Dr. Fekete Jenõ A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC

Dr. Fekete Jenõ A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 2009

LaChrom Ultra • UHPLC Sebesség és hatékonyság a kromatorgráfiában

Merck Kft. · Magyarország Telefon: 463-8100 Fax: 463-8101

1113 Budapest, Bocskai út 134-146. E-mail: [email protected] [email protected]

ÚJ

!

www.merck-chemicals.hu

Dr. Fekete Jenõ A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai HILIC 2009

© Dr. Fekete Jenõ

Lektor: Ritz Ferenc

ISBN 978 963 06 8017 2

Felelõs kiadó: Merck Kft. Felelõs vezetõ: Dr. Meisel Tibor Terjedelem: 11 ( A5) ív

Köszönetnyilvánítás Ezúttal szeretnék köszönetet mondani, azért a sok segítségért, amelyet a BME Szervetlen és Analitikai Tanszék HPLC csoport tagjai nyújtottak a könyv elkészítésében. Köszönöm Oláh Erzsébetnek, Mészáros Ágnesnek, Kiss Kornéliának és Berki Róbertnek a könyv alapos és mindenre kiterjedi átnézését és javítását. Külön köszönetet mondok Ritz Ferencnek az ábrák elkészítéséért és a könyv szerkesztésért. A tisztelt olvasótól elnézést kérünk, hogy az irodalomból vett példáknál a vegyületek angol nevét használtuk.

Tisztelt kromatográfus Kollégák! Nagy örömmel lépünk Önök elé ezzel az új kiadvánnyal, amely egy sorozat második kötete. A sorozat elsõ kiadványát 2008-ban vehették kezükbe az Olvasók, melybõl a gyors folyadékkromatográfia alapjaiba, legújabb fejlesztési irányaiba kaphattak betekintést. Örömmel nyugtáztuk, hogy ez a kiadvány hiánypótlónak bizonyult, hisz az utánnyomást is megérte és mind a mai napig igen nagy iránta az érdeklõdés. Jelen kiadványunkat az az igény hívta életre, melyet a folyadékkromatográfia egy új ágának, a hidrofil kölcsönhatásokon alapuló elválasztásnak (HILIC) a térnyerése támasztott. A Merck ezen a téren is lépést tart a tudomány fejlõdésével, hiszen az új módszer alkalmazói számára széles skálán kínálja legújabb állófázisait. Bizonyára Önök közül már sokan megismerkedtek ezzel az elválasztási módszerrel, sõt biztosan alkalmazzák is mindennapi munkájukban. Biztosak vagyunk abban is, hogy számos kolléga mostanában fog ismereteket gyûjteni róla. Bízunk benne, hogy mindannyiuknak hasznos eszközt jelent ez a könyv. A kiadvány létrejöttéért ismét Dr. Fekete Jenõ tanár úrnak tartozunk köszönettel, aki összefoglalta a HILIC technika alapjait és segít elhelyezni azt a többi elválasztástechnikai módszer között. Kívánunk minden kedves Olvasónknak a kötet tanulmányozása során hasznos idõtöltést, remélve, hogy hozzájárulunk ismereteinek gyarapodásához és mindennapi munkájának megkönnyítéséhez!

Üdvözlettel, A Merck Kft. csapata

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC

Tartalomjegyzék 1.

Bevezetés

7

2.

A HILIC helye a hagyományos folyadékkromatográfiás módszerek között.

8

2.1. A hidrofil kölcsönhatású kromatográfiában alkalmazott állófázisok és jellemzésük

11

2.2. Folyadékkromatográfiás vegyületek osztályba sorolása a HILIC használatakor

12

Szilikagél, mint HILIC állófázis

15

3.1. Szilikagél használata HILIC állófázisként

21

3.2. Polárisan módosított szilikagélek, mint HILIC állófázisok

24

3.3. Ioncserélők, mint HILIC állófázisok.

27

3.4. Zwitter-ion tartalmú HILIC állófázisok.

29

3.5. Egyéb állófázis típusok a HILIC-ban

38

4.

Mozgófázisok a HILIC gyakorlatában

40

5.

A pH kontroll és a vegyületek szerkezete közti összefüggés

44

5.1. Puffer választás a HILIC –ban

48

5.2. A pH mérés lehetőségei és gyakorlata a folyadékkromatográfiában

52

6.

A visszatartást megszabó tényezők és törvényszerűségek a HILIC-ban

54

7.

Szerves oldószer tartalom hatása a visszatartásra

61

8.

Grádienselúció a HILIC-ban

65

8.1. Általános grádienselúció a HILIC-ban

65

8.2. A grádienselúció és problémája a HILIC-ban.

75

8.3. A grádienselúciós folyadékkromatográf tesztje

79

3.

Tárgymutató

84

5

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

6

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC

1. Bevezetés Amikor Cvet elvégezte híres kísérletét, és felöntötte a petroléterrel kivont növényi extraktumot a porított kálcium-karbonáttal megtöltött üvegcsövére, nem gondolhatta, hogy bevonul a tudománytörténelembe és ezzel egyúttal a világtörténelembe is. Mózes, amikor a bibliai történetek szerint az ihatatlan vízből ihatót állított elő, szintén nem gondolhatta, hogy több mint kétezer évvel ezután, mint az ókor első kromatográfiás „szakemberének” nevezik. A kromatográfiát nagyon sok misztérium és fátyolköd lengi körül. Pedig ennek az alkalmazott tudománynak az alapjai sokkal jobban ott vannak a mindennapi életünkben, mint azt gondolnánk. Alkalmazott tudomány csak úgy lehet, hogy alapjai szilárd természeti törvényeken nyugszanak. A mindennapi életből hadd ragadjak csak ki egy példát. Amikor a kellemetlen szagokat okozó vegyületeket el akarjuk távolítani a levegőből, akkor egy olyan anyagot alkalmazunk, amely azt megköti. Létezik hát egy áramló fázis, amely szállít egy anyagot, és van egy fázis, mely helyhez kötött. A kérdéses komponens azonban jobban szereti, szakszóval élve, affinitása nagyobb az állófázishoz, ezért azon adszorbeálódik, majd a folytonos áramban egy idő után deszorbeálódik. Miután ezek a folyamatok sokszor egymásután megismétlődnek a komponensek áthaladnak a töltetágyon. A modern megfogalmazás szerint a kromatográfiás módszerek olyan, kvázi-egyensúlyon alapuló elválasztási módszerek, amelyeknél találunk egy állófázist, amely az esetek többségében helyhez kötött, és egy mozgófázist, amelybe a komponenseket tartalmazó mintát bejuttatjuk. Az egyes komponensek megoszlása az álló- és a mozgófázis között eltérő, ezért eltérő sebességgel haladnak, a szorpciós és deszorpciós sebességük különböző. Ez az eltérő vándorlási sebesség (migrációs sebesség) különbség az oka az egyes komponensek elkülönülésének. Könnyű belátni, hogy bármely hatás, amely megváltoztatja ezt a vándorlási sebességet, az egyúttal a komponensek elválasztását is befolyásolja. A folyadékkromatográfiában ebből a szempontból a változtatást mindkét fázisban elvégezhetjük. A folyadék-szilárd megoszlásban, ha a folyadékban bármilyen összetétel változtatást végzünk, az megváltoztatja a szilárd határfelület tulajdonságát is. Folyadékkromatográfiás szempontból ez annyit jelent, hogy nagyon sok lehetőség áll rendelkezésünkre az elválasztás befolyásolására. A klasszikusnak tekinthető normál-, fordított fázisú, ioncserés és méretkizárásos módszerek mellett a nagy polaritású és ionos vegyületeket elválasztására így fejlődött ki egy új elválasztási módszer. Ezt a módszert cukrok elválasztására már régóta alkalmazták, ezt általánossá téve a nagy polaritású és ionos vegyületekre jött létre az az új módszer, amelyet hidrofil kölcsönhatási kromatográfiának (hydrophilic interaction chromatography) vagy hidrofil kölcsönhatási folyadék kromatográfiának (hydrophilic interaction liquid chromatography) és az ebből képzett mozaik vagy betűszó után HILIC-nek nevezünk. Ennél a módszernél az elválasztást –sok esetben– több, egymás mellett lejátszódó folyamat szabja meg. Ez a módszerfejlesztésnél jól kihasználható a megfelelő elválasztás elérésére. További jellemzője ennek a módszernek, hogy a klasszikus módok is kiválthatók vele. Ez különösen fontos szempont, akkor, amikor a tömegspektrométer (MS) előtérbe került a detektálási módszereknél. A HILIC olyan módszer, amely kompatibilis a tömegspektrométerrel (MS). Ugyanez vonatkozik az elpárologtatás utáni fényszóráson alapuló detektor alkalmazásakor (evaporative light scattering detector, ELSD), vagy korona kisülést felhasználó aeroszol detektornál (corona charged aerosol detektor, CAD). Az MS, az ELSD és a CAD kompatibilitás egyben mutatja, hogy ezzel a módszerrel nemcsak az elemezhető vegyületek számát, hanem a detektálási módok használhatóságát is kiterjesztettük. Végül, de nem utolsósorban, mivel a nagy polaritású és ionos vegyületeknél, ahol szilárd additívet kellett a mozgófázisba tenni, a fent említett detektálási módok nem voltak használhatók, ezek a módszerek a HILIC-val kiválthatók, és ezek a detektorok is használhatók. A rövid bevezetővel arra szerettük volna felhívni a figyelmet, hogy a HILIC jelentős szerepet tölt be a hagyományos folyadékkromatográfiás módszerek között is.

7

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

2. A HILIC helye a hagyományos folyadékkromatográfiás módszerek között. A folyadékkromatográfiás módszereket a mozgó- és az állófázis jellege szerint csoportokba sorolhatjuk. A csoportba sorolás azért is célszerű, mert meg tudjuk adni azokat a vegyületcsoportokat, amelyek elemezését az adott módszer lehetővé teszi. Vagy megadhatjuk azt is, hogy az adott mozgó-, és állófázis milyen vegyületcsoportok elemzését nem teszi lehetővé. Az álló- és mozgófázis jellege szerinti beosztást adunk meg az 2.1. táblázatban. A 2.1. táblázatban megadott besorolást nevezzük a hagyományos folyadékkromatográfiás besorolásnak. Állófázis

Mozgófázis

Elnevezés

aolárisabb

apolárisabb

normálfázisú folyadékkromatográfia (NP-HPLC, NPLC)

apolárisabb

polárisabb

fordítottfázisú folyadékkromatográfia (RP-HPLC, RPLC

apolárisabb

polárisabb + hidrofób ion

fordítottfázisú ionpár- folyadékkromatográfia (RP-IP-HPLC, RPIPLC)

ionos

puffer, vagy ion tartalmú víz és szerves oldószer

ioncserés nagyhatékonyságú kromatográfia (IEC, IE-PLC)

apoláris, nagy pórus átmérőjű

szerves oldószer

nem vizes méretkizárásos kromatográfia (SEC), régebbi nevén gél permeációs kromatográfia (GPC)

poláris, nagy pórus átmérőjű

puffer

vizes méretkizárásos kromatográfia,(SEC), régebbi nevén gélszűrés

C-4, C-6 RP

só (1-4 mol/l)

HIC hidrofób kölcsönhatási LC

2.1. táblázat A hagyományos folyadékromatográfiás módszerek besorolása az álló- és a mozgófázis fázisviszonya alapján. A fázisviszonyok, és a fázisok felületi tulajdonságainak ismerete egyben megszabja a folyadékkromatográfiásan vizsgálható vegyületeket. Alaptétel, hogy csak azok a vegyületek határozhatók meg, melyek a mozgófázisban, a detektálás megszabta koncentrációban, kémiai átalakulás nélkül oldhatók. Ahhoz, hogy a vegyületek vándorlási sebessége között különbség legyen, az kell, hogy az állófázis felületén eltérő időt töltsenek. Ehhez a komponens és az állófázis között kölcsönhatásnak kell kialakulnia. Ha a komponens és az állófázis jellege nagyban eltér, akkor nem alakulhat ki olyan kapcsolat, hogy a visszatartás nagyobb legyen, mint a holtidő kétszerese. Ez a minimális visszatartás, ami azért szükséges, hogy a két komponens együtt eluálódásából eredő interferenciát minimalizáljuk. Ezeket a szempontokat figyelembevéve, a 2.2. táblázatban összegeztük az egyes módszerekkel meghatározható vegyületek jellegét.

8

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Módszer

Vegyület jellege

Kizáró ok

NP-HPLC

közepesen poláris

ionos jelleg, nincs poláris csoport a vegyületben, nagy polaritású anyagok

RP-HPLC

apoloráris

ionos jelleg kis apoláris résszel, nagy polaritás

RP-IP-HPLC

ionos

nem ionos vagy nem ionizálható

IE-HPLC

ionos

nem ionos vagy nem ionizálható

nem vizes SEC

apoláris polimer

poláris polimer ionos vagy ionizálható csoporttal

vizes SEC

biopolimerek

apoláris polimerek

HIC

biopolimerek

kis molekula

2.2. táblázat Az egyes folyadékkromatográfiás módszerek alkalmazhatósága a vegyületek jellege szerint. A 2.2 táblázatban megadtuk, hogy az egyes folyadékkromatográfiás módszerek milyen jellegű vegyületcsoportoknál használhatók, és milyen kizáró okok vannak, amelyek megakadályozzák a vizsgálatot. A 2.2 táblázatban megadott folyadékkromatográfiás módszereket a könnyebb átláthatóság érdekében bontsuk két csoportba. A folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegűeknek azokat tekintjük, melyek molekulatömege a 2-4 ezret nem haladja meg. Ezeket a vegyületeket azokkal a porózus és monolit töltetű kolonnákkal vizsgálhatjuk, melyek pórusátmérője 6-15 nm (NP-HPLC, RP-HPLC, RP-IP-HPLC, IE-HPLC). A második csoportba az efölötti molekulatömegűek tartoznak, amelyek vagy méretkizárásos folyadékkromatográfiával vagy nagy pórusátmérőjű töltetekkel határozhatók meg. Ha folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagokat vesszük szemügyre és megnézzük, hogy az egyes módszereknél milyennek kell a vegyületek jellegének lenni, és milyen kizáró okok teszik lehetetlenné használatukat, akkor azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a nagy polaritású vegyületek a megadott módszerek egyikével sem vizsgálhatók. A szerves vegyületek folyadékkromatográfiás meghatározásánál ezt a hiányzó szeletet tölti be a hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia (HILIC). A HILIC-nél, csakúgy, mint a NP-HPLC-nál vagy a RP-HPLC-nál, a fázisviszonyokat kell értelmezni. Ismételten hangsúlyozzuk a meghatározandó komponensek oldhatóságát a mozgófásban, és kölcsönhatásukat az állófázissal. A nagy polaritású vegyületek csak valamilyen poláris jellegű oldószerben oldódnak, kölcsönhatásuk csak akkor lesz számottevő az állófázissal, ha az polárisabb jellegű a mozgófázisnál. Az általánosan használt fogalmak szerint két eltérő módon poláris jellegű fázissal van dolgunk, ahol az állófázis polárisabb, mint a mozgófázis. A polárisabb állófázissal a vegyületek nagyobb kölcsönhatást alakítanak ki, mint a mozgófázissal, így véges visszatartásuk lesz. A mozgófázis oldaláról megfogalmazva, ahogy annak polaritása csökken, úgy abban a nagyon poláris komponensek vagy ionos anyagok oldhatósága is csökken, és az állófázis felületére szorulnak. Az eltérő vándorlási sebesség az egyes nagyon poláris vagy ionos vegyületek között azért jön létre, mert oldhatóságuk a mozgófázisban csökken, és ezzel párhuzamosan az állófázissal való kölcsönhatásuk nő. Ha a fázis viszonyok alapján a 2.1. táblázatban megadott módszerek közé helyezzük be a HILIC-t, akkor az IE-HPLC után tehetjük (2.3. táblázat).

9

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Állófázis

Mozgófázis

Elnevezés

polárisabb

apolárisabb

normálfázisú folyadékkromatográfia (NP-HPLC, NPLC)

apolárisabb

polárisabb

fordítottfázisú folyadékkromatográfia (RP-HPLC,RPLC

apolárisabb

polárisabb + hidrofób ion

fordítottfázisú ionpár- folyadékkromatográfia (RP-IP-HPLC, RPIPLC)

Ionos

puffer vagy ion tartalmú víz és szerves oldószer

ioncserés nagyhatékonyságú kromatográfia (IEC, IE-PLC)

polárisabb

kevésbé poláris

hidrofil kölcsönhatási kromatográfia (HILIC)

apoláris, nagy pórus átmérőjű

szerves oldószer

nem vizes méretkizárásos kromatográfia, (SEC), régebbi nevén gél permeációs kromatográfia (GPC)

poláris, nagy pórus átmérőjű

puffer

vizes méretkizárásos kromatográfia (SEC), régebbi nevén gélszűrés

C-4,C-6 RP

Só (1-4 mol/l)

HIC hidrofób kölcsönhatási LC

2.3. táblázat A HILIC besorolása a hagyományos folyadékromatográfiás módszerek közé az álló- és a mozgófázis fázisviszonya alapján Ha az NP-HPLC és a HILIC fázis viszonyait összevetjük, akkor könnyen érthetővé válik, hogy miért nem fázis polaritásokról, hanem polaritás viszonyokról beszélünk. Mind a HILIC-nál, mind a NP-HPLC-nál poláris jellegű az állófázis, és a mozgófázis ennél kevésbé poláris; csakhogy a HILIC-nál ez poláris jellegű oldószerelegyet jelent, míg a NP-HPLC-nél a mozgófázis fő komponense apoláris jellegű.

10

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Módszer

Vegyület jellege

Kizáró ok

NP-HPLC

közepesen poláris

ionos jelleg, nincs poláris csoport a vegyületben, nagy polaritású anyagok

RP-HPLC

apoloráris

ionos jelleg kis apoláris résszel, nagy polaritás

RP-IP-HPLC

ionos

nem ionos vagy nem ionizálható

IE-HPLC

ionos

nem ionos vagy nem ionizálható

HILIC

nagy polaritású, ionos

apoláris, és ionos állapotba nem hozható

nem vizes SEC

apoláris polimer

poláris polimer ionos vagy ionizálható csoporttal

vizes SEC

biopolimerek

apoláris polimerek

HIC

biopolimerek

kis molekula

2.4. táblázat Az egyes folyadékkromatográfiás módszerek alkalmazhatósága a vegyületek jellege szerint, és a HILIC helye ebben a besorolásban. A HILIC alapvetően a nagy polaritású és ionos anyagok elválasztási módszere. A protonfunkciós csoportot nem tartalmazó molekulák meghatározására, amelyek nagy polaritásúak, ez az egyetlen technika, amellyel az elválasztásuk megoldható. Ionos vagy ionos formába hozható vegyületeknél a HILIC mellett használható még a fordított fázisú ionpár kromatográfia és az ioncserés kromatográfia is. Az ionpár kromatográfiában az alkalmazott ionpárképző só formában van. Így a bevezetőben már leírtak szerint nem kompatibilis a tömegspektrometriás (MS), az elpárologtatás utáni fényszóráson alapuló (ELSD) és a korona kisüléses aeroszol (CAD) detektor használatakor.

2.1. A hidrofil kölcsönhatású kromatográfiában alkalmazott állófázisok és jellemzésük Az állófázis a folyadékkromatográfiában elsődlegesen megszabja a komponensek visszatartását. Emiatt elsőnek megnézzük, hogy milyen anyagok használhatók erre a célra. Minden szorbensnek, melyeket HILIC állófázisnak használunk, eleget kell tennie az általános elvárásoknak. Ezek a következők: • • • •

mechanikai stabilitás kis szemcseátmérő és kis szemcseátmérő eloszlás mikropórus mentesség a felületen nem lehetnek (nagyon eltérő mennyiségben) nagyban eltérő kölcsönhatási erősségű szorpciós helyek

A HILIC-ban használható poláris felületeknek, ennek megfelelően, a következő lehetőségeink vannak: • • • • •

szilikagél aluminium-oxid zirkónium-oxid titán-dioxid poláris módosított szilikagélek-(amino-, nitril-, diol stb.) 11

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

• anioncserélők • kationcserélők • zwitter-iont tartalmazó állófázisok Amennyiben a fenti listát áttekintjük, akkor azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az apoláris felületű állófázisokat kivéve, szinte az összes nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiában alkalmazott állófázis használható a HILIC-nál.

2.2. Folyadékkromatográfiás vegyületek osztályba sorolása a HILIC használatakor A folyadékkromatográfiás elválasztás tervezésének első lépése az állófázis fizikai paramétereinek kiválasztása. A fizikai paraméterek alatt több, a töltetre jellemző adatot értünk. A töltet szemcseátmérője alapvetően megszabja a zónaszélesedést és ezzel az elméleti tányérszámot. Ezt a hatást részletesen tárgyaltuk a Dr. Fekete Jenő, A folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edisonhose, 2006 és Dr. Fekete Jenő A folyadékkromatográfia fejlesztési irányai, Merck, 2008. című könyvekben. Itt csak a lényeges elemeket és azoknak a folyadékkromatográfiás készülékek kiválasztására gyakorolt hatását foglaljuk össze röviden. A szemcseátmérő megszabja a töltetre jellemző Hmin és umin értékeket. Ezek az adatok teszik lehetővé, hogy az eltérő szemcseátmérőjű tölteteket összevessük. A gyakorlatban soha nem dolgozunk ezen paraméterek alkalmazásával. Az ok nagyon egyszerű, mivel a folyadékkromatográfiában a zónaszélesedést a diffúziós folyamatok kontollálják és a diffúzió alapjellege, hogy lassú. A diffúzió kontollált folyamatoknál az idő faktor alapvető (lásd Fick I és Fick II. törvény) a mért Hmin kis umin értéknél van. Ez gyakorlatban az elemzési idő jelentős mértékű növekedését eredményezné. Ezért a gyakorlati életben ettől a ponttól jobbra, nagyobb lineáris áramlási sebességeknél dolgozunk, ahol az anyagátadási ellenállás növeli a H értéket. Ezt is a diffúziós folyamatok szabják meg, amely közül a porózus szemcsén belüli diffúziós úthossz adja a legnagyobb járulékot. Ez viszont szorosan összefügg az állófázis szemcseátmérőjével. A szemcseátmérő megválasztása megszabja a kromatográfiás elválasztás hatékonyságát, ezért alapvető jelentőségű. Az előbbiek csak akkor igazak, ha a szemcseátmérő eloszlása egy szűk intervallumba esik. A másik, állófázisra jellemző tényező, a töltet pórusátmérője. Ezt a molekula mérete szabja meg. A ma alkalmazott folyadékkromatográfiás töltetek döntő többsége porózus szerkezetű. Ez igaz a HILIC tölteteknél is. Bármilyen típusú HILIC állófázist használunk is a visszatartás biztosításához a töltet fajlagos felülete alapvető. A porózus szerkezet adja a nagy fajlagos felületet és ezen keresztül a nagy visszatartást. A fajlagos felület és a visszatartás fordított arányban vannak. A pórusátmérő csökkentése a fajlagos felület növekedését eredményezi. Ahhoz, hogy a fentiek igazak legyenek, a vegyületeknek be kell diffundálni a pórusokba. A pórusátmérő csökkentésének határt szab a molekula mérete. A pórusdiffúzió a stagnáló, a mozgófázis összetételével megegyező összetételű folyadékelegyben történik. Ebből a szempontból a diffúzió sebessége megegyezik a szemcsék közötti térben mérttel, mindaddig, amíg a pórusfal nem gátolja azt. Ez annyit jelent, hogy a pórusnak olyan átmérőjűnek kell lenni, hogy a molekulák szabadon diffundálhassanak abban. Bármely hatás ugyanis, amely a diffúzió sebességét csökkenti a pórusokban, az a zóna kiszélesedését eredményezi. Ahogy azt már hangsúlyoztuk, a fajlagos felület és a pórusátmérő között fordított arányosság áll fenn, és a nagy fajlagos felület azért szükséges, hogy nagy legyen a töltet visszatartása. Egy kromatográfiás kolonnában a visszatartást az össz. fajlagos felület szabja meg. Ezt a tételt úgy kell módosítanunk, hogy a vegyületek számára hozzáférhető felület. Ezzel későbbiekben foglalkozunk.

12

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC A nagy visszatartásshoz, tehát kis pórusátm mérőjű tölteet kell. Nézzzünk meg eegy közelítő elméleti modellt, hogy a pórrusátmérő cssökkentéséneek mik a hattárai. Egyik oldalról a pórusátmérő csökkentésnek határt h szab, hogy h a vizsg gált molekulaa nem tud a pórusba bed diffundálni. E Ezt nevezzük k kizárási molekulaatömegnek. A 2.1.1. ábrrán látható, hogy h kb. egy y 10 000-es molekulatöm megű makromolekula átmérőjee megegyeziik a pórusátm mérővel, így y abból kizáródik.

2.1.1. ábra a A porózus tööltet és a moolekulatömegg (molekula átmérő) viszzonya. A porózus tölteteek naggy részénél a kiindulási szilikagél átlagos á pórussátmérője 10 0 nm. A biop polimerek viizes olldatban felteekeredett állaapotban van nnak. A 10 nm-es n pórussból általábaan kizáródna ak. A molekulatö ömeg csökkeenésével a molekulák egyre több pórusba tu udnak behatolni, így hatásba lépni a pórus fellülettel. Ez teermodinamik kailag alapveető a visszataartáshoz (k), azonban kölcsönh a diffúzziójuk ekkorr a pórusban n gátolt (kin netikai oldaal), ami nagy y zónaszelesedést okozz. Ahhoz, hogy kiss zónadiffúzzió legyen, a másik oldaalról figyelem mbe kell ven nnünk, hogy y a vegyülett a pórusokban stagnáló folyadékban viszonylag v s szabadon diiffundáljon, a pórusátm mérő/moleku ulaátmérő aránynaak kb. 10-nek kell lenni.. Ezt a helyzzetet adtuk meg m a 2.1.2. ábrán.

2.1.2. ábra a A porózus tölltet pórusátm mérőjének éss a molekula améretének viszonya v a sszabad diffúzzió (póórus által neem gátolt) szzemszögéből.. Ha a pórussátmérő és a molekula áátmérő viszonya 1:10-heez, a molekula a pórusbaan stagnáló folyadékban f n szabadon ddiffundál. Ek kkor a moleekulatömeg kb. 1000-4 4000 közé esik. e A HILIC gyakorlattában ez atttól függ, hogy azz állófázis milyen m jellegű ű. Ez alatt azt a értjük, ho ogy módosíttott vagy m módosítatlan. A töltetek jellemzésénél, am mikor a gyáártó cégek megadják m a pórus p átmérő őt, akkor azok a módosítás előtt k. Ez a módo osított töltettekre egy iráányszám, meert a pontos érték a tölteet pórusátmérőjének, értendők szilikagéél alapú álló ófázisnál a módosítószer m r méretétől iss jelentősen függ. Minéll nagyobb az átlagos pórusátm mérő, annál nagyobb molekulatöm m megű anyago ok diffundállnak be a p pórusokba. 30 3 nm-es átlagos pórusátmérő őjű töltetekb be a 10 000 0-es moleku ulatömegű anyagok is g gátlás nélkü ül tudnak ndálni. Ezeket a töltetekett „WP” (widee pore) jelzésssel látják el, ez megmutaatja a felhaszználónak, bediffun hogy naagy molekulaatömegű any yagok elválaasztására alk kalmas tölteetről van szó ó.

13

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

Összegezve az előzőket: •

•

14

a HILIC-nél használt töltetek nagy részénél a pórusátmérő 6-20 nm között változik, így az 1000-4000-es molekulatömegig a vegyületek vizsgálhatók. Az ebbe a molekulatömeg tartományba eső vegyületeket nevezzük folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagoknak. Ezeknél a tölteteknél a két vagy három helyiértékű szám előtt, amely pórusátmérőt adja meg Angströmben, nincs külön jelzés. amennyiben a töltetek nem folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagok elválasztására alkalmasak, akkor „WP” (Wide Pore), Bio mozaikszó szerepel a pórusátmérő előtt.

