Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem
Xilit előállítás Candida boidinii mikroorganizmus segítségével rázatott lombikban illetve fermentorban TDK dolgozat
Készítette: Illés Boglárka Bsc. Biomérnök hallgató Témavezető: Dr. Barta Zsolt egyetemi adjunktus Konzulens: Fehér Csaba doktoráns hallgató
Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék Budapest, 2014
1
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés...............................................................................................................................3 1.1. Célkitűzés...................................................................................................................... 3 2. Irodalmi áttekintés.................................................................................................................3 2.1. Xilit.............................................................................................................................3 2.2. Xilit alkalmazása, előnyös tulajdonságai....................................................................3 2.3. Xilit előállítás 2.3.1. Kémiai úton történő előállítás 2.3.2. Biológiai úton történő előállítás..........................................................................3 2.3.2.1. A biológiai úton történő előállítás biokémiai háttere 2.3.2.2. A Candida nemzetség, Candida boidinii 2.3.2.3. A biológiai úton történő előállítás környezeti paraméterei 2.4. Lignocellulóz alapú biomassza 2.4.1. Cellulóz 2.4.2. Hemicellulóz 2.4.3. Lignin 2.4.4. Inhibítorok 3. Anyagok és módszerek.........................................................................................................3 3.1. Alkalmazott mikroorganizmus törzs...........................................................................3 3.2. Agar készítés...............................................................................................................3 3.3. Inokulum készítés.......................................................................................................3 3.4. Hidrolízátum...............................................................................................................3 3.4.1. Hidrolízis 3.4.2. pH állítás, detoxikálás 3.4.3. Ammóniás kezelés 3.5. Sterilezés.....................................................................................................................3 3.6. Fermentáció.................................................................................................................3 3.6.1. Beoltás.................................................................................................................3 3.6.2. Aerob szakasz......................................................................................................3 3.6.3. Semi-aerob szakasz.............................................................................................3 3.6.4. Mintavétel............................................................................................................3 3.7. Analitikai módszerek..................................................................................................3 3.7.1. Optikai denzitás mérés........................................................................................3 3.7.2. HPLC analízis......................................................................................................3 3.7.3. Redukáló cukor mérése (RC)..............................................................................3 3.7.3.1. DNS oldat készítése 3.7.3.2. DNS oldat kalibrálása 4. Eredmények és kiértékelésük................................................................................................3 4.1. Fermentáció rázatott lombikban..................................................................................3 4.2. Fermentáció nagylaboratóriumi fermentorban modell oldattal...................................3 4.2.1. Első fermentáció modell oldattal 4.2.2. Második fermentáció modell oldattal 4.3. Fermentáció nagylaboratóriumi fermentorban hidrolizátummal................................3 4.3.1. Első fermentáció nagylaboratóriumi fermentorban 4.3.2. Második fermentáció nagylaboratóriumi fermentorban 4.4. Ecetsavmentesített hidrolizátumos fermentáció 5. Konklúzió..............................................................................................................................3 6. Irodalomjegyzék....................................................................................................................3
2
1. Bevezetés Napjainkban számos kutatás foglalkozik a xilit xilózból, mikrobiológiai úton történő előállításával. Ennek oka, hogy a xilit (vagy ismertebb nevén nyírfacukor) sok előnyös tulajdonsággal rendelkezik. Öt szénatomos cukor alkohol ((2S, 3R, 4R)-pentán-1,2,3,4,5pentaol). A szacharóznál 33%-kal kevesebb az energiatartalma. Mivel fogyasztásakor nincs savképződés, a fogakat is védi a fogszuvasodástól. Édesítő hatása a glükózéval majdnem azonos, így széles körben alkalmazzák az élelmiszer- illetve a cukrásziparban, mint édesítőszert. Egészségvédő hatását fluoridos fogkrémek összetevőjeként használják ki. Mivel lassabban emeli a vércukorszintet, a diabetikus szacharóz helyettesítésére is használják. A xilit ipari előállítása kémiai redukcióval történik – hemicellulóz hidrolizátumból származtatott D-xilóz redukciójával – mely egyáltalán nem veszélytelen módszer a magas hőmérséklet illetve a nagy nyomás miatt, ráadásul nagy tisztaságú xilózt igényel. Ezért került a xilóz mikroorganizmusokkal való előállítása a kutatók figyelmének középpontjába, mint gazdaságos és környezetbarát előállítási módszer. A fermentáció lefutását számos tényező befolyásolja: a hőmérséklet, az oldott oxigén szint, az inolukum életkora, a pH, a kevertetés sebessége. Általánosan megfigyelhető, hogy az élesztő törzsek hatékonyabb, termelékenyebb xilit-előállítók a gombáknál és a baktériumoknál. Az élesztők természetes úton, közti termékként állítanak elő xilitet. A dolgozatban található fermentációk során Candida boidinii élesztőtörzzsel dolgoztam, mely nem patogén, így biztonságosan használható az élelmiszeriparban fermentációs célokra. Manapság a (Magyarországon is) nagy mennyiségben keletkező kukorica és egyéb növényi rostokat nyersanyagforrásként kezdik el egyre több helyen használni. A kukoricarost szerkezeti felépítését tekintve lignocellulóz, melynek cellulóz és hemicellulóz tartalma kb 50%, szárazanyagra nézve. Az első kísérleti fermentációt rázatott lombikokban végeztem el. Ezután léptéknöveltem, és a további fermentációs kísérleteket fermentorban hajtottam végre. A kísérletek egyik részét xilóz oldattal (szintetikus), másik részét kukoricarost savas hidrolízisével előállított hidrolizátum segítségével végeztem el.
3
1.1. Célkitűzés A kísérletsorozatom folyamán hat fermentációt futtattam le. A első kísérletem rázatott lombikban történt. Három lombikban ecetsavas xilóz oldattal, másik háromban sima xilóz oldattal dolgoztam, tehát hat fermentáció futott párhuzamosa. Ezután léptéknöveltem és nagylaboratóriumi fermentorban fermentáltam. Két-két párhuzamos kísérlet történt, ecetsavas xilóz oldattal illetve savasan kezelt hidrolizátummal. Majd a legutolsó fermentációnál ecetsavmentesített, azaz a savas hidrolízisen kívül, ammóniásan kezelt hidrolizátumot használtam. Ezen kísérleteknél mértem főként az ecetsav, de más környezeti tényező inhibeáló hatásait. A dolgozatom célja, hogy az ecetsav inhibeáló hatását és annak mértékét kutatom a fermentált xilithozamra nézve.
4
2. Irodalmi áttekintés 2.1 Xilit A xilit egy öt szénatomos cukor alkohol ((2S, 3R, 4R)-pentán-1,2,3,4,5-pentaol). A xilit lánca nyílt szerkezetű, egy-egy OH csoport kapcsolódik minden szén atomjához. Mivel nem tartalmaz királis szén atomokat, nevét L vagy D prefixum nélkül használjuk. A molekula tehát szimmetrikus. [1],[2] Elemi állapotban fehér színű, kristályos anyag. Jól oldódik vízben, nincs kellemetlen mellékíze. Negatív oldáshője miatt fogyasztás során hűsítő érzést ad. A xilit megtalálható gyümölcsökben és zöldségekben például szilvában, földieperben, salátában, karfiolban valamint különböző gabonanövényekben például kukorica héjban, rizsben, zabban, cukornád bagaszban, búza szárban, cirokban, árpában illetve nagy mennyiségben nyírfában is. [3] Előállítása xilózból történik.
1. ábra A xilit [4]
2.2 A xilit előnyös tulajdonságai és alkalmazása A xilitet széles körben cukorhelyettesítőként alkalmazzák az élelmiszer- illetve a cukrásziparban. Édesítő értéke a szacharózéhoz hasonló, azonban 33%-kal kevesebb az energiatartalma (4 kcal/g helyett 2,4 kcal/g). Szerkezetét tekintve a polialkoholokhoz sorolható, mint számos más diétás édesítőszer (mannit, szorbit). [5] A xilit lebontása inzulin független útvonalon megy végbe a szervezetben, így a cukorbetegek és más emésztési rendellenességgel élők is fogyaszthatják. [6] Felszívódásának helye a máj és a bélrendszer. A
5
lebontásából származó glükózt a máj glikogénként tárolja, majd fokozatosan hasznosítja, így a vér glükóz koncentrációja nem emelkedik meg ugrásszerűen. [7] További fontos tulajdonsága, hogy véd a fogszuvasodástól. A fogszuvasodást a Streptococcus nemzetség tagjai okozzák. Ezen törzsek nem képesek a xilit hasznosítására, így a xilitfogyasztás csökkenti a számukat a szájüregben, ez pedig könnyebben eltávolítható lepedéket eredményez. [8] Fogyasztása gátolja a savképződést és a pH csökkenését. [9] Ezen előnyös hatásai miatt számos fogápolási termék tartalmaz xilitet például: rágógumi, fogkrém, szájvíz, fogselyem.
