MUDr. Soòa Peková, PhD. CHAMBON s.r.o., Laboratoø molekulární diagnostiky, Evropská 176/16, Praha
Vyuití GS Junior v projektu hledání nových markerù pro sledování minimální reziduální nemoci u akutních leukémií Úvod Akutní leukémie (AL) patøí mezi závaná hematoonkologická onemocnìní s velmi heterogenním biologickým prùbìhem. Abnormality karyotypu u de novo zjitìných akutních leukémií jsou prokazatelné pøiblinì u 50 procent dospìlých pacientù s akutní myeloidní leukémií (AML), resp. u 70 procent dospìlých pacientù s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL)(1), avak pouze èást karyotypových zmìn má za následek vznik fúzního produktu, jen je moné detekovat na molekulární úrovni. K rutinnì vyetøovaným fúzním transkriptùm, které lze monitorovat na RNA úrovni, patøí u pacientù s akutní myeloidní leukémií zejména AML1-ETO (RUNX1RUNX1T1), PML-RARα, DEK-CAN (DEK-NUP214), CBFβ-MYH11(2). U pacientù s akutní lymfoblastickou leukémií jsou to fúzní transkripty BCR-ABL, MLLAF4 (MLL-AFF1), E2A-PBX1 (TCF3PBX1), TEL-AML1 (ETV6-RUNX1)(3,4). U nìkterých pacientù jsou pomocí metod molekulární biologie identifikovány nejrùznìjí mutace v hematologicky významných genech - NPM1, CEBP , FLT3, c-KIT, WT1(5-7). U pacientù s ALL jsou èasté pøestavby tìkých øetìzcù imunoglobulinu (IGH) a T-bunìèného receptoru (TCR)(8). Zmínìné chromozomové abnormality, genové mutace a pøestavby mohou být 8
Labor Aktuell 04/12
Obr. 1. Molekulárnì cytogenetická analýza karyotypu pacienta s akutní leukémií A) Mnohobarevná fluorescenèní in situ hybridizace (mFISH) B) Mnohobarevné pruhování s vysokou rozliovací schopností (mBAND) pro chromozomy X, 4 a 11
v prùbìhu léèby pacientù s akutní leukémií pouity jako molekulární markery k monitorování minimální reziduální nemoci (MRN). Detekce MRN je v souèasné dobì rozhodujícím nástrojem ke zhodnocení kvality odpovìdi pacienta na léèbu, jeliko umoòuje predikovat její selhání, pøípadnì u pacientù po transplantaci kostní døenì dovoluje vèas pøedpovìdìt blíící se relaps onemocnìní. Proto je velmi ádoucí identifikovat unikátní klonálnì specifické znaky leukemických bunìk, a umonit tak monitorování MRN i pacientùm, u nich nebyla nalezena ádná ze standardnì vyetøovaných aberací. Moderní techniky molekulární biologie zaloené na technikách celogenomového sekvenování (Next Generation Sequencing; NGS) umoòují mapovat a identifikovat unikátní klonální abnormality, co dovoluje konstruovat kvantitativní RealTime PCR eseje pro sledování MRN itých na míru jednotlivým pacientùm; jinými slovy - tento pøístup umoòuje personalizovanou medicínu v hematoonkologii.
Obr. 2. Reverzní FISH. Ovìøení specifiènosti disekovaných chromozomových fragmentù u pacienta s akutní leukémií. A) Derivovaný chromozom 4 B) Derivovaný chromozom 11
Tab. 1. Základní informace o analýze jednotlivých zlomových míst
Obr. 3. Schématické zobrazení postupu pøi identifikaci zlomového místa na derivovaném chromozomu
Labor Aktuell 04/12
9
Technologie Pro NGS identifikaci unikátních abnormalit na nukleotidové úrovni je klíèovým momentem identifikace derivovaných chromozomù pomocí technik molekulární cytogenetiky - mFISH a mBAND, tenkojehlová mikrodisekce èásti derivovaného chromozomu a následná sekvenace disekovaného materiálu pomocí celogenomového sekvenování na platformì GS Junior (Roche).