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC

3. Szilikagél, mint HILIC állófázis A szilikagél, mint állófázis jól ismert a NP-HPLC-ban. A felülete poláris, ez alapvető, mind a NP-HPLC, mind a HILIC technikánál. Ahhoz, hogy megértsük a két módszer közti különbséget, meg kell ismernünk a szilikagél felületi fizikai-kémiai tulajdonságait. A szilikagél alapváz SiO4 tetraéderekből áll (3.1. ábra). A szilikagél felszíne –OH (szilanol) csoportokkal borított. Mérések szerint a szilanol-csoport sűrűség 8-9 μmol/m2. OH

OH O

Si O

O

Si O

határfelület

OH O

Si

O

O

szilárd fázis

3.1. ábra Szilikagél alapváz A két szilicium atomot oxigén köti össze, az így kialakult sziloxán kötés apoláris. A polaritást a szilanol csoportok okozzák. A hagyományos NP-HPLC-nál az alkalmazott mozgófázisokban a szilanolcsoportok nem disszociált molekuláris formában vannak. A HILIC mozgófázisok mindig tartalmaznak kis mennyiségű vizet, ami lehetővé teszi a szilanolcsoportok disszociációját. A szilanolcsoportok molekuláris formáját a mozgófázis pH-ja szabja meg. Kis pH értékeken ion visszaszorított formában vannak, nagy pH értékeken ionizált formában. Ekkor kationcserélőként viselkednek. Nézzük meg, hogy a HILIC módszernél használt szilikagél milyen tulajdonságokkal rendelkezik. Elsőnek a hagyományos folyadékkromatográfiában használt szilikagél tulajdonságait tekintjük át. A mai besorolás szerint hagyományos folyadékkromatográfiának tekintjük azt, amikor a készülékek maximális nyomása 400-500 bar (6000 PSI) és a kolonnán kívüli zónaszélesítő hatásokat a 100250 mm hosszú és 4,6 mm belső átmérőjű kolonnákra tervezték. A hagyományos HPLC-ban használt szilikagél formáját, szerkezetét a következő tulajdonságok jellemzik: • • • • • •

átlagos szemcseátmérő, dp , 3-10 μm között szemcseméret eloszlása: ±20% alak, geometria (gömbszabályos [reguláris], szabálytalan [irreguláris]) pórusátmérő, 6-20 nm között fajlagos felület, 50-400 m2/g között fajlagos pórus térfogat, 0,5 – 1,0 cm3/g között

A szilikagél nagy mechanikai stabilitása miatt az elsőszámú állófázis az NP-HPLC-ban és a HILIC-ban. A szűk szemcseméret-eloszlási intervallum egyrészt azért fontos, mert: • •

a kisebb szemcsék az oszlopot érő nyomásterhelés hatására beékelődnek a nagyobb szemcsék közötti járatokba („beton effektus”), így jelentősen növelik a nyomásesést, és a kolonna úgy fog viselkedni, mintha csupa kisebb átmérőjű szemcsével lenne megtöltve; másrészt jelentősen nő a zónaszélesedés, ha nő a szemcseátmérő eloszlás.

15

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A töltetet alko otó szemcsék k alakja és geeometriája a fenti két össszefüggés miaatt érdemel figyelmet. f a részecsskék mechaniikai paramétereit, azt tapasztaljuk, Összehassonlítva a szaabályos és szzabálytalan alakú hogy a szabályos szemcsék s sokkal jobban n ellenállnak k a nyomássterhelésnek,, kevésbé porlódnak apróbb darabokká, és térkitöltéésük is sokkal egyenleteesebb, mint a szabálytallan alakú szzemcséké 3 ábra). (3.2. – 3.3.

3.2. ábra á Szzabályos alaakú szemcsékk

3.3 3. ábra alakú szemcsék Szabálytalan S Áraamlási csatorna szűkülés s

3.4. ábra A szabálytallan alakú szemcsék porlódásának mechanizmus m sa A kromatográáfiás oszlopon n az áramláss csak a szem mcsék közöttt történik, haa az áramlási keresztmetszet csökken, ak kkor a nyomáásesés nő a kolonnán. A porozitás a szilikagél igeen fontos tullajdonsága. A szilikagél gömb g belül ccsatornákat, zegzugos járatokaat rejt, ezáltaal fajlagos feelülete, és íg gy adszorpciós kapacitássa igen nagy y. Azz egyes gyárttmányok eseetében megad dott átlagos pórusátmérő p tág pórustarttomány legjeellemzőbb pórusmééretét jelzi. Például egy Si S 60 jelzésű szilikagél áttlagos pórusáátmérője 60 Å∗, de 6 – 400 4 Å-os járatokatt is tartalmazz. A pórusm méret csökken nésével növek kszik a fajlag gos felület, d de jelentős mértékben m csökken az ún. kizáráási molekulattömeg∗∗. képpen a Lichrosorb illl. a Lichrosp pher tölteteek fizikai Azz 3.1. tábláázat tartalmazza példak jellemző őit.

∗ ∗∗

16

A foly yadékkromato ográfiás gyak korlatban a pórusátmérő mértékegysége m e az Ängström m (Å) 1Å = 0,1 nm A kizzárási moleku ulatömeg azt jelenti, hogy y a molekulaa átmérője nagyobb, n min nt a pórusátm mérő és a komp ponens nem tu ud bediffundáálni.

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC

LiChrosorb®

Fajlagos felület (m2/g)

Fajlagos pórustérfogat (ml/g)

Kizárási molekulatömeg (Dalton)

Si 40

800

0,6

4,000

Si 60

500

0,7

20,000

Si 100

300

1,0

40,000

Si 60

700

0.85

20,000

Si 100

400

1.25

70,000

100 DIOL

350

1,25

40.000

LiChrospher®

3.1. táblázat Különböző pórusméretű szilikagélek adatai

A szilikagél állófázisok felületi tulajdonságai: A szilikagél felületén három eltérő tulajdonságú szilanol csoportot találunk:

OH Si

OH

O

Si

3.5. ábra Szabad szilanol csoportok

O Si

H

O

O

H

Si

3.6. ábra H-hidas kötésű szilanol csoportok A szabad szilanol csoportok egymástól 0,5 nm-nél nagyobb távolságra vannak. Ha ennél kisebb a távolság, akkor H-hidak alakulnak ki az egyes szilanol csoportok között, melyek nagyban csökkentik az állófázis aktivitását. A szilikagél felületén kialakulhatnak ún. szilándiolok, amelyek már nem tudnak H-hidas kölcsönhatásba lépni (3.7. ábra).

HO

OH Si

3.7. ábra Szilándiol 17

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Tehát az előzőekből is látszik, hogy a szilikagél felülete energetikailag heterogén, nem mutat egységes adszorpciós tulajdonságokat kromatográfiás szempontból.

H H

O

O H

O

O

Si

Si

O

O

O

H

O

3.8. ábra A szilikagél kölcsönhatása vízzel A fizikailag szorbeálódott víznek a HILIC elválasztásnál nagy jelentősége van. Ez adja azt a határfelületi réteget, amelybe a vizsgálandó komponensek beoldódnak. A leegyszerűsített kromatográfiás kép alapján, minél nagyobb a vegyületek vízoldékonysága, annál több időt töltenek ebben a határfelületi rétegben. A határfelületi rétegben a tartózkodási idő megegyezik a vegyületek nettó retenciós idejével. Az egyes vegyületek nettó retenciós ideje közti különbség a kromatográfiás rendszer szelektivitását adja meg. Tn = tr-tm

[3.1.]

α = tn2/ t n1

[3.2.]

ahol: tn a nettó retenciós idő, a tr a bruttó retenciós idő és tm a holtidő. Neue (2.1. Estimation of the extent of the water-rich layer associated with the silica surface in hydrophilic interaction chromatography David V. McCalleya,*, Uwe D. Neue Journal of Chromatography A, 1192 (2008) 225–229) és munkatársai kimérték, hogy a szilikagél pórusainak 4-13 %-a vízzel feltöltött a 70-95 % acetonitril-víz mozgófázis használatakor. Hasonló eredményt kaptak a teljesen porózus Atlantis szilikagélre és a héjszerű töltetre (Halo). A mérésekre benzolt használtak, és feltételezték, hogy a benzol nem lép kölcsönhatásba a nagy víztartalmú határfelületi réteggel. A felületi inhomogenitást még csak fokozza a fémszennyezők jelenléte a szilikagélben. Fémionok beépülése a szilikagél szerkezetbe erős kölcsönhatási energiával rendelkező ioncserélő és komplexképző centrumok létrejöttét jelenti, illetve még polarizáltabbá teszi az Si–OH-kötéseket. A fémionokkal és a polarizáltabb szilanol csoportokkal a molekula kölcsönhatások energiája jóval nagyobb, mint a nem fémion környezetben lévő szilanol csoportoké, amely a kromatográfiás csúcs kiszélesedéséhez, torzulásához vezethet. A modern szilikagél állófázisok már csak néhány ppm fémszennyezést tartalmaznak. Ezeket nevezzük nagy tisztaságú vagy harmadik generációs szilikagélnek. (Silica B) A fentebb ismertetetteken kívül a szilikagél felületén lehetnek a gyártásból visszamaradt savas, vagy bázikus karakterű szennyezések. Ezek a tényezők együttesen szabják meg az állófázis kromatográfiás tulajdonságait, nevezetesen a visszatartást, a zónaszélesedést, a szelektivitást, vagyis az elválasztást. A fém-ion tartalom változása viszont megváltoztatja a felületen a szilanol csoportok molekuláris állapotát, ami befolyásolhatja a vízréteg vastagságát. Egyéb, a retenciót befolyásoló hatás itt nem várható.

18

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC

3.9. ábra A HILIIC-nál haszn nált szilikagéél felületének k változása a pH függvéényében. A 3.8. ábra azzt mutatja, hogy h a szilik kagél erős kö ölcsönhatásbaa lép a vízzeel. Eddigi ism mereteink uláris rétegb ben adszorbeeálódik, létreehoz egy megosztó fáziist. A két fáázis közti szerint, több moleku folyadék k-folyadék megoszlás m m mellett a sziilanolcsoporrt molekulárris formájáttól függően felléphet egy mássik kölcsönh hatás is, ameely a visszattartást, a szeelektivitást és é a csúcsallakot is befo olyásolja. Ez a kölccsönhatás azz ioncserés kölcsönhatás. k . Ez a kölcsö önhatási form ma a RP-HPLLC módszerben tiltott. Kérdés, hogy a HIL LIC módszeernél vajon ki lehet-e használni az a elválasztás szelektiv vitásának növeléséére vagy ez itt is tiltott. A HILIC-nál is alaptétel,, hogy olyaan erős kölccsönhatás az a ionozált szilanolcsop port és a ött nem jöhett létre, amely y irreverzibillis adszorbciiót vagy asziimmetrikus csúcsokat c protonállt amin közö eredmén nyez. A viszo onyok viszon nt nagymérttékben külön nböznek a RP-HPLC-hoz R z képest. A HILIC-nél H a vízréteegbe történő megoszlás és é az erős ioncserés (ionos) kölcsönh hatás a két fő ő retenciót megszabó m tényező.. A 3.9. ábrrán a pH füg ggvényében n adtuk meg g a szilanolccsoport moleekuláris állaapotát. A kis pH értékeknél é a szilanolcso oportok ionizációja visszaszorított. Ekkor csak H-hidas kö ötés jöhet létre a pozitív töltésű ű aminokkall, ez egy gyeenge kölcsönhatás, amely ynek a kromaatográfiás erredménye n pH-n a szilanolcsoport teljes egészében szimmettrikus kromaatográfiás cssúcs. A másik véglet a nagy ionos forrmában lenn ne, de ez a HILIC körülméények közöttt nem lehetsééges, mert a szilikagél felloldódna. A közbeenső pH értékeken a kéét molekuláris forma arránya a pH függvénye.. Amennyib ben a két forma aránya a összeemérhető, ak kkor ezekneek a pH értéékeknek haszználata is leehetséges. McCallay, M aki bázissos csoporto ot tartalmazó ó vegyületek k elválasztássát, mind RP P-HPLC, min nd HILIC mó ódszerben tanulmáányozta, a ko olonna túlteerhelésével ellenőrizte, e hogy h fellépn nek-e olyan eerős kölcsön nhatások, melyek inkompatibi i ilitást eredm ményeznek. (In nterneten ellérhető: www.sciencedirrect.com Jou urnal of Ch hromatography A, 1171 1 (2007) 46–55. Is I hydrophiliic interaction n chromatogrraphy with silica s column ns a viable allternative to reversedphase liquid chromaatography foor the analyssis of ionisa able compoun nds? David V. McCalleyy) M McCallay azt találta, hogy y a kolonna terhelése a savas közeg gű HILIC elváálasztásnál tízszerese t a RP-HP PLC-nél tapaasztaltaknak k. Ez annyit jelent, hogy y a HILIC megfelelőbb eelválasztási módszere m az ionizzálható bázissos csoporto ot tartalmazó ó vegyületek knek, mint a RP-HPLC. Különböző Silica B kolonnáák azonos reetenciós sorrrendet adtak k. A visszataartás mértékee is megegy yezett a közeel azonos fajlagos felületű szillikagéleknéll. oportok moleekuláris form mája kérdésess. A Silica B alapú szilikaagéleknél A határfelületii szilanolcso a szilano olcsoportok átlagos pKaa értéke 5-7.. Köztudott, hogy nagy szerves oldó ószer tartalm mú közegekben a gyenge savak s pKa értéke é megv változik. Álttalában a nagyobb n értéékek felé to olódik el. C visszatartáást megalapo ozó elmélet szerint a határfelületen h n egy vízrétteg jön létree. Ez azt A HILIC okozhatj tja, hogy a szilanolcsopo s ortok pKa érrtéke nem változik. v Azo ok az értékek k lesznek mérvadók, m melyekeet a vizes közegben mértek m ki. A pH<3 saavasságú közegekben a szilanolccsoportok prototon nált formábaan vannak. Ez E a pH értéék a vizes kö özegben mérrve értendő. A kis pH értéékeknél való ó működés nem n okoz sttabilitási pro oblémákat. A szilikagéll polisav, amely saavas közegb ben nem old dódik. A külö önböző cégeek által forg galmazott, éss a HILIC elv választásokra ajánlott szilik kagéleknél ezz az alsó pH H érték 1-2. Az egyes pH H érték alattt a szilanolccsoportok v töltésű cssoportok an nioncserélőkéént viselked dnek. Egyess szerzők protonállódhatnak, és a pozitív szerint a szilanolcsoport izoeleektromos po ontja a 2-3 pH körül van. v Valószín nűleg az újabb erős kölcsönh hatás elkerü ülése miatt ajjánlják, hog gy a szilikagééleket 1-2 pH érték felettt használjuk.

19

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A felső haszn nálati pH teekintetében az egyes szzilikagélek esetén e még nagyobb azz eltérés. nagyobb 8-8 8,5. Az eltérő ő felső pH érrtéket részbeen magyarázzhatja az A legalaacsonyabb 5, míg a legn eltérő szzilanolcsopo ort aktivítás,, részben azz előállítás módja. m A szól-gél techn nológiával előállított e szilikagéélek, általáb ban kisebb fajlagos f felü ületűek és vaastagabb pórusfalúak. Így a pH staabilitásuk nagyobb b. Kéérdés, hogy akkor mi a különbség a NP-HPLC elválasztások e kra, és a HIL LIC módszerrre forgalomba hozott h kromaatográfiás kolonnák közzött. A kérdésre adandó ó válasz nag gyon egyszerrű, mivel a két szilikagél, am melyet két kü ülönböző cég hoz forgaalomba, a pó órus paraméétereiben kü ülönbözik d felületi tulajdonsága t aiban nem, egyszerre leehet NP-HPL LC-ban és H HILIC-ben használni. ugyan, de Mindenk kiben joggal merül fel a kérdés, ak kkor mit is ajánlanak NP-HPLC N alkkalmazásra és mit a HILIC-ree? A válasz nag gyon egyszeerű; a szilik kagél azonos, értve ez alatt az oszzloptöltetet,, csak az n tárolják különböző! k A NP-HPLC-ban haszn nált szilikagéél kolonnát apoláris oldószerr, amelyben oldószerrben tároljáák. A HILIC C célra hassznált szilik kagél kolon nna oldószeere acetonittril vagy acetonittril-víz elegy ye. A protonfunk kciós vegyülletek elválassztásakor a HILIC-nél is elkerülhettetlen a pH kontroll. e n pH Kis pH értékeken a szilikagél, ahogy az előzőekben kifejtettük, lévén polissav, stabil, nagy értékekeen viszont az alapsziliikagél oldód dik. Az old dódás változzását a 3.9 ábrán adttuk meg. A szilikaagél oldható ósága 7-es pH p felett jeleentősen nő, amire ügyellnünk kell, h hogy a nagy y szerves oldószerr tartalmú mozgófáziso okban a hidrogén-ion aktivitása jelentősen j nő. Ha a szilikagél s felületén n egységesen vízborítotttság van, akkor a ezt a pH eltolódáást nem kelll figyelemb be venni. Ha egyes felületi résszeket aceton nitril-víz borrít, akkor itt pH eltolódáss lesz, amely y a szilikagél hosszúh idejű staabilitását jeleentősen befolyásolhatja. Ez akár 2-3 egységgel iss növelheti aaz aktuális hidrogénion aktiv vitást. Ez a hatás h mindenképpen a felső f pH értéék csökkentését kívánná meg. A mássik hatás, hogy a kioldódó szilikát term mékek ionoso ok, amelyek k oldhatósága a nagy acetonitril tartalmú 1000-szer kiisebb, mint vízben, v ez kiinetikailag gátolja g a gyo ors oldódástt. mozgófáázisba 100-1 M Mindenesetre a pH>7 alkaalmazásakor a kolonna élettartama é j jelentősen cssökkenhet. A Silica A és a Siliica B kolonn na közül, a kisebb k szilan nol aktivitású ú Silica B ko olonna válassztása az elő őnyösebb. A viszon nyokat a 3.1 10. ábrán ad dtuk meg.

3.10. ábra A szzilikagél oldh hatósága a pH p függvényyében

20

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Ismételten hangsúlyozzuk, gyártók által forgalmazott HILIC szilikagél abban különbözik a normálfázisú folyadékkromatográfiában alkalmazottól, hogy acetonitrilben hozzák forgalomba. A zirkónium- és a titán-dioxidot ma még nem, vagy ritkán alkalmazzák, de elvi akadálya nincs, hogy alkalmazzuk, mint HILIC állófázist. Néhány a HILIC gyakorlatban használt szilikagélt az alábbiakban adunk meg: Betasil (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) [30], Hypersil (Thermo Scientific) [31], Inertsil (GL Science, Tokyo, Japan) [32], Kromasil (EKA Chemicals, G¨oteborg, Sweden) [33], Supelcosil LC-Si(Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) [34], Alltima (Alltech, Nicholasville, KY, USA) [35], Spheri5 Silica (Alltech) [36], and Supersphere Si (Trentec, Gerlingen, Germany) [37]. Atlantis (Waters) [38–46]. Waters for HILIC mode ultrahigh-performance liquid chromatography (UPLC) [47,48]. Luna HILIC (Phenomenex) Ascentis silica ((Supelco, Bellefonte, PA, USA).

3.1. Szilikagél használata HILIC állófázisként A rövid felsorolásból is látható, hogy mind a Silica A , mind a Silica B osztályból is használtak szilikagéleket poláris vegyületek elválasztására. Egyben ez annyit jelent, hogy bármely normálfázisú folyadékkromatográfiában használt állófázis használható a HILIC technikában. A folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagok elválasztására a 10 nm (100 Å) ,a folyadékkromatográfiásan nagy molekulatömegű anyagok elválasztására a 30 nm(300 Å) pórusátmérőjű szilikagéleket használjuk. A 3.1.1. táblázatban a LiCHrosorb sorozatra adtuk meg a pórusátmérőket és a kizárási tömegeket. Ez a szilikagél a Silica A osztályba tartozik és a Merck cég terméke. A továbbiakban ugyanennek a cégnek a Silica B kategóriába tartozó termékeit adjuk meg a specifikációjukkal együtt (3.1.2. táblázat) Fajlagos felület (m2/g)

Fajlagos pórustérfogat (ml/g)

Kizárási molekulatömeg (Dalton)

LiChrospher® Si 60

700

0.85

2 · 104

LiChrospher® Si 100

400

1.25

7 · 104

LiChrospher® 100 DIOL

350

1.25

4 · 104

LiChrosorb® Si 40

800

0.6

4 · 103

LiChrosorb® Si 60

500

0.7

2 · 104

LiChrosorb® Si 100

300

1.0

4 · 104

Töltet megnevezése

3.1.2. táblázat A Merck cég által forgalmazott Silica B kategóriába tartozó termékek, amelyek a HILIC-ban állófázisként használhatók. A szilikagélek felülete energetikailag heterogén. A felületi szilanolcsoportok pKa értékét több tényező együttesen határozza meg. A HILIC-ban a szilanolcsoportok molekuláris állapota meghatározza a kölcsönhatásukat a vizsgált vegyületekkel. Bármilyen változás a molekuláris formájukban megváltoztatja a kölcsönhatási lehetőségeket, ez viszont a visszatartást befolyásolja. A szakirodalom ezt a jelenséget úgy interpretálja, hogy a szilikagélek használatakor az egyensúly beállása lassú. Nézzük meg, hogy ez a meglehetősen summás kijelentés mikor igaz és hogyan lehet ezt az időt csökkenteni. Ezt a jelenséget Snyder a fordított fázisú folyadékkromatográfiában behatóan tanulmányozta. Az ott szerzett tapasztalatokat ültetjük át a HILIC-nál alkalmazott körülményekre.

21

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A lassú egyensúly beállás oka jelenleg nem ismert. Snyder feltételezte, hogy a szilanolcsoportok molekuláris formáinak változása (egyensúly beállása) a pH változtatásával gyors (3.1.3.): SiOH = SiO-+H+

[3.1.3.]

Emellett a protolitikus folyamat mellett lejátszódik egy másik is, amelynek eredete nem ismert (3.1.4): XH=X-+H+

[3.1.4.]

Ez a folyamat kinetikailag gátolt. Az eddigi ismereteink szerint az anion protonfelvétele lassú folyamat. Itt kimondottan kinetikai gátlásról van szó. Az egyensúly beállását nem segíti, hogy nagyobb térfogatáramlási sebességgel több mozgófázist áramoltatunk át a kromatográfiás kolonnán. Egyedüli paraméter az idő. Snyder azt találta, hogy az általa vizsgált 19 Silica B alapú kolonnából ez az egyensúly-beállási probléma 8 kolonnánál lépett fel. Ezeket a vizsgálatokat fordított fázisú kolonnákkal végezte. Ha ezek az egyensúly-beállási problémák a kémiailag módosított szilikagéleknél felléptek, akkor a módosítatlan szilikagéleknél is fel kell, hogy lépjenek. Feltételezések szerint a proton felvételi sebesség a lassú folyamat, ezért a hatás a 2-3 pH körüli értékeknél erősebben érzékelhető. Mindaddig, amíg a XH/X- arány nem lesz állandó, addig a visszatartás is változhat. A továbbiakban meg kell néznünk, hogy milyen típusú vegyületek azok, amelyek a XH/X- arány változására érzékenyen reagálnak. Folyadékkromatográfiásan a vizsgálandó vegyületeket négy csoportba sorolhatjuk: 1. 2. 3. 4.

Kromatográfiásan semlegesek; a és b csoport. Savas csoportot tartalmazók Bázisos csoportot tartalmazók Ionos csoportot tartalmazók.

A négy csoport közül az 1a osztályba soroltak kivételével az összes csoportba tartozó vegyület meghatározható HILIC-val, ha a vegyületek lgP értéke kisebb mint -0,5 vagy -1. Most sorba vesszük az egyes osztályokat és megnézzük, hogy hol reagálnak jelentősen a XH/X- arány megváltozására. 1.

A kromatográfiásan 1.b osztályba azok a vegyület tartoznak, amelyek poláris csoportot tartalmaznak. A poláris csoportok molekuláris állapotát a pH változtatása nem változtatja meg. Például a HILIC-val meghatározható vegyületek közül ilyenek a polihidroxi vegyületek. Nézzük meg a cukrokat, amelyek a “legrégibb” HILIC vegyületek. A cukrok beoldódnak a határfelületi vízrétegbe, és H-hidas kölcsönhatást alakítanak ki a vízzel körülvett szilanolcsoporttal. Ez a H-hidas kölcsönhatás gyenge, mert a víz is erős H-hidat képez a szilanolcsoporttal. Ennek eredménye, hogy az ebbe az osztályba tartozó vegyületek csak kis mértékben reagálnak az XH/X- arány megváltozására. Tehát az ebbe a csoportba tartozó vegyületeknél az egyensúly beállás lassúságából eredő probléma csak kis mértékű.

2.

A kromatográfiásan 2. osztályba sorolt vegyületeknél (savas csoportot tartalmazó vegyületek) a molekuláris formák arányát állandó értéken kell tartani. A vegyületek oldaláról nézve szükséges a pH kontroll. A pH megváltoztatja a XH/X- arányt. A HILIC-nál is érvényes, hogyha lehet, akkor az elválasztást az ion-visszaszorított formában végezzük. Egyes szakirodalmak ezt nevezik a savas csoportot tartalmazó vegyület semleges formájának. Ekkor a pKa-2=pH értékeknél kisebbeken dolgozunk. Az anionos ismeretlen felületi elem ekkor protonálódik. A 3.1.3. és a 3.1.4. egyenlettel jellemzett egyensúlyok baloldalra tolódnak el. A 3.1.3. egyenletben megadott szilanolcsoport protonálódása gyors, ezért ami az egyensúly beállását megszabja, az az ismeretlen anion protonálódása (3.1.4.). A savas csoport, mind az ion visszaszorított szilanollal, mind az ismeretlen anion protonált formájával H-hidas kölcsönhatást tud kialakítani. Ennek erőssége nagyobb, mint az alkoholos hidroxiddal kialakított-é. Továbbra is igaz, hogy ezt a kölcsönhatást gyengíti, hogy a víz molekulák is kialakítanak H-hidakat a két protonált csoporttal. A protonálódás befejeződése után a retenció állandó lesz. A lassú egyensúly beállás miatti retencióváltozás a savas csoportot tartalmazó

22

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC vegyületeknél már nagyobb lehet, mint a kromatográfiásan semlegeseknél (1.b). Ha a vegyületek poláris jellegének növelése miatt a savas csoportot ionos formába akarjuk hozni, akkor célszerű a pKa+2=pH feletti tartományban dolgozni. Ennek határt szabhat a szilikagél oldhatósága. Ha a savas csoport pKa értéke öt, akkor ez hetes pH-t jelent. Ezen a pH értékén a 3.1.3. egyenlettel megadott folyamat a jobb oldali irányba tolódik el. A szilanolcsoportok ionizálódnak, ezért a felületi töltéssűrűség jelentősen megnövekszik. Ehhez képest az ismeretlen eredetű protonfunkciós hely deprotonálódásából eredő töltés növekedés csak kisebb mértékben járul hozzá. Az, hogy a negatív töltések száma a szilikagél felületén idővel növekszik, csak kis mértékben csökkenti az ionos formában lévő savas csoportot tartalmazó vegyület retencióját. Általánosan elmondható, hogy 6-os pH felett a savas csoportot tartalmazó vegyületek elválasztásánál nincs egyensúly beállási hatás. 3.

A kromatográfiásan 3. osztályba sorolt vegyületeknél (bázisos csoportot tartalmazó vegyületek) a molekuláris formák arányát állandó értéken kell tartani. A vegyületek oldaláról nézve szükséges a pH kontroll. A pH megváltoztatja a XH/X- arányt. A HILIC módszernél a bázisos csoportot tartalmazó vegyületeket általában kis pH értékeken határozzuk meg. Lehetőleg a pKa-2=pH értékeknél kisebbeken, mert ekkor a vegyületek teljes mértékben ionos formában vannak. A protonálódott aminok (pozitív töltés) visszatartása függ attól, hogy a határfelületi fázisban a negatív töltést hordozó helyek száma mennyi. A 3.1.3. egyenlet szerint a szilanolcsoportok gyakorlatilag protonálódtak. Az XH csoportok pKa értékei nem ismertek, csak annyi, hogy protonálódásuk lassú. Az X- csoportok számának csökkenésével a protonált aminnal való erős kölcsönhatás lehetősége csökken, ami visszatartás csökkenést eredményez. Aminok HILIC-val történő mérésekor, kis pH értékeken, számolhatunk egyensúlybeállási problémákkal. Ha lehetőségünk van bázisos csoportot tartalmazó vegyületek elválasztására, pH>6 savasságú közegben, ahol a bázis ion-visszaszorított formában van, akkor nem lép fel erős kölcsönhatás a szabad bázis és a felületen lévő aniononos hely között. Az anionos helyek számát a szilanolcsoportok ionizációja szabja meg, ezért nem lép fel az egyensúly beállási probléma.

4.

A kromatográfiásan 4. osztályba sorolt vegyületek egy része állandó töltéssel rendelkezik.

