi dan sel efektor yang berperan pada penyakit alergi. Efek tersebut diantaranya berupa peningkatan permeabilitas vaskular dan vasodilatasi dari pembuluh darah. Reseptor histamin ditemukan pada sel basofil, sel mast, neutrofil, eosinofil, limfosit, makrofag, sel epitel dan endotel. Oleh karena itu, histamin diduga berperan dalam modulasi sel-sel tersebut. Sel-sel yang berperan pada patofisiologi alergi adalah sel Antigen Presenting Cell (APC), sel T, sel B, sel mast dan basofil. Oleh karena itu, sasaran terapi dapat ditujukan terhadap sel-sel tersebut atau mengubah molekul adhesi dan kemoatraktan serta mencegah terjadinya ikatan histamin yang dilepas pada inflamasi dan reseptornya di organ sasaran. Histamin memiliki empat reseptor yaitu, H1, H2, H3 dan H4. Reseptorreseptor ini banyak terdapat pada daerah saluran nafas, kulit, dan saluran cerna. Antihistamin bekerja dengan cara berkompetisi pada reseptor histamin. Antihistamin biasanya memblok reseptor H1 dan H2 (Tcokroharyanto 1976). Histamin disimpan dalam granul sitoplasma basofil dan sel mast. Histamin berperan dalam fase cepat yang memodulasi respons vaskular dan saluran nafas melalui reseptornya yang juga ditemukan pada sel-sel inflamasi atau jaringan. Jadi peran histamin tidak hanya terbatas pada fase dini saja, tetapi juga pada fase kronis. (Tcokroharyanto 1976). Penghambat reseptor H1 digunakan pada terapi alergi yang diperantai IgE. Obat-obat tersebut telah tersedia tetapi penggunaan generasi antihistamin pertama (klorfeniramin, bromfeniramin, difenhidramin, klemastin, hidroksizin) terbatas, karena adanya efek samping sedasi primer dan menyebabkan
keringnya membran mukosa. Kontroversi penggunaan antihistamin (AH) pada asma disebabkan karena AH lama mempunyai efek sedasi, antikolinergik dan antiserotonergik (Rhoades et al. 1975). Dengan adanya AH generasi kedua dan ketiga, banyak peneliti yang menelaah ulang efek AH terhadap asma. Antihistamin generasi kedua (loratadin, cetirizin) dan ketiga (feksofenadin, desloratadin) bekerja menghambat reseptor histamin H1, di samping efek antiinflamasi. Azelastin merupakan preparat antihistamin topikal yang digunakan secara intranasal yang tidak menunjukkan efek samping sistemik. Terapi antihistamin generasi kedua dan ketiga berguna pada penderita rinitis alergi yang juga menderita asma. Hal tersebut diduga oleh karena ekspresi Intracellular Cell Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) yang dicegah antihistamin sehingga infiltrasi eosinofil ke jaringan juga dicegah. Pemberian antihistamin intramuskular atau intravena dalam pengobatan anafilaksis sistemik hanya efektif terhadap gejala kulit dan gastrointestinal, tetapi tidak efektif pada vaskular yang kolaps atau obstruksi saluran nafas (Rhoades et al. 1975). Marmot (Cavia porcellus) Marmot (Cavia porcellus) merupakan hewan rodensia yang memiliki Kingdom (Animalia), Filum (Chordata), Kelas (Mammalia), Ordo (Rodentia), Subordo (Hystricomorpha), Famili (Caviidae), Subfamili (Caviinae), Genus (Cavia), Spesies (Cavia porcellus). Meski memiliki nama lain Guinea pig,namun marmot bukan berasal dari Negara Guinea melainkan dari Andes. Selain itu, hewan ini juga tidak termasuk dalam golongan babi (pig) seperti ditunjukkan pada Gambar 3 (Wagner 1999). Terdapat tiga basis keturunan marmut yang ada saat ini yaitu: Inggris (bulu pendek), Peruvian (bulu panjang), dan Abisinian (bulu rosette). Hewan ini memiliki keunikan jika dibandingkan hewan coba lainnya, diantaranya adalah, sebagai herbivora. Marmot tidak mampu mensintesis vitamin C dengan cukup sehingga memerlukan asupan vitamin C dari luar melalui makanan yang diberikan. Percobaan biologis untuk marmot telah dilakukan sejak abad ke 17. Marmot sering digunakan dalam penelitian terutama untuk penelitian kondisi medis manusia seperti diabetes, tuberkulosis, penyakit kudis ,dan komplikasi kehamilan (Nichols 2003).
5
Menurut Luebke (2007), telah banyak dikembangkan metode untuk pengujian Dermatitis Kontak Alergi (DKA) dan marmot merupakan hewan yang utama digunakan. Saat ini, uji telah dikembangkan pula terhadap mencit yang mewakili kemajuan yang signifikan untuk tes DKA. Marmot jantan dan marmot betina memilki perbedaan yang signifikan dalam hal data biologisnya. Marmot jantan dewasa memiliki bobot badan mulai 800-1200 gram sedangkan marmot betina dewasa memiliki bobot badan 250-320 gram. Data biologi lengkap dari marmot tercantum pada Tabel 1. Beberapa jalur bisa digunakan ketika akan menginjeksikan obat-obatan, vaksin, atau obat bius. Jalur itu ditentukan oleh sifat alami dari bahan yang akan diberikan, jenis hewan, dan tujuan dari pemberian,selain faktor-faktor yang lainnya. Beberapa jalur yang bisa digunakan untuk pemberian bahan yaitu mulut dan melewati bagian kulit menggunakan jarum.
