VLIV METABOLISMU HOMOCYSTEINU NA LIDSKOU REPRODUKCI

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie

VLIV METABOLISMU HOMOCYSTEINU NA LIDSKOU REPRODUKCI Bakalářská práce

Autor práce: Martina Vodová Vedoucí práce: Ing. Jitka Kubešová, Ph.D.

Brno 2008

ANOTACE

Zvýšená hladina homocysteinu je významný rizikový faktor řady onemocnění: kardiovaskulárních chorob, selhání ledvin, hypotyreózy, rakovinných onemocnění, diabetu, depresí, Alzheimerovy choroby, vrozených defektů neurální trubice a také neplodnosti. Cílem této práce je shrnutí dosavadních znalostí o homocysteinu, jeho metabolismu a jeho vlivu na mužský a ženský reprodukční systém.

Klíčová slova: thioly, homocystein, hyperhomocysteinemie, folát, vitamíny B6 a B12, polymorfismus MTHFR, lidská reprodukce, oxidační stres, plodnost

ANNOTATION

Elevated plasma homocysteine is a significant risk factor for the number of disorders: cardiovascular diseases, renal failure, hypothyroidism, cancer diseases, diabetes, Alzheimer disease, inborn neural tube defects and also infertility. The goal of this essay is to summarize present knowledges about homocysteine, its metabolism and its impact on male and female reproduction system.

Keywords: thiols, homocysteine, hyperhomocysteinemia, folate, vitamin B6 and B12, MTHFR polymorphism, human reproduction, oxidative stress, fertility

2

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že svou bakalářskou práci na téma Vliv metabolismu homocysteinu na lidskou reprodukci, jsem vypracovala sama pod oborným vedením Ing. Jitky Kubešové, Ph.D. a s použitím uvedené literatury.

V Brně dne 15. 5. 2008

_________________________

3

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala Ing. Jitce Kubešové, Ph.D. za její čas a cenné rady, které mi poskytla při vypracování této práce. Děkuji také svým rodičům za materiální podporu a trpělivost.

4

OBSAH SEZNAM ZKRATEK ................................................................................................................ 7 1 ÚVOD ........................................................................................................................................ 8 2 HISTORIE ............................................................................................................................... 9 3 VLASTNOSTI A FUNKCE HOMOCYSTEINU ................................................... 10 3.1

FORMY HOMOCYSTEINU V CIRKULACI ................................................................... 11

3.2

TRANSPORT HOMOCYSTEINU ................................................................................... 12 3.2.1

3.3

Přenašeče homocysteinu ............................................................................... 13

TOXICITA HOMOCYSTEINU ....................................................................................... 14

4 METABOLISMUS HOMOCYSTEINU .................................................................... 16 4.1

REMETHYLACE ........................................................................................................... 16 4.1.1

Homocystein-methioninový cyklus ................................................................ 16

4.1.2

Folátový cyklus.............................................................................................. 18

4.1.3

Propojení cyklů ............................................................................................. 19

4.2

TRANSSULFURACE ...................................................................................................... 20

4.3

REGULACE METABOLISMU ....................................................................................... 20

4.4

PORUCHY METABOLISMU.......................................................................................... 23 4.4.1

Homocystinurie ............................................................................................. 23

4.4.2

Hyperhomocysteinemie ................................................................................. 24

5 HOMOCYSTEIN A LIDSKÁ REPRODUKCE ..................................................... 25 5.1

5.2

MUŽSKÁ REPRODUKCE .............................................................................................. 25 5.1.1

Tvorba pohlavních buněk - spermatogeneze ................................................. 25

5.1.2

Vliv vitamínů B6, B12 a kyseliny listové ......................................................... 26

5.1.3

Vliv oxidačního stresu ................................................................................... 28

ŽENSKÁ REPRODUKCE ............................................................................................... 31 5.2.1

Tvorba pohlavních buněk – oogeneze ........................................................... 31

5.2.2

Sekrece pohlavních hormonů ........................................................................ 31

5.2.3

Homocystein a estrogen ................................................................................ 32

5

5.2.4

Homocystein a těhotenství............................................................................. 33

5.2.5

Metody asistované reprodukce - IVF ............................................................ 34

5.2.6

Syndrom polycystických ovarií (PCOS) ........................................................ 35

6 METODY DETEKCE HOMOCYSTEINU .............................................................. 36 6.1

VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) .............................. 37 6.1.1

HPLC s fluorescenční detekcí ....................................................................... 38

6.1.2

HPLC s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) ....................... 38

6.1.3

HPLC s elektrochemickou detekcí................................................................. 38

6.1.4

HPLC s fotometrickou detekcí....................................................................... 38

6.2

PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (GC-MS)...... 39

6.3

VYSOKOÚČINNÁ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA (HPCE) ..................................... 39

6.4

KOLORIMETRICKÉ METODY ..................................................................................... 39

6.5

IMUNOCHEMICKÉ METODY....................................................................................... 40 6.5.1

Radioenzymové stanovení ............................................................................. 40

6.5.2

Imunoenzymové metody (EIA) ....................................................................... 40

6.5.3

Fluorescenční polarizační imunometody (FPIA) .......................................... 40

7 ZÁVĚR.................................................................................................................................... 41 8 SEZNAM LITERATURY ............................................................................................... 42

6

SEZNAM ZKRATEK BHMT ........................................... betainhomocysteinmethyltransferasa 5-BMF ........................................... 5-bromomethylfluorescein CBS ................................................ cystathionin-β-syntasa CGS ............................................... cysteinylglycin CL .................................................. cystathioninlyasa DHFR............................................. dihydrofolátreduktasa dTMP ............................................. deoxythymidinmonofosfát DTT ............................................... dithiothreitol dUMP............................................. deoxyuridinmonofosfát FSH ................................................ folikuly stimulující hormon – folitropin GNPs .............................................. gold nanoparticles GnRH ............................................. gonadoliberin GPX ............................................... glutathionperoxidasa GSH ............................................... glutathion GTR ............................................... glutathionreduktasa HTL ............................................... homocystein thiolakton ISCI................................................ intracytoplasmatic spermia injection IVF ................................................. in vitro fertilizace LH .................................................. luteinizační hormon - lutropin LIF ................................................. laserem indukovaná fluorescence MAT .............................................. methioninadenosyltransfera MTHFR ......................................... methylentetrahydrofolátreduktasa MTR............................................... methyltransferasa NOX 5............................................ NADPH oxidasa PCOS ............................................. syndrom polycystických ovarií SAH ............................................... S-adenosylhomocystein SAHH ............................................ S-adenosylhomocysteinhydrolasa SAM............................................... S-adenosylmethionin SBD-F ............................................ amonium-7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-sulfonát SHMT ............................................ serin-hydroxymethyltransferasa SOD ............................................... superoxiddismutasa TBP ................................................ tri-N-butylfosfin TCEP ............................................. tris-(2-karboxylethyl)-fosfin tHcy ............................................... celkový homocystein THF................................................ tetrahydrofolát TS................................................... thymidylátsyntasa

7

1

ÚVOD Při léčbě pacientů je v současnosti kladen stále větší důraz na odstraňování příčin

jejich onemocnění, tyto postupy jsou označovány jako tzv. kauzální léčba. Tento druh léčby může být uskutečňován díky rozsáhlým vědeckým studiím, jimž se podařilo objasnit řadu patologických procesů, které doprovázejí dané onemocnění. Mezi tyto patologické procesy může být také zařazeno toxické působení aminokyseliny homocysteinu, který vzniká v buňkách z methioninu. Odbourávání homocysteinu probíhá dvěma metabolickými drahami – remethylací a transsulfurací. Významné látky zapojené do metabolismu homocysteinu jsou vitamíny B6, B12 a kyselina listová. Je-li v těle těchto látek nedostatek, odbourávání homocysteinu je narušeno a dochází k jeho kumulaci v těle. Vysoká hladina homocysteinu je spojována se vznikem řady onemocnění. Vliv homocysteinu na lidské zdraví byl poprvé studován v souvislosti s kardiovaskulárními onemocněními, dnes je spojován s řadou faktorů ovlivňující mnoho oblastí lidského zdraví. Cílem této práce bylo vypracovat literární rešerši o vlastnostech, metabolismu, metodách detekce homocysteinu a jeho vlivu na lidskou reprodukci.

8

2

HISTORIE Homocyst(e)in byl poprvé připraven a popsán Butzem a du Vigneaudem v roce

1932 jako produkt demethylace a následné oxidace esenciální aminokyseliny methioninu. Reakce byly prováděny v zahřívané koncentrované kyselině sírové (Přistoupilová et al., 1999). Pomocí dalších důkazových reakcí vědci zjistili, že molekula nově vzniklé sloučeniny obsahuje atomy síry v disulfidické formě a atomy dusíku jsou přítomny jako aminodusíky. Na základě těchto poznatků a elementární analýzy určili empirický vzorec sloučeniny – C8H16O4N2S2 a rozhodli, že se jedná o bis-(γ-amino-γ-karboxypropyl) disulfid, symetrický homolog cystinu. Díky tomuto vztahu navrhli pro sloučeninu název homocystin (Butz and du Vigneaud, 1932). Jeho redukovaná forma homocystein se v dalších letech stala předmětem mnoha výzkumů v různých oblastech. V roce 1962 byla provedena studie u mentálně retardovaných dětí, která popisovala zvýšenou koncentraci homocysteinu v moči – homocystinurii. O dva roky později Mudd et al. popsali, že tato metabolická porucha je způsobena deficitem cystathionin-β-syntasy (Wilcken and Wilcken, 2001). V roce 1969 McCully popsal u pacientů s homocystinurií patologické změny v cévním systému, např. proliferaci hladkých svalů, postupné zužování cév a hemostatické změny (Bolander-Gouaille and Bottiglieri, 2003). Dalším důležitým zjištěním přispěli k výzkumu kardiovaskulárních chorob Wilckenovi, kteří roku 1974 popsali výrazný sklon k žilní i arteriální trombóze při nedostatečné funkci cystathionin-βsyntasy (Erben, 2005). Z počátku devadesátých let pochází obsáhlé publikace McCullyho, které se věnují dalším oblastem základního výzkumu homocysteinu: 1. Homocystein ve vztahu k aterosklerose a kardiovaskulárním onemocněním, 2. Homocystein a nádory, 3. Homocystein a stárnutí. Dále McCully spolu s Olszewským položili základ pro zpochybnění cholesterolové teorie. U mužů s hypercholesterolemií pozorovali v krvi vyšší koncentraci částic LDL a homocysteinu než u jedinců s normální hladinou cholesterolu. Během roku 2000 se podařilo sloučit poznatky ze dvou okruhů výzkumu, a to výsledky studií základních chemických procesů probíhajících v lidských buňkách s poznatky o vzniku kardiovaskulárních a dalších civilizačních onemocnění. Ukázalo se, že ke vzniku kardiovaskulárních chorob dochází v důsledku poruch biochemických procesů v buňkách – poruch v procesech, v nichž vzniká a metabolizuje se homocystein (Erben, 2005). 9

3

VLASTNOSTI A FUNKCE HOMOCYSTEINU Homocystein,

2-amino-4-merkaptomáselná

kyselina,

patří

mezi

esenciální

aminokyseliny obsahující síru v podobě volné thiolové skupiny (–SH). Na rozdíl od svého nejbližšího homologa – cysteinu se nepodílí na výstavbě bílkovin (Refsum et al., 1998; Přistoupilová et al., 1999). Aminothioly (sloučeniny s volnou sulfhydrylovou skupinou a aminoskupinou) jsou prekurzory a meziprodukty mnoha metabolických drah a podílí se na udržování intra- a extracelulární redoxní homeostázy. Mezi nízkomolekulární biologické thioly patří také např. cystein, glutathion a koenzym A. Glutathion je tripeptid skládající se z kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu. Hojně se vyskytuje v intracelulárním prostředí jako součást antioxidačních systémů, kde plní funkci ochrany proti volným radikálům kyslíku (Ebisch et al., 2006). Cystein spolu s glutathionem patří mezi tzv. „dobré thioly“, které jsou poměrně známé a vyskytují se ve vyšších koncentracích. Homocystein je znám méně a vyskytuje se ve výrazně nižších koncentracích oproti ostatním thiolům. Jeho zvýšené množství v plazmě je spojeno např. s kardiovaskulárními chorobami, selháním ledvin, hypotyreózou1, defektem neurální trubice a kognitivními dysfunkcemi. Je tedy zřejmé, že vyšší koncentrace homocysteinu působí nepříznivě, a proto získal označení „ne tak dobrý thiol“. Prekurzorem cysteinu a homocysteinu je esenciální aminokyselina methionin, která patří z hlediska struktury mezi sulfidy, jejichž obecné označení je R–S–R’. Všechny tři sloučeniny mají podobnou strukturu (Jacobsen, 2001).