2. ábra Xilit tartalmú rágógumi [10]
A xilit segít megelőzni más betegségek kialakulását is. Xilit alkalmazása mellett a középfülgyulladást okozó baktériumok a Streptococcus pneumoniae, a Haemophilius influenzae és más irritáló anyagok kevesebb eséllyel képesek a fertőzött felületen (az orr és a torok hámsejtjein) megtapadni, és így nem tudnak szaporodni sem. Vizsgálatok arra is rámutattak, hogy ha gyermeknek rágógumi vagy szirup formájában adnak xilitet, a középfülgyulladás és az orr-garati Pneumococcus-hordozás aránya csökkent. A xilit a fül-, homlok- és arcüreggyulladás kialakulásáért felelős baktériumok megtelepedését is képes megakadályozni. [11]
6
3. ábra Baktériumok megtapadása az orrban [11]
Az előzőekben látott számos előnyös tulajdonsága és felhasználási módja miatt került a xilit a kutatók figyelmének középpontjába. Az utóbbi néhány évtizedben a jobb hozam és a fenntartható
termelés
elérése
érdekében
nagy
hangsúlyt
fektetnek
a
megújuló
energiaforrásokból fermentációs úton mikroorganizmus törzsekkel történő előállítási módok kutatására, fejlesztésére. [12] 2.3 Xilit előállítás 2.3.1. Kémiai úton történő előállítás A kémiai úton történő előállításhoz nagy tisztaságú D-xilóz oldatra van szükség. A D-xilóz kinyerése lignocellulóz alapú anyagok hemicellulóz frakciójából történik kémiai, fizikai vagy fiziko-kémiai előkezeléssel majd savas hidrolízissel. A D-xilózt ezután el kell választani és ki kell nyerni a hidrolizátumban felszabadult egyéb cukroktól, sóktól, aromás vegyületektől. [13] Ezek után a xilit ipari előállítása a xilóz katalitikus hidrogénezésével történik Raney-Nikkel katalizátor jelenlétében. [14] A reakció magas hőmérsékleten (80 °C – 140 °C) és nagy nyomáson (50atm) zajlik 30 percig. [15] Majd a kapott vegyület sűrítése, tisztítása után kristályosítással állítják elő a tiszta xilitet. A kémiai előállításnak számos hátránya van: sok tisztítási lépést igényel az eljárás folyamán, mely költségessé teszi, nagy az energiaigénye, nagy mennyiségű hulladékot termel, ezáltal nem kifejezetten környezetbarát. Az 1970-es években dolgozták ki ezen ipari léptékű eljárást és a mai napig ez az alapja a xilit előállításnak. Az elérhető maximális hozam a kiindulási anyag xilóz tartalmára nézve maximum 50-60%.
7
2.3.1. Biológiai úton történő előállítás Létezik egy alternatív előállítási módja a xilitnek. A fermentációs úton, mikroorganizmus törzsekkel történő előállítás. Az alapanyag itt is a lignocellulózok hidrolízise által kapható xilóz oldat, de ellentétben az ipari eljárással, a kiindulási oldatnak nem kell nagy tisztaságúnak lennie. Így a tisztítási költségek csökkenek. A módszer további előnyös tulajdonsága, hogy a reakció enyhébb körülmények között játszódik le és viszonylag egyszerű eljárás. Mivel a lignocellulóz különböző növényi hulladékokban (mezőgazdasági, erdőgazdasági) megtalálható, a biológiai előállítás lehetővé teszi az újrahasznosításukat, ezáltal környezetbarátabb. [16] Számos fonalas gomba és baktérium képes xilitet előállítani, azonban a legmagasabb hozamot az élesztőtörzsek alkalmazásával lehet elérni (Candida, Pichia, Hansenula). [17] 2.3.2.1. A biológiai úton történő előállítás biokémiai háttere A xilóz xilitté történő redukálására az élesztő törzsek a legalkalmasabbak. Az élesztők a Dxilóz metabolizmusa során köztitermékként állítják elő a xilitet. A D-xilóz lebontásához három enzim szükséges: a xilóz-reduktáz (XR), a xilit-dehidrogenáz (XDH) és a xilulokináz (XK). A XR egy tipikusan NADPH-függő enzim (néhány esetben NADH-t igényel), míg a XDH NAD+-t igényel (egyes esetekben NAD-ot). A legtöbb élesztő törzsnél a D-xilóz Dxilulózzá való lebontása két lépésben történik, a redukciós lépést egy oxidációs lépés követi. A D-xilóz először redukálódik D-xilitté NADPH-függő XR-zal. Az ebből a lépésből keletkezett D-xilit vagy tovább oxidálódik D-xilulózzá NAD+-függő XDH-zal vagy kiürül az extracelluláris térbe. A fermentáció sebességének meghatározó lépései tehát az ezen két enzim által katalizált reakciók. Néhány élesztő törzs képes a D-xilulózt xilulóz-5-foszfáttá alakítani a xilulokináz enzim segítségével. A xilulóz-5-foszfát ezek után be tud lépni a pentózfoszfát ciklusba, melyben a NADPH regenerálódik. [18],[19] A NAD+ koenzim a mitokondriális légzési láncból származik. Ha a termelés semi-aerob körülmények között történik, a NAD+ regeneráció csökken, így a második, oxidációs lépés az XDH inaktiválódása miatt nem tud lejátszódni, ez pedig xilit felhalmozódáshoz vezet. Abban az esetben, ha nagyobb a levegőáram, nagyobb XDH aktivitáshoz vezet, így a xilulóz halmozódik fel a folyamat során. [20] A redoxipotenciál kiegyensúlyozatlansága a NADPHfüggő XR és a NAD+-függő XDH enzimek között az oka a xilit felgyülemlésének. [14] 8
4. ábra A xilóz metabolizmus enzimei [21]
2.3.2.2 A Candida nemzetség, Candida boidinii Általánosan megfigyelhető, hogy az élesztő törzsek hatékonyabb, termelékenyebb xilitelőállítók a gombáknál és a baktériumoknál. A korábbi években a xilit előállítással kapcsolatos kísérleteket génmódosított Saccharomyces cerevisiae-vel végezték. További kísérleteket végeztek számtalan más mikroorganizmussal is, például: Candida tropicalis, Pichia pastoris, Pichia Stipitis, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum. A Candida nemzetség tagjai a fermentáció környezeti paramétereinek optimalizálásához végzett kísérletek során kerültek előtérbe. [14] A Candida törzsek általi biológiai előállítások hozama általában 0,4-0,7 g termék/g szénforrás közötti érték. A Candida nemzetséghez tartozó törzsek ezen adat illetve az 1. táblázat adatai alapján a legmegfelelőbbek további fermentációs vizsgálatok elvégzéséhez, ipari léptékű termelési rendszer kidolgozásához. [22]
9
1. táblázat Mikroorganizmusok xilit hozamai [22]
A Candida nemzetség az élesztőgombák közé tartozik. Néhány fajuk szimbiózisban él a gazdaszervezettel, például az emberi bélflóra alkotói és a bőrön is megtalálhatóak. Vannak patogének
is
közöttük
(Candida
albicans),
azonban
legtöbb
fajuk
nem
okoz
megbetegedéseket. Laboratóriumi tenyészetekben szobahőmérsékleten a Candida nagy kerek fehér vagy krémes telepekben nő agar táptalajon, jellegzetes élesztő szaggal. [23] A Candida boidinii egy eukarióta sejt, fakultatív metilotróf élesztő, mely képes a metanol metabolizálására is. [23] A C. boidinii sejtműködése különleges, mert ellentétben más xilitelőállító élesztővel, oxigén limitált környezetben a sejt NADH/NADPH aránya nagyobb mint 1. Számos kísérlet elvégzése után bizonyították, hogy a xilitelőállítás két metabolikus útvonalon mehet végbe a Candida boidinniben. Az egyik során a D-xilóz közvetlenül redukálódik xilitté, a másik útvonalon a D-xilóz kezdetben izomerizálódik a D-xilóz izomeráz által xilulózzá, majd később xilitté redukálódik. Az XR enzime képes a NADPH és a NADH kofaktorként való felhasználására is. Az előzőekben láthattuk, hogy NADPH regenerációja tekinthető a szűk keresztmetszetnek a xilit előállításakor, azonban itt a kettős függésű XR ezt képes orvosolni. [24] A törzs további előnyös tulajdonsága, hogy nem patogén, így
10
biztonságosan használható az élelmiszeriparban fermentációs célokra. Fenti tulajdonságai mellett természetes xilóz fogyasztó, ezért sok xilitfermentációs kísérletet végeznek vele.