Gambar 3 Marmot (Cavia porcellus). Tabel 1 Data biologi marmut Karakteristik biologi Data Bobot badan jantan 800-1200 g Bobot badan betina 250-320 g Luas permukaan tubuh 9.5 cm2 Waktu hidup 4-5 tahun Konsumsi makanan 6 g/100 g/hari Konsumsi air 10 mL /100 g/hari Pubertas jantan 8-10 minggu Pubertas betina 67.8 + (21.5 SD) hari Periode kehamilan 65-72 hari temperatur tubuh 37.2-39.5 oC Detak jantung 230-380 denyut/ menit Laju respirasi 42-204 per menit Volume tidal 2.3-5.3 mL/kg Volume darah 67-92 mL/kg (Nichols 2003)
Kuersetin Kuersetin merupakan golongan flavonoid yang paling tersebar luas dalam kingdom plantae dan merupakan golongan flavonoid yang paling melimpah. Kuersetin banyak ditemukan dalam makanan yang bisa dikonsumsi. Sebagai contoh yaitu apel, bawang, dan seledri. Selain itu, kuersetin juga banyak ditemukan dalam tanaman obat keluarga. Kuersetin memiliki efek yang berpengaruh terhadap kesehatan manusia, yaitu sebagai antikanker, antioksidan, antialergi, antivirus, dan aktivitas antiinflamasi (Monson & Schoenstadt 2009). Menurut Kunia (2006). Kuersetin adalah zat aktif kelas flavonoid yang secara biologis sangat kuat dan memiliki aktivitas antioksidan 4,7 kali dari vitamin C. Flavonoid merupakan sekelompok besar antioksidan bernama polifenol yang terdiri atas antosianidin, biflavon, katekin, flavanon, flavon, dan flavonol. Kuersetin termasuk ke dalam kelompok flavonol. Semua flavonoid memiliki dasar struktur kimia yang hampir sama. Gambar 4 menunjukkan bahwa kuersetin memiliki tiga molekul cincin dengan gugus hidroksil (OH) yang menempel. Kuersetin merupakan suatu aglikon (tanpa molekul gula). Rutin, kuersetrin, dan isokuersetin merupakan flavonoid yang memiliki struktur yang hampir sama dengan kuersetin hanya saja flavonoid tersebut memiliki molekul gula yang spesifik pada cincin C gugus hidroksil pada kuersetin. Perbedaan tersebut bisa berakibat berubahnya aktivitas dari molekul tersebut (Gugler 1975). Menurut Gugler (1975) dosis oral untuk kuersetin adalah 400-500 mg tiga kali sehari. Dosis itu akan menjadi lebih kecil ketika molekul kuersetin lebih tinggi kelarutannya dalam air. Sebagai contoh adalah kuersetin kalkon yang lebih mudah larut dalam air sehingga menggunakan dosis lebih kecil dari kuersetin yang lain yaitu 250 mg tiga kali sehari Namun itu bukanlah patokan yang direkomendasikan untuk kuersetin. Tidak ada standar yang pasti untuk dosis pemakaian kuersetin (Ehrlich 2007). Hal itu dimungkinkan karena perbedaan yang bermacam-macam dalam hal kemurnian dan kekuatan aktivitas kuersetin antar perbedaan merek dari suplemen yang sama, yang membuat sukar menentukan dosis efektif dan keamanan untuk kuersetin (Monson & Schoenstadt 2009).
6
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan
Gambar 4 Struktur kuersetin. Anafilaksi Kutanus Pasif (AKP) Menurut Luebke (2007) anafilaksis merupakan sebuah keadaan tidak biasa dari reaksi alergi yang terjadi pada hewan terhadap protein asing atau substansi yang lain. Anafilaksis termasuk reaksi hipersensitif yang diperantarai antibodi dan termasuk ke dalam reaksi hipersensitif tipe I disebabkan oleh pengeluaran agen vasoaktif seperti histamin dan serotonin. Pengeluaran agen vasoaktif tersebut terjadi karena pengikatan imunoglobulin E (IgE) pada reseptor Fragment Crystalise (Fc) di permukaan sel mastosit atau basofil. Anafilaksis bisa terjadi secara lokal contohnya kutanus atau sistemik (menyeluruh) atau yang disebut dengan syok anafilaksis. Syok anafilaksis merupakan manifestasi pemaparan hipersensistif pada individu teresensitisasi terhadap antigen spesifik yang mengakibatkan keadaan darurat sistem respirasi yang diikuti oleh syok dan diiringi oleh urtikaria, pruritus dan angiodema. Terdapat dua istilah anafilaksis yaitu anafilaksis pasif dan anafilaksis aktif. Anafilaksis aktif adalah anafilaksis karena injeksi oleh protein asing sedangkan anafilaksis pasif adalah anafilaksis yang terjadi karena individu normal diinjeksi dengan serum dari orang yang tersensitisasi (Luebke 2007). Anafilaksis Kutanus Pasif (AKP), yaitu anafilaksis pasif lokal yang ditransfer oleh injeksi antibodi secara intradermal setelah 24 – 27 jam, dilakukan injeksi intravena dengan antigen yang homolog dan pewarna Evans blue. Kebiruan pada kulit pada daerah yang diinjeksi intradermal merupakan bukti adanya reaksi permeabilitas (Luebke 2007). Anafilaksis kutanus pasif dilakukan dengan menyuntikkan antigen ke dalam kulit hewan uji yang telah disensitisasi, kemudian akan menimbulkan reaksi lokal. Reaksi ini terdiri atas pembengkakan lokal dan kemerahan. Kenaikan permeabilitas vaskular lokal yang merupakan ciri khas reaksi ini ditunjukkan dengan menggunakan Evans blue (Henson 1993).