Ha kis pH értéken dolgozunk, akkor mind az anionoknál, mind a kationoknál az állófázis felületén található negatív töltés befolyásolja a visszatartást. Például a kvaterner ammóniumsóknál az erős ioncserés kölcsönhatás szabja meg a visszatartást. Változik a negatív töltésű helyek száma a felületen, változik a visszatartás. Az eredmény csökkenő retenció. Az anionoknál az azonos töltések közötti elektrosztatikus taszítás miatt változik a visszatartás. Minél kevesebb a felületen a negatív töltés, annál nagyobb lesz a retenció. A kationok vagy anionok elválasztásakor, amikor kis pH értékeken dolgozunk, egyensúly beállási problémával találkozhatunk. pH>6 (lúgos) közegben, ahol a negatív töltést döntően a szilanolcsoportok ionizációja eredményezi, a lassú proton felvétel nem okoz egyensúly-beállási problémát. Az egyensúly beállás lassúsága kis pH értékeken nemcsak a szilikagélnél, hanem az összes szilikagél alapú HILIC állófázisnál problémát okozhat. Először röviden összefoglaljuk a fő jellemzőit az egyensúly beállás lassúságának, majd javaslatot teszünk, hogy a gyakorlati életben hogyan lehet hatását csökkenteni vagy teljes mértékben megszüntetni. Jellemzők: • • • • • • •

kis pH tartományban lép fel független a kolonnán a mozgófázis térfogatától, csak az időtől függ savas csoportot tartalmazó vegyületeknél retenciónövekedést okoz bázisos csoportot tartalmazóknál retenció csökkenést eredményez anionoknál retenciónövekedést okoz kationoknál retenció csökkenést okoz hőmérséklet növelésével az egyensúly beállási idő jelentősen csökken. 23

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A lassú egyen nsúly beálláás acetonitriilben még jo obban jelenttkezik, mertt gyakorlatillag nincs s A különböző ő kolonnagy yártó cégek ezért ajánlják, hogy proton, amely a follyamathoz szükséges. pár százzalék vizet vagy v puffert tegyünk az acetonitrilbee. A nagy szzerves oldósszer tartalmú ú mozgófázisokb ba csak szerv ves pufferko omponensek ket tehetünk,, mert külön nben kristály y kiválás kö övetkezik be. Ahogy a lassú egyensúly e b beállás jellem mzőit felsoro oltuk, a két legfontosab bb tényező, hogy kis pH érték keken következik be (saavas közegbeen), és időfo olyamat. Ah hhoz, hogy eegyes esetek kben akár órákig várjunk v az egyensúly e b beállásra, szü ükséges, hog gy a szilikaagél vagy szzilikagél alap pú HILIC kolonnáákat pufferbeen tároljuk. Még szervees pufferek használatak h kor is ügyeln nünk kell arrra, hogy ne legyeen túl nagy a koncentráációja, hogy a só kiválásst elkerüljük k!

3.2. Polárisan módosított m t szilikagéllek, mint HILIC H állófáázisok A polárisan módosított m szzilikagélek közül k a szén nhidrát analittikai alkalmazások miattt kiemelt szerepe van v az amin nofázisnak, a többi is allkalmazható különböző elválasztási célokra. A polárisan p módosíttott szilikagéélek általáno os felépítésétt a 3.2.1. ábrán adjuk meg. m

3.2.1. ábra a Polárris csoportott tartalmazó szilánnal kéémiailag móódosított szillikagél A propil csop porthoz kap pcsolódó am minocsoport poláris, és savas pH-n protonfelvéétel után anioncseerélő (ionoss) jellegű. A propilcsoportot távtarrtónak neveeztük el, meert a poláriss csoport közvetlenül nem kap pcsolódhat a szilicium-attomhoz, mertt nem lesz sttabil. A propiilcsoport „táv volságot” tart a szilicium és az aminocssoport között. A szilicium-atomhoz kapcsolód dó két metill-csoport sztérikuss gátlást jeleent, hogy azz újabb reak ktív szilán a szomszédoss szilanolcso oportokkal reeagáljon. 2 A sztérik kus gátlás miatt m kb. a szzilanolcsopo ortok fele reagál. 8 μmo ol/m átlagoss szilanol ko oncentrácsoport kon cióval szzámolva 3-4 4 μmol/m2 propilamino p ncentráció leesz a módosíítás után a szilikagél s felületén n. Ha a szilik kagél fajlagos felülete 300 3 m2/g, ak kkor ez 0,9-1,2 mmol/g borítottságot jelent. A felüleeten több faajta kölcsön nható csopo ort található ó. Reagálatlaan szilanol, aminocsop port és a propil, metilcsoport m ok. A 3.1. fejezetben bemutaattuk, hogy a szilanolcso oportok a mozgófázis m p pH-tól függő ően vagy v ionizáltt formában vannak. Az aminocsopo ort molekulááris formája,, és ezzel ionvisszzaszorított, vagy kölcsönh ható képesséége is pH függő.

gyantaa

N

CH3

+

+H

H

fázis am mino

proton

H+ CH H3 N H amino cssoport

a 3.2.2. ábra Az aminoocsoport prottonálódása Azz aminocsop port savas pH H-n protonállódik és anio oncserélővé alakul. a Propiilaminnal modellezve a folyam matot, az am minocsoport pKa p értéke 10.4. 1 A fázis felső haszn nálati pH-ja 7 7. Tehát pH kontrollt használv va az amino ocsoport anio oncserélőkén nt működik 24

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC CH3 + N H H

Ioncserélő kapacitás meq/g

CH3 + N H H CH3 N

I. III II. pKb

H

CH3 N

H

pH

3.2.3. ábra Az aminofázis molekuláris állapota a pH függvényében. A kolonnát 7-es pH alatt lehet használni, ezért pH kontroll használva a 3-7 tartományban anioncserélőként is működik A protonált aminocsoport H-hidas kötést alakít ki azokkal a vegyületekkel, amelyek aktív hidrogén-atomot tartalmaznak. Ugyancsak H-hidas kötést alakít ki a disszociójában visszaszorított szilanolcsoport. Az ionizált szilanol viszont kationcserélő helyként viselkedik. A propil- és metilcsoportok apoláris (hidrofób) kölcsönhatást tudnak kialakítani a vizsgált vegyületekkel. A poláris szilanolcsoportok, a protonált aminocsoportok is hidratálódnak, és az állófázis határfelületén vízréteg alakul ki. A visszatartást és a szelektivitást több tényező együttesen szabja meg a vegyületek szerkezetétől függően: k=kv+kic+kH+kd

[3.2.1.]

ahol: kv, kic, kH, kd a vízréteg, az ioncsere, a H-hidas kötés és a diszperziós kölcsönhatás járuléka a visszatartáshoz. A primér amino csoportot tartalmazó aminofázisoknál problémát jelenthet a Schiff-bázis képződés. Az irodalomban, ezt azonban eddig senkinek sem sikerült bizonyítani . Az irodalomban sok aminofázist használtak HILIC elválasztásra. Közülük adunk meg néhányat: Bondapak AX (Waters), Bondapak carbohidrate (Waters), Spherisorb NH2 (Waters),YMC-Pack NH2 (Waters), Luna Amino (Phenomenex) Hypersil APS2 (Thermo Science) [61,62], Zorbax NH2 (Agilent, Santa Clara,CA, USA) [63], apHera NH2 (ASTEC, Whippany, NJ, USA)[64], Alltima Amino (Alltech) [65], PALPAK TypeN (TakaraBio,Otsu, Japan) [66], and Micropellicular [67]. YMC PackPolyamine II (YMC) A következő táblázatban (3.2.1. táblázat) a Merck termék adatait adjuk meg: Állófázis jellemző Alak: Szemcseátmérő: Pórusátmérő: Pórustérfogat Fajlagos felület: Széntartalom: Felületi borítottság: Hatékonyság pH tartomány: Tárolási oldószer:

Propilamino módosított szilikagél gömbszimmetrikus 5; 10 μm 100 Å (10 nm) 1,25 ml/g 350 m2/g 4,6 % C 4,1 μmol/m2 25 000 N/m ; 20 000 N/m pH 2-7,5 n-Heptán 3.2.1. táblázat A Merck aminofázis és jellemző paraméterei

25

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A 3.2.1. tábláázatban a Merck M cég n-heptánban n n szállítja a kolonnát, a HILIC-ban n viszont yet kell haszználnunk. Eh hhez oldószercserét kelll végrehajtan nunk. Ennek k kivitele acetonittril–víz elegy egyszerű ű. A kolonnáát először dik klórmetánnall mossuk. A kolonna mosáshoz kb. 2 20-50 szeres kolonnatérfogatú ú diklórmetáánt használu unk. Majd diklórmetáno d os mosás utáán ugyanoly yan térfogattú acetonitrillel mossuk ism mét a kolonn nát és ezutáán használhaatjuk a HILIIC-nál haszn nálatos oldó ószereket. Ezt az oldószercserétt kell minden n olyan esettben végrehaj ajtani, amiko or n-heptánban vagy n-h hexánban szállítják k a kolonnátt. Ez az oldó ószercsere mutatja m meg azt, hogy a hagyomány yosan a norm málfázisú folyadék kkromatográáfiához szálllított kolonn nákat hogyan kell a „HIL LIC”-módbaa átvinni. Azz aminocsop port helyett lehet nitrilcsoport is.

a 3.2.4. ábra Nitrilcsoportot taartalmazó álllófázis, ami HILIC töltettként hasznáálható. A nitril csopo ortban töltéés szétválás történik; a nitrogén-attom részlegeesen negatív v, míg a m részlegeseen pozitív lesz. l A csop port dipól-diipól kölcsön nhatást tud kialakítani. Ennél a szénatom módosíttásnál is maaradnak a felületen f reaagálatlan szzilanol csoportok. A HIILIC-nél felttételezett vízburok k kialakításáában a nem m reagált sziilanolcsoporrtok, és a niitrilcsoportok is szerepeet játszanak. A felületi vízzrétegbe törtténő beoldó ódás (abszorrpció) mellettt a dipól-d dipól kölcsön nhatás is befolyássolja a vegyü ületek visszaatartását.

3.2.5 ábra Diolccsoportot tarrtalmazó állóófázis, ami HILIC H töltetkként használható. A hidroxilcsop portok gyeng ge H-hidas kölcsönhatást k t alakítanak ki a vizsgált vegyülettel. A határn létrejövő vízburok v kiaalakításáhozz úgy járulnaak hozzá, ho ogy a diolcssoportot hid drátburok felületen veszi kö örül. A 3.2.2. táblázzatban a Meerck által forrgalmazott, γ-propiolinit γ trillel módossított szilikag gél alapú termék adatait a adjuk k meg.

26

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Töltet jellemzője:

Szilikagél γ-propiolinitrillel módosítva

Alak:

gömbszimmetrikus

Szemcseátmérő:

5; 10 μm

Pórusátmérő:

100 Å (10 nm)

Fajlagos pórustérfogat:

1,25 ml/g

Fajlagos felület:

350 m2/g

Széntartalom:

6,6 % C

Felületi borítottság:

3,52 μmol/m2

Hatékonyság:

40 000 N/m ; 15 000 N/m

pH tartomány

pH 2-7,5

Tárolási oldószer:

n-Heptán

3.2.2. táblázat Merck által forgalmazott γ-propiolinitrillel módosított szilikagél. A „HILIC”-módra történő oldószer váltás megegyezik az aminó módosított szilikagélnél leírtakkal. A 3.2.3. táblázatban a Merck által forgalmazott, diol módosított szilikagél alapú termék adatait adjuk meg. Töltet jellemzője:

Diol módosítású szilikagél

Alak:

gömbszimmetrikus

Szemcseátmérő:

5; 10 μm

Pórusátmérő:

100 Å (10 nm)

Fajlagos pórustérfogat:

1,25 ml/g

Fajlagos felület:

350 m2/g

Széntartalom:

8,0 % C

Felületi borítottság:

3,87 μmol/m2

Hatékonyság:

45 000 N/m ; 20 000 N/m

pH tartomány:

pH 2-7,5

Tárolási oldószer:

n-Heptán

3.2.3. táblázat Merck által forgalmazott, diol módosított szilikagél alapú termék adatai. Elvileg bármely módosítás, amely poláris jelleget ad a felületnek HILIC töltetként használható.

3.3. Ioncserélők, mint HILIC állófázisok. A HILIC-ben használhatunk ioncserélőket is állófázisként. Az ioncserélőket töltésük alapján két osztályba soroljuk: •

Erős anioncserélők, jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltésű csoportok vannak az elválasztás körülményei között

27

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC •

Kationcserrélők, jellemzzőjük, hogy az a állófázis felületén f rögzített negatív v töltések tallálhatók az elválasztás körülm ményei között

üggése alapjáán ismét kétt csoportba sorolhatjuk: s Az ioncsserélőket tölltésük pH-fü •

Erős anion ncserélők azzok, amelyek k ioncserélő kapacitása független f a mozgófázis (eluens) pH értékéttől. Ilyenek a kvaterner--ammónium m vegyületek k (3.3.1. ábraa). -

gyantaa fázis vagy alapfáázis

OH H

elllenion

+

N

ioncserélő 3.3.1. ábra a Erős anioncserélőő gyanta (álllófázis) szerrkezete Azz ioncserélő ők döntő tö öbbsége szerrves polimer alapú. Ezeket az alaapfázisokat az a angol szakirod dalom "resin ne"-nek, egy yszerűen gyaantának nev vezik. Innen n ered a gyaanta fázis ellnevezés. Készülheetnek szerveetlen oxid alapon a is azz esetek többségében szzilikagél alaapon. Attól függően, hogy po olimer vagy szervetlen (szilikagél) alapon készzültek az an nioncserélőkk más lesz az a alkalmazható ó pH tartomáány. Allkalmazási pH p tartomán ny szerves po olimer alapú ú anioncseréélőnél: 1-12 2 (13) Eg gyes irodalm mak ezt a pH H tartománytt az 1-14 közzé teszik. Azz előzőekben n 1-12-re szű űkítettük. A szervees polimer alaap valóban az a 1-14 pH tartományban n használhattó, károsodáss nélkül. A problémát p viszont az okozza, hogy a HIILIC módszeernél hasznáált folyadék kkromatográfiás rendszeer ugyan mentes acélból készül, de d a kis és a nagy pH értékeken é meegnő a korrrózió veszély ye. Ez az rozsdam oka a pH H tartomány y korlátozásáának. Allkalmazási pH p tartomán ny szilikagéll alapú anion ncserélőnél: 3-7 Kiis pH értékek knél jelentősen nő az io oncserélő cso oportot tartaalmazó rész hidrolízis seebessége. A nagy pH értékekeen viszont ellőtérbe kerüll az alapszilikagél oldhaatóságának n növekedése. oncserélők felületén f szeerves szulfon nsav csoporrtok vannakk. A csoporttok vizes Azz erős katio közegbeen nagymérttékben disszzociálnak. Így Í a felüleet negatív töltéssel t ren ndelkezik. A szerves szulfonsav disszociácciója függ a közeg szerv ves oldósezr tartalmától. t H elfogadju Ha uk a HILIC allaptételét, h en egy vízréteg alakul ki, k akkor a szzerves szulfo onsav disszo ociációs viszzonyainál hogy a határfelülete is a hatáárfelületi vízzréteggel kelll számolnun nk. A szerves poliimer alapú erős e kationccserélő szerk kezetét a 3.3..2. ábrán mu utatjuk be.

3.3.2. ábra a Szzerves polim mer alapú erőős kationcseerélő, mint HILIC H állófázzis. 28

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC A HILIC méréési körülmén nyei között a szerves po olimer alapú ú erős ioncseerélő ionizállt formádul elő. Az ionos részt hidrátburok k veszi körü ül, ez biztosíítja a határffelületi vízrééteget. A ban ford vízbe történő beoldó ódás mellettt a kationcseere is hozzájárulhat a viisszatartásho oz. e ioncseréélők mellett használhatók még a szzervetlen alaapúak is. A szerves pollimeralapú erős zül a szilika agél alapúak , amelyeket a leggyakraabban használunk. Ezek köz reeaktív szilanol cssoportok CH3

OH H

Si

+ Cl

O

CH3

Si

O

Si

H OH

O

OH H

Si

Si

Si CH3

CH3

sszilikagél r része

reaktív szilán

sziláárd

CH3 cc. H2SO4

Si

O

O Si

H OH

Si

SO3-H+

CH3

3.3.3. ábra a Szzilkagél alap pú erős katiooncserélő felülete, amelyyet HILIC álllófázisként h használhatun nk. Azz ioncserélő csoportot tarrtalmazó részz borítottsága kisebb, min nt a oktadeccil csoportot tartalmzó t szilánnaal történt mód dosításnál, tö öbb lesz a reeagálatlan sziilanolcsoportt. A reágalattlan szilanolccsoportok is hozzáájárulnak a határfelületti vízréteg kialakulásáh k oz. Kölcsön nhatási szem mpontból a szilanolcsoporto ok molekulárris állapota a mozgófázis pH-tól füg gg. A pH 3 körül nagy réészük nem diisszociált formábaan van és H-hidas H kölcsönhatást alakít ki, pH 7 körüli saavasságú kö özegben nag gy részük ionizált formában kationcserére k e alkalmas.

3.4. Zwitter-ioon tartalmú ú HILIC állóófázisok. Azz előző két fejezetben (3.2 és 3.3.. fejezet), lááttuk, hogy mind az an nion, mind a kationcserélők k használhatók állófázisk ként a hidro ofil kölcsönh hatási kromaatográfiában n (HILIC). A felületen lévő pozzitív és negattív töltések hidratációja h azt eredmény yezi, hogy a határfelületten vízréteg alakuljon ki, amely a HILIC módszer m egyiik jellemzőjee. A pozitív töltés okoztta anioncserre és a negatív töltés eredmén nyezte kation ncsere önmaagában is leh hetőség, hog gy az ionos vegyületekné v él megfelelő mértékű visszatartás jöjjön létre. l Az ion nos kölcsönh hatáshoz a vizsgálandó v vegyületnek is ionos formában f nie. kell lenn

3.4.1. ábra a Zwitter-iont tartalmazó t HILIC H állófázzis

29

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A 3.4.1. ábrán n adtuk meeg a ZIC-HIL LIC állófázisst. A hordozzó vagy alap p itt is kétfééle lehet. Vagy szzilikagélen, vagy szerv ves polimereen immobiliizálják a szzulfo-bétain típusú ketttős iont. Az alap vagy hordo ozó megszab bja a pH tűrését az álló ófázisnak. A szilikagél alapnál az általános á 3 közötti pH p tartomán nyt jelenti. A gyártó ugy yan nem határ 3--7, ez a gyárri specifikácció szerint 3-8 adja meg g, hogy mily yen kötésen keresztül tö örténik a zwiitterion kapccsolása a felü ülethez, való ószínűleg ez Si-O--Si kötésen keresztül k törrténik, ahogy y a 3.4.2. áb brán megadttuk.

CH3

CH3 Si O

Si (CH2)n ) CH3

CH2

N

(CH2)3

SO3

CH3

3.4.2.ábra A zwittterion kapcsolódása a szzilikagél felü ületéhez. A kettősion a polárisab bb mozgófázzis felé orieentálódik, mert m a végccsoport egy y szerves szulfonssav, amely az a alkalmazzott pH értéékeken ionoss formában van. Az allkalmazott szilikagél s jellegét nem adják meg, de ism merve a maai trendeket, ez egy Siliica B kategóriába tarto ozó fázis, f tartalma kisebb b, mint 10 0 ppm. Az állófázis határfelületéén tehát amelyneek összes fémion immobillizát kettősio on és nem reeagált szilan nolcsoportok k találhatók. A szilanolcssoportok mo olekuláris állapotaa, mint azt a 3.1. fejezettben, a 3.1.1 1. ábrán bem mutattuk, a pH p függvény yében változzik. Ezen a pH-n a zwitterion nos állófáziss határfelüleeten kialaku ult pH-t értjü ük. A szilikaagél felületéén, ennél i t ligand és a szilanolcssoport is po oláris, így a felületen kiialakul a az állófáázisnál, az immobilizál vízréteg. Ennek a vízrétegnek v a pH-ja dön nti el a szilan nolcsoportok k molekulárris formáját.. Silica B ba sorolt szilikagéleknél a szilanolcso oportok pKaa értéke 7 körül van. 5-ös pH alatt a szilanolcsoportb csoporto ok döntően protonált (ionvisszaszzorított) forrmában van nnak. Ezek a szilanolccsoportok H-hidas kölcsönhatáást tudnak kiialakítani. Kv vaterner-amm mónium ionok nem tudn nak H-hidas kölcsönn résztvennii, tehát a szilanolcsop s ort és a lán ncban lévő szilanolcso oport kölcsö önhatását hatásban kizárhatj tjuk. A láncc végén lévő ő szulfonsav v csoport, ha h hidrogén formában v van, azaz ellenionja hidrogén n, H-hidas kölcsönhatás k st tud a szilaanolcsoporto okkal kialakíítani. pH H>5 savassáágú közegek kben a szilaanolcsoporto ok egy részee ionizált m molekuláris formában f van. A negatív n töltéésű szilanolcsoport és a pozitív töltésű kvatern ner-ammóniiun ion erőss elektrosztatikuss kölcsönhaatást tud kiaalakítani. Azz ionizált, negatív töltéssű szulfonsaav csoport viszont v a víztartallmú mozgóffázis felé orientálódik. A módosíttásnál, a sziilícium-atom mot és a kv vaternerammoniium iont egy y hosszabb alkillánc kö öti össze. Ezz az alkillán nc védi az alap szilikagél felülét (3.4.3. ábra), ez leheet az oka, ho ogy a forgalm mazók a felsső alkalmazási pH-t nyo olcra növeltéék.

3.4.3.ábra A ZIC--HILIC felülete pH>5 saavasságú közzegben. Az ionizált i szilaanol és a kvaaterner-amm mónium ion közzötti elektrossztatikus köllcsönhatás van, v ennek eredményekép pp az alkilláánc védi a felületet. f

30

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Az alkillánc hosszát nem adták meg a forgalmazók, de 20 nm pórusátmérőből arra lehet következtetni, hogy 3-nál nagyobb. Figyelembe véve, hogy a gyakorlatban milyen zwitterionos felületaktív anyagot használnak, akkor ez valószínűleg dodecilcsoport. A betain 12 elnevezésű felületaktív anyag ugyanis N-dodecil-N,N-dimetil-aminó-propánszulfonsav. A gyári specifikáció elég szűkmarkú. Ezt a 3.4.1. táblázatban adjuk meg. Kolonna típusa:

ZIC-HILIC

Átlagos szemcseátmérő:

5 μm

Átlagos pórusátmérő:

200 Å

Maximálisan alkalmazható nyomás:

40 Mpa (400 bar)

Alkalmazható pH tartomány:

3-8

Maximális hőmérséklet:

70 °C

Fajlagos felület:

140 m2/g

Nem alkalmazható oldószerek:

THF, DMSO, DKM, ha PEEK a kolonnaház

3.4.1. táblázat A ZIC-HILIC specifikációja a gyártó alapján. A 3.4.1. táblázatban megadott 20 nm-es (200 Å) átlagos pórusátmérő a módosítás előtti szilikagélre vonatkozik. Az, hogy ez milyen mértékben csökken a módosítás után, az a felületi borítottság függvénye, erre vonatkozó adatokat eddig nem adtak meg. Nem adták meg a módosítás utáni fajlagos felületet sem. A 20 nm viszont elég, hogy ne csak a folyadékkromatográfiásan kis vegyületeket vizsgáljuk ezzel a kolonnával. A 3.4.1. táblázat utolsó sorában megadtuk azokat az oldószereket, amelyek a kolonna szerkezeti anyagát duzzasztják. Az állófázist ugyanis poliéter-éterketon (PEEK) műanyag kolonnában is forgalomba hozzák. Tilos tehát minden olyan oldószer használata, amely ezt a műanyagot oldja, vagy duzzasztja. A szerves polimer alapú állófázist ZIC-pHILIC névvel hozzák forgalomba. A kis „p” jelzi a felhasználó számára, hogy itt szerves polimer hordozóról van szó. A szerves polimer alap pH tűrő, ami korlátozza az alkalmazott pH értéket, az a polimer-zwitterion kapcsolat. ZIC®-HILIC

ZIC®-pHILIC

pH taromány: 3-8

pH taromány: 2-10

Nyomás: 400 bar

Nyomás: 200 bar

Hőmérséklet: 70 °C

Hőmérséklet: 60 °C

Pórusátmérő: 200 A(20nm) 2

Fajlagos felület: 140 m /g

Pórusátmérő: 200 A(20nm) Fajlagos felület: N/A

3.4.2. táblázat A ZIC-HILIC és a ZIC-pHILIC kolonna jellemzői Ha a 3.4.2. táblázatban megadott paramétereket összevetjük, akkor jól láthatók az alkalmazási körülmények közti különbségek. Az első a használható pH tartomány. A polimer alapúnál 2-10 közötti érték (ZIC-pHILIC). A pH<2 alatt és pH>10 az alap polimer és a zwitterion közötti kötés hidrolízisének sebessége jelentősen megnő. A polimer alapból eredően a felső alkalmazható nyomás 200 barra (20 Mpa) csökken. A felső alkalmazható hőmérséklet ugyancsak 10°C-kal kisebb. 31

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC Nincs adat a pórus átmérőről és a fajlagos felületről. A szerves polimer alap nagy valószínűséggel sztirol-divinilbenzol koopolimer. A szerves polimereknél csak akkor lehetséges a 200 baros nyomás használata, ha a térhálósági fok nagy. Ezeknél a nagy térhálóságú polimereknél a mikropórusok előfordulási valószínűsége nagy. A mikropórusok minden esetben kiszélesítik a kromatográfiás csúcsokat, ami az elméleti tányérszám csökkenését okozza. A 3.4.3. táblázatban a szilikagél alapú ZIC-HILIC kolonnák dimenzióit adtuk meg. A rendelkezésre álló kolonna méretek széles skálát mutatnak. Az analitikai mérettől a mikroméreten keresztül a kapilláris kolonnáig terjed. Katalógusszám P/N

Hossz mm

Átmérő mm

Szemcseátmérő μm

Pórusátmérő Å

2712-052

50

2.1

5

200

2712-055

50

4.6

5

200

2712-058

50

7.5

5

200

2712-102

100

2.1

5

200

2712-105

100

4.6

5

200

2712-108

100

7.5

5

200

2712-152

150

2.1

5

200

2712-155

150

4.6

5

200

2712-158

150

7.5

5

200

2712-252

250

2.1

5

200

2712-255

250

4.6

5

200

2902-030

30

0.3

3

200

2912-030

30

0.3

5

200

2902-150

150

0.3

3

200

2902-150

150

0.3

3

200

2912-150

150

0.3

5

200

2902-031

30

1.0

3

200

2912-030

150

1.0

5

200

2902-030

30

1.0

3

200

2912-030

150

1.0

5

200

2912-710

5

0.3

5

200

2912-750 (5 pcs)

5

0.3

5

200

2912-711

5

1.0

5

200

2912-711

5

1.0

5

200

2712-258

250

7.5

5

200

2912-751 (5 pcs)

5

1.0

5

200

3.4.3. táblázat A ZIC-HILIC kolonnák választéka, amely az analitikai mérettől a mikroméreten keresztül a kapilláris kolonnáig terjed.

32

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC A ZIC-HILIC kolonnák választéka az anlitikai folyadékromatográfiás elválasztásra alkalmastól indul és a nano-folyadékkromatográfiásnál ér véget. Kérdés, hogy adott folyadékkromatográfiás készülékhez milyen méretű kolonnát válasszunk. Természetes, hogy a kisebb dimenziójú kolonnáknál a mozgófázis fogyasztás csökken. Az azonos hatékonyság eléréséhez, ha a töltet minden egyéb paramétere a két kolonnában megegyezik, akkor az átmérők arányának négyzetével változik a felhasznált mozgófázis térfogata. (dc1/dc2)2 F1=F2

[3.4.1.]

ahol: dc1 és dc2 a két kolonna átmérő, F1és F2 az 1. és 2. kolonnán mért térfogat-áramlási sebesség. Ha 4,6 mm-es belsőátmérőjű kolonna helyett 2,1 mm-est használunk, akkor a felhasznált oldószer mennyiség a kisebb átmérőjűnél az első kolonnához képest csak 21 %. Az oldószer megtakarítás kb. ötszörös. A 3.4.3. táblázatban megadott 50 mm hosszúságú kolonnák közül az első, a 2,1 mm belsőátmérőjű használatakor nagy mennyiségű oldószert spórolunk meg. A kisebb retenciós térfogat nagyobb csúcsmaximumbeli koncentrációt jelent, ami növeli az érzékenységet. Ha kromatográfiás rendszer csúcsszélesítő hatása nem teszi tönkre, amit a kolonna tud. Az ötször kisebb retenciós térfogat azt is eredményezi, hogy a csúcsszélesség, térfogategységben kifejezve, is ötször kisebb lesz. Vegyük a 50 mm hosszú 2,1 mm belső átmérőjű kolonnát. A van Deemter összefüggés alapján a Hmin 10μm, akkor az elérhető maximális elméleti tányérszám: 2000, a holttérfogat (VM) 105 μl, felhasználva a 3.4.2. összefüggést, k=5-nél a retenciós térfogat (VR) 630 μl VR = VM (1+k)

[3.4.2.]

Ekkor a σ2= 4 μl2 és a maximálisan a kolonnán kívül megengedett zónaszélesedés ennek 10 %-a lehet, azaz 0,4 μl2.

