VIZELETSZTEROID-PROFILOK OSZTEOPORÓZISBAN ÉS NŐGYÓGYÁSZATI MEGBETEGEDÉSEKBEN
PhD értekezés
Bufa Anita
Témavezetők: Dr. Gőcze Péter Miklós, Dr. Kilár Ferenc
Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
2009
Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK ...................................................................................................................................... 2 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .............................................................................................................................. 4 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE.............................................................................................................................. 5 BEVEZETÉS......................................................................................................................................................... 7 IRODALMI ÁTTEKINTÉS ................................................................................................................................ 8 1. VIZELETSZTEROID-PROFIL MÓDSZER ........................................................................................................... 8 1.1 Szteroid hormonok.................................................................................................................................. 8 1.1.1 Szteroid hormonok típusai, szerkezete ............................................................................................................... 8 1.1.2 Szteroid hormonok metabolizmusa .................................................................................................................... 9
1.2 A vizeletszteroid-profil vizsgálat alapjai............................................................................................... 13 1.2.1 Előzetes mintaelőkészítés................................................................................................................................. 13 1.2.2 A szteroidok gázkromatográf-tömegspektrometriája ....................................................................................... 14
1.3 Vizeletszteroid-profil a klinikai diagnosztikában................................................................................. 17 2. NŐKET ÉRINTŐ MEGBETEGEDÉSEK ÉS A SZTEROID HORMONOK KAPCSOLATA ........................................ 19 2.1 Csontritkulás (Oszteoporózis)............................................................................................................... 19 2.2 Méhtest daganat.................................................................................................................................... 21 2.2.1 Mióma.............................................................................................................................................................. 21 2.2.2 Méhnyálkahártyarák........................................................................................................................................ 22
2.3 Petefészek daganat................................................................................................................................ 24 2.3.1 Hám eredetű petefészek daganat ..................................................................................................................... 24 2.3.2 Granulózasejtes petefészek daganat ................................................................................................................ 26
2.4 Méhnyakrák .......................................................................................................................................... 27 2.5 Endometriózis ....................................................................................................................................... 29 CÉLKITŰZÉSEK............................................................................................................................................... 31 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ......................................................................................................................... 32 1. BETEGANYAG ................................................................................................................................................ 32 1.1 Csontritkulásos betegek ........................................................................................................................ 33 1.2 Méhtest daganatos betegek................................................................................................................... 33 1.2.1 Miómás betegek ............................................................................................................................................... 33 1.2.2 Méhnyálkahártyarákos betegek ....................................................................................................................... 34
1.3 Petefészek daganatos betegek............................................................................................................... 34 1.3.1 Hám eredetű petefészek daganatos betegek..................................................................................................... 34 1.3.2 Granulózasejtes petefészek daganatos betegek................................................................................................ 34
1.4 Méhnyakrákos betegek ......................................................................................................................... 34 1.5 Endometriózisos betegek ...................................................................................................................... 34 2. VIZELETSZTEROID-PROFIL ELEMZÉS.............................................................................................................. 35 2.1 Minták gyűjtése és tárolása .................................................................................................................. 35 2.2 Mintaelőkészítés.................................................................................................................................... 35 2.2.1 Szteroidok kivonása ......................................................................................................................................... 35 2.2.2 Konjugátumok hidrolízise és kivonása............................................................................................................. 36 2.2.3 Származékképzés.............................................................................................................................................. 36 2.2.4 Tisztítás............................................................................................................................................................ 36
2.3 Gázkromatográf-tömegspektrometria .................................................................................................. 37 2.3.1 Gázkromatogfráf-tömegspektrometriai mérések.............................................................................................. 37 2.3.2. Minőségi és mennyiségi analízis..................................................................................................................... 39
2.4 Eredmények normalizálása, statisztikai értékelése .............................................................................. 41 EREDMÉNYEK.................................................................................................................................................. 42 1. SZTEROID PROFIL VIZSGÁLATOK CSONTRITKULÁSOS NŐKNÉL ................................................................. 43 2. SZTEROID PROFIL VIZSGÁLATOK MÉHTEST DAGANATOS NŐKNÉL ............................................................ 45 2.1 Vizsgálatok miómás betegeknél............................................................................................................ 45 2.2 Vizsgálatok méhnyálkahártyarákos betegeknél................................................................................... 54 3. SZTEROID PROFIL VIZSGÁLATOK PETEFÉSZEK DAGANATOS NŐKNÉL....................................................... 58 3.1 Vizsgálatok hám eredetű petefészek daganatos betegeknél................................................................. 58 3.2 Vizsgálatok granulózasejtes petefészek daganatos betegeknél............................................................ 61 4. SZTEROID PROFIL VIZSGÁLATOK MÉHNYAKRÁKOS NŐKNÉL .................................................................... 65
2
5. SZTEROID PROFIL VIZSGÁLATOK ENDOMETRIÓZISOS NŐKNÉL ................................................................. 68 EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE...................................................................................................................... 73 ÖSSZEFOGLALÁS............................................................................................................................................ 80 HIVATKOZÁSOK JEGYZÉKE....................................................................................................................... 82 FÜGGELÉK........................................................................................................................................................ 91 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK ........................................................................ 105 EGYÉB KÖZLEMÉNYEK.............................................................................................................................. 107
3
Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik hozzájárultak ahhoz, hogy ez a munka elkészülhessen. Mindenek előtt köszönettel tartozom két témavezetőmnek, Prof. Dr. Gőcze Péternek és Prof. Dr. Kilár Ferencnek, akik 2004 óta vezettek, szakmai segítséget nyújtva, emberileg támogatva, bíztatva munkám során. Köszönöm a PTE ÁOK Bioanalitikai Intézet és a Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika dolgozóinak, hogy készségesen együttműködtek a kutatásom során. Köszönöm Dr. Poór Viktóriának, hogy megosztotta velem tapasztalatait, segített és bíztatott, ha szükségem volt rá. Köszönettel tartozom Golobné Wassenszky Ritának, aki rengeteget segített a mindig jó hangulatú laboratóriumi munkában, emberileg támogatott és bíztatott. Köszönöm Dr. Juricskay Istvánnénak, hogy értékes tanácsokkal segítette a munkámat. És nem utolsó sorban köszönetet mondok családomnak türelmükért és bíztatásukért.
4
Rövidítések jegyzéke Szteroid-metabolitok rövidítései RÖVIDÍTÉS
TUDOMÁNYOS NÉV
TRIVIÁLIS NÉV
An
5α-androsztán-3α-ol-17-on
androszteron
∆5-AT
5-androsztén-3β,16α,17β-triol
androszténtriol
aTHB
5α-pregnán-3α,11β,21-triol-20-on
allotetrahidrokortikoszteron
aTHF
5α-pregnán-3α,11β,17α,21-tetrol-20-on
allo-tetrahidrokortizol
α−C
5β-pregnán-3α,11β,17α,20α,21-pentol
α-kortol
α−CL
5β-pregnán-3α,17α,20α,21-tetrol-11-on
α-kortolon
β−CL
5β-pregnán-3α,17α,20β,21-tetrol-11-on
β-kortolon
DHEA
5-androsztén-3β-ol-17-on
dehidroepiandroszteron
DHEAS
5-androsztén-3β-ol-17-on szulfát
dehidroepiandroszteronszulfát
E2
ösztrán-3,17β-diol
17β-ösztradiol
Et
5β-androsztán-3α-ol-17-on
etiokolanolon
F
4-pregnén-11β,17α,21-triol-3,20-dion
kortizol
IS
5α-androsztán-3β,17β-diol
5α-androsztándiol
KB
3β-hidroxi-5-kolesztén-3-butirát
koleszteril-butirát
11-OH-An
5α-androsztán-3α,11β-diol-17-on
11β-hidroxi-androszteron
16-OH-DHEA 5-androsztén-3β,16α-diol-17-on
16α-hidroxi-DHEA
11-OH-Et
5β-androsztán-3α,11β-diol-17-on
11β-hidroxi-etiokolanolon
11-O-PT
5β-pregnán-3α,17α,20α-triol-11-on
11-keto-pregnántriol
P
4-pregnén-3,20-dion
progeszteron
PD
5β-pregnán-3α,20α-diol
pregnándiol
∆5-PD
5-pregnén-3β,20α-diol
pregnéndiol
PT
5β-pregnán-3α,17α,20α-triol
pregnántriol
∆5-PT
5-pregnén-3β,17α,20α-triol
pregnéntriol
SS
5,22-kolesztadien-24β-etil-3β-ol
sztigmaszterol
T
4-androsztén-17β-ol-3-on
tesztoszteron
5
THA
5β-pregnán-3α,21-diol-11,20-dion
tetrahidro-11dehidrokortikoszteron
THB
5β-pregnán-3α,11β,21-triol-20-on
tetrahidrokortikoszteron
THE
5β-pregnán-3α,17α,21-triol-11,20-dion
tetrahidrokortizon
THF
5β-pregnán-3α,11β,17α,21-tetrol-20-on
tetrahidrokortizol
THS
5β-pregnán-3α,17α,21-triol-20-on
tetrahidro-11-deoxikortizol
Egyéb rövidítések BMI
testtömeg index (body mass/index)
CAH
congenitalis adrenalis hyperplasia (veleszületett adrenogenitális szindróma)
FSH
follikulus stimuláló hormon
GnRH
gonadotropin releasing hormon
LH
luteinizáló hormon
Max
maximum érték
Me
gyakorisági eloszlás középső értéke (medián)
Min
minimum érték
StAR protein
szteroidgenezis akut szabályozó fehérje (steroidogenic acute regulatory protein)
Q1, Q3
alsó és felső negyedelő értékek (kvartilisek)
6
Bevezetés A szteroid hormonok minőségi és mennyiségi meghatározása, a szervezet fiziológiás folyamataiban betöltött összetett szerepük miatt fontos az orvosi diagnosztikában és a különböző betegségek patofiziológiájának felderítésében. A szteroid hormonok és metabolitjaik mérésére alkalmazható többféle módszer közül napjainkban legelterjedtebbek a kromatográfiai módszerek és az immunoesszék használata. A szérumból, plazmából és egyes komponensek esetében nyálból és vizeletből történő egyedi
szteroid
mérések
(általában immunoesszék) gyorsan végezhetők, könnyen
kivitelezhetők és többnyire automatizálhatók, de csak a mintavétel pillanatában, a keringésben lévő szteroidokról adnak információt (Andrew, 2001). A vizeletből történő mérések eredményei azonban tájékoztatást adnak a mirigyekben és a periférián történő szteroid metabolizmusról is. A vizeletszteroid-profil néven ismert gázkromatográfiai módszer lehetővé teszi több szteroid csoport egyidejű mérését. Kiküszöbölve az egyes szteroidokra jellemző napi ingadozást, a 24 órán át gyűjtött vizeletből történő mérés átfogó képet nyújt az egy napi szteroid anyagcseréről, a szteroidok metabolikus útjairól és a szintézisben résztvevő enzimek működéséről is. A
vizeletszteroid-profil
módszer
több
endokrin
megbetegedés
differenciál
diagnosztikájában és kutatásában (Juricskay és Telegdy, 2000; Szilágyi és mtsai, 2000; Poór és mtsai, 2005) kiemelkedő fontossággal bír. Magyarországon rutinszerűen egyedül a PTE ÁOK Bioanalitikai Intézetében végezhető vizeletszteroid-profil vizsgálat, a módszerrel dolgozó laboratóriumokat összefogó nemzetközi szervezet tagjaként. Kutatásunk során olyan nőgyógyászati megbetegedések vizsgálatára fektettük a hangsúlyt, melyek patofiziológiája nem teljesen felderített és kapcsolatba hozható a szteroid metabolizmus módosulásával. Célcsoportjaink a napjainkban is nagy jelentőséggel bíró népbetegségnek számító csontritkulás, a ma is a vezető halálozási okok közé tartozó női nemi szervi daganatok. Az endometriózissal szorosan összefüggő meddőség az emelkedő incidenciája miatt került a figyelmünk előterébe.
7
Irodalmi áttekintés 1. Vizeletszteroid-profil módszer 1.1 Szteroid hormonok 1.1.1 Szteroid hormonok típusai, szerkezete A szteroid hormonokat az élő szervezetben betöltött biológiai hatásuk alapján mineralo- és glükokortikoidokra, ill. szexuálszteroidokra (androgének, ösztrogének, gesztagének) oszthatjuk fel. A mineralokortikoidok az ásványi, a glükokortikoidok a szénhidrát anyagcserében játszanak szerepet, a szexuálszteroidok a nemi működést befolyásolják. A mineráló- és glükokortikoidok a mellékvesekéregben, a szexuálszteroidok kisebb részt a mellékvesekéregben, nagyobb részt pedig az ivarmirigyekben keletkeznek. Az emberi szervezetben termelődő szteroid hormonokat az 1. táblázat mutatja.
1. táblázat Főbb szteroid hormonok az emberi szervezetben
Neve
Az elválasztott végtermék Fő hatása
Mellékvesekéreg Zona glomerulosa aldoszteron kortizol Zona fasciculata dehidroepiandroszteron Zona reticuláris dehidroepiandroszteron-szulfát tesztoszteron Here progeszteron Petefészek androszténdion ösztradiol progeszteron Méhlepény ösztradiol ösztriol
mineralokortikoid glükokortikoid gyenge androgén erős androgén gesztagén gyenge androgén ösztrogén gesztagén ösztrogén ösztrogén
Minden szteroid hormon szintézise azonos szubsztrátból (koleszterin) indul ki, és a szintézis nagy része azonos enzimek közreműködésével történik. A kémiai szerkezetükben közös, hogy ciklopentanoperhidrofenantrén (szterán) vázat tartalmaznak (1. ábra). Az elválasztásra kerülő hormonok azonban mind kémiai szerkezetüket, mind biológiai hatásaikat tekintve nagymértékben különbözőek. A különböző szteroidok a szénatomok számában, a
8
kettőskötések helyzetében és a különféle szubsztituensek jelenlétében és helyzetében térnek el egymástól. Szénatomszámuk alapján három csoportba oszthatók: a 18 szénatomból álló ösztrán az ösztrogének, a 19 szénatomból álló androsztán az androgének, a 21 szénatomból álló pregnán pedig a kortikoszteroidok és a gesztagének alapvázát képezi (1. ábra). 12 13
11 1 2 3
10
A 4
C
9
5
6
16
D 8
B
17
14
15
7
1.
18
21
18
20
19
2.
3.
4.
1. ábra Szterán váz és a szteroidok alapvázai 1. szterán váz, 2. ösztrán, 3. androsztán, 4. pregnán vázak
1.1.2 Szteroid hormonok metabolizmusa A szteroidok metabolizmusának két fő útja van. Az egyik az, hogy az endokrin mirigyben termelődött szteroid más szervekben egy másik, még mindig hatásos vegyületté alakul át (pl. a tesztoszteron hatásosabb dihidrotesztoszteronná redukálódik, az androgének egy része más szövetekben ösztrogén hormonná alakulhat). A másik út a szabályos inaktiválódás, amely során az aktív hormonból inaktív vegyületek képződnek. Az inaktiválódás közben a hormonok redukciós folyamatok során elveszítik biológiai hatásosságukat, majd vízoldékony formává alakulnak át. Mindkét átalakulás elsősorban a májban játszódik le. A redukciós folyamatok alapja hasonló a legtöbb szteroid (androgének, progesztagének, kortikoszteroidok, aldoszteron) esetében: az A gyűrűben (4. és 5. szénatom közötti kettős kötésnél) és a keto csoportokon (C3, C11 és C20 helyzetben) redukció történik. 9
A redukciós lépések után, a már inaktivált szteroidok szulfáttal, vagy glükuronsavval konjugálódnak, és a keletkezett szteroid-szulfátokat vagy szteroid-glükuronidokat a vese választja ki, és így a vizeletben ürülnek. A 3α-hidroxi-5α és a 3α-hidroxi-5β szteroidok glükuronid, a 3β-hidroxi-5-én szteroidok pedig mono-, vagy diszulfát formában választódnak ki. Bizonyos konjugált formák (pl: DHEAS) a keringésben maradva visszaalakulhatnak szabad formájukká (Shackleton, 1986). A vizelettel ürülő szteroid-metabolitok nagy része a mellékvese hormonjaiból, kisebb része az ivarmirigyek hormonjaiból származik, és vannak olyan metabolitok, amelyek mindkét szervben termelődő hormonokból származnak. Szintjük magába foglalja a periférián keletkezett, a keringésbe nem kerülő hormonok metabolitjait is (Wudy és mtsai, 2004). A 2. ábrán foglaltam össze a klinikai diagnosztikában leggyakrabban vizsgált androgén, kortikoid és progeszteron vizeletszteroid-metabolitok eredetét.
10
Koleszterin Cit P-450 koleszterin oldallánc hasítás 17α-hidroxiláz/17, 20 liáz
17α-hidroxiláz
Pregnenolon
17α-OH-pregnenolon
3β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
Progeszteron
17β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
Dehidroepiandroszteron
3β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
3β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
17α-hidroxiláz
17β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
17α-hidroxiláz/17, 20 liáz
17α-OH-progeszteron 21-hidroxiláz
21-hidroxiláz
Androszténdiol
Androszténdion
Tesztoszteron
Aromatáz
Aromatáz
11β-hidroxiláz
21-dezoxikortizol
11-dezoxikortikoszteron
Ösztron
11-dezoxikortizol
Ösztradiol
17-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
11β-hidroxiláz
11β-hidroxiláz 11β-hidroxiláz
21-dezoxikortizon Kortikoszteron
11β-hidroxiláz
11β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
Kortizon
11-hidroxi-androszténdion
Kortizol Szérum
11β-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz
PD ∆5-PD
THA THB aTHB
11-O-PT
∆5-PT PT
THS THE α-CL β-CL
THF aTHF α-C F
DHEA ∆5-AT 16-OH-DHEA
Vizelet An Et
11-OH-An 11-OH-Et
2. ábra A klinikai diagnosztikában leggyakrabban vizsgált, vizeletben ürülő szteroid-metabolitok eredete Az ábra a főbb szteroidok kialakulásának reakcióit és fontosabb metabolitjainak eredetét szemlélteti. Az átalakulásban résztvevő enzimek piros színnel vannak feltüntetve. A szervezetben nincs olyan sejt, amelyikben valamennyi átalakulás végbemenne. A rövidítések jelentése a RÖVIDÍTÉSEK fejezetben található (5. o.). (Andrew, 2001; Homma és mtsai, 2003; Honour, 1997a közleményei alapján).