Alat-alat yang digunakan adalah kandang hewan coba individual, autoklaf TOMY ES315, sentrifus klinis Beckman microfuge 11, inkubator 4oC, kipas angin, syringe (Terumo), vial, sarung tangan (Sensi gloves), sonde, masker, dan kit IMMULITE 2000 (Laboratorium Prodia). Alat-alat tersebut digunakan ketika masa pemeliharaan marmot, pengambilan serum darah, dan analisis IgE serum. Bahan-bahan yang digunakan adalah marmot (dari peternak Sukabumi), putih telur ayam, Evans blue, kuersetin (Sigma Q0125 10G), alkohol 70%, betadin, kapas, buffer saline, pakan marmut (Indo feed K-03), Al (OH)3, dan anestetik (eter). Metode Penelitian Pengujian Dosis Farmakologis (Barnes & Paget 1964). Tiga ekor marmot jantan diadaptasikan selama 3 hari. Setelah itu, marmot dicekok dengan kuersetin dosis 13.92 mg/kg bobot badan yang dilarutkan dalam 1 mL akuades. LD50 kuersetin sebesar 160mg/kg bobot badan tikus per oral (Gugler 1975). Dosis dihitung berdasarkan konversi LD50 kuersetin. Jika 2 ekor marmot ada yang mati, menunjukkan bahwa dosis 13.92 mg/kg bobot badan bukan merupakan dosis aman dan harus diturunkan lagi dosisnya. Namun jika tidak ada yang mati, menunjukkan bahwa dosis tersebut aman untuk digunakan dalam percobaan. kuersetin tersebut Dosis diperoleh berdasarkan LD50 kuersetin, yaitu 160 mg/kg bobot badan (Gugler 1975) yang diberikan per oral pada tikus. Untuk 200 gram tikus dilakukan konversi, yaitu (200/1000) x 160 mg/kg = 32 mg/200 gram bobot badan tikus. Berdasarkan tabel konversi dari hewan coba tikus ke hewan coba marmot, diperoleh : 32 mg/200 g x 1.74 = 55.68 mg/ 400 g bobot badan marmot. Untuk 1000 gram marmot diperoleh hasil 1000/400 x 55.68 mg = 139.2 mg/kg marmot. Menurut Olson (2003), indeks terapeutik untuk LD50 adalah sepersepuluh (1/10) sehingga diperoleh dosis kuersetinnya yaitu 139.2 mg/kg bobot badan x 1/10 = 13. 92 mg/kg bobot badan marmot. Dosis ini kemudian digunakan pada uji dosis farmakologis untuk melihat pengaruhnya pada marmot.
7
Aklimatisasi (Adaptasi) Adaptasi marmot dilakukan selama 2 kali. Adaptasi pertama merupakan adaptasi marmot terhadap pakan yang dilakukan selama 45 hari. Marmot diberi pakan berupa rumput dan pakan formulasi dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 90:10, dan 100%pelet. Adaptasi kedua merupakan adaptasi setelah marmot sudah bisa memakan pelet 100% yang dilakukan selama 14 hari dan bobot badan marmot dicatat setiap harinya. Marmot kemudian dibagi menjadi 2 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol dan kelompok kuersetin (Q). Masing - masing kelompok terdiri atas tiga ekor marmot (3 ulangan). Kelompok kuersetin (Q) akan disensitisasi dengan putih telur sedangkan kelompok kontrol tidak disensitisasi. Sensitiasi Marmot (Malo & Morin 1986) yang Dimodifikasi Sensitisasi dilakukan terhadap 1 kelompok marmot yaitu kelompok kuersetin (Q). Setiap marmot disuntik secara subkutanus dengan putih telur 2 µg sebagai alergen dan 3 mg Al(OH)3 sebagai adjuvant dan dilarutkan dalam buffer saline 0.4 mL. Sensitisasi dilakukan setelah masa adaptasi, yaitu pada hari ke-1 dan hari ke-14. Hari ke-31 sampai hari ke-39 marmot disensitisasi dengan larutan putih telur di dalam air minum dengan konsentrasi 2 mg/mL. Selama masa sensitisasi bobot badan marmot dicatat setiap hari untuk melihat pengaruh sensitisasi terhadap bobot badan marmot. Pada hari ke-0 sensitisasi dilakukan pengambilan darah dari jantung sebanyak 1.5 mL dan disimpan di dalam vial, lalu didiamkan selama 1 jam sampai terjadi penggumpalan. Darah ini kemudian disentrifus pada kecepatan 1200 g selama 10 menit. Serum diambil dan dipindahkan ke dalam vial lain. Serum kemudian disimpan di dalam pembeku 4oC untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Pengujian Anafilaksis Kutanus Pasif (Bakara 2002) Serum yang diperoleh dari marmot diencerkan dengan buffer saline dengan perbandingan 1:1. Larutan ini kemudian disuntikkan pada marmut yang sama dengan donor serum sebanyak 0.05 mL secara intradermal di bagian permukaan dorsal yang telah dicukur bulunya. Pada jam ke-47 setelah penyuntikan serum, marmot kelompok kontrol dicekok dengan air minum sebanyak 1 mL
sedangkan marmot kelompok kuersetin dicekok kuersetin dosis 13,92 mg/kg bobot badan. Uji Anafilaksis Kutanus Pasif (AKP) ini dilakukan pada jam ke-48 setelah penyuntikan serum dengan cara disuntikkan 1 mg putih telur dalam 2 mL pewarna Evans blue 0.5% melalui intravena di leher. Reaksi anafilaksis kutanus pasif diamati setelah 30 menit penyuntikan dengan adanya kebiruan pada daerah yang disuntikkan serum menunjukkan reaksi positif. Penghitungan Kadar Imunoglobulin E dari Serum marmot Marmot yang telah dianestesi diambil darahnya dari jantung sebanyak 1.5 mL dan ditempatkan ke dalam vial, kemudian dibiarkan selama 1 jam sampai terjadi penggumpalan. Sampel darah kemudian disentrifus pada kecepatan 1200 g selama 10 menit dan diambil serumnya. Serum tersebut kemudian dihitung kadar IgE nya di Laboratorium Prodia. Cara kerja kit chemiluminescent immunometric assay IMMULITE 2000 ini berdasarkan pendaran yang dihasilkan. Prinsip kerja alat ini hampir sama dengan Enzim Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) tipe indirect ELISA yaitu penempelan antibodi sekunder (anti IgE) dan pewarnaan menggunakan enzim yang telah dilabel. Mulamula sampel yang diduga mengandung antibodi diinkubasi dalam reagen yang dilabel alkalin fosfat. Campuran reaksi dipisahkan dari butiran yang ada di dalam kolom dengan cara memutar tabung reaksi pada kecepatan tinggi sepanjang sumbu vertikalnya. Larutan kemudian dipindahkan ke dalam suatu tempat yang sekaligus memiliki tempat pencucian butiran. Empat hasil pencucian yang terpisah akan muncul dalam beberapa detik, sehingga tabung reaksi dapat diproses berurutan dengan waktu yang seragam. Butiran yang telah lepas dari antibodi atau antigen yang dilabel tersebut akan tertinggal di tabung reaksi setelah pencucian dan akan menghasilkan residu yang bebas dari labelnya. Label yang terikat pada butiran kemudian dihitung secara kuantitatif menggunakan substrat dioksietana agar menghasilkan pendaran. Pendaran akan terpancarkan saat substrat chemiluminescent bereaksi dengan alkalin fosfatase yang terikat pada butiran. Jumlah pendaran yang terpancar sesuai dengan jumlah analat pada sampel. Pendaran ini dideteksi menggunakan Photo Multiplier Tube (PMT). Hasil deteksi kemudian dikalkulasikan dan menjadi data.