σ

2 E

Összetevői

P

σ

σ ö2

2 A

A

K

2 σ Dt2 σ Dcell

D

2 2 σ E2 = σ A2 + σ ö2 + σ Dcell + σ Dt

detektor elektronika okozta zónaszélesedés detektorcella okozta zónaszélesedés összekötő vezetékek okozta zónaszélesedés adagoló okozta zónaszélesedés

3.4.4. ábra A kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások a ZIC-HILIC kolonna használatakor.

33

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC Kolonnahossz (mm)

Átm mérő (m mm)

Vm (ml)

σ2 (μ μl2)

folyadéékkromato ográf

50

2 2,1

0,10

0 0,4

gyorrs

50

4 4,6

0,50

1,9

gyorrs

100

2 2,1

0,2

0 0.8

gyorrs

100

4 4,6

1,00

3,,84

gyorrs

150

2 2,1

0,3

1,2

gyorrs

150

4 4,6

1,5

5 5,7

gyors, HPLC?

250

2 2,1

0,5

2 2,0

gyorrs

250

4 4,6

2,5

9 9,5

HPLC C

3 3.4.4. táblázzat 5μm szzemcseátmérrőjű ZIC-HIL ILIC a megen ngedett kolon nnán kívüli zónaszélesíttés és alkalm mazható folyaadékkromatoográfiás készzülék (k=5). A gyors follyadékkromaatográf a kiss kolonnán kívüli k térfogatú kéészülékeket jelenti, j HPLC C a hagyomá ányos 400 bar b nyomásraa tervezettett, ahol detektor d cellaa térfogata 5-10 5 μl közöött van. A 3.4.4. tábláázat adataiból látható, hogy h az 5 μm μ szemcseáátmérőjű ZIIC-HILIC oszzlopnál a mányos HPLC C csak a 250 0 x 4,6 mm-es kolonnáánál alkalmazható mindeen kétséget kizáróan. k hagyom A 150 x 4,6 mm-es kolonnát cssak akkor, ha h 1-5 μl térrfogatú minttákat adagollunk. A max ximálisan adagolh ható térfogattot úgy dönttjük el, hogy y a különbö öző térfogatú ú adagolásokkhoz kiszám moljuk az elméleti tányérszámo ot (N) és az ad dagolási térfo ogat függvén nyében ábrázzoljuk (3.4.5. ábra). A max ximálisan adagolh ható mintatérrfogat (Vinjm or az N érték ke már 10 %-kal % csökkeen. max) az, amiko

3.4.5.ábra A maximáálisan adagoolható mintaatérfogat a ZIC-HILIC Z koolonna haszználatakor. A maxximálisan adagolható miintatérfogat (Vinjmax) az, amikor az N értéke márr 10 %-kal csökken. c A 3.4.5. tábláázatban a szeerves polimeer alapú ZIC C-pHILIC kollonnákat adttuk meg. Itt kisebb a olttérfogat és a kolonnáán kívüli választéék. Ebből a táblázatból hiányzik kéét oszlop; a becsült ho maximáálisan megen ngedett zónaaszélesedés. Az A utóbbivaal kezdve. Kö öztudott, hogy a szervess polimer alapú tö öltetek póru usszerkezete miatt széleesebb krom matográfiás csúcsokat c kkapunk összevetve a megegyeező szemcseeátérőjű sziliikagélekhez viszonyítvaa. Az a tétel,, hogy a Hmnn kb kétszerrese vagy háromszzorosa a szem mcseátmérőn nek, a jó pó órusszerkezettű szilikagélre igaz. A szzerves polim mer alapú töltetek pórusszerkeezete gyártm mányfüggő, ezért e a szilik kagél alapú kolonnáknáál használt becslés b itt A átlagos pórusátmérő p őt a gyártó megadta ugyan, de pó óruseloszlás,, alak és nem hassználható. Az jelleg is ismeretleneek, így a hollttérfogatot sem lehet ugyanazzal u a összefügg az géssel becsü ülni, mint HILIC-nél haasználtunk. amelyet a szilikagéll alapú ZIC-H 34

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC Katallógusszám P/N

Hosssz mm m

Átmérő mm

Szemccseátmérő μm

Pórusáttmérő Å

2812-052

50

2.1

5

200 0

2812-102

100 0

2.1

5

200 0

2812-055

50

4.6

5

200 0

2812-105

100 0

4.6

5

200 0

3 3.4.5. táblázzat A ZIC-pHILIC Z kolonnák választéka, amely az anaalitikai méreettől mérőjű kolon nnáig terjed. a mikroátm A ZIC-HILIC sorozatban s issmeretes egy y új tag is, ek kkor a szilik kagél felületéhez olyan keettős iont (zwitter--iont) immobilizáltak, amikor a a küllső ion lesz a kvaternerr-ion és a beelső egy foszzforkolin csoport.

a 3.4.6. ábra A ZIC-cHILIC C kolonna szzerkezeti feléépítése. Az alap a szilikaggél. A szilikaagél felületéén kettős ion nokat immobilizálni az állófázis elő őállítóknál m ma már rutiinfeladat. Ezekből a módosítássokból mutaatunk be néh hányat. CH O

CH3 N CH3

CH O

HEMA-D DMAES

SO3

CH3 SO3

N

S300-EC CH-DMA-PS S

CH3 CH3 N

SO3

S300-TC C-DMA-PS

CH3

O O CH3

O

CH3 N CH3

SO3

S300-MA AA-SPE PolyDAE EMA+(SiO2)--grafted silica

O

35

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

NH NH O O

His-SiO2

N H2 Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

OH

Lys-SiO2

N H2

OOC NH2

NH2 H2 N NH

O NH

Arg-HEMA

O

CH3 CH2

N

ZIC-HILIC (SeQuant, Merck)

SO3

CH3 O O n-1

O O

O

O OH Si O

O OH Si O

N

O

O

O

P

N

N

SO3H

KS-polyMPC

SilmPS

Cl

S

N

N CF3SO3

36

N

O O P O O O

SO3H

SilmBs

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC

O

O NH O

O NH

Si O

Si

O NH

O

O

O

O

O O N H3

NH

NH

NH

NH

PolyCAT A (PolyLC, USA)

O NH

NH O

Si O

Si

NH

O O

Si O

Si

O P O

O

CH3 N CH3

IAM.PC.DD (Regis Tech)

CH3

NH O

3.4.6. táblázat Kettős-ion immobilizálás a szilikagél felületén. Ugyancsak kettős-ion (zwitter-ion) szerkezetet mutat az Obelisc N kolonna. Az „N” megjelölés a normál fázisra utal. A fázis szerkezetét a 3.4.7. ábrán mutatjuk be.

Hidrofil lánc

+ + + + + + + + + - - - - - - - - 3.4.7. ábra Obelisc N kolonna határfelülete. A pozitív és negatív töltéseket hidrofil lánc köti össze. A pozitív és negatív töltéseket hidrofil lánc köti össze, így a fázis poláris jellegű. HILIC módban, mind a töltés körüli részeket, mind a hidrofil láncot hidrát búrok veszi körül. Így teljesül az feltétel, hogy az állófázis felületén vízréteg van, ami polárisabb a mozgófázisnál. A ZIC-HILIC-hez képest fordított töltéshelyzet az ionos vegyületeknél eltérő visszatartást és szelektivítást eredményez.

37

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC

3.5. Egyéb állóófázis típussok a HILIC C-ban Allpert, aki a HILIC H módszzert illetve a vizes fázisú ú normálfázissú kromatog gráfiás módszzer nevét adta annak, az aminopropil-szzilánt poliszzukcin-imidd del módosította, ezzel eegy új típussú HILIC k adta meg az a alapját. állófáziss sorozatnak Azz így kialakíított állófáziss felületén szulfonsav cssoportok taláálhatók. A kkémiai kötéstt savamid csoporto ok biztosítjáák, amelyek polárisak. A határfelüleeti fázisban az anioncserélő csoporrtok és a savamid d csoportok is hidrátburrokkal vann nak körülvév ve. A visszattartást két ffő hatás szab bja meg: a vízréteegbe való beeoldódás és az ionos köllcsönhatás. A ciklodextrin nt tartalmazzó szilikagéleek is felhaszználhatók HIILIC állófáziisként. Építő őegységei ben lévő glükózok g (3..5.1. ábra). Különböző tagszámú ciklikus veegyületet kiialakítva. α-kötésb Három típust t alkalm maznak, α-CD D, β-CD, γ-C CD (3.5.2. áb bra), sorrend dben hat, hétt illetve nyollc glükóz egységből épülnek fel. A cikolodextrinek belső része apoláris jelllegű. A belső részre keerülnek a C-O-C kötések, k amellyek elektron ndonorok ug gyan, de ezt kötés-típust tartalmazó v vegyületek polaritása p kicsi, a külső k részen n vannak a –CH – 2OH cso oportok, ameelyek erős H-hidas H kölcssönhatást allakítanak a vízzell. A nagy acetonitril a taartalmú mozzgófázisokn nál adott, ho ogy a felüleeti fázisban vízréteg alakuljon ki.

3.5.1. ábra a γ-Cikloodextrin szerrkezete, az üreg ü belső réésze apoláriss, míg a külsső részén azz alkoholos hidroxil h c csoportok errős H-hidas kölcsönhatá ást alakítanaak ki a vízzeel

38

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC

3.5.2. ábra a A 6, 7 és 8 glükóóz egységbőll felépülő cik klodextrinekk jellemző mééretei. Cilod dextrinek

Belső átmérő [nm m]

Kü ülső átmérő [nm]

Magasság [nm]

α-CD

0,57

1,37

0,78

β-CD

0,78

1,53

0,78

γ-CD

0,95

1,69

0,78

3 3.5.1. táblázzat Cikloodextrinek adatai a A kettős-iont tartalmazó állófázisokn nál bemutatttuk, hogy a szilikagél v vagy szervess polimer n sokionos anyag a immo obilizálható,, ugyanez elmondható, e bármely neem ionos, de poláris felületén csoportrra. Ezeket a poláris csop portot tartalm mazó állófázzisokat, amelyek apoláriis karaktere elhanyagolható, mind haszn nálhatjuk HIILIC állófáziisként. Az egyes e állófázzis típusokn nál bemutattuk, hogy több köllcsönhatás szabja meg a visszatartást és ezzel a szelektivitáást is. Ezt azzért emeljük ki ismét, mert az állófázis előállításáná e ál bekövetkeező bármely y változás a kolonnáró ól-kolonnáraa történő reproduk kálhatóságo ot megváltozztatja. Hosszzú távú haszználat során azokra a ko olonnagyárttókra kell támaszk kodni, akik a sarzsról-sarzsra történ nő reproduk kálhatóságott biztosítanii tudják. Ez különös fontos a HILIC alkalmazásának k mai fázisában, amiko or kevés ad dat áll rendelkezésre a kolonna stabilitáásról és a rep produkálható óságról.

39

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

4. Mozgófázisok a HILIC gyakorlatában A HILIC-ban használt mozgófázisoknak is eleget kell tenni azoknak az általános feltételeknek, amelyeket akár a normál, akár a fordított fázisú folyadékkromatográfiában megköveteltünk. Ezeket most felsorolásszerűen adjuk meg. • • • • • • • •

kis viszkozitás nagy tisztaság szilárdanyag mentesség gázmentesség UV detektálásnál kis UV cut-off kis mértékű kipárolgás kis toxicitás gazdaságosság

Az általánosan megadott követelmények mellé jön az a HILIC megszabta követelmény, hogy kevésbé kell polárisnak lenni, mint az állófázis felületén kialakult vízrétegnek. A nemzetközi irodalomban ezt úgy adják meg, hogy apolárisabbnak kell lennie, mint az állófázis. Figyelembe véve a vízzel elegyedő, kis viszkozitású oldószereket, amelyeket önmagukban szintén polárisnak tekintünk, javasoljuk a valóságot jobban megközelítő, kevésbé poláris kifejezés használatát. A HILIC módszernél a mozgófázisnak kis mennyiségű vizet minden esetben kell tartalmaznia, mivel általánosan elfogadott, hogy az állófázis felületén kialakult vízréteg és a kevésbé poláris mozgófázis közötti eltérő megoszlás eredményezi a komponensek eltérő vándorlási sebességét. A HILIC a poláris, ionos és könnyen ionizálható vegyületek meghatározási módszere. Minél ionosabb vagy polárisabb a vizsgált molekula, annál kevésbé tartózkodik a kevésbé poláris mozgófázisban. Ha növeljük a mozgófázis víztartalmát, akkor a vegyületek többet tartózkodnak abban, és így a visszatartásuk csökken (4.1.) k=ns/nm

[4.1.]

ahol: az nsés nm az álló-és a mozgófázisban az anyagmennyiség mólokban kifejezve. Ennek fényében a víz lesz a legerősebb mozgófázis összetevő, mert növelésével a visszatartás csökken. Ehhez a vízhez kell a vízzel elegyedő, lehetőleg kis viszkozitású szerves oldószert adni. Amennyiben a víz mennyiségét jelentősen növeljük, gyakorlatilag a kolonnára adagolt vegyületek csak a mozgófázisban tartózkodnak. Ennek eredménye, hogy a holtidőhöz közeli idővel eluálódnak a kolonnáról. Ez egyben azt is jelenti, hogy csak egy adott értékig csökkenthetjük a víztartalmat. A vegyület szerkezetétől és az állófázis milyenségétől függően ez a víztartalom nem lehet nagyobb, mint 30-40 %. A HILIC-nál az erősebbik oldószer koncentrációja a mozgófázisban korlátozott. 30-40 tf.% felett a poláris és/vagy ionos vegyületek a holtidőnél eluálódnak. Víztartalom oldaláról nézve a mozgófázis víztartalma 2-40 tf% között változhat. Nézzük, hogy milyen szerves oldószereket használhatunk és hogyan viszonyul a mozgófázis erőssége a vízhez. A vízhez polaritásban a metanol áll a legközelebb. Ezért a poláris és ionos vegyületek kölcsönhatása a víz után ebben a legerősebb. Így az eluenserősségi sorban a víz után a metanol következik. Az etanol is erős H-hidas kölcsönhatást tud a vegyületekkel kialakítani. Sok vegyületnél az eluenserősségi sorrendben a metanolt követi. Problémát okoz, hogy az etanol-víz elegynek nagy a viszkozitása. Az etanol viszkozitása 1,2 cP, 25 °C-on. Használata ezért elenyésző.

40

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Az eluenserősségi sorban a következő oldószer az acetonitril. Az acetonitril több szempontból is nagyon előnyös mozgófázis összetevő. A 4.1. ábrán adtuk meg azoknak a biner elegyeknek a viszkozitás változását a szerves oldószertartalom függvényében, amelyeket a HILIC gyakorlatában alkalmazunk. A HILIC-nál a 60 tf. % feletti koncentrációra kell koncentrálnunk. 60-70 tf.% között az acetonitril-víz elegy viszkozitása harmada a metol-víz elegyének. Ez két szempontból is előnyös a kis viszkozitás szűkebb kromatográfiás csúcsokat eredményez, másrészt a Darcy törvény értelmében a nyomásesés kisebb (4.2.)

Δp =

φηLu d2p

[4.2.]

ahol:

Δp

nyomásesés a kolonnán

dp

átlagos szemcseátmérő

tM

holtidő

η

mozgófázis viszkozitása

L

kolonna hossza

4.1. ábra Viszkozitás változás a szerves oldószer-víz összetétel függvényében

41

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

Oldószer

UV cut-off [nm]

Refraktív index (20°C)

Viszkozitás [cP]

Forrpont [°C]

Polaritás [P’]

Acetonitril

190

1,3441

0,38

81,6

5,8

Dioxán

215

1,4224

1,37

101,3

4,8

Etanol

210

1,3614

1,20

78,0

n.a.

2-Propanol

205

1,3772

2,40

82,3

3,9

Metanol

205

1,3284

0,55

64,7

5,1

Tetrahidrofurán

212

1,4072

0,55

66,0

4,0

Víz

190

1,3330

1,00

100,0

10,2

4.1.táblázat A HILIC-ban alkalmazott mozgófázisok és tulajdonságai Műveleti szempontból ez annyit is jelent, hogy a kis viszkozitás kis áramlási ellenállást jelent (4.3), ezért a térfogatáramlási sebesség növelhető. Kérdés, hogy ez mennyire rontja le a kinetikai hatékonyságot.

φ=

Δpd2pt M ηL2

[4.3.]

A 4.2. ábrán mutatjuk be hogyan befolyásolja a viszkozitás változása a kinetikai hatékonyságot.

4.2. ábra Az elválasztás hatékonyságának függése a mozgófázis viszkozitásától. A 4.2. elvi ábrán látható, hogy a megnövelt térfogatáramlási sebesség, amellyel arányosan nő a mozgófázis lineáris sebessége is, a kis viszkozitású mozgófázisnál csak kis mértékű hatékonyság vesztéssel jár. A 4.2. ábrán a ΔH jelenti a kinetikai hatékonyság veszteséget a legnagyobb hatékonysághoz képest (Hmin). Acetonitil-víz elegy használatakor a térfogatáramlási sebességet 3-6 ml/perc értékre lehet növelni, ezzel arányosan az elemzési idő csökken. A jó minőségű acetonitril UV cut-off értéke a 4.1. táblázat szerint 190 nm. Ez azért fontos, mert minél kisebb a detektálási hullámhossz, annál több vegyületet lehet az általánosan elterjedt UV detektorral mérni. Az eluenserősségi sorban a következő oldószer a terahidrofurán (THF). Viszkozitása a metanolvíz és az acetonitri-víz közé esik. A nem stabilizált THF UV cut-off értéke 212 nm. Csak akkor 42

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC alkalmazhatjuk, ha a vegyületeeket e fölöttti hullámhossszon tudjuk k detektálni.. A THF a polimerek p knak ez a nagy résszét duzzaszztja, így hossszú távú haasználatkor a PEEK-t iss; ha a HILIIC kolonnák szerkezeeti anyaga, akkor a hasznáálata nem ajjánlatos. Azz etanol és az a izopropan nol viszkoziitása nagy, tehát t sem ny yomásesési, sem zónaszzélesedési oldalról nézve nem kedvező a használata. h u de Nééhány irodaalom ajánljaa még az aceeton hasznáálatát. Az acceton kis visszkozitású ugyan az UV cu ut-off-ja 250 nm fölött van. Ezt az UV detektálláskor figyelembe kell v venni. Véégezetül megadjuk a kü ülönböző bin nér-elegyek H-u H görbéit (4.3.ábra.)

4.3. ábra a Különbözző binér-eleggyek H-u görrbéi a lineárris áramlási sebesség függgvényében. Az acetonitril-víz eleegy adja a leegkisebb H értékeket, é haasználatakorr legnagyobb azz elválasztáss hatékonysáága. Haszná álata a HILIC C-ban ajánlaatos. A különböző oldószerek elúciós erősssége a köv vetkezőképpeen változik. A legerősebb oldógül a tetrahiidrofurán. szer a vííz, ezt követti a metanol,, majd az accetonitril vég vízz>metanol>aacetonitril>ttetrahidrofurrán. A szelektivitásst a HILIC-ban több tény yező együtteesen szabja meg. m Attól fü üggően, hog gy milyen állófázist használunk k és az hány y fajta és erő ősségű kölcsö önhatásra képes a vegyüllettel, ez leszz a döntő faktor. Egy E adott állófázisnál á a szelektivittás általábaan fordítottaan változik az eluenserősséggel. Ennek megfelelően m a szelektivittási sorrend:: vízz<metanol
43

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

5. A pH kontroll és a vegyületek szerkezete közti összefüggés A HILIC-nál, ugyanúgy, mint a RP-HPLC módszernél a pH kontrollra több szempontból is szükséges lehet. Az első szempont, hogy a vegyületek molekuláris formája vagy azok aránya az elválasztás körülményei között állandó legyen. Ha ez a feltétel nem teljesül, akkor a másodlagos egyensúlyok miatt a kromatográfiás csúcs kiszélesedik, és a visszatartás is változhat. Ha az állófázis felületén savas vagy bázisos csoportok vannak, azokra is érvényes, hogy a molekuláris formájuk nem változhat, mert az kölcsönhatás változást okoz, ami csúcsszélesedés és visszatartás változást okozhat. A molekuláris formák állandóságának tétele, mind az állófázisra, mind a mozgófázisban feloldott vegyületekre igaz. A pH kontroll szükségességének megítélése előtt a szerves vegyületeket kromatográfiás szempontból csoportokba kell sorolni. Hangsúlyozzuk, hogy a szerves vegyületek osztályba sorolása kizárólag a folyadékkromatográfiás szempontok alapján történik. A HILIC-nál is első eldöntendő kérdés, hogy kell pH kontroll vagy a vegyületek oldaláról nézve ez nem szükséges. Ennek a csoportosításnak a vezérlő elve tehát, hogy a mozgófázis pH-jának változtatásával megváltozik-e a vegyületek molekuláris formája. Mindazon esetekben, amikor ez bekövetkezik, akkor pH kontroll kell, hogy biztosítani tudjuk a molekuláris formák állandóságát és ezzel összhangban a visszatartást és a zónaszélesedést. Ebben a megközelítésben a mozgófázis oldaláról vizsgáljuk, azokat a követelményeket, amelyekkel az elválasztás fő paramétereit állandó értéken tudjuk tartani. Az utóbbi évek kutatásai nyilvánvalóvá tették, hogy a szilikagél alapú állófázisoknál a szilanol csoportok molekuláris formáit is állandó értéken kell tartani, ahhoz, hogy a visszatartás, a zónaszélesedés és a csúcs szimmetria ne változzon. Lehetséges olyan eset is, hogy a vegyület molekuláris állapota pH független, de a szilikagél alapú állófázis megköveteli a pH kontrollt. HILIC szempontból a vegyületek négy csoportra oszthatók: 1. kromatográfiás szempontból semleges vegyületek 2. savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek 3. bázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek 4. ionos vegyületek Az 1. osztályba tartoznak azok a nagy polaritású vegyületek, amelyek kis apoláris rész (hidrofób) rész mellett olyan poláris csoportokat tartalmaznak, amelyek a kromatográfiás körülmények között használt pH-n nem változtatják a molekuláris formájukat. Az alkalmazott pH tartományokat az 5.1. táblázatban adtuk meg.

Állófázis típus

pH tartomány

Szilikagél

2-7

Szilikagél alapúak

3-7 (8)

Szerves polimer alapúak

2-10

5.1. táblázat Különböző HILIC állófázisok és alkalmazási pH tartománya. Ezeken a pH értékeken belül kell dolgoznunk ahhoz, hogy az állófázis élettartama megfelelő legyen.

44

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Ebbe a csoportba tartoznak a poliol vegyületek, például a szaharidok és poliszaharidok. Ezeknél a vegyületeknél nem kell pH kontrollt használni, ha az állófázis vagy a mátrix komponensek nem követelik meg. A savas funkciós csoportot tartalmazó vegyületek a pH-tól függően két molekuláris állapotban lehetnek jelen, s ezeknek a mozgófázisban való oldhatósága eltérő. Ebből következik, hogy ha pH-kontroll nélkül próbálnánk mérni, és a körülmények valami miatt megváltoznak, akkor a molekuláris formák aránya is változni fog, ami pedig a visszatartási tényező definíciójának megfelelően (k=ns/nm, az ns a mólok száma az állófázison és a nm a mólok száma a mozgófázisban) a retenció megváltozását eredményezi. A fentiekből egyértelműen kitűnik, hogy a pH-kontroll célja biztosítani a mozgófázisban a molekuláris formák arányának állandóságát, illetve, hogy kizárólag az egyik vagy másik forma legyen jelen. HILIC-nál a nagyobb polritású vegyületek visszatartása a nagyobb. A savas csoportot tartalmazó vegyületeknél fontos a pH kontroll, azért is, hogy a minimális visszatartást elérjük (k>1). Az 5.1. ábrán adtuk meg a savas csoportot tartalmazó vegyületekre az ionizáltsági diagramot. Ha vegyület ionizációja (disszociációja) elhanyagolható, akkor az ionizáltsági fok 0, ha az ion visszaszorított forma arány elhanygolható, akkor I=1, ha pKa= pH, akkor I=0,5. A pKa értékhez képesti 2 pH egységgel való eltolás annyit jelent, hogy a molekuláris formák aránya 100/1, ami az egyik molekuláris forma dominanciáját jelenti.

ionizáltság I=1

1

ionizált sav

I -2

0,5 nem disszociált sav I=0

+2

pKa pH

5.1. ábra Ionizáltság változása a pH függvényében savas csoportot tartalmazó vegyületeknél A pH-ionizáltsági fok savas vegyületek esetében, a) ion visszaszorított forma, b) teljesen ionizált, c) mind két forma jelen van a mozgófázisban Az ábrán három tartományt különböztethetünk meg: 1. A pH=pKa−2 értéknél savasabb tartományban a vegyület ion visszaszorított formában van jelen, ezt a formát a szakirodalom semleges formának is nevezi. Pontosabb, ha a savas csoportot tartalmazó vegyület semleges formájáról beszélünk. A vegyületek apoláris jellege nagy mértékben megnő. Az esetek többségében a HILIC körülmények között a holtidő körül eluálódnak. Ezt a tarományt el kell kerülni a hatékony elválasztás érdekében.

45

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC 2. A pH=pKa+2 értéknél lúgosabb tartományban a molekula ionos formában van.A savas csoportot tartalmazó vegyületeknél ez jelenti legpolárisabb molekuláris formát és a legnagyobb visszatartást. Efölött a pH érték felett a pH megváltozása nem jár a vegyület visszatartásának változásával.Stabil, robusztus a rendszer, HILIC szempontjából ez jelenti a jó működést, ha a szilikagél alapú állófázisok megengedik ennek a pH-nak a használatát.. 3. A pH= pKa±2 tartományban a molekula mindkét formája jelen van, a visszatartás (retenció) attól függ, hogy milyen a két forma aránya. Itt több kölcsönhatás típus játszik szerepet az elválasztásban, s mivel ez zónaszélesítő hatású, a csúcs általában széles. Emellett a módszer nem robosztus, hiszen kis pH változás esetén a két molekulaforma arányának megváltozása miatt jelentős retencióváltozás következhet be. A megfelelő pH és a puffer kiválasztásához a vegyületek pKa értékét ismerni kell. Ezt vagy a szakirodalomból keressük ki, vagy megmérjük, vagy intelligens programok segítségével a vegyületek szerkezeti képletéből előre jelezzük (prediktáljuk). A továbbiakban egy kereskedelmi forgalomban lévő program csomagra hivatkozunk, amellyel ezek az értékek meghatározhatók. A program kombinálja a lgP és pKa értékeket, hogy előre jelezze, hogyan változik meg a szerves vegyület megoszlása az oktanol és a víz közöt (5.2. ábra). Ezt a modult lgD-nek nevezik. A lgk érték szoros korrelációt mutat a lgD értékkel a pH függvényében.

lgD ionvisszaszorított forma

pka ionos forma pH 5.2. ábra A lgD-pH összefüggés a Pallas intelligens szoftverrel előre jelezve. A lgD-t nevezhetjük a lgP pH függő formájának. A lgP vagy lgKow az n-oktanol és víz közötti megoszlást adja meg. HILIC-nál víz és egy kevésbé poláris mozgófázis közti megoszlás van. Az noktanol-víz és a HILIC-nhál tapasztalt fázisviszonyok inverzei egymásnak. Minél nagyobb a lgP, annál kisebb a vegyületek visszatartása a HILIC-ban. Saját tapasztalat, hogy általában, ha lgP<-1, akkor kapunk a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál megfelelő visszatartást (k>1). A szakirodalomban, az erre témára vonatkozó, kevés számú közleményben ez az érték -0,5. Az elválasztások tervezésénél a lgP helyett a lgD használata előnyösebb, a későbbiekben ezt fogjuk használni. A lgD megadja, hogy adott ionerősség és puffer koncentráció mellett hogyan függ az adott vegyület megoszlása az apoláris oktanol és a poláris víz között. Tekintettel arra, hogy a HILIC és az oktanol-víz hasonló megoszlási rendszert jelent, de inverzei egymásnak, ezt figyelembe véve, használhatjuk a Collender-típusú megközelítést: lgk=-algD+b ahol: a és b rendszer állandók 46

[5.1]

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Ez egyben annyit jelent, hogy a vízre vonatkozó lgD értékek megfelelő korrekcióval átvihetők a HILIC elválasztásra. Ezt a korrekciót tartalmazza a „a” és „b” együttható. A 3. csoportba vagy osztályba sorolt vegyületek azok, amelyek bázisos csoportot tartalmaznak. Az ionizációs viszonyokat az 5.2. ábrán adtuk meg.

ionizáltság 1

protonált bázis

I 0,5

-2

+2

pKa

szabad bázis

pH

.

5.3. ábra Ionizáltság változása a pH függvényében bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél •

A pH=pKa−2 értéknél savasabb tartományban a molekula ionos formában van jelen (a.), ez jelenti a poláris molekuláris formát, amely a mozgófázisban kevésbé jól oldódik, ennek megfelelően visszatartása a szabad bázishoz képest nagy mértékű. A kölcsönhatási lehetőségek száma kicsi, nincs több egyensúly egymás mellett, ezért kis zónaszélesség és szimmetrikus csúcs várható.