CH3 S CH2 CH2 + H3N C COO H

SH CH2 CH2 + H3N C COO H

SH CH2 + H3N C COO H

methionin

homocystein

cystein

Obr. 3.1 Struktura aminothiolů

1

snížená činnost štítné žlázy

10

Hlavní chemickou vlastností aminothiolů je schopnost se oxidovat v přítomnosti elektronakceptorního prvku (např. molekulárního kyslíku) za vzniku disulfidů, obecné struktury R–S–S–R’. Nové vazby, prostřednicvím kterých se homocystein váže na molekulu dalšího homocysteinu nebo ostatních thiolů, jsou vytvářeny mezi volnými sulfhydrylovými skupinami. Důležitou vlastností sulfhydrylových skupin je schopnost disociace vodíku a tvorba thiolátového aniontu (Jacobsen, 2001; Medina et al., 2001).

3.1

Formy homocysteinu v cirkulaci Homocystein se v plazmě vyskytuje ve formě oxidované a redukované.

Redukovaný homocystein (forma s volnou thiolovou skupinou) tvoří u zdravých jedinců méně než 2 % z celkového množství. Až 98 % homocysteinu je po transportu z buňky do plazmy během několika minut až hodin oxidováno (Chambers et al., 2001; Medina et al., 2001). Oxidace a autooxidace thiolů v plazmě probíhá v přítomnosti molekulárního kyslíku a při fyziologickém pH podle obecné rovnice 2RSH + O2 ↔ RSSR + H2O2. Reakce je katalyzována přechodnými kovy, mědí a kobaltem, a produktem je disulfid, peroxid vodíku a další kyslíkové radikály. Spojením dvou molekul homocysteinu, nebo-li autooxidací homocysteinu, vzniká disulfid homocystin. Homocystein může být oxidován dalšími sloučeninami, které obsahují sulfhydrylovou skupinu. Při této reakci vznikají tzv. smíšené disulfidy. Převažují především dvě formy – homocystein navázaný na cystein a homocystein vázaný na protein. Hlavním vazebným proteinem homocysteinu je albumin, který je tvořen 35 cysteinovými zbytky. V N-terminální části molekuly je přítomna volná sulfhydrylová skupina v pozici Cys34, s níž homocystein vytváří vazbu (Jacobsen, 2000; Jacobsen, 2001).

Redukované formy + NH3 homocystein < 2 %

- OOC

SH

11

Oxidované formy + NH3

+ NH3 homocystin 5 - 10 %

-

smíšené disulfidy cystein-homocystein 5 - 10 %

COO

S S

OOC

-

+ NH3 - OOC

S S

COO

-

+ NH3

protein-homocystein 80 - 90 %

protein

S S

COO

-

+ NH3 Obr. 3.2 Formy homocysteinu v cirkulaci (Jacobsen, 2000)

V plazmě existuje mezi těmito formami dynamická redoxní rovnováha. Suma všech redukovaných a oxidovaných forem homocysteinu v plazmě je označována jako hladina celkového homocysteinu – tHcy. Koncentrace tHcy se s věkem postupně zvyšuje. Novorozenci a děti do 11 let mají koncentraci 3 – 6 µmol.l-1, adolescenti 5 – 8 µmol.l-1, dospělí nižšího a středního věku 5 – 13 µmol.l-1 a u osob vyššího věku koncentrace převyšuje 10 µmol.l-1. Francouzská studie u stoletých jedinců uvádí hodnoty koncentrace tHcy mezi 25 a 27 µmol.l-1 (Jacobsen, 2001; Medina et al., 2001).

3.2

Transport homocysteinu Mechanismus přenosu homocysteinu přes buněčnou membránu není v současné

době zcela objasněn. Množství exportovaného homocysteinu závisí na metabolické kapacitě. Nerovnováha mezi tvorbou a metabolismem homocysteinu v buňce má za 12

následek jeho narůstající export do extracelulárního prostředí. Kultivace buněk v nadbytku methioninu vede ke zvýšenému exportu homocysteinu. Farmakologické a genetické studie dokazují, že rozhodující význam pro export homocysteinu při nízké koncentraci methioninu má aktivita enzymu methyltransferasy (MTR). Zatímco aktivita enzymu cystathionin-β-syntasy (CBS) ovlivňuje export při vysoké koncentraci methioninu (Ueland et al., 1993; Refsum et al., 1998; Jacobsen, 2001). In vitro studie ukazují větší produkci homocysteinu u množících se buňek a jeho nadměrný export připisují zvýšenému přísunu methioninu, nedostatku folátu nebo kobalaminu a narušení remethylace. Hepatocyty mají unikátní schopnost zvýšit příjem homocysteinu na základě koncentrace extracelulárního methioninu, zřejmě díky jejich schopnosti tvořit S-adenosylmethionin2. Všechny typy buněk ovšem nemají tuto schopnost využívat homocystein jako zdroj methioninu (Refsum et al., 1998). U zdravých jedinců je do plazmy během 24 hodin uvolněno přibližně 1,2 mmol homocysteinu, což odpovídá 5 – 10 % tHcy. Pouze nepatrné množství homocysteinu je vylučováno v nezměněné formě do moči, většina tHcy je tedy metabolizována (Refsum et al., 1998).

3.2.1

Přenašeče homocysteinu Podle Bloma (2000) je transport homocysteinu uskutečňován nejméně dvěma typy

přenašečů – přenašečem redukovaných forem homocysteinu a přenašečem oxidovaných forem homocysteinu. V buňkách je homocystein přítomen v redukované formě. Při nadbytku homocysteinu nedochází k jeho eliminaci vazbou na proteiny, ale pomocí přenašeče redukovaných forem je exportován do krevního oběhu. Zde je homocystein vlivem oxidačních podmínek přeměněn na disulfidy. Oxidované formy homocysteinu jsou pravděpodobně transportovány do buňky odlišnými systémy. Pro katabolismus homocysteinu jsou vybaveny hlavně buňky jater a ledvin, které budou k transportu využívat přenašeče, kanály nebo receptory rozpoznávající oxidované formy homocysteinu (Bloom, 2000; Fowler, 2001).

2

meziprodukt metabolismu homocysteinu, vznik popsán ve 4. kapitole

13

3.3

Toxicita homocysteinu Přestože je homocystein spojován s řadou patologických procesů, neexistuje

jednotná hypotéza o mechanismu jeho působení na molekulární a buněčné úrovni V současnosti je na molekulární úrovni navrhováno několik možných mechanismů: hypomethylace, inkorporace homocysteinu do řetězce proteinů označovaná jako N-homocysteinylace a tvorba volných radikálů. Volné radikály vznikající při oxidaci a autooxidaci homocysteinu (viz. kapitola 3.1) poškozují membrány, krevní destičky, lipoproteiny a leukocyty. Intracelulárně působí na endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát a oxid dusnatý (Jacobsen, 2001). S N-homocysteinylací úzce souvisí tvorba homocystein thiolaktonu (HTL). Z chemického hlediska se jedná o intramolekulární thioester homocysteinu, který je syntetizován methionyl-tRNA syntetasou a je přítomen ve všech typech buněk. Intramolekulární thioesterová vazba HTL je citlivá k reakci s nukleofily, konkrétně s volnými aminoskupinami lysinových zbytků v proteinech. Mechanismus reakce je založen na acylaci ε-NH2 skupiny lysinu aktivovanou karboxylovou skupinou HTL. N-homocysteinylace vede k poškození proteinů a následně ke ztrátě jejich funkce. HTL může inaktivovat trypsin a methionyl-tRNA syntasu nebo způsobuje agregaci fibrinogenu, hemoglobinu, myoglobinu, transferrinu nebo cytochromu c (McDowell and Lang, 2000; Jakubowski, 2001; Perla-Kaján et al., 2007)

NH2 O S Obr. 3.3 Homocystein thiolakton (Jakubowski, 2001)

Na buněčné úrovni je patologický vliv homocysteinu spojován se změnou funkce endoteliálních buněk. Tyto buňky jsou velmi citlivé i na mírně zvýšenou hladinu homocysteinu. Jejich citlivost můžeme vysvětlit skutečností, že endoteliální buňky nevytváří aktivní formu cystathionin-β-syntasy, a proto v nich nemůže probíhat katabolismus homocysteinu transsulfurační dráhou. Zvýšená hladina homocysteinu narušuje funkci cévního endotelu změnou jeho povrchu z antikoagulačního na prokoagulační. Homocystein také zvyšuje shlukování krevních destiček a aktivitu 14

koagulačních faktorů V, X a XII. Zároveň snižuje aktivitu proteinu C a expresi trombodulinu, čímž přispívá k rozvoji trombózy. Narušením produkce endotelinu-1, oxidu dusnatého a prostacyklinu ovlivňuje homocystein také vasodilataci cév. Další toxické účinky homocysteinu nejsou doposud zcela objasněny (Hajjar, 2001; Perna et al., 2003; Perla-Kaján et al., 2007).

15

4

METABOLISMUS HOMOCYSTEINU Prekurzorem homocysteinu v buňkách je aminokyselina methionin, kterou

organismus získává z potravy. Jeho metabolismus může poté pokračovat dvěmi drahami, remethylací a transsulfurací (Medina et al., 2001; Forges et al. 2007).

4.1

Remethylace Tato metabolická dráha zahrnuje dva navzájem propojené cykly, homocystein-

methioninový a folátový cyklus. Úkolem těchto cyklů je přenos methylových skupin, které jsou z vnějšího prostředí přinášeny foláty (Erben, 2005).

4.1.1

Homocystein-methioninový cyklus Hlavní reakcí tohoto cyklu je přeměna homocysteinu na methionin probíhající

prostřednictvím

přenosu

methylové

skupiny

z

N-5-methyltetrahydrofolátu

(N-5-

methylTHF). Reakci katalyzuje methyltransferasa [5-methyltetrahydrofolát-homocysteinS-methyltransferasa (MTR)], jejímž kofaktorem je kobalamin – vitamín B12. Kobalamin je příjemce methylové skupiny z N-5-methylTHF a postupně ji přenáší na MTR, která ji dále předává homocysteinu (Medina et al., 2001; Voet and Voet, 2004; Forges et al., 2007). Homocystein

může

být

také

remethylován

v játrech

pomocí

enzymu

betainhomocysteinmethyltransferasy (BHMT), který je nezávislý na folátech a vitamínu B12. Methylová skupina je v tomto případě na homocystein přenášena z betainu, který v organismu vzniká oxidací cholinu a lecithinu. Betain je v průběhu reakce přeměněn na dimethylglycin (Erben, 2005; Foges et al., 2007). H3C

oxidace

+

H3C N H3C

OH

cholin

H3C

+

H3C N H3C

COO -

betain

Obr. 4.1 Oxidace cholinu

16

Remethylací homocysteinu vzniká methionin, který může být dále včleněn do řetězce různých peptidů, nebo přeměněn na S-adenosylmethionin (SAM). Tato sloučenina je univerzálním donorem methylu při methylaci nukleových kyselin, bílkovin, polysacharidů, fosfolipidů, atd. a hraje tak klíčovou roli v buněčných procesech. SAM vzniká přenosem adenosylové skupiny z ATP na atom síry v molekule methioninu, za katalýzy methioninadenosyltransferasy (MAT). Síra získá po navázání adenosylu kladný náboj a aktivuje tak sousední methylovou skupinu, čímž se molekula stává reaktivnější (Voet and Voet, 2004; Foges et al., 2007). +

NH3

-OOC

+

NH3

- OOC

H

H

NH2

MAT

+

ATP

N +S

S

N

O

N + Pi + PPi N

H3C

H3C

OH

HO methionin

S-adenosylmethionin (SAM)