8
Analisis Data (Mattjik 2002) Rancangan percobaan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor dengan dua kelompok perlakuan dan tiga kali ulangan. Analisis data menggunakan ANOVA dengan model rancangan sebagai berikut: Yij = µ + τi + εij Keterangan: µ = Pengaruh rataan umum τi = Pengaruh perlakuan ke-i, i = 1,2 εij = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1,2,3 i = 1 adalah kontrol i = 2 adalah kuersetin
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengujian Dosis Farmakologis Berdasarkan hasil uji dosis farmakologis ternyata dosis tersebut merupakan dosis aman. Hal ini ditunjukkan dengan semua marmot yang dijadikan hewan uji (3 ekor marmot) tidak ada yang mati. Dengan demikian, dosis ini bisa digunakan untuk perlakuan pada tahap anafilaksis kutanus pasif untuk melihat pengaruh kuersetin dosis tersebut sebagai antialergi. Hasil tersebut diperoleh ketika marmot dicekok dengan kuersetin dosis 13.92 mg/kg bobot badan. Dosis ini diperoleh berdasarkan LD50 dari kuersetin yaitu sebesar 160 mg/kg bobot badan tikus yang diberikan secara oral. Oleh karena itu, diperlukan konversi dari hewan coba tikus ke hewan coba marmot. Dosis yang digunakan dipakai berdasarkan indeks terapeutik LD50, yaitu nilai sepersepuluh dari LD50 yang merupakan ukuran keamanan sebuah obat yang menyebabkan kematian pada 50% subjek yang diberi obat tersebut (Olson 2002). Kuersetin dengan dosis tersebut kemudian dicekokan pada tiga ekor marmot kemudian dilihat persen kematian dari ketiga marmot tersebut. Marmot yang akan dijadikan hewan uji dosis aman sebelumnya diadaptasikan terlebih dulu selama 3 hari. Masa adaptasi ini berbeda dengan masa adaptasi untuk perlakuan. Hal ini dikarenakan marmot hanya memerlukan selama 2 hari untuk melihat positif atau tidaknya uji dosis farmakologis ini dan berbeda dengan marmot perlakuan yang memerlukan waktu 39 hari untuk masa sensitisasi dan masa perlakuan anafilaksis kutanus pasif. Tujuan dari adaptasi ini adalah untuk mencegah marmot mati dikarenakan faktor bukan perlakuan.
Adaptasi Marmot (Cavia porcellus) Menurut Malole & Pramono (1989), marmot secara intensif digunakan dalam studi laboratorium penyakit, nutrisi dan hereditas, dan dalam pengembangan serum. Lavoisier menggunakan marmot untuk mengukur produksi panas. Selain itu, digunakan juga untuk pekerjaan yang berhubungan dengan vitamin C, diagnosis tuberkulosis, dan penelitian yang berkaitan dengan anafilaksis. Marmot yang digunakan sebanyak 6 ekor yang semuanya marmot jantan dan sebagian besar memiliki bulu putih pada bagian punggungnya. Pemilihan marmot jantan bertujuan menghindari adanya pengaruh hormon terhadap hasil penelitian. Marmot betina atau hewan coba lainnya yang berjenis kelamin betina memiliki sistem hormonal yang relatif tidak stabil jika dibandingkan dengan marmot jantan. Pemilihan marmot yang memiliki punggung putih bertujuan memudahkan pengamatan ketika akan dilakukan pengukuran diameter bulatan Evans blue yang disuntikkan pada marmot. Adaptasi marmot dilakukan selama dua kali adaptasi dengan total waktu adaptasi adalah dua bulan masa adaptasi. Waktu adaptasi yang lama ini dikarenakan oleh adaptasi pakan marmot dari rumput ke pakan yang sudah diformulasi sangat sulit. Selama masa awal adaptasi, marmot diberi pakan berupa daun jagung dan rumput gajah. Bobot marmot hanya dicatat pada adaptasi yang ke2. Pencatatan bobot badan dilakukan setiap hari untuk melihat pengaruh dari masa adaptasi terhadap bobot marmot. Gambar 5 menunjukkan bahwa bobot badan marmot selalu berubah secara fluktuatif selama adaptasi. Perubahan ini dikarenakan pola makan marmot yang tidak stabil. Namun demikian, sebelum masuk masa perlakuan (sensitisasi), bobot badan semua kelompok marmot berada dalam kondisi naik jika dibandingkan bobot badan awalnya. Pada hari ke-1 sampai hari ke-45 masa adaptasi pertama, pakan marmot berupa campuran pakan formulasi dari pabrik pakan K-03 super dari pabrik Indo feed di Bogor dengan rumput. Mula-mula pakan dicampur dengan perbandingan rumput dan pakan formula (pelet) adalah 90:10 lalu hari berikutnya 80 rumput dan 20 pelet sampai semua marmot memakan pelet (100% pelet). Pakan formulasi tersebut sebenarnya bukanlah pakan khusus untuk marmot melainkan untuk kelinci super. Kandungan protein pelet sebesar 18% yang dikhususkan
9
Gambar 5
Grafik pengukuran bobot badan pada dua minggu terakhir Kontrol( ) dan adaptasi. kuersetin( . ).