Na konkrétním pøíkladu pacienta s akutní leukémií je v dalím textu tato technika objasnìna. Molekulárnì cytogenetickým vyetøením (mFISH a mBAND) byla u pacienta s akutní leukémií nalezena balancovaná chromozomová translokace zahrnující gen MLL - 46,XX,t(X;4;11)(q25;q21;q23) (Obr. 1). Z kadého derivovaného chromozomu bylo mikrodisekováno deset fragmentù. Jejich specifiènost byla ovìøena hybridizací na metafázní chromozomy ne-
Obr. 6. Kvantifikaèní grafy A) Relativní kvantifikace chromozomového zlomu na der(4) B) Relativní kvantifikace chromozomového zlomu na der(11) C) Relativní kvantifikace fúzního transkriptu MLL-AF4 (BM = kostní døeò)
Obr. 4. Long-range PCR produkty u pacienta s akutní leukémií A) Derivovaný chromozom 4 B) Derivovaný chromozom 11
Obr. 5. Sekvence long-range PCR produktù A) derivovaný chromozom 4; fúze genu AF4 (intron 5) a pseudogenu LOC392539 na chromozomu X B) derivovaný chromozom 11; fúze genù MLL (intron 9) a AF4 (intron 5)
10
Labor Aktuell 04/12
gativní kontroly (Obr. 2 A, B). Sekvenací disekovaných chromozomových fragmentù na pøístroji GS Junior bylo získáno 122 279, resp. 120 209 ètení pro chromozomy der(4), resp. der(11) (Tab. 1). Získaná ètení byla pomocí in-house software GeneAnalyzer (Plachý R., nepublikováno) pøiøazena na referenèní sekvence chromozomù 4 a 11, co umonilo identifikaci potenciálních míst zlomu obou chromozomù. Na tuto sekvenci byly ekvidistantnì (po cca 1 500 bp) navreny primery pro longrange PCR (LR-PCR) (Obr. 3). LR-PCR amplifikace vedla k zisku produktù o velikostech ~ 0,5 kb pro derivovaný chromozom 4, resp. ~ 3 kb pro derivovaný chromozom 11 (Obr. 4). Sekvenováním LR-PCR amplikonù na kapilárním sekvenátoru ABI3130 (Applied Biosystems, USA) jsme identifikovali DNA sekvence bodù zlomù obou fúzních partnerù. Derivovaný chromozom 4 vznikl fúzí pseudogenu LOC392539 z chromozomu X a genu AF4 na 4q21. Derivovaný chromozom 11 vznikl fúzí genù MLL (intron 9) a AF4 (intron 5) (Obr. 5). Novì identifikované sekvence byly poté vyuity ke konstrukci Real-Time PCR eseje pro klonálnì-specifickou kvantifikaci MRN (zlomy derivovaných chromozomù 4 a 11 - zlomová místa Xq25; 4q21, resp. 4q21; 11q23). Novì identifikované mole-
kulární cíle byly rovnì srovnány s ji zavedeným cílem pro sledování MRN (fúzní transkript MLL-AF4) (Obr. 6). Pøíklad mapování zlomového místa (derivovaný chromozom 4) pomocí inhouse aplikace GeneAnalyzer je uveden na obrázku 7.
Závìr Sledování dynamiky minimální reziduální nemoci u akutní leukémie pomocí klonspecifických Real-Time PCR esejí umoòuje preciznì monitorovat osud maligní populace bunìk v tìle pacienta v prùbìhu léèby a vyhodnotit léèebnou odpovìï. Cílem naí práce bylo pomocí moderních technik molekulární cytogenetiky, celogenomového sekvenování a standardního Sangerova sekvenování pøipravit flexibilní metodiku pro identifikaci nových klonálnì specifických znakù leukemických bunìk u pacientù s akutní leukémií, u kterých nelze pomocí bìného screeningového panelu analýz v záchytu onemocnìní nalézt molekulární marker pro sledování minimální reziduální nemoci. Prognostický význam detekce MRN pomocí PCR byl potvrzen mnoha pracemi(9-13). V naí laboratoøi slouí jako cíl pro monitorování MRN pacientù s akutními leukémiemi klonální pøestavby tìkých øetìzcù imunoglobulinu (IGH) a T-bunìèného receptoru (TCR), fúzní transkripty a klonálnì specifické mutace prognostických markerù asociovaných s leukémiemi identifikované pomocí konvenèní PCR s následným sekvenováním. Fúzní transkripty jsou zahrnuty v unikátním diagnostickém systému AcutePlexX(14), díky
GS Junior
-
-
Tab. 2. AcutePlexX. Seznam rekurentních chromozomových abnormalit detekovaných u pacientù s akutní leukémií.
