EFEK ECHINACEA TERHADAP KEMAMPUAN FAGOSITOSIS DAN KADAR NITRIC OXIDE (NO) MAKROFAG PADA ADENOKARSINOMA MAMMAE MENCIT C3H YANG MENGALAMI STRESS THE EFFECT OF ECHINACEA ON THE PHAGOCYTOSIS ABILITY AND NITRIC OXIDE (NO) LEVEL OF MACROPHAGE IN BREAST ADENOCARCINOMA OF C3H MICE IN STRESS
Tesis untuk memenuhi sebagian persyaratan mencapai derajat Sarjana S-2 dan memperoleh keahlian dalam bidang Ilmu Bedah
Barkah Fajar Riyadi
PROGRAM PASCA SARJANA MAGISTER ILMU BIOMEDIK DAN PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I ILMU BEDAH UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG 2008
Tesis
EFEK ECHINACEA TERHADAP KEMAMPUAN FAGOSITOSIS DAN KADAR NITRIC OXIDE (NO) MAKROFAG PADA ADENOKARSINOMA MAMMA MENCIT C3H YANG MENGALAMI STRESS Disusun oleh Barkah Fajar Riyadi Telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 31 Januari 2008 dan dinyatakan telah memenuhi syarat untuk diterima Menyetujui : Komisi Pembimbing Pembimbing I
dr. Djoko Handojo, SpB, SpBOnk NIP. 130 675 341
Pembimbing II
Prof.dr. Edi Dharmana, MSc, PhD, Sp.ParK
NIP. 130 529 451 Mengetahui :
Ketua Program Studi PPDS I Bedah Universitas Diponegoro
Ketua Program Studi Magister Ilmu Biomedik Program Pasca Sarjana Universitas Diponegoro
dr. Sidharta Darsojono, SpB, SpU NIP. 131 757 921
Prof. dr. Soebowo, SpPA(K) NIP. 130 352 249
ii
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis ini adalah hasil pekerjaan saya sendiri dan di dalamnya tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi atau lembaga pendidikan lainnya. Pengetahuan yang diperoleh dari hasil penerbitan maupun yang belum/tidak diterbitkan, sumbernya dijelaskan di dalam tulisan dan daftar pustaka.
Semarang, 31 Januari 2008
Penulis
iii
RIWAYAT HIDUP SINGKAT
A. IDENTITAS Nama
: dr. Barkah Fajar Riyadi
NIM Magister Biomedik : G4A002004 NIM PPDS I Bedah
: G3A002004
Tempat / Tgl lahir
: Semarang, 16 Oktober 1974
Agama
: Islam
Jenis kelamin
: Laki-laki
B. Riwayat Pendidikan 1. SD Kanisius SMG
Jawa Tengah
: Lulus tahun 1987
2. SMPN 3 SMG
Jawa Tengah
: Lulus tahun 1990
3. SMA Negeri 3 SMG
Jawa Tengah
: Lulus tahun 1993
4. FK UNDIP Semarang Jawa Tengah
: Lulus tahun 2001
5. PPDS I Bedah FK UNDIP Semarang Jawa Tengah 6. Magister Ilmu Biomedik Pasca Sarjana UNDIP Semarang Jawa Tengah
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan anugerahNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul Efek Echinacea Terhadap Kemampuan Fagositosis Dan Aktifitas Nitric Oxide (No) Makrofag Pada Adenokarsinoma Mamma Mencit C3h Yang Mengalami Stress Penelitian ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar derajat sarjana S2 Ilmu Biomedik Program Pasca Sarjana dan Program Pendidikan Dokter Spesialis I Bedah Universitas Diponegoro Semarang. Penulis menyadari tugas ini tidak dapat terselesaikan dengan baik tanpa dukungan dari berbagai pihak. Kepada dr. Djoko Handojo, SpB, SpBOnk dan Prof. dr. Edi Dharmana, MSc, PhD, Sp.ParK sebagai dosen pembimbing, yang selalu memberikan dukungan moral yang tak ternilai harganya, penulis mengucapkan
terima
kasih
atas
bimbingan,
sumbangan
pikiran,
serta
kesabarannya dalam proses penyelesaian tesis ini. Dalam kesempatan ini penulis juga menghaturkan terima kasih kepada : 1. Prof. Dr. dr. Susilo Wibowo, SpAnd, Rektor Universitas Diponegoro Semarang. 2. Prof.dr.Soebowo,SpPA(K), Ketua program Studi Magister Ilmu Biomedik Program Pasca sarjana Universitas Diponegoro Semarang.
v
3. dr.
Soejoto,
SpKK(K),
Dekan
Fakultas
Kedokteran
Universitas
Diponegoro Semarang. 4. Prof. dr. H. Soebowo, SpPA(K), Ketua Program Studi Magister Ilmu Biomedik Program Pasca Sarjana Universitas Diponegoro Semarang. 5. Prof. Dr. dr. Tjahjono, SpPA(K)FIAC, Ketua Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran UNDIP / RS dr. Kariadi Semarang. 6. dr. Djoko Handojo, SpB, SpBOnk, Ketua Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro / RSUP dr. Kariadi Semarang. 7. dr. Sidharta Darsojono, SpB, SpU, Ketua Program Studi PPDS I Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang. 8. dr. Pudjadi, SU, Ketua Laboratorium Biokimia FK UNDIP Semarang 9. Tim penguji dan nara sumber yang telah dengan sabar berkenan memberi masukan, arahan dalam penelitian dan penulisan tesis ini. 10. dr. Selamat Budijitno, Msi.Med, SpB, yang memberikan waktu untuk memberikan inspirasi dan konsultasi. 11. Semua rekan sejawat Residen Ilmu Bedah FK UNDIP, pegawai Lab. Biokimia FK UNDIP, dan yang tidak dapat kami sebutkan satu per satu. 12. Ucapan terima kasih khusus kepada kedua orang tua saya yang telah memberikan dukungan moril dan materiil untuk keberhasilan studi saya. 13. Tesis ini kupersembahkan untuk anaku Alfin Shidqi. Penulis menyadari bahwa penelitian ini masih jauh dari sempurna. Kritik dan
vi
saran demi kesempurnaan penelitian ini akan diterima dangan senang hati. Penulis berharap penelitian ini dapat berguna bagi masyarakat serta memberi sumbangan bagi perkembangan ilmu kedokteran.
Semarang,31 Januari 2008
Penulis
vii
ABSTRAK
Latar belakang : Echinacea purpurea merupakan salah satu imunostimulator yang dapat meningkatkan imunitas seluler, yang telah tersedia di pasaran. Salah satu respon imunitas seluler adalah peningkatan aktifitas fagositosis makrofag dan kadar nitric oxide (NO), karena tebukti NO efektif untuk eliminasi sel-sel tumor. Tujuan dari penelitian ini membuktikan adanya perbedaan kemampuan fagositosis makrofag dan adanya perbedaan kadar NO makrofag pada mencit adenokarsinoma mamma yang diberikan Echinacea purpurea dengan yang tidak. Metoda : Dilakukan penelitian eksperimental hewan coba, desain randomized post test only controle group design. Sampel 18 ekor mencit C3H yang diinokulasi tumor, dibagi 3 kelompok yang terbagi K-P1-P2, pada P1 diberikan diberikan diet standart dan stress sedangkan P2 diberikan diet standart, Echinacea purpurea 0,195 mg/gramBB/hari dan stress. Perlakuan dilakukan selama 10 hari, kemudian dilakukan pemeriksaan kemampuan fagositosis dan kadar NO makrofag. Analisis statistik untuk uji beda semua kelompok dengan menggunakan uji One way Anova dan uji beda untuk masing-masing kelompok dengan menggunakan Post Hoc Bonferoni Test. Hasil : Didapatkan bahwa semua kelompok mempunyai perbedaan bermakna pada kemampuan fagositosis makrofag (p=0,001) dan kadar NO makrofag (p=0,004). Uji beda masing-masing kelompok pada kemampuan fagositosis makrofag terdapat perbedaan bermakna antara K (42,75 ± 6,49) dan P1 (29,83 ± 2,64) dengan nilai p=0,001 dan antara P1 (29,83 ± 2,64) dan P2 (38,17 ± 3,66) dengan nilai p=0,019. Tidak ada perbedaan bermakna antara K (42,75 ± 6,49) dengan P2 (38,17 ± 3,66) dengan nilai p=0,307 dan untuk uji beda masing-masing kolompok pada kadar NO terdapat perbedaan bermakna antara K (5,034 ± 0,274) dengan P1 (4,384 ± 0,169) dengan nilai p=0,004 dan antara P1 (4,384 ± 0,169) dan P2 (4,848 ± 0,169) dengan nilai p=0,038. Tidak terdapat perbedaan bermakna antara K(5,034 ± 0,274) dan P2 (4,848 ± 0,169) dengan nilai p=0,829 Simpulan : Terdapat perbedaan yang signifikan pada kemampuan fagositosis dan kadar NO antara makrofag mencit yang diberi echinacea purpurea daripada tanpa pemberian echinacea purpurea. Kata kunci : Echinacea purpurea, Aktifitas makrofag, Adenokarsinoma mammae.
xv
ABSTRACT
Background : Echinacea purpurea is one of the immunostimulators which already avaiable in the market that can increase cellular immunity. One of the cellular immunity respons are the enhancement of macrophage’s phagocytosis activity and the increase of nitric oxide level for killing process of tumor cells. The objectives of this study are to differentiate macrophage’s phagocytosis activity and the difference of nitric oxide level between mice, inoculated with breast adenocarcinoma, which are receive Echinacea purpurea and which are not. Methods : The design of this study with randomized post test only control group design. 18 C3H mice which was inoculated by breast adenocarcinomas were divided to 3 groups : K-P1-P2, the P1 group received standart diet and stress, whereas P2 group received standart diet, Echinacea purpurea 0,195 mg/gram/day and stress. The intervention was performed for 10 days. Statistical analysis were using one way ANOVA test and Post Hoc Bonferoni test. Results : There are significant differences in all groups for macrophage’s phagocytosis activity (p=0,001) and the macrophage’s nitric oxide level (p=0,004). There was significant difference in differential test in each group for macrophage’s phagocytosis activity between K (42,75 ± 6,49) and P1 (29,83 ± 2,64) groups with p=0,001 and between P1 (29,83 ± 2,64) and P2 (38,17 ± 3,66) groups with p=0,019. There was no significant differences K (42,75 ± 6,49) and P2 (38,17 ± 3,66) with p=0,307. The differential test for each groups for nitric oxide level between K (5,034 ± 0,274) and P1 (4,384 ± 0,169) groups and between P1 (4,384 ± 0,169) and P2 (4,848 ± 0,169) groups were significantly different (p=0,004 and p=0,038, respectively). There was no significant diffrerence between K (5,034 ± 0,274) and P2 (4,848 ± 0,169) groups with p=0,829. Conclusions : It is shown in this study for macrophage’s phagocytosis activity and the macrophage’s nitric oxide level, that the macrophage which treated mice with echinacea purpurea is significantly enhance than non treated mice Keyword : Echinacea purpurea, macrophage’s activity, breast adenocarcinoma
xvi
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................ ii PERNYATAAN ................................................................................................. iii RIWAYAT HIDUP ............................................................................................ iv KATA PENGANTAR ........................................................................................ v DAFTAR ISI ...................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xii DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiv ABSTRAK.......................................................................................................... xv ABSTRACT........................................................................................................ xvi BAB 1. Pendahuluan ......................................................................................... 1 1.1. Latar Belakang ............... .............................................................. 1 1.2. Perumusan Masalah ...... ............................................................... 4 1.3. Tujuan dan Manfaat Penelitian ..................................................... 4 1.3.1. Tujuan Umum .... .............................................................. 4 1.3.2. Tujuan Khusus .................................................................. 4 1.3.3. Manfaat Penelitian ........................................................... 5 1.4 Orisinalitas ……………………………..………………………. 6 viii
Halaman BAB 2. Tinjauan Pustaka ...................................................................................7 2.1. Adenokarsinoma mamma.............................................................. 7 2.1.1. Anatomi dan Histologi ……………………….......……… 7 2.1.2. Etiologi dan patogenesis ………....………….........……... 7 2.1.3. Klasifikasi.……...............………….………….................... 8 2.2. Respon Imunologik Terhadap Sel Tumor Ganas …….………..... 9 2.2.1. Antigen tumor …….……........................…......................... 10 2.2.2. Peran makrofag dalam respon antitumor ………......…....... 14 2.2.3. Limfosit T sebagai Efektor anti tumor ……….….…..…..... 15 2.2.4. Makrofag teraktivasi .............................................................18 2.3. Nitric Oxide (NO)...........................................................................22 2.4. Pengaruh Stress Terhadap Respon Imunitas Seluler .....................24 2.5. Echinacea sp Sebagai Imunostimulator ....................................... 29 2.5.1. Latar belakang echinacea ..................................................... 29 2.5.2.Farmakologi .......................................................................... 30 2.5.3. Mekanisme ........................................................................... 31 2.5.4. Hasil-hasil penelitian echinacea .......................................... 32 2.5.5. Keamanan dan kemanjuran Echinacea ............................... 33 2.5.6. Dosis .................................................................................... 37 BAB 3. Kerangka Teori, Kerangka Konsep dan Hipotesis ……...….….……... 38 3.1 Kerangka Teori ……….……...………………….……....……... 38 ix
3.2 Kerangka Konsep ……….……...…............……….…………... 38 3.3 Hipotesis Penelitian ……….……...………………….……….... 39 BAB 4 . Metode Penelitian ……….……...………………….……....……........ 40 4.1 Rancangan Penelitian ……….……...………………..….…….... 40 4.2 Populasi Dan Sampel ................…….……...……………….….. 41 4.2.1. Populasi ................................................................................ 41 4.2.2. Sampel ..................................................................................41 4.3 Variabel Penelitian .…...….......………………….……....……... 42 4.3.1. Variabel bebas ..................................................................... 42 4.3.2. Variabel tergantung ............................................................. 42 4.4 Definisi Operasional ….…....…...………………….……....….. 42 4.5 Bahan dan alat ...................…...……...………………….…….... 44 4.6. Alat / Instrumen Penelitian ........................................................... 46 4.7. Tempat Penelitian .....................…….……...………………….... 46 4.8. Prosedur Pengumpulan Data ..……….……...…….……....……...46 4.9. Alur Kerja .............................…….……...……….……....……... 48 4.10. Analisis Data ..............……….……...………….……....……... 48 4.11. Persyaratan Etik ……….…….....………….……....……........... 49 BAB 5. Hasil ................................................................................................... 50 5.1. Kemampuan fagositosis makrofag dan produksi NO makrofag ................................................................. 50 5.2. Uji Statistik ....................................................................................51 x