5 .ábra A Candida boidinii
2.3.2.3. A biológiai úton történő előállítás környezeti paraméterei A biológiai úton történő előállítást, a fermentációt számos környezeti paraméter befolyásolja. Ezek a közül a legfontosabbakat tényezőket és a gyakorolt hatásaikat fogom bemutatni: inokulum kora, adptáció, kiindulási sejtkoncentráció, pH, hőmérséklet, xilóz kezdeti koncentrációja, levegőztetés. Az inokulum életkora Az inokulum életkora nagyban befolyásolja a metabolikus aktivitást és a sejtek életképességét, ezért hatással van mind a produktivitásra, mind a hozamra. Felipe és munkatársai 48 órás C. guilliermondii inokulummal végezett kísérlete 36%-kal alacsonyabb produktivitást eredményezett, mint a 24 órás inokulummal végzett, holott ugyanazt a mikroorganizmust használták mindkét alkalommal. [25] Pfeifer és munkatársai szintén C: guillermondii-val végeztek kísérleteket, melyek során arra jutottak, hogy az ideális inokulálási idő 15-24 óra. Az ennél fiatalabb tenyészet negatív hatással van a fermentáció alatti szaporodásra, míg az idősebb tenyészet esetében kisebb a produktivitás, alacsonyabb a hozam. [26] Adaptáció Sene és munkatársai rendkívüli emelkedést értek el mind a xilit hozamra mind a térfogati produktivitásra nézve, azáltal hogy négy alkalommal újrahasználták a élesztősejteket.[27] Ezzel azt próbálták bizonyítani, hogy a jobban adaptálódott sejtek képesek nagyobb hozamot elérni. Azonban Cunha és munkatársai nem találtak számottevő különbséget amikor immobilizált sejteket használtak fel újra polivinil-alkohol-gélben. [28] 11
Kiindulási sejtkoncentráció Számos tanulmány rávilágított arra, hogy a xilit térfogati produktivitása lineárisan növekszik a kezdeti biomassza szinttel egy viszonylag széles tartományban. Különösen a D. hansenii és a C. parapsilosis törzsekkel végzett kísérletekben észlelték azt a viselkedést (Parajó, Sampaio), hogy a xilit koncentráció 0,042-32,4 és 8-30 g/l között tartományokban változott, míg a specifikus produktivitás közel állandó volt, vagy alig csökkent. [29] Ezt számos kutató az inhibítorok toxikus hatásainak tudta be. Másrészről viszont Domínguez és Felipe társaikkal [25] szintén ugyanezen törzsekkel dolgoztak és csak a maximális sejtkoncentrációnál figyeltek meg térfogati produktivitás emelkedést. Az általam használt C. boidinii-re a viszonylag nagy, 5,1 g/L-es sejtkoncentráció eredményezi a legnagyobb hozamot a szakirodalom szerint. [30] pH A fermentáció pH optimuma erősen függ a xilittermelő törzstől. [31] A fermentlé pH-ja az ecetsav miatt alacsony lehet. Ecetsav a hemicellulóz hidrolizátumból származhat, de a xilittermelés során is keletkezhet. C. tropicalis élesztő esetében vizsgálták az ecetsav hatását, melynek az optimális pH-ja 4,5-6,0 közé esik. A kísérletek arra mutattak rá, hogy az ecetsav hatásának csökkentése pozitív hatással van a xilóz felvételére továbbá a xilittermelésre illetve a biomassza mennyiségének növelésére. A termelékenység a duplájára nőtt, a xilit hozam 0,42 g/g-ról, 0,71 g/g-ra nőtt. [32] Hőmérséklet Az élesztők 24-45°C között képesek xilitet termelni, de az optimális hőmérséklet általában 28 és 30°C közé esik. Az optimális hőmérséklet - mint sok más környezeti paraméter élesztőtörzs-függő. 28°C a C. guillermondii-nál, 28-35°C a D. hansenii-nél és 30°C a P. tannophilusnál. [33] A C. guillermondii esetében 30-35°C között nem tapasztaltak változást a hozamokban, 40°C fölött, azonban jelentősen lecsökkent. A Pachysolen tanophilus optimuma 30°C, amikor 37°C-ra növelték a hőmérsékletet a xilittermelés teljesen leállt. Ezek a kísérletek bizonyítják, hogy ha a fermentáció kivitelezése az optimálistól eltérő hőmérsékleten történik, a XDH enzim aktivitása lecsökken, ezért a xilithozam és a produktivitás is visszaesik. [16] Magas hőmérséklet alkalmazása esetén tehát károsodhatnak a D-xilóz
12
metabolizmusáért felelős enzimek. Ennek kiküszöbölésére használhatunk hőtoleráns élesztőtörzseket. Kiindulási xilóz koncentráció A kiindulási D-xilóz koncentrációnak nagy hatása van a xilittermelésre élesztőknél. A xilit hozam meglehetősen alacsony, amikor a kiindulási oldat alacsony xilóz koncentrációjú. Ennek oka, hogy a szénforrás nagy része biomassza képződésre fordítódik és minimális termékképződés figyelhető csak meg. Azonban a D-xilóz koncentráció növelésével, csökken a fajlagos növekedési sebesség és a szubsztrát nagy százaléka termékképződésre fordítódik, ezáltal nő a xilit hozam. Kim és Walther munkatársaikkal [34] számos esetben demonstrálták az élesztők ezen tulajdonságát (pl. C. parapsilosis, C. tropicalis törzsekkel). Túl nagy D-xilóz kiindulási koncentrációt használva, a többlet szubsztrát az XR enzim inhibícióját okozza és nagy ozmotikus nyomást eredményez a tápoldatban, mely a nem ozmofil törzseket gátolhatja. A vizsgálatok szerint, a C. boidinii számára a kedvező D-xilóz kiindulási koncentráció 100150 g/L. [30] Egyéb C-források A D-xilózon kívül más cukrok is előfordulhatnak a fermentlében, attól függően, hogy a hemicellulóz hidrolizátum milyen tisztítási lépéseken esett át. Természetesen ezen cukrok (glükóz, D-mannóz, L-arabinóz, D-galaktóz) koncentrációjuktól függően befolyásolhatják, serkenthetik vagy gátolhatják a xilóz xilitté történő átalakítását. A glükóz általában nagy mennyiségben van jelen a hidrolizátumban, azonban mivel a Dxilóznál könnyebben felvehető és metabolizálható szubsztrát, az élesztők anaerob körülmények között etanol előállítására használják fel. Ennek elkerülésére Preziosi-Belloy és munkatársai [35] olyan módszert dolgoztak ki melyben a fermentáció első felét aerob körülmények között végezték. Így az élesztők sejttömeg növelésre használták fel rövid idő alatt a glükózt, nem keletkezett etanol. A második szakaszban a D-xilóz az elsődleges szénforrás. Szemi-aerob körülmények létrehozásához csökkenteni kell a levegőztetés sebességét, így növelhető a xilóz-xilit konverzió. Más hexózok mint, a galaktóz és a mannóz, csakúgy mint az etanol, fékező hatást fejtenek ki a xilittermelésre. A mannóz, bár kisebb mennyiségben van jelen, hasonló hatást fejt ki, mint a glükóz. A D-mannóz először mannóz-6-foszfáttá majd fruktóz-6-foszfáttá alakul, a Dgalaktóz pedig négy lépésben alakul át glükóz-6-foszfáttá. Ezek a vegyületek a glikolízis intermedierjei. 13
Az L-arabinóz gátlolja az XDH enzim aktivitását, ezért nagy arabinóz koncentrációnál nőtt az etanol koncentráció és csökkent a xilit termelés hozama. Az arabinóz xilulóz-5-foszfáttá alakul és a pentóz-foszfát körbe kapcsolódik be. [35] Általában más pentózok és a glicerin nem inhibeáló hatásúak. [35] N-forrás és vitaminok A nitrogén forrás típusa és a nitrogén koncentrációja kulcsfontosságú a xilittermelés során, de természetesen itt sem mindegy milyen élesztőtörzsről van szó. Általában szerves nitrogénforrások – mint például a karbamid, élesztő kivonat, rizsszem, pepton stb – alkalmazásával nagyobb produktivitást és xilit hozamot lehet elérni, összehasonlítva a szervetlen nitrogénforrásokkal. Ennek oka, hogy a szerves nitrogén számos élesztőben (C. boidinii, C. guillermondii, C. mogii) stimulálja a pentóz-foszfát útvonal oxidatív lépését. [30] Számos élesztő – mint például a C. guilliermondii és a P. tannophilus – vitaminokat igényel: biotint, aszkorbinsavat, piridoxint, kolint. [36] Vitaminok hozzáadására általában nincs szükség, ezt az igényt az élesztő extraktum bevitele kielégíti. Más tápanyagok is rendelkeznek hasonló tulajdonsággal, a Mg2+ ion jelenléte növeli a xilitkitermelés hozamát. [37] Levegőztetés Az oldott oxigén koncentrációja, a levegőztetés az egyik legfontosabb környezeti paraméter melyet figyelembe kell venni xilit fermentáció során. Nem csak műveleti szempontból lényeges, de az élesztősejt fiziológiájára is nagy hatással bír. Számos alkalommal vizsgálták a hatását mind a szintetikus közegre, mind a hemicellulóz hidrolizátumra, azonban a különböző vizsgálati módszerek és eszközök miatt, ezen eredmények sajnos gyakran nem összehasonlíthatóak. Az előzőekben láthattuk, hogy az oxigén koncentráció nagy hatást gyakorol a xilit előállításért felelős enzimekre. Ha NADPH-függő XR enzimmel rendelkező élesztőt használunk (pl. D. hansenii) az oldott oxigén koncentrációt alacsony szinten kell tartani, hogy elkerüljük a xilit légzésre történő felhasználását. Az optimális oxigén koncentráció értéke élesztőknél általában a szemi-aerob körülményeknek felel meg. A NAD+ regenerációja szükséges a kívánt ATP és NADPH megtermeléséhez, ezáltal a sejtnövekedés és az XR enzim aktivitásának fenntartásához. [20] Aerob levegőztetési viszonyok mellett a szénforrás nagy része biomassza képzésre fordítódna. A különböző élesztőtörzsek oxigén igénye eltérő lehet, ez az igény a fermentáció során változhat illetve más paraméterek is hatással lehetnek rá. [38]