Pengaruh Sensitisasi terhadap Bobot Marmot (Cavia porcellus) Uji kehomogenan dari marmot pada masa awal sensitisasi menunjukkan bahwa semua marmot berada dalam keadaan homogen bobot badannya baik marmot dalam satu kelompok maupun antar kelompok perlakuan Dengan kata lain, kelompok marmot berada dalam keadaan homogen (p>0.05). Uji kehomogenan ini dilakukan melalui perangkat lunak SPSS. Sensitisasi dilakukan selama 39 hari. Sensitisasi marmot dilakukan dengan putih telur yaitu pada hari ke-1 dan hari ke-14 melalui penyuntikan subkutanus. Selanjutnya hari ke-31 sampai hari ke-39 pemberian putih telur dilakukan setiap hari melalui air minum. Pemberian putih telur dalam air minum bertujuan supaya paparan ovalbumin sebagai alergen lebih mempercepat terjadinya reaksi pembentukan antibodi pada tubuh marmot. Sebelum masa sensitisasi (hari ke-0) atau hari terakhir adaptasi, marmot diambil darahnya dari jantung sebanyak 1.5 mL. Pengambilan
darah dari jantung pada awal perlakuan sebenarnya tidak disarankan dikarenakan hewan coba memerlukan masa pemulihan yang lama untuk kembali normal. Selain itu, risiko kematian dan stres lebih meningkat dibandingkan dengan pengambilan darah dari ekor atau kuping. Namun hal ini dilakukan karena jalur pengambilan darah pada marmot tidak seperti hewan coba lain. Pengambilan darah pada marmot tidak bisa dilakukan melalui kuping ataupun ekor. Perbandingan hasil pengukuran bobot badan marmot pada masa adaptasi, pengambilan darah dan sensitisasi memberikan gambaran yang jelas bahwa marmot mengalami stres. Perbandingan bobot badan tampak pada Gambar 6. Berdasarkan grafik tersebut terlihat bahwa pada masa adaptasi bobot badan marmot mengalami peningkatan yaitu sampai hari ke-14. Namun setelah pengambilan darah dari jantung pada tanggal hari ke-0 sensitisasi, bobot badan marmot mengalami penurunan yang signifikan dari sebelumnya dan hal ini dimungkinkan karena marmot sedang dalam masa pemulihan. Tidak ada pengaruh sensitisasi terhadap bobot badan marmot karena penurunan bobot badan marmot bukanlah karena pengaruh senstisasi melainkan karena pengambilan darah dari jantung. Hal ini dibuktikan dengan peningkatan bobot badan semua kelompok marmot setelah hari ke- 14. Seandainya putih telur berpengaruh terhadap bobot badan, maka akan terjadi penurunan bobot badan selama masa sensitisasi. Namun hal tersebut tidak terjadi sehingga bisa dikatakan bahwa sensitisasi dengan putih telur tidak berpengaruh terhadap bobot badan marmot. Rata-rata bobot badan (g)
untuk pakan kelinci super (Lampiran 10). Kandungan protein pada pakan formula tersebut kemungkinan terlalu banyak untuk marmot dan hal tersebut mengakibatkan sistem pencernaan marmot pada minggu ke-4 sering mengalami gangguan sistem pencernaan dengan terjadinya mencret. Diperkirakan bahwa marmot mengalami stres metabolik. Namun hal tersebut bisa diatasi dengan memberikan rumput dengan jumlah yang tidak terlalu banyak. Tujuan dari pemberian tersebut yaitu supaya nafsu makan marmot meningkat dan tidak mengalami stres metabolik.
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 18
13 4
9 14 19 24 29 34 39
Hari keGambar 6 Grafik bobot badan masa adaptasi (sebelah kiri garis hitam) dan selama masa sensitisasi (sebelah kanan garis hitam). Kontrol( )dan kuersetin( ).
10
Anafilaksis Kutanus Pasif Hasil uji AKP (Tabel 2, Gambar 7, dan Gambar 8) tampak bahwa tidak terdapat perbedaan intensitas warna kebiruan yang signifikan antara kelompok kontrol dan kuersetin.. Hasil ini menunjukkan bahwa kuersetin yang diberikan pada dosis 13.92 mg/kg bobot badan mampu mencegah terjadinya reaksi alergi pada marmot. Marmot kelompok kontrol merupakan marmot yang tidak disensitisasi sebelum disuntik serum sehingga marmot tersebut tidak mendapat paparan pertama alergen dan tidak diberi kuersetin, sedangkan marmot kelompok kuersetin disensitisasi dengan putih telur sebelum disuntik serum pada hari ke-40 dan diberi kuersetin pada jam ke-47 setelah penyuntikan serum . Dengan demikian, ketika dilakukan uji AKP, marmot kelompok kontrol diasumsikan tidak mengalami reaksi alergi sedangkan marmot kelompok kuersetin mengalami alergi. Meskipun diasumsikan bahwa marmot kontrol tidak akan mengalami alergi namun, hasil uji AKP menunjukkan bahwa marmot mengalami alergi karena masih menunjukkan warna kebiruan jika dibandingkan dengan marmot normal (Gambar 9). Marmot kelompok kuersetin dicekok terlebih dahulu dengan kuersetin dosis 13.92 mg/kg bobot badan pada jam ke-47 yang bertujuan mencegah terjadinya reaksi alergi ketika paparan alergen yang kedua. Warna kebiruan pada kelompok kuersetin ternyata sama dengan kelompok kontrol. Berdasarkan hasil tersebut, kuersetin pada dosis tersebut ternyata hanya mampu mencegah terjadinya reaksi alergi pada tahap sama dengan marmot kelompok kontrol dan tidak sampai pada tahap marmot normal (benar-benar tidak mengalami alergi) dilihat dari intensitas warna kelompok kontrol dan kelompok kuersetin yang sama. Menurut Kuby (2005) ketika terjadi alergi, histamin yang disekresikan tubuh akan meningkatkan permeabilitas pembuluh darah dan juga meningkatkan vasodilatasinya. Pada saat yang sama Evans blue telah disuntikkan ke dalam pembuluh darah sehingga ketika reaksi alergi muncul, pewarna Evans blue akan keluar dari pembuluh darah yang mengakibatkan warna kebiruan. Reaksi alergi terjadi ketika IgE berada pada permukaan sel mastosit yang disebabkan oleh kontak dengan alergen. Kuersetin bertindak secara langsung pada sel mastosit dalam mencegah terjadinya respon alergi.