BAB 6. Pembahasan .......................................................................................... 56 BAB 7. Simpulan dan Saran ............................................................................. 61 7.1. Simpulan ....................................................................................... 61 7.2. Saran ..............................................................................................61 Daftar Pustaka .................................................................................................... 62 Lampiran ............................................................................................................. 67
xi
GAMBAR Halaman Gambar-1. Reaksi immune T-Cell mediated..................................................... 17 Gambar-2. Tahapan sitolitik sel target oleh CTLs ............................................. 18 Gambar-3. Molekul NO ………………………………………………………. 21 Gambar-4. Reaksi kimia terbentuknya Nitric Oxide (NO)................................. 23 Gambar-5. Mekanisme yang terjadi pada stress dan sistem imun...................... 25 Gambar-6. Fungsi sel-sel Th1 ............................................................................ 28 Gambar-7. Fungsi sel-sel Th2 ............................................................................. 28 Gambar-8. Grafik boxplot kemampuan fagositosis Makrofag .......................... 50 Gambar-9. Grafik boxplot kadar NO .................................................................. 51 Gambar-10. Hasil Post Hoc test kemampuan fagositosis makrofag dengan menggunakan uji Bonferroni .............................................................................. 53 Gambar-11. Hasil Post Hoc test produksi NO makrofag dengan menggunakan uji bonferroni................................................................................... 54 Gambar-12. Diagram skematik hasil penelitian...................................................55 Gambar-13 Mekanisme yang terjadi pada stress dan sistem imun ......................57 Gambar-14 Mekanisme yang terjadi pada stress dan sistem imun ......................58
xii
DAFTAR TABEL Halaman Tabel-1. Tumor antigen yang menstimulasi respon sel-T................................... 11 Tabel-2. Nilai rata-rata hasil penghitungan kemampuan fagositosis makrofag dan produksi NO makrofag pada tiap kelompok percobaan...................... 50 Tabel-3. Uji normalitas data kemampuan fagositosis makrofag pada tiap kelompok percobaan ............................................................................ 52 Tabel-4. Uji normalitas data produksi NO makrofag pada tiap kelompok percobaan ..............................................................................................52
xiii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran Prosedur Trasplantasi Tumor .............................................................. 67 Lampiran Prosedur Pengambilan Sampel Dari Hewan Percobaan ...................... 68 Lampiran Prosedur Pemeriksaan NO .................................................................. 69 Lampiran Prosedur Pemeriksaan Fagositosis Makrofag dengan Latex Beads .....71 Lampiran bentuk makrofag yang memfagosit latex beads dan yang tidak ...........73 Lampiran ethical clearance ...................................................................................74 Lampiran Data Penelitian.......................................................................................75
Xiv
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. LATAR BELAKANG Tumor ganas payudara merupakan keganasan yang sering ditemukan diseluruh dunia, dengan insidensi relatif tinggi yaitu sebesar 20% dari seluruh keganasan. Sekitar 600.000 kasus baru setiap tahunnya dan 250.000 kasus diantaranya ditemukan di negara berkembang, sedangkan 350.000 kasus lainnya ditemukan dinegara maju 1. Di Amerika pada tahun 2003 ditemukan 180.000 kasus baru per tahun 1, sedangkan pada tahun 2005 di Amerika ditemukan 211.240 kasus baru dengan jumlah kematian 40.410 wanita per tahun 2.Insiden tumor ganas payudara di Amerika adalah 100 per 100.000 penduduk per tahun3. Di Asia secara keseluruhan insidennya 20 per 100.000 penduduk per tahun 3
. Di Indonesia, insiden tumor ganas payudara adalah 100 per 100.000 penduduk,
dan menempati urutan kedua jumlah tumor ganas terbanyak (11% dari jumlah seluruh tumor ganas di Indonesia) setelah tumor ganas leher rahim 4. Data dari BRK-IAPI (Badan Registrasi Kanker Ikatan Ahli Patologi Indonesia) 1994 menunjukkan bahwa persentase tumor ganas payudara wanita menduduki urutan kedua tertinggi (11,77%) setelah tumor ganas rahim (17,70%) dari semua kasus tumor ganas di seluruh senter Patologi Anatomi di Indonesia5. Di Jawa Tengah pada tahun 2005 ditemukan sebanyak 3.884 kasus (36,83%) dari keseluruhan kasus tumor ganas dan merupakan urutan kedua setelah tumor ganas leher rahim. Sedangkan di Semarang pada tahun 2005, ditemukan tumor ganas payudara
sebanyak 749 kasus atau 19,62% dari keseluruhan kasus tumor ganas payudara di Jawa Tengah dan menempati urutan pertama6. Insiden puncak pada kelompok umur 45-54 tahun 7. Data dari Departemen Kesehatan RI hasil survei kesehatan rumah tangga (SKRT) menunjukkan bahwa angka kematian karena tumor ganas payudara meningkat yaitu pada tahun 1972: 1,4%, tahun 1980:3,4% tahun 1986: 4,3%, dan tahun 1992:4,4% 8. Penyakit tumor ganas umumnya dipandang oleh masyarakat sebagai penyakit yang tidak dapat disembuhkan dan berakhir dengan kematian disertai dengan penderitaan hebat. Asumsi masyarakat yang demikian ini akan sangat menimbulkan stress bagi penderitanya. Stress sangat berpengaruh terhadap imunitas tubuh melalui stimulasi sekresi kortisol dan adrenalin dari korteks dan medula adrenal. Juga berpengaruh terhadap pelepasan noradrenalin dari postganglion simpatik terminal saraf di pembuluh darah dan organ lymfoid. Efek sistemik dari glukokortikoid dan katekolamin ini akan menghambat produksi Interleukin-12 (IL-12) dan penurunan produksi Interferon-γ (IFN-γ) oleh monosit sehingga akan terjadi penurunan respon imun seluler [terutama makrofag, sitotoksik T-limfosit (CTL), dan sel-NK (=Natural Killer)] yang sangat penting untuk immunitas terhadap sel tumor ganas. 9 Aktifitas makrofag selain sebagai APC adalah sebagai efektor imun seluler yaitu dengan kemampuan fagositosis dan memproses sel tumor.
Mekanisme
killing terhadap sel tumor adalah dengan proses oksidasi di dalam sel dengan pembentukan Reactive Oxygen Species (ROS) melalui jalur Reactive Oxygen Intermediates (ROI).10 Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADPH)
oksidase akan mengkatalisis molekul oksigen menjadi O2- (Superoksida) yang dapat dimetabolisir menjadi ROI seperti H2O2 yang sangat toksik. Dilain pihak iNOS akan mengkatalisis L-arginin menjadi sitrulin dan membentuk Nitric Oxide (NO) yang selanjutnya dapat dimetabolisir menjadi Reactive Nitrogen Intermediate (RNI).11
Pada suatu penelitian memperlihatkan bahwa tingkat
ekspresi yang tinggi dari iNOS dapat sebagai sitostatika atau sitotoksik terhadap sel tumor adenokarsinoma. Sinergi ROI dan RNI dapat membentuk spesies antimikroba yang lebih toksik. Sebagai contoh NO yang bereaksi dengan singlet O2 membentuk peroksinitrit (ONOO-) suatu oksidan yang dapat merusak lipid, protein, dan DNA bakteri serta mempunyai peran dalam killing sel tumor. Aktifitas makrofag dapat diukur dengan kemampuan fagositosis dan pengukuran kadar Nitric Oxyde (NO) makrofag. 11,12 Salah satu imunostimulator adalah Echinacea sp yang dapat meningkatkan respon imunitas seluler, telah tersedia di pasaran baik dalam bentuk suplemen yang dapat diperoleh dengan mudah. Echinacea sp dapat memacu makrofag untuk menghasilkan sitokin yang akan membantu regulasi sistem imun. Kultur makrofag yang mendapat stimulasi echinacea sp menunjukkan efek antiviral dibandingkan dengan yang tidak distimulasi.10 Sitokin yang dihasilkan makrofag darah perifer mencit yang mendapat Echinacea purpurea akan mengaktifasi sel T helper untuk berproliferasi. Dilaporkan juga bahwa aktifasi makrofag yang berhubungan dengan aktifasi limfosit T akan meningkatkan produksi IFN-γ.9,13 Belum ditemukan adanya suatu penelitian yang menganalisa efek pemberian Echinacea sp pada penderita adenokarsinoma mamma. Oleh karena hal tersebut belum
pernah dicobakan ke manusia, maka peneliti menggunakan mencit C3H sebagai sampel penelitian.
1.2. RUMUSAN MASALAH Melihat hal-hal tersebut diatas, penelitian ini berusaha menjawab beberapa masalah : 1.2.1. Apakah akan terjadi perbedaan kemampuan fagositosis makrofag pada kelompok mencit adenokarsinoma mamma C3H yang mendapatkan stress, antara yang diberi Echinacea sp dan yang tidak? 1.2.2. Apakah akan terjadi perbedaan kadar NO makrofag pada kelompok mencit adenokarsinoma mamma C3H yang mendapatkan stress, antara yang diberi Echinacea sp dan yang tidak?
1.3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 1.3.1. TUJUAN UMUM Membuktikan bahwa echinacea sp efektif dalam upaya meningkatkan respon immun pada penderita tumor ganas yang mengalami stress.
1.3.2. TUJUAN KHUSUS 1.2.1. Membuktikan adanya perbedaan kemampuan fagositosis makrofag pada kelompok mencit adenokarsinoma mamma C3H yang mendapatkan stress, antara yang diberi Echinacea sp dan yang tidak.
1.2.2. Membuktikan adanya perbedaan kadar NO makrofag pada kelompok mencit adenokarsinoma mamma C3H yang mendapatkan stress, antara yang diberi Echinacea sp dan yang tidak.
1.3.3. MANFAAT PENELITIAN Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi bahan informasi mengenai pentingnya penggunaan imunostimulator pada penderita tumor ganas terutama yang mengalami stress sehingga tidak akan menimbulkan dampak lebih lanjut dengan menurunnya sistem kekebalan seluler yang pada akhirnya akan mempercepat pertumbuhan tumor. Penelitian ini juga bermaksud memberikan alternatif dalam upaya menanggulangi efek negatif berupa penurunan respon imunitas seluler tersebut dengan memberikan echinacea sp pada penderita tumor ganas terutama yang mengalami stress. Penelitian ini diharapkan juga dapat memberikan landasan untuk penelitian lebih lanjut pada manusia.
1.4. ORISINALITAS Penulis
Judul / penerbit
Hasil
Burger R, Torres A, Warren R, Caldwell V, Hughes B.
Echinacea-induced cytokine production by human macrophages. Int J Immunopharmacol. 1997; 19(7): 371-9.
Echinacea sp dapat meningkatkan kemampuan fagositosis makrofag alveoler. Disamping itu juga didapatkan
Mishima S, Saito K, Maruyama H, Inoue M, Yamashita T, Ishida T, Gu Y. See D, Broumand N, Sahl L, Tilles J.
Bratman S, Kroll D.
Antioxidant and immuno-enhancing effects of Echinacea purpurea. Biol Pharm Bull. 2004;27(7):1004-9 In vitro effects of echinacea sp and ginseng on natural killer and anti-bodydependent cell cytotoxicity in healthy subjects and chronic fatigue syndrome or AIDS patients. Immunopharmacology. Jan 1997; 35(3): 229-35 Natural Health Bible. Prima Publishing. 1999: 179-81.
Currier NL, Miller Natural Killer cells from aging mice treated with SC.
Goel V, Chang C, Slama J, Barton R, Bauer R, Gahler R, Basu T.
extracts from echinacea sp purpurea are quantitatively and functionally rejuvenated. Exp Gerontil. 2000 Aug;35(5): 627-39 Echinacea sp stimulates macrophage function in lung and spleen of normal rats. J Nutr Biochem. 2002;13(8):487
peningkatan TNF-α, interferonγ dan pelepasan Nitric Oxide (NO) makrofag alveoler yang dirangsang dengan Lipopolisakarida (LPS) 10. Kultur makrofag yang mendapat stimulasi echinacea sp menunjukkan efek antiviral dibandingkan dengan yang tidak distimulasi 13. Ekstrak echinacea sp secara nyata akan meningkatkan fungsi imun yang imunitas selulernya tertekan seperti pada AIDS 14.
Penelitian klinis double blind terhadap 120 orang common cold yang mendapat echinacea sp dibanding plasebo didapatkan perbaikan klinisnya lebih cepat pada kelompok yang mendapatkan echinacea sp 15. E.purpurea dengan komponenkomponen fitokimianya dapat merangsang produksi sel-sel NK demikian juga fungsi sitolitiknya pada binatang coba yang mengalami penuaan 16. Echinacea purpurea lebih meningkatkan sistem imunologis subset CD4+ dan CD8+ dibanding sel-sel T helper dan sel T supresor sebagaimana hasil penelitiannya dan ini menunjukkan adanya peningkatan respon imunitas seluler 17.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1. ADENOKARSINOMA MAMMAE 2.1.1. Anatomi dan Histologi Kelenjar ini khas untuk golongan mamalia. Jumlah kelenjar berbeda tergantung jenis spesies. Kelenjar payudara dewasa terletak diantara lapisan luar dan dalam fasia pektoralis superfisialis dinding dada depan, berada pada celah iga depan ke dua sampai ke tujuh. Kelenjar payudara merupakan kelenjar tubuloalveolar terdiri atas 15 – 25 lobus yang berfungsi mengeluarkan air susu. Setiap lobus terpisah oleh jaringan ikat padat dan banyak jaringan lemak yang sesungguhnya merupakan kelenjar itu sendiri dengan saluran laktiferus ekskretorius.18,19
2.1.2. Etiologi dan patogenesis Ada 3 pengaruh penting pada tumor ganas payudara : a. Faktor genetik Faktor turunan pada suatu keluarga yang terkena tumor ganas payudara. Kelainan ini diketahui terletak dilokus kecil di kromosom 17q21 pada tumor ganas payudara yang timbul saat usia muda . b. Jenis kelamin. Tumor payudara umumnya diderita oleh jenis kelamin wanita. Akan tetapi bisa juga ditemukan pada laki-laki dengan insiden yang sangat kecil. c. Hormon
Kelebihan hormon estrogen endogen atau lebih tepatnya terjadi ketidak seimbangan hormon terlihat sangat jelas pada tumor ganas payudara. d. Faktor lingkungan Pengaruh lingkungan diduga karena berbagai faktor antara lain: alkohol, diet tinggi lemak, kecanduan minum kopi, dan infeksi virus.Hal tersebut mungkin mempengaruhi gen supresi tumor dari tumor ganas payudara18,20. e. Umur Usia saat menarche yang terlalu awal atau kurang dari 11 thn, usia menopause lebih dari 55 tahun dan usia saat kehamilan anak pertama lebih dari 30 tahun merupakan faktor-faktor resiko tumor payudara yang berhubungan dengan usia.