•

A pH=pKa+2 értéknél lúgosabb tartományban ion visszaszorított formában (szabad bázis). Ez jelenti az apolárisabb molekuláris formát, amely kölcsönhatása az állófázissal kisebb, mint a protonált formáé. A nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál a bázisos csoportot tartalmazó vegyület a holtidő körül eluálódik.

•

A pH= pKa±2 tartományban (c. tartomány) a molekula mindkét formája jelen van, több egyensúly lehetséges, ennek megfelelően széles csúcs és egyes esetekben aszimmetria várható. A szilikagél alapú állófázisoknál ebben a pH tartományban a szilanol csoportok egy része is ionizált molekuláris formában van. A negatív töltésű szilanol anion erős kölcsönhatásba lép a pozitív töltésű, protonált bázikus csoporttal. Az ioncserére alkalmas helyek száma korlátozott, ezért ezeken a helyeken hamar túltelítés következik be, amely eredménye széles aszimmetrikus kromatográfiás csúcs..

A lgD-pH és a lgk-pH között ugyanaz a Collendar-típusú összefüggés érvényes (5.4. ábra), amelyet a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél már bemutattunk (5.2. ábra). Az 5.4. ábrán bemutatott pH-lgD görbe a Pallas intelligens programmal előre jelezhető. A lgD adatok korrekciókkal felhasználhatók az elválasztás tervezésére.

47

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

lgD

ionvisszaszorított forma pka ionos forma pH

5.4. ábra lgD-pH összefüggés bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél. Ma az alkalmazott mérési módszerekkel szemben alapvető követelmény, hogy robosztus legyen a módszer. Ebből következik, hogy amennyiben ez lehetséges, mind a savas, mind pedig a bázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek esetében az ionizált formának megfelelő pH-t kell beállítani. A 4. csoportba sorolt vegyületek a HILIC állófázisok által megengedett pH tartományban nem változik meg a molekuláris formájuk. Ha pH kontroll kell, akkor az az állófázis miatt szükséges.

5.1. Puffer választás a HILIC –ban A HILIC-ban is a puffereknek eleget kell tenni az általános követelményeknek. Ezek közül a legfontosabb, hogy a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisból ne váljanak ki. Idegen kifejezéssel kompatibiliseknek kell lenniük a mozgófázissal. Mielőtt ezt a részt tovább tárgyalnánk, nézzük meg, hogy a folyadékkromatográfiás gyakorlatban mit nevezünk puffereknek. A pufferoldatok pH-ja jól definiált, sav illetve bázis hozzáadásakor kevéssé változik. A pufferoldatok gyenge savból (vagy bázisból) és a gyenge sav (bázis) erős bázissal (savval) alkotott sójából álló rendszerek. Folyadékkromatográfiás gyakorlatban alkalmazunk olyan anyagokat is, amelyek a fenti definíciónak nem felelnek meg viszont pH változás tompító hatásúak. Ha a pH tompító hatást tesszük meg a puffer definiciónak, akkor ezek az anyagok is a puffer kategóriába kerülnek. A pH változást tompító oldatok egyik fő jellemzőjük a pufferkapacitás. A pufferkapacitás (ß) a pufferoldatok tompítóhatását jellemzi, definíciószerűen valamely erős bázisnak (b) vagy erős savnak (a) az a mennyisége [mol/dm3], amely a pufferoldat pH-ját egy-egységgel változtatja meg:

β ahol:

HA

βHA Csav Csó

= 2 ,3 ⋅

c sav ⋅ c só c sav + c só

[5.1.1]

puffer-kapacitás puffer gyenge sav komponense alkalmazott gyenge sav bázissal képzett sója

Mielőtt a pH tompító hatású anyagokkal (pufferek) szemben támasztott általános követelményeket vizsgálnánk, néhány, a kiválasztásuknál fontos gyakorlati szempontot vizsgálunk meg.

48

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Először is puffer használata savas vagy bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél szükséges. Az ionos vegyületek bevitele a mozgófázisba az esetek többségében csökkenti az állófázis stabilitását. •

a puffer tartalmú mozgófázisnak szilárd anyagtól mentesnek kell lennie. Mindig szűrni kell a puffer oldatot, HPLC-nél kb. 0,5μm-es ,az UPLC-nél 0,22 μm-es pórusátmérőjű membránszűrővel. A következő kritérium a detektálással függ össze. A puffer komponenseknek is van fényelnyelése, amennyiben ez túl nagy az adott hullámhosszon, akkor lehetetlenné teszi a mérést. A fény áteresztést a tiszta puffer komponensekre adjuk meg, a gyakorlatban 0,2 mol/l feletti koncentrációban nem használjuk azokat, így a megadott értékeknél kisebb hullámhosszon is mérhetünk. Alap kritérium puffer fényelnyelésével kapcsolatban, hogy • •

a puffer tartalmú mozgófázis UV cut-off hullámhossza kisebb legyen, mint a mérésnél alkalmazott hullámhossz. puffer tisztasági követelménye. Kromatográfiás minőségű, tiszta puffer még nem kapható, így mindig az elérhető legtisztább anyagot kell alkalmazni. Nem megfelelően tiszta puffert tartalmazó mozgófázis in-situ módosíthatja az állófázis felületét, illetve gradiens elúciónál szellemcsúcsokat eredményezhet.

A HILIC alkalmazásánál kritikus a puffer kompatibilitása a mozgófázissal. A nagy acetonitril és metanol tartalmú mozgófázisoknál a szerves alapú pufferek használata ajánlatos. Ezeknél is figyelembe kell venni az oldhatóságot, sok esetben 25 mmol/dm3 feletti pufferkoncentrációk esetén megnő a szilárd anyag kiválás veszélye. A használható legnagyobb puffer koncentrációt a mozgófázis szerves oldószer tartalma szabja meg. Figyelembe véve, hogy ennél a módszernél 70 tf.% feletti szerves oldószer tartalmat használunk, minél jobban közelítünk a vízmentes mozgófázishoz, annál kisebb a megengedett puffer koncentráció. Kivételként említjük meg, hogy 70-80 tf.% szerves oldószer tartalomnál az irodalomban 200 mmol/dm3 koncentrációt is alkalmaztak. A nagy szerves oldószer tartalom miatt a puffer típus megválasztása kritikus. A szervetlen pufferek, így a foszfát pufferek a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisokban nem oldódnak. Más szavakkal inkompatibilisek a mozgófázissal. A pufferek közül csak a szerves komponens tartalmúak jöhetnek szóba, ezek ammónium-acetát/ecetsav ammónium-formát/ hangyasav ammónium-citrátok/citomsavak tris/tris HCl trietilamin-foszfát A HILIC módszernél a legtöbbet használt oldószer az acetonitril. A fenti pufferek oldhatósága is korlátozott ebben sz oldószerben. Az eddigi gyakorlat szerint 25 mmol/l feletti alkalmazásukkor a só kiválás veszélye megnő. A vegyületek többsége, amelyeket ebben a kategóriában találunk nem tartalmaz UV-fényt elnyelő csoportot. Detektálásukhoz vagy tömegspektrométert, vagy ELSD vagy koronakisülésen alapuló aeroszol detektort kell használni, ekkor az ammónium-só formában lévő vegyületek használhatók pufferként, mert nagyobb hőmérsékleten elpárologtathatók (illékony pufferek). Tompító hatású anyagokként, azaz a folyadékkromatográfiás gyakorlatban pufferként használatosak a következő anyagok: hangyasav ecetsav trifluorecetsav

49

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A HILIC-ban az a egyik legg gyakrabban alkalmazott a tompító t hatáású anyag (pu uffer) az amm móniumA ammóniu um-acetát kéét pH tartom mányban haasználható (5 5.1. ábra). A 3,5-5,5 közzti tartoacetát. Az mánybaan és 8,5-10 0,5 köztiben. Ahogy az ábrából láttható, hogy 3,5 pH alattt, az 5,5-8,,5 között kicsi a pufferkapacit p tása. Az 5.1.1. ábrán beemutatott ad datok vizes közegre k vonaatkoznak.

5.1.1. ábra a A pufferkapaccitás pH és koncentráció k ófüggése ammónium-aceetát puffer aalkalmazásakor A HILIC-ban nagy szervees oldószertaartalomnál dolgozunk. d Ez a tompíttóhatású any yagoknál (pufferek knél) a pKa érték eltolód dását eredm ményezi. Az 5.1.2. 5 ábrán ezt az eltoló ódást adtuk meg.

5.1.2. ábra a Az ammónium-acetát p pKa értékéneek változása a a metanolbban a vízhez viszonyítva Azz 5.1.2. ábráából jól láth ható, hogy a változás mértéke m márr olyan nagy y, hogy sok k esetben nem férrünk be a pK Ka értékének k eltolódásáával korrigállt ±1-es tarttományba. A maximális pufferkapacitáás a puffer komponenssének pKa±1 1 környezettében van. A vízben m mért pKa érttéket 1-3 egységgel korrigálnii kell. Elméletileg még meg m nem old dott kérdés, hogy a HILIIC-nál a hattárfelületi ben hogyan n alakulnak k a pH viszo onyok. Feltehetőleg eb bben a vizess rétegben az ionos vízrétegb anyagok k, így a tom mpítóhatású anyagok (p pufferek) felldúsulnak. Ennek E eredm ményeképp a pufferkapacitáásuk nő. Ebb ben az esetben a vízre vonatkozó v pK Ka értékekett használhattjuk a tompíítóhatású anyagok k (pufferek) kiválasztásáánál. 50

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC A puffer készítése és a pH mérés mikéntje a HILIC módszerek reprodukálásánál és adaptálásánál is alapvető. Továbbiakban ezt tárgyaljuk. Elsőnek a puffer készítés lehetséges módjait vizsgáljuk. Savas vagy bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél elérkeztünk az egyik központi kérdéshez: milyen pH értéken dolgozzunk. Vagy meddig kell csökkenteni a pH értéket ahhoz, hogy az protonált formáját kapjuk meg a bázisoknak. Vagy a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél meddig növelhetjük a pH-t, hogy a savaniont kapjuk meg anélkül, hogy a kolonnát tönkretennénk. A szervesvizes rendszerekben a hidrogén-ion aktivitást több tényező együttesen szabja meg, a pH, mint fogalom egy műveleti paraméter, amely mérésének megvannak az egyértelmű szabályai. A protonálódást, a deprotonálódást, és a kolonna tönkremenetelt viszont az oldatok hidrogén-ion aktivitása szabja meg. Megállapíthatjuk, hogyha csak a puffer pH-ját mérjük, akkor a nem vizes oldatban a hidrogén-ion aktivitás nem adható meg. Így a vizes pufferoldatokra megadott kolonna stabilitás értéke nem számolható ki csak a puffer pH ismeretében. A mozgófázisban mért, de vízre kalibrált pH mérésnél már a hidrogén-ion aktivitások a megadottak alapján számolhatók, amennyiben az elektródoknál a diffúziós potenciál elhanyagolható. A pH skála értelmezésénél mindig a használt mozgófázis összetételéből, és az azt alkotó szerves oldószerből kell kiindulnunk. A pH skálát a mozgófázist alkotó oldószerelegy nagy mennyiségű alkotója határozza meg. Viszonyítási alapnak a vizet vesszük: 25 ºC-on a víz önprotonálódási állandójának negatív logaritmusa 14. Azaz a pH skálát 0 és 14 között értelmezzük, metanolnál ez az érték 16,77 a pH skála ennek megfelelően 0 és 16,77 között értelmezendő, acetonitril-víz esetén a pKa érték 34,40, tetrahidrofurán-víznél 34,70. A pufferek kiválasztásánál és a vegyületek ionizáltsági állapotának megítélésénél a pKa központi szerepet tölt be. A vízre kimért pKa értékek különösen a nagy szerves oldószer tartalomnál változnak meg jelentősen. Sajnálatos módon az irodalomban még nem jelentek meg adatok arról, hogy a vízre megadott 1-8 pH közötti stabilitás hogyan vihető át a szerves oldószer tartalmú mozgófázisban mért pH stabilitásra. Spekulatív módon azonban következtethetünk ezekre az adatokra. Például 70 tf.% acetonitril víz elegynél a pH skála kitolódása 3,14, így a fordított fázisú s töltet felső pH ( s pH ) határa 11 körül van. Ismételten fel kell hívni a figyelmet, hogy ez nem az alkalmazott puffer pH-ja! Mindezekből látszik, hogy a viszonylag egyszerű pH megadási és mérési módszer adja a használható kolonna pH tartományáról a legkevesebb információt. A kolonna gyártók megadják a felső alkalmazási pH értéket. Nem adják meg viszont, hogy vizes vagy a szervesvizes közegre vonatkozik-e. A HILIC gyakorlatában használt nagy szerves oldószer tartalomnál a hidrogén-ion aktivitás és a vizes közegben mért pH értékek között jelentős eltérés van. Ezért, ha a megadott felső használati pH értéknél dolgozunk, kérdéses a kolonna élettartama! Gyakorlati szempontból is elérkeztünk egy lényeges szemponthoz; hogyan lehetséges úgy puffer oldatokat készítenünk, hogy azok reprodukálhatóak legyenek. Ez a kérdés ismételten visszavezethető arra, hogy az oldatban mért hidrogén-ion aktivitás még vizes oldatban sem törvényszerűen egyezik meg a mért pH értékkel, továbbá az ion koncentráció is befolyásolja. Következmény, hogy az eltérően készített és a pH mérő által azonos értéket adó oldatok hidrogén-ion aktivitása eltérő, és a módszer reprodukálásánál eltérő eredményt kapunk. Ezek után nézzük meg, hogy hányféleképpen készíthetjük el a puffert. 1.

Az ajánlott módszer, hogy az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekből tömeg szerint összemérjük az oldatokat, és a nemzetközileg elfogadott értéket használjuk. Ez egyértelmű, mindenhol reprodukálható. Amennyiben táblázatban az adott összetételt és a hozzá tartozó pH értéket nem találjuk meg, akkor a tiszta komponensekből törzsoldatot készítünk, ezek pH-ja adott és a megadott arányokban összemérjük, és mérjük a pH értéket. A tömegmérés az egyik legpontosabb analitikai mérésünk.

2.

Az analitikai-kémiai számításoknál megismert közelítő képlet alapján számítást végzünk: pH=pKa+log Csó/Csav

51

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC a képlet alapján kiszámoljuk, hogy 0,01 mól/l savhoz mennyi bázist kell adni, hogy 4-es legyen a pH értéke. Készítsünk ecetsav-ammóniumacetát puffert. pKa=4,76, ekkor bemérünk 0,01 mol ecetsavat egy 1000 ml-es normállombikba, majd a számítás alapján hozzáadunk 0,015 mol ammónium-hidroxidot, és 1 l-re egészítjük ki. A pH csak körülbelül lesz 4-es értékű, mert a bázisnál nem vettük figyelembe az aktivitásfüggést ( lásd Debey-Hückel elmélet vagy Bates-Guenheim közelítés). A hidrogén-ion aktivitás függ a disszociációs állandótól, az egyéb ionoktól, és a mozgó fázisban mért valódi hidrogénion aktivitás, az önprotonálódási állandótól. 2.1. módszer: bemérjük az ecetsavat és ammónium-hidroxiddal-dal 4-es pH értékig titráljuk. Ismételten a hidrogén-ion aktivitás meghatározatlansága okoz bizonytalanságot a retenció reprodukálásában. 2.2. módszer: a fenti műveletet a mozgófázisban hajtjuk végre. A mozgófázishoz hozzámérjük az ecetsavat, és NH4OH oldattal titrálva állítjuk be a pH értéket. Ekkor a vízre vonatkoztatott értékhez képest megkapjuk a vízre kalibrált, de a mozgó fázisban mért pH értéket, amely eltér a vízre vonatkoztatottól és a szerves oldószerre vonatkoztatottól is. A puffer készítésnél, tehát az első módszer ajánlott, módszer átvételnél viszont ellenőrizni kell, hogy hogyan készítették. Mivel a HILIC használatakor is a helyes pH megválasztásának döntő szerepe van, továbbá a módszereket csak azonos pH mérési megoldás mellett lehet reprodukálni bemutatjuk a módszereket és rámutatunk azok különbségeire.

5.2. A pH mérés lehetőségei és gyakorlata a folyadékkromatográfiában A pufferek pH-ját az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekhez viszonyítva egyértelműen, és reprodukálhatóan lehet mérni. Kérdéses viszont, hogy mit értünk a mozgófázis pH-ján és hogyan mérjük. Három lehetőség kínálkozik: 1. 2. 3.

Mérjük a puffer pH-t és ehhez adjuk a szerves oldószert Kalibráljuk az üvegelektródot az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekre, és utána a kész mozgófázisban mérjük a pH-t A kalibrációnál az elsődleges és/vagy másodlagos puffereket a mozgófázisba mérjük be, és a mérést is a mozgófázisban végezzük el.

Az első esetben a pH alsó és felső indexében is „w” kell, hogy szerepeljen, a második esetben, az alsó indexben „w”, a felsőben „s”, a harmadik esetben mind az alsó, mind a felső indexben „s”-nek kell szerepelni. A három mérési módszer három eltérő eredményt (számot) ad. Kérdés, hogy milyen folyadékkromatográfiás szempontból lehet érdekes a „valódi” hidrogén-ion aktivitás. Az első lényeges kérdés, hogy a gyártó cégek által megadott pH tartomány a fordított fázisú töltetekre milyen módon mért értékre értendő. A másik lényeges kérdés kapcsolódik a proton funkciós vegyületek elválasztásához (a savas vagy bázikus csoportot tartalmazókra). Az ilyen típusú elválasztásoknál a pH alapvető paraméter, mert a vegyületek pKa értékéhez képest kell beállítani. Ahhoz, hogy a hidrogénion aktivitás hatását megértsük, vissza kell mennünk az ionaktivitás általános elméletéhez, nevezetesen a Debey-Hückel közelitéshez és a Bates-Guggenheim konvencióhoz. Az előbbi a termodinamikailag nem mérhető egyedi hidrogén-ion aktivitás becslését teszi lehetővé, az utóbbi ezt kiterjeszti más oldószerekre is. Az összefüggés a követező:

logγ H = −

A · I1/2 1 + a 0 · B · I1/2

[5.2.1.]

ahol γH az egyedi hidrogén-ion aktivitás, I az ionerősség, A és B konstansok, amelyek az oldószertől és a hőmérséklettől függenek, az ao a szolvatált ionméret. 52

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC Az eredeti Bates-Guggenheim konvenció szerint az oldószer víz, és a standard állapotot is erre vonatkoztatjuk, úgyhogy a hidrogén-ion koncentrációt végtelen kicsinek vesszük, akkor az ao · B értéke 1,5. Ha a fenti adatokat átvisszük más oldószerekre is, akkor az előbbi megközelítés szerint az alábbi összefüggést kapjuk. w

ερ 1/2 ] [5.2.2.] ε wρ ahol a felső index s az adott oldószert, míg w a vizet jelenti, ε az adott oldószer és víz permittivitását, a ρ pedig a sűrűséget. s

(s a0 B) = 1,5[ s

Amennyiben a pH-t értelmezni akarjuk a fordított fázisú mozgófázisoknál, akkor a standard állapot nem lehet más, mint az adott oldószer, és ebben a hidrogén-ion koncentrációt végtelen kicsinek vesszük. Ez egy újabb hidrogén-ion skálát jelent. A vízre vonatkozó pH skálát szokás „abszolút” pH skálának nevezni. A két pH skála megkülönböztetésére a IUPAC (Robinson és Stoke alapján), amennyiben a pH-t az abszolút értékhez akarjuk hasonlítani, vagy kifejezni vele, akkor a pH alsó indexében „w” szerepel, és a felső indexben „s”. Ha az adott közeg (oldószer) a viszonyítási alap, akkor az alsó és a felső indexben is „s” szerepel: s w pH

= ss pH − log( sw γ 0H )

[5.2.3.]

amennyiben a vízre definiáljuk a standard állapotot, akkor a két skála megegyezik. Ezeket a meggondolásokat kell alkalmaznunk az összes sav-bázis egyensúlyra is, ahol a pH-nak szerepe van. Ennek megfelelően a savi disszociációs állandó negatív logaritmusára is (pKa): s w pK a

= ss pK a − log( sw γ 0H )

[5.2.4.]

Ebben az összefüggésben a hidrogénion standard állapotát vizes közegre adjuk meg, ha a koncentrációja tart a nullához; másképpen fogalmazva, ha végtelen híg oldatról van szó, akkor értéke tart a nullához. Nem szabad elfelednünk, hogy értéke függ az oldatban található egyéb ionoktól is. Folyadékkromatográfiás körülmények között viszont a viszonyítási alap az adott mozgófázis. Ez okozza a hidrogénion aktivitása közti eltérést! Ha a három módszerrel ugyanazt az értéket olvassuk le a pH mérőről, tudnunk kell, hogy az három nagyon eltérő hidrogén-ion aktivitást jelent. Ha vegyületek oldaláról nézzük az ionos és a nem ionos molekuláris formák aránya nagy mértékben változik. Ez pedig a visszatartás változásával jár a HILIC-ban. Reprodukálni csak akkor lehet egy módszert, ha pH mérés ugyanazon módszerrel történik, mint, amelyet a módszer kidolgozásánál alkalmaztak.

53

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC

6. A visszaatartástt megszzabó téényezőkk és törvényszzerűségek a HILIC--ban A folyadékkro omatográfiáás gyakorlatb ban, ahol a vegyületek k többféle m molekuláris formában f k jelen a mo ozgófázisban n, biztosítan ni kell, hogy y az elválassztás során az arányuk k állandó lehetnek legyen. Így van ez a HILIC-nál is. A módszzer kidolgozáásnál, vagy az átvett módszer megíítélésénél e ho ogy kell-e alk kalmaznunk pH kontrolltt. Ennek meg gítéléséhez issmernünk első feladat, annak eldöntése, Ka értékeit. Azt A kell mond danunk, hogy y a pKa ismeerete nélkül n nem lehet a módszerm kell a veegyületek pK fejlesztéssnek nekikezzdeni. Ezt azz anyagi állaandót vagy valaki v már megmérte m és közzé tette az irodalomban, vagy nekün nk kell külön nböző módsszerek alkalm mazásával megmérni, m vaagy ma már léteznek gramok, amellyekkel a veg gyületszerkezzetek alapján n előre tudju uk jelezni (preediktálni) olyan szzakértői prog azokat. A pKa ismerretében és azz állófázis pH p tűrését fig gyelembe vééve dönthetü ünk arról, ho ogy kell-e pH konttroll. Szilikag gél vagy szillikagél alapú ú HILIC állófázisokat 2-8 vagy 3-7--es pH tartom mányban használh hatjuk. Savaas csoportott tartalmazó ó vegyületek knél a pKa-2 2 pH értékekk alatt a veegyületek disszociáációja elhany yagolható. Ha H az állófázzis felső haszználati pH-aa 8, akkor azzok a savas csoportot c tartalmaazó vegyülettek, melyek pKa értéke 10, az ilyen közegben már m ion visszzaszorított formában f vannak. Ezeknél a savas s csoporrtot tartalmaazó vegyületteknél nem kell pH kon ntroll. Ha az állófázis felső hassználati pH--a 7, akkor azok a a savass csoportot tartalmazó t v vegyületek, m melyek pKa értéke 9, az ilyen közegben már m ion visszaszorított formában f vaannak. Bázissos csoporto ot tartalmazó ó vegyük csak k most az álllófázisok allsó pH tűréssi határait keell figyeleteknél,, ugyanezt a metódust követve lembe veennünk, ez az a érék 0 vagy 1. A HILIIC –nál, aholl nagy szerv ves oldószer tartalmú közzegekben dolgozunk, az ionizzációs viszon nyok úgy változnak v meeg, hogy sav vak pKa érttékei a vízheez képest oportot tartaalmazóké viszont csökk kenek. A vízrre vonatkozó ó értékek teh hát nagy nőnek, a bázisos cso biztonsáágot nyújtan nak a pH kon ntroll megítéélésére. Ezt mutatjuk m bee a 6.1. és 6.2. ábrákon.

6.1. ábra Savaas csoportott tartalmazó vegyületek elválasztásaa savas puffe ferrel. Az 1. görbe g a vizees közegben adja meg a vizsgálandóó vegyületre a molekulárris formák arányát, a a 3. nagy n szervess oldószer taartamú közeggben. A 2. és é 4. görbék a puffer ion nizációs viszoonyait a adják meg víízben és naggy szerves old dószer tartamú közegben n. A 6.1. áb brán az I=0,5 5 ionizáltság gi állapot jeleenti a pKa érrtéket. Egyérrtelműen láth ható, hogy a vegyület pKa értééke is, és például a HIILIC-ban sok kat használtt ammónium m-actát/ecettsav pKa érttéke is a nagyobb b pH értékek k felé tolódott el. Ez abb ból a szempo ontból is fon ntos, mert feellép a komp penzációs effektus és az azono os eltolódás miatt megm marad a rendszer pufferkapacitása, m mert benne maradunk m ományban. Az A elválaszttás tervezéséénél a vízre v vonatkozó adatokkal a a pufferrre megadottt pKa±1 tarto számolh hatunk. Enneek feltétele, hogy savass csoportot tartalmazó vegyületekn nél savat taartalmazó tompító hatású (pufffert) anyago ot használjunk. 54

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC Bázisos csoportot taartalmazó vegyületekné v él (6.2. ábra)) is hasonló viszonyokaat kapunk, ha h puffer bázist taartalmaz. A pKa értékeek eltolódásaa, csökkenésse azonos irrányba mutat, és ismétt fellép a kompenzációs effek ktus

6.2. ábra A puff ffer bázikus összetevőjén ö ek és a szervves vegyülett bázisos csooportjának p pKa érték eltoolódása a moozgófázis szeerves oldószeer tartalmán nak változtattásával. Jelöölések: 1. puffe fer vizes közeegben, 2. báázikus csoporrtot tartalmaazó vegyülett vízben, 3. puffer 60 6 v/v% szerves oldószeerben, 4. bázzikus csoporrtot tartalmaazó vegyület 60 v/v% % szerves old dószerben A HILIC gyak korlatában kevés k a bázisos csoporto ot tartalmazzó puffer. So ok esetben a formiát E az eseetben a báziisos csoport pKa értéke a kisebb vagy acetát puffereket kell használnunk. Ebben pH felé tolódik el, míg m a puffer pKa –ja a nagyobbak n felé f (6.3.ábraa). A két elleentétes irány yú változás azt eredményez e bból a ph taartománybóll, ahol a puffferkapacitás megfei, hogy a kicsúszunk, ab lelő. Ilyeenkor empirrikus megközzelítést haszználunk. s p HA s pK

w

= as w pK K HA + bs

[6.1.]

A jelölésseknél az s jelenti j a nag gy szerves olldószer tartaalmú mozgófázist, w a v vizet.

6.3. ábra A szaggatott s voonallal jelöltt görbék a víízre megadott ionizációss viszonyokaat tartalmazzzák, a folyytonos a szerrves vegyülettek hozzáadáása után kia alakultakat. A jobb oldaalon a savas puffer (formiát vagy acetát)) változása, míg a balold dalon a bázisos vegyületté látható. 55

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A 6.1. összefüggést felhasználva, a puffer vízben mért pKa értékét ismerjük, akkor úgy kell a puffer pH-t vízre számítani, hogy az 1-2 egységgel kisebb legyen, mint bázisos csoport vízre számított pKa értéke. Ebben az esetben a maximális pufferkapacitást biztosító pH tartományban maradunk. A molekuláris formák ismerete a HILIC elválasztásnál alapvető. Ennek oka nagyon egyszerű, mert csak nagy polaritású anyagok elválasztása oldható meg ezzel a módszerrel. Az ionogén vegyületek (savas vagy bázisos csoportot vagy csoportokat tartalmazók) molekuláris formái a pH függvénye. Az ionos forma nagy polaritású, míg az ion-visszaszorított forma sokkal apolárisabb. Az ionos forma ilyenkor HILIC-val, míg az ion visszaszorított forma a RP-HPLC módszerrel határozható meg. Bázisos csoportot tartalmazó vegyületek vízoldhatósága nagyban növelhető, ha olyan mozgófázis pH-án dolgozunk, ahol protonált formában fordulnak elő. A 6.6. ábrán a dextrometorfán, diphenydramin és a pszeudóefedrin lgD-pH görbéjét adtuk meg. A 6.5. ábrán megadott lgD-pH görbék alapján megállapítható, hogy a pH, mint retenciót és szelektivitást befolyásoló paraméternek alapvető szerepe van a HILIC módszer alkalmazásánál is. Ez előre vetíti, hogy a HILIC alkalmas nagyobb molekulatömegű és ionizálható csoportot tartalmazó anyagok elválasztására is, ha mérési körülmények között a vegyület ionos molekuláris formába hozható. Az ionos molekuláris formában a szerves vegyületek oldhatósága nagyságrendekkel megnő a vízben az ion visszaszorítotthoz képest (semleges molekuláris forma). Ezt mutatjuk be olyan vegyületeknél, melyek nagyobb molekulatömegűek, és apoláris hidrofób részt is tartalmaznak (6.4 ábra).