11
A tesztoszteron és az androszténdion vizeletben ürülő fontosabb metabolitjai az androszteron (An) és az etiokolanolon (Et), amelyek származhatnak mind a mellékvese, mind az ivarmirigy eredetű hormonokból. A dehidroepiandroszteron (DHEA) és fő metabolitjai a 16α-hidroxi-DHEA (16-OHDHEA) és az androszténtriol (∆5-AT), a mellékvese androgén termelését jellemzik. A 11-hidroxi-17 ketoszteroidok: a 11β-hidroxi-androszteron (11-OH-An) és a 11βhidroxi-etiokolanolon (11-OH-Et) gyenge androgén hatású metabolitok, amelyek oldallánc hasítással kortizolból is keletkezhetnek. A petefészekben termelődő progeszteron legfontosabb vizeletben ürülő metabolitja a pregnándiol (PD), amelynek szintje pontos jelzője a progeszteron mennyiségének, ezért ciklusmonitorozásra, sárgatest funkció megítélésére használatos. A progeszteronból származó kortikoszteron termelését jellemzik a tetrahidro-11dehidrokortikoszteron (THA), tetrahidrokortikoszteron (THB) és allo-tetrahidrokortikoszteron (aTHB) metabolitok. A 11-oxo-kortizol (kortizon) metabolitok: a tetrahidrokortizon (THE), α-kortolon (αCL), β-kortolon (β-CL), és a 11-hidroxi-kortizol (kortizol) metabolitok: a tetrahidrokortizol (THF), allo-tetrahidrokortizol (aTHF) és α-kortol (α-C) összege a napi kortizol termelést jellemzi. A vizeletszteroid-profil módszerrel a különböző szteroid hormonok metabolitjait egyidejűleg tudjuk mérni, ezáltal lehetővé válik, hogy az egyes metabolitok egymáshoz viszonyított arányát is nyomon kövessük, és információt kapjunk a metabolizmusban szerepet játszó enzimek működéséről. A metabolikus utak köztitermékei: a pregnéndiol (∆5-PD), pregnántriol (PT), pregnéntriol (∆5-PT), 11-keto-pregnántriol (11-O-PT) és a tetrahidro-11-deoxikortizol (THS) metabolitok
mennyiségének
adrenogenitalis
szindróma
megváltozása
központi
betegségcsaládba
tartozó
jelentőségű
a
veleszületett
enzimműködési
zavarok
diagnosztizálásában (bővebben lásd az 1.3 alfejezet) (Shackleton, 1986; Sólyom, 1998, 2001).
12
1.2 A vizeletszteroid-profil vizsgálat alapjai Több szteroid csoport egyidejű, gázkromatográfiai vizsgálatával 1966 óta találkozunk az irodalomban, és azóta a módszerben a technikai fejlődéseknek köszönhetően jelentős változások történtek (Shackleton és Honour, 1976; Shackleton és Whitney, 1980a; Shackleton 1986; Shackleton és mtsai, 1990; Honour, 1997a). 1.2.1 Előzetes mintaelőkészítés A biológiai minták gázkromatográfiai analízise előtt általában több munkafolyamatból álló mintaelőkészítésre van szükség. A kvantitatív vizeletszteroid-profil meghatározáshoz az alábbi feltételeknek kell teljesülnie (Shackleton 1986): •
24-órás vizeletgyűjtés
•
a minta megfelelő tárolása a gyűjtés és a feldolgozás közötti időszakban
•
a konjugált szteroidok kvantitatív kivonása vizeletből
•
a konjugált szteroidok tökéletes hidrolízise
•
a felszabadított szteroidok kvantitatív visszanyerése
•
az összes szteroid kvantitatív átalakulása illékony származékokká
•
szennyeződések elkerülése
A szteroidok vizeletből történő kivonása során korábban alkalmazott oldószeres extrakciót ma már felváltotta az egyszerűbb és lényegesen kevesebb időt igénylő szilárd fázisú kivonás. A folyamat során szűrők közé töltött, konjugált és szabad szteroidok kivonására is alkalmas, oktadecilszilán fázist tartalmazó kis oszlopokat használnak (Shackleton és Whitney, 1980a). Az extrakciós lépést a szteroid konjugátumok kémiai (szolvolízis), vagy enzimatikus hidrolízise követi, melynek során a szteroid-szulfátként, illetve glükuronidként ürülő metabolitokat felszabadítják a konjugált formáikból. Az összes vizelet szteroid kvantitatív hidrolízisének megvalósítása igen nehéz. Többféle enzim alkalmazható (pl.: bakteriális /Escherichia coli/ és marhamáj enzimek), de a legelterjedtebb az éti csiga (Helix pomatia) emésztőenzimeinek használata, amelyek alkalmasak az összes szteroid glükuronid és a legtöbb szulfát forma hidrolizálására (Shackleton, 1986). A konjugátumok hidrolízise után a felszabadított szteroidokat ismét szilárd fázisú extrakcióval nyerik vissza.
13
A szteroid-metabolitok kis illékonyságú és magas hőmérsékleten erősen bomlékony anyagok, ezért a gázkromatográfiás analízis előtt olyan kémiai átalakítást szükséges végezni rajtuk, melynek során a metabolitok illékonysága és hőstabilitása is megnő. Az eljárás során a hőbomlást és az illékonyságot befolyásoló poláris csoportok (keto és hidroxil csoportok) átalakítása történik. Többféle származékképzési eljárás ismert. A szteroidok hidroxilcsoportjait általában trimetil-szililoxi, az oxo-csoportokat pedig O-metiloxim származékká alakítják át. Mindkét funkciós csoport jelenléte esetén O-metiloxim-trimetil-szililoxi származékokat képeznek. Az átalakítás során először az enolizációra hajlamos keto-csoportok blokkolása történik metoxim képzéssel, majd a hidroxil csoportok hidrogénjét cserélik inaktív, trimetil-szilil csoportokra (Shackleton és mtsai, 1990) (3. ábra). a.,
R=C=O + H2NOCH3.HCl →
b.,
R-OH + Me3SiX
→
R=C=NOCH3 + H2O + HCl
R-OSiMe3 + HX
3. ábra Származékképzési reakciók Az a., reakció a keto csoportok metoxim származékokká történő átalakítása. A reagens metoxiamin-hidroklorid 2%-os piridines oldata. A b., reakció a trimetil-szililezési reakció általános sémája. Az általunk alkalmazott szililezőszer: trimetilszililimidazol (TMSI).
Egyes szililező reagensek (pl.: TMSI) roncsolhatják a gázkromatográfiai mérésekhez használt kapilláris oszlopot, ezért a feleslegét a mérés előtt el kell távolítani a mintákból. Ez a folyamat általában gél-kromatográfiás technikával történik Lipidex 5000 géloszlop segítségével. 1.2.2 A szteroidok gázkromatográf-tömegspektrometriája Napjainkban a szteroidok származékainak minőségi és mennyiségi meghatározására leginkább alkalmazott módszer a gázkromatográf-tömegspektrometria. A szteroid-metabolitokat folyadék halmazállapotban juttatják a gázkromatográfba. Nagyon fontos, hogy a minta pillanatszerűen és kvantitative elpárologjon a mintaadagolás folyamán. Számos mintaadagoló rendszer közül az ún. Split-splitless mintabeviteli rendszer a leggyakrabban alkalmazott. Ebben az esetben a mintát mikrofecskendő segítségével juttatják a többnyire szilikon szeptummal lezárt, 1-2 cm3 térfogatú üvegbetétet tartalmazó, fűthető
14
elpárologtatóba. A kétféle mintabeviteli technika közül a split mintabemérés során a mintából képződő gőz bizonyos hányadát egy mintaáram elosztó segítségével a szabadba engedik, és csak a kisebb, szükséges hányad jut az oszlopra. A splitless technika esetén a minta bevitelét követően a teljes elpárologtatásig nem alkalmaznak mintaáram elosztást. Mivel a legtöbb szteroid forráspontja 150 °C feletti, ezért a mintabemérő hőmérséklete a mintaadagolás során 300 °C körüli. A legtöbb szteroid-metabolit elválasztása, kémiai tulajdonságaiknak megfelelően, apoláris vagy kismértékben poláris állófázisokat (nem-szelektív, metilszilikon fázisok) tartalmazó kapilláris oszlopokon [pl.: HP-1-MS oszlop (Agilent Company)] történik. Az oszlopok hossza általában 15-30 m, belső átmérője 0,2-0,4 mm, állófázisuk vastagsága 0,10,33 µm. A komponensek elválasztására hőmérsékleti programot alkalmaznak. Az oszlopot, a minta bejuttatását követően, rövid várakozási idő (1-2 perc) után gyorsan felfűtik az analitikus hőmérsékletre (180°C), majd lassan (kb. 2°C/perc) tovább emelik a legkevésbé illékony összetevő forráspontjáig kb. 300°C-ig (Shackleton és mtsai, 1990). A szteroidok elválasztására alkalmazott oszlopok kis kapacitásúak, mivel vékony állófázis réteget tartalmaznak, ezért nagy érzékenységű detektorra van szükség. A sokféle gázkromatográfiás detektor közül napjainkban a leginkább alkalmazott, legsokoldalúbb a tömegspektrométer, amely nagy érzékenységű és szelektivitású. A tömegspektrométer gázhalmazállapotú ionok (töltéssel rendelkező gáz molekulák), tömegük alapján történő szétválasztására szolgál. A tömegspektrometriai mérés részfolyamatainak vákuumban (10-3 Pa) kell végbe mennie, amelyek sorrendben a következők: •
a minta gázállapotba hozása
•
ionizáció
•
a keletkezett ionok elektromos térben történő felgyorsítása
•
az elektromos és mágneses térben az m/z (töltésegységre jutó tömeg) szerint elválasztott ionnyalábok regisztrálása
A tömegspektrometria analitikai alkalmazása azon alapul, hogy gondosan ellenőrzött, azonos kísérleti körülmények között a molekulák fragmentációja azonos módon történik. Ezen túlmenően a fragmensek tömege és mennyisége a molekula szerkezetének, funkciós csoportjainak függvénye. Így a tömegspektrum adataiból a molekula szerkezetére is következtethetünk.
15
A szteroid komponensekből álló minta minőségi és mennyiségi analízisére legcélszerűbb
a
belső
standard
módszert
alkalmazni,
ezáltal
kiküszöbölhetők
a
mintaelőkészítés és a mintabemérés bizonyos hibái. A módszer azon alapul, hogy a mintaelőkészítés során, vagy a mintabemérés előtt a mérendő elegyhez hozzáadnak egy olyan komponenst (belső standard), amelynek csúcsa teljesen elválik a többi csúcstól, nincs jelen a vizsgálandó mintában és nincs semmilyen zavaró hatása. Ez a módszer kalibrációs görbe segítségével dolgozik, de lényegében relatív kalibrációt alkalmaz. A kalibrációs görbét ismert mennyiségű, meghatározni kívánt anyagok és a belső standard keverékével készítik el előzetesen. A modern gázkromatográf-tömegspektrometriai készülékek lehetővé teszik az ún. szelektív ionkereséssel (SIM) történő analizálást. A meghatározni kívánt komponenseknél és a belső standardnál kiválasztanak néhány jellemző tömegiont, egy céliont és 1-2 minősítő iont. A komponenseket a relatív retenciós idők, valamint az egyes anyagok célionjának és minősítő ionjainak egymáshoz viszonyított aránya alapján azonosítják. A mennyiségi meghatározás során az összes mért komponens, a kalibráció során meghatározott érzékenységi faktorokkal korrigált célion csúcs alatti területét viszonyítják a belső standard célion csúcs alatti területéhez. A szteroidok mérésénél gyakori a 3 belső standard: az 5α-androsztán-3β,17β-diol (IS), a sztigmaszterol (SS) és a koleszteril-butirát (KB) együttes használata. Az 5α-androsztán-3β, 17β-diolt a mennyiségi és minőségi analízisben használják. A sztigmaszterolt a származékképzés ellenőrzésére alkalmazzák. Erre azért van szükség, mert a trimetil-szilil származékok nagyon érzékenyek, viszonylag könnyen hidrolizálódnak, ha víz vagy sav nyomok maradnak a mintában. A sztigmaszterol trimetil-szilil származéka különösen könnyen hidrolizálódik, így a folyamat során bekövetkező hiba esetén a csúcs alatti területe azonos mennyiség esetén is jelentősen kisebb lesz, mint a koleszteril-butirát standardé (Shackleton, 1986; Honour, 1997a).
16
1.3 Vizeletszteroid-profil a klinikai diagnosztikában A normál vizeletbe ürülő szteroid-metabolitok szintje nem és életkor szerint változik, amit figyelembe kell venni a klinikai diagnosztikában. Az életkori és nemi sajátosságok miatt szteroid-profil meghatározások esetében szükség van nem és életkor szerinti referencia értékekre (Honour, 1997a; Shamin és mtsai, 2000). Referencia értékek találhatók Weykamp és mtsai (1989), Honour (1990) és Homma és mtsai (2003) közleményeiben. A vizeletszteroid-profil módszer kiemelkedő fontossággal bír olyan betegségek hátterében álló okok felderítésében, amelyek befolyásolják a szteroidok szintézisét és metabolizmusát. Ezen betegségek többsége a normáltól lényegesen eltérő, jellegzetes vizeletszteroid-profilokat ad. Ilyen betegségek pl.: a sóvesztő állapotok, magas vérnyomás (hypertonia), kövérség (obesitas), havi vérzés elmaradása (amennorhea), korai adrenarche, szeméremszőrzet korai megjelenése (pubarche praecox), korai nemi érés (pubertas praecox), bizonytalan neműség (intersex genitaliák), nőknél a férfias jelleg megjelenése (virilizáció) és hiperandrogén állapotok (pl. policisztás ovárium szindróma – PCOS). A vizeletszteroid-profil módszer bizonyos betegségeknél, mint pl. a szteroid-termelő tumorok esetén, segítik az egész életen át tartó kezelés monitorozását. A legismertebb, jellegzetes profillal rendelkező betegségcsalád a veleszületett adrenogenitalis szindróma (congenitális adrenális hyperplasia, CAH, AGS). Ebbe a betegségcsaládba a szteroidszintézis ötféle veleszületett enzimműködési zavara tartozik (2. táblázat),
melyek
a
mellékvese
és
az
ivarmirigyek
szteroidképzésének
összetett
rendellenességét okozzák, elégtelen kortizolképzéshez vezetnek változatos tünetekkel kísérve (Sólyom, 2001). Jellegzetes profilt ad még a 11β és 17β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzimek, az 5αreduktáz elégtelen működése is, a Cushing szindróma, továbbá egyes szteroid-termelő tumorok (Shackleton és mtsai, 1990). A 2. táblázatban néhány, jellegzetes szteroid-profillal rendelkező betegséget és jellemzőit foglaltam össze.
17
2. táblázat Endokrin betegségek és jellemző vizeletszteroid-profiljaik Betegség Congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH)
Ok
Vizeletszteroid-profil változásai
21-hidroxiláz hiány
−csökkent kortizol metabolitok −emelkedett 21-deoxi-szteroidok (17-OH-Pg, PT, 11-OPT) és androgén metabolitok −enyhe formájában (néhány későn manifesztálódó formában is) a kortizol metabolitok szintje normális, de a 17-hidroxi-progeszteron és a kortizol metabolitok aránya megnövekszik −teljes defektusnál alig detektálhatók a kortizol metabolitok −emelkedett 11-deoxi-kortizol (THS) és 11 -deoxiandrogén metabolitok (An, Et) −csökkent kortizol metabolitok
11β-hidroxiláz hiány
3β-hidroxi-szteroiddehidrogenáz hiány
17α-hidroxiláz hiány
StAR fehérje hiány
−emelkedett az összes kortizol metabolit szintje
Cushing szindróma hormontermelő tumorok
mellékvese tumorok ivarmirigy tumorok
androgéntermelés zavarai
alacsony ösztrogén termelés terhesség alatt policisztás ovárium szindróma
−emelkedett 3β-hidroxi-5-én szteroid szulfátok (p1.: ∆5-PT) −leányoknál túlzott, férfiakban elégtelen androgén termelés −teljes defektusnál a kortizol és androgén metabolitok alig detektálhatóak −fő vizelet szteroidok a kortikoszteron metabolitjai (THB, aTHB) −csökkent szteroid metabolit szintek
5α-reduktáz hiány
17β-hidroxi-szteroiddehidrogenáz hiány méhlepény-szulfatáz hiány
−bizonyos szteroidok szintje emelkedett (p1.: 3βhidroxi-5-én szteroidok, 11-OH-An) −különféle típusú petefészek (PT), ill. here eredetű metabolitok emelkedett szintje (tesztoszteron és metabolitjai, és 3β-hidroxi-5-én szteroidok) −5α-redukált szteroidok alacsony szintje −csökkent 5α/5β metabolit arány pl.: An/Et, THF/aTHF −emelkedett An és Et szint −3β-hidroxi-5-én szteroidok emelkedett szintje a terhes nő vizeletében, alacsony ösztriol szint −emelkedett 5α/5β metabolit arány
(Shackleton, 1986; Shackleton és mtsai, 1990; Sólyom, 1998; Szilágyi és mtsai, 2000; Wudy, 2004 közlemények alapján).
18
2. Nőket érintő megbetegedések és a szteroid hormonok kapcsolata Napjainkban, a nőket leginkább veszélyeztető betegségek közé tartozik a csontritkulás, a mióma, a méhnyálkahártyarák, a petefészek daganatok, a méhnyakrák és az endometriózis. Kialakulásukban számos kockázati tényező ismert. Ebben a fejezetben rövid áttekintést adok ezen nőgyógyászati megbetegedésekről, melyek patofiziológiája nem teljesen felderített és kapcsolatba hozható a szteroid metabolizmus módosulásával. 2.1 Csontritkulás (Oszteoporózis) A csontritkulás (4. ábra) a társadalom széles rétegeit érintő népegészségügyi probléma, a csontrendszer szisztémás, progresszív megbetegedése, melyet a csonttömeg fogyása mellett a csont szerkezeti megváltozása és mindezek miatt a csont törékenységének fokozódása jellemez. Fiatal korban vagy terhesség alatt is jelentkezhet, de leggyakoribb a menopauzás nőknél (I. típus). Öregedés során (65 év felett) a betegség mindkét nemet érinti (II. típus).
4. ábra Csontritkulás
19
Az oszteoporózis kialakulásának hajlamosító tényezői jól ismertek (Westfall és mtsai, 2001): •
dohányzás
•
alkoholizmus
•
mértéktelen kávé fogyasztás
•
családi halmozódás
•
női nem
•
magasabb életkor
•
endokrin betegségek (férfi nemi hormon hiánya, pajzsmirigy túlműködés, Cushing-szindróma)
•
szteroidkészítmények tartós használata
A szexuálszteroidok alapvető szerepet játszanak a csontok homeosztázisában. Az ösztrogének jelentősége a csonttömeg fenntartásában posztmenopauzás nőknél ismert. Ezt támasztják alá azok a tanulmányok, amelyek a menopauzában az ösztrogén hormonpótló terápia (Lindsay és Tohme, 1990; Sowers és mtsai, 1993) és az ösztrogén-progesztogén kombinált kezelés hatásait vizsgálták az oszteoporózis megelőzésében (Goeretzlehner, 2001). Az
androgének
is
fontos
fiziológiás
szerepet
játszanak
a
csontállomány
fenntartásában, a csontokra antireszorptív módon hatnak. Ez részben a közvetlen androgén hatásnak köszönhető, valamint az androgének indirekt módon is hatnak az aromatizáción keresztül az androgénekből szintetizált ösztrogének révén (Davis, 1997; Sasano és mtsai, 1997). Az androgének stimulálják a csontsejtek proliferációját és differenciálódását (MunozTorres és mtsai, 1995; Kasperk és mtsai, 1997), befolyásolhatják az inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1) szintézisét (Barett-Connor és Goodman-Gruen, 1998), valamint a D-vitamin és az ösztrogén receptorok mennyiségét is (Davis és mtsai, 1994; Otremski és mtsai, 1997). A glükokortikoid többlet a csontritkulás kialakulásában jelentős szerepet játszik. A glükokortikoidok növelik a csontreszorpciót, gátolják a csontképződést és indirekt módon hatnak a csontokra az intesztinális Ca2+ abszorpció csökkentésével, a D-vitamin metabolizmus módosításával. Továbbá hiperkalciuriát tartanak fenn, gátolják a gonadotróp és szomatotróp tengelyt (Manelli és Giustina, 2000).