2.1.3. Klasifikasi Berdasarkan gambaran histologis, WHO membuat klasifikasi tumor ganas payudara sebagai berikut. a. Tumor ganas Payudara Non Invasif 1. Karsinoma intraduktus non invasif 2. Karsinoma lobular in situ b. Tumor ganas Payudara Invasif 1. Karsinoma duktus invasif 2. Karsinoma lobular invasif 3. Karsinoma musinosum 4. Karsinoma meduler 5. Karsinoma papiler invasif 6. Karsinoma tubuler 7. Karsinoma adenokistik
8. Karsinoma apokrin 18-20 Berdasarkan gambaran gejala klinik, Klasifikasi TNM menurut International Union Against Cancer (UICC ) 21 Apabila dilihat dari derajat histologi, adenokarsinoma payudara menurut "Nottingham Modification of The Bloom- Richardson System" 18-20,22
2.2. RESPON IMUNOLOGIK TERHADAP SEL TUMOR GANAS Respon imun merupakan hasil Interaksi antara antigen dengan sel-sel imunokompeten, termasuk mediator-mediator yang dihasilkannya. Limfosit merupakan
unit dasar terbentuknya respon imun karena selain mampu
berdiferensiasi menjadi seri lainnya, juga karena berperan dalam mengenal sekaligus bereaksi dengan antigen. Limfosit T dapat bertindak sebagai efektor dalam respon imun, tetapi dapat pula bertindak sebagai regulator respon imun karena kemampuannya dalam mempengaruhi aktifitas sel imunokompeten lainnya melalui limfokin yang dilepaskannya. Limfosit T-helper (Th) akan mempengaruhi produksi imunoglobulin oleh limfosit B. Setelah limfosit B berkontak dengan antigen kemudian berproliferasi, sebagian berdiferensiasi menjadi sel plasma yang berfungsi mensintesis serta mensekresi imunoglobulin, dan sebagian lagi menjadi limfosit B memori. 23-29 Induksi limfosit T dalam respon imun hampir selalu bersifat makrofag “dependent”. Makrofag berfungsi untuk memproses imunogen dan menyajikannya – sebagai Antigen Presenting Cells (APC) – ke limfosit T spesifik (immune T cells). Pada penelitian in vitro dapat terjadi ikatan limfosit T dengan makrofag. 2329
2.2.1. Antigen tumor Meski tumor ganas berasal dari jaringan tubuh sendiri, ada beberapa sel tumor yang dapat mengekspresikan molekul yang akan dikenali oleh lymphosit B dan T sebagai benda asing. Protein asing pada permukaan sel tumor ganas juga menjadi target sel NK. Sedangkan antigen tumor dapat dikelompokkan menjadi : - Tumor-specific antigens (TSAs)
-
Adalah tumor antigen yang diekspresikan oleh sel tumor ganas tetapi tidak diekspresikan oleh sel-sel normal. Dan bila antigen ini karakteristik untuk satu jenis tumor / satu clone tumor disebut Unique tumor antigen. Tumor-associated antigens (TAAs)
Bila tumor antigen juga diekspresikan oleh jaringan normal di dalam tubuh, antigen ini juga dapat menginduksi respon imun tubuh, tetapi biasanya tidak. Antigen tumor biasanya diekspresikan bersama Major Histocompatibility Complex kelas I (MHC kelas I) yang akan dikenali oleh sel limphosit T CD8. Jadi sel tumor sendiri dapat menjadi Antigen Presenting Cells (APCs) dari antigennya sendiri. Dan apabila protein antigen ini terlepas ke medium ekstraseluler bersama sel tumor yang mati atau sel tumor yang utuh akan diendositosis oleh APCs dan diekspresikan sebagai MHC tipe II yang akan dikenali oleh limphosit T Helper CD4. 23-29 Antigen tumor yang diekspresikan bisa berasal dari anomali sintesa protein maupun anomali dari sintesa protein tumor supressor pada sel maligna. Beberapa tumor antigen yang menstimulasi respon sel-T antara lain dapat dilihat pada tabel-1. Tabel-1. Tumor antigen yang menstimulasi respon sel-T.23 Kategori Produk Onkogen
Produk dari gen tumor-supressor yang mengalami mutasi Produk dari gen virus yang berkaitan dengan keganasan
Contoh p21ras protein (10% karsinoma pada manusia) p210 (chronic myelogenous leukemia) HER-2/neu, merupakan over ekspresi dari gen normal (karsinoma mamma) p53 (≈ 50% ca mamma pada manusia) SV40T antigen HPV E6 dan E7 (karsinoma serviks pada manusia) EBNA-1 (limphoma Burkitt’s, dan karsinoma nasofaring)
Respon Imun pada dasarnya terdiri dari tiga fase : a. Fase Kognitif Fase kognitif dari respon imun terdiri dari pengikatan imunogen ke reseptor spesifik dari limfosit
mature yang terjadi sebelum stimulasi
imunogenik. Limfosit B memiliki molekul antibodi pada permukaannya yang
dapat mengikat protein, polisakarida, atau lipid. Sedangkan limfosit T hanya mengenal peptida yang berikatan dengan MHC pada permukaan sel penyaji. Respon imun diawali dengan peristiwa masuknya imunogen dan penyajian imunogen tersebut ke reseptor dari limfosit. b. Fase Aktifasi Fase aktifasi dari respon imun merupakan rangkaian kejadian dimana limfosit terinduksi sebagai konsekuensi dari pengenalan terhadap imunogen spesifik. Limfosit mengalami dua perubahan utama dalam respons terhadap imunogen. Pertama,
limfosit spesifik berproliferasi sehingga jumlahnya
bertambah. Kedua, limfosit tersebut berdiferensiasi menjadi sel yang berfungsi mengeliminasi imunogen asing.10 Interaksi makrofag yang menyajikan imunogen dengan limfosit T spesifik mengakibatkan makrofag mensekresikan IL-1 yang menstimulasi limfosit T helper sehingga menghasilkan IL-2. Limfosit T helper berproliferasi sebagai respons terhadap IL-2 tersebut. Limfosit T helper tersebut juga menghasilkan interleukin lain yang dapat menginduksi berbagai sel lain seperti limfosit B, makrofag, prekursor limfosit T sitotoksik, dan sel endotelial. c. Fase Efektor Fase Efektor dari respons imun adalah tahap pada waktu limfosit telah teraktifkan oleh Imunogen dan dalam keadaan yang dapat berfungsi mengeliminasi imunogen tersebut. Pada fase Efektor, imunogen tidak lagi berperan kecuali sebagai suatu target untuk dihancurkan
23-29
Fungsi sistem
imun adalah fungsi protektif dengan mengenal dan menghancurkan sel-sel
abnormal itu sebelum berkembang menjadi tumor atau membunuhnya kalau tumor itu sudah tumbuh. Peran sistem imun ini disebut immune surverillance, oleh karena itu maka sel-sel Efektor seperti limfosit B, T-sitotoksik dan sel NK harus mampu mengenal antigen tumor dan memperantarai/menyebabkan kematian sel-sel tumor. 23-29 Dari beberapa penelitian diperoleh yang mendukung bahwa peran sistem imun dalam melawan tumor ganas, diantaranya yang mendukung teori itu adalah: 1) Banyak tumor mengandung infiltrasi sel-sel mononuklear yang terdiri atas sel T, Sel NK dan Makrofag; 2) Tumor dapat mengalami regresi secara spontan; 3) Tumor lebih sering berkembang pada individu dengan imunodefisiensi atau bila fungsi sistem imun tidak efektif; bahkan imunosupresi seringkali mendahului pertumbuhan tumor; 4) Dilain fihak tumor seringkali menyebabkan imunosupresi pada penderita. Bukti lain yang juga mendukung bahwa tumor dapat merangsang sistem imun adalah ditemukannya limfosit berproliferasi dalam kelenjar getah bening yang merupakan draining sites dari pertumbuhan tumor disertai peningkatan ekspresi MHC dan Interselluler adhesion molecule (ICAM) yang mengindikasikan sistem imun yang aktif. Sebukan limfosit disekitar sel tumor secara histologik mempunyai nilai prognostik yang baik karena kecepatan pertumbuhan sel tumor akan menurun. Secara invitro, beberapa sel imun disekitar sel tumor terbukti dapat membunuh sel tumor disekelilingnya 26,30. Hubungan antara banyaknya limfosit yang ditemukan diantara kelompok sel tumor secara histologi dengan prognosis penderita telah ditunjukkan pada tumor ganas leher rahim.31 Sel imun yang berada disekitar sel tumor yang berperan dalam perondaan terhadap tumor adalah limfosit T sitotoksik (CTL), Sel NK (Natural Killer) dan
makrofag. Setelah mengenal sel tumor sebagai sel asing, ketiga sel imun tersebut akan menghancurkan sel tumor Sel CTL dan sel NK melakukan cara sitotoksisitas yang sama yaitu dengan mengeluarkan perforin, sedangkan makrofag menggunakan cara fagositosis 10,20,27. Dalam memproses antigen tumor in vivo akan melibatkan baik respon imun humoral maupun seluler. Sampai saat ini belum ada bukti antibodi secara sendiri dapat menghambat perkembangan / pertumbuhan sel tumor. Dengan demikian respon imun humoral dalam bentuk antibodi terhadap tumor selalu memerlukan bantuan efektor imun seluler 10,20,26. Komponen efektor pada sistem imun yang memiliki kemampuan bereaksi dengan sel tumor ialah limfosit T, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), sel NK dan makrofag. 23-29
2.2.2. Peran makrofag dalam respon antitumor. Makrofag juga berperan dalam pertahanan melawan sel tumor baik bertindak sebagai APC dalam mengolah dan mempresentasikan antigen tumor kepada sel T helper, maupun bertindak langsung sebagai efektor dengan melisiskan sel tumor. Makrofag yang berperan dalam mekanisme tersebut adalah makrofag aktif yaitu makrofag yang telah diaktifasi oleh Macrofag Activating Factors (MAF), suatu sitokin yang dihasilkan limfosit T yang distimulasi antigen. Makrofag yang tidak aktif telah dibuktikan tidak memiliki kemampuan melisis sel tumor. Seperti juga pada sel NK, mekanisme pengenalan sel tumor sasaran oleh makrofag juga belum jelas. Sedangkan kemampuan untuk berikatan dengan sel tumor terjadi karena sel makrofag juga memiliki reseptor Fc dari IgG, sehingga dapat bekerja sama dengan IgG dalam melisiskan sel tumor. Penyebab terjadinya lisis sel tumor disebabkan oleh pengaruh enzim lisosomal, metabolit yang reaktif terhadap oksigen dan NO. Makrofag aktif juga mensekresi sitokin antara lain IL12 dan Tumor Necrosis Factor (TNF). IL-12 berperan memacu proliferasi dan aktifasi sel T CD4+, sel T CD8+ serta sel NK. TNF, sesuai namanya mampu melisis sel tumor melalui cara : 1) TNF berikatan dengan reseptor permukaan dari sel tumor dan secara langsung melisis sel tumor, 2) TNF dapat menyebabkan apoptosis dari sel tumor dengan cara memobilisasi berbagai respon imun tubuh. 2329
2.2.3. Limfosit T sebagai Efektor anti tumor
Subpopulasi limfosit T, limfosit T-helper dan T- sitotoksik sama-sama berperan dalam mengeliminasi antigen tumor. Sel yang mengandung antigen tumor akan mengekspresikan antigennya bersama molekul MHC kelas I yang kemudian membentuk komplek melalui TCR (T-cell Receptor) dari sel T-sitotoksik (CD8), mengaktifasi sel T-sitotoksik untuk menghancurkan sel tumor tersebut. Sebagian kecil dari sel tumor juga mengekspresikan antigen tumor bersama molekul MHC kelas II, sehingga dapat dikenali dan membentuk komplek dengan limfosit T-helper (CD4) dan mengaktifasi sel T-helper terutama subset Th1 untuk mensekresi limfokin IFN-γ dan TNF-α di mana keduanya akan merangsang sel tumor untuk lebih banyak lagi mengekspresikan molekul MHC kelas I, sehingga akan lebih mengoptimalkan sitotoksisitas dari sel T-sitotoksik (CD8). 23-29 Pada banyak penelitian terbukti bahwa sebagian besar sel efektor yang berperan dalam mekanisme anti tumor adalah sel T CD8, yang secara fenotip dan fungsional identik dengan CTL yang berperan dalam pembunuhan sel yang terinfeksi virus atau sel alogenik. CTL dapat melakukan fungsi surveillance dengan mengenal dan membunuh sel-sel potensial ganas yang mengekspresikan peptida yang berasal dari protein seluler mutant atau protein virus onkogenik yang dipresentasikan oleh molekul MHC kelas I. Limfosit T yang menginfiltrasi jaringan tumor (Tumor Infiltrating Lymphocyte = TIL) juga mengandung sel CTL yang memiliki kemampuan melisiskan sel tumor. Walaupun respon CTL mungkin tidak efektif untuk menghancurkan tumor, peningkatan respon CTL merupakan cara pendekatan terapi antitumor yang menjanjikan dimasa mendatang. Sel T CD4+ pada umumnya tidak bersifat sitotoksik bagi tumor, tetapi sel-sel itu dapat berperan dalam respon antitumor dengan memproduksi berbagai sitokin yang diperlukan untuk perkembangan sel-sel CTL menjadi sel Efektor. Di samping itu sel T CD4+ yang diaktifasi oleh antigen tumor dapat mensekresi TNF dan IFNγ yang mampu meningkatkan ekspresi molekul MHC kelas I dan sensitivitas tumor terhadap lisis oleh sel CTL (Gambar 1). Beberapa tumor yang antigennya diekspresikan bersama dengan MHC kelas II dapat mengaktifasi sel CD4+ spesifik tumor secara langsung, yang lebih sering terjadi adalah bahwa APC professional yang mengekspresikan molekul MHC kelas II memfagositosis, memproses dan menampilkan protein yang berasal dari se-sel tumor yang mati kepada sel T CD4+, sehingga terjadi aktifasi sel-sel tersebut. Proses sitolitik CTLs terhadap sel target dengan mengaktifkan penggunaan enzim Perforin dan Granzym, ada beberapa langkah proses sitolitik CTLs terhadap sel target. 2329 (Gambar 2)
Gambar 1. Reaksi immune T-Cell mediated 25.
Gambar 2. Tahapan sitolitik sel target oleh CTLs 26.