6.4. ábra. Nagyobb molekulatömegű anyagok, amelyek jelentős apoláris (hidrofób) részt tartalmaznak, ezek is jól oldhatók ionos molekuláris állapotban. Ezeknek a vegyületeknek az elválasztása többféleképpen megoldható. A 6.5. ábrán látható lgD-pH függvények alapján a vegyületek nagy pH értéken viszonylag apoláris jellegűek. Ez jellemzi a vegyületek szabad bázis formáját vagy az ion visszaszorított molekuláris formát. A RP-HPLC módszer alkalmazható, ha a lgD vagy lgP értéke nullánál nagyobb. Nagy pH értékeken ez a megadott vegyületekre igaz, mert mindhárom vegyületre 2-es értékű körül van a lgD. Ezzel teljesül, hogy az RP-HPLC módszerrel a vegyületek meghatározhatók. A következő kérdés, hogy vajon megfelelően nagy-e a lgD –k közötti különbség, hogy a vegyületeket el tudjuk választani. Ehhez a két legközelebb eső lgD-t kell megnéznünk (kritikus pár), ha ezek között a különbség (ΔlgD) nagyobb, mint 0,1-0,2 akkor nagy valószínűséggel elválaszthatók A 6.5. ábrából megállapítható, hogy a kritikus párra lgD értékek között nagyobb a különbség, mint 0,1, ezért ezek a vegyületek egy jól borított utószilanizált C-18-as tölteten elválaszthatók nagy pH értéken. A megadott vegyületek lgD értéki több nagyságrenddel csökkennek (lásd 6.5. ábra) kis pH értékeken, ezzel az ionos molekuláris formában a vegyületek a víz oldhatósága jelentősen megnő. Ezzel párhuzamosan sószerű vegyületek szerves oldószerekben való oldhatósága jelentősen csökken. HILIC módszer alkalmazásakor, ha

56

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC ezeket a vegyületeket kolonnára adagoljuk, akkor a koncentrációjuk a poláris állófázis felületén kialakult vízrétegben nagyobb, mint a mozgófázis oldószerében. Ezzel teljesül az a feltétel, hogy legkevésbé poláris vegyületre is nagyobb lesz a visszatartás, mint 1. A HILIC módszernél többféle állófázist is használhatunk az elválasztásukra. Nézzük meg, ha egy szilikagél alapú diol fázist alkalmazunk, akkor milyen fő kölcsönhatások szabják meg a visszatartást. Vizsgálatunk most az állófázis hatásra terjed ki. Ennél az állófázisnál a poláris jellege miatt kialakul az víz réteg, amelybe az ionos molekuláris formában lévő komponensek kedvezményezetten beoldódnak. Ezt nevezzük HILIC hatásnak. A szilikagél alapú diol-fázisnál a propil-csoportok apolárisak, ezért a molekulák apoláris része és az állófázis közötti apoláris (hidrofób) kölcsönhatás elkerülhetetlen. Feltételezzük, hogy a két kölcsönhatás egymástól függetlenül lép fel ekkor a visszatartás a két hatás összege lesz: k=khilic+khidrofób

[6.2.]

ahol: khilic és a khidrofób a két kölcsönhatás megszabta visszatartási rész

6.5. ábra A dextrometorfán, diphenydramin és a pszeudóefedrin megoszlása az apoláris n-oktán és a víz között. A pH<5 mozgófázisban mind három vegyület egyetlen molekuláris formában található. A protonált forma vízoldhatósága nagy. A 6.5. ábrán a dextrometorfán, diphenydramin és a pszeudóefedrin megoszlását adtuk meg az apoláris n-oktán és a víz között. A HILIC módszernél alkalmazott nagy szerves oldószer tartalomnál a pKa érték attól függően lesz nagyobb vagy kisebb, hogy milyen típusú puffert alkalmazunk. Az irodalmi példában egy keverék puffert használtak, amely ammónium-acetátot, trietilamint tartalmazott és a pH-t foszforsavval állították be 5,2-re. A vegyületek retenciós sorrendje megegyezett a n-oktanol-vízben mérttel, elsőként a pszeudóefedrin, másodikként a diphenydramin végül a dextrometorfán eluálódott. Az alklamazott kolonna egy Silica A típusú Supelcosil kolonna volt. Ez a kolonna típus nagyobb mennyiségű fémiont tartalmaz, amely növeli a szilanolcsoportok savasságát. 5,2-es pH értéknél a szilanolcsoportok egy része ionizált formában van. A vegyületek pKa értéke 9 felett van, így gyakorlatilag ionos formában vannak jelen a mozgófázisban. A protonált amin csoport és a negatív töltésű ionizált szilanolcsoportok között ioncserés kölcsönhatás alakul ki. A visszatartás mértéke az ionizált szilanolcsoportoktól függ, ez viszont a szilikagél fémion tartalmától. Ez egyben jelzés arra nézve is, hogy csak az azonos állapotú, gyakorlati szempontból azonos fémion tartalmú kolonna az, amely azonos visszatartást és szelektivitást ad. Az ioncserét a mozgófázis ionkoncentrációja nagyban befolyásolja, tehát ilyen esetekben nemcsak a pH-t, de puffer koncentrációt is azonos értéken kell tartani. Mivel mindhárom vegyület gyakorlatilag ionizált formában van és egy hidrogéniont vesz fel (egy pozitív töltés), ezért az ionkölcsönhatás az állófázissal közel azonos, a vegyületek apoláris része (hidrofób rész) eltérő ezért a szerves oldószerekben az oldhatósága megnő. 57

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A fenti, irodallomból vett példával p azt kívántuk biizonyítani, hogy h a lgD-p pH függvény y ismerete m h hogy egy-egy y vegyületcssoport HILIC C módszerreel meghatáro ozható-e. is alapvető, hogy megítéljük, yen pH érték keken lesz sttabil a rendszer. Továbbáá, hogy mily A lgP vagy ionogén anyag goknál a lgD D-pH függvén ny ismerete lehetővé teszzi a retenciós sorrend gítélését is. A két adatsor ismerete fo ontos, mert a nagy vízolldhatóság és elválaasztás nehézsségének meg alapvető ő a HILIC allkalmazásakor. A nagy vízoldhatóságú anyagok sok funkcciós csoporto ot tartalmaznak és a vegyülletek apolárris váza elhaanyagolható.. Néhány ko onkrét példáát a 6.6. ábráán mutatunk be..

6.6. ábra DG), triglicin n (TG), N-(1--deoxi-D-glü ükóz-1-il)-glicin (GG), glicin (G),, diglicin (D N--(1-deoxi-D--glükóz-1-il))-di-glicin (GDG), ( N-(1-deoxi-D-glü ükóz-1-il)-trri-glicin (GT TG) A 6.4. ábrán glicin és abból a levezeethető szárm mazékok láth hatók. A veegyületek lg gP értéke nél kisebb, am mi mutatja a jó vízoldhattóságukat. A vízoldhatósság tovább növelhető, n minden esetben -1-n ha mérésskor alkalmaazott puffer pH-ján p az am minocsoport protonálódik p vagy a savaas csoport ion nizálódik. A glicin sorozat lgP értékeit a 6..1. táblázatbaan adtuk meeg. A retenció ós sorrend kköveti a lgP értékeket. é m a legnag gyobb N-(deeoxy-D-gluk kóz-1-il)A legkissebb visszataartása a gliccinnek (lg=-2,75) volt, míg diglicinn nek (lgP=-3,,93). Vegyület neve: n

lgP

G

-2,75

DG

-2,95

GG

-3,22

TG

-3,33

GDG

-3,44

GTG

-3,93 6.1. tábláza at A glicin n sorozat lgP P értékei

Ah hogy előzőleg hangsúly yoztuk a vízzoldhatóság tovább növelhető, ha m méréskor alk kalmazott puffer pH-ján az am minocsoport protonálódik k vagy a sav vas csoport ionizálódik. A pH függv vényében a megad dott vegyülettek ionizáció ós viszonyaiit a 6.5. ábráán adtuk meg. A lgD csö ökkenésével a visszatartás nő őni fog. Ezzzel a pH is egy e döntő paraméter p lessz, amennyiiben a vegyü ület proton funkciós csoporto ot tartalmaz.. 58

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC A fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszernél a lgP-t és az lgD-t közvetlen függvénykapcsolatba hoztuk a lgk –val. Megtehetjük ezt a HILIC-nél is. Az RP-HPLC módszernél alkalmazott lgP-lgk összefüggés ekkor a következőképp módosul: lgk=-algP+b

[6.3.]

Ismételten felhívjuk a figyelmet arra, hogy ezt a közelítést csak a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál lehet használni, ahol teljesül a k>1 feltétel.

6.7. ábra A nagy polaritású, proton funkciós vegyületek megoszlása n-oktanol-víz között. A lgD-pH diagram segíti a pH optimálást is. Ismételten hangsúlyozzuk, hogy ezek az adatok vízre vonatkoznak. Felhasználva 6.3. összefüggést és annak analógiájára: lgk=-algD+b

[6.4.]

és a már bemutatott 5.7 összefüggést: s w pK a

= ss pK a − log( sw γ 0H )

és ennek alapján a 6.1.-ben megadottat: s s pK HA

w

= as w pK HA + bs ,

Ezek alapján a bázisos csoportot tartalmazó vegyületeknél 1-2 egységgel kisebbre vesszük a vízre megadott értékeket. A transzformált értékek segítenek a kritikus pH elkerüléeésre is. Kritikusnak nevezzük, azokat a pH-kat, ahol a két vegyület lgD értéke megegyezik, mert ott a visszatartásuk is nagy valószínűséggel azonos. A lgD értékek különbsége segít annak megítélésében, hogy mely vegyületek lesznek a kritikus párok. Minél kisebb a lgD-ben a különbség, annál nagyobb a valószínűsége, hogy a két vegyület retenciós ideje közel esik. Ez a megközelítés az elválasztást a mozgófázis oldaláról nézi. Az állófázis szerepe a folyadékkromatográfiás elválasztásban döntő. A mozgófázisban meglévő kis különbségeket nagyban felerősítheti az állófázis-komponens kölcsönhatás. Ez különösen igaz a HILIC módszernél, ahol egyszerre több kölcsönhatás szabja meg a visszatartást. A mozgófázisbeli ioizációs viszonyok segítenek abban, hogy kevesebb számú lépéssel oldjunk meg egy-egy feladatot. Nézzük meg azt a vegyületsort, amelyeket a 6.8. ábrán adtunk meg.

59

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC

6.8.ábra HILIC C-val meghaatározott veggyületek szerrkezeti képleete. A vegyülletek között kromatográffiásan s semleges, savvas- és bázisos csoportoot tartalmazóók is vannakk. A 6.8. ábrán megadott m veegyületek kro omatográfiáss szempontból nagyon eeltérő tulajdo onságúak. Az általu unk alkalmaazott folyadéékkromatogrráfiás beosztás szerint taalálunk köztü ük folyadékk kromatográfiásan n semleges vegyületeke v et, például acetamid, forrmamid, sav vas csoporto ot tartalmazó ó vegyületeket, oxálsav, oxaamiksav és bázisos b csop portot tartalm mazókat, 1-aminó-benzzpirén. An nélkül, hogy y ismernénk k a felsorolt vegyületek lgD-pH viseelkedését neehez lenne eldönteni, hogy miilyen pH-n kezdjük k az elválasztások e kat, és hogyaan folytassuk k a kísérletekket, ha több vegyület együtt eluálódik. e A 6.9. ábrán adtuk a meg azt, a hogy a pH p függvény yében hogyaan változnak k meg az n-oktanol-víz közötti megoszláások. A lgD D közötti kü ülönbségek értékeléséveel látjuk, ho ogy mely nek kritikusaak. A sok metszéspont egyben e jelzi,, hogy egyikk pH értékrő ől áttérve vegyülettpárok leszn a másik kra hogyan változhatnak v k meg a kriitikus vegyü ületpárok. Mindezek M fig gyelembevéteelével az elválasztás tervezése a mérnökii elvárásokn nak megfelelően történhet, amely jelentősen csö ökkenti a módszerr kidolgozásra fordított időt.

6.9. ábra A 6.8. ábráán megadott vegyületek és az aminó-benzpiridin nt tartalmazó vegyületek k ionizáációs viszonyyait megadó lgD-pH függgvény. 60

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC

7. Szerves oldószer tartalom hatása a visszatartásra Az 5. és 6. fejezetben részletesen tárgyaltuk a pH szerepét a HILIC módszerrel meghatározható vegyületek elválasztásánál. Az ionogén anyagoknak olyan molekuláris formába kell lenniük, hogy oldhatóságuk a mozgófázisban a legkisebb legyen. Továbbá, a kromatográfiásan semleges (nem ionogén) vegyületeknél a lgP értékeknek - 0,5 vagy -1 alatt kell lenniük, hogy a minimális visszatartás értékét (k>1) biztosítani tudjuk. Ha a megadott minimális visszatartás értékét (k>1) biztosítani tudjuk, akkor a következő lépés, hogy a szerves oldószer tartalmat változtatva a legrövidebb idő alatt a legnagyobb elválasztást elérjük. A lehetséges oldószerek, amelyeket a HILIC gyakorlatában használhatunk, azok a következők: víz>metanol>acetonitril>tetrahidrofurán. A sorrend az elúciós erősségi sorrendet adja meg. Minél nagyobb a víztartalom, annál nagyobb az elúciós erősség és annál kisebb a vegyületek visszatartása. Megfordítva a tételt, ahogy csökken a mozgófázisok víztartalma, úgy csökken a mozgófázis poláris jellege; ezzel a poláris, ionogén és ionos vegyületek oldhatósága is csökken a mozgófázisban, és ezzel együtt nő a visszatartásuk. A legkisebb elúciós erősségű a legkevésbé poláris tetrahidrofurán (THF) lesz, a legerősebb a víz, a víznél kisebb elúciós erősséget mutat a metanol (MeOH), ennél is kisebbet az acetonitril (ACN). Ennek egyszerű a magyarázata, a megadott sorrendben növekednek a nagy polaritású anyagok és a szerves vagy szervetlen ionok oldhatósága, így k=ns/nm

[7.1.]

ahol k a visszatartási tényező (retenciós faktor), ns az állófázisban a kolonnára adagolt mólok száma, az nm ugyanez a mozgófázisban. Első közelítésben, amennyiben növekszik a vegyületek oldhatósága mozgófázisban az a 7.1. kifejezés szerint visszatartás csökkenést eredményez. A megoszlási hányados oldaláról közelítve a visszatartást: K=Cs/ Cm

[7.2.]

ahol K megoszlási hányados, a Cs és a Cm az álló és a mozgófázisban a kolonnára adagolt minta koncentrációja. Amennyiben az előzőekben megadott sorrend szerint változtatjuk az oldószereket, akkor a THF-től a vízig nő a nagy polaritású anyagok és a szerves és szervetlen ionok koncentrációja a mozgófázisban (nm). Végül: tr= tm(1+ns/nm)

[7.3.]

ahol tm a holtidő. A retenciós idő csökkenését jól mutatja a 7.3. kifejezés. Az eluenserősségi sorrend megfordulása még egy nagyon jelentős változást eredményez a fordított fázisú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC, RPLC) módszerhez képest. A fordított fázisú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC, RPLC) módszernél növelve a mozgófázis szerves oldószer tartalmát a visszatartás a 7.4. egyenlet szerint csökken: lgk=A-Bϕ

[7.4.]

ahol ϕ a szerves oldószer koncentrációja a mozgófázisban, A állandó, B az egyenes meredeksége a 7.1. ábrán

61

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC

7.1. ábra A visszatartáási tényező változása v a szerves s oldószer koncentrációjának ffüggvényébeen a fordíított fázisú folyadékkrom f matográfiás (RP-HPLC, RPLC) módsszernél. A nagy polarritású vegyü ületeknél, ah hol poláris állófázist á alk kalmazunk, akkor a vissszatartás változássa ellentétes lesz. A külö önböző nagy y polaritású ú vegyületek knél ez a válltozás, általáában 7080 tf.% szerves oldó ószer tartalom fölött, sziintén linearrizálható (7.5 5): gk= A’+B’ϕ lg

[7.5.]

A 7.5. kifejezéésben a B’ irránytangensse pozitív lessz (7.2. ábraa).

7.2. ábra A visszatartáási tényező változása v a szerves s oldósszer koncenttrációjának ffüggvényébeen, ha nagyy polaritású anyagokat szerves s vagyy szervetlen ionokat i hatáározunk megg poláris állóófázison. M Mivel a 7.2. ábrán á bemutatott változzás ellentétees a fordítottt fázisú foly yadékkromaatográfiás (RP-HPL LC, RPLC) mó ódszerhez kéépest és az állófázis á oldaaláról nézve a visszatartáás valamilyeen poláris kölcsönh hatás eredm ményeképp jön j létre, ezt a módszzert Hidroph hil Interactio on Chromattography vagy maa köztudatbaan csak, min nt HILIC terjedt el. A kromatográáfiás módszer névadásáában a poláris kölcsönh hatás megjelölése egyérrtelmű, a kkromatográffia megjelöléése, viszont magyarázattot igényel. A megnevezzés takarja az a összes folyadék folyadék kfázisú elvállasztást. A HILIC-nál H azz elválasztáss mechanizm musára utal, ahol a fő retenciót megszab bó folyamattot visszaveezetik a follyadék-folyaadék megosszlásra. Áltaalánosan elffogadott, hogy a poláris p állóffázis felületéén a víz kedvezményezeetten szorbeáálódik. Ebbee a szorpcióss rétegbe oldódnak be a komp ponensek és ekkor egy folyadék-foly f yadék megoszlás jön léttre a két fáziis között. uk meg a 7.3 3. ábrán. Ezt adtu 62

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC

7.3. ábra A visszatartáás egyik leheetséges változzata a HILIC C folyadékkrromatográfiáás módszernél. A koomponens megoszlik m a szorbeált s vízréteg és a mozgófázis m köözött. A másik megk közelítést a normálfázissú folyadékk kromatográfi fia (NP-HPLC C) oldaláról tehetjük. Az állóffázisok, amelyekben a HILIC mód dszernél hassználunk, po olárisak. Azz NP-HPLC--nél és a HILIC módszernél m a azonos jelleg gű állófázistt alkalmazun nk. Mozgófáázis oldaláró ól, és a vissszatartást megszab bó tényezőkeet figyelembee véve, a NP P-HPLC-ben csökken a retenció, r ha a poláris mo odifikátor koncentrrációját növ veljük az alk kalmazott old dószerelegyb ben. HILIC-n nál is, ha a v víztartalmat növeljük a mozgó ófázisban, csö ökken a vissszatartás. AN N-H2O vagy MeOH-H M e a vííz jelenti a polárisabb p 2O elegyben oldószerrt. A fent leíírtak alapján n vontak anaalógiát a HILIC és az NP P-HPLC között. Elnevezzték vizes fázisú normálfázisú ú folyadékkro omatográfiáának. Ma enn nek csak törrténelmi jeleentősége van n, mert a e HILIC elnevezés az elterjedt. n folyadékkrromatográfiás módszer, ahol poláriss állófázist éés vizet (puffferelt) és A HILIC olyan ves oldószerreket használlunk mozgófázisként. Jeelentős visszzatartást csak k a nagy azzal eleegyedő szerv szerves oldószer tarrtalmú mozg gófázisoknáll kapunk, ah hol a poláriis anyagok o oldhatóságaa jelentős ben csökken.. mértékb A szerves veegyületek olldhatóság cssökkenése a nagy szerrves oldószeer tartalomn nál válik jelentősssé (7.4. ábraa)

7.4. ábra A visszatartáás változásaa a mozgófázzis szerves oldószer o tartaalmának válltoztatásáva al. A vegyületek poláriss jellegével a visszatartá ás nő. Polariitási sorrendd: 3>2>1. A 7.4. ábrán látható, hogy jelentős változás 60 0-70 tf.% feelett várható ó. Minél naagyobb a ntrációban keell alkalmazzni a szervess oldószert. vegyülettek polaritássa, annál kissebb koncen A szerves oldószerben a vegyületek v o oldhatóságo t az oktanoll-víz megoszzlásból becsülhetjük, e az elvállasztási péld dákon már bemutattuk k. Amennyib ben a mego oszlási hány yadost a ahogy ezt HILIC-nél a mozgófázis és az állófázis á felü ületén kialak kult víz közti megoszlás szabja meg, akkor a retencióss sorrend elllentétes lesz a lgP értékeekkel. Amen nnyiben a reetenciós sorreend ettől elttér, akkor más kölccsönhatások k is szerepet játszanak a visszatartássban. 63

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC Am mennyiben kihasználju uk az analóg giát a normálfázisú foly yadékkromtográfiával, akkor az elválasztások tervezzésénél felhaasználhatjuk k a 7.6.összefüggést [7.6.]

gk= A-Slgϕ lg

ah hol: A mozg gófázis víztaartalma, aho ol nincs visszzatartás, S az a egységny yi víz koncen ntrációra jutó vissszatartás válltozás, ϕ a mozgófázis m v víztartalma. Grrafikusan áb brázolva a 7.6. kifejezést a 7.5. ábráát kapjuk.

7.5. ábra A visszataartás változzása a mozggófázis víztaartalmának függvéényében a HILIC H módszeer alkalmazáásakor. Minéll nagyobb a vízoldhatósá ága a vegyülletnek, a annál kisebbb az egyenes meredeksége.

64

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC

8. Grádienselúció a HILIC-ban A kromatográfiás elválasztás tervezésekor, a pH kontroll eldöntése után, annak megítélése, hogy az adott feladatot izokratikusan (állandó mozgófázis összetétel) megoldható-e vagy grádienselúciót kell alkalmazni. Egy elválasztás akkor oldható meg izokratikusan, ha a legkevésbé visszatartott komponensre k>1 és legnagyobb retenciójura teljesül, hogy a k<10. Ennél a megítélésnél a kritikus pár a két szélső retenciójú komponens. HILIC-nál, tehát legkevésbé poláris és a legpolárisabb komponenst kell szemügyre vennünk. Ha ezek között túl nagy a polaritás különbség, akkor izokratikusan egy lépésben a feladat, a megadott feltételek mellett, nem oldható meg. Mielőtt a grádienselúció részletes tárgyalásába belemennénk, hangsúlyozzuk, hogy maga a fogalom egy gyűjtőfogalom. Általános értelemben minden olyan esetben grádienselúcióról beszélünk, mikor a kromatográfiás rendszerben úgy változtatjuk meg a paramétereket, hogy a vegyületek retenciója csökken. Ha például HILIC-ban a mozgófázis víztartalmát növeljük, akkor annak az elúciós erőssége nő és ezért a vegyületek retenciója csökken. A retenció csökkenését az oldószer összetételének megváltoztatásával értük el, ezért oldószergrádiensről beszélünk. A kettősionokat tartalmazó (zwitterionos) állófázisoknál az ionogén anyag retenciója csökkenthető a pufferkoncentráció növelésével, ez a sógrádiens. Az elválasztásnál növelhetjük a hőmérsékletet, ami növeli a mozgófázis felé a komponensek megoszlását, ekkor hőmérsékletgrádiensről beszélünk. Vagy ionogén anyagoknál a pH változtatásával lehet csökkenteni a visszatartást, ekkor pH grádiensről beszélünk. A gyakorlati életben az oldószergrádienst használjuk az esetek döntő többségében, ezért a továbbiakban ezzel foglalkozunk részletesen. Az oldószergrádiensnél mindig az elválasztás szempontjából erősebb oldószer koncentrációját kell növelni az időben. A HILIC-nál ez a víz, amelynek a koncentrációját növelni kell, s ekkor csökken a retenció. A szerves oldószer víztartalmát megszabja az, hogy 40 tf.% felett az összes poláris komponens a holtidő körül eluálódik. Ez adja a felső határát a mozgófázis víztartalmának növelésében. A HILIC elválasztásnál alapvető, hogy a határfelületi fázisban vízréteg alakuljon ki, ehhez értelemszerűen a mozgófázisnak vizet kell tartalmaznia. A gádineselúció nem indítható szerves oldószerből, mint a leggyengébbik oldószertől, hanem 2-4 tf% vizet kell tartalmaznia. Nézzük meg, hogy hogyan dönthető el, hogy mikor kell grádienselúciót alkalmaznunk. Ennek egyik eldöntési lehetősége az általános grádienselúció alkalmazása. Az általános grádienselúció a fordított fázisú folyadékkromatográfiában vált ismerté. Ez annyit jelent, hogy az adott elválasztási módszernél a grádienselúciót az alkalmazgató leggyengébb mozgófázis összetételtől indítjuk és azt a legerősebbig folytatjuk. A kapott kromatogram alapján döntünk arról, hogy a feladat izokratikusan megoldható-e vagy grádienselúciót kell használni. Az általános elvet vetítsük ki a HILIC gyakorlatára és elsőnek a hagyományos HPLC-nál adjuk meg, hogyan hajtható végre az általános grádienselúció.

8.1. Általános grádienselúció a HILIC-ban A 8. fejezetben megadottak szerint elsőnek a két mozgófázis összetételt kell kiválasztanunk. A gyengébbik oldószert a továbbiakban „A”-val a legerősebbet „B”-vel jelöljük. A mozgófázis összetétel határ, amelyben mozoghatunk: A

97/3 tf.%

acetonitril/víz

B

60/40 tf.% acetonitril/víz

65

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A hagyományos HPLC rendszernél a 2,5 μm-nél nagyobb szemcseátmérőjű töltettel megtöltött kolonnákat használhatjuk. A kolonnák minimális hosszúsága függvénye a szemcseátmérőnek, általában a 3 μm-es vagy ennél kisebb szemcseátmérőjűeknél a maximális hossz 15 cm, a nagyobb szemcseátmérővel töltötteknél 10 cm. Ahhoz, hogy a kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások ne haladják meg a 10 %-ot, a kolonnaátmérő 3mm vagy ennél nagyobb. Ekkor lesz a folyadékkromatográfiás rendszer kolonnán kívüli zónaszélesítő hatása 10 %-nál kisebb. Ahhoz, hogy az elválasztás sebessége megfelelő legyen 0,5 vagy 1 ml/min térfogatáramlási sebesség használata ajánlatos. Mivel minden folyadékkromatográfiás rendszernek van késletetési ideje, ezt a grádiensprofil beállítássánál figyelembe kell vennünk. Erről a fejezet további részében foglal-kozunk részletesen. Ezzel a késleltetési idővel kell növelnünk a grádiensidőt a „B” oldószernél, ahhoz a kolonna végén valóban az általunk beállított oldószer legyen a mérési ciklus végén. A következő lépés a grádiensprofil kiválasztása. A készülékek különböző grádiensprofil alkalmazását teszik lehetővé ugyan, de a gyakorlatban a lineáris profil használata elterjedt, mert ennek elméleti háttere ismert valamilyen mélységben. A HILIC-nál használjunk lineáris grádiensprofilt az általános grádienselúció végrehajtásakor. A lineáris grádiens arra is jó, hogy az izokratikus módszer használatakor a körülményeket (mozgófázis összetételt) előrejelezzük. Nézzük meg, hogy a HILIC módszernél, hogyan alkalmazhatjuk a fordított fázisú folyadékkromatográfiában jól bevált lineáris grádienst. Az angol elnevezése ennek a módszernek linear solvent strength gradient elution (LLS). A 6. és 7. fejezetben tárgyaltuk a HILIC-ban az oldószerek szerepét az elválasztásban. Megállapítást nyert, hogy a RP-HPLC-ban használt összefüggések a mozgófázis erősségi sorrend figyelembe vételével használhatók a HILIC gyakorlatában is. Ahhoz, hogy az olvasónak a kereszthivatkozásokhoz ne kelljen visszalapozni és az általános grádiens, mint módszer könnyen érthetővé váljon a módszer kiválasztása szempontjából, a fő megállapításokat megismételjük. Kezdjük a mozgófázis (eluenserősséggel) erősséggel. A RP-HPLC módszernél az oldószererősségi sorrend: H2O<MeOHMeOH>AN>EtOH>IPrOH>THF Azt, hogy hogyan befolyásolják a különböző oldószerek a visszatartást, mindig arra az oldószerre adjuk meg, amely csökkenti a visszatartást, tehát a nagyobb oldószererőségűre. Ezt a konvenciót használva, a RP-HPLC módszernél: lgk=A-Bφ

[8.1.1.]

ahol az A és B állandók, amely az alkalmazott kolonnától és a vizsgált vegyületektől függ, a φ a szerves oldószer térfogat százaléka a mozgófázisban. Megjegyezzük, hogy a B-t sok közleményben „S”-sel jelölik, és oldószererősségi paraméternek nevezik. Sajnos az RP-HPLC-ban ennek értéke nemcsak a szerves oldószer minőségétől, hanem az alkalmazott állófázis borítottságától is függ. Ez az egyszerű összefüggés 10 tf.% szerves oldószer tartalomtól 90 tf.% szerves oldószer tartalomig, az esetek többségében jól írja le az oldószererősség hatását a visszatartásra a RP-HPLC módszernél. A HILIC-nál a legerősebb oldószer a víz lesz, és mivel a mozgófázisnak minden esetben kell vizet tartalmaznia, az összefüggéseket a víztartalomra kell vonatkoztatni. Továbbá, ahogy többször már hangsúlyoztuk, hogy egy adott víz koncentráció felett az összes komponens a holtidő körül fog eluálódni. Ez szűkíti az alkalmazható víztartalmát a mozgófázisnak. 40 tf% víz koncentráció alatt a komponensek visszatartása exponenciális függvény szerint változik a víztartalommal. Formailag ugyanazok az összefüggések használhatók, mind a RP-HPLC módszernél, csak a φ most a mozgófázis víztartalmát jelenti. Ennek alapján a 3tf.% víztartalomtól a 40 tf.% víztartalomig felírható, hogy lgk=A-Bφvíz

66

[8.1.2.]