14
2.4. Lignocellulóz alapú biomassza Mivel a dolgozatom keretein belül biomassza hasznosítással is foglalkoztam, bemutatom a növényi biomassza főbb összetevőit. A növényi biomassza legnagyobb része lignocellulóz. Bolygónk egyik legnagyobb mennyiségben előforduló nyersanyaga, melynek előnye, hogy évente akár többször is megújul. A lignocellulóz a növényi sejtfal egyik építőeleme. Hemicellulózból, cellulózból és ligninből álló összetett szerkezettel rendelkezik. Egyéb anyagokat (fehérje, lipid, ásványi sók) is tartalmazhat, pontos összetétele függ a növény fajtájától illetve hogy az adott sejtfal milyen növényi részt épít fel. [39]
6 . ábra A lignocellulóz stuktúrája
15
2.4.1 Cellulóz A cellulóz egy poliszacharid, mely ß-D-glükóz egységekből felépülő lineáris homopolimer, a glükóz molekulák ß-1,4-es kötésekkel kapcsolódnak össze. A glükóz molekulák az energetikailag legkedvezőbb szék konformációban kapcsolódnak össze, 180°-kal elforgatva egymástól. Mivel a növényi sejtek másodlagos sejtfalában a legnagyobb arányban fordul elő, a cellulóz a legelterjedtebb szerves polimernek tekinthető. Egy-egy cellulózlánc 2000-15000 glükóz egységből épül fel, a molekulák száma a növény fajtájától függően változik. A szálak összekapcsolódását a glükóz molekulákon található hidroxilcsoportok és oxigén atomok között kialakuló H-hidak biztosítják, melyek a szálakon belül és a szomszédos szálakkal is létrejönnek. A cellulózrostok mikrofibrillumokat alkotnak, melyekben a kristályos és a kevésbé rendezett amorf részek váltakoznak. Szerkezete, rendezettsége miatt rendkívül stabil. Enzimes és vegyszer (híg sav és lúg) kezelésnek részben ellenáll, vízoldhatatlan. [39]
7 . ábra A cellulóz molekulájának egy részlete
2.4.2. Hemicellulóz A hemicellulóz a biomassza 20-25 %-át teszi ki, ezért a második legelterjedtebb polimer. Elágazó szerkezetű heteropolimer, melyet pentózok (xilóz, arabinóz) és hexózok (glükóz, mannóz, galaktóz) építenek fel. Tartalmaz még különböző savakat, például ferulsavat, ecetsavat, glükuronsavat. Az elágazások miatt a szerkezet kevésbé ellenálló enzimes és vegyszer kezelésekkel szemben. A hemicellulóz láncokat egy vagy két cukorkomponens építi fel, ezek a xilánok, mannánok, glükoxilánok, galaktomannánok, ß-glükánok, arabinoxilánok
16
stb. Egy-egy polimerlánc hossza 100-200 monomer egységből áll. Főként az elsődleges sejtfalban található meg. A fa szárazanyagtartalmának 15-20%-át teszi ki. A hemicellulóz a cellulózzal H-kötéssel és van der Waal’s kötéssel kapcsolódik. [39]
8 . ábra A hemicellulóz
2.4.3. Lignin A lignin egy három dimenzós, aromás szerkezetű makromolekula. Fenil-propán váz alkotja, felépítésében három fahéj-alkohol származék vesz részt: p-kumáralkohol, koniferilalkohol, szinapilalkohol. Szilárd, rendkívül ellenálló, ez biztosítja a lignocellulózok ellenállóságát is. Körbeveszi és az enzimes bontástól óvja a cellulóz és hemicellulóz rostokat. A fa szárazanyagtartalmának 20-25%-át teszi ki. Hidrofób molekula. Szerves oldószerekkel oldatba vihető. [39]
17
9 . ábra A lignin
2.4.4. Inhibítorok A kukoricarostból készített hidrolizátumban az alábbi inhibítorok találhatók meg: hemicellulóz származékok, cellulóz származékok és lignin származékok. A hemicellulóz származékok a gyenge: az ecetsav és a hangyasav. Az ecetsav a hidrolízis mellékterméke lehet, míg a hangyasav bomlás során képződik. Az inhibíció mechanizmusa úgy történik, hogy a sejten belül és azon kívül koncentrációkülönbség lép fel. Emiatt az ecetsav és a hangyasav molekulák disszociálatlan állapotban jutnak be a sejte, ahol már disszociálnak protonra és anionra. A protont a sejt kipumpálja, ami energiaigényes, mivel a sejten kívül nagyobb a proton koncentráció, ezért ehhez ATP-t használ fel. A sejten belül maradt anion a foszfát transzportban okoz problémát, így gátolja az ATP szintézist, ami a sejt szaporodását nehezíti. A cellulózból származó inhibitorok között a legjelentősebb az 5-HMF (5-hidroximetil-furfurol), ami cukrok dehidratációja során keletkezik. Az 5-HMF erősen gátolja a fehérjék és RNS-ek szintézisét, ezzel okozva problémát a biotechnológiai eljárásokban. A ligninből származó inhibitorok közé a fenolos komponensek tartoznak, pl. a vanilin. Ezek a cukor specifikus transzportfehérjéket teszik tönkre. [40]
18
3. Anyagok és módszerek Az alábbiakban részletezett rázatott lombikos illetve nagylaboratóriumi fermentoros fermentációs kísérleteket a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszékén végeztem el.
3.1 Alkalmazott mikroorganizmus törzs Kísérleteim során minden esetben Canadida biodinii törzzsel dolgoztam, ez egy eukarióta sejt, mely fekultatívan metilotróf így képes metanolt metabolizálni. Előnye, hogy nem patogén, az élelmiszeriparban biztonsággal alakalmazható. 3.2 Agar készítése Az első lépés a kísérlet során a négy párhuzamos inokulumhoz szükséges mennyiségű Candida boidinii élesztőgomba kitenyésztése. Az ehhez szükséges agart saját magam készítettem el. Az átoltást végig steril körülmények között végeztem, a felszaporítás 2-3 napig tartott. Általában szobahőmérsékleten szaporítottam, de ha szükséges volt a gyors felszaporodás érdekében az első nap 300C-on hagytam az átoltott sejteket.
Hozzávalók: 1
%
glükóz
1
%
pepton
0,3
%
élesztő
1
%
agar
Egy Erlenmeyer lombikba belemértem a 200 ml vízhez kimért hozzávalókat, majd hozzáadtam 200 ml csapvizet. Az elegyet egy Bunsen-égő fölött lévő vízzel teli edénybe helyeztem 50 percre. Az edény alját előre kibéleltem vattával a jobb fixálás végett. Forrás közben az oldatot pár percenként üvegbottal megkevertem. Az 50 perc letelte után üvegpipettával kimértem kémcsövekbe 10-10 ml térfogatokat, majd a kémcsöveket ezután autoklávban sterileztem 120°C-on 1 órán keresztül. Sterilezés után a kémcsöveket lezárva, szobahőmérsékleten egy napig hagytam megszilárdulni. 19
3.3 Inokulum készítése Négy párhuzamos inokulumot készítettem minden fermentáció kezdetekor, így a befertőződést és az esetleges bemérési hibákat el tudtam kerülni. Az inokulumhoz az elkészített agarokra frissen, sterilfülke alatt átoltott és felszaporított 1-2 napos C. boidinii-t használtam. Egy csavaros folyadéküvegben tápsó oldatot készítettem, ehhez szénforrásként glükózt használtam, melyet ásványi anyagokkal egészítettem ki. A tápsóhoz 350 ml vízben az alábbiakat oldottam egy folyadéküvegben: 10,5 g
KH2PO4
0,7
g
MgSO4*7H2O
2,1
g
(NH4)2HPO4
7
g
élesztő extraktum
Ezután négy Erlenmeyer lombikba a következőket mértem be: 75 ml
desztillált víz
4,5 g
xilóz
A xilóz oldatokat tartalmazó lombikokat vattadugóval és papírral lezárva, illetve a tápsót kupakkal lezárva autoklávba helyeztem és sterileztem 1200C-on 20 percen keresztül a később szükséges eszközökkel együtt. A magas hőfokon az oldott anyagok reagálnak egymással, ezért ezeket minden esetben csak később, a sterilfülke alatt öntöttem össze. A sterilezés után megvártam, míg kb. 30°C-ra visszahűltek az oldatok vagy hideg csapvizes hűtéssel hűtöttem le. A sterilfülkét alkohollal tisztítottam és UV lámpa segítségével csírátlanítottam a munka megkezdése előtt, hogy elkerüljem a befertőződést. A sterilfülke alatt mind a négy xilóz oldathoz 75-75 ml tápsóoldatot mértem be. A sejteket tartalmazó ferde agaros kémcsőbe kb 34 ml-t pipettáztam a kapott oldatból, majd egy Henle kaccsal felszuszpendáltam a sejttömeget, egy kicsit megkavartam, majd egy hirtelen mozdulattal visszaöntöttem az Erlenmeyerlomikokba. A lombikokat ezt követően 2-3 napig 30°C-os hőmérsékleten rázattam.