2.2.4. Makrofag teraktifasi Proses pengaktifan makrofag bukanlah proses tunggal. Untuk melihat apakah makrofag teraktifasi maka dilakukan pengukuran tertentu misalnya kemampuan killing terhadap mikroba. Pengukuran lain misalnya adalah kemampuan killing terhadap sel tumor. Aktifasi makrofag diakibatkan adanya peningkatan transkripsi gen-gen. Karena adanya peningkatan ekspresi gen-gen
tersebut maka makrofag dapat melakukan fungsi yang tidak dapat dilakukan oleh sel yang sama dalam keadaan istirahat. Fungsi tersebut antara lain adalah killing bakteria yang sudah difagositosis. Sitokin aktifator makrofag yang poten adalah IFN-γ. IFN-γ bukanlah satu-satunya sitokin yang mengaktifasi makrofag, tetapi makrofag juga diaktifkan oleh kontak dengan limfosit T melalui CD 40. Beberapa ciri yang menunjukkan makrofag teraktifasi diuraikan sebagai berikut: 1. Makrofag teraktifasi akan meningkat kemampuan Killing-nya terhadap mikroorganisme. Killing terhadap bakteria menyangkut proses fagosistosis dan pembentukan Reactive Oxygen Species (ROS). Sitokin seperti IFN-γ akan meningkatkan baik endositosis maupun fagositosis oleh monosit. Fagositosis terhadap partikel tertentu dapat ditingkatkan dengan opsonisasi bakteria yaitu dengan melapisi bakteria dengan molekul IgG atau komplemen. IFN-γ menyebabkan ekspresi reseptor dengan ikatan kuat terhadap bagian Fc dari IgG pada makrofag meningkat. Setelah bakteria masuk ke dalam fagolisosom sel maka makrofag akan melakukan pembunuhan dengan pembentukan Reactive Oxygen Species (ROS) melalui jalur Reactive Oxygen Intermediates (ROI). Proses killing terhadap bakteri dibedakan menjadi 2 yaitu untuk bakteri ekstraseluler dan intraseluler. Pada bakteri ekstraseluler, setelah dicerna di dalam fagolisosom dengan menggunakan ROS termasuk NO sebagai zat toksik yang berperan dalam pembunuhan bakteri. Prosesnya makrofag
ini
akan
mengenali
antigen
bakteri
tersebut
dan
mengekspresikannya ke permukaan sel makrofag bersama dengan MHC II,
yang selanjutnya akan dikenali oleh sel T-Helper CD4 yang akan mensekresikan IFN-γ, IFN-γ ini akan mengaktifasi proses pencernaan dalam fagolisosom makrofag. Sedangkan pada bakteri intraseluler, setelah masuk di dalam fagolisosom bakteri ini akan masuk ke sitoplasma makrofag dan survive di dalam sel APC tersebut, Bakteri ini akan mempengaruhi sel host untuk mensintesa protein-protein tertentu, yang merupakan antigen yang akan dipresentasikan ke permukaan makrofag bersama MHC I, MHC I ini akan dikenali oleh CTL CD8 yang selanjutnya akan dilakukan proses killing. 26 2. Makrofag teraktifasi akan memacu inflamasi akut dengan mengeluarkan mediator-mediator inflamasi. Beberapa mediator seperti Platelet Activating Factor (PAF), prostaglandin dan leukotrien adalah lipid. Beberapa disintesa oleh makrofag sendiri dan yang lainnya dihasilkan dari molekul-molekul plasma sebagai tanggapan atas enzym dan molekul-molekul terkait yang dihasilkan oleh makrofag. Sebagai contoh makrofag dapat menghasilkan tissue factor yang dapat menginisiasi clotting cascade ekstrinsik. Trombin sebagai protease darah yang terkativasi selama clotting cascade akan menyebabkan netrofil dan sel endotel mensintesa PAF. Pemberian IFN- γ akan meningkatkan kapasitas biosintesis makrofag untuk membentuk mediator semacan tissue factor. Akibat mediatormediator yang dilepaskan maka terjadilah inflamasi lokal. 3. Makrofag teraktifasi akan meningkat efisiensinya sebagai sel APC. Peningkatan kapasitas presentasi antigen berhubungan dengan ekspresi molekul MHC I maupun MHC II pada permukaaan sel makrofag setelah
mengenali/berinteraksi dengan antigen. IFN-γ diketahui
sebagai aktifator
untuk transkripsi gen-gen MHC kelas II untuk infeksi bakteri, dan MHC I untuk sel tumor dan virus. Fungsi kostimulator juga meningkat pada makrofag yang teraktifasi. Pada keadaan teraktifasi, makrofag akan mengekspresikan molekul-molekul keluarga B7 dan meningkatkan kadar ICAM-1 dan LFA-3. Pada akhirnya makrofag teraktifasi menghasilkan sitokin seperti IL-12 atau IFN-γ yang memacu diferensiasi limfosit. Apabila proses inflamasi dan aktifasi makrofag gagal mengeradikasi mikroba / tumor maka produk-produk makrofag teraktifasi yang frustrasi ini akan dapat menyebabkan reaksi hipersensitifitas tipe IV. Di mana produk ekspresi dari sitokin-sitokin makrofag tersebut akan memodifikasi lingkungan jaringan lokal, selanjutnya dimulailah
penghancuran/perusakan
jaringan
lokal
(Delayed
Type
Hypersensitifity / T-cell mediated cytolysis). 26 4. Makrofag teraktifasi akan membunuh sel-sel tumor. Meskipun makrofag teraktifasi biasanya dihubungkan dengan mekanisme efektor pada pertahanan terhadap organisme infeksius tetapi dari pengamatan didapatkan bukti bahwa makrofag teraktifasi akan membunuh sel-sel ganas. Bagaimana aktifasi makrofag oleh sel tumor belum diketahui dengan pasti. Mekanisme yang mungkin terjadi adalah adanya pengenalan secara langsung antigen permukaan sel tumor dan aktifasi makrofag dengan IFN-γ. Secara tidak langsung makrofag dapat membunuh tumor dengan berbagai mekanisme, kemungkinan sama dengan mekanisme membunuh bakteri. Mekanisme ini meliputi pelepasan enzym lisosom, Reactive Oxigen Intermediate (ROI) dan NO. Makrofag yang teraktifasi mempunyai kemampuan fagositosis dan menghasilkan NO yang akan mencerna sel-sel tumor di fagolisosom seperti pada bakteri. Bedanya fagositosis bakteri dengan tumor adalah pada ekpresi antigen di permukaan sel, di mana pada bakteri antigen-nya akan diekspresikan bersama MHC II, sedangkan pada tumor diekspresikan bersama MHC I. 26 2.3. Nitric Oxide (NO)
NO merupakan radikal bebas yang sangat reaktif. Bila bereaksi dengan oksigen akan terbentuk peroksinitrit (ONOO-). Nitric Oxide (NO) merupakan molekul yang relatif tidak stabil dan potensial menjadi reactive nitrogen species.
Gambar 3. Molekul NO.32 NO dibentuk dari biosintesa arginin dan oksigen oleh berbagai enzym Nitric Oxide Synthase (NOS) dan dengan reduksi nitrat inorganik. Reaksi biologis yang penting pada pembentukan NO adalah S-nitrosilation, ikatan kovalen dari NO terhadap thiol yang merupakan grup cysteine pada protein.32 NOS merupakan enzym yang bertanggunjawab atas sintesa NO yang berasal dari atom nitrogen terminal dari l-arginin dengan adanya oksigen dan kofaktor nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), flavin adenine dinucleotide
(FAD),
flavin
mononucleotide
(FMN),
heme,
tetrahydrobiopterin (BH4).33 NO bila terekspos oksigen akan menjadi NO2 : 2NO + O2 → 2NO2 Konversi ini diperkirakan terjadi melalui ONOONO intermediate, di mana pada reaksi ini dapat menghasilkan reactive nitrogen species seperti ONOO..32
NO juga diproduksi oleh makrofag dan netrofil, yang merupakan sarana penghancur bakteri, virus maupun sel tumor, sebagai bagian dari respon sistem imun seluler pada manusia. Konsentrasi NO dapat diperiksa dengan ELISA, di mana akan menghasilkan data dalam panjang gelombang cahaya tertentu.32 Pada suatu penelitian yang dilakukan pada sel-sel adenokarsinoma ovarium SKOV-3, ekspresi NO dapat membunuh 100% sel, sedangkan pada sel adenokarsinoma kolon manusia DLD-1 dapat membunuh 54% sel.
Gambar 4. Reaksi kimia terbentuknya Nitric Oxide (NO).32 Pada penelitian tersebut memperlihatkan bahwa tingkat ekspresi yang tinggi dari iNOS dapat sebagai sitostatika atau sitotoksik terhadap sel tumor. Nitric Oxide (NO) merupakan molekul yang relatif tidak stabil dan potensial menjadi reactive nitrogen species seperti ONOO- , dan reactive nitrogen
species ini yang mempunyai peran dalam killing sel tumor.
Aktifitas
makrofag dapat diukur dengan kemampuan fagositosis dan pengukuran kadar Nitric Oxyde (NO) makrofag. 12
2.4. PENGARUH STRESS TERHADAP RESPON IMUNITAS SELULER Stress sangat berpengaruh terhadap imunitas tubuh melalui stimulasi sekresi kortisol dan adrenalin dari korteks dan medula adrenal. Juga berpengaruh terhadap pelepasan noradrenalin dari postganglion simpatik terminal saraf di pembuluh darah dan organ lymfoid. Efek sistemik dari glukokortikoid dan katekolamin ini mempengaruhi pengaturan sitokin tipe 1 dan tipe 2. Stresss akan menurunkan produksi sitokin tipe 1 yang dibutuhkan dalam menanggapi infeksi bakterial melalui respon imunitas seluler.9 (Gambar 5)
Gambar 5. Mekanisme yang terjadi pada stress dan sistem imun9
Sel T CD4+ yang telah teraktifasi akan berdiferensiasi tergantung tipe stimulan terutama adalah sitokin yang dihasilkan pada saat pengenalan antigen. Sitokin terpenting yang dihasilkan sel Th1 pada fase efektor adalah IFN-γ. IFN-γ akan memacu aktifitas pembunuhan mikroba sel-sel fagosit dengan meningkatkan destruksi intrasel pada mikroba yang difagositosis. Jadi fungsi pokok efektor Th1 adalah adalah sebagai pertahanan infeksi dimana proses fagositosis sangat diperlukan. Th1 juga mengeluarkan IL-2 yang berfungsi sebagai faktor pertumbuhan autokrin dan memacu proliferasi dan diferensiasi sel T CD8+. Jadi Th1 berfungsi sebagai pembantu (helper) untuk pertumbuhan sel limfosit T sitotoksik yang juga meningkatkan imunitas terhadap mikroba intrasel. Sel-sel Th1 memproduksi LT yang meningkatkan pengambilan dan aktifasi netrofil.10,26 (gambar-6) Karakteristik sitokin yang dihasilkan Th2 adalah IL-4 dan IL-5. Sehingga Th2 adalah mediator untuk reaksi alergi dan pertahanan infeksi terhadap cacing dan arthropoda. Th2 juga memproduksi sitokin seperti IL-4, IL-13 dan IL-10 yang bersifat antagonis terhadap IFN-γ dan menekan aktifasi makrofag. Jadi Th2 kemungkinan berfungsi sebagai regulator fisiologis pada respon imun dengan menghambat efek yang mungkin membahayakan dari respon Th1. Pertumbuhan yang berlebihan dan tak terkontrol dari Th2 berhubungan dengan berkurangnya imunitas seluler terhadap infeksi mikroba intraseluler seperti mikobakteria 10,26.(gambar 7)
Diferensiasi Sel T CD4+ menjadi Th1 dan Th2 tergantung sitokin yang diproduksi pada saat merespon mikroba yang memacu reaksi imunitas. Beberapa bakteria intaseluler seperti
Listeria dan Mycobakteria dan
beberapa parasit seperti Leishmania menginfeksi makrofag dan makrofag merespon dengan mengeluarkan IL-12. Mikroba lain mungkin memacu produksi IL-12 secara tidak langsung. Misalnya virus dan beberapa parasit memacu sel NK untuk memproduksi IFN-γ yang memacu makrofag mengeluarkan IL-12. IL-12 berikatan dengan Sel T CD4+ sehingga memacu untuk menjadi sel Th1. IL-12 juga meningkatkan produksi IFN-γ dan aktifitas sitolitik yang dilakukan oleh sel T sitotoksik dan sel NK sehingga memacu imunitas seluler. IFN-γ yang diproduksi Th1 akan menghambat proliferasi sel Th2 sehingga meningkatkan dominasi sel Th1 10,26. Diferensiasi Sel T CD4+ menjadi Th2 dipacu oleh IL-4. Peranan IL-4 untuk memacu diferensiasi sel T CD4+ menjadi Th2
menimbulkan
pertanyaan, darimana datangnya IL-4 sebelum Th2 dipacu karena sel Th2 adalah sumber utama IL-4. Ternyata Sel T CD4+ mengeluarkan IL-4 dalam jumlah kecil pada saat aktifasi inisial. Apabila antigen bersifat persisten dan berada dalam konsentrasi tinggi maka konsentrasi lokal IL-4 perlahan-lahan akan meningkat. Jika antigen tidak memicu inflamasi dengan mengeluarkan IL-12 maka hasilnya adalah peningkatan diferensiasi Sel T ke subset Th2 dan terjadi penumpukan efektor Th2. Jadi respon terhadap parasit cacing dan alergen lingkungan yang menyebabkan bergeser ke Th2 adalah stimulasi sel T yang persisten dan berulang-ulang dengan inflamasi yang kecil atau
aktifasi makrofag. Keterangan lain yang diajukan adalah produksi IL-4 oleh tipe sel lain dan perbedaan struktur antigen atau signal yang melengkapi APC selain sitokin. Faktor genetik juga mempengaruhi bergeser ke Sel Th1 atau Th2. 10,26
Gambar 6. Fungsi sel-sel Th126
apakah akan
Gambar 7. Fungsi sel-sel Th2 26
2.5. ECHINACEA Sp SEBAGAI IMUNOSTIMULATOR. 2.5.1. Latar belakang echinacea sp Echinacea sp memegang peranan penting pada pengobatan tradisional di Amerika. Nama umumnya adalah cone flower, black susan, black sampson, Rudbeckia, Missouri snakeroot, Red sunflower, coneflower ungu dan narrowleafed coneflower. Ekstrak echinacea sp sering diresepkan sampai diperkenalkan sulfa pada tahun 1930-an. Tanaman obat ini menjadi populer lagi pada tahun 1980-an.34 Suplemen diet echinacea sp berisi ekstrak
segar bagian tumbuhan yang
berada diatas tanah dan dipanen pada musim berbunga, meskipun bagian lain tumbuhan itu telah digunakan untuk kepentingan medis. Dari 9 spesies, E.angustifolia, E.purpurea dan E.pallida sudah biasa digunakan untuk mengobati
common cold dan infeksi saluran pernafasan atas (ISPA). Meskipun sudah lama E.angustifolia diketahui mempunyai efek imunostimulasi yang besar tetapi sekarang tidak banyak digunakan.35,36,37 E.purpurea lebih mudah dibudidayakan secara komersial, sehingga merupakan spesies yang paling banyak digunakan di Amerika. Kegunaan echinacea sp adalah untuk terapi suportif common cold, infeksi traktus respiratorius kronik, pengobatan infeksi traktus urinarius bawah dan pengobatan luka superfisial bila diberikan secara eksternal. Pada percobaan manusia dan hewan, sediaan diberikan secara oral atau parenteral untuk menghasilkan efek imunostimulasi. Diantara aksi-aksi fisiologik yang lain, jumlah sel-sel darah putih meningkat, fagositosis granulosit manusia meningkat dan peningkatan temperatur tubuh.38 Aktifitas lainnya bisa bersifat antiviral, antiinflamasi, antibakterial yang secara terus-menerus dilaporkan pada percobaanpercobaan invitro. Echinacea sp telah digunakan dengan aman selama berabadabad. Echinacea sp dapat meningkatkan jumlah sel darah putih dan meningkatkan daya tahan tubuh, merangsang sel-sel killer dan menunjukkan aktifitas antiviral.39
2.5.2. Farmakologi Komponen kimia yang terdapat pada Echinacea sp meliputi karbohidrat: polisakarida (arabinogalaktan, xyloglycan, echinacin), inulin; glikosida: asam kafeat dan derivatnya (chichoric acid, echinacoside, chlorogenic acid), cynarin; alkaloids: isotussilagine, tussilagine; alkylamides (alkamides) seperti echinacein; polyacetylenes; germacrene sesquiterpene alkohol; komponen lain: glikoprotein, flavonoids, resin, asam lemak, minyak esensial, phytosterol dan mineral. Derivat