Tabel 2 Perbandingan intensitas warna hasil uji AKP Intensitas warna Kelompok Ulangan 1 2 3 Kontrol + ++ + Kuersetin + ++ +
1
2
3
Gambar 7 Hasil uji AKP kelompok kontrol.
1
2
3
Gambar 8 Hasil uji AKP kelompok kuersetin.
Gambar 9 Marmot normal (tanpa perlakuan). Analisis Imunoglobulin E (IgE) Berdasarkan hasil analisis bisa dilihat bahwa semua hasil analisis IgE tidak menunjukkan hasil yang spesifik. Tabel 3 menunjukkan bahwa semua serum sebelum dan setelah disensitisasi yang dianalisis di laboratorium Prodia memiliki nilai IgE < 2.4 ng/mL atau setara dengan <1 IU/mL. Hasil ini tidak spesifik dan kemungkinan disebabkan oleh sedikitnya jumlah IgE dalam serum marmot (<2.4 ng/mL) sehingga alat yang digunakan tidak bisa mendeteksi IgE dengan jumlah yang terlalu kecil. Nilai IgE yang sama untuk kedua kelompok perlakuan ini kemungkinan juga menunjukkan bahwa
11
kuersetin mampu mencegah terjadinya reaksi alergi. Alat yang digunakan hanya bisa menganalisis sampel dengan limit deteksi sebesar >1.0 IU/mL. Pengenceran yang dilakukan kemungkinan juga menyebabkan konsentrasi IgE pada saat dianalisis menjadi tidak terukur secara spesifik. Pengeceran ini dilakukan karena pada saat uji AKP, ada penyuntikan Evans blue sebagai indikator dan menyebabkan darah menjadi pekat. Namun demikian, sampel darah tetap bisa dianalisis dengan cara mengencerkan darah terlebih dahulu sehingga tidak terlalu pekat. Darah diencerkan dengan NaCl fisiologis 0.9% dengan faktor pengenceran 60 kali. Pengenceran ini dilakukan sampai warna sampel yang akan dianalisis sama dengan warna serum darah normal. Gambar 10 menunjukkan bahwa darah sangat pekat jika dibandingkan dengan darah dalam keadaan normal. Tabel 3 Perbandingan hasil analisis IgE sebelum dan sesudah sensitisasi Kelompok
Kontrol
Kuersetin
perlakuan juga sama untuk semua kelompok perlakuan, yaitu < 2,4 ng/mL. Berdasarkan hasil penelitian ini bisa disimpulkan bahwa kuersetin pada dosis 13.92 mg/kg bobot badan menunjukkan pengaruh sebagai antialergi namun belum efektif. Saran Disarankan untuk menggunakan hewan coba yang lain sebagai pengganti marmot sehingga volume darah yang diambil bisa lebih banyak dan tidak mempengaruhi hasil analisis IgE. Pengujian dosis farmakologis sebaiknya dilakukan pada beberapa dosis yang berbeda, dan juga lebih tinggi dosisnya dari dosis penelitian ini. Selain itu, disarankan melakukan uji validasi metode terlebih dahulu sebelum melakukan penelitian.
DAFTAR PUSTAKA
1 2 3
Sebelum sensitisasi < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL
Setelah sensitisasi < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL
Bakara TLM. 2002. Kajian aktivitas antialergi ekstrak paria (Momordica charantia L.) pada mencit dan sel mastosit. [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
1 2 3
< 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL
< 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL < 2.4 ng/mL
Baratawidjaja RK. 1976. Penyakit alergi dan pengobatannya. Cermin Dunia Kedokteran 6:8-13.
Ulangan
Barnes JM, Paget GE. 1964. Toxicity test. Di dalam: Laurence DR, Bacharach, editor. Evaluation of Drug Activities:Pharmacometrics. London: Academic Pr. hlm 161-162. Buhler DR, Miranda C. 2000. Antioxidant Activities of Flavonoids. Oregon: Oregon State Univ.
Gambar 10 Darah yang tercampur dengan pewarna Evans blue.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Hasil uji dosis farmakologis pada marmot dengan dosis 13.92 mg/kg bobot badan menunjukkan bahwa dosis tersebut adalah dosis aman. Hasil uji AKP menunjukkan intensitas warna kelompok kontrol dan kuerestin adalah sama. Jumlah IgE yang dikeluarkan baik sebelum maupun sesudah
Effendi Z. 2003. Peranan Leukosit sebagai Anti Inflamasi Alergik dalam Tubuh. Sumatera Utara: Universitas Sumatera Utara Pr. Ehrlich SD. 2007. Private Practise Spesializing in Complementary and Alternative Medicine. Phoenix: University of Maryland. Gugler R, Leschik M, Dengler HJ. 1975. Disposition of quercetin in man after single oral and intravenous doses. Eur J Clin Pharmacol 9:229-234. Hasyimi et al. 1992. Kadar IgG dan IgM pada bentuk tuberkuloid dan lepromatous dari
12
penyakit lepra. Cermin Kedokteran 75:21-25.