Obr. 4.2 Vznik SAM (Garrett and Grisham, 1995)

Aktivovaná methylová skupina je z molekuly SAM uvolněna a specifickými methyltransferasami přenesena na akceptor methylových skupin a výsledkem reakce je S-adenosylhomocystein (SAH) (Garrett and Grisham, 1995). Cyklus uzavírá reverzibilní reakce katalyzovaná S-adenosylhomocysteinhydrolasou (SAHH), při níž je SAH rozštěpen na homocystein a adenosin, který je využit při syntéze ATP. Homocystein je znovu methylován a cyklus se opakuje (Forges et al., 2007). +

NH3

-OOC H

NH2 N +

S

+

NH3

-OOC

O

N

H

NH2

N

N R-H

N

S

O

N

H3C HO

N

R- CH3

-OOC H2O

adenosin

+

NH3

H

N

SH

OH

HO

S-adenosylmethionin (SAM)

OH

S-adenosylhomocystein (SAH)

homocystein

Obr. 4.3 Přeměna SAM (Garrett and Grisham, 1995)

17

4.1.2

Folátový cyklus Hlavní roli v tomto sledu reakcí hraje aktivní forma kyseliny listové -

tetrahydrofolát (THF). Savci nedokáží kyselinu listovou syntetizovat, získávají ji potravou nebo od střevních mikroorganismů. Kyselina listová je oproti THF dvojnásobně oxidovaná, proto musí být enzymově redukována na aktivní molekulu. Obě redukce jsou katalyzovány dihydrofolátreduktasou (DHFR) za spoluúčasti NADPH + H+. Podstatou funkce THF je schopnost vázat C1 zbytky v různých oxidačních stavech a poskytovat je během dalších reakcí (Voet a Voetová, 1990). Struktura tetrahydrofolátu

THF je derivát 6-methylpterinu navázaný přes p-aminobenzoovou kyselinu na několik zbytků glutamátu. Na první glutamát se může navázat tzv. izopeptidovou vazbou nejvýše pět dalších zbytků kyselin glutamové, čímž se vytvoří polyglutamový řetězec (Voet a Voetová, 1990). COO-

H N

H2N

N

CH2

O

CH2

10

N

5

N

C N H2 H

N CH H COO-

H 2-amino-4-oxo-6-methylpterin

p-aminobenzoová kyselina

glutamát

pteroová kyselina tetrahydrofolát (THF) (pteroylglutamová kyselina)

Obr. 4.4 Struktura tetrahydrofolátu (Voet a Voetová, 1990)

Jednouhlíkaté zbytky jsou kovalentně vázány na N(5) nebo N(10) THF, popřípadě na oba současně. Tyto zbytky mohou být v různých oxidačních stavech, které mohou pomocí enzymově katalyzovaných redoxních reakcí přecházet jeden v druhý. Jednouhlíkaté zbytky vznikají převážně při přeměně serinu na glycin, která je katalyzována enzymem serinhydroxymethyltransferasou (SHMT), a při štěpení glycinu glycinsyntasou. Z THF při těchto přeměnách vzniká N-5,N-10-methylentetrahydrofolát. Navázané C1 zbytky mohou být dále využity k různým účelům:

18

1. přímo ve formě N-5,N-10-methylenTHF při přeměně deoxynukleotidu dUMP na dTMP katalyzované thymidylátsytasou (TS) 2. jsou oxidovány přes N-5,N-10-methenylTHF dále na N-10-formylTHF a použity při syntéze purinů 3. jsou redukovány na N-5-methylTHF a využity při přeměně homocysteinu na methionin (Voet a Voetová, 1990).

Pro průběh folátového cyklu je důležitá právě přeměna N-5,N-10-methylenTHF na N-5-methylTHF

katalyzovaná

FAD-dependentní

methylentetrahydrofolátreduktasou

(MTHFR). Methylová skupina z N-5-methylTHF je prostřednictvím kobalaminu přenesena na MTR a donor tohoto uhlíkového zbytku je přeměněn na THF. Touto reakcí je folátový cyklus uzavřen a THF může být opět metabolizován ve folátovém cyklu (Forges et al., 2007).

4.1.3

Propojení cyklů Z výše popsaných metabolických drah je zřejmé, že homocystein-methioninový a

folátový cyklus jsou propojeny remethylací homocysteinu a demethylací N-5-methylTHF. Jedná se tedy o klíčovou reakci obou cyklů, při které je methylová skupina přenesena kobalaminem z N-5-methylTHF na MTR, a odtud na homocystein (Forges et al., 2007). CH3

+

SH

S

CH2

CH2

CH2

+

H3N C COO H

CH2

H3N C COO H

-

methionin

homocystein

MTR B12

O

O

OH

HO HN

OH

HO HN

O

O

H2N

N H

N CH3

O

O

N

N

O

O

N

N NH

5-methyltetrahydrofolát

H2N

N H

N H

NH

tetrahydrofolát

Obr. 4.5 Reakce spojující homocystein-methioninový a folátový cyklus (Froges et al., 2007) (methylová skupina, která je přenášena kobalaminem a MTR je vyznačena červenou barvou)

19

4.2

Transsulfurace Prvním krokem této metabolické dráhy je kondenzace homocysteinu se serinem

katalyzovaná enzymem cystathionin-β-syntasou (CBS). Kofaktorem tohoto enzymu je pyridoxal-5-fosfát, aktivní forma vitamínu B6. Produktem této ireverzibilní reakce je cystathionin, který je v dalším kroku deaminován za účasti cystathioninlyasy (CL) na cystein a α-ketoglutarát. Kofaktorem je opět pyridoxal-5-fosfát (Forges et al., 2007). HO H

+

NH3

SH

COO

-

+

H2O

NH3

+

+

H

NH3

homocystein

COO

-

S

OOC

H

COO -

+

cystathionin

HS

O

+

NH4

H NH3

serin

H2O

H2O

+

-

OOC

CH3

H

+

+

NH3

alfa-ketoglutarát

COO

-

cystein

Obr. 4.6 Transsulfurace (Garrett and Grisham, 1995)

Cystein může být využit při proteosyntéze nebo je zapojen do metabolismu glutathionu, popřípadě je oxidován na taurin nebo anorganický síran. α-ketoglutarát je oxidační dekarboxylací přeměněn na propionyl-CoA a dále na sukcinyl-CoA (Garrett and Grisham, 1995; Medina et al., 2001).

4.3

Regulace metabolismu Centrální

roli

v koordinované

regulaci

metabolismu

homocysteinu

má

S-adenosylmethionin. Tato sloučenina je allosterickým inhibitorem MTHFR, in vitro také BHMT, a aktivátorem CBS. Schopnost SAM působit jako enzymatický efektor metabolismu homocysteinu poskytuje prostředky, kterými mohou být remethylace a transsulfurace koordinovány. Nízká hladina buněčného SAM vede k aktivaci MTHFR, zatímco aktivita CBS je potlačena. V této situaci je tedy výslednou cestou metabolismu homocysteinu převážně remethylace. Naopak v případě vyšší hladiny SAM je MTHFR 20

inhibována, CBS stimulována a převáží tedy cesta transsulfurace. Hladina buněčného SAM je primární faktor, který ovlivňuje regulaci metabolismu homocysteinu a to tak, že přispívá k udržování správné koncentrace homocysteinu koordinací podílů remethylace a transsulfurace. Koordinace je natolik jemná, že dokáže zabránit kumulaci homocysteinu a přitom zajišťovat biologicky nutný přísun methylových skupin (Medina et al., 2001; Erben, 2005).

21

Folát

POTRAVA

Dihydrofolát

ATP

Pi PPi

Methionin MAT

Tetrahydrofolát (THF)

Dimethylglycin

SAM

BHMT

X-H

Serin Betain

FOLÁTOVÝ SHMT

MTR B12

CYKLUS

X-CH3

CYKLUS SAH

Glycin 5-methylTHF

5,10-methylenTHF

TS

H2O

SAHH

MTHFR

Thymidin

Homocystein

FAD

Adenosin

dUMP

dTMP

DNA

MT

HOMOCYSTEINMETHIONINOVÝ

ATP

TRANSSULFURACE 5,10-methenylTHF Serin Purin

10-formylTHF

CBS

B6

Cystathionin

CL

alfa-ketoglutarát

O2

Taurin

O2

Cystein

2-

SO4

Glutathion

Obr. 4.7 Schéma metabolismu homocysteinu, (Ebisch et al., 2007, upraveno)

22

4.4

Poruchy metabolismu Vznikají narušením některé z metabolických drah. Mutace CBS nebo nedostatek

vitamínu B6 blokuje transsulfuraci a deficit folátu nebo vitamínu B12 způsobuje nedostatečnou remethylaci homocysteinu. Následkem těchto poruch je kumulace homocysteinu

v těle.

K hlavním

poruchám

metabolismu

homocysteinu

patří

homocystinurie a hyperhomocysteinemie (Forges et al., 2007).

4.4.1

Homocystinurie Vzácně se vyskytující onemocnění vzniklé mutací genu pro enzym CBS.

Onemocnění patří do skupiny dědičně metabolických poruch. Dědičnost homocystinurie je autosomálně recesivní a výskyt tohoto onemocnění v běžné populaci je 1:340 000. U pacientů s tímto onemocněním dochází k hromadění homocysteinu v tkáních a tělesných tekutinách – krvi a moči. Podle klinických příznaků a efektu léčby se rozlišují dvě formy onemocnění: 1. vitamín B6 senzitivní (reagující) – u této formy je částečná zbytková aktivita enzymu CBS, což umožňuje při podávání vitamínu B6 společně s dodržováním diety snížit u pacientů hladinu homocysteinu 2. vitamín B6 rezistentní (nereagující) – u této formy je prakticky nulová aktivita enzymu a pacienti na podávání vitamínu B6 nereagují. Neléčená homocystinurie může způsobovat celou řadu klinických příznaků, které se obvykle začínají projevovat v kojeneckém, batolecím nebo předškolním věku, po uplynutí zcela bezpříznakového období. Nejčastější příznaky jsou opoždění psychomotorického vývoje, obtíže s učením, těžká krátkozrakost přecházející do dislokace oční čočky, v některých případech až s rozvojem glaukomu, osteoporóza (odvápnění kostí), skolióza (vybočení páteře do strany), větší délka dlouhých kostí (v oblasti paží a nohou) (Ishida et al., 2001; Páterová et al., 2004). Cílem léčby je snížit příliš vysokou hladinu homocysteinu v organismu. Léčba této choroby obvykle spočívá v podávání nadměrných dávek vitamínu B6 a dodržování nízkobílkovinné diety s limitovaným množstvím methioninu. Některým pacientům je podáván betain pro zvýšení přeměny homocysteinu na methionin (Páterová et al., 2004).