asam kafeat, cynarin, polisakarida, dan glikoprotein bersifat polar sedangkan alkylamides dan polyacetylenes bersifat lipofilik. Penelitian untuk mencari komponen aktif Echinacea sp telah dilakukan sejak lama, tetapi hasilnya masih belum pasti. Belum ada komponen fraksi polar maupun lipofilik dapat melakukan aktifitas imunomodulasi secara sendiri. Beberapa komponen seperti alkilamid, polisakarida dan glikoprotein memegang peranan sebagai “active principle”. Saat ini perhatian ditujukan pada 4 komponen sebagai bahan aktif, yaitu derivat asam kafeat, alkilamid, polisakarida dan glikoprotein. Menurut monograf dari German expert-commission BANZ No.43,1989, menyatakan press juice dari tanaman segar yang sedang berbunga telah dikenal sebagai komponen aktif
E. Purpurea yang mempunyai nilai
terapeutik, termasuk akar E, purpurea, E. pallida, dan E. angustifolia. Sampai saat ini penelitian untuk menerangkan komponen yang -biological active principlepada press juice ini belum berhasil. Hubungan antara sejumlah bahan yang telah dapat diisolasi seperti chicoric acid, polisakarida, dan arabinogalaktan diperlukan untuk menginduksi efek biologik. Karena komponen kimia yang begitu banyak terdapat pada Echinacea sp dan komposisinya berbeda-beda ditiap bagian tanaman dan tiap spesies, maka bahan aktif yang sebenarnya memiliki efek imunomodulasi belum diketahui. Banyak herbalist yang menyimpulkan bahwa efek yang muncul karena adanya interaksi diantara komponen-komponen tersebut, tetapi hal ini belum dievaluasi secara formal.40 2.5.3. Mekanisme Echinacea sp sebagai Imunostimulator
Echinacea sp mempengaruhi sistim imun terutama sistim imun non spesifik. Pemberian Echinacea sp meningkatkan respon imun fase awal dan mempercepat terjadinya respon imun adaptif. Burger A. Roger dkk melakukan percobaan secara in vitro menggunakan fresh pressed juice dan dried juice Echinacea sp dengan konsentrasi 10µg/ml-0,012 µg/ml yang dicampur dengan makrofag darah tepi manusia yang telah diisolasi dan dibandingkan dengan kelompok kontrol (endotoksin yang distimulasi dan tidak distimulasi). Dilakukan penghitungan produksi sitokin rata-rata. Dari hasilnya didapatkan bahwa kultur makrofag yang telah dicampur dengan Echinacea sp bermakna meningkatkan produksi IL-1, IL-6, IL-10 dan TNF-α (P<0,05), pada semua konsentrasi yang digunakan. Bagaimana mekanisme aktifasi sistim imun melalui jalur sitokin ini oleh Echinacea sp belum diketahui. Disamping itu Echinacea sp juga diketahui dapat mengaktifasi Natural Killer (NK) sel dan antibody-dependendent cellular cytotoxicity oleh sel mononuklear.40
2.5.4. Hasil-hasil penelitian echinacea sp Bahan aktif echinacea sp adalah echinacoside, polisakarida (echinacin), antibiotic polyacetylenes, betaine, caffec acid glycosides, inulin, isobutyl amides, minyak esensial (humulene, caryophylene), isobutyl+alkylamine, resin, flavonoid (pada akar dan batang), ester sesquiterpene (echinadiole, epoxyechinadiole, echinax-anthole dan dihydor-xynardole). Penelitian-penelitian terdahulu menunjukkan bahwa echinacea sp dapat meningkatkan produksi antibodi, jumlah dan aktifitas sel-sel darah putih sehingga dapat disimpulkan hal-hal inilah yang meningkatkan sistem kekebalan untuk
mencegah sakit.41-46 Bahkan pada salah satu buku yang berjudul “The AIDS Fighters” menyebutkan bahwa Echinacea sp mungkin dapat membantu meningkatkan sistem kekebalan tubuh yang menurun pada penderita AIDS.47 Pada tahun 1998 See D dkk. melaporkan studi fase 1 Echinacea angustifolia pada 14 pasien dengan HIV (+) yang memiliki nilai CD4 bervariasi dari 6-600/mm3 (rata-rata 269) dan jumlah virus (log 10) bervariasi dari 2,3-5,4 (rata-rata 4,68). Dari 14 partisipan ini, ada yang telah mendapatkan rejimen antiretroviral dan ada yang belum mendapatkan dalam 12 minggu terakhir. Masing-masing kemudian mendapatkan Echinaea angustifolia 1000 mg 3kali/hari selama 12 minggu. Setiap 2 minggu dilakukan penilaian terhadap jumlah virus, CD4, aktifitas sel Natural Killer (NK) terhadap sel target, penilaian klinis, dan laboratorium. Tidak ada efek hepatotoksik maupun gangguan metabolisme pada pemakaian lama baik secara klinis maupun laboratorium yang diamati selama penelitian. Pada minggu ke 12 tidak terdapat perbedaan bermakna jumlah CD4 dibandingkan nilai awal, akan tetapi terdapat penurunan jumlah virus 0,32 log 10 (rata-rata 4,36, P<0,05). Tidak ada perubahan aktifitas sel NK . Dari pilot study ini disimpulkan bahwa Echinacea angustifolia aman digunakan dan bermakna dalam menurunkan jumlah virus pada pasien dengan HIV (+).40
2.5.5. Keamanan dan kemanjuran echinacea sp Meskipun sekolah farmasi di Richmond, Virginia sudah menyatakan bahwa echinacea sp aman, namun para peneliti dalam edisi Pharmacotherapy pada bulan Juni 2000 menegaskan lagi bahwa echinacea sp aman untuk
digunakan. Pasien-pasien tanpa kontraindikasi tidak perlu dicegah bila akan menggunakan sediaan echinacea sp untuk mengobati commom cold.48 Penelitian RCT double blinded tahun 1999 juga mendukung kemanjuran dan keamanan echinacea sp. Para peneliti Jerman meneliti 238 kasus common cold. Pasien –pasien diberi echinacea sp atau plasebo selama 7 sampai 9 hari dan ditanya beratnya gejala common cold menggunakan skala yang berjumlah 10. Dokter juga memeriksa pasien di hari ke-4 dan ke-8. Pasien-pasien yang menderita sakit dalam skala sedang pada awalnya menunjukkan perbaikan sebesar 55% pada kelompok yang mendapat echinacea sp dibandingkan 27% pada kelompok plasebo. Pasien yang mendapat terapi lebih awal akan menunjukkan perbaikan yang lebih cepat, pada umumnya pada hari ke-2, dilanjutkan sampai akhir pengobatan. Semua perbaikan terlihat pada 3 hari pertama pada kelompok yang mendapat echinacea sp dan tidak ada efek serius yang dilaporkan. Para peneliti menyimpulkan bahwa echinacea sp adalah aman digunakan. Mereka juga menggarisbawahi
bahwa kegunaan terapetiknya adalah cepatnya onset
penyembuhan gejala common cold dan perlunya menggunakan echinacea sp sesegera mungkin bila gejala-gejala common cold mulai dirasakan.49 Keampuhan echinacea sp mengatasi flu sudah banyak dibuktikan. Hasil uji invitro yang dilakukan A. Vogel bekerja sama dengan tim riset dari Eidgenossishe Technishe Hochschule ( Institut Tehnologi Federal Swiss), echinacea sp mengandung senyawa alkilamid. Senyawa ini menetap dalam reseptor CB2 dari sel imun. Alkilamid membantu megendalikan TNF-α, pengaktif sistem kekebalan tubuh. Senyawa lainnya antara lain asam sikorat, polisakarida,
glikoprotein, flavonoid dan minyak esensial. Senyawa-senyawa ini berperan menghambat peradangan, pertumbuhan bakteri, virus, dan cendawan. Produk echinacea sp yang dihasilkan A.Vogel diakui pemerintah Swiss sebagai obat karena telah teruji. Pengujian dilakukan pada 77 pasien dengan influensa yang dirawat di beberapa rumah sakit di Austria. Masing-masing pasien diberi asupan ekstrak echinacea sp cair 3 kali sehari masing-masing 30 tetes. Dua pekan kemudian kondisi pasien diperiksa. Hasilnya angka indeks gejala 76 pasien menurun secara signifikan. Ini menandakan kondisi pasien semakin membaik. Seorang pasien memburuk kondisinya karena menghentikan terapinya. Echinacea sp yang diolah dalam bentuk tablet juga teruji. Saat itu A. Vogel bersama dengan dr. R. Brinkeborn, dokter spesialis penyakit infeksi di rumah sakit Uppsala, Swedia. Dari 41 pasien flu yang diberi asupan ekstrak echinacea sp berdosis 2 tablet (setara dengan 6,78 mg ekstrak echinacea sp) 3 kali sehari, 79 % pasien membaik setelah perlakuan 8 hari. 50 Di tanah air sendiri, Echinacea purpurea sebenarnya bukan pendatang baru. Pada penelitian yang dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman rempah dan aromatik (Balittro), tanaman asal Amerika Utara itu ternyata adaptif dikembangkan di Indonesia dengan ketinggian 450-1100 m diatas permukaan laut (dpl). PT. Sidomuncul menanamnya didaerah boyolali dengan ketinggian 450 dpl. Echinachea sp dipanen pada umur 3 bulan. Selain di boyolali echinacea sp juga ditanam di Tawangmangu Jawa Tengah. Kandungan purple coneflower tersebut sama dengan yang dibudidayakan di luar. Total fenol, misalnya, mencapai 4%, seperti yang dipersyaratkan Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM).
Echinacea sp selain sebagai imunostimulator juga sebagai antioksidan. Obat yang berperan sebagai antioksidan biasanya juga berkasiat sebagai hepatoprotektor. Sering dikombinasikan dengan tanaman obat lain seperti yang diproduksi oleh salah satu produsen obat, dengan komposisi Echinacea sp 150 mg, Sylibum marianum (35 mg), Curcuma xanthorium (20 mg). Perusahaan farmasi tersebut melakukan riset bekerja sama dengan baian hepatologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Penelitian dilakukan terhadap 30 pasien hepatitis C kronis. Masing-masing pasien perlakuan , kadar rata-rata SGOT pasien yang semula 91,2 u/L, turun menjadi 33,6 u/L, begitu juga dengan kadar SGPT dari 92,4 turun menjadi 35,9 u/L. Pada penelitian yang dilakukan bagian hepatologi FKUI, menuturkan obat itu tidak mengurai jumlah virus hepatitis yang bersarang ditubuh pasien. Tetapi jumlah rata-rata sel T dan sel NK pasien meningkat meskipun tidak terlalu bermakna, namun aktifitas sel NK dan Sel T merupakan indikator sistem kekebalan tubuh. Penelitian lain di Indonesia melalui uji klinis yang dilakukan terhadap 7 pasien bronkitis, 6 pasien tuberkulose, 5 pasien bronkhiektasis, 4 pasien COPD, 3 pasien Asma, dan 1 pasien bronkopneumonia di RS Pertamina, Jakarta. Setelah mendapatkan terapi echinacea sp, 76,9 % pasien menyatakan kondisi tubuhnya lebih segar, 57,7 % menjadi jarang batuk, 3,85 % nyeri dada berkurang, dan 15,4 % rongga dada membaik. 50 Keamanan penggunaan Echinacea sp selama kehamilan belum dapat dijelaskan, hanya sedikit data relevan yang menunjang. Michael Gallo dkk.
melaporkan prospective controlled study untuk menilai keamanan fetus pada penggunaan Echinacea sp selama kehamilan. Penelitian melibatkan wanita yang mengikuti Motherisk Program di Toronto, yang menggunakan Echinacea sp dalam kurun waktu 1996-1998. Wanita yang menggunakan Echinacea sp selama kehamilan (206 orang, 112 orang, (54%) menggunakan pada trimester pertama dan 17 (8%) meggunakan selama 3 trimester), dipantau secara prospektif dan dibandingkan dengan kelompok kontrol (wanita hamil yang mengikuti Motherisk Program yang tidak menggunakan Echinacea sp atau menggunakan antibiotik nonteratogenik), 206 orang. Dilakukan pembandingan terhadap kejadian malformasi mayor, minor, keguguran dan komplikasi neonatal pada kedua kelompok. Pada pembandingan antara kelompok Echinacea sp dengan kelompok kontrol didapatkan jumlah kelahiran hidup (195:198), aborsi spontan (13:7), aborsi terapeutik (1:1) dan malformasi mayor dan minor (6:7). Tidak ada perbedaan secara statistik terlihat pada kedua kelompok baik dalam keluaran kehamilan, metode persalinan, penambahan berat badan ibu, usia kehamilan, berat lahir ataupun distres fetus. Angka kejadian malformasi antara kedua kelompok juga tidak berbeda bermakna secara statistik. Disimpulkan bahwa penggunaan Echinacea sp dalam kehamilan, selama organogenesis, tidak berhubungan dengan peningkatan risiko malformasi mayor.40,51 Efek stimulasinya berubah bila digunakan berkepanjangan, seharusnya jangan digunakan secara terus-menerus selama 8 minggu. Setelah penghentian obat, bisa di restart lagi untuk pengobatan 8 minggu berikutnya.52
2.5.6. Dosis Preparat echinacea sp terdiri dari bermacam-macam bentuk sehingga dosisnya juga bervariasi. Dosis untuk berbagai jenis sediaan tersebut adalah: 53 Akar kering= 0.5 – 1.0 gram diberikan 3X sehari Tincture (1:5) = ½ - 1 sendok teh diberikan 3X sehari Ekstrak bubuk kering (standarisasi 3.5% echinacoside) = 300 mg diberikan 3X sehari Ekstrak cair (1:1) = ¼ sampai ½ sendok teh diberikan 3X sehari Freeze dried = 1 sampai 2 kapsul atau tablet diberikan 3X sehari
BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS.
3. 1. KERANGKA TEORI Echinacea
Stress dan Tumor
IFN-γ LT TNF-β
Th1
MAKROFA G Sbg APC
Limfosit T CD4+
IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-13
MHC II
IFN-γ
IL-12
Sel NK
Th2
Sel T CD8
Efek penghambatan
KEMAMPUAN FAGOSITOSIS MAKROFAG THD SEL TUMOR, VIRUS, BAKTERI DAN JAMUR
Efek Stimulasi
Diukur dengan kemampuan fagositosis dan kadar NO
3. 2. KERANGKA KONSEP Kemampuan fagositosis makrofag Mencit C3H dengan Ca Mammae dan stress
Echinacea purpurea ekstrak
Kadar Nitric Oxyde (NO) Mencit C3H dengan Ca
3. 3. HIPOTESIS
3.3.1. Akan terjadi perbedaan kemampuan fagositosis makrofag pada kelompok mencit adenokarsinoma mamma C3H yang mendapatkan stress, antara yang diberi Echinacea sp. 3.3.2. Akan terjadi
perbedaan
kadar NO makrofag pada kelompok mencit
adenokarsinoma mamma C3H yang mendapatkan stress yang diberi Echinacea sp.
BAB 4 METODE PENELITIAN
4.1. RANCANGAN PENELITIAN Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik, dengan pendekatan The Post Test – Only Control Group Design yang menggunakan binatang percobaan sebagai objek penelitian.54 Percobaan dilakukan dengan rancangan acak lengkap (Completely Randomized Design), randomsasi sederhana dilakukan mengunakan komputer. Kelompok penelitian dibagi menjadi 3 yaitu kelompok kontrol (K), Perlakuan 1 (P1), Perlakuan 2 (P2). Adapun pembagian kelompok perlakuan adalah sebagai berikut: K
:
P1 : P2 :
Kelompok kontrol, mencit yang diinokulasi sel tumor Kelompok perlakuan 1, mencit yang diinokulasi sel tumor, setelah timbul benjolan, mendapat stressor renjatan listrik. Kelompok perlakuan 2, mencit yang diinokulasi sel tumor, setelah timbul benjolan, selain mendapat stressor renjatan listrik juga mendapat ekstrak Echinacea purpurea
Skema rancangan penelitian adalah sebagai berikut: Skema rancangan penelitian adalah sebagai berikut: Inokulasi Sel tumor Tikus
-
Dikeluarkan K P1
+ 3-4
P2 Random Alokasi
† † †
4.2. POPULASI DAN SAMPEL 4.2.1. POPULASI Populasi penelitian ini adalah mencit betina strain C3H Strain ini dipilih karena selain sudah sering digunakan untuk penelitian tumor juga dapat diamati respon imunologiknya. Sedang penentuan jenis kelamin mencit yang dipakai pada penelitian ini adalah karena faktor hormonal karena tumor yang digunakan pada penelitian ini adenokarsinoma mammae.