kterému jsme schopni detekovat více ne sto známých fúzních transkriptù a jejich
sestøihových variant (Tab. 2). Uvedenými pøístupy identifikujeme cíl pro sledování minimální reziduální nemoci pøiblinì u 50 procent dospìlých pacientù s akutní myeloidní leukémií. Popsaný postup identifikace nových klonálnì specifických markerù maligních bunìk umoòuje vyuívat i dosud nepopsané chromozomové aberace jako specifický cíl pro detekci a kvantifikaci MRN na molekulární úrovni. Mikrodisekované fragmenty chromozomù byly celogenomovì amplifikovány a sekvenovány na platformì GS Junior, který pøedstavuje pro výe popsanou aplikaci ideální pøístup - GS Junior poskytuje ètení s mediánem pøiblinì 400 bp, co umoòuje precizní mapování i repetitivLabor Aktuell 04/12
11
ních sekvencí, èím stoupá vyuitelnost jednotlivých ètení. Kombinace metod cytogenetiky a molekulární biologie umoòuje pøevést cytogenetický znak (derivovaný chromozom) leukemických bunìk pacientù s akutní leukémií a na molekulární (DNA sekvence) cíl urèený k detekci a kvantifikaci MRN pomocí techniky kvantitativní RealTime PCR. Tato technologie pøedstavuje zcela unikátní postup identifikace molekulárního markeru pro sledování MRN u pacientù s akutní leukémií. Jde o laboratorní pøístup itý na míru nemocných s akutní leukémií, který naplòuje nai pøedstavu o personalizované medicínì. V optimálním pøípadì je RealTime MRN esej na podkladì unikátního klonálnì specifického znaku leukemické populace pøipravena ji za est týdnù od stanovení diagnózy, co je zcela v souladu s potøebami rutinního diagnostického procesu u pacientù s akutní leukémií, kdy první vzorky ke sledování MRN dostává laboratoø po doznìní indukèní terapie, co je pøiblinì jeden mìsíc od záchytu onemocnìní. Obr. 7. Zlom na derivovaném chromozomu 4 urèený pomocí in-house software GeneAnalyzer
Literatura: 1) Mrózek K, Heerema NA, Bloomfield CD. Cytogenetics in acute leukemia. Blood Rev 2004; 18: 115-36. 2) Grimwade D, Hills RK, Moorman AV, et al. Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Research Council trials. Blood 2010; 116: 354-365. 3) Bassan R, Spinelli O, Oldani E, et al. Improved risk classification for risk-specific therapy based on the molecular study of minimal residual disease (MRD) in adult acute lymphoblastic leukemia (ALL). Blood 2009; 113: 4153-4162. 4) Brüggemann M, Gökbuget N, Kneba M. Acute lymphoblastic leukemia: monitoring of minimal residual disease as a therapeutic principle. Semin Oncol 2012; 39: 47-57. Review.
12
Labor Aktuell 04/12
5) Cairoli R, Beghini A, Grillo G, et al. Prognostic impact of c-KIT mutations in core binding factor leukemias: an Italian retrospective study. Blood 2006; 107: 3463-3468. 6) Schlenk RF, Döhner K, Krauter J, et al. Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med 2008; 358: 1909-1918. 7) Rossi G, Minervini MM, Carella AM, et al. Comparison between multiparameter flow cytometry and WT1-RNA quantification in monitoring of minimal residual disease in acute myeloid leukemia without specific molecular targets. Leuk Res. 2012; 36: 401-406. 8) Campana D. Minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010; 2010: 7-12. 9) Brüggemann M, Raff T, Kneba M. Has MRD monitoring superseded other prognostic factors in adult ALL? Blood 2012; [Epub ahead of print] PubMed PMID: 23033265. 10) Schnittger S, Weisser M, Schoch C, et al. New score predicting for prognosis in PMLRARA+, AML1-ETO+, or CBFBMYH11+ acu-
te myeloid leukemia based on quantification of fusion transcripts. Blood 2003; 102: 27462755. 11) Weisser M, Kern W, Schoch C, et al. Risk assessment by monitoring expression levels of partial tandem duplications in the MLL gene in acute myeloid leukemia during therapy. Haematologica 2005; 90: 881-889. 12) Perea G, Lasa A, Aventín A, et al. Prognostic value of minimal residual disease (MRD) in acute myeloid leukemia (AML) with favorable cytogenetics [t(8;21) and inv(16)]. Leukemia 2006; 20: 87-94. 13) Abdelhamid E, Preudhomme C, Helevaut N, et al. Minimal residual disease monitoring based on FLT3 internal tandem duplication in adult acute myeloid leukemia. Leuk Res 2012; 36: 316-23. 14) Plachy R, Zejskova L, Cmejla R, et al. Five-color multiplex Real-Time PCR technology to detect over 75 recurrent chromosomal abnormalities in acute myeloid leukemia; benefits for minimal residual disease detection. Blood 2011; 118: 1083 Abstract 2526.