Dunia
Henson PM. 1993. Mekanisme injuri jaringan yang dihasilkan oleh reaksi imunologik. Di dalam: Bellanti JA, editor. Imunologi III. Yogayakarta: UGM Pr. Koolman J, Rohm KH. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Ed ke-2. New York: Thieme Stuttgart. Kuby J. 1997. Immunology. Ed ke-3. New York: WH Freeman. Kunia K. 2006. Apel mengatasi Beragam Penyakit. Bandung: ITB Pr. Luebke R, House R, Kimber I, editor. 2007. Immunotoxicology and Immunopharmacology. Ed ke-3. New York: CRC Pr. Malo C, Morin CL. 1986. Establishment of an animal model of ovalbumin sensitized mouse to study protein induced enteropathy. Gut. 27: 1298-1305. Malole MB, Pramono CSU. 1989. Penggunaan Hewan-Hewan Percobaan di Laboratorium. Bogor: IPB Pr. Mattjik AA. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Ed ke-2. Bogor: IPB Pr. Monson K, Schoenstadt A. 2009. Quercetin Drug Interaction. New York: Clinaero. Nichols JB. 2003. Veterinary Service Guinea Pig. Florida: Florida Atlantic Univ. Olson J. 2003. Belajar Mudah Faramakologi. Linda C, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Clinical Pharmacology Made Ridiculously Simple. Rengganis I et al. 2008. Sensitivitas terhadap serbuk sari pada pasien alergi pernafasan. Majalah Kedokteran Indonesia 9:328-334. Rhoades et al. 1975. Pengaruh pruritus oleh obat-obat antihistamin. J allergy clin immuno 55:180. Ryan WM. 2007. Allergies:Skin Testing of Allergies. Chicago: WebMD. Tcokroharyanto. 1976. Dasar-Dasar Alergi. Jakarta: UI Pr. Wagner JE. 1976. Introduction and taxonomy. Di dalam: The Biology of the Guinea
Pig. Wagner JE, Manning PJ, editor. London: Academic Pr. hlm 245-261. Wild G. 2006. Immunology and immunotoxicology. Di dalam: Duffus JH, Wortg GJ, editor. Fundamental Toxicology. New York: CRC Pr. hlm 151-160.
LAMPIRAN
14
Lampiran 1
Alur kerja pengujian dosis farmakologis (uji pendahuluan)
Adaptasi 3 ekor marmot selama 3 hari
Pencekokan 3 ekor marmot dengan kuersetin
Ulangan 1 Bobot badan 207 g Jumlah kuersetin yang diberikan 2.882 mg
Ulangan 2 Bobot badan 361 g Jumlah kuersetin yang diberikan 5.025 mg
Pengamatan uji farmakologis selama 24 48 jam
Ulangan 3 Bobot badan 400 g Jumlah kuersetin yang diberikan 5.568 mg
15
Lampiran 2 Alur kerja penelitian
Marmot Jantan
Kontrol
Adaptasi 14 hari
Kuersetin
Adaptasi 14 hari
Disuntik putih telur 2µg, 3 mg Al(OH)3, buffer saline
Hari ke-0 sensitisasi Pengambilan darah marmot ke-1, 1.5 mL
Induksi putih telur 2 mg/mL melalui air minum
Dibiarkan hingga menggumpal, sentrifus 1200 g
Serum darah
Pengujian Anafilaksis Kutanus Pasif
Pengambilan darah ke-2
Analisis IgE
Hari ke-1 dan hari ke-14
Hari ke 31-39
16
Lampiran 3 Proses pengambilan putih telur secara aseptik
Telur ayam
Cangkang telur disemprot alkohol 70%
Cangkang telur dipecah dekat bunsen
Putih telur diambil dengan pipet mikro dan dilarutkan dalam 2 mL akuades
Larutan kemudian di vortex selama 1 menit
Dalam laminar
17
Lampiran 4 Alur kerja sensitisasi
Kelompok kuersetin (n=3)
Hari ke-0 sensitisasi dilakukan pengambilan darah 1.5 mL dari jantung
Uji AKP
Hari ke 1 dan hari ke-14
Disuntik 2 µg putih telur, 3mg Al(OH)3 dalam 0.4 mL buffer saline Hari ke 31-39
Kadar IgE serum darah dianalisis di Lab.
Diinduksi putih telur 2 mg/mL dalam air minum
18
Lampiran 5 Alur kerja uji anafilaksis kutanus pasif
Serum marmot diencerkan dengan buffer saline 1:1 0.05 mL disuntik intradermal pada permukaan dorsal yang telah dicukur bulunya
Kelompok kontrol (n=3) Kelompok kuersetin (n=3)
Biarkan 47 jam kontrol dicekok air minum 1mL kelompok kuersetin dicekok kuersetin dosis 13.92 mg/kg bobot badan
Pada jam ke-48 1 mg putih telur dalam 2 mL Evans blue 0.5% melalui intravena leher Pengambilan darah untuk analisis IgE Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya bulatan warna kebiruan
19
Lampiran 6
Prosedur penggunaan kit chemiluminescent immunometric assay IMMULITE 2000.
1. Sebelum kit digunakan, akan terlihat tampilan layar seperti terlihat pada Gambar 11 Bagian yang dipilih adalah RUN IMMULITE 2000.
Gambar 11 Tampilan awal pada layar program analisis kit. 2. Indikator status dari sistem di cek dan bagian yang digunakan sebagai tempat penyimpanan air dikosongkan 3. Pipet-pipet untuk pengambilan sampel dan reagen disiapkan terlebih dahulu dan diperiksa pula air dan substrat yang akan ditambahkan. 4. Kotak yang digunakan untuk menahan vial yang berisi alergen, Allergen Wedges, di scan menggunakan scanner. Penempatan vial alergen pada allergen wedges terlihat pada Gambar 12.
Gambar 12 Contoh penempatan vial-vial alergen pada Allergen Wedges. 5. Carousel ialah suatu tempat penahan tabung-tabung kontrol, reagen, sampel, adjustor, dan diluents. Carousel ini dicek kondisinya, setelah itu tabung yang berisi sampel, kontrol, adjustor, dan diluents dimasukkan. Contoh penempatan tabung-tabung vial pada carousel dapat dilihat pada Gambar 13.
20
Lanjutan lampiran 6
Gambar 13 Contoh penempatan tabung pada carousel. 6. Nomor akses dihubungkan dengan jenis tes yang diperintahkan 7. Jumlah Reagent Wedges dicek dan dicocokkan dengan kemasan butiran yang digunakan. Reagent Wedges mengandung konjugat enzim yang spesifik terhadap uji. Reagen ini dalam tes alergi mengandung reagen anti immunoglobulin yang digunakan untuk menguji alergi.