20
3.4 Hidrolizátum 3.4.1. Hidrolízis A kukoricarost, melyet a hidrolizátum elkészítéséhez használtam, a Hungrana Kft-től származik. A kukoricarost a kukorica-keményítő kinyerésekor keletkező feldolgozóipari hulladék. Az áztatott és csírátlanított szemeket apróra őrlik majd a rostot szita segítségével választják el a keményítőtől, majd szárítják. Takarmányként használható, jól tárolható anyag. A
hidrolizátum
elkészítéséhez
először
meg
kellett
határoznom
a
kukoricarost
szárazanyagtartalmát. Ezt egy PRECISIA XM-60 típusú szárazanyagmérésre alkalmas műszer segítségével végeztem. A mérési pontatlanság kiküszöbölésére több helyről vettem mintát a rosttároló dobozból és három párhuzamos mérésből állapítottam meg a kukoricarost végső szárazanyagtartalmát. A hidrolizátumhoz 89% desztillált vízben 1% kénsavat kevertem el, majd ezt elegyítettem a 10% szárazanyagtartalommal. A kapott oldatot 9 db 1 literes folyadéküvegbe öntöttem szét, majd 1 órán keresztül autoklávoztam 120 °C-on. Ezután vízsugár szivattyú segítségével szűrtem a klávozott rostot az oldatból. Az első szűréshez Büchner tölcsért, szívópalackot és vászon szűrőt használtam, de a további szűréseknél papírszűrőre váltottam. További szűrésre azért volt szükség, hogy minél tisztább, rostmentes oldatot kapjak. 3.4.2. pH állítás, detoxikálás Az első pH állítást közvetlenül az első szűrés után végeztem el: a kezeletlen oldat pH-ja 0,5-1 között változott, Ca(OH)2-dal 7,5-ös pH értéket állítottam be. A pH mérésére üvegelektródot alkalmaztam, a Ca(OH)2 oldódását mágneses keverővel segítettem. A kivált Ca-szulfátot egy Universal 32 Hettich 1605 típusú centrifugakészülékkel ülepítettem. A felülúszót cc. HCl-val 5,5-es pH-júra állítottam be. Amikor szükséges volt ezután dekantáltam az oldatot, majd ismét autoklávoztam 10 percig 120°C-on. (Ha szükséges volt, később sterilfülke alatt újra dekantáltam a hidrolizátumot.) A tisztítás után kb 5,5 liternyi hidrolizátumhoz jutottam.
21
3.4.3. Ammóniás kezelés Az utolsó fermentációt kukoricarost hirdolizátummal végeztem el, azonban a savas hidrolízist megelőzően a rostot ammóniásan is kezeltem. Az ammóniás kezelésre az ecetsav-mentesítés miatt volt szükség. A kukoricarost szárazanyagtartalmát megmértem a már fentebb említett géppel, majd 5%-os NH3 és 10%-os szárazanyagtartalmú oldatot készítettem belőle desztillált vízzel. Az oldatot 9 db csavaros üvegben 1 órán keresztül 120 °C-on autoklávoztam. Ezután mikor az oldatok szobahőmérsékletűre hűltek, vízsugárszivattyú segítségével szűrtem, majd alaposan átmostam a kezelt rostot, hogy ammóniamentes legyen. A 40 °C-os szárítószekrényben szárítottam kb egy héten keresztül. A savas hidrolízist később a kiszárított rostokkal végeztem el. A savas kezelés a korábbiakban leírt módon zajlott. 3.5. Sterilezés A fermentáció előkészítését a befertőzés elkerülése végett mindig egy sterilezési szakasz zárta. A modell oldattal végzett fermentációnál az ecetsavas xilóz oldattal (melyhez tápsót adtunk) sterileztem a fermentort. A kukoricarost hidrolizátumos fermentációnál a fermentor sterilezése csapvízzel történt. A xilóz oldatot és a tápsót külön-külön sterileztem, a korábban leírt elreagálási probléma miatt. A tápsót autoklávban sterileztem 20 percig 120 °C-on. A xilóz oldatot a mintavevő- és leeresztőcsonkok elzárása után bemértem a fermentorba. Amennyiben szükséges volt, még ez előtt bekalibráltam a pH és pO2 elektródokat. A pH elektródnál a 7-es majd a 4-es pH értékű standardoknál a berendezés kezelőpaneljének segítségével rögzítettem az feszültség értékeket, majd a beépített szoftver kikalkulálta a kalibrációs egyenest. A pO2 elektród kalibrálásához előbb CoCl2*6H2O és Na2SO3 sókból készített oldatban felvettem a nullpontot, majd később a sterilezési szakaszt követően folyamatos levegőztetés és kevertetés mellett (400rpm; 2VVM) már a tartályba helyezett állapotban felvettem a maximális oxigén telítettséghez tartozó feszültségértéket. A kalibrációs egyenest szintén a szoftver kalkulálta ki. A fermentortetőt felhelyeztem, a szigetelő O gyűrűvel együtt. Elhelyeztem a szükséges berendezéseket a fermentortetőn: nyomásmérő, biztonsági levegőszelep, ki- és bemenő levegőszűrő, bemenő levegőelosztó (ezt sterilezési állásba állítottuk), illetve a szükséges vakdugók. Ezt követően a levegő- és vízcsapokat megnyitottam, a köpenyteret
22
levegőmentesítettem, a köpenytér nyomását 0,6 bar túlnyomásra állítottam és ellenőriztem a hűtővíz szelep működését. Majd elindítottam a kezelőpanel segítségével a sterilezést és ehhez a szükséges adatgyűjtést a számítógépen. Itt jellemzően csak a köpenytér hőmérsékletét és a tartály nyomás és hőmérsékleti értékeit követtem nyomon az esetleges hibák rögzítésének érdekében. Folyamat kb 2 órán keresztül tartott, amely tartalmazta a felmelegítési szakaszt, majd a 120 °C-on történő 20 perces sterilezést és az oldat visszahűtését. Ez idő alatt a tápsó oldatot, az üres beoltólombikkal és a háromágú sav-bázis-habzásgátló bemeneti csonkkal együtt autoklávoztam 20 percig a 120 °C-on. Majd ha az OD értékek alapján megfelelő koncentrációjúak voltak a felszaporított inokulumok, steril fülke alatt összeöntöttem ezeket a beoltólombikban. 3.6. Fermentáció 3.6.1. Beoltás A sterilezési szakasz után a fermentort 30 °C-ra szabályoztam. A fermentációs szakasz első lépése a beoltás volt. Ez úgy zajlott, hogy a fermentor oltómembránját az oltótűvel átszúrtam, majd az oltólombikban található oldatot a fermentorba juttattam. A beoltás után a membránba behelyeztem a háromágú sav-bázis-habzásgátló csonkot és rákötöttem a három szabályozó folyadék adagolókábeleit. A fermentor oldalán elhelyezett pH és hőmérsékletmérők miatt volt fontos, hogy minimum 5 liternyi hidrolizátumot tisztán ki tudjak nyerni a savas hidrolízis során. Ennél alacsonyabb folyadékszintnél nem mérnek megfelelően, mivel csak alig vagy egyáltalán nem érnek bele a folyadékba. Eközben a számítógépen elindítottam az adatgyűjtést. Az alábbi paraméterek értékeit rögzítettem: hőmérséklet, pH, pO2, kevertetés, nyomás, levegőáram, sav és lúg adagolás (0,1M H2SO4; 0,1M NaOH), habzásgátló adagolás. 3.6.2. Aerob szakasz A fermentáció ezen szakaszában történik a sejtfelszaporítás. A beoltást követően a fermentoron 400rpm kevertetést, 5,5-ös pH értéket és 2 VVM (Volume/Volume/Minute) levegő térfogatáramot állítottam be. A fermentációk 5 literes össztérfogattal indultak, így tehát a levegőztetési érték 10 L/min (a levegőztetési érték mindig arányos a fermentációs
23
térfogattal). Általában 7-8 óra elteltével értem el a kívánt sejtkoncentrációt. A koncentrációkat természetesen óránkénti mintavételek során folyamatosan figyeltem és rögzítettem. 3.6.3. Semi-aerob szakasz Az aerob szakasz után átállítottam a rendszert a semi-aerob szakaszra. A kevertetést 150rpmre, míg a levegőáramot 0,8 VVM-re (4 l /min) csökkentettem, erre a már korábban ismertetett élesztő sejtműködés miatt volt szükség. Mivel ha a termelés semi-aerob körülmények között történik, a NAD+ regeneráció csökken, így a második, oxidációs lépés az XDH inaktiválódása miatt nem tud lejátszódni, ez pedig xilit felhalmozódáshoz vezet. Tehát ebben a szakaszban történik a xilit konverzió. A fermentációt mindig akkor állítottam le, amikor a lentebb ismertetett redukáló cukor meghatározásoknál nem találtam jelentős eltérést a vak mintától. 3.6.4. Mintavétel A fermentorban a mintavevő csonk holttér, ezért mintavételek során a levett minta első 45-50 ml-ét mindig kiöntöttem (ez a mintavevő csonkban állt, nem lett volna releváns a minta). A mérésekhez az ezt követően levett kb 13-15 ml mintát használtam. A minta sejtkoncentrációját OD mérés segítségével állapítottam meg 600 nm-en, három párhuzamos hígítás segítségével. Ezután a minta egy kis részét mikroszkóp segítségével is megvizsgáltam, így ellenőrizhettem, hogy a sejtek alakja, nagysága, mennyisége megfelelő-e illetve, hogy a fermentorban lévő oldat befertőződött-e. Ezután a mintát 5 percig 9000rpm-en centrifugáltattam a fentebb már említett készüléken és a felülúszóból redukáló cukor (RC) meghatározásával mértem a xilóz fogyását (hozzávetőleges értékeket, melyek támpontot adtak a kísérlet további folytatásához). A maradék felülúszót mindig lefagyasztottam, majd a kísérlet végén HPLC módszerrel mértem a valós értékeket. A xilit konverziós szakaszában csak naponta kétszer, reggel 8 órakor és este 18 órakor vettem mintát. Ezeket a fentebb tárgyalt módon mértem, kezeltem. 3.7. Analitikai módszerek
