Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Vliv selenu na metabolismus laboratorního potkana Klára Truhlářová, FPBT BL 342
Vliv selenu na metabolismus laboratorního potkana
Laboratoř živočišné biochemie B211
Ústav biochemie a mikrobiologie (320) – FPBT
Vedoucí práce: Zídková Jarmila RNDr. CSc.
Konzultant: Melčová Magdalena Ing.
1
Selen
esenciální stopový prvek
antioxidační, chemopreventivní, protizánětlivé a antivirové účinky, pozitivní účinek na plodnost
vyšší koncentrace: toxický, kancerogenní
v organismu ve formě selenoproteinů
2
Selen
hlavním zdrojem potrava + doplňky stravy
DDD: 55 μg (zdravý dospělý člověk)
max. denní příjem 400 μg
nedostatek: poruchy plodnosti chronický nedostatek: onemocnění Keshan, Kashin-Beck
chronický nadbytek: selenosa 3
Selenoproteiny
enzymy, v aktivním centru AMK selenocystein (Sec)
označení jako 21. kódovaná AMK
především redoxní reakce
funkce při ochraně proti oxidačnímu stresu, při metabolismu štítné žlázy, ovlivnění tvorby hormonů štítné žlázy protizánětlivé funkce vliv na správný růst, vývoj a rozmnožování
4
selenocystein
Selenoproteiny a.
glutathionperoxidasy (GPx) redukce peroxidu vodíku a organických hydroperoxidů
ochrana buňky proti oxidačnímu stresu u člověka 5 typů (GPx1, GPx2, GPx3, GPx4, GPx6) b.
thioredoxinreduktasy (TrxR)
glutathion (γ-Glu-Cys-Gly)
součást redoxního systému 2 formy - pouze 1 selenoprotein (vyšší eukaryota) antioxidační ochrana, kontrola buněčného cyklu
5
Vybrané antioxidační enzymy a.
katalasa (CAT) 2H2O2 → 2H2O + O2
ochrana před vyššími koncentracemi peroxidu vodíku katalasová + peroxidasová aktivita erytrocyty, játra b.
glutathion-S-transferasy (GST) katalýza napojení GSH na xenobiotické substráty detoxikační funkce (toxické, karcinogenní látky, léky)
6
Vybrané antioxidační enzymy c.
glutathionreduktasa (GR) redukce GSSG na GSH (udržení požadovaného poměru)
ochrana proti oxidačnímu stresu
7
Cíl práce stanovení aktivity antioxidačních enzymů ve vybraných tkáních laboratorního potkana po podávání diety s různým obsahem řepkových pokrutin
vybrané tkáně: stanovení v plasmě, erytrocytech samci kmene Wistar krmeni 63 dní 4 testovací skupiny (po 8): 1. standardní krmná dieta 2. obohacení řepkovou pokrutinou (30%) 3. obohacení řepkovou pokrutinou (60%) 4. obohacení řepkovou pokrutinou (100%)
řepková pokrutina pěstována na půdě obohacené Se 8
Schéma
Řepka olejná pěstovaná na Se obohacené půdě
obohacené řepkové pokrutiny
plasma erytrocyty
stanovení aktivity 9
Wistar Kyoto
Stanovované parametry, metody stanovení specifických aktivit: 1. katalasy 2. glutathionperoxidasy 3. glutathionreduktasy 4. thioredoxinreduktasy 5. glutathion-S-transferasy 6. (superoxiddismutasy)
spektrofotometrické měření při příslušné vlnové délce:
→ úbytek absorbance → nárůst absorbance
10
Metody 1.
katalasa 2H 2O2 CAT O2 2H 2O
pokles A při 240 nm (2 min., 25˚C) 2.
glutathionperoxidasa ROOH 2GHS GPx GSSG ROH H 2O GR GSSG 2 NADPH 2 NADP 2GSH
pokles A při 340 nm (5 min., 25˚C) 3.
glutathionreduktasa
plasma:
GR NADPH H GSSG NADP 2GSH nárůst A při 412 nm
GSH DTNB GS TNB TNB GR erytrocyty: NADPH H GSSG NADP 2GSH
11
(5 min., 25˚C) pokles A při 340 nm (5 min., 25˚C)
Metody 4.
thioredoxinreduktasa redukce disulfidové vazby v DTNB – vznik TNB přírůstek A při 412 nm (mezi 1. a 2. minutou, 25˚C)
5.
glutathion-S-transferasa GSH CDNB GST GS DNB HCl
přírůstek A při 340 nm (5 min., 25˚C)
12
Výsledky-plasma Specifická aktivita CAT 7
6
asp (U.mg-1 proteinů)
5
4
Výběrová směrodatná odchylka
3
2
1
0 1
2
3 testovací skupina
13
4
Výsledky-plasma Specifická aktivita GPx 8
7
asp (U.mg-1 proteinů)
6
5
Výběrová směrodatná odchylka
4
3
2
1
0 1
2
3 testovací skupina
14
4
Výsledky-plasma Specifická aktivita GR 0,40 0,35
asp (U.mg-1 proteinů)
0,30 0,25
Výběrová směrodatná odchylka
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 1
2
3 testovací skupina
15
4
Výsledky-plasma Specifická aktivita TrxR 0,25
asp (U.mg-1 proteinů)
0,20
0,15
Výběrová směrodatná odchylka
0,10
0,05
0,00 1
2
3
testovací skupina
16
4
Výsledky-plasma Specifická aktivita GST 6,0
asp (U.mg-1 proteinů)
5,0
4,0
Výběrová směrodatná odchylka
3,0
2,0
1,0
0,0 1
2
3 testovací skupina
17
4
Plány do budoucna stanovení specifické aktivity enzymů v lyzátech erytrocytů změření koncentrace bílkovin (popř. hemoglobinu) v lyzátech erytrocytů změření koncentrace redukovaného glutathionu v lyzátech erytrocytů stanovení obsahu selenu ve standardní krmné dietě, v řepkové pokrutině ------------------------------------------------------------------------------ zahrnutí a proměření specifické aktivity dalšího antioxidačního enzymu: superoxiddismutasa (SOD)
18
Poděkování
Zídková Jarmila RNDr. CSc. Melčová Magdalena Ing. kolektiv laboratoře B211
Fyziologický ústav AV ČR
Česká zemědělská univerzita v Praze
Děkuji za pozornost. Financováno z účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT č.20/2014 a grantem GAČR 13-04580S.