Gambar 14 Contoh Reagen Wedges dan kompartemennya. 8. Setelah semua pengecekan selesai dilakukan, proses pengujian otomatis sudah dapat dimulai dengan dipilih tombol RUN. 9. Butiran spesifik untuk assay dimasukkan ke dalam tabung reaksi. 10. Sampel, reagen, kontrol, dan air dipipet ke dalam kemasan butiran tersebut. 11. Tabung reaksi akan bergerak ke area inkubasi. Tabung diagitasikan pada 37ºC. 12. Tabung reaksi kemudian dicuci 13. Substrat ditambahkan dan reaksi chemiluminescent muncul, menghasilkan pendaran. 14. Jumlah pendaran yang muncul di ukur oleh Photomultiplier Tube, hasilnya dikalkulasikan dan di Print.
21
Lampiran 7 Tabel perhitungan dosis farmakologis yang digunakan
20 g Mouse
200 g Rat
1.5 kg Rabbit
2.0 kg Cat
4.0 kg Monkey
12.0 kg Dog
7.0
400 g Guinea pig 12.25
27.8
29.7
64.1
124.2
70.0 kg Man 387.9
20 g Mouse
1.0
200 g Rat
0.14
1.0
1.74
3.9
4.2
9.2
17.8
56.0
400 g Guinea pig
0.08
0.57
1.0
2.25
2.4
5.2
10.2
31.5
1.5 kg Rabbit
0.04
0.25
0.44
1.0
1.08
2.4
4.5
14.2
2.0 kg Cat
0.03
0.23
0.41
0.92
1.0
2.2
4.1
13.0
4.0 kg Monkey
0.016
0.11
0.19
0.42
0.45
1.0
1.9
6.1
12.0 kg Dog
0.008
0.06
0.10
0.22
0.24
0.52
1.0
3.1
70.0 kg Man
0.0026
0.018
0.031
0.07
0.076
0.16
0.32
1.0
(sumber: Barnes & Paget 1964)
22
Lampiran 8 Uji statistik bobot badan marmot Descriptives respon
kontrol kuersetin Total
95% Confidence Interval for Mean Test of Homogeneity of Variances N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 3 327.6667 22.50185 12.99145 271.7690 383.5644 310.00 353.00 3 308.0000 22.27106 12.85820 252.6756 363.3244 284.00 328.00 6 317.8333 22.73690 ANOVA 9.28230 293.9724 341.6942 284.00 353.00
Test of Homogeneity of Variances respon Levene Statistic .012
df1 Uji Tukey
df2
1
4
Sig. .917
ANOVA respon
Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares 580.167 2004.667 2584.833
df 1 4 5
Mean Square 580.167 501.167
F 1.158
Sig. .343
23
Lampiran 9 Uji statistik kadar IgE serum
Descriptives respon
N kontrol kuersetin Total
3 3 6
Mean Std. Deviation Std. Error 1.0000 .00000 .00000 1.0000 .00000 .00000 1.0000 .00000 .00000
95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 1.0000 1.0000 1.00 1.00 1.0000 1.0000 1.00 1.00 1.0000 1.0000 1.00 1.00
Test of Homogeneity of Variances respon Levene Statistic
df1 .
df2 1
Sig. .
.
ANOVA respon
Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares .000 .000 .000
df 1 4 5
Mean Square .000 .000
F
Sig. .
.
Lampiran 10 Kandungan nutrisi pakan formula (pelet) marmot dari indo feed Kandungan nutrisi Konsentrasi dalam pakan (%) Protein K 18 Lemak 4 Serat kasar 13 Abu 9 Protein 13 T.D.N 70 Kalsium (Ca) 0.80 Fosfat (P) 0.60
24
Lampiran 11 Data bobot badan marmot Kontrol Tanggal 1 2 25/8/2009 26/8/2009 27/8/2009 28/8/2009 29/8/2009 30/8/2009 31/8/2009 1/9/2009 2/9/2009 3/9/2009 4/9/2009 5/9/2009 6/9/2009 7/9/2009 8/9/2009 9/9/2009 10/9/2009 11/9/2009 12/9/2009 13/9/2009 14/9/2009 15/9/2009 16/9/2009 17/9/2009 18/9/2009 19/9/2009 20/9/2009
299 306 298 319 321 310 310 312 299 294 287 280 272 267 255 243 232 223 224 239 250 243 236 224 221 213 221
314 319 322 324 309 308 320 314 297 291 281 279 274 270 261 246 245 237 223 230 241 248 257 255 262 262 259
3
1
346 347 376 373 360 354 353 340 332 341 337 338 340 343 349 369 370 386 407 395 409 415 427 435 433 451 454
287 300 289 288 292 290 284 276 264 259 254 250 248 242 228 230 228 218 222 210 229 235 241 230 231 229 230
Kuersetin 2 289 291 292 298 311 311 312 310 289 281 281 274 262 253 258 257 246 238 235 237 236 255 255 264 266 275 279
3 311 321 321 330 330 329 328 325 299 300 294 288 280 271 266 252 249 249 246 248 263 264 266 261 264 266 282
25
Lanjutan lampiran 11 Tanggal 21/9/2009 22/9/2009 23/9/2009 24/9/2009 25/9/2009 26/9/2009 27/9/2009 28/9/2009 29/9/2009 30/9/2009 1/10/2009 2/10/2009 3/10/2009 4/10/2009 5/10/2009 6/10/2009 7/10/2009 8/10/2009 9/10/2009 10/10/2009 11/10/2009 12/10/2009 13/10/2009 14/10/2009 15/10/2009 16/10/2009
1 221 216 212 204 201 232 248 249 258 264 272 260 271 278 275 280 285 288 285 299 297 307 297 323 311 329
Kontrol 2 274 274 293 286 298 298 301 301 307 323 326 324 335 347 347 355 353 366 371 388 388 391 392 393 390 402
3
1
473 475 491 481 493 502 512 516 525 520 530 535 540 539 550 556 564 548 526 580 585 578 594 610 595 582
229 240 239 242 224 224 232 237 241 250 243 246 244 247 298 241 240 235 235 230 226 226 218 217 207 198
Kuersetin 2
289 292 298 306 301 292 305 300 298 293 318 276 308 321 324 334 329 341 339 341 353 350 354 366 361 359
3 303 290 312 312 289 260 296 318 323 332 330 337 340 349 353 369 366 372 382 383 383 384 391 403 400 408