Ebben az alfejezetben a fermentációs kísérletek alatt alkalmazott analitikai mérési módszereket szeretném bemutatni. A levett mintákból az élesztősejtek és különböző cukrok
24
koncentrációját határoztam meg. A savas hidrolízis előtt és után is vettem mintát, így információt nyerhettem a kezelés hatásáról. Ezen felül az inhibítorok koncentrációját is megtudhattuk. 3.7.1. Optikai denzitás mérés A fermentorból vett minta optikai denzitását mértem egy Pharmacia LKP – Ultrospec III típusú spektrofotométerrel, így meghatározhattam a sejtkoncentrációt. Homogenizáltam a mintát, majd három párhuzamos hígítást készítettem, addig hígítottam a mintánkat, míg a mérési tartomány 0,9 és 0,2 abszorbancia érték közé nem esett (ezen értékek estek a kalibrációs egyenesünkre). 600 nm-es hullámhossz tartományon mértem. Ezután egy korábban számolt kalibrációs egyenes képlet segítségével kiszámoltam a koncentrációkat. Vak mintaként desztillált vizet használtam. 3.7.2. HPLC analízis A HPLC analízist egy Shimadzu LC-VP típusú géppel végeztem, melynek oszlopa BIO-RAD Aminex HPX-87H típusú. A lefagyasztott mintákat felolvasztás után 0,45 mikométeres cellulóz membránon át szűrtem majd megfelelően hígítottam. HPLC méréssel a fermentáció közben fogyott glükóz és xilóz illetve a képződött xilit mennyiségét, ezen túl az inhibítorok mennyiségét tudtam meghatározni. 3.7.3. Redukáló cukor mérése (RC) A mérés lényege, hogy a DNS oldat (elkészítését és kalibrációját később tárgyalom) lúgos közegben redukáló csoportokkal lép reakcióba, ennek során egyik nitrocsoportja aminocsoporttá alakul. Redukálódását színváltozás jelzi: a narancssárga oldat barna színű lesz. A képződött szín intenzitását spektrofotométerrel mértem. Különböző redukáló cukrok megkülönböztetésére nem alkalmas, nem specifikus, így nem szelektív xilózra. A levett mintát centrifugálás után megfelelően hígítottam, mégpedig úgy hogy 1,5 ml össztérfogatot kapjak. A vak minta szintén 1,5 ml desztillált víz volt. Ezután handy step segítségével pontosan 3,0 ml DNS oldatot adagoltam a kémcsövekbe. Forrásban lévő vízbe tettem és 5 percig hagytam benne. Miután a színreakció lejátszódott, kivettem és hagytam lehűlni szobahőmérsékletűre. 16 ml desztillált vízzel meghígítottam a mintákat és mérés előtt 25
óvatosan összeráztam őket. A spektrofotométeren 550 nm mérési tartományban mértem. A vak mintára lenulláztam a gépet és a kapott abszorbanciákat rögzítettem. Az alábbi képlet segítségével számoltam ki a redukáló cukor koncentrációkat: . RC mg / mL
ahol
A550 b D, m VSample
RC - a redukáló cukor tartalom [mg/ml], A550 - az abszorbancia 550 nm-en, b - a DNS kalibrációs egyenes tengelymetszete, m - a DNS kalibrációs egyenes meredeksége, VSamplea- mintatérfogat [ml], D - a minta hígítása a vizsgálat előtt.
3.7.3.1. DNS oldat készítése 10g 3,5-dinitroszalicilsavat feloldottam 500ml 2%(m/m)-os NaOH oldatban. Melegítés közben (kb. 50-60 °C-on), folytonos keverés mellett hozzáadtam 200g kritályvizes K,Natartarátot (Rochelle só) és 0,5 g Na2SO3-ot, majd 2g fenolt. Lehűlés után mérőlombikban desztillált vízzel 1000 ml-re egészítettem ki. A DNS reagens fény hatására bomlik, ezért sötét üvegben tároljuk. Kalibrálás és felhasználás előtt a reagens 3 napig kell állni hagyni.
3.7.3.2. DNS oldat kalibrálása A DNS oldatot ismert koncentrációjú glükóz oldatokkal be kell kalibrálni, ahhoz hogy használni tudjuk. Készítettem egy 1 mg/ml-es glükóz törzsoldatot, melyből 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 ml-t mértem be kémcsövekbe. A törzsoldatot minden esetben desztillált vízzel 1,5 ml-re egészítettem ki. A referencia (vak) 1,5 ml desztillált vizet tartalmazott. Minden kémcsőbe 3,0 ml DNS oldatot mértem be adagoló pipettával, majd 5 percre forrásban lévő vízbe tettem. Forrás után szobahőmérsékletűre hűlve 16 ml desztillált vizet adagoltam a kémcsövekbe és összeráztam őket. Vakkal szemben 550 nm-en mértük az abszorbanciát.
26
A mért értékek alapján kalibrációs görbét készítettem, amit későbbiekben a méréseim során használtam fel.
1,2 y = 1,0514x R 2 = 0,9915
Abszorbancia [-]
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,00
0,20
0,40
0,60
Koncentráció [g/l]
10 . ábra A DNS oldat kalibrációs egyenese
27
0,80
1,00
4. Eredmények és értékelésük Az első xilit fermentációt rázatott lombikokban végeztem el. Ezután léptéknöveltem és fermentoros kísérleteket hajtottam végre, számszerint ötöt. A fermentoros kísérletek közül kettőt modell oldattal (xilóz), további kettőt pedig hidrolizátum segítségével végeztem el. 4.1. Fermentáció rázatott lombikban A rázatott lombikos fermentáció során hat párhuzamos lombikban dolgoztam. Három lombik ecetsavas xilóz oldatot, három csak xilóz oldatot tartalmazott. A 11. ábrán az ecetsavmentes fermentáció kiértékelt adatai láthatóak, a 12. ábrán az ecetsavas xilóz oldattal végzett fermentáció diagramja. Az három-három kísérlet adatait átlagoltam és ezután dolgoztam fel, készítettem diagramot. Az ecetsavmentes diagramon jól látható, hogy a xilóz koncentráció meredeken csökken az idővel, míg a xilit koncentráció görbéje jelentős növekedést mutat, a két görbe keresztezi egymást. A hozama 58,8%-os, míg a produktivitása 0,34 G/L/h lett.
Ecetsavmentes rázatott lombikos fermentáció 30
koncentráció [g/l]
25 20 xilóz
15
xilit
10
EtOH
5 0 0
20
40
60
80
100
idő [óra] 11. ábra Fermentáció rázatott lombikban (30 g/l xilóz, 5 g/l sejt, 125 rpm, 100/60), xilóz, xilit, EtOH koncentrációja az idő függvényében
28
Az ecetsavas diagramon szintén azt látjuk, hogy a xilóz koncentráció csökken és a xilit koncentráció nő idővel, azonban a görbék kevésbé meredekek. Az ecetsav koncentrációja majdnem konstans volt végig a fermentáció során. A hozam 25,7%, a produktivitás 0,08 g/L/h lett.
Ezen adatok alapján arra következtettem, hogy az ecetsav gátló hatást fejtett ki a
xilitképződésre a kísérlet során.
Ecetsavas rázatott lombikos fermentáció 30
koncentráció [g/l]
25 20 xilóz
15
xilit
10
EtOH
5
ecetsav
0 -5
0
20
40
60
80
100
idő [óra] 12. ábra Fermentáció rázatott lombikban (30g/l xilóz, 5 g/l sejt, 2,5 g/l ecetsav, 125 rpm, 100/60), xilóz, xilit, EtOH, ecetsav koncentrációk az idő függvényében
4.2. Fermentáció nagylaboratóriumi fermentorban modell oldattal 4.2.1. Első fermentáció modell oldattal A rázatott lombikos kísérlet után léptéknöveltem és nagylaboratóriumi fermentorban folytattam a kísérletsorozatot. A fermentációt a fentebb leírt műveletek végrehajtása előzte meg. A beoltás után az aerob szakaszban óránként vettem mintát.
A megfelelő
sejtkoncentráció eléréséhez 7 órát kellett várnom. Az átlagos sejttömeg az aerob szakaszban 2,24 g/l-re adódott, az átállásig elhasznált xilózzal összevetve a sejthozam 0,3 gramm sejt/ gramm xilóz. Az első fermentáció diagramja a 13. ábrán látható.
29
1. modell oldatos fermentáció (2014.06.23-27.)
Koncentráció [g/l]
35 30
Redukáló cukor Arabinóz
25
Sejttömeg xilóz
20
xilit
15
EtOH Szumma cukor Ecetsav
10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Idő [óra]
13. ábra Az első modell oldatos fermentáció fontosabb adatai, a fermentáció lefutása
A diagram jól mutatja a semi-aerob szakaszra való átállást. A 7. óra után a sejtkoncentráció már csak nagyon kis mértékben nő tovább, majd elkezd stagnálni. A xilit görbéje pedig jól látható módon elkezd emelkedni, tehát a xilit termelés megindult a 7. óra után. A levett mintákból redukáló cukor tartalmat mértem minden alkalommal. Ezek az adatok a később kiértékelt hplc adatokkal nem mindig estek egybe, azonban az a redukáló cukor mérések alapján is látható volt, hogy folyamatosan csökken a cukorkoncentráció. A fermentációt a redukáló cukor mérések alapján állítottam le a kísérlet ötödik napján, ekkor már alig tartalmazott az oldat fermentálható cukrot. A mintákból ezután 4-szer hígítással hplc mintákat készítettem. Ezen adatok alapján számoltam ki a hozamot és a produktivitást. A xilit hozam a xilit koncentráció maximumértéke osztva az átálláskori xilóz koncentrációval 23,7%-nak adódott. Ez elmarad az irodalmi adatoktól. A produktivitás a xilit maximumkoncentrációja osztva az ehhez szükséges semi-aerob környezetben eltöltött idővel, 0,12 g/L/h.