20
2.2 Méhtest daganat 2.2.1 Mióma Méhtestből kiinduló mesenchymalis eredetű leiomyoma (5. ábra) a női szervezet leggyakoribb daganata, a méheltávolító műtétek (hysterectomia) 30-40 %-a emiatt történik, az esetek 0,1-0,5 %-ában alakul át rosszindulatú daganattá. A reproduktív életkorban levő nők 20-25
%-ában
kimutatható,
gyakoriságának
maximumát
a
korai
változókorban
(premenopauza) éri el. Ugyanakkor a nőgyógyászati panaszok 2-3 %-ért felelős.
5. ábra Mióma
A mióma kialakulásának oka, valamint a növekedés ütemét befolyásoló tényezők ma még
tisztázatlanok.
Kialakulásában
örökletes
faktorok
is
szerepet
játszhatnak,
színesbőrűekben gyakrabban fordul elő.
21
Minden egyes góc egy sejtből eredő, monoclonalis tumor. Hormondependens daganat, ösztrogén receptorokat tartalmaz (Wilson és mtsai, 1980; Sudan és mtsai, 1987; Fujii, 1992; Brandon és mtsai, 1995; Kokawa és mtsai, 2002; Leitao és mtsai, 2004). Növekedésében az ösztrogénhormonok jelentőségét több tényező bizonyítja (Ichibura és mtsai, 1998): •
menarche előtt nem fordul elő
•
menopauza után általában nem alakul ki, a meglévő gócok általában fokozatosan kisebbednek
•
terhesség idején mérete nő, a gyermekágyban visszafejlődik
•
gyakran fordul elő fokozott ösztrogénhatásra utaló állapotokkal együtt (endometriózis, endometriumhiperplázia, melldaganat, policisztás ovárium (PCO)-szindróma stb.)
Az esetek egy részénél azonban nem mutatható ki az ösztrogénhormonok daganatnövekedést serkentő hatása (Potgieter és mtsai, 1995; Wu és Cheng, 1995). 2.2.2 Méhnyálkahártyarák A méhnyálkahártyarák (6. ábra) általában a méh nyálkahártyájából (endometrium) alakul ki, amely a leggyakoribb női nemi szervi daganat. Általában 50-60 éves korban fordul elő, azonban az esetek 5 %-a 40 éves kor előtt kerül felismerésre (Bray és mtsai, 2005). Mivel a méhtestrák gyakrabban fordul elő túlsúlyos, dohányzó, magas vérnyomásban és cukorbetegségben szenvedő nőknél, ezért ezek a betegség hajlamosító tényezői (Austin és mtsai, 1991; Hill és Austin, 1996; Troisi és mtsai, 1997; Bjorge és mtsai, 2007). A daganat kialakulása után igen lassan nő, korai stádiumban okoz klinikai tüneteket (rendetlen vérzés), hosszú ideig nem ad más szervekbe áttétet, ezért kórjóslata a méhnyakráknál lényegesen kedvezőbb.
22
6. ábra Méhnyálkahártyarák
Az endometrium daganat kifejlődésének pontos oka nem ismert, kialakulásában az ösztrogénhormonok szerepe azonban bizonyítottnak tekinthető. Gyakran ösztrogéntúlsúllyal járó állapotokkal társul (Escobedo és mtsai, 1991; Parazzini és mtsai, 1991; Potischman és mtsai, 1996; Weiss és Hill, 1996; Modan és mtsai, 1998; Niwa és mtsai, 2000; Emons és mtsai, 2000; Akhmedkhanov és mtsai, 2001; Zeleniuch-Jacquotte és mtsai, 2001; Kaaks és mtsai, 2002; Lukanova és mtsai, 2004): •
ösztrogéntermelő petefészek daganat
•
gyakori anovulációs ciklusok (PCO-szindróma, korai menarche, késői menopauza)
•
kóros elhízás (csökken a keringő progeszteron és a nemihormon-kötő fehérje (SHBG) szintje, ezért emelkedik a szabad ösztradiol szintje, továbbá az androgének a zsírszövetben is ösztrogénné alakulhatnak)
•
ösztrogéntartalmú gyógyszerek
Az esetek egy részénél azonban nem mutatható ki az ösztrogének emelkedett szintje (Judd és mtsai, 1980; Falsetti és mtsai, 1983; Bonney és mtsai, 1986). A progeszteron protektív hatását több tényező valószínűsíti. Azokban a nőkben, akik életük során terhesek voltak, ritkábban alakul ki a betegség, valamint a kombinált hormonális fogamzásgátlók szedése is protektív hatású (Weiderpass és mtsai, 1999). Néhány tanulmány szerint az androgének emelkedett szintje is elősegítheti a daganat kialakulását (Gimes és mtsai, 1986; Nagamani és mtsai, 1986; Austin és mtsai, 1991; Parazzini és mtsai, 1991; Potischman és mtsai, 1996). Vannak azonban olyan kutatási
23
eredmények is, melyek nem igazolják az androgének emelkedett szintjét (Judd és mtsai, 1980; Falsetti és mtsai, 1983; Bonney és mtsai, 1986). Genetikai faktorok is szerepet játszanak a méhtest daganat kialakulásában. Azokban a családokban, ahol petefészek-, emlő- és vastagbél daganat fordul elő (Lynch-szindróma II.), nagyobb a méhtest rák kialakulásának a kockázata (Dunlop és mtsai, 1997; Chen és mtsai, 2007). 2.3 Petefészek daganat 2.3.1 Hám eredetű petefészek daganat A női kismedencei nemi szervek rosszindulatú daganatainak 25 %-a indul ki a petefészekből. Ezzel a rosszindulatú nemi szervi tumorok között Magyarországon a harmadik leggyakoribb, a daganatos halálozást tekintve azonban első, megelőzve a méhtest és a méhnyak tumorait. Ez annak tulajdonítható, hogy korai stádiumban nem ad tüneteket, megbízható szűrőmódszerek nem állnak rendelkezésre, és a felismerésre általában csak előrehaladott stádiumban kerül sor, amikor a terápiás lehetőségek már korlátozottak. A petefészek daganatainak 80-90 %-a indul ki az embrionális coelomahám multipotens sejtjeiből származó petefészek felszíni hámból, amelynek sejtjei a felső genitális traktus valamennyi hámfélesége irányába differenciálódhatnak, előidézve a hám eredetű petefészek daganatok (7. ábra) szövettani sokféleségét.
7. ábra Hám eredetű petefészek daganat
24
A petefészek hám eredetű daganatainak kóreredete az esetek többségében ismeretlen. Ovulációkor a petefészkek felszíni hámja sérül, a hám helyreállításához fokozott sejtszaporodás szükséges. Feltehetően ekkor nagyobb esély van a proliferációt szabályozó gének mutációjára, mely a tumorképződés kialakulásához vezet (Ho, 2003). Azok az állapotok, melyekben az ovulációk száma kevesebb, csökkentik a hám eredetű petefészek daganatok kialakulásának valószínűségét (Rossing és mtsai, 1994; Ness és mtsai, 2002; Riman és mtsai, 2002; Folsom és mtsai, 2004; Tung és mtsai, 2005; Choi és mtsai, 2007; Zheng és mtsai, 2007): •
krónikus anovuláció
•
terhesség
•
szoptatás
•
orális fogamzásgátlók használata
Több szerző azt feltételezi, hogy a szteroid hormonoknak is szerepe lehet a daganat kialakulásában (Lukanova és Kaaks, 2005; Zheng és mtsai, 2007). Az androgének emelkedett szintje elősegítheti a daganat kifejlődését, ezt több tanulmány is alátámasztja (Wiegratz és mtsai, 1995; Helzlsouer és mtsai, 1995; Coenen és mtsai, 1996; Schildkraut és mtsai, 1996; Ilekis és mtsai, 1997; Cottreau és mtsai, 2003). Az emelkedett ösztrogénhatás szerepet játszhat a daganat kialakulásában (Syed és mtsai, 2001; Lindgren és mtsai, 2001; Riman és mtsai, 2002; Ho, 2003; Folsom és mtsai, 2004), azonban vannak ennek ellentmondó irodalmi adatok is (Helzlsouer és mtsai, 1995; Lukanova és mtsai, 2003). A progeszteron protektív hatását több tényező is valószínűsíti. A kombinált hormonális fogamzásgátlók használata protektív hatású, valamint a terhesség is gátolja a daganat kifejlődését (Adami és mtsai, 1994; Bu és mtsai, 1997; Risch, 1998; Yu és mtsai, 2001; Schildkraut és mtsai, 2002).
25
A betegség kb. 10 %-ában családi halmozódás figyelhető meg. A familiáris daganatok három formája ismert (Chen és mtsai, 2007; Ramus és mtsai, 2008): •
helyspecifikus familiáris petefészekrák (autoszomális domináns öröklődésű)
•
familiáris emlő/petefészekrák szindróma (a 17. kromoszómán található BRCA1, ritkábban a 13. kromoszómán levő BRCA2 tumorszupresszor gén mutációja okozza, autoszomális domináns öröklődésű)
•
Lynch-szindróma II (a 2. kromoszómán található MSH2, illetve a 3. kromoszómán levő MLH1 gén mutációja okozza)
2.3.2 Granulózasejtes petefészek daganat Az ivarléc és sztróma eredetű petefészek tumorok 80 %-át, az összes petefészek daganat 2-3 %-át granulózasejtes daganatok (8. ábra) alkotják (Schumer és Cannistra, 2003). Bármely életkorban előfordulhat, leggyakrabban 50-60 éves korban alakul ki (Savage és mtsai, 1998).
8. ábra Granulózasejtes petefészek daganat
Kóreredete ismeretlen, nem tudnak olyan faktorokról, amelyek granulózasejtes daganat kialakulására hajlamosítanának. Hormonálisan aktív tumor (Ohel és mtsai, 1983; Pectasides és mtsai, 2008), általában ösztrogéneket termel (Kaye és Davies, 1986; Lappohn és mtsai, 1989; Rey és mtsai, 1996), 5 %-ban méhtest- és emlőrák is kialakulhat a fokozott ösztrogénhatás miatt (Bennington és mtsai, 1968; Evans és mtsai, 1980). Az esetek 2-3 %-ára nem ösztrogén, hanem androgén 26
hormonok termelése jellemző (Lappohn és mtsai, 1989). Ez defeminizációval, virilizációval jár (hirzutizmus, a beszédhang elmélyülése, nőies zsírpárnák eltűnése, kopaszodás). Az esetek egy részében a granulózasejtes daganatok inhibint termelnek, amely tumormarkerként alkalmazható (Petraglia és mtsai, 1998; Robertson és mtsai, 1999). 2.4 Méhnyakrák Az európai nők körében a méhnyakrák (9. ábra) ma is a második leggyakoribb ráktípus. Magyarországon évente 1200-1500 új esetet diagnosztizálnak és évente kb. 500 nő halálát okozza ez a betegség. A betegség leggyakrabban 35-65 éves nőkben alakul ki, de a betegek 10 %-a 65 év feletti, és egyre gyakrabban figyelhető meg 35 éves kor előtt is.
9. ábra Méhnyakrák
A méhnyakrák kialakulásában a humán papillomavírus (HPV) egyes típusainak szerepe bizonyított. A több mint 100 különböző típusú HPV közül 15 magas kockázatú rákkeltő (onkogén). A HPV-16, 18, 31, 33 és 45 típusok valamelyike a tumorszövetek 90 %ában kimutatható (Mitchell és mtsai, 1986; Mitchell és mtsai, 1997). A hengerhám-laphám átmenetnél (transformációs zóna = squamo-columnáris junctio), illetve szexuális együttlét során fellépő hámsérüléseken (mikroabráziókon) keresztül a vírus bejut a bazálsejtekbe. A gazdasejtekbe jutott vírus saját szaporodása érdekében integrálódik a sejt genomjába. Az integrálódott vírus DNS korai génszakaszainak (early=E) átíródása a vírus replikációs képességének elvesztésével és a gazdasejt carcinogenesisével jár együtt. Az E6-E7 onkogének által kódolt onkoproteinek a sejt tumorszuppresszor (p53, pRB) rendszerének felfüggesztését eredményezik, így a sejt az apoptozis helyett a korlátlan osztódás útjára lép.
27
A HPV fertőzés nem minden esetben vezet méhnyakrák kialakulásához. A fertőzés az esetek 80 %-ában átmeneti jellegű, mert az immunrendszer a fertőzött sejteket eliminálja. 20 %-ban azonban a fertőzés tartóssá válik, így a jó osztódó képességgel rendelkező bazálsejtekből daganat fejlődik ki. A normál epitheliumból a daganat kialakulását megelőző (praecancerosus) állapot hónapok, az invazív daganat évek-évtizedek alatt fejlődik ki. Ugyanakkor nem minden onkogén HPV fertőzés állandósul, ami arra utal, hogy esetenként más tényezők is hozzájárulhatnak a rákkeltő HPV törzsekkel történt fertőzés talaján kialakuló méhnyakrák kifejlődéséhez. Ezek közé tartozik (Schneider és mtsai, 1987, Lindström és mtsai, 2000; Salazar és mtsai, 2001; Mori és Sagae, 2001; Lee és mtsai, 2003; Lindström és mtsai, 2008): •
dohányzás
•
fogamzásgátló tabletták hosszú távú alkalmazása
•
szülések magasabb száma
•
korán elkezdett szexuális élet
•
gyakori partnerváltás
•
immunológiai tényezők
•
hormonális státusz
•
a beteg kórelőzményében szereplő más, nemi úton terjedő betegségek
Jelenleg nem tisztázott, hogy a rákos elváltozások kialakulásához az egyes kofaktorok pontosan milyen mértékben járulnak hozzá, és milyen kölcsönhatással vannak az onkogén HPV fertőzésre. Néhány tanulmány arra utal, hogy a módosult ösztrogén metabolizmus és a legtöbb ösztrogén érzékeny sejt a méhnyakrák kockázati tényezője lehet. Az ösztradiol fokozott átalakulása 16α metabolitokká az ösztrogén érzékeny sejtekben a HPV-függő daganat jelzője lehet (Auborn és mtsai, 1991; Sepkovic és mtsai, 1995). Terhesség alatt, amikor emelkedett az ösztrogének szintje, nő a papillomavírussal fertőzött terület (Schneider és mtsai, 1987). Mai ismeretek szerint örökletes tényezők nem játszanak szerepet a betegség kialakulásában.
28
2.5 Endometriózis Az endometriózis (10. ábra) a reproduktív kor betegsége, 95 %-ban a termékeny életszakaszban
fordul
elő,
meddő
nőkben
gyakoribb.
Menopauzában
ritka,
a
posztmenopauzális endometriózis általában exogén ösztrogénkezeléssel van összefüggésben.
10. ábra Endometriózis
Az endometriózis betegségben a méh nyálkahártyájához (endometrium) hasonló szövet található a szervezet más területein, a méh üregén kívül. Az endometriózisos csomók leggyakoribb elhelyezkedése a hasüreg, de ritkán előfordulhat bármely szervben: húgyhólyagban, köldökben, belekben, tüdőben, izületekben. Az endometriózisos csomók a méh nyálkahártyájához hasonlóan reagálnak az ösztrogén és progeszteron hormonokra a menstruációs ciklus során. Minden hónapban hasonlóan felépülnek, és menstruációs vérzés formájában leválnak. Szemben a méh nyálkahártyájával, a méh üregén kívül elhelyezkedő endometriózis szövet számára nincs lehetőség a testüregből való kijutásra. Ennek eredménye belső hasüregi vérzés, a szövettörmelék
szétesése
majd
kijutása
a
csomóból,
a
csomót
övező
területen
következményes gyulladással és összenövésekkel. Az endometriózis oka ismeretlen. Számos elméletet dolgoztak ki, de ezek közül egyik sem ad magyarázatot valamennyi esetre (Matsuura és mtsai, 1994; Giudice, 2004; Zheng és mtsai, 2005). Legelfogadottabb, a "retrográd menstruáció" elmélete, amely szerint a menstruáció során a menstruációs szövettörmelék a petevezetőkön keresztül a hasüregbe jut vissza, ott megtapad a hashártyán, és növekedésnek indul. Valószínűleg az immunrendszer elváltozása
29
teremti meg a feltételeket, hogy a szövettörmelék a hashártyán megtapadjon, és növekedésnek induljon, amely folyamatot különböző citokinek és növekedési faktorok segítik elő. Másik elmélet szerint az endometriális szövet a méhüregből a nyirok- és vérkeringés útján terjedhet szét a test különböző részeire. A genetikai elmélet szerint bizonyos családok génállományában endometriózisra hajlamosító területek fordulnak elő. Újabb elmélet szerint a nők embrionális korából származó szövet maradványok alakulhatnak át a felnőtt korban később endometriózissá. A sebészi transzplantáció lehetőségét olyan esetekben vetették fel, ahol endometriózist találtak hasi műtéti hegekben. A betegség kezelésénél műtéti és gyógyszeres kezelés egyaránt szóba jöhet. Gyógyszerek alkalmazása esetén, az endometriózissal kapcsolatos tünetek kezelésében nagy szerep jut a petefészek működését (ösztrogén termelést) gátló különböző szereknek. Legelterjedtebb a gonadotropin releasing hormon (GnRH) agonisták alkalmazása, ugyanis bizonyított tény, hogy ösztrogénszegény környezetben az endometriózis visszafejlődik, és a tünetek javulnak (Hughes és mtsai, 1993; Lessey, 2000).