4.2.2. SAMPEL Hewan coba adalah mencit strain C3H yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Kriteria Inklusi: a. Mencit betina b. Strain C3H c.. Berat badan 20-30 gram setelah aklimatisasi. d. Tidak ada abnormalitas anatomis yang tampak Kriteria Eksklusi: a. Tidak tumbuh tumor setelah dilakukan inokulasi b. Selama inokulasi dan perlakuan mencit tampak sakit (gerakan tidak aktif) Besar sampel menurut WHO tiap kelompok minimal 5 ekor, dengan cadangan 1 ekor 55, pada penelitian ini jumlah sampel yang digunakan tiap kelompok 6 ekor mencit.
Sebelum digunakan dalam penelitian, 18 ekor mencit diadaptasikan terlebih dahulu selama 1 minggu. Selama dalam pemeliharaan mencit diberi makan dan minum secara ad libitum. Untuk menghindari bias terhadap berat badan maka dilakukan penimbangan mencit sebelum mendapat perlakuan.
4.3. VARIABEL PENELITIAN 4.3.1. Variabel bebas: Sebagai variabel bebas dalam penelitian ini adalah 1. Pemberian ekstrak Echinacea purpurea 4.3.2. Variabel tergantung: 1. Kemampuan fagositosis makrofag 2. Kadar Nitric Oxide makrofag 4.4. Definisi Operasional: 1. Electric foot shock dilakukan dengan cara mengalirkan arus listrik pada lempeng tembaga di dasar kandang perlakuan tempat kaki mencit berpijak. Aliran listrik akan mengejutkan mencit. Besar arus listrik 220 VAC antara 1 – 3mA.
Jumlah renjatan adalah sebagai berikut:
Hari ke-
Renjatan
sesi
1
4
2
2
8
2
3
10
3
4
12
3
5
14
4
6
16
4
7
18
5
8
20
5
9
22
6
10
24
6
Lama 1 kali renjatan = 1 kejut, diberikan interval 4 menit untuk tiap sesi. Hari pertama diberikan 4 renjatan-2 sesi, hari kedua diberikan 8 renjatan-2 sesi bukannya 6 renjatan-2sesi, karena peningkatan sebanyak 2 renjatan x 2 sesi untuk hari kedua dianggap terlalu kecil. Pemilihan stressor berupa renjatan listrik pada alas kaki dengan electric foot shock karena intensitas dapat terukur dengan tepat, penjalaran arus listrik dari kaki ke seluruh tubuh termasuk ke otak berjalan cepat dan pemulihan setelah renjatan tidak ada efek ikutan. Banyak penelitian telah dilakukan dengan renjatan listrik sebagai stressor untuk menimbulkan stress dan memberi dampak pada target spesifik, telah terbukti dan menunjukkan akurasi yang tepat. Sedangkan pemilihan lama waktu 10 hari adalah berdasarkan penelitian terdahulu bahwa kadar kortisol mulai meningkat pada hari ke-4, mencapai puncak pada hari ke-7 dan mulai
menurun pada hari ke-14. Sehingga dapat diharapkan pengambilan unit sampel pada hari ke-11 sudah terjadi modulasi sistem imun.56 2. Pemberian Echinacea purpurea (ekstrak bubuk kering dengan 3.5% echinacoside)
dilakukan
melalui
sonde
dengan
dosis
0,195
mg/gramBB/hari atau 5,85 gram/hari untuk mencit dengan BB 30 gram yang dilarutkan dalam 2 ml aquadest steril. 3. Kemampuan fagositosis makrofag adalah prosentase sel yang memfagosit partikel latex beads dihitung dari 200 sel yang diperiksa dengan mikroskop cahaya, dengan 3x penghitungan, dan hasilnya dirata-rata. 4. Kadar Nitric Oxide makrofag diukur dengan metoda ELISA dengan satuan ng/ml.
4.5. BAHAN DAN ALAT •
Mencit betina strain C3H dengan umur 6 bulan, dan berat 20 - 30 gram. Mencit diperoleh dari Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
•
Adenokarsinoma diperoleh dari mencit donor. Tumor yang mengandung sel adenokarsinoma dari mencit donor akan ditransplantasikan ke mencit resipien. Sebelum ditransplantasikan, tumor dari mencit donor akan diincisi biopsi dan dilakukan pemeriksaan histologi untuk mengkonfirmasi jenis tumornya
•
Bahan-bahan untuk pemeriksaan immunologi:
o Peritoneal Exudate Cells (PEC) dari mencit betina strain C3H (hewan percobaan). o Ekstrak Echinacea sp yang diperoleh langsung dari perusahaan farmasi yang memproduksi echinacea sp. o RPMI 1640. o Foetal Bovine Serum (FBS) o Phosphate Buffer Saline (PBS) o Metanol, Larutan Giemsa, Tripan Blue o Aquadest steril •
Bahan transplantasi jaringan tumor pada mencit o Alkohol 70 % o Larutan Garam fisiologik o Es batu o Mencit donor bertumor o Mencit resipien
4.6. ALAT/ INSTRUMEN PENELITIAN. •
Mikroskop
•
Inkubator buatan Schwabach
•
Spuit 1cc, 10 cc
•
Termometer
•
Tabung Sentrifus 15 cc, 50 cc
•
Tabung reaksi dengan alas datar
•
Lampu Bunsen
•
Tabung reaksi biasa
•
Cawan Petri
•
Kaca benda
•
Gunting bengkok dan lurus
•
Trokar
•
Kanul mulut
•
Pinset, scalpel
•
Pipet Pasteur & Pipet Eppendorf
•
Yellow & Blue tape
•
ELISA reader
•
Autoclav
•
Laminar Flow
•
Colony Counter
•
Timbangan elektronik dan biasa
•
Cover slip bulat ∅ 13mm
•
18 buah kandang hewan coba individual
•
Alat sentrifugasi yang dilengkapi pengatur suhu
4.7. TEMPAT PENELITIAN Penelitian dilakukan di:
Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Undip.
Laboratorium Fisika Medik Fakultas Kedokteran Undip.
Laboratorium Bioteknologi Fakultas Kedokteran Undip.
4.8. PROSEDUR PENGUMPULAN DATA • 18 ekor mencit betina strain C3H dengan umur 6 bulan, dan berat 20 - 30 gram diaklimatisasi di laboratorium dengan dikandangkan secara individual dan diberi pakan standar selama satu minggu secara ad libitum. • Dilakukan inokulasi sel-sel tumor pada masing-masing mencit kemudian ditunggu selama 3-4 hari.
• 18 ekor mencit yang telah terpapar tumor tersebut kemudian dibagi menjadi 3 kelompok masing-masing 6 ekor yang ditentukan secara acak dengan komputer, masing-masing kelompok dikandangkan secara individual. • Masing masing kelompok mendapatkan pakan standar yang sama. • Kelompok pertama hanya mendapatkan makanan standar, pada hari ke-8 disuntikkan Foetal Bovine Serum (FBS) 0,3cc secara i.p. 3 hari kemudian mencit dibunuh untuk diperiksa kemampuan fagositosis dan kadar Nitric Oxide (NO) makrofag. • Kelompok kedua selain mendapatkan makanan standar juga mendapatkan stressor renjatan listrik menggunakan electric foot shock, pada hari ke-8 disuntikkan Foetal Bovine Serum (FBS) 0,3cc secara i.p. 3 hari kemudian mencit dibunuh untuk diperiksa kemampuan fagositosis dan kadar Nitric Oxide (NO) makrofag. • Kelompok
ketiga
selain
mendapatkan
stressor
renjatan
listrik
menggunakan electric foot shock juga mendapatkan ekstrak Echinacea purpurea, pada hari ke-8 disuntikkan Foetal Bovine Serum (FBS) 0,3cc secara i.p. 3 hari kemudian mencit dibunuh untuk diperiksa kemampuan fagositosis dan kadar Nitric Oxide (NO) makrofag.
4.9. ALUR KERJA 18 Ekor mencit diadaptasikan selama 1 minggu
Inokulasi sel-sel tumor secara individual 3-4 hari
FBS 0,3cc i.p
3 hari
FBS 0,3 cc i.p
3 hari mencit dibunuh
Diet standar + Echinacea purpurea +
Diet standar
Hari ke-8 FBS 0,3cc i.p
M 2
mencit dibunuh
3 hari mencit dibunuh
4.10. ANALISIS DATA Data hasil penelitian diolah dan disajikan dalam bentuk tabel dan boxplot. Untuk mengetahui normalitas data dilakukan uji normalitas menggunakan
shock
M1 Diet standar + electric foot shock
M0
electric foot
RANDOMISASI
Shapiro-Wilk test. Karena data berdistribusi normal maka dilakukan uji One Way Anova untuk melihat adanya perbedaan pada ketiga kelompok perlakuan. Besarnya perbedaan masing-masing kelompok perlakuan dianalisis lebih lanjut dengan Post Hoc Test Bonferoni. Semua analisis statistik tersebut dilakukan dengan menggunakan program komputer SPSS 10.05 for windows. Nilai
signifikansi
pada
penelitian
ini
adalah apabila variabel yang
dianalisis memiliki nilai p<0,05.
4.11. PERSYARATAN ETIK Implikasi etik pada hewan, pengelolaan binatang coba pada penelitian ini mengikuti animal ethics. Hal yang perlu dilaksanakan sesuai dengan etik antara lain perawatan dalam kandang, pemberian makan minum (ad libitum), aliran udara dalam ruang kandang, perlakuan saat penelitian, menghilangkan rasa sakit, pengambilan unit analisis penelitian, dan pemusnahannya.
BAB 5 HASIL 5.1. Kemampuan fagositosis dan Produksi NO makrofag Kemampuan fagositosis makrofag diukur dari kemampuan makrofag memfagositosis Latex beads. Kemampuan ini diukur dengan persentase jumlah makrofag yang memfagositosis Latex beads. Sedangkan aktifitas Nitric Oxyde (NO) makrofag diukur dari produksi NO makrofag. Hasil pengukuran persentase fagositosis makrofag dan produksi NO makrofag dapat dilihat pada tabel-2. Tabel-2. Nilai rata-rata hasil penghitungan kemampuan fagositosis dan produksi NO makrofag pada tiap kelompok percobaan Kontrol
% fagositosis; rerata (SD); median Produksi NO; rerata (SD); median
Perlakuan 1
Perlakuan 2
42,75; (6,49);41,25
29,83; (2,64);29,50
38,17; (3,66);38,00
5,034; (0,274);5,126
4,384; (0,169);4,360
4,848; (0,374);4,917
55
50
%-fagositosis
45
40
35
30
25
K
P1
P2
Gambar-8. Grafik Box plot kemampuan fagositosis Makrofag Nilai median yang digambarkan pada grafik box plot menunjukan bahwa median kemampuan fagositosis makrofag paling tinggi pada kelompok K, diikuti kelompok P2 dan paling rendah pada kelompok P1. (Gambar -8)
5.400
Kadar NO
5.100
4.800
4.500
4.200
K Gambar-9. Grafik Box plot Kadar NO
P1
P2
Nilai median yang digambarkan pada grafik box plot menunjukan bahwa median kadar NO makrofag paling tinggi pada kelompok K, diikuti kelompok P2 dan paling rendah pada kelompok P1.(Gambar-9)
5.2. Uji Statistik Pada eksplorasi data, uji normalitas data masing-masing kelompok dilakukan dengan menggunakan uji Shapiro Wilk .
Tabel-3 .
Uji normalitas data kemampuan fagositosis makrofag pada tiap kelompok percobaan Variabel
Kelompok
Kontrol % P1 Fagositosis P2 Tabel-4 .
Shapiro-Wilk .321 .890 .737
Uji normalitas data kadar NO makrofag pada tiap kelompok percobaan Variabel
Kelompok
Kontrol Kadar NO P1 P2
Shapiro-Wilk .177 .366 .390
Dari tabel di atas terlihat bahwa distribusi data tiap kelompok perlakuan pada tabel kemampuan fagositosis dan kadar NO adalah normal. Kemudian untuk uji homogenitas data tiap kelompok perlakuan dilakukan dengan Levene’s test. Didapatkan pada uji tersebut bahwa pada kemampuan
fagositosis p=0,167 dan pada kadar NO p=0,316 maka dikatakan bahwa data tiap kelompok perlakuan adalah homogen Oleh karena skala variabel independen maupun dependennya numerik dan distribusi datanya normal, maka analisis statistik untuk uji beda semua kelompoknya menggunakan One way ANOVA. Uji beda untuk masing-masing kelompok menggunakan Bonferoni test. Hasil uji ANOVA didapatkan bahwa keseluruhan kelompok dari variabel kemampuan fagositosis makrofag mempunyai perbedaan yang bermakna secara statistik dengan nilai p<0,05 (p=0,001). Begitu juga dengan variabel produksi NO makrofag pada uji tersebut juga menunjukkan perbedaan yang sangat bermakna secara statistik dengan nilai p<0,05 (p=0,004). Variable % fagositosis
Signifikan K*P1 P1*P2 K*P2 Kadar NO K*P1 P1*P2 K*P2 Uji Bonferoni pada variabel kemampuan fagositosis makrofag menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna (p=0,001) antara kelompok kontrol (K) (42,75 ± 6,49) dan perlakuan 1 (P1) (29,83 ± 2,64), dan terdapat perbedaan yang bermakna juga (p=0,019) antara kelompok perlakuan 1 (P1) (29,83 ± 2,64) dan perlakuan 2 (P2) (38,17 ± 3,66). Sedangkan antara kelompok kontrol (K) dengan kelompok perlakuan 2 (P2) tidak terdapat perbedaan yang bermakna (p=0,307)(gambar.-11)
42,75%
50
38,17%
40
29,83 %
30 20 10 0 Kontrol
P1
P2
P=0,001
P=0,019
P=0,30 Gambar-10. Hasil Post Hoc test kemampuan fagositosis makrofag dengan menggunakan uji Bonferroni .
Uji Bonferoni pada variabel produksi NO makrofag menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna (p=0,004) antara kelompok kontrol (K) (5,034 ± 0,274) dan perlakuan 1 (P1) (4,384 ± 0,169), dan terjadi perbedaan bermakna (p=0,038) juga antara kelompok perlakuan 1 (P1) (4,384 ± 0,169) dan perlakuan 2 (P2) (4,848 ± 0,169). Sedangkan antara kelompok kontrol (K) dengan kelompok perlakuan 2 (P2) tidak terdapat perbedaan yang bermakna (p=0,829).
5,200 5,000 4,800 4,600 4,400 4,200 4,000
5,034 4,848
4,384
Kontrol
P1
P=0,004
P2
P=0,038
P=0,82 Gambar-11. Hasil Post Hoc test produksi NO makrofag dengan menggunakan uji Bonferroni .