23

4.4.2

Hyperhomocysteinemie Normální hladina homocysteinu se pohybuje mezi 5 a 15 µmol.l-1 a je ovlivněna

především věkem, pohlavím a životním stylem. Koncentrace nad 15 µmol.l-1 je označována jako hyperhomocysteinemie, která se podle množství tHcy v plazmě rozděluje do tří skupin: 1. mírná hyperhomocysteinemie

15 – 30 µmol.l-1

2. střední hyperhomocysteinemie

31 – 100 µmol.l-1

3. těžká hyperhomocysteinemie

> 100 µmol.l-1

Avšak již koncentrace tHcy nad 10 µmol.l-1 zvyšuje riziko kardiovaskulárních onemocnění. Těžká hyperhomocysteinemie je nejčastěji způsobena vrozenými genetickými defekty enzymů, které se účastní metabolismu homocysteinu. Příčiny mírné a střední hyperhomocysteinemie jsou různé např. nedostatek vitaminu B6, B12 nebo folátu, selhání ledvin, užívání některých léků, hypotyreóza nebo polymorfismus enzymu MTHFR. Hladina homocysteinu je také ovlivňována životním stylem – kouřením, konzumací kávy a alkoholu, stravovacími návyky a fyzickou aktivitou (Vollset et al., 2001; Carmel et al., 2003; Hillenbrand et al., 2008). Polymorfismus MTHFR

Jedná se o jednobodovou mutaci genu pro MTHFR. Podstatou mutace je výměna cytosinu za thymin v nukleotidu 677 (677C→T), která má za následek změnu alaninu na valin v pozici 222. Konečným důsledkem mutace MTHFR je vznik termolabilní formy tohoto enzymu, který má sníženou aktivitu až o 50 %. Proto je polymorfismus MTHFR spojován s mírnou hyperhomocysteinemií, která se projevuje především u homozygotů (TT677). Procentuální výskyt homozygotů je demograficky závislý (Rozen, 2001; Lee et al., 2005; Forges et al., 2007, Ananth et al., 2007). Hyperhomocysteinemie je spojena s mnoha onemocněními. Mezi nejvýznamnější patří kardiovaskulární, cerebrovaskulární a periferní vaskulární onemocnění. Dále selhání ledvin, hypotyreóza, rakovinná onemocnění, diabetes, deprese, Alzheimerova choroba, vrozené defekty neurální trubice a mnoho dalších (Carmel and Jacobsen, 2001). Popsat vliv homocysteinu u všech těchto chorob by bylo obsahově příliš náročné, a proto se ve své práci budu dále podrobněji věnovat vlivu homocysteinu na lidskou reprodukci. 24

5

HOMOCYSTEIN A LIDSKÁ REPRODUKCE Vzestupný

trend

k intenzivnímu zájmu

počtu

neplodných

párů

v posledních

desetiletích

vede

o problematiku etiopatogeneze lidské neplodnosti. Řada

fyziologických procesů v lidských gonádách je úzce vázána na lidský metabolismus homocysteinu a dalších thiolů.

5.1

Mužská reprodukce Homocystein nepůsobí na mužskou reprodukci přímo (sám o sobě), ale

prostřednictvím svých toxických mechanismů, především pak oxidačním stresem. Dále je mužská plodnost ovlivňována koncentrací vitamínů B6, B12 a folátu.

5.1.1

Tvorba pohlavních buněk - spermatogeneze Pohlavní buňky se tvoří v semenotvorných kanálcích varlat (testes). Opakovaným

mitotickým dělením spermatogonií (buňky zárodečného epitelu) vznikají primární spermatocyty, které podléhají redukčnímu dělení – meióze. Vytvořené sekundární spermatocyty, spermatidy a posléze spermie obsahují pouze poloviční počet chromosomů – 22 somatických a 1 pohlavní X nebo Y chromosom. Celý proces generace pohlavních buněk trvá asi 70 dnů. Díky prvnímu mitotickému dělení vznikají dvě nové spermatogonie – jedna se vyvíjí v 16 zralých spermií, druhá je základem nové spermatogeneze. Tím je zajištěna nevyčerpatelnost spermatogonií pro spermatogenezi. Vyvíjející se spermie jsou vyživovány Sertoliho buňkami, se kterými jsou v těsném kontaktu. Zralé spermie jsou zadržovány v nadvarleti (epididymis), kde se mísí s hlenovitým sekretem a získávají zde pohyblivost nutnou pro oplození vajíčka. Ve funkčním stavu jsou zde spermie uchovávány až 40 dní (Trojan et al., 2003). Vyzrálá spermie je tvořena hlavičkou, krčkem a bičíkem. V hlavičce spermie jsou nahromaděny chromosomy obklopené malým zbytkem cytoplazmy, jejíž větší část přešla do cytoplazmy Sertoliho buněk. Vnější 2/3 hlavičky jsou kryty akrosomem, ve kterém jsou obsaženy proteolytické enzymy, hlavním z nich je hyaluronidáza, umožňující vniknutí spermie do vajíčka. V krčku spermie jsou přítomny mitochondrie, které vytvářejí energii (ATP) nezbytnou pro pohyb spermií. Rychlost pohybu spermií závisí na vlastnostech prostředí (např. na pH). Udává se hodnota 1 – 4 mm za minutu (Trojan et al., 2003). 25

Abnormální morfologie spermií je jednou z příčin neplodnosti. Na obrázku 5.2 vlevo je spermie s normální morfologií. Dále následují spermie abnormálního tvaru: s malým akrozómem, spermie se dvěma hlavičkami, spermie s vakuolou v hlavičce, spermie s kulatou hlavičkou, s kulatou hlavičkou bez akrozómu, se zúženou hlavičkou, hruškovitou hlavičkou a se dvěma bičíky (www.repromeda.cz).

Obr. 5.1 Stavba spermie (www.sci.muni.cz)

5.1.2

Obr. 5.2 Tvary spermií (www.repromeda.cz)

Vliv vitamínů B6, B12 a kyseliny listové Spermatogeneze je ovlivněna kombinací endokrinních, genetických a vnějších

faktorů. Mezi vnější faktory patří především výživa a životní styl. Nedostatečný příjem vitamínů B6, B12 a kyseliny listové má za následek narušení metabolismu homocysteinu a vznik mírné hyperhomocysteinemie, která působí na spermatogenezi negativně (Wong et al., 2002). Králíková et al. (2005) jako první provedli studii, jejíž cílem bylo stanovit koncentraci homocysteinu, vitamínu B12 a kyseliny listové v seminální tekutině. Koncentrace těchto látek byla měřena u zdravých mužů a u mužů s azoospermií3. Hladina homocysteinu a vitamínu B12 byla výrazně vyšší u zdravých mužů. Tentýž vztah byl nalezen u kyseliny listové, rozdíl však nebyl tak výrazný. Nižší hladina homocysteinu u azoospermických pacientů zřejmě svědčí o celkově snížené testikulární metabolické aktivitě u těchto mužů. 3

porucha, při které nejsou v ejakulátu přítomny zralé spermie

26

Boxmeer et al. (2007) provedli studii u mužů, kteří se účastnili IVF4 nebo ICSI5. Cílem studie bylo zjistit a porovnat koncentraci folátu, kobalaminu, pyridoxinu a homocysteinu v krvi a seminální tekutině. Analýza spermatu zahrnovala koncentraci, pohyblivost a morfologii spermií podle kritérií Světové zdravotnické organizace (WHO).

Tabulka 5.1.1 Normální spermiologické hodnoty dle WHO (www.sexuologie.cz, www.repromeda.cz)

Objem ejakulátu

2,0 a více ml

pH

7,2 – 8,0

Koncentrace spermií

20 milionů v ml

Celkový počet spermií

40 milionů a více

Pohyblivost

50 % spermií s pohybem vpřed nebo rychle vpřed; nebo 25 % s pohybem rychle vpřed

Morfologie

30 % a více normálních forem

Vitalita

75 % a více živých spermií

Výsledky této studie potvrzují nižší koncentraci kobalaminu u mužů s oligospermií6 než u mužů s normální koncentrací spermií. Dříve se předpokládalo, že kobalamin ovlivňuje zrání spermií (Watson, 1962). Tato studie však vztah mezi morfologií spermií a koncentrací kobalaminu nepotvrdila. Dále tato studie vyvrátila vzájemný vztah vitamínů skupiny B a tHcy v seminální tekutině a jejich souvislost se spermiologickými hodnotami. Byla ale zjištěna pozitivní korelace mezi koncentrací folátu v krvi a seminální plazmě. Výsledky této studie naznačují přenos folátu a kobalaminu z krve do mužských reprodukčních orgánů a zdůrazňují roli kobalaminu ve spermatogenezi. Kubešová et al. (2007) stanovovali koncentraci homocysteinu, folátu a vitamínu B12 v seminální tekutině u mužů s oligoasthenoteratozoospermií7, azoospermií a normospermií8. Významně vyšší koncentrace stanovovaných látek byla naměřena u mužů s normospermií než u mužů s oligoasthenoteratozoospermií a azoospermií. U mužů

4

in vitro fertilizace – mimotělní oplodnění probíhající ve zkumavce

5

intracytoplasmatic spermia injection - technicky náročná metoda určená k léčbě neplodnosti v případech, kdy muž produkuje velmi malé množství spermií, které nestačí ani k přirozenému, ani k mimotělnímu oplodnění

6

snížené množství spermií v ejakulátu, snížená tvorba spermií

7

smíšená porucha počtu, pohyblivosti a morfologie spermií

8

normální ejakulát dle předepsaných norem

27

s normospermií byla také prokázána negativní korelace mezi folátem a homocysteinem. Ve skupině mužů s azoospermií byla zjištěna nižší hladina homocysteinu. Tyto výsledky potvrzují sníženou metabolickou aktivitu testikulární tkáně u azoospermických mužů, která byla zjištěna ve studii Králíkové et al. (2005). Foláty v mužském pohlavním ústrojí

Seminální tekutina je směs sekretů různých tzv. pomocných žláz v mužském pohlavním ústrojí. Wallock et al. (2001) měřili koncentraci folátů v seminální tekutině a krevní plazmě u zdravých jedinců a zjistili, že koncentrace folátů v seminální tekutině významně koreluje s koncentrací folátů v krevní plazmě. Střední hodnota koncentrace folátů v seminální tekutině byla 18 nmol.l-1 a v krevní plazmě 10 nmol.l-1. Dále bylo zjištěno, že 74 % folátů v seminální tekutině tvoří 5-methylTHF a 26 % nemethylované THF. Právě koncentrace nemethylovaných THF v seminální tekutině významně souvisí s počtem spermií a má významnou úlohu při spermatogenezi a zrání spermií (Tamura and Picciano, 2006 ; Forges et al., 2007). Vliv na mužskou plodnost má také polymorfismus MTHFR. Výskyt fenotypu 677CT pro MTHFR byl 19 % u neplodných mužů a 10 % u plodných mužů. Dále bylo zjištěno, že počet spermií u mužů se standardním fenotypem 677CC se po dávkách kyseliny listové a zinku zvýšil. Muži s fenotypy 677TT a 677CT na dávky těchto látek nereagovali. Zatím však nebyl potvrzen kauzální vztah mezi mužskou neplodností a různými fenotypy genu pro MTHFR (Bezold et al., 2001; Ebisch et al., 2003; Forges et al., 2007).

5.1.3

Vliv oxidačního stresu Nadměrnou produkcí volných radikálů dochází k porušení oxidační rovnováhy a

vzniká oxidační stres, jehož následkem je mnoho patologických procesů (viz. kapitola 3.3). Právě oxidace homocysteinu za katalýzy přechodných kovů je jeden z faktorů vyvolávající vznik volných radikálů (Zarghami and Khosrowbeygi, 2005; Tremellen, 2008). Patologické procesy působení volných radikálů jsou příčinou 30 – 80 % případů mužské neplodnosti. Volné radikály působí na spermie a tím i mužskou (ne)plodnost dvěma klíčovými mechanismy. Prvním z nich je oxidace nenasycených mastných kyselin v membráně spermií a následné poškození mitochondrií, které vede ke snížení pohyblivosti

28

spermií a narušení jejich schopnosti proniknout do vajíčka. Druhým mechanismem působení volných radikálů je přímé poškození DNA ve spermiích. Hlavnímí zdroji volných radikálů ve spermatu jsou leukocyty (převládají neutrofily) a spermie. Rychlost produkce volných radikálů je u leukocytů 1000 x vyšší než u spermií při kapacitaci (Tremellen, 2008). Na druhé straně produkce malého množství volných radikálů spermiemi je nutná pro jejich správnou funkci. Tato produkce má pozitivní účinky při kapacitaci spermií. Peroxid vodíku stimuluje reakci akrosomu a aktivitu spermií a napomáhá tak při oplodnění vajíčka. Posiluje vazbu membrány spermií na protein ZP-3 zóny pellucida9 a podporuje tím fúzi spermie-vajíčko. Schopnost spermií produkovat určité množství volných radikálů byla zjištěna díky separačním technikám, které oddělily spermie od seminálních leukocytů (Barker et al., 2003). Produkce volných radikálů spermiemi nepřímo koreluje s jejich zráním – spermatogenezí. Během spermatogeneze ztrácí spermie cytoplazmu, což jim umožňuje tvořit jejich kondenzovaný prodloužený tvar. Nezralé teratozoospermie10 jsou charakterizované přítomností nadměrného množství cytoplazmatických zbytků. Tyto zbytky obsahují enzym glukosa-6-fosfátdehydrogenasu, který kontroluje tok glukosy a intracelulární produkci NADPH pomocí monofosfátu hexosy. NADPH je využíváno jako zdroj při generaci volných radikálů prostřednictvím NADPH oxidasy, která je lokalizována v membráně spermií. Následkem toho produkují teratozoospemické spermie zvýšené množství volných radikálů oproti morfologicky normálním spermiím (Tremellen, 2008). Aktivita kalcium dependentní NADPH oxidasy, která je označována jako NOX 5 není ve spermiích, narozdíl od leukocytů, řízena proteinkinasou C. Spojitost mezi výskytem NOX 5 ve spermiích neplodných mužů a oxidativním stresem zatím nebyla potvrzena (Armstrong et al., 2002). Lidské tělo má mnoho různých antioxidačních mechanismů, kterými zajišťuje svou ochranu a udržuje oxidační rovnováhu, při níž nedochází k poškození buněk. Seminální tekutina a samy spermie disponují řadou ochranných antioxidantů, které můžeme rozdělit na enzymatické a neenzymatické (Garrido et al., 2004a; Valko et al., 2007) Mezi enzymatické antioxidanty můžeme zařadit superoxiddismutasu (SOD) a katalasu, které rozkládají superoxidový anion (O2•−) a peroxid vodíku na vodu a kyslík. SOD je přítomna v seminální tekutině i ve spermiích. Zini et al. (2000) potvrdili vztah