30
Célkitűzések Olyan komplex endokrin hátterű, nőket érintő megbetegedéseknél (csontritkulás, mióma, méhnyálkahártyarák, petefészek daganatok, méhnyakrák, endometriózis) vizsgáltuk a vizeletszteroid-profilokat, amelyek viszonylagos gyakoriságuk miatt napjainkban is nagy jelentőséggel bírnak. Ezen betegségek patofiziológiája nem teljesen felderített, és kapcsolatba hozható a szteroid metabolizmus módosulásával, melyet illetően ellentmondásosak az irodalmi adatok. Célunk volt ezen nőgyógyászati megbetegedések klinikumának jobb megismerése, hormonális hátterével kapcsolatos ismeretek bővítése. Vizsgálni kívántuk, létezik-e ezekre a kórképekre specifikusan jellemző vizeletszteroid-profil, illetve a detektált változások értelmezhetők-e a diagnosztika, valamint a terápia szintjén. Vizsgálni
kívántuk
az
androgének
és
a
kortikoszteroidok
érintettségét
a
posztmenopauzában kialakuló csontritkulásban. Premenopauzában
kialakult
miómás
nők
vizeletszteroid-profiljait
elemeztük
méheltávolító műtét előtt és után. Célunk volt a szteroid metabolizmus változásainak megismerése a kezelés előtti és utáni időszakban. Vizsgálni kívántuk a posztmenopauzában kialakuló méhnyálkahártyaráknál az androgének valamint a túlsúly, mint kockázati tényező érintettségét. Célunk volt az androgén és progeszteron metabolitok szintjének vizsgálata, ill. egyedi vizeletszteroid-profil felállítása a posztmenopauzában kialakuló hám eredetű petefészek daganatnál. Premenopauzában lévő granulózasejtes petefészek daganatos nők szteroid-profiljait elemeztük. Vizsgálni kívántuk az androgének feltételezett szerepét ezen betegségben. Célunk volt a posztmenopauzában kialakuló méhnyakráknál vizsgálni az androgének szerepét. Fiatal, endometriózisos nők vizeletszteroid-profiljait elemeztük GnRH analóg kezelés közben. Vizsgálni kívántuk a kezelés hatására kialakuló szteroid metabolizmus változásait.
31
Anyagok és módszerek
1. Beteganyag Munkánk során 24 órán át gyűjtött vizelet-mintákkal dolgoztunk. A betegcsoportokat a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika betegei közül választottuk ki, szigorú kritériumoknak megfelelően, a klinika orvosainak segítségével. A kutatást a PTE OECC Regionális Kutatás Etikai Bizottság 2785 és 2998 számú határozataiban engedélyezte. A tanulmányban azon személyek vehettek részt, akik hozzájárultak a kutatásban való részvételhez, nem szenvedtek egyéb súlyos egészségkárosító ill. endokrin betegségekben, a vizeletgyűjtés megkezdése előtt nem részesültek szteroid metabolizmust befolyásoló, valamint daganatellenes gyógyszeres kezelésben és a mintagyűjtést pontosan végezték. Ezen kritériumok miatt a csoportonként minimálisan 10 (granulózasejtes petefészek daganat esetén 2) értékelhető beteg vizsgálatba történő bevonása hosszú időt vett igénybe. Tekintettel a szteroid metabolizmus életkori sajátosságaira, az egyes csoportokat úgy alakítottuk, hogy a korösszetételük homogén legyen. Kontroll csoportként a legtöbb esetben a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika illetve a Bioanalitikai Intézet azonos nemű és hasonló korosztályú egészséges dolgozóinak közreműködését kértük. A vizsgált betegségeket, a beteg és kontroll személyek számát és kor szerinti megoszlását a 3. táblázatban foglaltam össze. Kiegészítő
adatként
a
szérum-hormonok
közül
a
progeszteron
(P),
dehidroepiandroszteron-szulfát (DHEAS), ösztradiol (E2), tesztoszteron (T), follikulus stimuláló hormon (FSH) és a luteinizáló hormon (LH) szintjei is meghatározásra kerültek. (Ez alól kivételt képez a csontrikulás vizsgálata). A szérum minták vételezése ugyanazon a napon (reggel 7 és 8 óra között) történt, mint a vizelet minták gyűjtése. A mintákat a feldolgozásig fagyasztva
(-20°C)
tároltuk.
A
szérum-hormonok
mennyiségi
meghatározása
elektrokemilumineszcens immunoesszé technikával történt a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Laboratóriumi Medicina Intézetben.
32
3. táblázat A vizsgált betegségek, a beteg és kontroll személyek száma (n) és kor szerinti megoszlása Betegségek n
Betegek Tartomány értékek; átlag életkor (év)
n
Kontrollok Tartomány értékek; átlag életkor (év)
Csontritkulás
posztmenopauzás nők
11
50-72; 53,8
13
52-75; 56,6
Mióma
premenopauzás nők
10
47-52; 49,2
10
39-51; 43,4
Méhnyálkahártyarák Hám eredetű petefészek daganat Granulózasejtes petefészek daganat
posztmenopauzás nők
13
53-85; 67,7
10
51-69; 58,7
posztmenopauzás nők
15
50-81; 60,4
10
51-69; 58,7
premenopauzás nők
2
50-50; 50
10
39-51; 43,4
Méhnyakrák
posztmenopauzás nők
14
50-85; 59,6
10
51-69; 58,7
Endometriózis
fiatal nők
10
23-34; 28,8
10
24-32; 26
1.1 Csontritkulásos betegek Olyan csontritkulásos betegeket választottunk ki, akiknél a posztmenopauzában alakult ki a betegség. Az utolsó, petefészekhormonok által kiváltott havivérzés a menopauza, amelyet egy éven belül nem követ másik. A menopauza előtti életszakaszt premenopauzának, az utána következőt posztmenopauzának nevezzük. Az utolsó havivérzés körüli, 2-2 éves időszakot pedig perimenopauzának hívjuk. A kontroll személyek posztmenopauzában lévő nők voltak. 1.2 Méhtest daganatos betegek 1.2.1 Miómás betegek Olyan, műtét előtt álló betegek kerültek kiválasztásra, akiknél a premenopauzában alakult ki a mióma. A kiválasztott személyektől a vizelet és a szérum minták vételezése műtét előtt és a műtét utáni hatodik héten történt. A kontroll személyek premenopauzában lévő, egészséges egyetemi dolgozók voltak.
33
1.2.2 Méhnyálkahártyarákos betegek Olyan, kezelés előtt álló betegeket választottunk ki, akiknél a posztmenopauzában fejlődött ki a méhnyálkahártyarák. A kontroll személyek posztmenopauzában lévő nők voltak. 1.3 Petefészek daganatos betegek 1.3.1 Hám eredetű petefészek daganatos betegek Olyan, kezelés előtt álló petefészek daganatos betegek kerültek kiválasztásra, akiknél a posztmenopauzában alakult ki a betegség. A kontroll személyek posztmenopauzában lévő nők voltak. 1.3.2 Granulózasejtes petefészek daganatos betegek A
granulózasejtes
petefészek
daganat
ritka
előfordulása
miatt
csak
két
premenopauzában lévő beteget választottunk ki. A kontroll személyek premenopauzában lévő nők voltak. 1.4 Méhnyakrákos betegek Olyan, kezelés előtt álló beteg személyek kerültek kiválasztásra, akiknél a posztmenopauzában fejlődött ki a méhnyakrák. A kontroll személyek posztmenopauzában lévő nők voltak. 1.5 Endometriózisos betegek Olyan fiatal, premenopauzában lévő endometriózisos betegeket választottunk ki, akik a két hónapos GnRH analóg kezelést követően szolgáltatták a vizelet és a szérum mintákat. A kontroll személyek az egyetem fiatal dolgozói voltak.
34
2. Vizeletszteroid-profil elemzés Az általunk használt módszer alapja C. H. L. Shackleton és mtsai által kidolgozott szteroid-profil meghatározás volt (Shackleton, 1976; Shackleton és Whitney, 1980a; Homoki és mtsai, 1987; Shackleton, 1990). Az 1990-es évek elején a PTE ÁOK Bioanalitikai Intézet gázkromatográfiai laboratóriuma által adaptált vizeletszteroid-profil módszert (Juricskay és Mezey, 1994; Juricskay és mtsai, 1997; Poór és mtsai, 2004) alkalmaztuk a csontritkulásos betegek mintáinak feldolgozásánál. A technikai feltételek korszerűsítésének köszönhetően a módszert továbbfejlesztettük (Bufa és mtsai, 2008) és az új módszert alkalmaztuk a mióma, a méhnyálkahártyarák, a petefészek daganatok, a méhnyakrák és az endometriózis vizsgálatainál. A továbbiakban a betegségek többségének vizsgálatánál használt, továbbfejlesztett vizeletszteroid-profil módszer lépéseit részletezem. 2.1 Minták gyűjtése és tárolása A 24 órás vizeletgyűjtési idő betartására fokozottan felhívtuk a betegek és a kontroll személyek figyelmét. A 24 órás vizeletgyűjtés a következők alapján történt: a lefekvés előtti utolsó vizeletürítés után üres hólyaggal indult a gyűjtés, és 24 óra múlva az utolsó vizeletürítéssel fejeződött be. A vizelet mennyiségének meghatározása után a mintákból 50-50 ml-t a feldolgozásig fagyasztva (-20°C) tároltunk. 2.2 Mintaelőkészítés 2.2.1 Szteroidok kivonása A szteroid-konjugátumok kivonása vizeletből szilárd fázisú extrakcióval történt. Mintánként 20 ml vizeletet extraháltunk szűrők közé töltött oktadecilszilán fázist tartalmazó Sep-pak C18 oszlopokon (Waters Assoc, Milford, MA USA). Az oszlopokat előzőleg 5 ml metanollal aktiváltuk, 5 ml desztillált vízzel mostuk, majd 10 ml-es üvegfecskendővel két részletben az oszlopokra juttattuk a vizeletet ~20 ml/perc-es áramlási sebeséggel. A szteroidokat 5 ml vízzel és 5 ml levegővel való mosás után 5 ml metanollal eluáltuk. Az eluálásnál a mintákat a negyedik csepptől kezdve 10 ml-es, teflonos bevonatú műanyag tetővel zárható üvegcsövekben gyűjtöttük, majd ezt követően a metanolt 37°C-on N2 gázzal elpárologtattuk. Az oszlopokat 5 ml metanollal és 5 ml vízzel tisztítottuk.
35
2.2.2 Konjugátumok hidrolízise és kivonása A üvegcsövekben maradt mintákat 4 ml 0,1 M acetát pufferben (pH 4,6) oldottuk, majd 50 µl β-glükuronidáz-arilszulfatáz enzim keverék (Helix pomatia, Merck KGsA, Darmstadt, Germany) hozzáadásával enzimatikus hidrolízissel (3 óra, 55°C) szabadítottuk fel a szteroidokat a glükuronid, ill. szulfát konjugátumaikból. A felszabadított szteroidokat a 2.2.1 pontban leírtak szerint újból extraháltuk a Sep-pak C18 oszlopokon. A metanol N2 gázzal történő elpárologtatása után a kivonatokat 2 ml metanolban oldottuk, így bekoncentráltuk azokat. 2.2.3 Származékképzés A kémiai átalakítás előtt mintánként 200-200 µl-t külön üvegcsövekbe mértünk, majd 200 µl előzőleg elkészített metanolban oldott belső standardokat: 5α-androsztán-3β,17β-diol (IS), sztigmaszterol (SS) és koleszteril-butirát (KB) (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO, USA) adtunk hozzájuk, így az oldat 5-5 µg belső standardokat tartalmazott. Ezek után a mintákról a metanolt N2 gázzal elpárologtattuk, majd 120 µl, 2 %-os piridinben oldott metoxiamin-hidrokloridot (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO, USA) adtunk hozzájuk, és 4 órás 80°C-os inkubáció után a piridint N2 gázzal elpárologtattuk. Ezt követően 50 µl, N-trimetilszililimidazolt (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO, USA) adtunk a mintákhoz, és egy éjszakán át tartó 100°C-os inkubáció során metoxim-trimetilszilil származékok keletkeztek. 2.2.4 Tisztítás A szililező reagens feleslegét oszlopkromatográfiával távolítottuk el a mintákból. Lipidex 5000 (10-20 % hidroxil-alkoxipropil-Sephadex, 80-100 % metanol) (Packard Bioscience BV, Groeningen, Netherland) felhasználásával géloszlopokat készítettünk Pasteur pipettákban az alábbiak szerint. A Lipidex 5000-t mostuk kétszer 5 ml metanollal, 5 ml etanollal, majd kétszer 5 ml ciklohexánnal. Ezt követően 100 mm-es géloszlopokat töltöttünk a Pasteur pipettákba, amelyek elkeskenyedő végébe a gél betöltése előtt üveggyapotot helyeztünk. A géloszlopokat átmostuk kétszer 1-1 ml ciklohexánnal, és kétszer 1-1 ml ciklohexán: piridin: hexametildiszilazán (CPH) 98:1:1 térfogat arányú elegyével. A kivont
36
szteroidokat 1 ml ciklohexánban oldottuk, felvittük az oszlopokra, majd leoldottuk négyszer 1-1 ml CPH-val. Végezetül a mintákat N2 gázzal ~100 µl-re pároltuk. 2.3 Gázkromatográf-tömegspektrometria 2.3.1 Gázkromatográf-tömegspektrometriai mérések Munkánk során Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográffal (GC-MS) (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) (11. ábra) dolgoztunk, a komponenseket HP-1-MS (25 m* 0,2 mm* 0,33 µm), (Hewlett-Packard Company, USA) oszlopokon választottuk el. Vivőgázként héliumot (1,5 ml/perc) alkalmaztunk. A split-splitless mintabemérő és a transzferline hőmérsékletét 250oC-ra, az elektron ionizáló ionforrás hőmérsékletét 230oC-ra, a kvadrupól analizátor hőmérsékletét 150oC-ra állítottuk. Az elektronionizáció 70 eV-on történt. A hőmérsékleti program a következő volt: a 100oC-os kezdeti hőmérsékletet 1 percig tartottuk, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra emeltük, majd egy 1 perces izoterm periódus után tovább növeltük 270oC-ra 2,1oC/perces növekedési ütemmel. Ezek után tovább emeltük a hőmérsékletet 25oC/perc sebességgel 320oC-ra és ezt tartottuk 8 percig (Bufa és mtsai, 2008). 2 µl minta bemérése splitless injektálási technikával történt az automata mintabemérő segítségével.
11. ábra 6890N Gázkromatográf-5975 Tömegspektrométer
A vizeletben 23 szteroid-metabolit mennyiségét határoztuk meg (4. táblázat). A szteroid-metabolitok molekulatömege, szerkezeti- és összegképlete a Függelék 1. táblázatában található. A belső standardok közül az IS-t a mennyiségi analízishez, az SS-t a származékképzés, a KB-t a rendszer tömítettségének ellenőrzéséhez alkalmaztuk. 37
4. táblázat A szteroid-profil segítségével meghatározott vizeletszteroid-metabolitok
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Triviális név Androszteron Etiokolanolon Dehidroepiandroszteron 11β-hidroxi-androszteron 11β-hidroxi-etiokolanolon 16α-hidroxi-DHEA Pregnándiol Pregnántriol Pregnéndiol Androszténtriol Tetrahidro-11-deoxikortizol 11-keto pregnántriol Pregnéntriol Tetrahidrokortizon Tetrahidro-11-dehidrokortikoszteron Tetrahidrokortikoszteron Allo-tetrahidrokortikoszteron Tetrahidrokortizol Allo-tetrahidrokortizol α-kortolon β-kortolon α-kortol Kortizol
Rövidítés An Et DHEA 11-OH-An 11-OH-Et 16-OH-DHEA PD PT ∆5-PD ∆5-AT THS 11-O-PT ∆5-PT THE THA THB aTHB THF aTHF α-CL β-CL α-C F
Tudományos név 5α-androsztán-3α-ol-17-on 5β-androsztán-3α-ol-17-on 5-androsztén-3β-ol-17-on 5α-androsztán-3α,11β-diol-17-on 5β-androsztán-3α,11β-diol-17-on 5-androsztén-3β,16α-diol-17-on 5β-pregnán-3α,20α-diol 5β-pregnán-3α,17α,20α-triol 5-pregnén-3β,20α-diol 5-androsztén-3β,16α,17β-triol 5β-pregnán-3α,17α21-triol-20-on 5β-pregnán-3α,17α,20α-triol-11-on 5-pregnén-3β,17α,20α-triol 5β-pregnán-3α,17α,21-triol-11,20-dion 5β-pregnán-3α,21-diol-11,20-dion 5β-pregnán-3α,11β,21-triol-20-on 5α-pregnán-3α,11β,21-triol-20-on 5β-pregnán-3α,11β,17α,21-tetrol-20-on 5α-pregnán-3α,11β,17α,21-tetrol-20-on 5β-pregnán-3α,17α,20α,21-tetrol-11-on 5β-pregnán-3α,17α,20β,21-tetrol-11-on 5β-pregnán-3α,11β,17α,20α,21-pentol-11-on 4-pregnén-11β,17α,21-triol-3,20-dion
A metabolitok a kromatogramok alapján, a származékaik retenciós idejeinek sorrendjében vannak feltüntetve.
38
2.3.2. Minőségi és mennyiségi analízis A gázkromatográf-tömegspektrometriai mérés szelektív ionkövetéssel (SIM) történt. Minden származékképzett szteroid-metabolitnál és a belső standardoknál három tömegiont, a céliont (Tg ion) és két minősítő iont (Q ionok) választottunk ki, amelyeket a 5. táblázatban foglaltam össze (Homma és mts, 2003; Bufa és mts, 2008). A származékképzett szteroidok, a cél és minősítő ionok szerkezeti képleteit a Függelék 2. táblázatában ábrázoltam. A szteroid-metabolitokat a származékaik retenciós idejei, valamint az egyes származékképzett metabolit célionjának és minősítő ionjainak egymáshoz viszonyított aránya alapján azonosítottuk. A mennyiségi meghatározás során az összes mért komponens érzékenységi faktorokkal korrigált célion csúcs alatti területét viszonyítottuk az 5α-androsztan-3β,17β-diolszármazék (IS) célionjának csúcs alatti területéhez.