Nem
meglepő ez az alacsony érték a 2, 24 g/L-es sejtkoncentráció után. 2,7 g/L volt a beállított kiindulási ecetsav koncentráció. A mérési adatokból a 11. ábrán látható, hogy a kezdeti aerob szakaszban az ecetsav koncentráció kicsit több mint a felére csökkent, de a semi-aerob szakaszban mennyisége folyamatosan növekedett.
30
4.2.2. Második fermentáció modell oldattal A semi-aerob környezetre való áttéréshez itt is 7 órát kellett várnom, azonban a sejtkoncentrációra a 7. órában már 3,43 g/L koncentrációt mértem. Az átlagos sejttömeg (3,0 g/L) az átállásig elhasznált xilózzal (27,64 g) összevetve 0,12 gramm sejt/ gramm xilóz sejthozam, ez igen kevés. A harmadik fermentáció diagramja a 14. ábrán látható.
2. modell oldatos fermentáció (2014.07.07-11.)
30
Redukáló cukor Arabinóz
25
Koncentráció [g/l]
Sejttömeg 20
xilóz xilit
15
EtOH Szumma cukor Ecetsav
10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Idő [óra]
14 . ábra A második modell oldatos fermentáció fontosabb adatai, a fermentáció lefutása
A diagramon jól látható a semi-aerob szakaszra való áttérés, a sejtkoncentráció a 7. óránál bizonyos szinten állandósul. A xilit koncentráció is ebben az időpontban kezd el növekedni, a xilóz koncentráció pedig csökkenni, tehát elindul a xilóz xilitté való átalakítása. A mért redukáló cukor koncentrációk szépen fokozatosan csökkentek a fermentáció során, ezek alapján az ötödik napon leállítottam a kísérletet, mivel ekkor már nem alig volt cukor a rendszerben. A mintákból 4-szeres hígítással hplc mintákat készítettem és a kapott adatok szépen követték az általunk lemért cukorkoncentrációkat. A hplc adatok alapján számoltam ki a hozamot és a produktivitást. A hozam ennél a fermentációnál 28,35% lett (5,5g/19,4g), a produktivitás 0,12 g/L/h (5,5g/46,98h).
31
A tanszéken korábban végeztek nagylaboratóriumi fermentorban ecetsavmentes xilóz oldattal kísérleteket. Ezeket az általam kapott adatokkal hasonlítottam össze. Az ecetsavmentes fermentációnál a xilóz csökkenő és a xilit növekvő koncentrációja meredeken változik az idővel, közel lineáris. Az ott kapott hozam 66%, a produktivitás 0,19 g/L/h volt. Ezen adatok alapján arra lehet következtetni, hogy a xilithozamot gátlólag befolyásolja az ecetsav jelenléte. A fermentorban véghez vitt kísérletek a rázatott lombikos kísérletek léptéknövelt „párjai”. Ezeket összehasonlítva érdekes dolgokat figyelhetünk meg. A lombikos fermentáció előtt nem állítottam be az oldat pH-ját, hanem 3-4-es körüli pH-án hagytam. Míg az ecetsavas modell oldatot a fentebb már említett módon 5,0-5,5-ös pH-ra állítottam. Amikor beállítottam a pH-t gyorsabban fogyott a xilóz, mint a nem állított lombikos fermentáció során. Tehát a pH is igen nagy hatással van a xilózból történő xilit konverziójára. Ezen kívül, mivel a lombikos kísérleteknél vattával volt lezárva az oldat, valószínűleg a levegőáram is nagyobb lehetett a semi-aerob szakaszban (így az aerob irányba tolódott el), mint a pontosan, vezérlőpanel segítségével beállítható fermentor esetében. A fermentoros kísérleteknél megfigyelhető a semi-aerob szakaszban a kiindulási koncentráció hatása is. A két kísérletnél ezek eltértek, az elsőnél 2,27 g/L, míg a másodiknál 3,43 g/L volt. A nagyobb sejtkoncentrációnál hamarabb fogyott el a xilóz és nagyobb hozamot kaptam. A produktivitás viszont mindkét esetben 0,12 g/L/h volt. Mindkét esetben az aerob szakaszról semi-aerob szakaszra való átállás a 7. órában történt és a fermentáció lefutása 5 napig tartott. 4.3 Fermentáció nagylaboratóriumi fermentorban hidrolizátummal 4.3.1. Első fermentáció nagylaboratóriumi fermentorban A kísérletet kukoricarost fentebb leírt kénsavas hidrolízisével előállított hidrolizátum betáplálásával végeztem. Ez volt az első ilyen fermentáció, így számos új dologgal szembesültem. Az aerob szakaszban lassabban értem el a semi-aerob szakaszba lépéshez kívánt sejttömeget. A 13. ábrán lévő diagramon is látható, hogy 8 illetve 9 óra között történt az átállás, ekkor 3,84 g/L volt a sejtkoncentráció. Az átlagos sejttömeg az aerob szakaszban 2,96 g/L-re adódott, az átállásig elhasznált xilózzal összevetve (3,63g) a sejthozam 0,81
32
gramm sejt/ gramm xilóz. Ez
sokkal jobb arány mint amivel az
előző kísérleteknél
találkoztam.
15. ábra Az első hidrolizátumos fermentáció fontosabb adatai és a kísérlet lefutása
A fermentáció lefutása azonban nehezen értelmezhető. A diagramról leolvasható, hogy az átállás időpontjában a sejtkoncentráció növekedési sebessége lelassult (tehát biztosan élő sejttenyészetem volt), állandósult a koncentráció értéke és a xilittermelés is elkezdődött, habár az eddigi kísérleti adatokhoz viszonyítva csak kis mértékben nőtt a xilit koncentráció. A kísérlet érdekessége, hogy a xilóz mennyisége az egész fermentáció alatt alig változott, minimálisan csökkent csak. Ez szintén igaz a redukáló cukor mennyiségére is. A kísérletet már a 4. nap végén leállítottam, mivel nem képződött tovább xilit. A levett mintákból 3-szoros hígítással készítettem hplc mintákat. A produktivitásra 11,88%-ot kaptam (2,4g/20,2g), a hozamra pedig 0,03 g/L/h (2,4g/82,23h) jött ki számításaim alapján. Ezen értékek meg sem közelítik a szakirodalmi kihozatali értékeket.
33
4.3.2. Második fermentáció nagylaboratóriumi fermentorban A 16. ábrán látható a kísérlet lefutása az adatokkal. Hasonlóan az előző hidrolizátumos fermentációhoz, az aerob szakaszban igen lassan érte el a sejttenyészet a semi-aerob fázisba való átlépéshez szükséges koncentrációt.
16. ábra A második hidrolizátumos fermentáció fontosabb adatai és a kísérlet lefutása
A 11. órában állítottam át, ekkor 2,84 g/L-es koncentrációt mértünk. A diagramon jól látható, hogy a 11. óránál a sejttömeg közel azonos értékre beáll, a xilit mennyisége elkezd nőni, míg ezzel párhuzamosan a xilóz koncentráció csökken. A redukáló cukor mennyisége fokozatosan csökkent a kísérlet során, az 5. napon ezen adatok alapján állítottam le a fermentációt. Ezután a mintáinkat 3-szoros hígítással hplc-n futtattam, az értékek szépen követték a redukáló cukor koncentrációkat. A hozam értékére 46,27%-ot kaptam (8,7g/18,8g), a produktivitás pedig 0,21 g/L/h (8,7g/40,53h) lett.
34
A kísérlet különlegessége, hogy a hidrolizátumot mellyel dolgoztam a kísérlet indítása előtt egy hétig lefagyasztva tároltam. Ennél a fermentációnál kaptam a legmagasabb hozam és produktivitási adatot. Mivel az alkalmazott módszerek, mérési technikák, felhasznált anyagok nem különböztek egyik kísérlet során sem, arra következtetek, hogy az előzetes fagyasztás majd kiolvasztás volt a hidrolizátum összetételére jó hatással. Ennek vizsgálatára a későbbiek során újabb kísérletek kidolgozását és végre hajtását tervezem. A modell-rendszerben történt xilóz oldatos fermentációnál a ecetsav zavaró hatása egyértelműen látszik. Azoknál a kísérleteknél xilóz oldat, desztillált víz, ecetsav és tápsó került a rendszerbe, de a hidrolizátumos kísérletek során nem tudtam pontosan a fermentlé összetételét, a savas hidrolízis közben számos különböző vegyület kioldódhatott (például inhibítorok). Ez lehet az oka annak, hogy a hidrolizátummal végzett fermentációnál nem látunk a modell oldatos fermentációnál kapotthoz hasonló, alacsony xilithozamot. Egyéb vegyületek zavárást okozhattak. 5.3 Ecetsavmenetesített hidrolizátumos fermentáció Az utolsó fermentációmat ammóniásan és savasan is kezelt kukoricarostból származó hidrolizátummal futtattam le. Az ammóniás kezelés lényege az ecetsavmentesítés volt, mivel a savas kezelés során hemicellulóz származékok, köztük az ecetsav is oldatba kerülhet.