9

blanka pokrývající zralé vajíčko

10

spermie, které nemají normální tvar

29

mezi deficitem SOD a mužskou neplodností. Dále patří mezi enzymatickou antioxidační obranu glutathionperoxidasa (GPX). Tento enzym se skládá ze souboru antioxidantů GPX1 – 5, které jsou využívány jako zdroj elektronů při redukci hydroperoxidů. GPX se nachází ve varlatech, prostatě, semenných váčcích, chámovodech, nadvarlatech, seminální tekutině a také ve spermiích. Také u GPX byla prokázána spojitost s mužskou neplodností. Aktivita GPX závisí na regeneraci glutathionu, který je redukován glutathionreduktasou (GTR). Selektivní inhibice GTR snižuje dostupnost redukovaného glutathionu udržujícího aktivitu GPX a spermie jsou tak vystaveny oxidačnímu stresu. Koordinovaná aktivita GPX, GTR a glutathionu hraje nepochybně klíčovou roli v ochraně spermií před oxidačním stresem (Therond et al., 1996; Giannattasio et al., 2002; Garrido et al., 2004b; Vernet et al., 2004; Williams and Ford, 2004). Neenzymatické antioxidanty ve spermatu zahrnují kyselinu askorbovou (vitamín C), α-tokoferol (vitamín E), aminokyseliny taurin a hypotaurin, albumin, karnitin, karotenoidy, flavonoidy, uráty a prostasomy. Mnoho studií potvrdilo výrazně nízkou aktivitu neenzymatických antioxidantů u neplodných mužů ve srovnání s plodnými muži (Gurbuz et al, 2003; Koca et al., 2003; Mostafa et al., 2006; Song et al., 2006). Významnou část neenzymatických antioxidantů tvoří glutathion (GSH). Vychytává volné radikály a tím dochází k jeho oxidaci a vzniku disulfidu, který je důležitý pro pohyblivost spermií a ochranu jejich DNA před fyzikálním a chemickým poškozením. Je-li koncentrace GSH vysoká dochází k nadměrnému vychytávání volných radikálů, jejichž množství tím klesne pod fyziologickou hranici, která je nutná pro normální funkci spermií a úspěšné oplodnění (Bedaiwy et al., 2004; Ebisch et al., 2006). Ebisch et al. (2006) stanovovali účinek volných radikálů a thiolů na fyziologické a patologické procesy probíhající při oplodnění. Cílem jejich studie bylo stanovit a porovnat mezi sebou koncentraci glutathionu, cysteinu, homocysteinu a cysteinylglycinu (CGS) v ejakulátu, purifikovaných spermiích a folikulární tekutině párů, které podstoupili asistované reprodukční technologie IVF nebo ICSI. Koncentrace thiolů byla vyšší v ejakulátu oproti purifikovaným spermiím, to potvrzuje antioxidační ochrannou funkci seminální tekutiny; dále byla stanovena vyšší koncentrace thiolů ve spermiích neplodných mužů ve srovnání s plodnými muži; byl nalezen vztah mezi koncentrací homocystein

30

v ejakulátu a kvalitou embryí11 u IVF/ICSI – vysoká koncentrace homocysteinu v ejakulátu má spojitost se střední/nízkou kvalitou embryí. Role homocysteinu v mužské reprodukci není zcela objasněna a další možné mechanismy jeho působení jsou v současnosti předmětem mnoha odborných studií (Tamura and Picciano, 2006; Boxmeer, 2007; Ebisch et al., 2007; Forges et al., 2007).

5.2

Ženská reprodukce Účast

hyperhomocysteinemie

na

vzniku

kardiovaskulárních

onemocnění

inspirovala gynekology, porodníky a neonatology k ověření vlivu homocysteinu na různé oblasti ženské reprodukce (Erben, 2005).

5.2.1

Tvorba pohlavních buněk – oogeneze Pohlavní buňky se tvoří v ovariích postupným vývojem z buněk zárodečného

epitelu – oogonií. Počet oogonií se mitotickým dělením zvyšuje a je definitivně určen mezi 20. – 24. týdnem prenatálně, kdy dosahuje 6 – 7 milionů buněk. Pak už jejich počet pouze klesá. Obnova, na rozdíl od spermatogonií, není možná (Trojan et al., 2003).

5.2.2

Sekrece pohlavních hormonů Na rozdíl od muže mají funkce reprodukčního systému ženy cyklický charakter,

který je dán hormonální souhrou mezi hypotalamem, adenohypofýzou, vaječníky a dělohou. Proto u ženy rozeznáváme tři synchronní spolu související cykly – hypotalamický (primární), ovariální (ovulační) a děložní (endometriální – menstruační). Hypotalamický cyklus zajišťuje tvorbu folitropinu – folikuly stimulující hormon (FSH) a lutropinu – luteinizačího hormonu (LH). Vlivem FSH a LH se ve vaječnících tvoří pohlavní hormony – estrogeny, gestageny a androgeny12. Mezi nejúčinnější estrogeny patří estradiol a nejdůležitějším gestagenem je progesteron (Trojan et al., 2003).

11

hodnotí se početnost buněk, jejich pravidelnost, množství fragmentů a stav jader jednotlivých buněk (blastomér) embrya

12

mužské pohlavní hormony – malé množství vzniká také u žen, způsobuje u nich mj. ochlupení v podbřišku a v podpaží

31

5.2.3

Homocystein a estrogen Ve věku 25 – 55 let umírá v důsledku kardiovaskulárních onemocnění 5 – 8x více

mužů ve srovnání se ženami. Avšak po menopauze se tento rozdíl značně snižuje. Je tedy zřejmé, že do menopauzy mají ženy ochranné faktory endotelu cév, které se po menopaze ztrácí. Dřívější studie ukázala snížení rizika infarktu myokardu u žen po menopauze, které podstoupili estrogenovou substituční léčbu (Barrett-Connor a Bush, 1991). Ochrana cév byla tedy připsána právě ženskému hormonu estrogenu. Původně se předpokládalo, že ochranné účinky estrogenu souvisí s jeho působením na metabolismus cholesterolů a lipidů. Nicméně výsledky studie, které se zabývaly vlivem estrogenové substituční léčby u žen s již diagnostikovanou aterosklerózou, tuto teorii nepotvrdily. Stav žen se nezlepšil, přestože hladina cholesterolu a lipidů byla snížena (Hulley et al., 1998). V roce 2001 Dimitrova et al. sledovali in vitro a in vivo ochranu cév před poškozením. Estrogen snížil hladinu homocysteinu u experimentálně vyvolané hyperhomocysteinemie. Mijatovic a van der Mooren (2001) vytvořili přehled studií, které popisovaly vliv estrogenu na hladinu homocysteinu. Většina z nich potvrdila inhibiční účinek estrogenu na produkci homocysteinu. Vysoká koncentrace homocysteinu má za následek tvorbu volných radikálů, které poškozují cévní endotel. Estrogen zvyšuje hladinu glutathionu, který volné radikály vychytává a snižuje tak jejich hladinu. Dále estrogen pravděpodobně zvyšuje aktivitu cystathionin-β-syntasy,

následkem

toho

převládne

v metabolismu

homocysteinu

transsulfurace (Dimitrova et al., 2002; Ebisch et al., 2006; Forges et al., 2007). Hladina homocysteinu se vlivem estrogenu mění také v průběhu menstruačního cyklu. Tallová et al. (1999) měřili koncentraci homocysteinu u 15 žen před menopauzou během luteální a folikulární fáze menstruačního cyklu. Vyšší hladina tHcy byla zjištěna během folikulární fáze ve srovnání s fází luteální, kdy výrazně stoupá hladina steroidních hormonů. Při sledování vlivu estrogenu na tHcy byly zjištěny tři základní rozdíly: 1) koncentrace tHcy u žen byla významně nižší než u mužů stejného věku; 2) ženy před menopauzou měli nižší koncentraci tHcy v porovnání se ženami po menopauze a 3) u těhotných žen byla stanovena výrazně nízká hladina tHcy (Morris et al., 2000; Eskes, 2001).

32

5.2.4

Homocystein a těhotenství Těhotenství je charakteristické řadou fyziologických změn, jako je rapidní zvýšení

hladiny prakticky všech hormonů, krevního a srdečního objemu, periferní vazodilatace, ledvinové clearance a tělesné váhy. Díky těmto změnám je těhotenství unikátním „studijním modelem“. Změny se týkají také homocysteinu, jehož hladina je v plazmě těhotných žen o 50 – 60 % nižší než už žen netěhotných. Přesněji tHcy je nejnižší ve druhém trimestru těhotenství. Přesný mechanismus snížení tHcy během těhotenství není znám. Možným vysvětlením je naředění krve zvětšením jejího objemu, produkce steroidních hormonů, zvýšení ledvinové clearance homocysteinu, snížení hladiny albuminu nebo zvýšené nároky rostoucího plodu na dávky methioninu (Eskes, 2001; Powers et al., 2004; Holmes et al., 2005). Nízká hladina tHcy spolu s vysokou koncentrací methioninu v plodové vodě naznačují převahu remethylace nad transsulfurací ve fetálním metabolismu homocysteinu. V plodové vodě byla také stanovena vysoká koncentrace folátu a kobalaminu, které jsou pro remethylaci esenciální, a potvrdily tak významnou roli této metabolické dráhy při růstu a vývoji embrya (Eskes, 2001; Tamura and Picciano, 2006). Během těhotenství výrazně klesá koncentrace folátu v krvi a je nutné zvýšit příjem této látky, která má v těhotenství velký význam. Snížení koncentrace folátu může představovat fyziologickou reakci na těhotenství. Možné příčiny jsou následující: zvýšený požadavek folátu rostoucího plodu a uteroplacentárních orgánů, zvětšení objemu krve, zvýšení katabolismu folátu, zvýšení folátové clearance, snížená schopnost absorpce folátu, hormonální vliv na metabolismus folátu a nízký příjem folátu. Nedostatek folátu je spojen s mnoha komplikacemi v průběhu těhotenství. Negativně ovlivňuje růst a vývoj plodu, ženy s nízkou hladinou folátu májí vyšší riziko potratů ve srovnání se ženami s normální koncentrací folátu. A je hlavní příčinou vrozených vývojových vad uzavírání neurální trubice v ranném stádiu těhotenství. Defekty postihují buď mozkovou část neurální trubice, pak jsou většinou neslučitelné se životem, nebo postihují koncovou část a figurují jako spina bifida13. Tyto poruchy jsou ukázkou následků nedostatku stavebního materiálu pro syntézu bílkovin v místech intenzivního růstu tkání. Obzvláště těhotné ženy by tedy měly dbát na dostatečný příjem kyseliny listové, která působí jako prevence proti těmto

13

vrozený rozštěp páteře, při kterém nejsou uzavřeny obratlové oblouky a mícha se svými obaly vystupuje ven z páteřního kanálu

33

komplikacím a poruchám (Eskes, 2001; van der Put et al., 2001; George et al., 2002; Erben, 2005; Tamura and Picciano, 2006).