39
5. táblázat Származékképzett szteroid-metabolitok és a belső standardok retenciós ideje, cél és minősítő tömegionjai
Származékképzett szteroid-metabolit 5α-androsztán-3α-trimetil-szililoxi-17-metoxim 5β-androsztán-3α-trimetil-szililoxi-17-metoxim 5-androsztén-3β-trimetil-szililoxi-17-metoxim 5α-androsztán-3α,11β-bisz-trimetil-szililoxi-17-metoxim 5β-androsztán-3α,11β-bisz-trimetil-szililoxi-17-metoxim 5-androsztén-3β,16α-bisz-trimetil-szililoxi-17-metoxim 5β-pregnán-3α,20α-bisz-trimetil-szililoxi 5β-pregnán-3α,17α,20α-trisz-trimetil-szililoxi 5-pregnén-3β,20α-bisz-trimetil-szililoxi 5-androsztén-3β,16α,17β-trisz-trimetil-szililoxi 5β-pregnán-3α,17α,21-trisz-trimetil-szililoxi-20-metoxim 5β-pregnán-3α,17α,20α-trisz-trimetil-szililoxi-11-metoxim 5-pregnén-3β,17α,20α-trisz-trimetil-szililoxi 5β-pregnán-3α,17α,21-trisz-trimetil-szililoxi-11,20-bisz-metoxim 5β-pregnán-3α,21-bisz-trimetil-szilioxi-11,20-bisz-metoxim 5β-pregnán-3α,11β,21-trisz-trimetil-szililoxi-20-metoxim 5α-pregnán-3α,11β,21-trisz-trimetil-szililoxi-20-metoxim 5β-pregnán-3α,11β,17α,21-tetra-trimetil-szililoxi-20-metoxim 5α-pregnán-3α,11β,17α,21-tetra-trimetil-szililoxi-20-metoxim 5β-pregnán-3α,17α,20α,21-tetra-trimetil-szililoxi-11-metoxim 5β-pregnán-3α,17α,20β,21-tetra-trimetil-szililoxi-11-metoxim 5β-pregnán-3α,11β,17α,20α,21-penta-trimetil-szililoxi-11-metoxim 4-pregnén-11β,17α,21-trisz-trimetil-szilioxi-3,20-bisz-metoxim 5α-androsztán-3β,17β-bisz-trimetil-szilioxi 3β-trimetil-szililoxi-5-kolesztén-3-butirát 5,22-kolesztadién-24β-etil-3β-trimetil-szilioxi
Retenciós idő (perc) 20,93 21,31 22,76 25,83 26,18 26,79 27,68 28,49 29,43 29,69 30,19 31,68 32,86 33,07 33,55 33,93 34,37 34,55 34,85 35,38 36,22 37,25 40,62 23,43 40,43 41,89
Célion (m/z) 270,1 270,1 260,2 448,2 448,2 446,2 269,1 255,1 372,1 432,2 564,3 449,3 433,2 578,3 431,3 474,3 474,3 472,3 472,3 449,3 449,3 343,2 515,2 421,2 484,3 368,3
Minősítő ionok (m/z) 360,2 391,1 360,2 391,1 358,2 389,3 358,2 479,1 358,2 479,1 356,2 477,3 284,1 449,3 435,3 552,1 462,3 447,2 522,4 329,3 474,3 595,4 359,2 566,2 343,2 253,1 488,3 506,2 490,2 521,4 564,4 595,4 564,4 595,4 562,3 580,2 562,3 580,2 551,3 359,2 551,3 359,2 523,2 548,1 361,2 425,1 346,2 436,1 394,2 255,1 353,2 326,2
A méréseket megelőzően a mennyiségi analízishez alkalmazott két darab, több-pontos kalibrációt készítettünk ismert mennyiségű szteroid-metabolit származékok és belső standardok (IS, SS, KB) elegyéből létrehozott referencia oldatok felhasználásával. Az alacsonyabb koncentráció-tartományra készített kalibrációs görbe felvett koncentráció-pontjai 10 ng / 200 µl, 50 ng / 200 µl, 500 ng / 200 µl és 1500 ng / 200 µl voltak. A magasabb koncentráció-tartományra készített kalibrációs görbe felvett koncentráció-pontjai 500 ng / 200 µl, 1500 ng / 200 µl, 5000 ng / 200 µl és 10000 ng / 200 µl voltak. A belső standardok koncentrációja minden felvett koncentráció-pontnál 5-5 µg / 200 µl volt. Az An szteroidmetabolitnak az alacsonyabb és a magasabb koncentráció-tartományra készített kalibrációs görbéit a Függelék 1. és 2. ábrái mutatják. Meghatároztuk az általunk használt műszerre vonatkoztatva az egyes szteroidmetabolit származékok kimutatási határait (LOD) és az alsó meghatározási határait (LLOQ), 40
melyeket figyelembe vettünk az metabolit értékek feldolgozásánál. A statisztikai számításokhoz azon metabolitok értékeit használtuk fel, melyek meghaladták a LLOQ értékeit. A mért szteroid-metabolitok LOD és LLOQ értékeit (ng/200µl) a Függelék 3. táblázatában foglaltam össze. A megbízható mérési eredmények ellenőrzése és hitelesítése érdekében a PTE ÁOK Bioanalitikai Intézet 1996 óta részt vesz a holland MCA szekció SKZL (Stichting Kwaliteitscewaking Klinisch Chemishie Ziekenhuislaboratoria) külső minőségbiztosítási programjában (www.skzl-mca.nl). 2.4 Eredmények normalizálása, statisztikai értékelése A vizsgált szteroid-metabolitok vizeletbe történő kiválasztásának napi ritmusa van, így a 24 órás vizelet gyűjtés lehetséges hibáinak kiküszöbölése érdekében a kapott szteroidmetabolitok koncentráció értékeit a vizelet mintákból meghatározott kreatinin koncentráció értékekre számoltuk át (nmol/µmol kreatinin). (Ez alól kivételt képez a csontritkulás vizsgálata, mely során a szteroid-metabolitok koncentráció értékeit a korábban alkalmazott vizeletszteroid-profil módszer alapján µmol/24 órában határoztuk meg). Normál vesefunkció mellett a kreatinin a glomerulus filtrációval választódik ki és a vizeletbe ürülő napi szintje állandónak tekinthető, így más, vizeletbe ürülő vegyület koncentrációjának referencia értékéül szolgál. A vizelet kreatinin meghatározása a módosított Jaffé módszer szerint történt (Bartels és mts, 1972; Foster-Swanson és mtsai, 1994) a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Laboratóriumi Medicina Intézetben. Az egyes betegek mintáiban mért szteroid-metabolitok mennyiségeit statisztikai próbákkal hasonlítottuk össze a kontrollok mintáiban mért szteroid-metabolitok értékeivel. A minták normalitás vizsgálatához Kolmogorov-Smirnov próbát alkalmaztunk. A minták nem normális eloszlásúak voltak, így a statisztikai értékeléshez a Mann-Whitney (M-W) tesztet alkalmaztunk, ezért az adatokat a minta-számmal (n), a középértékkel (Me), az alsó és felső negyedelő értékekkel (Q1, Q3), valamint a granulózasejtes petefészek daganat vizsgálatánál a minimum (Min) és a maximum (Max) értékekkel is jellemeztük. Az összetartozó értékpárok vizsgálatára a Wilcoxon (W) tesztet használtuk. Statisztikailag szignifikánsnak tekintettük azokat a próbákat, melyeknél a p értéke 5 %-nál kisebbnek bizonyult. A statisztikai számításhoz az SPSS 11.0 szoftvert alkalmaztuk (SPSS Institute Inc., Chicago, IL, USA).
41
Eredmények Vizeletszteroid-profil
méréseket
végeztünk
csontritkulásos,
miómás,
méhnyálkahártyarákos, hám és granulózasejt eredetű petefészek daganatos, méhnyakrákos, valamint endometriózisos megbetegedésekben. A 24 órán át gyűjtött vizeletből standardizált extrakciós és származékképzési eljárás után androgén, kortizol és progeszteron metabolitok mennyiségét határoztuk meg gázkromatográfiai, ill. gázkromatográf-tömegspektrometriai technikával. A szteroid-metabolitoknak a betegeknél és az egészséges kontrolloknál kapott értékeit statisztikai módszerek alkalmazásával összehasonlítottuk és elemeztük. Egy 65 éves, posztmenopauzás, kontroll csoporthoz tartozó nő vizeletszteroid-profilját a 12. ábra mutatja.
2 KB
IS 1
14 20 SS
8
4
21 5
3
13
10 6 7
9 11
12
18 16
22
15
19
23
17
Idő (perc)
12. ábra Egy 65 éves, posztmenopauzás, kontroll nő vizelet mintájának szteroid-profil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográf, HP-1-MS oszlop, hélium vívőgáz, elektronionizáció 70 eV-on, splitless injektálási technika, 2 µl mintabemérés automata injektorral. Hőmérsékleti program: 100oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra felfűtés, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 270oC-ra 2,1oC/perc sebességgel, majd ismét további hőmérséklet emelés 25oC/perc sebességgel 320oC-ra, és egy 8 perces izoterm periódus (Bufa és mtsai, 2008).
42
1. Szteroid profil vizsgálatok csontritkulásos nőknél Egy 65 éves, posztmenopauzás, csontritkulásos nő vizeletszteroid-profilját a 13. ábra mutatja.
IS 1
2 14 SS 18
4 6
20 7
3
13
9 5
KB
19
8
10 11
12
17
21 22
15 16
23
Idő (perc)
13. ábra Egy 65 éves, posztmenopauzás, csontritkulásos nő vizelet mintájának szteroid-profil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5890 Series II. gázkromatográf lángionizációs detektorral, Ultra-1 oszlop, nitrogén vívőgáz, splitless injektálási technika, 1 µl mintabemérés kézi injektálással. Hőmérsékleti program: 50oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 2 perces izoterm periódus, majd 30oC/perc sebességgel 180oC-ra felfűtés, majd egy 4 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 300oCra 2,1oC/perc sebességgel, és egy 8 perces izoterm periódus (Poór és mtsai, 2004).
A vizelet mintákat a korábban alkalmazott vizeletszteroid-profil módszer (Poór és mtsai, 2004) szerint dolgoztuk fel. Tizenegy,
posztmenopauzában
levő,
kezelés
előtt
álló
csontritkulásos
nő
vizeletszteroid-metabolit értékeit (µmol/24 óra) határoztuk meg és hasonlítottuk össze tizenhárom, posztmenopauzában lévő, egészséges nő metabolit értékeivel. Ezt mutatja a 6. táblázat. A szérum hormonok szintjeiről nem álltak rendelkezésre adatok.
43
6. táblázat Posztmenopauzás, csontritkulásos betegek és kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (µmol/24 óra) Kontroll (n=13) Szteroid
Adat-
szám metabolitok An 13 13 Et 13 DHEA 11-OH-An 13 11-OH-Et • 12 16-OH-DHEA 13 PD 13 PT 13 ∆5-PD 13 ∆5-AT 13 THS 13 11-O-PT • 12 ∆5-PT 13 13 THE 13 THA THB 13 aTHB • 12 THF 13 aTHF 13 α-CL 13 β-CL • 12 α-C • 12 F• 11
(µmol/24 óra) Átlag 2,8 3,2 0,6 2,5 1,0 1,9 0,9 1,0 0,3 1,1 0,5 0,1 0,6 9,3 0,8 1,1 1,4 3,3 3,0 2,9 2,5 1,4 0,7
Adat-
Q1
Me
Q3
1,2
2,4
4,1
1,9
3,4
3,9
0,3
0,5
1,0
1,2
1,9
3,8
0,3
0,6
1,8
1,0
1,4
1,7
0,4
0,7
1,3
0,4
0,7
1,7
0,1
0,2
0,4
0,6
0,9
1,5
0,2
0,4
0,5
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,9
4,1
9,0
14,0
0,2
0,6
1,0
0,4
0,9
1,8
0,6
0,9
2,3
1,6
2,5
4,3
1,2
2,4
5,8
1,1
2,7
4,1
1,3
2,4
4,0
0,6
1,2
2,3
0,4
0,6
0,7
szám 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10 11 11
M-W teszt p-értéke
Beteg (n=11) (µmol/24 óra) Átlag 1,6 1,6 0,2 2,1 3,1 1,0 1,0 1,5 0,2 2,3 0,2 0,1 0,1 3,5 0,2 0,8 0,6 1,9 1,9 1,8 1,3 0,4 1,3
Q1
Me
Q3
0,7
1,7
2,2
0,7
1,2
2,3
0,1
0,1
0,2
0,8
1,0
4,2
0,5
2,3
3,4
0,1
0,6
1,7
0,3
0,5
1,4
0,5
1,3
2,4
0,1
0,1
0,3
0,7
0,9
1,0
0,0
0,1
0,2
0,0
0,1
0,2
0,0
0,1
0,2
1,8
2,1
4,8
0,1
0,1
0,3
0,2
0,3
0,5
0,2
0,3
1,2
1,0
1,3
1,9
0,8
1,7
2,5
0,9
1,4
2,6
0,8
1,1
2,0
0,2
0,3
0,4
0,2
0,5
1,9
>0,05 0,045 <0,01 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,013 0,03 >0,05 0,02 >0,05 >0,05 >0,05 0,045 <0,01 >0,05
•-al jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékeit nem lehetett meghatározni az összes vizelet-mintában. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb metabolitokat és p értékeit piros betűvel jelöltük. A posztmenopauzában lévő, csontritkulásos nők vizeletszteroid-metabolit szintjeit a kontrollokéhoz viszonyítva azt tapasztaltuk, hogy szignifikánsan alacsonyabb volt az androgén metabolitok közül az Et és a DHEA szintje (6. táblázat). Nem volt szignifikáns különbség a progeszteron metabolit szintjében. A kortikoszteron metabolitok közül a THA és az aTHB szintjében tapasztaltunk szignifikánsan alacsonyabb értékeket a kontroll értékekhez képest (6. táblázat). Meglepő eredmény volt, hogy szignifikánsan alacsonyabb értékeket tapasztaltunk az egy napi kortizol termelést jellemző összeget alkotó kortizon és kortizol metabolitok közül a THE, a β-CL és az α-C szintjében a csontritkulásban szenvedő betegeknél (6. táblázat).
44
2. Szteroid profil vizsgálatok méhtest daganatos nőknél 2.1 Vizsgálatok miómás betegeknél Egy 49 éves, premenopauzás, miómás, műtét előtti nő vizeletszteroid-profilját a 14. ábra mutatja. IS
2
KB
SS 20 14 1 8
7 13
4 6 3
21 18 16
5
22
10 9
11
19
15 12
23
17
Idő (perc)
14. ábra Egy 49 éves, premenopauzás, miómás, műtét előtti nő vizelet mintájának szteroid-profil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográf, HP-1-MS oszlop, hélium vívőgáz, elektronionizáció 70 eV-on, splitless injektálási technika, 2 µl mintabemérés automata injektorral. Hőmérsékleti program: 100oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra felfűtés, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 270oC-ra 2,1oC/perc sebességgel, majd ismét további hőmérséklet emelés 25oC/perc sebességgel 320oC-ra, és egy 8 perces izoterm periódus (Bufa és mtsai, 2008).
Tíz, menopauza előtti, miómás beteg vizeletszteroid-metabolitjait és szérum-hormon értékeit határoztuk meg műtét előtt, illetve műtét után 6 héttel, és összehasonlítottuk tíz, hasonló korú, egészséges nő értékeivel. Az 7. táblázatban a műtét előtt, a 8. táblázatban a műtét után mért vizeletszteroid értékeket (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) hasonlítottuk össze a kontroll értékekkel. A 9. táblázatban a műtét előtt és műtét után mért értékeket viszonyítottuk egymáshoz. Mivel a műtéti kezelés során a petefészkek eltávolítása is megtörtént, ezért a miómás betegek műtét utáni vizeletszteroid-metabolit értékeit a lecsökkent hormontermelésű
45
petefészkekkel
rendelkező,
posztmenopauzában
lévő
kontrollok
értékeivel
is
összehasonlítottuk. Ezt mutatja a 10. táblázat. A 11. táblázatban a műtét előtt, a 12. táblázatban a műtét után mért szérum-hormon koncentráció értékeket hasonlítottuk össze a kontroll értékekkel. A 13. táblázatban a műtét előtt és műtét után mért értékeket viszonyítottuk egymáshoz. 7. táblázat Premenopauzás, miómás, műtét előtti betegek és kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) Kontroll (n=10) Szteroid
Adat-
szám metabolitok An 10 Et 10 DHEA * 10 11-OH-An 10 11-OH-Et 10 16-OH-DHEA * 10 PD 10 PT 10 ∆5-PD ** 5 ∆5-AT 10 THS ** 3 11-O-PT ** 3 ∆5-PT * 10 THE 10 THA * 10 THB * 10 aTHB * 8 10 THF aTHF * 8 10 α-CL β-CL 10 10 α-C F ** 0
(nmol/µmol kreatinin) Átlag 4,4 5,4 0,9 1,9 1,5 1,9 3,4 1,8
Q1
M-W teszt
Beteg, műtét előtt (n=10) Adat-
Me
Q3
2,3
5
5,7
3,2
3,6
7,5
0,2
0,8
1,5
1,5
1,7
2,1
1,2
1,5
1,7
0,7
1,6
2,4
1,8
4,5
5
1,2
1,9
2,2
1,1
0,3
0,9
1,4
0,7 7,1 0,6 2,1 0,5 2,1 1,1 2,1 1,6 0,3
0,5
0,6
0,8
5,3
7,7
8,2
0,3
0,6
0,8
1,3
2
3,3
0,5
0,5
0,6
1,5
2
2,5
0,7
0,8
1,7
1,8
2,1
2,2
1,3
1,6
1,8
0,2
0,3
0,4
szám 10 10 7 10 10 8 10 10 5 10 4 2 8 10 7 9 9 10 10 10 10 10 2
(nmol/µmol kreatinin) Átlag 6 8,1 2,1 3,9 2,6 4,1 6,3 2,7
p-értéke
Q1
Me
Q3
0,7
5,7
9
1,3
7,5
12,1
0,9
1,2
4
0,7
4,9
6,2
0,3
1,4
5,1
1,8
4,2
5,8
0,8
1,9
10,5
1,2
2,7
3,9
>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
2,2
0,4
2,1
2,6
>0,05
2,1 12,5 1,1 1,9 1,1 5 2,3 4,3 1,6 0,8
0,9
2,3
2,6
5,3
15,2
17,8
0,8
1,1
1,4
0,7
2,1
2,7
0,5
1,2
1,7
2,3
5,7
7,4
1,3
2,2
3,5
2,1
4,6
5,8
0,9
1,7
2,3
0,4
0,7
1,1
0,013 >0,05 0,006 >0,05 >0,05 0,034 0,021 0,034 >0,05 0,028
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit.
**-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb metabolitokat és p értékeit zöld betűvel jelöltük.
A premenopauzában lévő, miómás betegek műtét előtt mért vizeletszteroid-metabolit értékeit és a kontrollok értékeit egymáshoz viszonyítva nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést az androgén és a progeszteron metabolitok szintjeiben.
46
A beteg csoportnál szignifikánsan magasabb értékeket találtunk (7. táblázat) a kortizol metabolitok: THF, aTHF és α-C, a kortizon metabolitok közül az α-CL, a kortikoszteron metabolitok közül a THA, valamint a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PT szintjeiben. Vizsgálatunk során nem tudtuk a statisztikai számításhoz felhasználni a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PD, THS, 11-O-PT és az össz kortizol F metabolitok mennyiségeit, mert ezen metabolitok mennyiségi értékei a legtöbb beteg és kontroll mintákban nem érték el a LLOQ értékeket. Egy 47 éves, premenopauzás, miómás, műtét utáni nő vizeletszteroid-profilját a 15. ábra mutatja. IS
SS
10
20
14 KB 8 1
21 2
9 4 7
5 6
13 11
16
18
15 12
19
22
23
17
Idő (perc)
15. ábra Egy 47 éves, premenopauzás, miómás, műtét utáni nő vizelet mintájának szteroid-profil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográf, HP-1-MS oszlop, hélium vívőgáz, elektronionizáció 70 eV-on, splitless injektálási technika, 2 µl mintabemérés automata injektorral. Hőmérsékleti program: 100oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra felfűtés, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 270oC-ra 2,1oC/perc sebességgel, majd ismét további hőmérséklet emelés 25oC/perc sebességgel 320oC-ra, és egy 8 perces izoterm periódus (Bufa és mtsai, 2008).