18 ekor tikus
Aklimatisasi 1 minggu
Random alokasi
K : 6 ekor
Drop out = 0 % makrofag 42,75 ± 6,49
P1 : 6 ekor
Drop out = 0 % makrofag 29,83 ± 2,64
P2 : 6 ekor
Drop out = 0 % makrofag 38,17 ± 3,66
Drop out = 0
Drop out = 0
Drop out = 0
NO makrofag (ng/mL) 5,034 ± 0,274
NO makrofag (ng/mL) 4,384 ± 0,169
NO makrofag (ng/mL) 4,848 ± 0,169
Gambar-12. Diagram skematik hasil penelitian
BAB 6 PEMBAHASAN
Dari 18 ekor tikus dalam penelitian, ternyata tidak ada satu pun dari ketiga kelompok perlakuan yang mengalami drop out. Pada kelompok kontrol terlihat bahwa jumlah rerata makrofag yang mem-fagosit Latex beads adalah sejumlah 42,75 ± 6,49 %. Jumlah ini menggambarkan kemampuan fagositosis makrofag pada mencit yang menderita adenokarsinoma mamma. Pada kelompok perlakuan 1 (P1) terlihat bahwa kemampuan fagositosis makrofag menurun secara sangat signifikan (p=0,001) dibandingkan kelompok kontrol, yaitu dari 42,75 ± 6,49 % pada kelompok kontrol menjadi 29,83 ± 2,64 % pada kelompok P1. Penurunan kemampuan fagositosis makrofag pada kelompok P1 ini disebabkan karena stress yang diberikan pada kelompok ini. Adanya stress ini akan berpengaruh terhadap imunitas tubuh melalui stimulasi sekresi kortisol dan
adrenalin dari korteks dan medula adrenal. Juga berpengaruh terhadap pelepasan noradrenalin dari postganglion simpatik terminal saraf di pembuluh darah dan organ lymfoid. Efek sistemik dari glukokortikoid dan katekolamin ini mempengaruhi pengaturan sitokin yang diproduksi monosit. Stresss akan menurunkan produksi sitokin yang dibutuhkan dalam respon imunitas seluler.9 Pada saat disekresikan cortisol dan adrenalin akan terjadi hambatan ekspresi IL-2, IFN-γ, dan IL-12, di mana IL-12 dan IFN-γ sangat penting untuk stimulasi sel-sel efektor sistem imun seluler seperti Makrofag, Cytotoxic T-cell Lymphocyt (CTL), dan sel Natural Killer (NK). Pada saat mendapatkan stress, makrofag mengalami anergi, sehingga kemampuan fagositosisnya menurun. Hal ini dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
Hambata
Pergesera n Gambar 13. Mekanisme yang terjadi pada stress dan sistem imun9
Pada
kelompok perlakuan 2 (P2) di mana pada kelompok ini
mendapatkan imunostimulator, terlihat bahwa kemampuan fagositosis makrofag juga menurun tetapi tidak signifikan (p=0,307) dibandingkan kelompok kontrol, yaitu dari 42,75 ± 6,49 % pada kelompok kontrol menjadi 38,17 ± 3,66 % pada kelompok P2.
Dibandingkan dengan kelompok P1 yang mendapatkan stress
tetapi tidak mendapat imunostimulator, maka pada kelompok P2 yang mendapat imunostimulator, penurunan kemampuan fagositosis makrofagnya berbeda bermakna (p=0,019). Penurunan kemampuan fagositosis makrofag pada kelompok P2 dibandingkan dengan kelompok kontrol adalah tidak bermakna (p=0,307), hal ini membuktikan bahwa pemberian imunostimulator pada mencit adenokarsinoma mamma dengan stress akan memperbaiki kemampuan fagositosis makrofag. Hal ini terjadi karena Imunostimulator Echinacea sp yang diberikan akan mengaktifasi makrofag sehingga makrofag yang ada, baik sebagai APC maupun sebagai efektor akan aktif dan menghasilkan sitokin-sitokin yang penting untuk aktifitas imunitas seluler, terutama IL-12 dan IFN-γ 40-45.
Stimulasi
Pergesera n Stimulasi Gambar-14. Mekanisme yang terjadi pada stress dan sistem imun9 Produksi NO makrofag pada kelompok kontrol terlihat sejumlah 5,034 ± 0,274 ng/mL. Jumlah ini menggambarkan produksi NO makrofag pada mencit yang menderita adenokarsinoma mamma. Pada kelompok perlakuan 1 (P1) terlihat bahwa produksi NO makrofag menurun secara sangat signifikan (p=0,004) dibandingkan kelompok kontrol, yaitu dari 5,034 ± 0,274 ng/mL pada kelompok kontrol menjadi 4,384 ± 0,169 ng/mL pada kelompok P1. Penurunan produksi NO makrofag pada kelompok P1 disebabkan karena stress yang diberikan pada kelompok ini. Adanya stress ini akan berpengaruh terhadap imunitas tubuh melalui stimulasi sekresi kortisol dan adrenalin dari korteks dan medula adrenal. Juga berpengaruh terhadap pelepasan noradrenalin dari postganglion simpatik terminal saraf di pembuluh darah dan organ lymfoid. Pelepasan kortisol dan adrenalin ini akan menyebabkan penurunan stimulasi
sistem imun seluler. Hal ini berpengaruh pada penurunan produksi NO makrofag. Hal ini dapat dilihat pada gambar -10. Pada
kelompok perlakuan 2 (P2) di mana pada kelompok ini
mendapatkan imunostimulator Echinacea purpurea, terlihat bahwa produksi NO makrofag juga menurun tetapi tidak signifikan (p=0,829) dibandingkan kelompok kontrol, yaitu dari 5,034 ± 0,274 ng/mL pada kelompok kontrol menjadi 4,848 ± 0,374 ng/mL pada kelompok P2.
Dibandingkan dengan kelompok P1 yang
mendapatkan stress tetapi tidak mendapat imunostimulator, maka pada kelompok P2 yang mendapat imunostimulator, penurunan produksi NO makrofag berbeda bermakna (p=0,038). Penurunan produksi NO makrofag pada kelompok P2 dibandingkan dengan kelompok kontrol adalah tidak bermakna (p=0,829), hal ini membuktikan bahwa pemberian imunostimulator pada mencit adenokarsinoma mamma dengan stress akan memperbaiki produksi NO makrofag. Hal ini terjadi karena Imunostimulator Echinacea purpurea yang diberikan akan mengaktifasi makrofag sehingga makrofag yang ada, baik sebagai APC maupun sebagai efektor akan aktif dan menghasilkan sitokin-sitokin terutama IL-12 dan IFN-γ yang penting untuk aktifitas imunitas seluler 37-42. Hal ini dapat dilihat pada gambar-11.
BAB 7 SIMPULAN DAN SARAN
7.1. Simpulan 1. Terdapat perbedaan kemampuan fagositosis makrofag pada mencit C3H yang menderita adenokarsinoma mamma dan stress dengan pemberian imunostimulator Echinacea purpurea yaitu 29,83 ± 2,64 dengan 38,17 ± 3,66. 2. Terdapat perbedaan produksi NO makrofag pada mencit C3H yang menderita adenokarsinoma mamma dan stress dengan pemberian
imunostimulator Echinacea purpurea yaitu 4,384 ± 0,169 dengan 4,848 ± 0,169. 7.2. Saran 1. Untuk membuktikan bahwa peningkatan aktifitas makrofag adalah akibat dari peningkatan sitokin IL-12 dan IFN-γ, maka perlu dilakukan penelitian pada kadar IL-12 dan IFN-γ dari mencit C3H dengan adenokarsinoma mamma yang diberi Echinacea purpurea. 2. Bila Echinacea purpurea mempunyai efek yang baik terhadap peningkatan
aktifitas
makrofag
pada
mencit
C3H
dengan
adenokarsinoma dan stress, maka perlu dipikirkan pengembangan untuk kelanjutan uji klinik terhadap manusia.
DAFTAR PUSTAKA 1. Deteksi dini kanker payudara. Republika online; 2 April 2006. Available from : URL http://www.republika.co.id/cetak_berita.asp 2. Smigal C, Siegel R. Breast cancer facts and figure 2005-2006. American cancer society; 2005:1-3 3. Kardinah. Kanker Payudara : Bagaimana Hindari Berbagai Ancaman. DEPKES-RI ; April 2007. Available from : URL http://www.depkes.go.id/kanker.htm
4. M. Farid Aziz. Masalah pada Kanker Serviks. Cermin Dunia Kedokteran. 2001;133:15-8. Available from : URL http://www.kalbefarma.com/files/cdk/files/cdk_133_obstetri_dan_ginekologi.pdf
5. Sugito H. Kanker di Indonesia Tahun 1994 Data Histopatologik. Badan Registrasi Kanker Ikatan Ahli Patologi Indonesia. Dirjen YanMed Dep. Kes RI ; 1994 : 3-6. 6. Profil Kesehatan Provinsi Jawa Tengah Tahun 2005. Pencapaian Program Kesehatan Menuju Jawa Tengah Sehat. Dinas kesehatan Pemerintah provinsi
jawa tengah ; 2005. Available from : URL http://www.dinkesjateng.org/profil2005/bab4.htm
7. Shirley IM, MD. Epidemiologi kanker payudara dan pengendaliannya. Medika 2000;5:326-9 8. Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT). Jakarta (INA): Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI dan Biro Pusat Statistik; 2004:23. 9. Elemkov IJ and Chrousos GP. Stress hormones, Th1/th2 paterns, Pro/Antiinflamatory Cytokines and susceptibility to disease. TEM. 1999;10(9):359-68. 10. Burger R, Torres A, Warren R, Caldwell V, Hughes B. Echinacea-induced cytokine production by human macrophages. Int J Immunopharmacol. 1997; 19(7): 371-9. 11. Torres AV, Carson JJ, Mastroeni P, Ischiropoulos H,Fang GC. Antimicrobial Action of the NADPH Phagocyte Oxidase and Inducible Nitric Oxide Synthase in experimental Salmonellosis. I. Effects on microbial killing by Activated Peritoneal Macrophage in Vitro. J Exp Med 2000;192(2):227-236 12. Weiming X, Lizhi L, Ian GC. Microencapsulated iNOS-expressing cells cause tumor suppression in mice. The FASEB Journal express. 2001;10:1096. 13. Mishima S, Saito K, Maruyama H, Inoue M, Yamashita T, Ishida T, Gu Y. Antioxidant and immuno-enhancing effects of Echinacea purpurea. Biol Pharm Bull. 2004;27(7):1004-9. 14. See D, Broumand N, Sahl L, Tilles J. In vitro effects of echinacea and ginseng on natural killer and anti-body-dependent cell cytotoxicity in healthy subjects and chronic fatigue syndrome or acquired immunodeficiency syndrome patients. Immunopharmacology. 1997; 35(3): 229-35. 15. Bratman S, Kroll D. Natural Health Bible. Prima Publishing. 1999: 179-81. 16. Currier NL, Miller SC. Natural Killer cells from aging mice treated with extracts from echinacea purpurea are quantitatively and functionally rejuvenated. Exp Gerontil. 2000;35(5): 627-39. 17. Goel V, Chang C, Slama J, Barton R, Bauer R, Gahler R, Basu T. Echinacea stimulates macrophage function in lung and spleen of normal rats. J Nutr Biochem. 2002;13(8):487 18. Virginia KL, Colin AP, Raman Q, Edwin DS. Breast cancer. In: Philip R, Sandra M, Raman Q, editors. Clinical oncology. 7th ed. Philadelphia: WB Saunders Company, 1993: 187-94 19. Dickson R B., Lippman M E. Cancer Of The Breast. Cancer: Principles & Practice of Oncology, Vincent T. DeVita, Jr. M.D., Samuel Hellman, M.D., Steven A. Rosenberg, M.D. Ph.D. Eds; 5th Ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia 1997, 36 : 1541-1616
20. Kumpulan Naskah Ilmiah. Perhimpunan Ahli Bedah Onkologi Indonesia (PERABOI). Muktamar Nasional VI : 2003. 21. Sobin LH, Wittekind CH ed. Classification of Malignant Tumours TNM. International Union Against Cancer UICC ; 6th ed. A John Wiley & Sons Inc.2002 : 131-41. 22. Hayes Malcolm, MD. Reporting Pathology Specimen for Breast Cancer. British Columbia Cancer Agency; Vancouver Canada. Available from : URL : http://www.bccancer.bc.ca/NR/rdonlyres/enyptzz527vtdpy2qov5ngwe5wdre7vp r6nss5lmr2ohyqmpbyg32zgi25y4kqcyysnukvreieo7pk/PathologychecklistBREA STREPORTING4.doc 23. Wunderlich J R., Restifo N P.. Essentials Of Immunology . Cancer: Principles & Practice of Oncology, Fifth Edition Vincent T. DeVita, Jr. M.D., Samuel Hellman, M.D., Steven A. Rosenberg, M.D. Ph.D. Philadelphia 1997, 3 : 47-75 24. Contran RS, Kumar V, Robbins SL. Robin Pathologic basis of Disease. 5th ed. Philadelpia : WB Saunders, 1994 25. Stites DP, Terr Abba I, Parslow TP, .Medical Immunology, 9th ed, Stamford Connecticut, USA: Appleton & Lange, 1997 26. Abbas A, Lichtman AH, Pober JS. Cellular and Molecular Immunology. 5th ed. Philadelphia: Elsevier-Saunders; 2005. p. 4-15,22-3,65-80,81103,182-7,247-53,258-9,266,268-9,279-80,290-5. 27. Roitt IM, 1988. Essentiale Immunology, 6th ed. Blackwell sci. publ. London. 28. Goodman JW. The Immune Response, in Basic and Clinical Immunologi. 8th ed. Stites DP, Terr A I eds.,Prentice-Hall Int.Inc.,USA. 29. Kresno SB. Aspek imunologi pada kanker. Nelwan et al eds. Simposium 4th Jakarta Antimicrobial Update 2003. Sub Bagian Penyakit Tropik dan Infeksi Bagian Ilmu penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Rumah Sakit Umum Pusat Nasional Dr Cipto Mangunkusumo. Jakarta. 2003: 59 – 77. 30. Constatinides P. General Pathobiologi. Connecticut: Appleton & Lange,1994 : 173 – 90. 31. Sarjadi. Karsinoma epidermoid serviks uteri (Beberapa aspek epidemiologi serta peran histopatologi dan petanda tumor dalam penentuan prognosis). Disertasi doktor Universitas Diponegoro. Semarang,1985 32. The Wikipedia free encyclopedia. Nitric oxide. Adelaide: Wikimedia Foundation Inc; 2007. p. 1-3. Available from: URL:http://en.wikipedia.org/nitric_oxide 33. The Wikipedia free encyclopedia. Nitric oxide synthase. Adelaide: Wikimedia Foundation Inc; 2007. p. 1-5. Available from: URL:http://en.wikipedia.org/ nitric_oxide_synthase
34. Giles JT, Palat CT, Chien Susan H, Chang ZG, Kennedy DT. Evaluation of Echinacea for Treatment of the Common Cold. Pharmacotherapy, 2000; 20(6):690-7 35. Murray MT. Echinacea: pharmacology and clinical applications. Am J Nat Med 1995;2:18-24. 36. Bauer R, Jurcic K, Puhlmann J, Wagner H. Immunological in vivo and in vitro examinations of echinacea extracts. Arzneimittelforschung 1988;38(2):276-81. 37. Schumacher A, Friedberg KD. Analysis of the effect of Echinacea angustifolia on unspecified immunity of the mouse. Arzneimittelforschung 1991;41:141-7. 38. Blumenthal M, Riggins C. Popular herbs in the U.S. market: therapeutic monographs. Austin, TX: American Botanical Council 1997:1-68. 39. Bartram T. Encyclopedia of Herbal Medicine. Grace Publishers, Dorset, England. 1995: 161-2. 40. Pemberian Terapi Imunomodulator Herbal. HTA Indonesia,2004. Available from :URL : http://www.yanmedikdepkes.net/hta/Hasil%2520Kajian%2520HTA/2004/ 41. Echinacea species as potential immunostimulatory drugs. Econ Med Plant Res. 1991; 5: 253-321. 42. Wagner V. Immunostimulating polysaccharides (heteroglycans) of higher plants. Arzneimittelforschung. 1985; 35: 1069-75 43. Stimpel M. Macrophage activation and induction of macrophage cytotoxicity by purified polysaccharide fractions from the plant Echinacea purpurea. Infect Immun. 1984; 46:845-49 44. Luettig B. Macrophage activation by the polysaccharide arabinogalactan isolated from plant cell cultures of Echinacea purpurea. J Natl Cancer Inst. 1989; 81: 669-75 45. Mose J. Effect of echinacina on phagocytosis and natural killer cells. Med Welt. 1983; 34: 1463-7 46. Vomel V. Influence of a non-specific immune stimulant on phagocytosis of erythrocytes and ink by the reticuloendothelial system of isolated perfused rat livers of different ages. Arzneimittelforschung. 1984; 34: 691-95 47. Brighthope I, Fitzgerald P. The AIDS Fighters. Keats Publishing, New Canaan, Conn. 1987; 10: 134 48. Giles J, Palat C, Chien S, Chang Z, Kennedy D. Evaluation of echinacea for treatment of the common cold. Pharmacotherapy. 2000; 20(6): 690-7. 49. Henneicke-von Z, Hentschel C, Schnitker J, Kohnen R, Kohler G, Wustenberg P. Efficacy and safety of a fixed combination phytomedicine in the treatment of the common cold (acute viral respiratory tract infection): results of a randomised, double blind, placebo controlled, multicentre study. Curr Med Res Opin. 1999; 15(3): 214-27.