5.2.5

Metody asistované reprodukce - IVF Léčba

neplodnosti

pomocí

metod

asistované

reprodukce

je

jednou

z

nejprogresivnějších oblastí moderní medicíny. Od narození prvního dítěte ze zkumavky v roce 1978 (Louise Brownová, která se narodila ve Velké Británii díky péči slavných průkopníků Edwardse a Steptoea) došlo v oblasti výzkumu a diagnostiky neplodnosti a ve vývoji léčebných postupů k obrovským pokrokům (www.neplodnost.cz). Při dobrém spermiogramu probíhá tzv. „klasická IVF metoda“, při které jsou vajíčka kultivována společně se spermiemi ve speciálním médiu a kontrolována, zda dochází k samovolnému oplození „ve zkumavce“. Pokud jsou parametry spermiogramu nedostačující je nutné použít tzv. mikromanipulační techniku ICSI. Po oplodnění následuje tvz. embryotransfer - přenos embrya do dělohy (www.ivf-motol.cz; www.iscare.cz).

Obr. 5.3 Postup při IVF (www.ivf-motol.cz)

Vliv hyperhomocysteinemie na IVF

Úspěšné těhotenství je silně ovlivněno správným vývinem a funkcí placenty. Správná funkce placenty může být porušena zvýšeným rizikem trombózy v důsledku přítomnosti mikrotrombů v cévním řečišti placenty. Tyto mikrotromby mohou způsobovat četné placentální infarkty a následné komplikace v těhotenství. Několik studií prokázalo, že opakující se potraty jsou spojeny se zvýšeným rizikem trombózy, které je způsobeno 34

dědičnými trombofilickými poruchami nebo hyperhomocysteinemií, popřípadě kombinací obou. Hyperhomocysteinemie se tak stává rizikovým faktorem pro potraty nebo předčasné odloučení placenty. Bylo zjištěno, že hyperhomocysteinemie zvyšuje riziko potratů až 3x a je spojena s poškozením DNA a expresí genů, které způsobuje porušení cévního zásobení obalu plodu a následnou smrt embrya. Hyperhomocysteinemie a s ní spojené cévní onemocnění jsou pravděpodobně způsobené interakcí nutričních a genetických faktorů – např. podvýživa a porucha vstřebávání folátu a vitamínu B12 nebo vrozené defekty enzymů. Zvýšená hladina homocysteinu může vést k poškození deciduálních14 nebo chorionických15 cév a bránit tak nidaci oplodněného vajíčka (Unfried et al., 2002; Azem et al., 2004; Qublan et al., 2006). Pacchiarotti

et

al.

(2007)

provedli

studii

založenou

na

hypotéze,

že

hyperhomocysteinemie může být významný rizikový faktor neúspěšné nidace oplodněného vajíčka u pacientů, kteří podstoupili IVF. Cílem studie bylo zhodnotit účinek hyperhomocysteinemie na výsledek IVF – podíl těhotenství, nidací a potratů. Studie se zúčastnilo 46 neplodných párů, který byly náhodně rozděleny do 2 skupin: studijní skupina A a kontrolní skupina B. Pacienti ve skupině A podstoupili léčbu spočívající v denních dávkách kyseliny listové (400 µg), týdenních dávkách cyanokobalaminu (5000 µg) a hydrochloridu pyridoxinu (600 µg). Léčba trvala až do normalizace hladiny homocysteinu < 17 µmol.l-1. Skupina B byla bez léčby. Počet nidací a těhotenství byl výrazně snížen u skupiny pacientů bez léčby. Statisticky významný rozdíl byl nalezen v počtu potratů, který byl nižší u pacientů se sníženou hladinou homocysteinu před IVF. Výsledky studie tedy potvrdili hypotézu o hyperhomocysteinemii jako rizikovém faktoru koagulačních dysfunkcí, které mohou být příčinou vzniku mikrotrombů v děložních cévách, následkem kterých může dojít k potratům nebo je bráněno nidaci oplodněného vajíčka.

5.2.6

Syndrom polycystických ovarií (PCOS) Onemocnění je definováno jako zvýšená hladina androgenů v kombinaci

s nepravidelným menstruačním cyklem ve smyslu oligomenorey16 nebo sekundární amenorey17. Syndrom se projevuje širokou škálou klinických příznaků a endokrinních či

14

děložní sliznice v těhotenství

15

chorion – vnější obal plodu

16

slabé krvácení při menstruaci

17

nedostavení se menstruace

35

metabolických abnormalit. S největší pravděpodobností patří k nejčastějším endokrinním onemocněním žen ve fertilním věku. Jeho etiologie a patofyziologie však nejsou stále přesně objasněny (Cibula et al., 2004). Byl zjišťován vztah mezi hladinou homocysteinu, hormonů a inzulinové rezistence u žen s PCOS v porovnání se zdravými ženami. Vrbíková et al. (2003) zjistili významně vyšší koncentraci homocysteinu u žen s PCOS, a zároveň potvrdili pozitivní korelaci mezi koncentací homocysteinu a androgenu. Na druhé straně nebyla nalezena spojitost mezi hladinou homocysteinu, inzulinovou rezistencí a estradiolem. Koncentrace homocysteinu byla v uvedených studiích stanovována pomocí různých metod. Jejich stručnému přehledu je věnována poslední kapitola této práce.

36

6

Metody detekce homocysteinu Vzhledem k příbuzné struktuře homocysteinu a cysteinu je kladen velký důraz na

analytické metody, které musí být dostatečně specifické pro homocystein. Další překážkou při stanovování homocysteinu je jeho vazba na proteiny. U většiny analytických metod se tak před vlastním měřením provádí redukce vzorků, která homocystein z těchto vazeb uvolní. K nějčastěji používaným redukčním činidlům patří tri-N-butylfosfin (TBP), tris-(2karboxylethyl)-fosfin (TCEP), tetrahydroboritan sodný (NaBH4) a dithiothreitol (DTT). Některé metody zahrnují ve svém postupu také derivatizační reakce (Humplíková et al., 2007). Vliv na stanovení koncentrace homocysteinu v plazmě má také teplota, při které je odebraný vzorek krve před provedením analýzy uchováván. V odebrané plné krvi se při pokojové teplotě koncetrace homocysteinu zvyšuje. Důvodem je uvolňování homocysteinu z krevních buněk. Koncentrace tHcy se zvýší příbližně o 5 – 15 % za hodinu. Tomuto efektu je možné zabránit centrifugací vzorků do 1 hodiny po odběru nebo umístěním vzorků do ledové lázně. In vivo nemají krevní buňky na koncentraci homocysteinu vliv (Ueland et al., 1993; Refsum et al., 1998; Rasmussen and Møller, 2001). Dříve

byla

koncentrace

homocysteinu

stanovována

nejčastěji

pomocí

iontoměničového aminokyselinového analyzátoru nebo radioenzymové metody. Nyní se homocystein stanovuje především pomocí HPLC a imunochemických metod (Rasmussen and Møller, 2001; Amarnath et al., 2003; Sawula et al., 2008).

6.1

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) HPLC je dnes nejčastěji používaná metoda pro stanovení homocysteinu v krvi.

Jednotlivé typy HPLC se od sebe liší použitím různých druhů redukčních a derivatizačních činidel a detekčními způsoby (Rasmussen and Møller, 2001). V následujícím přehledu jsou uvedeny nejpoužívanější způsoby stanovení homocysteinu pomocí HPLC metod.

37

6.1.1

HPLC s fluorescenční detekcí U této metody se provádí předkolonová derivatizace thiolů fluorogenními látkami,

následuje HPLC a fluorescenční detekce. Mezi nejčastěji používané fluorogenní látky patří amonium-7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-sulfonát (SBD-F). K výhodám metody patří stabilita sloučenin thiolů s SBD-F a jejich vysoká fluorescence (Rasmussen and Møller, 2001; Ashavaid et al., 2003).

6.1.2

HPLC s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) Tato metoda byla vyvinuta pro analýzu tHcy v plazmě a v moči. Jako redukční

činidla jsou používány DTT nebo NaBH4 a konečná analýza je prováděna LC-MS/MS. Metoda patří mezi vysoce selektivní, specifické a časově nenáročné techniky a je vhodná pro rutinní stanovení hladiny tHcy v plazmě. Obchází časově náročné derivatizace, které jsou nezbytné při stanovení hladiny homocysteinu HPLC s fluorescenční detekcí a umožňuje tak analyzovat větší množství vzorků (Magera et al., 1999; Humplíková et al., 2007).

6.1.3

HPLC s elektrochemickou detekcí Přítomnost thiolové skupiny v molekule homocysteinu umožňuje detekci založenou

na oxidačně-redukčních reakcích. Tato metoda nevyžaduje derivatizaci vzorku. K nevýhodám patří možnost kontaminace průtokové kyvety a poškození Au/Hg elektrody (Rasmussen and Møller, 2001). Metoda používaná Melnykem et al. (1999) stanovuje zároveň

oxidované

a

redukované

formy

aminothiolů

použitím

coulometrické

elektrochemické detekce.

6.1.4

HPLC s fotometrickou detekcí V poslední době je využívána specifická postkolonální detekční metoda založená na

shlukování zlatých nanočástic (GNPs) s aktivním povrchem. Agregace zlatých nanočástic je indukována homocysteinem nebo cysteinem a má za následek snížení absorpce roztoku při 525 nm nebo naopak zvýšení absorpce při vyšších vlnových délkách 600 – 700 nm. GNPs jsou vysoce selektivní a nereagují s ostatními aminokyselinami a biomolekulami. Další výhodou těchto částic je jejich vysoká stabilita ve vodných roztocích (Lu et al., 2007). 38

6.2

Plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) Vzorky plazmy nebo séra jsou redukovány DTT, deproteinovány ethanolem a

derivatizovány přídavkem methylchloromravenčnanu a toluenu. Výsledné produkty jsou analyzovány pomocí GC-MS. Metoda byla vyvinuta a ověřena Windelbergem et al. (2005) a k jejím výhodám patří rychlá a jednoduchá příprava vzorků ve vodném prostředí při pokojové teplotě.

6.3

Vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) Vysoce selektivní, rychlá a přesná metoda vhodná pro běžná klinická stanovení.

Homocystein po uvolnění z vazby na proteiny reaguje s 5-bromomethylfluoresceinem (5BMF). K detekci produktu se využívá laserem indukovaná fluorescence (LIF). K výhodám metody patří jednoduchá instrumentace, stanovení ve velmi malých objemech vzorku (řádově nanolitrech) a minimální spotřeba roztoků. Metodou je možno stanovit i další nízkomolekulární sirné sloučeniny jako methionin, cystein a glutathion (Vecchione et al., 1999).

6.4

Kolorimetrické metody Matsuyama et al. (2001) vyvinuli kolorimetrickou metodu využívající enzymové

reakce. Vzorky jsou redukovány DTT. Následuje kaskáda reakcí, které jsou katalyzované specifickými enzymy. Konečným produktem je methylenová modř s absorpčním maximem 660 nm. Drobným nedostatkem metody je předběžná manuální úprava vzorků. Do této skupiny patří také vysoce selektivní a specifická metoda pro stanovení cysteinu a homocysteinu. Její podstatou je reakce aldehydických skupin azobarviv s cysteinem a homocysteinem. Reakce probíhá při neutrálním pH a dochází při ní k prostým okem pozorovatelné změně barvy z růžové na žlutou (Zhang et al., 2006).

39

6.5

Imunochemické metody

6.5.1

Radioenzymové stanovení Podstatou

metody

je

přeměna

homocysteinu

na

S-adenosylhomocystein

katalyzovaná S-adenosyhomocysteinhydrolasou. Reakce probíhá v přítomnosti

14

C-

adenosinu. Vzniká radioaktivní SAH, který je detekován HPLC a luminiscenčním měřením. Stanovení může být provedeno i bez značeného adenosinu prostřednictvím UV detekce při 254 nm (Ueland et al., 1993).

6.5.2

Imunoenzymové metody (EIA) Metody jsou opět založeny na přeměně homocysteinu na S-adenosylhomocystein

katalyzované

S-adenosylhomocysteinhydrolasou.