47
8. táblázat Premenopauzás, miómás, műtét utáni betegek és kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) Kontroll (n=10) Szteroid
Adat-
szám metabolitok An * 10 10 Et DHEA ** 10 11-OH-An * 10 11-OH-Et * 10 16-OH-DHEA * 10 PD * 10 PT 10 ∆5-PD ** 5 ∆5-AT * 10 THS ** 3 11-O-PT ** 3 ∆5-PT * 10 THE 10 THA * 10 THB * 10 aTHB * 8 THF 10 aTHF * 8 α-CL 10 β-CL 10 α-C * 10 F ** 0
(nmol/µmol kreatinin) Átlag 4,4 5,4
Q1
M-W teszt
Beteg, műtét után (n=10) Adat-
Me
Q3
2,3
5
5,7
3,2
3,6
7,5
1,9 1,5 1,9 3,4 1,8
1,5
1,7
2,1
1,2
1,5
1,7
0,7
1,6
2,4
1,8
4,5
5
1,2
1,9
2,2
1,1
0,3
0,9
1,4
0,7 7,1 0,6 2,1 0,5 2,1 1,1 2,1 1,6 0,3
0,5
0,6
0,8
5,3
7,7
8,2
0,3
0,6
0,8
1,3
2
3,3
0,5
0,5
0,6
1,5
2
2,5
0,7
0,8
1,7
1,8
2,1
2,2
1,3
1,6
1,8
0,2
0,3
0,4
szám 9 10 3 8 6 7 9 10 4 9 2 0 8 10 4 7 6 10 8 10 10 8 0
(nmol/µmol kreatinin) Átlag 2,1 2,3
Q1
p-értéke
Me
Q3
0,4
3
3,4
0,5
2,2
4,5
1 1,2 1,7 0,7 1,2
0,4
1,1
1,6
0,1
1,5
1,7
0,8
2,1
2,4
0,3
0,6
1,1
0,5
1,2
2,1
0,008 >0,05 >0,05 <0,001 >0,05
1,8
0,5
1,3
2,7
>0,05
1,6 8,4 0,5 1,1 0,6 3,1 2 2,9 1,6 0,6
0,8
1,6
2,4
2,7
9,7
14,2
0,4
0,5
0,5
0,7
1
1,5
0,5
0,6
0,9
0,9
3,3
4,6
1
2,2
2,8
0,9
3,2
4,7
0,6
1,8
2,1
0,2
0,7
0,8
0,033 >0,05 >0,05 0,015 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
0,014 0,016
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit. **-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb metabolitokat és p értékeit zöld betűvel jelöltük. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb metabolitokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
A premenopauzában lévő miómás betegek műtét után 6 héttel mért szteroid-metabolit értékeit
a
kontrollok
értékeihez
viszonyítva
szignifikánsan
alacsonyabb
értékeket
tapasztaltunk (8. táblázat) az androgén metabolitok közül az An és az Et szintjeiben, valamint az alacsony androgén hatású kortizol metabolitok közül a 11-OH-An szintjében. A PD, progeszteron metabolit szintje szignifikánsan alacsonyabb volt (8. táblázat) a beteg csoportban a kontrollhoz képest. A kortizol és kortizon metabolitok szintjeiben nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a beteg és a kontroll csoportok összehasonlításánál.
48
A kortikoszteron metabolitok közül a THB szintje szignifikánsan alacsonyabb volt (8. táblázat) a beteg csoportban a kontrollhoz viszonyítva. A premenopauzában lévő miómás betegek műtét után mért mintáiban a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PT szintje szignifikánsan magasabb volt (8. táblázat), mint a kontroll mintákban. Vizsgálatunk során nem tudtuk a statisztikai számításhoz felhasználni az androgén DHEA, a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PD, THS, 11-O-PT és az össz kortizol F metabolitok mennyiségeit, mert ezen metabolitok mennyiségi értékei a legtöbb beteg és kontroll mintákban nem érték el a LLOQ értékeket.
49
9. táblázat Premenopauzás, miómás betegek műtét előtt és után mért vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin)
Szteroid
Adat-
metabolitok An * Et DHEA ** 11-OH-An * 11-OH-Et * 16-OH-DHEA * PD * PT ∆5-PD ** ∆5-AT * THS ** 11-O-PT ** ∆5-PT * THE THA * THB * aTHB * THF aTHF * α-CL β-CL α-C * F **
szám 10 10 7 10 10 8 10 10 5 10 4 2 8 10 7 9 9 10 10 10 10 10 2
(nmol/µmol kreatinin) Átlag 6 8,1
M-W teszt
Beteg, műtét után (n=10)
Beteg, műtét előtt (n=10)
Adat-
Q1
Me
0,7
5,7
9
1,3
7,5
12,1
3,9 2,6 4,1 6,3 2,7
0,7
4,9
6,2
0,3
1,4
5,1
1,8
4,2
5,8
0,8
1,9
10,5
1,2
2,7
3,9
2,2
0,4
2,1
2,6
2,1 12,5 1,1 1,9 1,1 5 2,3 4,3 1,6 0,8
0,9
2,3
2,6
5,3
15,2
17,8
0,8
1,1
1,4
0,7
2,1
2,7
0,5
1,2
1,7
2,3
5,7
7,4
1,3
2,2
3,5
2,1
4,6
5,8
0,9
1,7
2,3
0,4
0,7
1,1
Q3
szám 9 10 3 8 6 7 9 10 4 9 2 0 8 10 4 7 6 10 8 10 10 8 0
(nmol/µmol kreatinin) Átlag 2,1 2,3
Q1
p-értéke
Me
Q3
0,4
3
3,4
0,5
2,2
4,5
1 1,2 1,7 0,7 1,2
0,4
1,1
1,6
0,1
1,5
1,7
0,8
2,1
2,4
0,3
0,6
1,1
0,5
1,2
2,1
0,017 0,028 0,018 0,008 0,013
1,8
0,5
1,3
2,7
>0,05
1,6 8,4 0,5 1,1 0,6 3,1 2 2,9 1,6 0,6
0,8
1,6
2,4
2,7
9,7
14,2
0,4
0,5
0,5
0,7
1
1,5
0,5
0,6
0,9
0,9
3,3
4,6
1
2,2
2,8
0,9
3,2
4,7
0,6
1,8
2,1
0,2
0,7
0,8
0,043 0,009 >0,05 0,018 0,046 0,013 >0,05 0,022 >0,05 >0,05
0,011 0,007
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit. **-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A műtét előtti értékekhez viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb metabolitokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
A premenopauzás miómás betegek műtét előtt és műtét után mért vizeletszteroidmetabolitok értékeit összehasonlítva azt tapasztaltuk, hogy számos metabolit szintje szignifikánsan alacsonyabb volt (9. táblázat) a betegek műtét után mért mintáiban. Szignifikánsan alacsonyabb értékeket tapasztaltunk (9. táblázat) az An, Et, 16-OHDHEA androgén metabolitok, a 11-OH-An, 11-OH-Et alacsony androgén hatású kortizol metabolitok, a PD progeszteron metabolit, a THE, α-CL kortizon metabolitok, a THF kortitol metabolit, a THB, aTHB kortikoszteron metabolitok, valamint a metabolikus utak köztitermékei közül a PT és a ∆5-PT metabolitok szintjeiben. 50
Az androgén DHEA, a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PD, THS, 11-O-PT és az össz kortizol F metabolitok mennyiségeit nem tudtuk felhasználni a statisztikai számításhoz, mert az általunk vizsgált legtöbb mintában ezen metabolitok mennyiségi értékei nem haladták meg a LLOQ értékeket. 10. táblázat Premenopauzás, miómás, műtét utáni betegek és posztmenopauzás kontrollok vizeletszteroidmetabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) Kontroll (n=10) Szteroid
Adat-
metabolitok An * Et DHEA ** 11-OH-An * 11-OH-Et * 16-OH-DHEA * PD * PT ∆5-PD ** ∆5-AT * THS ** 11-O-PT ** ∆5-PT * THE THA * THB * aTHB * THF aTHF * α-CL β-CL α-C * F **
szám 10 10 7 10 9 8 10 10 5 10 5 1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1
(nmol/µmol kreatinin) Átlag 3,9 5,2
M-W teszt
Beteg, műtét után (n=10) Adat-
Q1
Me
Q3
1,8
3,2
5,7
2,3
3,8
8,7
3,5 1,4 0,7 0,5 1,1
2,2
3,5
4,8
0,5
1,5
2,1
0,3
0,7
0,9
0,2
0,4
0,7
0,7
1,1
1,5
0,8
0,3
0,9
1,1
0,8 9 0,5 0,8 0,6 3,9 2 3,7 2,4 0,7
0,3
0,7
1,1
6,6
8
10,9
0,3
0,4
0,6
0,5
0,6
1
0,4
0,5
0,7
3,4
3,7
4,4
1,5
1,9
3,1
3
3,6
4,6
1,9
2,5
3,2
0,6
0,7
0,9
szám 9 10 3 8 6 7 9 10 4 9 2 0 8 10 4 7 6 10 8 10 10 8 0
(nmol/µmol kreatinin) Átlag 2,1 2,3
Q1
p-értéke
Me
Q3
0,4
3
3,4
0,5
2,2
4,5
1 1,2 1,7 0,7 1,2
0,4
1,1
1,6
0,1
1,5
1,7
0,8
2,1
2,4
0,3
0,6
1,1
0,5
1,2
2,1
<0,001 >0,05 0,04 >0,05 >0,05
1,8
0,5
1,3
2,7
>0,05
1,6 8,4 0,5 1,1 0,6 3,1 2 2,9 1,6 0,6
0,8
1,6
2,4
2,7
9,7
14,2
0,4
0,5
0,5
0,7
1
1,5
0,5
0,6
0,9
0,9
3,3
4,6
1
2,2
2,8
0,9
3,2
4,7
0,6
1,8
2,1
0,2
0,7
0,8
>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
>0,05 <0,005
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit. **-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb metabolitokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
51
A premenopauzában lévő miómás betegek műtét után mért szteroid metabolit értékeit a posztmenopauzás kontrollok értékeihez viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb értékeket tapasztaltunk (10. táblázat) az androgén metabolitok közül az Et és a 16-OH-DHEA szintjeiben, valamint az alacsony androgén hatású kortizol metabolitok közül a 11-OH-An szintjében. A progeszteron, a kortizol, a kortizon és a kortikoszteron metabolitok szintjeiben nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget. Az androgén DHEA, a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PD, THS, 11-O-PT és az össz kortizol F metabolitok mennyiségeit nem tudtuk felhasználni a statisztikai számításhoz, mert az általunk vizsgált legtöbb mintában ezen metabolitok mennyiségi értékei nem haladták meg a LLOQ értékeket. 11. táblázat Premenopauzás, miómás, műtét előtti betegek és kontrollok szérum-hormon értékei
E2 (pmol/L) T (nmol/L) DHEAS (µmol/L) P (nmol/L) FSH (U/L) LH (U/L)
Beteg, műtét előtt (n=10)
Kontroll (n=10)
Szérumhormonok Átlag
Q1
Me
Q3
Átlag
Q1
Me
Q3
289 1,1 5,0 15,3 11,3
245
292,5
332
176,8
300,8
791,8
0,6
0,8
1,4
0,9
1,3
1,3
3,2
3,4
6,5
2,1
3,7
4,8
1,8
14,6
27,7
1,2
1,8
19,8
4,3
6,1
14,6
544,9 1,2 3,5 8,6 16,4
3,9
8,3
35,8
15,4
13,8
3,0
6,8
20,4
8,4
3,0
3,9
M-W teszt p-értéke >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
A premenopauzában lévő miómás betegek műtét előtt mért szérum-hormon értékeit és a kontrollok értékeit egymáshoz viszonyítva nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget az E2, P, DHEAS, T, FSH és LH szintjeiben.
52
12. táblázat Premenopauzás, miómás, műtét utáni betegek és kontrollok szérum-hormon értékei
E2 (pmol/L) T (nmol/L) DHEAS (µmol/L) P (nmol/L) FSH (U/L) LH (U/L)
Beteg, műtét után (n=10)
Kontroll (n=10)
Szérumhormonok Átlag
Q1
Me
Q3
Átlag
Q1
Me
Q3
289 1,1 5,0 15,3 11,3 8,4
245
292,5
332
56,5
64,5
0,8
1,4
0,6
0,9
1,2
3,2
3,4
6,5
2,1
3,7
4,5
1,8
14,6
27,7
4,3
6,1
14,6
3,0
3,9
15,4
61,3 1,0 3,5 0,9 75,3 45,0
45,5
0,6
0,6
1,0
1,2
59,1
71,1
79,0
34,1
40,8
51,2
M-W teszt p-értéke <0,01 >0,05 >0,05 <0,05 <0,01 <0,01
A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb szérum-hormonokat és p értékeit zöld betűvel jelöltük. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb szérum-hormonokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
A miómás betegek műtét után mért szérum-hormon értékeit és a kontrollok értékeit egymáshoz viszonyítva azt találtuk, hogy a beteg csoportban az E2 szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, míg az FSH és LH szintjei szignifikánsan magasabbak voltak (12. táblázat), amelyek a petefészkek eltávolításának következményei. 13. táblázat Premenopauzás, miómás, műtét előtti és utáni betegek szérum-hormon értékei
Szérumhormonok E2 (pmol/L) T (nmol/L) DHEAS (µmol/L) P (nmol/L) FSH (U/L) LH (U/L)
Beteg, műtét előtt (n=10)
Beteg, műtét után (n=10)
Átlag
Q1
Me
Q3
Átlag
Q1
Me
Q3
544,9 1,2 3,5 8,6 16,4
176,8
300,8
791,8
56,5
64,5
1,3
1,3
0,6
0,9
1,2
2,1
3,7
4,8
2,1
3,7
4,5
1,2
1,8
19,8
0,6
1,0
1,2
3,9
8,3
35,8
61,3 1,0 3,5 0,9 75,3
45,5
0,9
59,1
71,1
79,0
13,8
3,0
6,8
20,4
45,0
34,1
40,8
51,2
M-W teszt p-értéke <0,01 >0,05 >0,05 <0,05 <0,01 <0,05
A műtét előtti értékekhez viszonyítva szignifikánsan magasabb szérum-hormonokat és p értékeit zöld betűvel jelöltük. A műtét előtti értékekhez viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb szérum-hormonokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
A miómás betegek műtét előtt és után mért szérum-hormon értékeit egymáshoz viszonyítva a vártnak megfelelően szintén azt tapasztaltuk, hogy a műtét után az E2 szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, míg az FSH és LH szintjei szignifikánsan magasabbak voltak (13. táblázat).
53
2.2 Vizsgálatok méhnyálkahártyarákos betegeknél Egy 61 éves, posztmenopauzás, méhnyálkahártyarákos nő vizeletszteroid-profilját a 16. ábra mutatja.
1
IS
SS
2
14
8
4
20
5
21 18
10
6
13 3
KB
7
9 11
12
16 15
19
22
23
17
Idő (perc)
16. ábra Egy 61 éves, posztmenopauzás, méhnyálkahártyarákos nő vizelet mintájának szteroid-profil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográf, HP-1-MS oszlop, hélium vívőgáz, elektronionizáció 70 eV-on, splitless injektálási technika, 2 µl mintabemérés automata injektorral. Hőmérsékleti program: 100oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra felfűtés, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 270oC-ra 2,1oC/perc sebességgel, majd ismét további hőmérséklet emelés 25oC/perc sebességgel 320oC-ra, és egy 8 perces izoterm periódus (Bufa és mtsai, 2008).
Tizenhárom, posztmenopauzában levő, kezelés előtt álló méhnyálkahártyarákos beteg vizeletszteroid-metabolit és szérum-hormon értékeit határoztuk meg és hasonlítottuk össze tíz, posztmenopauzában lévő, egészséges nő metabolit és szérum-hormon értékeivel. Kutatások szerint összefüggés van a méhtest rosszindulatú daganat kialakulása és a betegek testtömeg indexe (BMI) között (Kaaks és mts, 2002; Bjorge és mts, 2007), ezért ezen betegség vizsgálatánál a beteg és kontroll csoportoknál mért szteroid-metabolitok értékeit (átlag, Me, Q1 és Q3) µg/24 óra/egységnyi BMI-re is átszámoltuk. Ez található a 14. táblázatban. A 15. táblázat a beteg és kontroll csoportnál mért szteroid metabolitok nmol/µmol kreatininre normalizált értékeit mutatja. A posztmenopauzában lévő beteg és kontroll csoportoknál meghatározott szérumhormonok értékeit a 16. táblázatban hasonlítottuk össze.
54
14. táblázat Posztmenopauzás, méhnyálkahártyarákos betegek és kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (µg/24 óra/BMI) Kontroll (n=10) Szteroid
Adat-
metabolitok An * Et DHEA ** 11-OH-An * 11-OH-Et * 16-OH-DHEA * PD * PT * ∆5-PD ** ∆5-AT * THS ** 11-O-PT ** ∆5-PT * THE THA * THB * aTHB * THF aTHF * α-CL β-CL * α-C
szám 10 10 7 10 9 8 10 10 5 10 5 1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
F **
(µg/24 óra/BMI) Átlag 28,64 35,02
Adat-
Q1
Me
Q3
13,70
19,82
35,31
19,48
27,54
52,14
27,28 9,96 5,01 3,57 8,80
18,17
23,91
36,83
4,56
9,99
15,23
2,50
5,72
7,03
2,11
2,58
5,61
5,39
7,93
11,86
5,45
2,57
5,15
8,84
6,10 84,11 4,23 7,41 5,10 36,85 20,51 34,48 22,75 7,03
2,96
4,32
8,78
67,98
81,41
110,81
2,64
3,92
5,04
5,00
7,28
9,29
3,40
5,03
6,64
27,90
36,38
48,99
10,71
19,87
28,95
25,68
34,49
40,31
15,57
22,87
27,12
4,98
7,40
8,99
1
szám 12 13 3 13 13 8 11 11 4 11 3 1 6 13 5 11 10 13 11 13 11 10
M-W teszt p-értéke
Beteg (n=13) (µg/24 óra/BMI) Átlag 7,41 8,08
Q1
Me
Q3
3,31
4,83
11,00
4,26
6,76
13,40
11,61 4,61 5,12 2,65 4,42
5,76
9,34
18,22
2,83
3,80
5,67
3,59
4,33
6,05
1,80
2,73
3,51
2,26
3,93
5,68
<0,003 0,029 >0,05 >0,05 <0,007
3,91
1,53
3,40
6,35
>0,05
>0,05 <0,001 >0,05 >0,05 >0,05 <0,001 >0,05 <0,001 <0,001 >0,05
3,16 30,15 2,50 5,21 3,53 15,91 10,61 13,08 6,64 5,04
2,04
2,68
4,33
18,35
29,69
43,84
1,18
1,95
4,10
2,19
3,52
6,05
1,98
3,25
4,86
8,00
17,17
24,10
3,62
6,50
16,77
7,21
15,36
17,65
3,93
5,91
9,61
2,12
4,37
7,03
<0,001 <0,001
1
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit.