50. Trubus. Echinacea harapan baru pendamba kesehatan.PT. Trubus Swadaya. September 2007;454:102-4. 51. Gallo M, Sarkar M, Au W, Pietrzak K, Comas B, Smith M, Jaeger TV, Einarson A, Koren G. Pregnancy outcome following gestational exposure to echinacea: a prospective controlled study. Arch Intern Med. 2000;160(20):3141-3. 52. Tyler V. Herbs of Choice. Pharmaceutical Products Press, an imprint of The Haworth Press, Binghamton, NY. 1994; 12: 182-4. 53. Collins E, Berkoff N. Everything You Need to Know About Echinacea and Immunity. Roseville, CA:Prima Publishing;1999:85-6 54. Pratiknya AW. Dasar-dasar Metodologi Penelitian kedokteran dan kesehatan. Cetakan I. Jakatra: CV Rajawali, 1986: 147-65. 55. World Health Organization. Research guidelines for evaluating the safety and efficacy of herbal medicines. 1993: 44. 56. Elyana Asnar. Peran perubahan limfosit penghasil sitokin dan peptida motilitas usus terhadap modulasi respon imun mukosal tikus yang stress akibat stressor renjatan listrik. Suatu pendekatan psikoneuroimunologi.(Disertasi).Program Pasca Sarjana Unair.2001
LAMPIRAN
PROSEDUR-PROSEDUR LABORATORIUM 1. PROSEDUR TRANSPLANTASI TUMOR
1. Mencit donor dimatikan dengan eter, kemudian diletakkan terlentang pada tatakan / alas fiksasi dan keempat kakinya difiksasi dengan jarum. 2. Kulit dibagian yang bertumor diusap dengan alkohol 70 %, kemudian dibuat sayatan dengan gunting lurus, untuk mengeluarkan tumor. 3. Tumor diletakkan di cawan petri kecil yang telah terlebih dahulu dicuci dengan garam fisiologis dan diletakkan diatas es. 4. Amati bentuk dan keadaan tumor, kemudian ambil/potong jaringan tumor yang masih baik yaitu bagian yang tanpa nekrosis (biasanya di daerah tepi jika tumor besar) sebanyak kira-kira yang dapat menghasilkan bubur tumor paling sedikit 1 ml dan taruh dicawan petri kecil lainnya. Bersihkan dari jaringan ikat (simpai), jaringan nekrotik dan darah, kemudian cacah/potong-potong sampai halus dengan gunting hingga akhirnya terbentuk “bubur tumor” yang partikelnya dapat melewati jarum trokar.
Tambahkan garam fisiologis lebih kurang sama banyak dengan volume tumor. 5. Bubur tumor disuntikkan subkutan di aksila kanan mencit dengan dosis 0,2 ml. 6. Sisa tumor yang padat dimasukkan ke dalam botol formalin untuk dibuat sediaan mikroskopik. 7. Masing-masing mencit diberi nomor ditelinganya (lihat bagan) dan dimasukkan ke dalam kandang berbeda yang diberi label berisi : jenis kelompok perlakuan, tanggal transplantasi
2. PROSEDUR PENGAMBILAN SAMPEL DARI HEWAN PERCOBAAN 1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher setelah dinarkose menggunakan chloroform. Mencit diletakan dalam posisi terlentang, kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan selubung peritoneumnya dengan alkohol 70%. 2. Suntikkan 5 ml medium RPMI yang mengandung 2% FBS ke dalam rongga peritoneum, tunggu 2 menit sambil ditekan-tekan secara perlahan. 3. Cairan peritoneal diaspirasi dari rongga peritoneum dengan cara menekan organ dalam dengan 2 jari, cairan diaspirasi dengan spuit injeksi, dipilih bagian yang tidak berlemak dan jauh dari usus. Aspirat yang didapat ditampung dalam tabung sentrifus. a. Aspirat yang didapat kemudian disentrifus pada 400G, 4oC selama 10’.
b. Supernatan dibuang, cuci 2X dengan RPMI yang mengandung 2% FBS. c. Kemudian ditambahkan 2 ml medium RPMI komplit (RPMI 1640 yang mengandung L-glutamin (1mM), Foetal Bovine Serum (FBS)5%
dan ditambah antibiotika Penicillin 50 unit dan
streptomycin 50µg per ml) dan disentrifus pada 400g, 4oC selama 10’. d. Buang supernatan dan bila perlu larutkan dengan 3% asam asetat dalam PBS untuk melisiskan sel darah merah kemudian disentrifus pada 400g, 4oC selama 10’. e. Cuci dengan RPMI yang mengandung 2% FBS. f. Resuspensikan dengan medium komplit. g. Jumlah sel yang didapat dihitung menggunakan bilik hitung Neubauer setelah diwarnai dengan Tripan Blue sehingga didapatkan suspensi sel dengan kepadatan 106/ ml. h. Sel yang didapatkan ini dibagi dua untuk pemeriksaan produksi NO (3X100µl) masukkan ke plate 96 wells dan untuk pemeriksaan fagositosis dengan Latex beads diambil 2x100µl (diencerkan menjadi 200µl)Æ masukkan ke plate 24 wells yang telah diberi cover slip..
3. PROSEDUR PEMERIKSAAN NO a. Masukkan 100 µl suspensi 1-1,2 X 106 sel/ ml dalam setiap plate kultur yang berisi 96 wells atau 24 wells. b. Inkubasikan selama 2-3 jam pada 37oC, 5% CO2 untuk makrofag adheren. c. Buang sel-sel non adheren dengan aspirasi. d. Ganti medium e. Kultur sel dalam medium komplit selama 24 jam dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC. f. Lakukan pengukuran akumulasi nitrit pada kultur supernatan sebagai berikut:
Untuk memeriksa
produksi nitrit digunakan 96 wells
microplate ELISA dengan dasar rata.
Masukkan 100µl Reagen chromogenic dalam microplate ELISA dengan dasar rata.
Pipet 100µl supernatan yang hendak ditest atau standar NaNO2 dalam plate dengan duplikasi atau triplikasi. Gunakan medium kontrol sebagai blanko.
Tunggu selama 5 menit pada suhu ruang untuk pembentukan chromophore dan stabilisasi.
Ukur absorbansi pada 550 nm menggunakan automated microplate reader (SLT LABINSTRUMENS Model 16 570)
Buat kurva standar menggunakan analisis regresi linier sederhana/ simpel dari pembacaan standar NaNO2. Hitung konsentrasi sampel berdasarkan kurva standar atau rumus regresi.
Keterangan: Reagen chromogenic Merupakan campuran 1 volume Reagen I dan 1 volume Reagen II sebagai berikut: Reagen I.
N-(-1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (NED) 0,1gram dilarutkan dalam 100 cc air suling
Reagen II.
Sulfanilic Acid 0,2 gram dilarutkan dalam 100 ml
HCL 4N. Reagen I dan II tersebut harus disimpan di dalam almari pendingin, ruangan gelap dan digunakan sebelum 6 minggu/ sebelum reagen berubah menjadi gelap. Setiap kali pemeriksaan harus disiapkan fresh (segar).
Standar Larutkan 69mg NaNO2 dalam 500ml air suling (stok 2mM). Buat pengenceran bertingkat dari 0 - 200µM dengan cara melarutkan larutan stok dengan medium yang sama dengan medium kultur.
4. PROSEDUR PEMERIKSAAN FAGOSITOSIS MAKROFAG DENGAN LATEX BEADS a. Suspensi makrofag yang telah dihitung dikultur pada microplate 24 well yang telah diberi coverslips bulat, setiap sumuran 200 µl (5 x 105 sel), inkubasikan dalam inkubator CO2 5%, 37oC selama 30 menit, b. Tambahkan medium komplet 1 ml/sumuran, inkubasikan selama 2 jam. c. Sel dicuci dengan RPMI 2 x , kemudian tambahkan medium komplet 1 ml/ sumuran, inkubasikan sampai 24 jam. d. Makrofag peritoneum yang dikultur sehari sebelumnya, dicuci 2 x dengan RPMI. e. Latex beads diresuspensikan sehingga mendapat konsentrasi 2,5 x 107/ml f. Tambahkan suspensi latex 200 µl/sumuran, inkubasi selama 60 menit pada suhu 37oC, CO2. g. Cuci 3 x dengan PBS untuk menghilangkan partikel yang tak difagosit, h. Keringkan pada suhu ruang, fiksasi dengan metanol absolut, i. Setelah kering, coverslips dipulas dengan Giemsa 20% selama 30 menit.
j. Cuci dengan aquadest, angkat dari sumuran kultur dan keringkan pada suhu kamar. k. Setelah kering dimounting pada object glass. l. Prosentase sel yang memfagosit partikel latex dihitung dari 200 sel yang diperiksa dengan mikroskop cahaya, dengan replikasi penghitungan 3x.
Makrofag memfagosit Latex beads (pembesaran 40X)
Makrofag tidak memfagosit Latex beads (pembesaran 40X)
Data Penelitian Kelompok perlakuan 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2
Rerata % Makrofag yang memfagosit latex beads 40 54 37 43 46 37 29 30 31 34
Kadar NO rerata makrofag (ng/ml) 5.126 4.709 5.126 5.405 4.709 5.126 4.569 4.291 4.569 4.430
2 2 3 3 3 3 3 3
29 26 37 44 35 40 39 34
4.152 4.291 4.430 4.987 5.405 4.430 4.987 4.848
Statistik Case Processing Summary
%-fagositosis
Kadar NO
Klpk perlakuan kontrol P1 P2 kontrol P1 P2
N 6 6 6 6 6 6
Valid Percent 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%
N 0 0 0 0 0 0
Cases Missing Percent .0% .0% .0% .0% .0% .0%
N 6 6 6 6 6 6
Total Percent 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%
Tests of Normality
%-fagositosis
Kadar NO
Klpk perlakuan kontrol P1 P2 kontrol P1 P2
a
Kolmogorov-Smirnov Statistic df Sig. .188 6 .200* .209 6 .200* .141 6 .200* .299 6 .100 .209 6 .200* .202 6 .200*
*. This is a lower bound of the true significance. a. Lilliefors Significance Correction
Shapiro-Wilk Statistic df Sig. .882 6 .321 .973 6 .890 .955 6 .737 .845 6 .177 .893 6 .366 .899 6 .390
Test of Homogeneity of Variance
%-fagositosis
Kadar NO
Based on Mean Based on Median Based on Median and with adjusted df Based on trimmed mean Based on Mean Based on Median Based on Median and with adjusted df Based on trimmed mean
Levene Statistic 2.018 1.605
df1 2 2
df2 15 15
Sig. .167 .233
1.605
2
8.912
.254
1.806 1.245 .886
2 2 2
15 15 15
.198 .316 .433
.886
2
11.079
.440
1.330
2
15
.294
Descriptives
%-fagositosis
Klpk perlakuan kontrol
P1
P2
Kadar NO
kontrol
P1
P2
Mean 95% Confidence Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis Mean 95% Confidence Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis Mean 95% Confidence Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis Mean 95% Confidence Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis Mean 95% Confidence Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis Mean 95% Confidence Interval for Mean 5% Trimmed Mean Median Variance Std. Deviation Minimum Maximum Range Interquartile Range Skewness Kurtosis
Lower Bound Upper Bound
Lower Bound Upper Bound
Lower Bound Upper Bound
Lower Bound Upper Bound
Lower Bound Upper Bound
Lower Bound Upper Bound
Statistic 42.75 35.93
Std. Error 2.65
49.57 42.44 41.25 42.175 6.49 37 54 17 11.00 1.158 .981 29.83 27.06
.845 1.741 1.08
32.60 29.81 29.50 6.967 2.64 26 34 8 3.50 .268 1.252 38.17 34.33
.845 1.741 1.49
42.00 38.07 38.00 13.367 3.66 34 44 10 6.25 .611 -.085 5.03350 4.74617
.845 1.741 .11177
5.32082 5.03092 5.12632 7.496E-02 .27379 4.709 5.405 .696 .48732 -.219 -1.079 4.38374 4.20678
.845 1.741 .0688
4.56070 4.38632 4.36053 2.843E-02 .16862 4.152 4.569 .418 .31328 -.075 -1.550 4.84785 4.45578
.845 1.741 .15252
5.23993 4.84012 4.91747 .140 .37360 4.430 5.405 .975 .66136 .186 -.579
.845 1.741
Oneway Test of Homogeneity of Variances
%-fagositosis Kadar NO
Levene Statistic 2.018 1.245
df1
df2
Sig.
2 2
15 15
.167 .316
ANOVA
%-fagositosis
Kadar NO
Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares 514.583 312.542 827.125 1.344 1.215 2.559
df 2 15 17 2 15 17
Mean Square 257.292 20.836
F 12.348
Sig. .001
.672 8.099E-02
8.298
.004
Post Hoc Tests Multiple Comparisons
Dependent Variable %-fagositosis
Bonferroni
(I) Klpk perlakuan kontrol P1 P2
Tamhane
kontrol P1 P2
Kadar NO
Bonferroni
kontrol P1 P2
Tamhane
kontrol P1 P2
(J) Klpk perlakuan P1 P2 kontrol P2 kontrol P1 P1 P2 kontrol P2 kontrol P1 P1 P2 kontrol P2 kontrol P1 P1 P2 kontrol P2 kontrol P1
*. The mean difference is significant at the .05 level.
Mean Difference (I-J) 12.92* 4.58 -12.92* -8.33* -4.58 8.33* 12.92* 4.58 -12.92* -8.33* -4.58 8.33* .64976* .18565 -.64976* -.46411* -.18565 .46411* .64976* .18565 -.64976* -.46411 -.18565 .46411
Std. Error 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 2.64 .16431 .16431 .16431 .16431 .16431 .16431 .16431 .16431 .16431 .16431 .16431 .16431
Sig. .001 .307 .001 .019 .307 .019 .010 .430 .010 .004 .430 .004 .004 .829 .004 .038 .829 .038 .003 .727 .003 .081 .727 .081
95% Confidence Interval Lower Upper Bound Bound 5.82 20.02 -2.52 11.68 -20.02 -5.82 -15.43 -1.23 -11.68 2.52 1.23 15.43 3.84 21.99 -4.59 13.76 -21.99 -3.84 -13.70 -2.97 -13.76 4.59 2.97 13.70 .20716 1.09236 -.25696 .62825 -1.09236 -.20716 -.90671 -2.2E-02 -.62825 .25696 2.151E-02 .90671 .25907 1.04045 -.36484 .73613 -1.04045 -.25907 -.98641 5.82E-02 -.73613 .36484 -5.82E-02 .98641