Množství

SAH

je

stanoveno

kompetitivní EIA s použitím monoklonální protilátky anti-SAH (Frantzen et al., 1998; Tripodl et al., 2001).

6.5.3

Fluorescenční polarizační imunometody (FPIA) Používají stejný princip stanovení jako EIA. SAH soutěží o vazebná místa

monoklonální protilátky s analogem značeným fluoresceinem (Schipchandler and Moore, 1995; Badiou et al., 2006). V poslední době zaznamenává rychlý vývoj oblast mikrotechnologie, která umožňuje provádět imunoanalýzu pomocí mikročipů. Tato metoda má řadu výhod, např. vyšší reakční účinnost, jednoduchost provedení, kratší dobu analýzy, malou spotřebu vzorků a regentů. Malé objemy vyžadují použití citlivých detektorů, které jsou založeny na fluorescenci, chemiluminiscenci nebo na elektrochemických principech (Suk et al., 2008).

Obr. 6.1 Souhrn metod pro stanovení koncentrace tHcy (Refsum et al., 2004, upraveno)

40

7

ZÁVĚR Homocystein a jeho vliv na lidské zdraví se stal předmětem již mnoha vědeckých

prací. Můžeme se v nich setkat s rozporuplnými názory odborníků. Někteří z nich staví homocystein na pozadí prakticky všech patologických procesů. Na druhé straně stojí ti, kteří molekule homocysteinu nepřisuzují velký význam. Pohled na homocystein by měl být kompromisem těchto názorů. Homocystein by neměl být nadřazován jiným důležitým látkám, ale také by jeho role neměla být podceňována. Dnes je homocystein obecně přijímán jako rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění, avšak stále nejsou známy přesné mechanismy jeho toxických účinků. Dále byla potvrzena spojitost mezi vysokou hladinou homocysteinu v plazmě s deficitem vitamínů B6, B12 a kyseliny listové. Výsledkem špatných stravovacích návyků a životního stylu je nedostatečný příjem těchto vitamínů, následné narušení metabolismu homocysteinu a vznik hyperhomocysteinemie. Následkům této poruchy se v současnosti zabývá řada studií v různých oborech. Stále větší pozornost je věnována oblasti lidské reprodukce. Hyperhomocysteinemie negativně ovlivňuje plodnost mužů i žen, je úzce spjata s komplikacemi během těhotenství a působí také vývoj plodu. Přesné mechanismy účinku prozatím nejsou známy.

41

8

SEZNAM LITERATURY

Amarnath, K., Amarnath, V., Amarnath, K., Valentine, H.L. and Valentine, W.A., A specific HPLC-UV Metod for the determination of cysteine and related aminothiols in biological samples. Talanta 60, 2003, 1229 – 1238. Ananth, C.V., Peltier, M.R., Marco, C.D., Elsasser, D., Getahun, D., Rozen, R. and Smulian, J.C., Associations between two polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and placental abruption. Am. J. Obstet. Gynecol., 2007, 197(4): 385.el – 385.e7. Armstrong, J.S., Bivalacqua, T.J., Chamulitrat, W., Sikka, S. and Hellstrom, W.J.G., A comparison of the NADPH oxidase in human sperm and white blood cells, 2002, Int. J. Androl., 25: 223 – 229. Ashavaid, T.F., Eghlim, F.F., Shalia, K.K. and Nair, K.G., Standardization of homocysteine on HPLC using DTT as reductant. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 2003, 18(2): 106 – 110. Azem, F., Many, A., Yovel, I., Amit, A., Lessing, J.B. and Kupferminc, M.J., Increased rates of thrombophilia in women with repeated IVF failure. 2004, Human Reprod., 19: 368 – 370. Badiou, S., Terrier, N., Jaussent, I., Naudin, E., Maurice, F., Dupuy, A.M., Leray-Moragues, H., Rivory, J.P., Delcourt, C., Canaud, B. and Cristol, J.P., Association of aminothiols with the clinical outcome in hemodialysis patients: comparison of chromatography and immunoassay for homocysteine determination. Clin. Chem. Lab. Med., 2006, 44: 949 – 954. Baker, M.A., Krutskikh A. and Aitken, R.J., Biochemical entities involved in reactive oxygen species generation by human spermatozoa. 2003, Protoplasma, 221: 145 – 151. Barrett-Connor, E. and Bush, T.L., Estrogen and coronary heart disease in women. 1991, Clin. Cardiol., 265: 1861 – 1867. Bedaiwy, M.A., Falcone, T., Mohamed, M.S., Aleem, A.A., Sharma, R.K., Worley, S.E., Thornton, J. and Agarwal, A., Differential growth of human embryos in vitro: role of reactive oxygen species. 2004, Fertil. Steril., 82: 593 – 600. Bezold, G., Lange, M. and Peter, R.U., Homozygous methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutation and male infertility. 2001, N. Engl. J. Med., 344: 1172 – 1173. Blom, J.H., Consequences of homocysteine export and oxidation in the vascular system. Seminars in thrombosis and hemostasis. 2000, 26(3): 227 – 232. Bolander-Gouaille, Ch., Bottiglieri, T., Homocysteine Related Vitamins and Neuropsychiatric Disorders. 2003, 2. vydání, Springer, Paříž, New York, 219 str. Boxmeer, J.C., Smit, M., Weber, R.F., Lindemans, J., Romijn, J.C, Eijkemans, M.J., Macklon, N.S. and Steegers-Theunissen, R.P., Seminal plasma cobalamin significantly correlates with sperm concentration in males undergoing IVF or ICSI procedures. Journal of Andrology, 2007, Vol. 28, No.4.

42

Butz, L.W., du Vigneaud, V., The formation of a homologue of cystine by the decomposition of methionine with sulfuric acid. J. Biol. Chem., 1932, 99: 135 – 142. Carmel, R. and Jacobsen, D.W., Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Carmel, R., Green, R., Rosenblatt, D.S. and Watkins, D., Update on cobalamin, folate and homocysteine. Hematology, 2003, 62 – 81. Cibula, D., Stárka, L., Vrbková, J. a kolektiv, Syndrom polycystických ovarií. 2004, 1. vydání, Maxdorf s. r. o., Praha, 121 str. Dimitrova, K.R., DeGroot, K., Myers, A.K. et al., Estradiol and homocysteine-induced endothelial injury in vivo. 2001a, FASEB J, 15(5): A1132 – 1889. Dimitrova, K.R., DeGroot, K., Myers, A.K. et al., Estradiol prevents homocysteine-induced injury of endothelial cells in vitro. 2001b, FASEB J, 15(5): 1128 – 1887. Dimitrova, K.R., DeGroot, K., Myers, A.K. and Kim, Y.D., Estrogen and homocysteine. 2002, Cardiovascular Research, 53: 577 – 588. Ebisch, I.M.V., van Heerde, W.L., Thomas, C.M.G., van der Put, N., Wong, W.Y. and SteegersTheunissen, R.P.M., C677T methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism interferes with the effects of folic acid and zinc sulfate on sperm concentration. 2003, Fertil. Steril., 80: 1190 – 1194. Ebisch, I.M.V., Peters, W.H.M., Thomas, C.M.G., Wetzels, A.M.M., Peer, P.G.M. and SteegersTheunissen, R.P.M., Homocysteine, glutathione and related thiols affect fertility prameters in the (sub)fertile couple. 2006, Human Reproduction, Vol.21, No7: 1725 – 1733. Ebisch, I.M.W., Thomas, C.M.G., Peters, W.H.M., Braat, D.D.M. and Steegers-Theunissen, R.P.M., The importance of folate, zinc and antioxidants in the pathogenesis and prevention of subfertility, Human reproductive update, 2007, Vol.13, No.2, 163 – 174. Erben, K., Homocystein Klíč ke zdraví. 2005, 1. vydání, Formát, Praha, 126 str. Eskes, T.K.A.B., Homocysteine and human reproduction. In: Killian, R. (eds.): Homocysteine and Vascular Disease. 2000, 1. vydání, Springer, New York, 447 str. Forges, T., Monnier-Barbarino, P., Alberto, J.M., Guéant-Rodriguez, R.M., Daval, J.L. and Guéant, J.L., Impact of folate and homocysteine metabolism on human reproductive health. Human reproductive update, 2007, Vol.13, No.3, 225 – 238. Fowler, B., Transport and Tissue distribution of homocysteine and related S-adenosyl compounds. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Frantzen, F., Faaren, A.L., Alfheim, I. and Nordhei, A.K., Enzyme conversion immunoassay for determining total homocysteine in plasma or serum. Clinical Chemistry, 1998, 44:2, 311 – 316.

43

Garrett, R.H. and Grisham, Ch.M., Biochemistry. 1995, 1. vydání, University of Virginia, Saunders college publishing, USA, Garrido, N., Meseguer, M., Simon, C., Pellicer, A. and Remohi, J., Pro-oxidative and anti-oxidative imbalance in human semen and its relation with male fertility. 2004a, Asian. J. Androl., 6: 59 – 65. Garrido, N., Meseguer, M., Alvarez, J., Simon, C., Pellicer, A. and Remohi, J., Relationship among standard semen parameters, glutathione peroxidase/glutathione reductase activity, and mRNA expression and reduced glutathione content in ejaculated spermatozoa from fertile and infertile men. 2004b, Fertil. Steril., 82 (Suppl 3): 1059 – 1066. George, L., Mills, J.L., Johansson, A.L. et al., Plasma folate levels and risk of spontaneous abortion. 2002, JAMA, 288: 1867 – 1873. Giannattasio, A., De Rosa, M., Smeraglia, R., Zarrilli, S., Cimmino, A., Di Rosario, B., Ruggiero, R., Colao, A. and Lombardi, G., Glutathione peroxidase (GPX) activity in seminal plasma of healthy and fertile males. 2002, J. Endocrinol. Invest., 25: 983 – 986. Gurbuz, B., Yalti, S., Ficicioglu, C. and Zehir, K., Relationship between semen quality and seminal plasma total carnitine in infertile men. 2003, J. Obstet. Gynaecol., 23: 653 – 656. Hajjar, K.A., Homocysteine and hemostasis. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Hillenbrand, R., Hillenbrand, A., Liewald, F. and Zimmermann, J., Hyperhomocysteinemia and recurrent carotid stenosis. BMC Cardiovascular Disorders, 2008, 8:1. Holmes, V.A., Wallace, J.M.W., Alexander, H.D., Gilmore, W.S., Bradbury, I., Ward, M., Scott, J.M., McFaul, P. and McNulty, H., Homocysteine is lower in the third trimester of pregnancy in women with enhaced folate status from continued folic acid supplementation. 2005, Clinical Chemistry, 51:3, 629 – 634. Hulley, S., Grady, D., Bush, T. et al., Randomized trial of estrogen plus progestin for secondary prevention of coronary heart disease in postmenopausal women. 1998, J. Am. Med. Assoc., 280: 605 – 613. Humplíková, S., Minář, J., Kučerová, M., Radina, M. a Valík, D., Stanovení hladiny celkového homocysteinu v plazmě kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Klin. Biochem. Metab., 2007, 15(36): 31 – 34. Chambers, J.C., Ueland, P.M., Wright, M., Doré, C.J., Refsum, H. and Kliner, J.S., Investigation of relationship between reduced, oxidized and protein-bound homocysteine and vascular endotheliala function in healthy human subjects. 2001, Circulation Research, 89: 187 – 192. Ishida, S., Isotani, H., Furukawa, K. and Kuhara, T., Homocystinuria due to cystathionine-β-synthase deficiency associated with megaloblastic anaemia. 2001, Journal of Internal Medicine, 250: 453 – 456. Jacobsen, D.W., Biochemistry and metabolism. In: Killian, R. (eds.): Homocysteine and Vascular Disease. 2000, 1. vydání, Springer, New York, 447 str.