**-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb metabolitokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
A posztmenopauzában lévő beteg és kontroll csoportoknál mért, µg/24 óra/BMI-re számolt szteroid metabolitok értékeit vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy szignifikánsan alacsonyabb volt (14. táblázat) az androgén metabolitok közül az An és az Et, valamint a 11OH-An és 11-OH-Et alacsony androgén hatású kortizol metabolitok szintje. A progeszteron és kortikoszteron metabolitok szintjeiben nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget. A THE, α-CL és β-CL kortizon metaboltok szintje szignifikánsan alacsonyabb volt (14. táblázat) a betegek mintáiban.
55
A kortizol metabolitok közül a THF, a metabolikus utak köztitermékei közül a PT szintjei szignifikánsan alacsonyabbak voltak (14. táblázat) a betegek mintáiban. Nem tudtuk a statisztikai számításhoz felhasználni a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PD, THS, 11-O-PT, az össz kortizol F és az androgén DHEA metabolitok mennyiségeit, mert az általunk vizsgált legtöbb mintában ezen metabolitok mennyiségi értékei nem haladták meg a LLOQ értékeit. 15. táblázat Posztmenopauzás, méhnyálkahártyarákos betegek és kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) Kontroll (n=10) Szteroid Adatszám metabolitok An * 10 10 Et DHEA ** 7 10 11-OH-An 11-OH-Et * 9 16-OH-DHEA * 8 PD * 10 PT * 10 ∆5-PD ** 5 ∆5-AT * 10 THS ** 5 11-O-PT ** 1 ∆5-PT * 10 10 THE THA * 10 THB * 10 aTHB * 10 10 THF aTHF * 10 10 α-CL β-CL * 10 α-C * 10 F ** 1
M-W teszt
Beteg (n=13)
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Q1 Me Q3 3,9 1,8 3,2 5,7 5,2 2,3 3,8 8,7 3,5 1,4 0,7 0,5 1,1
2,2
3,5
4,8
0,5
1,5
2,1
0,3
0,7
0,9
0,2
0,4
0,7
0,7
1,1
1,5
0,8
0,3
0,9
1,1
0,8 9 0,5 0,8 0,6 3,9 2 3,7 2,4 0,7
0,3
0,7
1,1
6,6
8
10,9
0,3
0,4
0,6
0,5
0,6
1
0,4
0,5
0,7
3,4
3,7
4,4
1,5
1,9
3,1
3
3,6
4,6
1,9
2,5
3,2
0,6
0,7
0,9
Adatszám 12 13 3 13 13 8 11 11 4 11 3 1 6 13 5 11 10 13 11 13 11 10 1
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Q1 Me Q3 0,7 0,3 0,7 1 0,9 0,3 0,9 1,3
p-értéke <0,001 <0,001
1,1 0,5 0,5 0,2 0,4
0,5
1,2
1,5
0,3
0,4
0,6
0,3
0,4
0,6
0,2
0,3
0,3
0,2
0,3
0,5
<0,001 0,009 >0,05 >0,05 <0,001
0,4
0,2
0,3
0,5
>0,05
0,3 2,5 0,2 0,4 0,3 1,3 0,8 1,1 0,5 0,4
0,2
0,3
0,3
1,3
2,5
3,5
0,1
0,1
0,3
0,2
0,3
0,4
0,2
0,3
0,4
0,7
1,3
1,6
0,3
0,5
1,3
0,5
1,3
1,4
0,5
0,5
0,7
0,3
0,3
0,4
0,022 <0,001 0,04 0,006 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,003
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit. **-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb metabolitokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
56
A posztmenopauzában lévő beteg és a kontroll csoportoknál mért, nmol/µmol kreatinin-re számolt szteroid-metabolitok értékeit vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a metabolitok értékei hasonlóan változtak, mint a metabolitok testtömeg indexre számolt értékei. Szignifikánsan alacsonyabb volt (15. táblázat) a beteg csoportban az androgén metabolitok közül az An és az Et, valamint a 11-OH-An és 11-OH-Et alacsony androgén hatású kortizol metabolitok szintje. Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a progeszteron metabolit szintjében. Hasonlóan az előző vizsgálathoz azt tapasztaltuk, hogy a kortizon metabolitok (THE, α-CL és β-CL) és a metabolikus utak köztitermékei közül a PT szintje szignifikánsan alacsonyabb volt (15. táblázat) a betegek mintáiban. Az előző vizsgálat eredményeitől eltérően azt találtuk, hogy szignifikánsan alacsonyabb volt (15. táblázat) a betegek mintáiban az általunk vizsgált összes kortizol és kortikoszteron metabolit, illetve a köztitermékek közül a ∆5-PT szintje is. Hasonlóan az előző vizsgálathoz nem tudtuk felhasználni a statisztikai számításhoz a DHEA, ∆5-PD, THS, 11-O-PT és F metabolitok mennyiségét. 16. táblázat Posztmenopauzás, méhnyálkahártyarákos betegek és kontrollok szérum-hormon értékei
E2 (pmol/L) T (nmol/L) DHEAS (µmol/L) P (nmol/L) FSH (U/L) LH (U/L)
M-W teszt p-értéke
Beteg (n=13)
Kontroll (n=10)
Szérumhormonok Átlag
Q1
Me
Q3
Átlag
Q1
Me
Q3
66,9 1,5 1,9 1,0 69,5 31,9
18,5
29,7
86,5
38,2
53,8
1,4
2,3
0,4
0,7
1,4
0,9
1,3
2,5
1,0
1,8
3,3
0,5
0,9
1,5
0,5
0,7
1,1
53,9
64,8
86,8
33,1
54,8
71,9
25,5
30,9
34,9
41,4 1,0 2,0 0,8 55,3 26,7
18,9
0,6
17,8
23,5
34,1
>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
A posztmenopauzában lévő beteg és kontroll csoportoknál mért szérum-hormonok (P, DHEAS, E2, T, FSH, LH) értékeit egymáshoz viszonyítva nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget.
57
3. Szteroid profil vizsgálatok petefészek daganatos nőknél 3.1 Vizsgálatok hám eredetű petefészek daganatos betegeknél Egy 53 éves, posztmenopauzás, hám eredetű petefészek daganatos nő vizeletszteroidprofilját a 17. ábra mutatja. 2 20
1
14 KB IS SS 13 4
8
10
6 3
5
7
16
9 11
12
21
18
19
22
17 15
23
Idő (perc)
17. ábra Egy 53 éves, posztmenopauzás, hám eredetű petefészek daganatos nő vizelet mintájának szteroid-profil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográf, HP-1-MS oszlop, hélium vívőgáz, elektronionizáció 70 eV-on, splitless injektálási technika, 2 µl mintabemérés automata injektorral. Hőmérsékleti program: 100oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra felfűtés, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 270oC-ra 2,1oC/perc sebességgel, majd ismét további hőmérséklet emelés 25oC/perc sebességgel 320oC-ra, és egy 8 perces izoterm periódus (Bufa és mtsai, 2008).
Tizenöt, posztmenopauzában levő, kezelés előtt álló hám eredetű petefészek daganatos beteg vizeletszteroid-metabolit és szérum-hormon értékeit határoztuk meg és hasonlítottuk össze tíz, posztmenopauzában lévő, egészséges nő értékeivel. A 17. táblázat mutatja a beteg és kontroll mintákban mért szteroid-metabolitok értékeit (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin). A posztmenopauzában lévő beteg és kontroll csoportoknál meghatározott szérumhormonok értékeit a 18. táblázatban hasonlítottuk össze.
58
17. táblázat Posztmenopauzás, hám eredetű petefészek daganatos betegek és kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) Kontroll (n=10) Szteroid metabolitok An * Et * DHEA * 11-OH-An 11-OH-Et * 16-OH-DHEA * PD * PT * ∆5-PD ** ∆5-AT * THS ** 11-O-PT ** ∆5-PT * THE THA * THB * aTHB * THF * aTHF * α-CL * β-CL * α-C * F **
Adatszám 10 10 7 10 9 8 10 10 5 10 5 1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1
M-W teszt
Beteg (n=15)
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Q1 Me Q3 3,9 1,8 3,2 5,7 5,2 2,3 3,8 8,7 0,5 0,1 0,3 1 3,5 2,2 3,5 4,8 1,4 0,5 1,5 2,1 0,7 0,3 0,7 0,9 0,5 0,2 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,5 0,8
0,3
0,9
0,8 9 0,5 0,8 0,6 3,9 2 3,7 2,4 0,7
0,3
0,7
1,1
6,6
8
10,9
0,3
0,4
0,6
0,5
0,6
1
0,4
0,5
0,7
3,4
3,7
4,4
1,5
1,9
3,1
1,1
3
3,6
4,6
1,9
2,5
3,2
0,6
0,7
0,9
Adatszám 13 14 5 15 11 8 11 13 2 12 2 1 8 15 8 12 9 14 11 14 8 9 2
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Q1 Me Q3 6,3 2,6 5,4 8,6 8,8 3,3 6,9 13,3 1,5 0,6 1,7 2,4 4,9 2,4 4,4 6,5 2,5 0,9 2,5 3,9 2,8 1,7 2,6 3,4 1,7 0,9 1,2 2,1 2 1 1,6 3 2,9
1,4
2 15,3 1 2,5 1,5 7,8 3,9 5,2 2,8 1,8
0,9 7,8 0,6
0,8
1,3
p-értéke >0,05 >0,05 0,048 >0,05 >0,05 <0,001 <0,001 0,042
4,7
0,001
1,1
1,5
12,3
19,5
>0,05 >0,05 0,012 0,001 <0,001 >0,05 0,016 >0,05 >0,05 >0,05
1,8
1,4
1,7
2,6
1
1,3
1,3
3,9
5
8,2
2,1
3,4
4,3
2,8
3,8
6
1,4
1,7
2,9
0,7
1
1,7
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit.
**-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb metabolitokat és p értékeit zöld betűvel jelöltük.
A posztmenopauzában lévő hám eredetű petefészek daganatos betegek és a kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékeit egymáshoz viszonyítva azt tapasztaltuk, hogy a beteg csoportban szignifikánsan magasabb volt (17. táblázat) az androgén metabolitok közül a DHEA, a 16-OH-DHEA és a ∆5-AT; a progeszteron metabolit; a metabolikus utak köztitermékei közül a PT; a kortizol metabolitok közül az aTHF és az általunk vizsgált kortikoszteron (THA, THB, aTHB) metabolitok szintje. Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a kortizon metabolitok szintjében.
59
Vizsgálatunk során nem tudtuk a statisztikai számításhoz felhasználni a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PD, THS, 11-O-PT és az össz kortizol F metabolitok mennyiségeit, mert ezen metabolitok mennyiségi értékei a legtöbb beteg és kontroll mintákban nem érték el a LLOQ értékeit. 18. táblázat Posztmenopauzás, hám eredetű petefészek daganatos betegek és kontrollok szérum-hormon értékei
E2 (pmol/L) T (nmol/L) DHEAS (µmol/L) P (nmol/L) FSH (U/L) LH (U/L)
M-W teszt p-értéke
Beteg (n=15)
Kontroll (n=10)
Szérumhormonok Átlag
Q1
Me
Q3
Átlag
Q1
Me
Q3
66,9 1,5 1,9 1,0 69,5
18,5
29,7
86,5
22,6
37,2
1,4
2,3
0,7
1,2
1,6
0,9
1,3
2,5
0,9
1,4
2,2
0,5
0,9
1,5
0,4
0,8
1,3
53,9
64,8
86,8
32,3 1,3 1,7 1,0 85,0
18,4
0,6
60,2
84,1
102,4
31,9
25,5
30,9
34,9
44,3
29,2
43,8
52,0
>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05
A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb szérum-hormont és p értékét zöld betűvel jelöltük.
A posztmenopauzában lévő beteg és kontroll csoportoknál mért szérum-hormonok közül az LH szintje magasabb volt a betegek mintáiban a kontrollok mintáihoz viszonyítva (18. táblázat). A többi vizsgált szérum-hormonok (P, DHEAS, E2, T és FSH) értékei nem mutattak szignifikáns különbséget.
60
3.2 Vizsgálatok granulózasejtes petefészek daganatos betegeknél Egy 51 éves, premenopauzás, granulózasejtes petefészek daganatos nő vizeletszteroidprofilját a 18. ábra mutatja. IS
SS
KB
1 2
14 20
8
4
23
21 5 3
6
16
7 9
18
13
10 11
12
15
19
22
17
Idő (perc)
18. ábra Egy 51 éves, premenopauzás, granulózasejtes petefészek daganatos nő vizelet mintájának szteroidprofil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográf, HP-1-MS oszlop, hélium vívőgáz, elektronionizáció 70 eV-on, splitless injektálási technika, 2 µl mintabemérés automata injektorral. Hőmérsékleti program: 100oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra felfűtés, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 270oC-ra 2,1oC/perc sebességgel, majd ismét további hőmérséklet emelés 25oC/perc sebességgel 320oC-ra, és egy 8 perces izoterm periódus (Bufa és mtsai, 2008).
Két, premenopauzában levő, kezelés előtt álló granulózasejtes petefészek daganatos beteg vizeletszteroid-metabolit és szérum-hormon értékeit határoztuk meg és hasonlítottuk össze - mint két, azonos betegségben szenvedő nő esetének leírását – tíz, premenopauzában lévő, egészséges nő metabolit értékeivel. A 19. táblázat mutatja a beteg és kontroll mintákban mért szteroid-metabolitok értékeit (átlag, Min, Max, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin). A két beteg és a kontroll csoport meghatározott szérum-hormonok értékeit a 20. táblázatban hasonlítottuk össze.
61
19. táblázat Premenopauzás, granulózasejtes petefészek rosszindulatú daganatos és kontroll nők vizeletszteroid metabolit értékei (átlag, Min, Max, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) Kontroll (n=10) Szteroid metabolitok An Et DHEA 11-OH-An 11-OH-Et 16-OH-DHEA PD PT ∆5-PD ** ∆5-AT THS ** 11-O-PT ** ∆5-PT THE THA THB aTHB * THF aTHF * α-CL β-CL α-C F **
Adatszám 10 10 10 10 10 10 10 10 5 10 3 3 10 10 10 10 8 10 8 10 10 10 0
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Min Q1 Me 4,4 2,3 2,3 5 5,4 3,2 3,2 3,6 0,9 0,2 0,2 0,8 1,9 1,4 1,5 1,7 1,5 0,9 1,2 1,5 1,9 0,7 0,7 1,6 3,4 0,9 1,8 4,5 1,8 1,2 1,2 1,9
1. beteg 2. beteg (nmol/µmol kreatinin) Q3
Max
5
5
2,2
2,3
3,4 5,9 0,9 3 1,6 2,6 10,5 2,4
5,7
5,9
7,5
10,1
1,5
1,9
2,1
2,7
1,7
2,1
2,4
4
5,5 5,8 0,6 4,8 2,7 1,8 1,2 1,9
1,1
0,3
0,3
0,9
1,4
2,4
2
1,7
0,7 7,1 0,6 2,1 0,5 2,1 1,1 2,1 1,6 0,3
0,5
0,5
0,6
0,8
1,5
5,3
5,3
7,7
8,2
8,2
0,3
0,3
0,6
0,8
0,9
1,1
1,3
2
3,3
3,3
0,4
0,5
0,5
0,6
0,6
1,5
1,5
2
2,5
3,3
0,7
0,7
0,8
1,7
1,7
1,8
1,8
2,1
2,2
2,6
1,2
1,3
1,6
1,8
2,1
0,2
0,2
0,3
0,4
0,5
1,6 15,2 0,8 2,1 1,2 7,3 2,4 6,3 2,1 1,3
1,2 14,3 1,3 2,8 0,9 6,1 3,4 5,5 2,2 1,1
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit. **-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A két betegmintában mért szteroid-metabolitok értékeit külön színnel jelöltük, és azokat a metabolitokat és az értékeit, amelyek meghaladták a kontroll Max értékeit, vastagítással és aláhúzással emeltük ki.
Az esetek leírásánál azt tapasztaltuk, hogy a két premenopauzában levő, kezelés előtt álló granulózasejtes petefészek daganatos beteg mintáiban mért 23 szteroid metabolit közül 9 metabolit értéke hasonló volt a kontroll értékekhez viszonyítva. Az androgén metabolitok közül az An értéke az 1. betegnél a kontroll Q1 és a Me értékei, a 2. betegnél a kontroll Me és a Q3 értékei közé esett. Az Et értéke mind a két betegnél a kontroll Me és a Q3 értékei közé esett. A DHEA értéke az 1. betegnél a kontroll Me és a Q3 értékei, a 2. betegnél a kontroll Q1 és a Me értékei közé esett. A 16-OH-DHEA értéke az 1. betegnél a kontroll Q3 és Max értékei, a 2. betegnél a kontroll Me és a Q3 értékei közé esett. A ∆5-AT értéke mind a két betegnél a kontroll Q3 és Max értékei közé esett. A 62
kortikoszteron metabolitok közül a THB értéke mind a két betegnél a kontroll Me és a Q3 értékei közé esett. A gyenge androgén hatású kortizol metabolitok közül a 11-OH-An értéke mind a két betegnél meghaladta a kontroll Max értékét. A 11-OH-Et értéke az 1. betegnél a kontroll Me és a Q3 értékei közé esett, a 2. betegnél ez az érték meghaladta a kontroll Max értékét. A progeszteron metabolit, PD értéke az 1. betegnél meghaladta a kontroll Max értékét, a 2. betegnél viszont ez az érték a kontroll Min és a Q1 értékei közé esett. A metabolikus utak köztitermékei közül a PT értéke az 1. betegnél meghaladta a kontroll Max értékét, a 2. betegnél viszont ez az érték megegyezett a kontroll Me értékével. A ∆5-PT értéke az 1. betegnél meghaladta a kontroll Max értékét, a 2. betegnél ez az érték a kontroll Q3 és Max értékei közé esett. A kortizol metabolitok közül a THF, aTHF és α-CL értékei mind a két betegnél meghaladták a kontroll Max értékét. A β-CL értéke az 1. betegnél megegyezett a kontroll Max értékével, míg ez az érték a 2. betegnél meghaladta a kontroll Max értékét. A THE és α-C kortizon metabolitok értékei mind a két betegnél meghaladták a kontroll Max értékét. A kortikoszteron metabolitok közül a THA értéke az 1. betegnél megegyezett a kontroll Q3 értékével, míg a 2. betegnél meghaladta a kontroll Max értékét. Az aTHB értéke mind a két betegnél meghaladta a kontroll Max értékét. Nem tudtuk a statisztikai számításhoz felhasználni a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PD, THS, 11-O-PT, és az össz kortizol F metabolitok mennyiségeit, mert az általunk vizsgált legtöbb mintában ezen metabolitok mennyiségi értékei nem haladták meg a LLOQ értékeit.
63
20. táblázat Premenopauzás, granulózasejtes petefészek daganatos betegek és kontrollok szérum-hormon értékei Kontroll (n=10)
Szérumhormonok E2 (pmol/L) T (nmol/L) DHEAS (µmol/L) P (nmol/L) FSH (U/L) LH (U/L)
Átlag
Min
Q1
Me
Q3
Max
289 1,1 5,0 15,3 11,3
224
245
292,5
332
350
0,6
0,6
0,8
1,4
2,5
2,7
3,2
3,4
6,5
10,0
0,8
1,8
14,6
27,7
33,2
3,3
4,3
6,1
14,6
35,1
8,4
2,7
3,0
3,9
15,4
18,1
1. beteg
2. beteg
2683,0 0,7 2,3 23,4 4,0 2,0
674,0 1,3 3,9 21,2 5,4 4,2
A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb szérum-hormont és p értékét zöld betűvel jelöltük.