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC Mind a RP-HP M PLC-nál, min nd a HILIC-n nál formailag ugyanazok k az összefü üggések haszználhatók a mozgó ófázis erősséég és a visszzatartás közzti összefügg gés leírásáraa. Ez az alap pja, hogy a fordított fázisú kromatográfi k iában a lineeáris grádien nselúcióra jó ól kidolgozo ott összefügg géseket haszználjuk a HILIC-náál is. Ezeket az összefügg géseket az ellmélet iránt érdeklődők é s számára a kö önyv melléklletekében adjuk meg. m Most a gyakorlati szempontbó ól tárgyaljuk k, hogy mily yen követkeeztetéseket tudunk t a lineáris grádienelúcció használaatakor kapottt kromatogrramokból. A 8.1.1. ábráán három kü ülönböző nk be. A 8.1.1. ábrán az elválasztáso ok megítéléssénél alapvető három paaramétert lehetőséget mutatun e holtidő (tm), a mássodik a kétszzeres holtidő, amikor a visszatartáási faktor is megadtunk. Az első (retenció ós faktor) érrtéke 1 és a harmadik a tizenegyszzeres holtidő, amikor a visszatartáási faktor (retenció ós faktor) érrtéke 10. Ez a három fak ktor, mint sarokkövek lehetővé l teszzik, hogy dö öntéseket hozzunk k a HILIC mó ódszer haszn nálatáról.

8.1.1.ábra Az általánoss grádienselú A úció alkalmaazása a HILIIC-nál a módszerfejleszttés segítéséree. Az „A” ábrrán a legkevésbé poláriis komponen nsek visszataartása kisebbb, mint egy, az állófázis á nem m megfelelő, „B” ábra: erősebb e „A” mozgófázisssal kell indíttani a grádieenst, vagy gyoorsabban növvelni a „B” koncentrációóját, „C”ábra: optimált grádiens. A 8.1.1.A ábrán megadottt kromatogramnál az 1., a 2. és a harmadik kom mponens k<1 visszatartási tényezőnél t ( (retenciós faaktornál) elu uálódnak. A grádiensellúciós módsszer használlatakor a kromato ográfiás csúccsok keskeny yebbek (zónadiszperzióju uk kisebb), mint m az izokkratikusnál, de véges szélesség gűek. A közzeli tulajdon nságú vegyü ületeknél, am melyek ebbeen a visszatartási tartom mányban eluálódn nak, nagy leesz az együttt eluálódás (interferenci ( a ) veszélye. Ez annyit jjelent, hogy y az adott körülméények közöttt a HILIC nem m alkalmazh ható. Kéérdés az, ho ogy egyértellműen kijeleenhetjük-e, hogy ebben n az esetben n a HILIC-t az adott vegyülettcsoportra nem n alkalmaazhatjuk, meert egyik alaapvető feltéételünk, hogy y k>1 nem teljesült. A válaszz az, hogy nem! n M Minden folyad dékkromatog gráfiás, példáául az RP-HP PLC-ban az állófázis felü ületi tulajdon nságának alapvető ő szerepe van. Ezért kelll a módszerffejlesztést azz állófázis kiiválasztásáv val kezdeni. Ez E az elv még ink kább igaz a HILIC-nál. H A 3. fejezetbeen bemutattu uk, hogy nagyon eltérő felületi tulajjdonságú állófázissok használh hatók a HIL LIC-nál. Elm méleti megaalapozottságaa a HILIC-n nak a határrfelületen kialakultt vízréteg, mind m elsődleg ges poláris kölcsönhatási k i hely adja, ezt e viszont jelentősen módosítják m az állófáázis nyújtottaa egyéb kölcssönhatási leh hetőségek. Ezzeket, mivel a fő hatás m mellett befoly yásolják a visszatartást sok eseetben csak ,mint , másod dlagos kölcssönhatásoknak nevezzük k. Az elneveezés nem 67

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC teljesen fedi ezekneek a kölcsön nhatásoknak k a szerepét a visszatarrtásban. Az ionos vegyü ületeknél ben ezek a másodlagos m kölcsönhatáások adják a visszatartás döntő részzét. sok esetb k= =kHILIC+kmásoddlagos

[8.1.3]

A 8.1.1.A ábrrán megadottt helyzetnél, támaszkod dva a vegyülletek szerkezzetére, ki kelll válasza az állófáázis típust, amelyet a hassználva a k> >1 feltétel nagy n valószín nűséggel telljesül. Ez tanunk azt egyben bizonyíték b i arra, hogy is y a HILIC-néél is, akár izo okratikus elv választást, aakár grádien nselúcióst használu unk, első lép pés a módszeerfejlesztésnéél a vegyülettek szerkezettének ismereetében a kom mpatibilis állófáziss kiválasztáása. A komp patibilitás első e feltételee ugyanis, a sokat em mlített k>1 feltétel f a legkevéssbé visszatarrtott kompon nensre. HILIIC-nál ez a legkevésbé l p poláris vegyü ületet jelenti. A 8.1.1.B ábráán a legkevéésbé visszataartott komponens visszaatartása sokkkal nagyobb b, mint a E két leh hetséges meegoldás közü ül választhaatunk, vagy növeljük minimállisként megaadott k>1. Ekkor az „A” oldószer o vízttartalmát, erő ősebb mozgó ófázisról ind dítjuk a grádiienst, vagy a grádiens seebességét növeljük k. Ami anny yit jelent, ho ogy egységn nyi idő alattt nagyobb mértékben m v változtatjuk a víztartalmú”B B”mozgófázisst. A 8.1.1.C ábrrán a HILIC-ban optimált elválaszttást adtuk meg. m A legkkevésbé vissszatartott nens visszataartása nagyo obb, mint 1, a legnagyo obbé viszontt kisebb, min nt tíz. Terméészetesen kompon ez nem jelenti az optimált o elváálasztási körrülményekett, hanem azzt, hogy ben nne vagyunk k az ú.n. ográfiás céltáblában. A kromatográfiás céltáblaa nem más, minthogy aaz összes kom mponens kromato visszatartása beleesiik 1
[8.1.4.]

ah hol a tR és a tm jelenti a bruttó reten nciós időt és a holtidőt.

8.1.2. ábra a Az áltaalános grádiienselúcióvaal végrehajtott elválasztá ásnál a legkeevésbé visszaatartott kom mponens „k”-ja nagyobb, mint 1, a legjobban visszaatartotté kisebb, mint 2,, ekkor nagyy valószínűsééggel az don megoldh ható. elváálasztás izokkratikus mód

68

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC Álltalánosan elmondható, e hogyha a kromatogram k m bármely réészén a legkkevésbé vissszatartott és a legjjobban visszzatartott kom mponens vissszatartása között k a küllönbség kiseebb, mint 2-3 egység (Δk<2-3), akkor a veegyületek elv választására elegendő azz izokratikuss elválasztás.. A 8.1.3. ábrán ilyen k mon látható,, hogy a legjjobban visszzatartott kom mponens helyzeteet adtunk meeg. Ezen a kromatogram és a legk kevésbé vissszatartott komponens kö özötti különb bség kisebb,, mint 2-3.

8.1.3. ábra a Általáános grádiensselúció alkaalmazása ann nak eldöntéssére, hogy addott mintánáál izokratiku us vagy grádien nselúciót kelll-e használnii. Mivel a leggjobban vissszatartott kom mponens és a legkevésbéé visszatartott közötti visszzatartás különbség kisebbb, mint 2-3 3, ekkor izokkratikus móddszer alkalm mazható. os grádiensellúciós méréssből megadh ható-e az izo okratikus Kéérdés, hogy vajon ebbőll az általáno módszern nél alkalmazzandó mozgó ófázis összetéétel. A válaszzhoz meg keell vizsgálnun nk, hogy a különböző k vegyülettek visszatartása hogyaan függ a mozgófázis m összetételtől. ö Itt jön elő az oldószerrgrádiens előnye, amikor a lineárisan változttatjuk a „B” komponenst k a mozgófázisban. A lineeáris oldószerrgrádiens és az izzokratikus ellválasztás közti k analóg giát Snyder és munkatáársai kimutaatták. Az izo okratikus körülméények közöttt végrehajtottt elválasztássok törvénysszerűségei jo obban feltárttak, mint a grádiensg elúcióé, ezért a tov vábbi eszmeffuttatásokbaan ezeket haasználjuk fel. Az elválaasztások terv vezésénél osztályo okba soroltu uk a vegyüleeteket HILIC C elválasztáss szempontjai szerint. A Az azonos osztályba o tartozó vegyületek v a kromatográfiás körülmények változtatására hasonlóan rreagálnak. Ezeket E az irodalom m hasonló, vagy v kromattográfiásan rokon r vegyü ületeknek nev vezi. Ez szám munkra azérrt fontos, mert a víztartalom v függvényéb ben a retenccióváltozásu uk hasonló jellegű, ez eegyben azt is i jelenti, ha megv változtatjuk az induló („A”) oldószzer összetéteelét, akkor nincs n retencciós sorrend dváltozás. Ezt a heelyzetet a 8.1 1.4. ábrán mutatjuk m be.

8.1.4. ábra a A krom matográfiásan n egy osztályba sorolt veggyületek visszzatartás váltoozás a víztarrtalom függvéényében. A vegyü ületek visszatartásának csökkenése c h hasonló, ezéért az egyeneesek nem meetszik egymá ást, nincs retecióós sorrendvá áltozás. 69

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A HILIC-nál is i általános elvként hassználhatjuk fel, f hogy a kromatográf k fiásan egy osztályba o v a víztartalom v függvényéb ben. hasonló ó, ezért az eg gyenesek sorolt veegyületek viisszatartás változása nem meetszik egym mást, nincs retenciós so orrend válto ozás. Ez an nnyit jelent,, hogy az általános á grádiensselúciónál kapott sorren nd megegyezzik majd az izokratikus i elválasztásn nál. A másik lehetőség, hogy y a minta kü ülönböző krromatográfiáás osztálybaa sorolt vegy yületeket maz. Ezek a vegyületek v cssakúgy, mintt a RP-HPLC C módszernéll eltérően reaagálnak a vízztartalom tartalam megválttoztatására. Ezt E mutatjuk k be a 8.1.5.. ábrán.

8.1.5. ábra a Folyadékkroomatográfiássan eltérő módon F m viselkeedő komponensek, krom matográfiásan n nem m rokon vegyyületek, az izzokratikus módszerre m töörténő módszzer átvitelnéél, attól függgően, h hogy milyen mozgófázis összetételt használunk,, retenciós soorrend váltoozást kapunk k. A 8.1.5. ábrán n bemutatottt vegyületek k eltérő mód don reagáln nak a víztarttalom változztatására. Ez anny yit jelent, ho ogy folyadék kkromatográáfiásan eltérrő módon viselkedő v kom mponensek. A szakirodalom m ekkor krom matográfiásan nem rok kon vegyülettekről beszéll. Ilyen eseteekben az izo okratikus módszerrre történő módszer m átvittelnél, attól függően, f hog gy milyen mozgófázis m össszetételt hassználunk, retencióssorrend változást kapu unk. A 8.1.5 5. ábrán meg gadtuk a k=1 és k=10 h határokat, am melyeken belül báármely mozg gófázis összeetétel válaszztható az izo okratikus elv választásnáll. Az I., a II.. és a III: helyzetb ben a retenció ós sorrendek k lényegesen eltérnek. A módszerfejleesztés során, amikor azt próbáljuk p elérni, hogy h a lehető legkisebb elemzési idő ő mellett azz elvárt kritéériumokat teeljesítsük, vááltoztatni kell a mo ozgófázis összetételét. Ek kkor viszont mozgófázis összetételtőll függően máás retenciós sorrendet kapunk és minden változtatás v u után ellenőriiznünk kell azt. y az általáno os grádienseelúciónál kaapott eredméényeket átvigyük az A következő lépés, hogy izokratik kus elválaszztásra. Továb bbiakban eg gy becslést adunk a meg erről. Szerettnénk hangssúlyozni, hogy a HILIC mó ódszer összeetettsége miatt m nem lehetséges l e egyetlen lép péssel az általános á dni az izokraatikus elválassztás mozgóffázis összetéételét. Ami a módszer grádiensselúciós méréésből megad átvitelnéél fontos, ho ogy a kromatográfiás céltáblába c beetaláljunk. Ahogy A az ellőzőekben kiemeltük k már ez a 1≤k≤10 feltételt f jelen nti. A szakirrodalomban néha ezt a határt k=2 20-ig terjeszztik ki. A b szabadság got jelent ug gyan, de meegnöveli az elemzési kiterjeszztés a módszzerfejlesztésnél nagyobb időt és izzokratikus ellválasztásnáll a kromatog gráfiás csúcsm maximum cssökken, ami jjelentősen megnöveli m a kimutaatási határt, vagy más szóval s csökk kenti a módsszer érzéken nységét. A gy yakorlati felladatokat megoldó ó folyadékkro omatográfiáss szakember számára ezért a k=10-eet jelentő vissszatartási feelsőhatárt kell alap pul vennünk k. A módszeer átvitel máásik alapelve, hogy úgy ymond felülrről közelítjü ük meg a problém mát. Kromato ográfiás szaaknyelvet leffordítva ez annyit jelen nt, hogy a m módszer átv vitelnél a legjobbaan visszatarrtott kompon nenst tekinttjük a kritik kusnak. Az első izokratikus méréssnél az a célunk, hogy ennek k a komponeensnek a vissszatartása ne n legyen nagyobb, min nt 10 (felső határ az elválasztásnál). 70

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC A HILIC-ban kevés k adat áll á rendelkezéésre, hogy a víztartalom változtatásáára milyen mértékben m n a retenció, és milyen módon m változik a szeleektivitás, ezéért csak aján nlást tudunk k tenni a csökken víztartalom változtattására. Abbó ól indulunk ki, k hogy a rendelkezésün r nkre álló vízztartalom vááltoztatási %. Ezt a tarto ományt kell vizsgálnunk k, amikor az általános grrádienselúció ó alapján lehetőség kb. 40 tf.% ő mozgófázis összetételllel elvégeztü ük az első kísérletet. Többféle T leh hetőséget kaphatunk, a kezdő ezeket elemezzük e k a következzőkben. A 8.1.6. ki 8 ábrán a szabályosan viselked dő kromatog gráfiásan rokon, reeguláris) kro omatogramjáát adtuk meg g. Az 1. és a 2. komponeensre nem telljesül a visszzatartásra vonatko ozó minimális kitétel. A visszatartáási tényezőjü ük (retencióss faktoruk) kisebb, min nt 1. Első feladat, hogy a kétt komponens visszatartáása meghalaadja a minimálisan elv várt értéket. Ehhez a k A HILIC C-nál az eluenserősség sszempontjáb ból a víz, mozgófáázis elúciós erősségét cssökkenteni kell. tehát en nnek térfogattszázalékát kell k csökken nteni.

8.1.6. ábra a Az általlános grádieenselúció alaapján elvégzeett első izokratikus méréés eredményye. A kritiku us feltétel teljesültt, a legnagyoobb mértékbeen visszatarrtott kompon nens visszataartási tényezzője kisebb, mint m 10. A legkevésbé visszaatartott komp ponensé viszzont nem értte el a minim mum feltétellekben megszzabottat. Kéérdés, tehát ha h az általán nos grádienseelúció alapjáán elvégzett első e izokratikkus mérés erredménye azt mutaatja, hogy a kritikus feltétel teljesültt, ez annyit jelent, j hogy a legnagyob bb mértékben visszatartott komponens k v visszatartási tényezője kisebb, k mint 10. A legkeevésbé visszaatartott kom mponensé viszont nem érte el a minimum m feltételekb ben megszab bottat, akkorr hogyan fo olytassuk a módszerm nél mindig elsődleges a minimális feltételek teeljesítése. Ezz pedig a fejlesztéést. A módszzerfejlesztésn visszataartási kritériiumok teljessítését jelen nti, majd ezzt követi a kritikus páárok elválasztásának megoldáása. Esetünk kben a legk kevésbé vissszatartott ko omponens retencióját kkell növelni,, hogy a visszatartása meghaaladja a holltidő kétszerresét (k≥1). Ennek eléréésére a mozzgófázis vízttartalmát kell csök kkenteni. Mivel M a víztaartalom válto oztatásában n a lehetőség günk csak 4 40 tf.%-ot ölel ö fel, a víztartallom csökken ntését 5 tf.% %-nál nagyo obb mértékben nem aján nlatos elvég gezni. Tételeezzük fel, hogy azz elő izokrattikus mérésü ünket 10/90 tf.% víz-acetonitril mo ozgófázis össszetételnél végeztük, v akkor a következő k m mérést 15 tf.% % víztartalom mnál fogjuk ellvégezni. Ha a 8.1.6. ábráán az első ko omponens visszatartása eléri, vagy megh haladja k≥1 értéket, ak kkor követkeezik a szeleektivitás opttimálása, amikor a kritikus páárra el kell érnünk é az Rs≥ 1,5 vagy y Rs≥ 2-3 érttéket. A két érték két kü ülönböző elválasztási helyzettre vonatkozzik. Ha a komponensek k k a mintábaan közel azzonos menn nyiségben vannak és érzékenysségük az ado ott detektáláási módszerree közel azon nos, akkor azz Rs≥ 1,5 kriitériumot alkalmazzhatjuk, merrt ez jelenti az alapvonaali elválasztáást. Ha a kritikus pár ko oncentrációjaa, azonos detektáláási érzékeny ységnél több b nagyságren ndben eltér, akkor ahhozz, hogy a naagyobbik komponens interfereenciája ne haamisítsa meg g a megengeedett hibahattáron túl a kisebbikét k azz Rs≥ 2-3 kriitériumot kell alkaalmaznunk. A szelektivitás optimáláás a könyv ennél e a részéénél nem kéépezi azt. A másik szélsső esetet a 8..1.7. ábrán mutatjuk m be..

71

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC

8.1.7. ábra a Az általános gráddienselúció alapján a válaasztott izokra atikus elválaasztási módsszer. A legna agyobb >10, akkor kiléptünk k a minimális m ellvárásnak megfelelő m mértékben visszataartott kompoonensre a k> felttételekből. Ahhoz, A hogy az 5. és a 6. 6 komponen ns visszatartáása kisebb leegyen, mint 10, át növelni keell. a mozgófázis víztartalmá A 8.1.7. ábráán azt muttatjuk be, amikor a az általános á grrádienselúció ó alapján választott v izokratik kus elválaszztási módszeernél a legn nagyobb mértékben vissszatartott ko omponensre a k>10. Ebben az a esetben kiiléptünk a minimális m elvárásnak megfelelő m felttételekből. A Ahhoz, hogy y az 5. és a 6. kom mponens vissszatartása kisebb k legyeen, mint 10,, a mozgófáázis víztartallmát növeln ni kell. A 8.1.6. áb brán megado ottnak megfeelelően az izzokratikus ellválasztásnál 15 tf.% vízztartalmú accetonitrilt használttunk. Addig kell ezután a mozgófáziis víztartalm mát növelni, míg a 6. kom mponensre is i teljesül a k≤10 és igaz lesz, hogy az 1. komponen nsre is teljesü ül a k≥1 és a kritikus p párnál az elv választás v 2-3, a komponense k ek jelnagysáágától függően. Rs=1,5 vagy Ad ddig kell a mozgófázis m összetételét vááltoztatni, am míg a 8.1.8. ábrán á megad dott kromato ogramnak megfelellő elválasztáási képet nem m kapjuk.

8.1.8. ábra a Az általános á gráádienselúcióból kiinduló elválasztás optimálás és é az izokrattikus elválassztási körüllmények meggadása. A leegnagyobb mértékben m vissszatartott komponensre k e igaz, hogy k≤10, a leggkisebb reteciójura, hogyy k≥1 és min nden egyes komponensre k e igaz, hogy Rs≥1,5 vagyy 2-3.

72

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC A 8.1.8. ábrán adtuk meg az általános grádienselúcióból kiinduló elválasztás optimálását. Az elválasztási körülményeit addig kell módosítani, míg a legnagyobb mértékben visszatartott komponensre igaz, hogy k≤10, a legkisebb retenciójúra, hogy k≥1 és minden egyes komponensre igaz, hogy Rs≥1,5 vagy 2-3. Ha az előzőkben megadott kritériumokat nem tudjuk a mozgófázis összetételének változtatásával, akkor állófázist kell váltanunk. Az általános grádienselúciónak megvannak az előnyei, ha az állófázis az adott elválasztásra megfelelő. Ismét visszajutottunk a folyadékkromatográfia alapproblémájához. Nevezetesen, hogy hogyan válasszunk állófázist. Az általános alapelvek egyértelműek, egyrészt a visszatartásra vonatkoznak (lásd az előzőeket), másrészt a csúcsszimmetriára, A csúcsok aszimmetria faktora, vagy tailing faktorának egy adott értéken belül kell lennie. A csúcsok aszimmetria faktorra, vagy tailing faktorára elfogadott értékek sajnálatos módon a különböző folyadékkromatográfiás módszereket előíró szervezeteknél nem azonos. Fogadjuk el, hogy az aszimmetria faktor értéke (As) 0,8 és 1,8 között változhat. Ha bármelyik ezek közül nem teljesül, akkor az adott állófázis (kolonna) nem használható. Ezek kritériumok, azonban az állófázis kiválasztásánál a szükséges, de nem elégséges kritériumot jelentik. Ami minden esetben problematikus az a szelektivitás eldöntése. Ha csak a poláris határfelületi fázis és a kevésbé poláris mozgófázis közti megoszlás szabná meg a megoszlást és ennek megfelelően a szelektivitást, akkor a lgP értékek a szelektivitás előre jelzésére megfelelő alapot adnának. A fő visszatartást adó folyadék-folyadék megoszlás mellett az egyéb kölcsönhatások (másodlagos kölcsönhatások) nagymértékben befolyásolják az egyes vegyületek visszatartását és ezzel a szelektivitást. Ezt előrejelezni, a jelenlegi ismereteink szerint, nehéz. Az általános grádienselúció alkalmazásakor problémát jelent, hogy milyen pH-át használjunk. Ahogy az 5. fejezetben bemutattuk a pH megválasztás csakúgy, mint a fordított fázisú folyadékkromatográfiában alapvető a módszer kidolgozásánál. Ahhoz, hogy a pH megválasztásnál helyes döntést hozzunk ismernünk kell a vegyületek pKa értékeit. Ezeknek három forrása lehet.

•

ismert vegyületekről van szó, amelyeknek a pKa értékeit már kimérték, irodalmi adatok

•

titrálásos, spektrofotometriás módszerrel kimérjük

•

intelligens programok segítségével, a vegyületek szerkezetének ismeretében előre jelezzük (prediktáljuk)

Az általános grádienselúciónál is alapszabály, hogy a vegyületek olyan poláris formában legyenek, hogy azok visszatartása legalább kétszerese legyen a holtidőnek (k=1). Mivel ez ionofor vegyületek (savak és bázisok) a pH függvényében változtatják a molekuláris formáikat szükséges a molekuáris formák ismerete a mozgófázis kémhatását változtatjuk erre szolgálnak a már ismertetett lgD-pH függvények. Amit a HILIC szempontjából, leegyszerűsítve, pH függő „lgP”-nak tekintünk. Mivel a HILIC körülményei között a mozgófázisban és az állófázis határfelületi rétegében (vízrétegben) eltérő a vegyületek pKa értékei, arra kell törekedni, hogy azzal, hogy a nagy szerves oldószer tartalmú közegben és a vízben is ugyanazok legyenek a molekuláris formák arányai. Az általános grádienselúció elvégzése elött is szükséges a vegyületek lgD-pH görbéinek ismerete, hogy a HILIC-nál használt pH-t eldöntsük. Egyben alkalmas lesz arra is, hogy a kiválasztott pH értéken, becslést végezzünk arra nézve, hogy kell-e grádienselúciót alkalmaznunk az elválasztás során. Kiemeljük azt, hogy ez egy kiindulópont, amelyet majd az első mérés alapján módosítanunk kell. A módosítást szükségszerűvé teheti, hogy a minta milyen jellegű komponenseket tartalmaz. Emlékeztetőül, hogy a vegyületek ugyanabba a kromatográfiás osztályba tartoznak (kromatográfiásan hasonló, kromatográfiásan rokon, reguláris vegyületek), vagy különböző osztályba (kromatográfiásan nem hasonló, kromatográfiásan nem rokon, irreguláris vegyületek). A 8.1.9. ábrán különböző savakra adtuk meg a lgD-pH függvényeket. Az ábrából egyértelműen következik, hogy a HILIC elválasztás csak nagy pH értékeken oldható meg.

73

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC

8.1.9. ábra a Különbözző szénatom mszámú savak lgD-pH fü üggvényei. Azzt, hogy egy y intelligens program p a lggD-pH számo olásnál milyen adatokat aad meg, a n-h hexánsav példáján n mutatjuk be b (8.1.10. áb bra). A mego oszlási adato ok mellett megadja m az io onizált és ion visszaszorítottt forma lgP értékeit é és a vegyület pK Ka értékeit. A megoszlási adatok szám molására töb bb modell létezik, ezért a különböző szám molási módszzer eredményeit is feltün nteti, majd ttapasztalati faktorok segítségével ezeket átlagolja.

8.1.10. ábra a A n-hexánsav lgD-pH adaatai és megjeelenítése a Pallas P intelliigens prograam segítségévvel. 74

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC

8.2. A grádienselúció és problémája a HILIC-ban. Az általános grádienselúció valóban egy jó eszköz arra nézve, hogy az összes vegyületet lássuk a kromatogramon. Ha nagy vegyületek közötti visszatartás különbsége az, akkor jelzés arra nézve, hogy grádienselúciót kell használni. A nagy retenciós idő különbség ugyanis azt jelenti, hogy a komponensek elúciója nagyon eltérő oldószer összetételnél következik be. Mivel a vegyületek visszatartását a fő folyadék-folyadék megoszlás mellett több másodlagos kölcsönhatás szabja meg, ezek hatását- a jelenlegi ismereteink mellett-nehéz előre jelezni. A mozgófázisban a viselkedésüket viszont lehetséges. Létezik tehát egy számítógéppel végrehajtható előtervezés, amely irányt mutathat az elválasztási lehetőségre. Nevezetesen, hogy az elválasztás megoldható-e izokratikusan vagy sem. Ezután áttekintjük, hogy milyen szabályszerűségeket kell betartani a grádienselúciónál. A 8.2.1. ábrán az irodalomban leközölt elválasztás vegyületeit adtuk meg. Ha vegyületek szerkezetét nézzük, akkor a polaritásban nagy különbségeket vélünk felfedezni. A mérnöki és a tudományos gyakorlatban, azonban szeretünk mindent, amit lehet, számokkal kifejezni. Ezt a lehetőséget már bemutattuk, hogy a lgD-pH függvény erre nézve nagy segítséget ad. A 8.2.2. ábrán adtuk meg ezeknek a vegyületeknek a lgD-pH függvényét. A 8.2.2. ábrából kiolvasható, higyha HILIC-át akarunk alkalmazni, akkor ez csak a kis pH értékeken lehet. Itt lesz a lgD értéke olyan, hogy az ionos formában lévő vegyületek az acetonitril-puiffer mozgófásból a poláris jellegű állófázis felületére kényszerülnek. Ha kettes vagy hármas savasságú mozgófázisban dolgozunk, akkor látható, hogy a lgD értékek között nagy lesz a különbség. Ez a különbség a legkevésbé poláris és a legpolárisabb vegyület között értendő. A szemcsés és porózus tölteteknél, ha ez a különbség meghaladja a kettes értéket, akkor szükséges a grádienselúció. Az előzőekben taglalt példában ez a helyzet. Ahhoz, hogy egyetlen lépésben az elválasztást el tudjuk végezni grádienselúciót kell alkalmaznunk. Oldószergrádiensnél meg kell adnunk, hogy mi legyen az induló és mi legyen a befejező erős mozgófázis összetétele. Foglalkozzunk először az induló mozgófázis összetétellel. A leggyengébb oldószert a szerves oldószerek jelentik a vízhez viszonyítva. Az olodószerek tárgyalásánál kifejtettük, hogy az acetonitril jelenti a számunkra kedvezőt. A HIILIC gyakorlatában akkor a leggyengébb oldószert is az acetonitil jelenti. Kérdés, tehát, hogy akkor a grádienselúciót a HILIC-ban acetonitrtilből indítsuk? Ennek eldöntéséhez szükséges, hogy a HILIC elválasztási mechanizmusát és a grádienselúciós követelményeket áttekintsük és összeegyeztessük.