44

Jacobsen, D.W., Practical chemistry of homocysteine and other thiols. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Jakubowski, H., Biosynthesis and reactions of homocysteine thiolactone. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Koca, Y., Ozdal, O.L., Celik, M., Unal, S. and Balaban, N., Antioxidant activity of seminal plasma in fertile and infertile men. 2003, Arch. Androl., 49: 355 – 359. Králíková, M., Tallová, J., Crha, I. and Hill, M., Homocysteine, folate, and vitamin B12 in seminal plasma. 2005, Pavia Italy: Ferrat-Storti Foundation, s. 71 – 71. ISSN1824-9337. Kubešová, J., Tallová, J., Králíková, M., Crha, I. a Jarkovský, J., Homocysteine, folate and vitamin B12 in seminal plasma of males with oligoasthenoteratozoospermia and azoospermia. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2007, ročník 45, číslo 5, s. A46 – A46. Lee, CH-N., Su, Y-N., Cheng, W-F., Lin, M-T., Wang, J-K., Wu, M-H. and Hsieh, F-J., Association of the C677T methylenetetrahydrofolate reductase mutation with congenital heart diseases. Acta. Obstet. Gynecol. Scand., 2005, 84: 1134 – 1140. Lu, Ch., Zu, Y. and Yam, V.W., Specific postcolumn detection method for HPLC assay of homocysteine based on aggregation of fluorosurfactant-capped gold nanoparticles. Anal. Chem., 2007, 79: 666 – 672. Magera, M.J., Lacey, J.M., Casetta, B. and Rinaldino, P., Method for the determination of total homocysteine in plasma and urine by stable isotope dilution and electrospray tandem mass spectrometry. Clinical Chemistry, 1999, 45:9, 1517 – 1522. Matsuyama, N., Yamaguchi, M., Toyosato, M., Takayama, M. and Mizuno, K., New enzymatic colorimetric assay for total homocysteine, Clinical Chemistry, 2001, 47, No.12, 2155 – 2156. McDowell, I.F. and Lang, D., Homocysteine and endothelial dysfunction: a link with cardiovascular disease. 2000, J. Nutr., 130: 369S – 372S. Medina, M.A., Urdiales, J.L. and Amores-Sánchez, M.I., Roles of homocysteine in cell metabolism Old and new functions. Eur. J. Biochem., 2001, 268: 3871 – 3882. Melnyk, S., Pogribna, M., Pogribna, I., Hine, R.J. and James, S.J., A new HPLC method for the simultaneous determination of oxidized and reduced plasma aminothiols using coulometric electrochemical detection, J. Nutr. Biochem., 1999, 10: 490 – 497. Mijatovic, V. and van der Mooren, M.J., Homocysteine in postmenopausal women and the importance of hormone replacement therapy. 2001, Clin. Chem. Lab. Med., 39: 764 – 767. Morris, M.S., Jacques, P.F., Selhub, J. and Rosenberg, I.H., Total homocysteine and estrogen status indicators in the third national health and nutrition examination survey. 2000, American Journal of Epidemiology, Vol.152, No.2.

45

Mostafa, T., Tawadrous, G., Roaia, M.M., Amer, M.K., Kader, R.A. and Aziz, A., Effect of smoking on seminal plasma ascorbic acid in infertile and fertile males. 2006, Andrologia, 38: 221 – 224. Pacchiarotti, A., Mohamed, M.A., Micara, G., Linari, A., Tranquilli, D., Espinola, S.B. and Aragona, C., The possible role of hyperhomocysteinemia on IVF outcome. 2007, J. Assist. Reprod. Genet., 24: 459 – 462. Páterová T., Zeman, J. a Kožich, V., Homocystinurie z deficitu CBS. 2004, 1. vydání, VFN a 1. LF UK Ústav DMP, SHS-Nutricia a. s., Praha, 19 str. Perła-Kaján, J, Twardowski, T and Jakubowski, H., Mechanisms of homocysteine toxicity in humans. 2007, Amino Acids, 32: 561 – 572. Perna, A.F., Ingrosso, D., Lombardi, C., Acanfora, F., Satta, E., Cesare, C.M., Violeti, E., Romano, M.M. and De Santo, N.G., Possible mechanisms of homocysteine toxicity. 2003, Kidney International, Vol.63, 84: S137 – S140. Powers, R.W., Majors, A.K., Kerchner, L.J. and Conrad, K.P., Renal handling of homocysteine during normal pregnancy and preeclampsia. 2004, J. Soc.Gynecol. Invest., 11: 45 – 50. Přistoupilová, K., Přistoupil, T.I. a Heyrovský, M., Homocystein – molekula těšící se rostoucí pozornosti. Chemické Listy, 2001, 93: 365 – 374. Put, N.M.J., van Straaten, H.W.M., Trijbels, F.J.M. and Blom, H.J., Folate, homocysteine and neural tube defects: An overview. 2001, Exp. Biol. Med., Vol.226(4): 243 – 270. Quablan, H.S., Eid, S.S., Ababneh, H.A., Amarin, Z.O., Smadi, A.Z., Al-Khafaji, F.F. et al., Acquired and inherited thrombophilia: implication in recurrent IVF and embryo transfer failure. 2006, Human Reprod., 21: 2694 – 2698. Rasmussen, K. and Møller, J., Methodologies of testing. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Refsum, H., Guttormsen, A.B., Fiskerstrand, T. and Ueland, P.M., Hyperhomocysteinemia in terms of steady-state kinetics. Eur. J. Pediatr., 1998, 157[Suppl 2]: S45 – S49. Refsum, H., Smith, A.D., Ueland, P.M., Nexo, E., Clarke, R., McPartlin, J., Johnston, C., Engbaek, F., Schneede, J., McPartlin, C. and Scott, J.M., Facts and recommendations about total homocysteine determinations: An expert opinion, Clinical Chemistry, 2004, 50:1, 3 – 32. Rozen, R., Polymorphisms of folate and cobalamin metabolism. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Sawula, W., Banecka-Majkutewicz, Z., Kasziński, L., Jakóbkiewicz-Banecka, J., Węgrzyn, G., Nyka, W. and Banecki, B., Improved HPLC method for total plasma homocysteine detection and quantification. Acta Biochimica Polonica, 2008, Vol. 55, 119 – 125.

46

Schipchandler, M.T. and Moore, E.G., Rapid, fully automated measurement of plasma homocysteine with the Abbott IMX analyser. Clinical Chemistry, 1995, 41: 991 – 994. Song, G.J., Norkus, E.P. and Lewis, V., Relationship between seminal ascorbic acid and sperm DNA integrity in infertile men. 2006, Int. J. Androl., 29: 569 – 575. Suk, J.W., Jang, J.-Y. and Cho, J.-H., Reagent-loaded plastic mikrofluidic chips for detecting homocysteine. Journal of Micromechanics and microengineering, 2008, 18, 055024. Tallová, J., Tomandl, J., Bičíková, M and Hill, M., Changes of plasma total homocysteine levels dutiny the menstrual cycle. 1999, European Journal of Clinical Investigation, 29: 1041 – 1044. Tamura, T. and Picciano, M.F., Folate and human reproduction. 2006, Am. J. Clin. Nutr., 83: 993 – 1016. Therond, P., Auger, J., Legrand, A. and Jouannet, P., alpha-Tocopherol in human spermatozoa and seminal plasma: relationships with motility, antioxidant enzymes and leukocytes. 1996, Mol. Human. Reprod., 2: 739 – 744. Tremellen, K., Oxidative stress and male infertility – a clinical perspective. Human reproduction Update, 2008, 1 – 16. Tripodl, A., Chantarangkul, V., Lombardi, R., Lecchl, A., Mannucci, P.M. and Cattaneo, M., Multicenter study of homocysteine measurement – performance characteristics of different methods, influence of standards on interlaboratory agreement of results. Tromb. Haemost., 2001, 85: 291 – 295. Trojan, S., Langmeier, M. a autorský kolektiv, Lékařská fyziologie. 2003, 4. vydání, Grada Publishing, a.s., Praha, 772 str. Ueland, P.M., Refsum, H., Stabler, S.P., Malinow, M.R., Andersson, A. and Allen, R.H., Total homocysteine in plasma or serum: Methods and clinical applications. Clin. Chem., 1993, 39: 1764 – 1779. Unfried, G., Greismacher, A., Weismuller, W., Huber, J.C. and Temper, C.B., The C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reduktase gene and idiopathic recurrent miscarriage. 2002, Obstet. Gyn., 99: 614 – 619. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T., Mazur, M. and Telser, J., Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. 2007, Int. J. Biochem. Cell. Biol., 39: 44 – 84. Vecchione, G., Margaglione, M., Grandone, E., Colaizzo, D., Cappucci, G., Fermo, I., D’Angelo, A. and Di Minno, G., Determining sulfur-containing amino acids by capillary electrophoresis: A fast novel method for total homocyst(e)ine human plasma. Electrophoresis, 1999, 20: 569 – 574. Vernet, P. Aitken, R.J. and Drevet, J.R., Antioxidant strategies in the epididymis. 2004, Mol. Cell. Endocrinol., 216: 31 – 39. Voet, D. a Voetová, J.G., Biochemie. 1990, 1. vydání, Praha,

47

Voet, D. and Voet, J.G., Biochemistry. 2004, 3. vydání, Wiley international edition, USA, 1591 str. Vollset, S.E., Refusm, H., Nygard, O. and Ueland, P.M., Lifestyle factors associated with hyperhomocysteinemia. In: Carmel, R. and Jacobsen, D.W. (eds.): Homocysteine in health and disease, 2001, 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Vrbíková, J., Tallová, J., Bičíková, M., Dvořáková, K., Hill, M. a Stárka, L., Plasma thiols and androgen levels in polycystic ovary syndrome. 2003, Clin. Chem. Lab. Med., 41(2): 216 – 221. Wallock, L.M., Tamura, T., Mayr, C.A., Johnston, K.E., Ames, B.N. and Jacob, R.A., Low seminal plasma folate concentrations are associated with low sperm density and count in male smokers and nonsmokers. 2001, Fertil. Steril., 75: 252 – 259. Watson,A.A., Seminal vitamin B12 and sterility. Lancet, 1962, 280: 640 Wilcken, D.E.L. and Wilcken, B. Historical overview and recent perspective. In: Carmel, R. and Jacobsen, D. W. (eds.): Homocysteine in health and disease. 2001. 1. vydání, Cambridge University Press, Cambridge, 526 str. Williams, A.C. and Ford, W.C., Functional significance of the pentose phosphate pathway and glutathione reductase in the antioxidant defense of human sperm. 2004, Biol. Reprod., 71: 1309 – 1316. Windelberg, A., Arseth, O., Kvalheim, G. and Ueland, P.M., Automated assay for the determination of methylmalonic acid, total homocysteine and related amino acids in human serum or plasma by means of methylchloroformate derivatization and gas chromatography-mass spectrometry. Clinical Chemistry, 2005, 51:11, 2103 – 2109. Wong, W.Y., Merkus, H.M., Thomas, C.M., Menkveld, R., Zielhuis, G.A. and Steegers-Theunissen, R.P.M., Effects of folic acid and zinc sulfate on male factor subfertility: a doubleblind,randomized, placebocontrolled trial. 2002, Fertil. Steril., 77:491 – 498. Zarghami, N. and Khosrowbeygi, A., Seminal plasma levels of 15-F2α-isoprostane, malondialdehyde and total homocysteine in normozoospermic and asthenozoospermic males. 2005, Indian Journal of Clinical Biochemistry, 20 (2): 86 – 91. Zhang, D., Zhang, M., Liu, Z., Yu, M., Li, F, Yi, T. and Huang, Ch., Highly selective colorimetric sensor for cysteine and homocysteine based on azo derivatives. 2006, Tetrahedron Letters, 47: 7093 – 7096. Zini, A., Garrels, K. and Phang, D., Antioxidant activity in the semen of fertile and infertile men. 2000, Urology, 55: 922 – 926.

Internetové zdroje www.ivf-motol.cz – 2. LF UK a FN Motol, Centrum reprodukční medicíny a reprodukční genetiky www.neplodnost.cz – informace o léčbě neplodnosti, stránky provozuje firma Organon, s.r.o., 2005 www.repromeda.cz – Sanatorium Repromeda, Centrum reprodukční medicíny a genetiky www.sci.muni.cz – učební materiály doc. RNDr. Vladimíra Ptáčka, CSc. www.sexuologie.cz – Soukromé sexuologické centrum Gona s.r.o. www. maxdorf.cz – lékařský slovník on-line

48