Ammóniával kezelt hidrolizátumos fermentáció Xilit (2014.10.06-2014.10.10.)
Koncentráció [g/L]
30 25
Xilóz
20
EtOH
15
Glükóz Ecetsav
10 5 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
Idő [óra] 17. ábra Ecetsavmentesített hidrolizátumos fermentáció fontosabb adatai és lefutása
35
90
A fermentáció diagramján hasonlóan az eddigiekhez jól látszik, hogy a 7. órában állt át a rendszer semi-aerob szakaszba, ezután a sejtkoncentráció közel minden mintavételnél azonos volt. A xilóz és a xilit görbék lefutása leginkább az ecetsavas fermentációnál látott görbékhez hasonlít. Ugyanígy az ecetsav koncentráció az aerob szakaszban teljesen 0-ra csökken, majd a semi-aerob szakaszban újra elkezd nőni a mennyisége. A kísérlet hozama 20,7% míg a produktivitása 0,06 g/L/h volt. Ezen adatok is az ecetsavas fermentáció hozamaihoz esnek közel. Arra következtetek, hogy az ecetsavmentesítés nem volt megfelelő.
36
5. Konklúzió A kísérletek adatainak részletes elemzése során az ecetsav xilittermelés gátló hatását tanulmányoztam. A kísérleteim lefuttatása során fényderült arra, hogy még számos nagylaboratóriumi fermentorban végzett fermentációra lesz szükség, melyeket minden esetben rázatott lombikos elő-kísérlet kell, hogy megelőzzön. Az eddigi tapasztalataim és mérési adataim azt mutatják, hogy bár az ecetsav visszaveti a xilóz metabolizmusát, az ecetsavas és az ecetsavmentesített xilóz oldaton történt kísérletek hozamai a legtöbb esetben nem tértek el jelentősen egymástól. További megfigyelésem, hogy más környezeti paraméterek például a pH, levegőztetés is befolyásolják az ecetsav mellett a xilit hozamot.
37
6. Irodalomjegyzék: [1] Makinen K. K., 2000: Can the pentitol-hexitol explain the clinical observations made with xylitol? Medical Hypotheses. (4) 54 603-13 [2] http://goo.gl/xVSxxM (2014. április) [3] Weber C., Farwick A., Benisch F., Brat D., Dietz H., Subtil T., Boles E., 2010: Trends and challenges in the microbial production of lignocellulosic bioalcohol fuels. Appl. Microbiol. Biotechnol 87:1303-1315 [4] www.curetoothdecay.com [5] Akinterinwa O., Khankal R., Cirino PC., 2008: Metabolic engineering for bioproduction of sugar alcohols. Curr. Opin. Biotechnol. 19:461-467 [6] Arrizon J., Mateos JC., Sandoval G., Aguilar B., Solis J., Aguilar MG., 2011: Bioethanol and xylitol production from different lignocellulosic hydrolysates by sequential fermentation. J. Food Process Eng. doi:10.1111/j.1745-4530.2010.00599.x [7] Ylikhari R., 1997: Metabolic and nutritional aspects of xylitol. Advances in Food research. 25 159-180 [8] König K. G., 2011: Diet and oral health. International Dental Journal (3) 50 162-174 [9] Sipos D., Dienes D., Réczey I.,: Lignocellulóz tartalmú termények és melléktermékek hasznosítása fermentálható szénhidrátok és bioetanol előállítás céljából. 823-831, ISBN: 978963-9639-35-5 [10] www.deardoctor.com [11] www.xilit.hu
38
[12] Saha BC., 2003: Hemicellulose bioconversion. JIndMicrobiol Biotechnol 30:279-291 [13] Maki-Arvela P., Salmi T., Holmbom B., Willför S., Murzin D. Y., 2011: Synthesis of sugars by hydrolysis of hemicelluloses review. Chemical Reviews (9) 111-5638-5666 [14] Granström TB., Izumori K., Leisola M., 2007a: A rare sugar xylitol. Part I: the biochemistry and biosynthesis of xylitol. Appl. Microbiol. Biotechnol .74:277-281 [15] Nigam P., Singh D., 1995: Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute. Process Biochemistry. (2) 30 117-124 [16] Winkelhausen E., Kuzmanova S., 1998: Microbial conversion of D-xylose to xylitol. J Ferment. Bioeng. 86:1-14 [17] Parajó J. C., Dominguez H., Domínguez H. M., 1998: Biotechnological production of xylitol. Part 2: Operation in culture media made with commercial sugars. Bioresource Technology. (3) 65 203-212 [18] Chen X., Jiang ZH., Chen S., Qin W., 2010: Microbial and bioconversion production of D-xylitol and its detection and application. Int J Biol Sci 6:834-844 [19] Lachke AH., Jeffries TW., 1986: Levels of the enzymes of the pentose phosphate pathway in Pachysolen tannophilus Y-2460 and selected mutatnts. Enz. Microbial. Technol. 8:353-359 [20] Aranda-Barradasa J. S., Garibay-Orijela C., Badillo-Coronab J. A., SalgadoManjarreza E., June 2010: A stoichiometric analysis biological xylitol production. Biochemical Engineering Journal. vol. 50, no. 1-2, p. 1-9, 15 [21] http://ec.asm.org/content/2/5/867.figures-only [22] Kuna M, 2013: Szakdolgozat Bsc. Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem [23] http://en.wikipedia.org/wiki/Candida_(fungus), May 2013: Candida (fungus) [Online]
39
[24] Vongsuvanlert T., Tani Y., 1988: Purification and characterization of xylose reductase of a methanol yeast, Candida boidinii, which is involved in sorbitol production frome glucose. Agric. Biol. Chem. 52:1817-1824 [25] Felipe M. G. A., Vitolo M., Manchila I. M., Silva S. S., 1997a: Environmental parameters affecting xylitol production from sugar cane bagasse hemicellullosic hydrolyzate by Candida guilliermondii. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18:251-254 [26] Pfeifer M. J., Silva S. S., Felipe M. G. A., Roberto I. C., Manchila I. M., 1996: Effect of Culture Conditions on Xylitol Production by Candida guilliermondii. FTI 20037. Applied Biochemistry and Biotech. (1) 57-58 423-430 [27] Sene L., Felipe M. G. A., Vitolo M., Silva S. S., Manchila I. M.,1998: Adaptation and reutilization of Candida guilliermondii cells for xylitol production in bagasse hydrolyzate. J. Basic Microb. 38:61-69 [28] Cunha M. A. A., Converti A., Santos J. C., Silva S. S., 2006: YEast immobilization in LentiKats: a new strategy for xylitol bioproduction from sugarcane bagasse. World J. Microbiol. Biotechnol. 22:65-72 [29] Parajó J. C., Dominguez H., Domínguez J. M., 1997: Improved xylitol production with Debaryomyces hansenii Y-7426 from raw or detoxified wood hydrolyzates. Enzyme Microb. Technol. 21:18-24 [30] Vandeska E., Amartey S., Kuzmanova S., Jeffries T., March 1995: Effects of environmental conditions on production of xylitol by Candida biodinii. World Journal of Microbiology and Biotechnology. vol. 11, no. 2, pp. 213-218 [31] Felipe M. G. A., Vitolo M., Manchila I. M., Silva S. S., 1997b: Fermentation of sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolyzate for xylitol production: effect of pH. Biomass Bioenerg. 13.11-14 [32] Chenga K. K., Zhanga J. A., Lingb H. Z., Pingb W. X., Huanga W., Geb J. P., Xua J. M., February 2009: Optimization of pH and acetic acid concentraion for bioconversion of 40
hemicellulose from corncobs to xylitol by Candida tropicalis. Biochemical Engineering Journal. vol. 43, no. 2, p. 203-207 [33] Convert A., Torre P., De Luca E., Perego P., Del Borghi M., Silva S. S., 2003: Continuous xylitol production from synthetix xylose solutions by Candida guilliermondii: influence of pH and temperature. Eng. Life Sci. 3:193-198 [34] Kim J. H., Han K. C., KOh Y. H., Ryu Y. W., SEo J. H., 2002: Optimization of fedbatch fermentation for xylitol production by Candida tropicalis. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29:16-19 [35] Preziosi-Belloy L., Nolluesu V., Navarro J. M., 1997: Fermentation of hemicellulosic sugars and sugar mixtures to xylitol by Candida parapsilosis. Enzyme and MIcrobial Technology (1-2) 2 1124-129 [36] Kim S. B, Moon N. K., 2003: Enzymatic digestibility of used newspaper treated with aqueous ammonia-hydrogen peroxide solution. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108:365-373 [37] Mahler G. F., Guebel D. V., 1994: Influence of magnesium concentraion on growth, ethanol and xylitol production by Pischia stipitis NRRL Y-7124. Biothecnol. Lett. 16:407-412 [38] du Preez J. C. 1994: Processe parameters and environmental factors affecting D-xylose fermentation by yeasts. Enzyme Microb. Tech. 16:944-956 [39] Sjöström E., 1993: Wood Chemistry Fundamentals and Applications. Academc Press. San Diego, Ca. [40] Varga Á., Cselovszki L., Németh M., 2014: Xilit fermentáció vizsgálata nagylaboratóriumi fermentorban. Egyéni feladat.
41