75

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC

8.2.1. ábra a A szakirodaloomból vett elválasztási e p példa, amikoor nagyon elltérő polaríttásúvegyületeek elválasztásáát oldották meg m grádien nselúcióval a HILIC-ban.

8.2.2. ábra a A szakirodaloomból vett elválasztási e p példa, amikoor nagyon elltérő polaríttásúvegyületeek elválasztásáát oldották meg m grádien nselúcióval a HILIC-ban. 76

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC A grádienselú úciós technik ka alkalmazáásának az elldöntése a lg gD-pH görbee alapján.

8.2.3. ábra a A visszatartáás egyik leheetséges változzata a HILIC C folyadékkrromatográfiáás módszernél. A koomponens megoszlik m a szorbeált s vízréteg és a mozgófázis m köözött. A HILIC-nál a tudomány mai m álláspon ntja szerint az a elválasztáss egyik sarkaalatos alapjaa a határf adsszorbeálódottt víz és az annál kevéésbé poláris mozgófáziss közötti kom mponens felületi fázisban megoszllás, ahogy ezt e a 8.2.3. ábrán á bemu utattuk. Szük kséges tehátt, hogy a mozgófázisban víz legyen, mert m különbeen ez a hattárfelületi rééteg nem tu ud kialakuln ni. Kérdés, teehát, hogy mekkora legyen a víztartalom m a mozgófáázisban. Eh hhez a grádienselúció elméletéhez e kell visszam mennünk. A 8.2.4. ábrán n a gyakorrlati életben alkaalmazott gráádienselúciós folyamatot adtuk meg g. A grádienselúciónál többször ism mételjük a folyamaatot. Alapvettő, hogy min nden ismétléésnél ugyan nabból a hely yzetből indu uljunk, hogy y minden lépésnél ugyanolyan n visszatartáást, retenciótt kapjunk. B%

II

0

III 1 IV V

I tG

2 t

8.2.4.ábra Gradiens elúcciós technika a alkalmazássa. Az I. a mérés előttii szakasz, II.. az erősebb mozgó fáziss összetevő n növelése, állási idő az új mérés előőtt. tG = gra adiensidő III. vissszaállási szaakasz az „A”” mozgó fáziisra, IV. beá A gradienselú úciónál felm merül az a kérdés, k vajon n a két grad diens mérés között teljes egyenden esetben ugyanarról u a helyzetbőll elegendő iindítani a méréseket. m súlynak kell lennie, vagy mind k meg a grad dienselúció jellemző szak kaszokat a mérés m indítássától. Az első ő szakasz A 8.2.4. ábrán adtuk a mérési ciklus indíítása előtti szakasz. s Ekk kor a két fáázis között az a egyensúly y valószínűlleg beáll. veljük a mo ozgófázis ellúciós erősséégét, ez HIL LIC-nál a vííztartalom növelését n A II. szakaszon növ jelenti, a III. szakaszzon visszaálllunk az ered deti összetéteelre, míg a negyedik n szaakasz az újab bb ciklus előtti váárakozó szak kasz. A 8.2.4.. ábrán az ellső ciklust a nulladik méérésnek kell megadni, mert m ekkor kell ellen nőrizni a mo ozgófázis tissztaságát. A HILIC-nál a IV. szakaszzon kell kialaakulni a hattárfelületi vízrétegn nek. Amenn nyiben ennek k kialakulásaa bizonytalaan, akkor a visszatartás v (retenció) iss bizonytalanná válik. A haatárfelületi rééteg kialakullásának bizo onytalanságaa összefügg azzal, hogy mekkora nél kisebb a mozgófázzis víztartallma, annál hosszabb időt vesz a mozgófázis víztaartalma. Min ületen az eg gyensúlyhozz közeli állap pot elérése. Ha nulladikk lépéstől, amelyet a a igénybe a határfelü mozgófáázis tisztasáágának ellen nőrzésére haasználunk, eltekintünk, e akkor auto omata mintaaadagoló használaatakor, amik kor egy mérééssorozaton belül vagyu unk, nem szü ükséges az áálló- és a mo ozgófázis közötti teljes t egyenssúly beállásaa. A feltétel, hogy mindig g , a nulladik k lépéstől eltekintve, ugy yanolyan helyzetb ből indítsuk a grádienselúciót. Sajno os a hagyományos folyad dékkromatog gráfiás rendsszereknél 77

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC a késleltetési térfogat (dwell volume) nagyon eltérő is lehet. Ennek következtében ezt a HILIC módszerek átvételénél is figyelembe kell venni. A 8.2.5. ábrán adtuk meg, hogy az eltérő késletetési térfogatú készülékekben hogyan alakulnak a mozgófázis összetételi viszonyai. Ha a legkisebb késletetési térfogatú készülékre kidolgozott módszert át akarjuk vinni más folyadékkromatográfiás készülékre, akkor figyelembe kell vennünk az eltérő késletetési térfogatot, amely döntően a folyadékkromatográfiás készülékek eltérő keverési térfogatából ered.

B% 100

tg

t [perc]

8.2.5. ábra A mozgófázis összetétel változása eltérő késleltetési idejű folyadékkromatográfiás készülékek használatakor. Ha a legkisebb késleltetési térfogatú készüléknek megfelelően állítjuk a grádiensidőt, akkor a többi készüléknél előbb ér véget a folyamat, mielőtt elérnénk a végső mozgófázis összetételt A késleltetési idő arányosan eltolja retenciós időket, mert kolonna elejét ezzel az idővel később éri el a mozgófázis. Ez a térfogat értelemszerűen nem okoz zónaszélesedést, de az elválasztásnál alapvető, hogy az elemzés leállítása előtt a kívánt erősségű oldószert elérjük (B). Az elemzési időt tehát ezzel az idővel meg kell hosszabbítani. Izokratikus méréseknél is az adagolt minta térfogata és az adagolót a kolonnával összekötő vezeték térfogata megnöveli a retenciót. A jól optimált rendszernél ez a térfogat elhanyagolható a kolonna térfogatához képest.

8.2.6. ábra Az elméleti grádiens lefutás (szaggatott vonal) és a gyakorlatban kapott (folytonos vonal). A grádienselúciónál mindig figyelembe kell venni a késleltetési térfogatot. A 8.6. ábrán megadtuk az elméleti grádiens lefutást (szaggatott vonal) és a gyakorlatban kapottat (folytonos vonal). A HILIC módszerek átvételénél ezt figyelembe kell vennünk ezt. Továbbá, mivel a határfelületi vízréteg az elválasztásnál alapvető szerepet játszik, a grádienst nem indíthatjuk acetonitrilből. A gyengébbik oldószernek a grádienselúciónál mindig kell vizet tartalmaznia. Kérdése, hogy milyen koncentrációban. Elméletileg, annál jobb, minél nagyobb a koncentrációja, gyakorlatban viszont 78

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC problémát jelenthet, hogy a legkevésbé visszatartott komponens (legkevésbé poláris) visszatartása nem lesz megfelelő és a kolonna elején nem történik meg a koncentrálása. Ennek eredménye az lesz, hogy ennek a komponensnek a csúcsszélesedése nagyobb lesz, mint a többié. Az erős „B” oldószertartályba nem vizet teszünk, hanem 50-60 % szerves oldószer tartamú vizet vagy puffert. Az előzőekben már megállapítást nyert, hogy ez alatt a szerves oldószertartalom alatt a vegyületek visszatartása elhanyagolható. A 8.2.7. ábrán megadott grádinselúciós rendszernél, tehát az „A” tartályba 95/5 térfogatarányú acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)víz (puffer), míg a „B” tartályba 50-60 tf. % acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)víz (puffer kerül). A K

I

KOL

D

A, B – oldószerek I – injektor

B gradienskésés oka: tD=tkev+tö+tinj tD – dwell time, késleltetési idő tkev – keverő kiürülési ideje tö – összekötő vezetéken történő áthaladás ideje tinj – injektorban töltött idő

8.2.7. ábra Az „A” tartályba 95/5 térfogatarányú acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)víz(puffer), míg a „B” tartályba 50-60 tf. % acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)víz (puffer kerül). Amennyiben puffert kell használnunk az ionogén anyagok elválasztásánál, akkor a sókiválás az oldószernél lesz kritikus, mert csökkentve az acetonitril (szerves oldószer) tartalmat a pufferek oldhatósága nő a mozgófázisban. Ha az acetonitrilt (szerves oldószert) összekevertük a pufferrel és fél-egy óra múlva sincs kristály kiválás, akkor a sóproblémát elkerültük. Automata mintaadagoló használatakor egy mintasorozat mérésekor nem kell a teljes egyensúly beállását kivárnunk. Ez sokszor feleslegesen megnövelné az elemzési időt. Ha az első mérést, amelyet „0”-nak nevezünk el, arra használjuk, hogy az oldószer tisztaságot ellenőrizzük, akkor a IV. szakaszon az a fontos, hogy annak befejeztével az „A” mozgófázis áramoljon a kolonnán. A szabályos egymás utáni adagolásokkor, minden esetben ugyanolyan távol vagyunk a teljes egyensúlytól, így minden egyes adagolás után ugyanazokat a visszatartásokat kapjuk. Ha mérést valamilyen okból megállítjuk, akkor az új sorozatot ismét a „0” megjelöléssel kell indítanunk.

8.3. A grádienselúciós folyadékkromatográf tesztje A grádienselúciós rendszerek megbízhatóságát több paraméter is befolyásolja. Az előző fejezetben (8.2.) kiemeltük a késleltetési térfogat szerepét(dwell volume), emellett a folyadékkeverés jósága, a szelepek megbízható működésével összefüggő paraméterek mind-mind befolyásolják a grádiens ismételhetőségét és reprodukálhatóságát. Fel szeretnénk hívni a figyelmet, hogy sok esetben a grádiens ismételhetőségét és reprodukálhatóságát felcserélve használják. Minden olyan esetben, amikor ugyanazon a készüléken végezzük el a kísérleteket, annak bizonyítására, hogy ha ugyanazt a grádinsprofilt alkalmazzuk, akkor a retenciós idők szórása a megadott előíráson belül (specifikáción) marad, akkor ez a grádiens ismételhetőségét jelenti. Ha a kidolgozott grádienselúciós módszert átvisszük egy megegyező késleltetési térfogatú készülékre és a retenciós időkre; és a szórására ugyanazt kapjuk, mind az előző készülékre, akkor a reprodukálhatóságot ellenőriztük. 79

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC A retenciós idők két grádienselúciós készüléken, azonos körülményeket alkalmazva, akkor egyeznek meg, ha a késletetési térfogataik és a folyadékkromatográfiás rendszer kolonnán kívüli térfogati megegyeznek. A 8.1.7. ábrán adtuk meg a grádienselúciós rendszert. A késleltetési térfogat három részből tevődik össze; a keverő, a keverőt az adagolóval összekötő kapilláris, az adagoló össztérfogatából és az adagolót a kolonnával összekötő vezeték térfogatából. A hagyományos folyadékkromatográfiás rendszernél ezek közül a térfogatok közül a keverő térfogata a legnagyobb, ehhez képest a többi elhanyagolható. Elvileg a kolonna végét a detektorcellával összekötő vezeték és a detektor térfogatoknak is meg kellene egyeznie, azonban az ezek között lévő különbségek elhanyagolhatók. Első feladat, tehát a HILIC-ban használt grádienselúciós készüléknél a késleltetési térfogat ellenőrzése. Ehhez a folyadékkromatográfiás rendszerből a kolonnát kivesszük, és az adagolót a detektor bemenetelével egy fojtást jelentő kapillárissal kötjük össze. Ezzel küszöböljük ki, hogy a nagynyomású szivattyú pulzálásából eredő detektorzajt nagymértékben csökkentsük. Vagy a nagyobb térfogat-áramlási sebességet alkalmazzunk, hogy az összekötő vezetéken megfelelően nagy legyen a nyomásesés (1-5 ml/perc). A grádienselúciós körülményeket a 8.3.1. táblázatban adtuk meg. „A” mozgófázis

97/3 tf.%

acetonitril-víz

„B” mozgófázis

97/3/0,5th.%

acetonitril-víz-aceton

Térfogatáramlási sebesség

1 ml/min

Detektálási hullámhossz

254 nm

Adagoló hurka teljes mértékben feltöltve „A” mozgófázissal 8.3.1. táblázat A késleltetési térfogat meghatározásakor alkalmazott folyadékkromatográfiás körülmények. Az adagoló hurka teljes mértékű feltöltése különösen azoknál a HPLC készülékeknél fontos, ahol a változtatható térfogatú adagolás miatt nagy mintatartó hurkot építenek be. Nem szabad elfelejteni, hogy az adagoló hurok térfogata része a késleltetési térfogatnak (dwell volume). A grádienselúciós módszernél az egyik készülékről a másikra való módszer átvitelnél fontos, hogy a teljes koncentráció intervallumban azonos sebességgel növekedjen az erősebb oldószer („B”) mennyisége az („A”)-ban. Ezt ellenőrizzük a grádiens lineritásának vizsgálatával. Ezt az ellenőrzést is kolonna használata nélkül végezzük el. A mérési körülményeket és módszert a 8.3.2. táblázatban adtuk meg. „A” mozgófázis

97/3 tf.%

acetonitril-víz

„B” mozgófázis

57/43/0,5tf.%

acetonitril-víz-aceton

Térfogatáramlási sebesség

1 ml/min

Detektálási hullámhossz

254 nm

Adagoló hurka teljes mértékben feltöltve „A” mozgófázissal Grádiensidő:10 perc, ehhez hozzá kell adni a késleltetési időt. 8.3.2. táblázat A grádinselúciós rendszer linearitásának ellenőrzése a HILIC-nál. 10 perc és ehhez adva a grádienskésés idejét, ez alatt az idő alatt jutunk el az „A” oldószerről a „B” oldószerig. A viszonyokat a 8.3.1.ábrán mutatjuk be. Ha felfutó szakasz egyenletes, akkor a grádiens lineáris, mert az egyenes szakaszra igaz, hog y az egységnyi idő alatt ugyanannyival nő a mozgófázisban a „B” koncentrációja (ΔB tf.%/Δt=állandó). Ha a felfutó szakasz nem egyenletes, akkor ez jelzése annak, hogy a keverő nem működik jól.

80

Dr. Fekeete Jenő: A folyadékkro f matográfia újabb fejlessztési irányaai – HILIC

8.3.1. ábra a A ggrádinselúcióós rendszer linearitásán nak ellenőrzéése a HILIC--nál. Kö övetkezőkbeen a gádiensslépések elleenőrzését végezzük el. Ehhez E a mérrési körülméényeket a 8.3.2. tááblázatban adtuk a meg. „A” mozgófázis m

% 97/3 tf.%

acettonitril-víz

„B” mozgófázis

57/43/0,5 5tf.%

acettonitril-víz-aaceton

Térfog gatáramlási sebesség s

1 ml/min n

Detekttálási hullám mhossz

254 nm

Adago oló hurka telljes mértékben feltöltve „A” mozgóffázissal A „B” koncentráciióját az „A”--ban 5 lépcssőzetesen nö öveljük és minden m lépcső ő között 5 percet p k, amíg eljuttunk a „B” oldószerig o (5 57/43/0,5tf.% % acetonitrill-víz-aceton n). várunk 8 8.3.3. táblázzat A gráádienselúciós készülék ggrádienslépésseinek ellenőőrzése a HILLIC-ban, mérrési körülméények. A lépcsők mag gasságának minden m egyees változtatáss után meg kell k egyezni. Ekkor a „B” koncentól független az oldószerr változtatáss sebessége.. Ha ez nem m teljesül, aakkor a készzüléket a rációjátó szervizn nek verifikáln ni kell.

8.3.2. ábra a A grádienselúcióss készülék grrádienslépéseinek ellenőőrzése a HILIIC-nál. A jól műkködő grádien nselúciós ren ndszernél h1= h2 = h3 = h4 = h5 = h6 = h7 = h8 . 81

Dr. Fekette Jenő: A foolyadékkrom matográfia újabb ú fejleszztési iránya i - HILIC A 8.3.2. ábraa a jól műkö ödő grádiensselúciós rend dszernél h1= h2 = h3 = h4 = h5 = h6 = h7 = h8 , yenlő lépcső őmagasságok kat kapunk. azaz egy A hagyomány yos nagyhattékonyságú folyadékkro omatográfiáss rendszerek knél (HPLC, 400 bar, 6000 PS SI) a kisnyo omású grád diens készüllékeket alkaalmaznak döntő d mértékben. Itt a vezérelt szelepek kkel érik el a megfelelő összetételű ö m mozgófázist. A szelepek működését m id dőről-időre elllenőrizni kell. Ezt szolgálja a következő teszt, amelyeet a HILIC-náál kell elvégeznünk. A kkisnyomású grádiensg elúciós készüléket k v vagy binér (két ( szelep) vagy kvaterrner (négy szelep) s rendszerként használjuk. A szelep pek működéssi jóságának k ellenőrzéséét a 8.3.4.táb blázatban megadottak szzerint végezzzük el. A és B ág

97/3 tf.réész

acettonitril/víz

C és D ág

97/3/0,5 tf.rész acettonitril/víz/aaceton

Térfog gatáramlási sbesség s

1 ml/min n

Detekttálási hullám mhossz

254 nm

Mérésii lépések: 1.

50/50 réssz az A ágbó ól, valamint a C ágból id dő: 3 perc

2.

100 részz a C ágból, idő 3 perc

3.

50/50 réssz az A ágbó ól, valamint a C ágból id dő: 3 perc

A fenttiek ismétlésse: négyszer,, majd az összes lehetséges kombináációra el kelll végezni. 8 8.3.4. táblázzat A kisnyomású grádieenselúciós kéészülékeknéll a szelepek korrekt műkködésének ellenőrzéseekor használlt mérési körrülmények és útmutató. Azz egyes szelepek ellenőrrzésekor a 8.3.3. ábrán megadottaka m at kapjuk.

8.3.3. ábra a A kissnyomású grrádienselúciiós készülékeeknél a szeleepek korrektt működésén nek ellenőrzéésekor kapottt jelsorozat. Az egyes magasságokbó m ól számoljuk k az átlagot, ezzel osztju uk az egy méérésnél kaapott jelet, majd m ezekbőll számoljuk a szórást, ha h ez két százaléknál kissebb a szelep pek felelő. műkködése megfe A 8.3.3. ábrán n látható méréseket m az összes szeleep kombináccióra elvégeezzük és szám moljuk a szórások kat. Ennél a műveletnéél az egyes magasságok m kból számoljjuk az átlag got, ezzel ossztjuk az egy mérrésnél kapottt jelet, majd ezekből szám moljuk a szó órást, ha ez két k százalékn nál kisebb a szelepek működése megfelelő ő.

82

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC A grádienselúció megbízhatóságát a rosszul működő szelepek nagyban befolyásolják. A nagynyomású szelepet ellenőrizni tudjuk, hogy jól zár-e. angolul ezt nevezik „pressure bleed-down” tesztnek. Elvégzése a következőképp történik. A nagynyomású szivattyú nyomás-behatárolóját 350 bar-ra állítjuk. A szivattyúról kijövő vezetéket lezárjuk, és megindítjuk a mozgófázis áramlását. A nyomáshatároló automatikusan leállítja a nagynyomású szivattyút, amikor a nyomás eléri a 350 bar-t. Ha tíz perc eltelte után a nyomáscsökkenés nem nagyobb, mint 15%, akkor a szelepek jól működnek. Ha ennél nagyobb, akkor a szelepet tisztítani vagy cserélni kell. Az egész grádienselúciós rendszer ellenőrzését teszi lehetővé a reprodukálhatóság ellenőrzése. A reprodukálhatóság itt annyit jelent, hogy a tesztet bármely időben megismételve ugyanazokat a szórásokat kapjuk. Az analitikai szakirodalomban ezt a tesztet inkább az ismételhetőség fogalomkörébe kellene sorolnunk. A szakirodalomban és a készülék gyártók körében a „reprodukálhatóság” néven vált ismertté, ezért mi is ezt a fogalmat használjuk. Tetszőleges vegyületsort kiválasztunk, azzal a feltétellel, hogy nagy legyen a vegyületek között a polaritás különbség. Kromatográfiásan semleges vegyületeknél, ez a két egység különbséget jelent a lgP-ben, úgyhogy a legkevésbé visszatartott komponensre teljesüljön, hogy a lgP kisebb legyen, mint -0.5 vagy -1. Hatszor elvégezve a grádienselúciós mérést, a mért adatokból számoljuk az átlagértéket és a szórást. Ugyancsak a görbe alatti területekből számoljuk az átlagot és a szórást. Mindkét esetben, ha a szórás egy százalék alatt van, akkor a grádienselúciós készülék jól működik.

83

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

Tárgymutató Állófázisok erős anioncserélő.....................................................................................................................................................28 erős kationcserélő....................................................................................................................................................28 HILIC aminofázis .....................................................................................................................................................30 HILIC szilikagél ........................................................................................................................................................15 HILIC Zwitter-ionos fázis .......................................................................................................................................29 kizárási molekulatömeg ...........................................................................................................................................13 ZIC-cHILIC ................................................................................................................................................................35 ZIC-HILIC ..................................................................................................................................................................31 ZIC-pHILIC ................................................................................................................................................................31 zwitterionos fázisok ................................................................................................................................................35 Elúció erősségi sorrend .......................................................................................................................................................61 visszatartás-víztartalom ...........................................................................................................................................61 Gradienselúció általános gradienselúció .........................................................................................................................................65 eredmény átvitele ....................................................................................................................................................70 gradiens ismételhetősége........................................................................................................................................80 gradiens lépcsők ......................................................................................................................................................77 gradiens linearitása...................................................................................................................................................80 gradiensprofil kiválasztása .......................................................................................................................................66 induló gradiens (A) .................................................................................................................................................65 késleltetési térfogat (dwell volume) .........................................................................................................................78 lineáris erősségű gradiens ......................................................................................................................................66 oldószer gradiens ......................................................................................................................................................65 szelepműködés ellenőrzése.....................................................................................................................................82 végső összetétel (B) ...................................................................................................................................................66 HILIC besorolása ...................................................................................................................................................................9 egyensúly beállása ....................................................................................................................................................21 elúciós erősségi sorrend .........................................................................................................................................43 eluens erősségi sorrend ..........................................................................................................................................40 fogalma .......................................................................................................................................................................7 használható állófázisok ...........................................................................................................................................11 kolonna tárolása ....................................................................................................................................................20 84

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC pH függés .................................................................................................................................................................19 pH kontroll ...............................................................................................................................................................20 polimer alapú álófázis pH tartomány ...................................................................................................................31 szelektivitási sorrend ..............................................................................................................................................43 szilikagél állófázis pH tartomány .........................................................................................................................21 szilikagél, polárisan módosított pH tartomány .......................................................................................................24 víztartalom a mozgófázisban ................................................................................................................................40 vizsgálható vegyületek ...........................................................................................................................................22 Zwitter-ion állófázis pH tartomány ......................................................................................................................31 HPLC elválasztás tervezése ..............................................................................................................................................12 ionizáció visszaszorítás ..........................................................................................................................................56 ionizáció, bázisos ....................................................................................................................................................47 ionizáció, pH függés .................................................................................................................................................45 ionizáció, savas .......................................................................................................................................................45 vegyületek besorolása .............................................................................................................................................22 HPLC kolonnák analitikai kolonnák anyaga, méretei ....................................................................................................................33 kolonnán kívüli zónaszélesedés ............................................................................................................................33 kritériumok a használatra ......................................................................................................................................10 mikro és nano kolonnák ..........................................................................................................................................32 Kölcsönhatások H-hidas .....................................................................................................................................................................17 hidrofób ....................................................................................................................................................................25 HILIC kölcsönhatás ...................................................................................................................................................7 ionos..........................................................................................................................................................................19 lgD gradienselúció ...........................................................................................................................................................59 kritikus párok ............................................................................................................................................................59 lgD-k .........................................................................................................................................................................46 lgD-pH .......................................................................................................................................................................46 lgP kritérium ...................................................................................................................................................................73 retenciós sorred.........................................................................................................................................................58 Mozgófázisok erőssége ....................................................................................................................................................................42

85

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC használható pufferek ..............................................................................................................................................49 kompatibilitása PEEK-al .........................................................................................................................................43 koncentrációja ..........................................................................................................................................................78 oldószerek.................................................................................................................................................................41 retenció változása ...................................................................................................................................................62 szelektivitsa ...............................................................................................................................................................43 vízhatás .....................................................................................................................................................................61 pH fogalma a HILIC-ben ................................................................................................................................................51 kiválasztása ..............................................................................................................................................................52 látszólagos ................................................................................................................................................................51 mérése .......................................................................................................................................................................52 optimálása ................................................................................................................................................................54 pH skála ....................................................................................................................................................................53 pKa bázisos ......................................................................................................................................................................47 savas ..........................................................................................................................................................................45 vizes ..........................................................................................................................................................................50 Puffer ..............................................................................................................................................................................48 készítése ....................................................................................................................................................................51 kompatibilitása ........................................................................................................................................................49 pufferkapacitás ........................................................................................................................................................48 szerves komponensekkel ........................................................................................................................................49 tisztasági követelmények .......................................................................................................................................49 RP-HPLC meghatározható vegyületek .....................................................................................................................................9 nem mérhető vegyületek ..........................................................................................................................................9 oldószererősség ........................................................................................................................................................66 visszatartás függése a szerves oldószer tartalomtól ...........................................................................................66 RP-IP-HPLC kiváltása HILIC-val ...................................................................................................................................................11 meghatározható vegyületek .....................................................................................................................................9 nem mérhető vegyületek ..........................................................................................................................................9 Szilikagél anion protonfelvétele ...............................................................................................................................................22 felületi tulajdonságok .............................................................................................................................................17

86

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC fémionok beépülése.................................................................................................................................................18 határfelület kialakulása ..........................................................................................................................................18 ioncserés kölcsönhatás ...........................................................................................................................................19 Vegyületek bázisos .......................................................................................................................................................................23 kis molekulatömegűek ............................................................................................................................................13 meghatározási kritériumok ....................................................................................................................................12 nagy molekulatömegűek .........................................................................................................................................12 savas ..........................................................................................................................................................................22 semleges....................................................................................................................................................................22 Visszatartási faktor függése állófázistól ................................................................................................................................................................57 lgD-től .......................................................................................................................................................................59 lgP-től........................................................................................................................................................................59 pH-tól ........................................................................................................................................................................47 víztartalomtól ................................................................................................................................................... 63, 66 Víztartalom határfelületi réteg ............................................................................................................................................. 18, 77 induló ........................................................................................................................................................................65 végső .........................................................................................................................................................................66 Víztartalom pH állófázisban ..............................................................................................................................................................23 mozgófázisban .........................................................................................................................................................53 Zwitterionos állófázisok kölcsönhatások ........................................................................................................................................................31 szerkezete .................................................................................................................................................................30 szerves polimer alapúak .........................................................................................................................................31 szilikagél alapúak ....................................................................................................................................................35

87

Merck HPLC állófázisok Megnevezés

Töltetcsalád jellemzõi

LiChrosorb®

Porózus, irreguláris, szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 5, 7, 10 μm szemcseméret.

LiChrospher®

Porózus, gömbszimmetrikus, szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 5, 10, 12 μm szemcseméret.

Superspher®

Porózus, gömbszimmetrikus, szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 4 μm szemcseméret.

Purospher®

Porózus, gömbszimmetrikus, nagytisztaságú (fémion-mentes) szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 5 μm szemcseméret.

Purospher STAR®

Porózus, gömbszimmetrikus, nagytisztaságú (fémion-mentes) szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok. 2, 3, 5 μm szemcseméret.

Aluspher®

Porózus, gömbszimmetrikus, alumínium-oxid alapú töltet. Apoláros fázisok. 5 μm szemcseméret

Chromolith®

Porózus, monolitikus, nagytisztaságú (fémion-mentes) szilikagél alapú töltet. Poláros és apoláros fázisok.

ZIC®-HILIC

Porózus, gömbszimmetrikus, szilikagél - vagy polimer alapú töltet. Ikerionos szerkezetû hidrofil állófázis. 3.5, 5 μm szemcseméret.

Merck Kft. · Magyarország Telefon: 463-8100 Fax: 463-8101

1113 Budapest, Bocskai út 134-146. E-mail: [email protected] [email protected]

www.merck-chemicals.hu

Felelõs kiadó: Merck Kft. · Magyarország 1113 Budapest, Bocskai út 134-146. Telefon: 463-8100 Fax: 463-8101 Honlap: www.merck-chemicals.hu E-mail: [email protected] [email protected]