A két beteg és a kontroll csoport szérum-hormonok értékeit összehasonlítva azt tapasztaltuk, hogy az E2 szintje szignifikánsan magasabb volt a két betegmintában (20. táblázat). Nem találtunk szignifikáns különbséget P, DHEAS, T, FSH, LH szintjeiben.
64
4. Szteroid profil vizsgálatok méhnyakrákos nőknél Egy 65 éves, posztmenopauzás, méhnyakrákos nő vizeletszteroid-profilját a 19. ábra mutatja. 20
IS
14
SS
8
21
18 2
KB
4 1 3
7
5 6
13
11
9
12 10
22
17 16 15
19 23
Idő (perc)
19. ábra Egy 65 éves, posztmenopauzás, méhnyakrákos nő vizelet mintájának szteroid-profil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográf, HP-1-MS oszlop, hélium vívőgáz, elektronionizáció 70 eV-on, splitless injektálási technika, 2 µl mintabemérés automata injektorral. Hőmérsékleti program: 100oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra felfűtés, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 270oC-ra 2,1oC/perc sebességgel, majd ismét további hőmérséklet emelés 25oC/perc sebességgel 320oC-ra, és egy 8 perces izoterm periódus (Bufa és mtsai, 2008).
Tizennégy, posztmenopauzában lévő, kezelés előtt álló méhnyakrákos beteg vizeletszteroid-metabolit és szérum-hormon értékeit határoztuk meg és összehasonlítottuk tíz, posztmenopauzában lévő, egészséges nő metabolit és szérum-hormon értékeivel. A 21. táblázat mutatja a beteg és kontroll csoportban mért szteroid-metabolitok értékeit (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin). A posztmenopauzában lévő beteg és kontroll csoportoknál meghatározott szérumhormonok értékeit a 22. táblázatban hasonlítottuk össze.
65
21. táblázat Posztmenopauzás, méhnyakrákos betegek és kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) Kontroll (n=10) Szteroid metabolitok An * Et * DHEA ** 11-OH-An * 11-OH-Et * 16-OH-DHEA ** PD * PT * ∆5-PD ** ∆5-AT * THS ** 11-O-PT ** ∆5-PT * THE * THA ** THB * aTHB ** THF * aTHF * α-CL * β-CL * α-C * F **
Adatszám 10 10 7 10 9 8 10 10 5 10 5 1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1
M-W teszt
Beteg (n=14)
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Q1 Me Q3 3,9 1,8 3,2 5,7 5,2 2,3 3,8 8,7 3,5 1,4
2,2
3,5
4,8
0,5
1,5
2,1
0,5 1,1
0,2
0,4
0,7
0,7
1,1
1,5
0,8
0,3
0,9
1,1
0,8 9
0,3
0,7
1,1
6,6
8
10,9
0,8
0,5
0,6
1
3,9 2 3,7 2,4 0,7
3,4
3,7
4,4
1,5
1,9
3,1
3
3,6
4,6
1,9
2,5
3,2
0,6
0,7
0,9
Adatszám 6 10 0 7 7 4 9 13 1 11 3 2 6 12 2 6 4 11 10 13 10 9 0
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Q1 Me Q3 0,6 0,2 0,3 0,9 0,7 0,3 0,4 0,8
p-értéke 0,003 <0,001
0,5 0,2
0,2
0,4
0,6
0,2
0,2
0,3
0,5 0,2
0,3
0,4
0,5
0,4
0,7
1
>0,05 >0,05
0,8
0,5
0,5
1,3
>0,05
0,4 2,9
0,2
0,3
0,6
1,6
2,5
4,2
>0,05 <0,001
0,5
0,2
0,5
0,8
>0,05
1,8 0,9 1,6 1 0,5
1,1
1,3
2,7
0,4
0,7
1,5
0,9
1,1
2,1
0,5
0,9
1,4
0,3
0,4
0,7
0,002 0,002 <0,001 <0,001 >0,05
<0,001 0,004
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit. **-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb metabolitokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
A posztmenopauzában lévő méhnyakrákos betegeknél a kontrollok értékeihez viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb volt (21. táblázat) az androgén metabolitok közül az An és az Et, valamint az alacsony androgén hatású kortizol metabolitok, a 11-OH-An és a 11OH-Et szintje. Nem találtunk szignifikáns különbséget a progeszteron és a kortikoszteron metabolitok, illetve a metabolikus utak köztitermékeinek szintjében.
66
Azt tapasztaltuk, hogy a beteg csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt (21. táblázat) a kortizon metabolitok (THE, α-CL, β-CL) és a kortizol metabolitok közül a THF és az aTHF szintje. Vizsgálatunk során nem tudtuk felhasználni a statisztikai számításhoz a beteg mintákban az androgének közül a DHEA, 16-OH-DHEA és a kortikoszteron metabolitok közül a THA, aTHB mennyiségeit, mert ezen metabolitok szintjei olyan alacsonyak voltak, hogy nem haladták meg a LLOQ értékeit. Szintén nem tudtuk felhasználni a metabolikus utak köztitermékei közül a ∆5-PD, THS, 11-O-PT és az össz kortizol F metabolitok mennyiségeit, mert ezen metabolitok beteg és kontroll mintákban mért mennyiségi értékei nem érték el a LLOQ értékeit. 22. táblázat Posztmenopauzás, méhnyakrákos betegek és kontrollok szérum-hormon értékei
Szérumhormonok E2 (pmol/L) T (nmol/L) DHEAS (µmol/L) P (nmol/L) FSH (U/L) LH (U/L)
M-W teszt p-értéke
Beteg (n=14)
Kontroll (n=10) Átlag
Q1
Me
Q3
Átlag
Q1
Me
Q3
66,9 1,5 1,9 1,0 69,5 31,9
18,5
29,7
86,5
18,4
37,3
71,4
0,6
1,4
2,3
0,6
1,2
1,5
0,9
1,3
2,5
1,2
1,4
2,8
0,5
0,9
1,5
0,4
0,9
1,4
53,9
64,8
86,8
54,2
76,6
83,8
25,5
30,9
34,9
48,2 1,2 2,1 1,0 69,0 38,4
29,7
36,6
55,3
>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
A posztmenopauzában lévő beteg és kontroll csoportoknál meghatározott szérumhormonok (P, DHEAS, E2, T, FSH, LH) értékeit egymáshoz viszonyítva nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget.
67
5. Szteroid profil vizsgálatok endometriózisos nőknél Egy 28 éves, endometriózisos nő vizeletszteroid-profilját a 20. ábra mutatja.
SS
KB
IS
1
14
2
20 21 8 17 10
13
4 3
9
5 6
7
11
15,16 12
18
22
23
19
Idő (perc)
20. ábra Egy 28 éves, endometriózisos nő vizelet mintájának szteroid-profil kromatogramja 1: An, 2: Et, 3: DHEA, 4: 11-OH-An, 5: 11-OH-Et, 6: 16-OH-DHEA, 7: PD, 8: PT, 9: ∆5-PD, 10: ∆5-AT, 11: THS, 12: 11-OPT, 13: ∆5-PT, 14: THE, 15: THA, 16: THB, 17: aTHB, 18: THF, 19: aTHF, 20: α-CL, 21: βCL, 22: α-C, 23: F, IS, SS, KB. Kísérleti körülmények: Agilent Technologies 5975 tömegspektométer detektorral felszerelt 6890N gázkromatográf, HP-1-MS oszlop, hélium vívőgáz, elektronionizáció 70 eV-on, splitless injektálási technika, 2 µl mintabemérés automata injektorral. Hőmérsékleti program: 100oC-os kezdeti hőmérséklet, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd 25oC/perc sebességgel 200oC-ra felfűtés, majd egy 1 perces izoterm periódus, majd további felfűtés 270oC-ra 2,1oC/perc sebességgel, majd ismét további hőmérséklet emelés 25oC/perc sebességgel 320oC-ra, és egy 8 perces izoterm periódus (Bufa és mtsai, 2008).
Tíz, fiatal, két hónapos GnRH analóg kezelésen átesett endometriózisos beteg vizeletszteroid-metabolit és szérum-hormon értékeit határoztuk meg és hasonlítottuk össze tíz, hasonló korú, egészséges nő értékeivel. A 23. táblázat mutatja az endometriózisos és kontroll csoportban mért szteroid-metabolitok értékeit (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin). A fiatal, endometriózisos beteg és kontroll csoportoknál mért szérum-hormonok értékeit a 24. táblázatban hasonlítottuk össze.
68
23. táblázat Fiatal, endometriózisos betegek és kontrollok vizeletszteroid-metabolit értékei (átlag, Me, Q1, Q3) (nmol/µmol kreatinin) Kontroll (n=10) Szteroid Adatszám metabolitok 10 An Et 10 DHEA * 10 11-OH-An 10 11-OH-Et * 9 16-OH-DHEA * 10 PD 10 PT 10 ∆5-PD * 9 ∆5-AT 10 THS * 9 11-O-PT ** 7 ∆5-PT 10 THE 10 THA 10 10 THB 10 aTHB THF 10 10 aTHF α-CL 10 β-CL 10 α-C 10 F ** 4
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Q1 Me Q3 5 4,4 4,9 5,5 5,5 3,9 5,4 6,1 0,7 0,4 0,7 1 1,5 1,3 1,4 1,7 0,9 0,4 1 1,5 2 1,6 1,7 1,8 1,1 0,7 0,8 1,7 1,8 1,6 1,8 2 0,2 0,1 0,2 0,2 1,5 0,9 1,6 2,2 0,3 0,2 0,3 0,3 1 7,1 0,7 2,9 0,7 1,5 2,1 2,4 1,9 0,4
M-W teszt
Beteg (n=10)
0,8
1
1,4
6
6,9
8,6
0,6
0,6
0,9
1,2
2,4
4,1
0,5
0,9
0,9
1
1,6
1,7
1,1
1,7
2,8
1,7
2,5
3
1,5
1,8
2,1
0,3
0,4
0,5
Adatszám 10 10 9 10 10 9 10 10 9 10 4 2 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5
(nmol/µmol kreatinin) Átlag Q1 Me Q3 4,1 2,4 2,9 5,8 5,3 2,7 4,5 8,2 2,5 0,2 0,7 3,9 1,3 0,8 0,9 2 1 0,3 0,3 1,7 2,1 0,7 1,3 2,9 0,7 0,4 0,7 1 1,5 1,1 1,6 1,9 0,2 0,1 0,2 0,3 1,2 0,7 1 1,5 0,2 0,2 0,2 0,3 1,3 6,8 0,6 1,5 1,2 2,1 1 1,7 1,8 0,4
0,8
1,3
1,8
3,6
6
9,5
0,4
0,6
0,9
0,5
0,7
2
0,2
0,3
1
1
2,1
3,5
0,5
0,8
1,5
1,2
1,5
2,8
0,9
1,7
2,5
0,3
0,4
0,6
p-értéke 0,049 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,016 0,034 >0,05 0,013 >0,05 >0,05 >0,05
*-gal jelölt szteroid-metabolitoknak a statisztikai számításhoz felhasznált adat-száma nem egyezik meg a mintaszámmal, mert ezen metabolitok értékei nem minden vizelet-mintában érték el a LLOQ értékeit.
**-gal jelölt szteroid-metabolitok esetén nem lehetett statisztikai számítást végezni, mert kevés adat állt rendelkezésre, mivel ezen metabolitok értékei a kontroll és beteg vizelet-minták többségében nem érték el a LLOQ értékeit. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb metabolitokat és p értékeit zöld betűvel jelöltük. A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb metabolitokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
A fiatal, endometriózisos betegek két hónapos GnRH analóg kezelés után mért vizeletszteroid-metabolit értékeit és a kontrollok értékeit egymáshoz viszonyítva azt tapasztaltuk (23. táblázat), hogy a beteg csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt az androgén metabolitok közül az An, a kortizol metabolitok közül az aTHF szintje. A beteg csoportban a kortikoszteron metabolitok közül a THB szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, viszont az aTHB szintje szignifikánsan magasabb (23. táblázat). Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a progeszteron és kortizon metabolitok, valamint a metabolikus utak köztitermékeinek szintjében.
69
Nem tudtuk felhasználni a statisztikai számításhoz a metabolikus utak köztitermékei közül a 11-O-PT, és az F kortizol metabolit mennyiségeit, mert ezen metabolitok beteg és kontroll mintákban mért mennyiségi értékei nem érték el a LLOQ értékeit. 24. táblázat Fiatal, két hónapos GnRH analóg kezelésen átesett, endometriózisos betegek és kontrollok szérumhormon értékei Kontroll (n=10)
Szérumhormonok Átlag E2 (pmol/L) T (nmol/L) DHEAS (µmol/L) P (nmol/L) FSH (U/L) LH (U/L)
Q1
Q3
Átlag
Q1
Me
Q3
241,6
270,5
41,7
58,6
70,1
1,1
1,4
2,2
0,9
1,2
2,0
5,1
5,7
7,8
5,1
5,4
7,1
1,1
1,4
2,1
0,8
1,3
2,5
4,8
5,3
7,2
55,3 1,4 6,1 1,6 4,4
3,7
3,9
4,8
6,1
7,1
7,7
0,6
0,3
0,6
1,0
240,3 1,7 6,4 1,6 6,0
172,3
10,2
Me
M-W teszt p-értéke
Beteg (n=10)
<0,01 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,01
A kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb szérum-hormonokat és p értékeit piros betűvel jelöltük.
A fiatal, endometriózisos beteg és kontroll csoportoknál mért szérum-hormonok értékeit egymáshoz viszonyítva azt tapasztaltuk, hogy az E2, FSH és LH szintjei szignifikánsan alacsonyabbak voltak a beteg csoportban (24. táblázat). Nem találtunk szignifikáns különbséget a szérum P, T és DHEAS szintjeiben. Szteroid-metabolit szintek változásainak összegzése A 25. táblázat összefoglalva mutatja azon szteroid-metabolitokat, amelyek esetében szignifikáns különbséget tapasztaltunk az egyes megbetegedéseknél. A 26. táblázat a két, granulózasejtes petefészek daganatos betegnél mutatja azon szteroid-metabolitokat, amelyek szintjei meghaladták a kontroll csoportnál mért metabolitok Max értékeit.
70
25. táblázat Szignifikánsan változott szteroid-metabolit szintek a vizsgált megbetegedésekben
Mióma
Csontritkulás
An Et DHEA 11-OH-An 11-OH-Et 16-OH-DHEA PD PT ∆5-AT ∆5-PT THE THA THB aTHB THF aTHF α-CL β-CL α-C
− ↓ ↓ − − − − − − − ↓ ↓ − ↓ − − − ↓ ↓
Méhnyálkahártyarák
műtét előtt
műtét után I
műtét után II
(nmol/nmol kreatinin)
(ng/24 óra /BMI)
− − − − − − − − − ↑ − ↑ − − ↑ ↑ ↑ − ↑
↓ ↓ − ↓ − − ↓ − − ↑ − − ↓ − − − − − −
− ↓ − ↓ − ↓ − − − − − − − − − − − − −
↓ ↓ − ↓ ↓ − − ↓ − ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
↓ ↓ − ↓ ↓ − − ↓ − − ↓ − − − ↓ − ↓ ↓ −
Hám eredetű petefészek Méhnyakrák Endometriózis daganat − − ↑ − − ↑ ↑ ↑ ↑ − − ↑ ↑ ↑ − ↑ − − −
↓ ↓ − ↓ ↓ − − − − − ↓ − − − ↓ ↓ ↓ ↓ −
↓ − − − − − − − − − − − ↓ ↑ − ↓ − − −
I: Műtét utáni szteroid-metabolit szint premenopauzás kontrollokéhoz viszonyítva. II: Műtét utáni szteroid-metabolit szint posztmenopauzás kontrollokéhoz viszonyítva. A szignifikánsan magasabb metabolitok szintjeit zöld nyíllal, a szignifikánsan alacsonyabb metabolitok szintjeit piros nyíllal jelöltük. −: nem volt szignifikáns különbség a metabolitok szintjében a kontrollhoz képest.
71
26. táblázat Kontrollok Max értékeit meghaladó szteroid-metabolit szintek granulózasejtes petefészek daganatnál
Granulózasejtes petefészek daganat
11-OH-An 11-OH-Et PD PT ∆5-PT THE THA aTHB THF aTHF α-CL β-CL α-C
1. beteg
2. beteg
↑ − ↑ ↑ ↑ ↑ − ↑ ↑ ↑ ↑ − ↑
↑ ↑ − − − ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
A kontroll csoportnál meghatározott szteroid-metabolitok Max értékeit meghaladó metabolitok szintjeit zöld nyíllal jelöltük. −: a metabolitok szintjei nem haladták meg a kontroll csoportnál meghatározott szteroid-metabolitok Max értékeit.
72
Eredmények értékelése Szteroid metabolizmust érintő, 7 nőgyógyászati kórképben elemeztük a betegek 24 órás vizeletszteroid-profiljait. Az általunk sikeresen továbbfejlesztett, klinikai és kutatási célokra is felhasználható vizeletszteroid-profil módszer, több szteroid-csoport egyidejű vizsgálatára alkalmas. Bár hosszabb időt és magasabb technikai hátteret igényel, mint egyes, pillanatnyi szteroid koncentrációkat mérő egyéb laboratóriumi rutinmódszerek, de előnye, hogy áttekinthető képet ad a szteroidok napi szintéziséről, beleértve a mirigyekben és a periférián történő anyagcserét is. Az egyes metabolitok szintjében és egymáshoz viszonyított arányában bekövetkezett változások ráirányítják a figyelmet az adott enzimek és szteroid csoportok szerepére, így segítséget nyújthatnak az egészségestől eltérő állapotok felismerésében, kezelésében. Posztmenopauzás,
csontritkulásos
nők
vizeletszteroid-metabolit
szintjeinek
vizsgálata során hangsúlyt kapott az androgének és a kortikoszteroidok szintjének alakulása. Az irodalmi adatok többségében pozitív korrelációt tapasztaltak a szérum, ill. plazma androgének és a csontsűrűség között (Zofková és mtsai, 2000; Takayanagi és mtsai, 2002; Tok és mtsai, 2004). Így várakozásunknak megfelelően az általunk tapasztalt jelentősen csökkent androgén metabolit szintek megerősítik annak lehetőségét, hogy a ösztrogének mellett az androgének is szerepet játszhatnak a csontvesztés folyamatában a menopauza után. Az androgének a csontokra antireszorptíven hatnak, hatásukat kifejthetik ösztrogénné alakulva, illetve közvetlenül, androgén receptorokon keresztül (Davis, 1997; Sasano és mtsai, 1997). Az általunk tapasztalt DHEA szint csökkenése alátámasztja azon kutatási eredményeket (Labrie és mtsai, 1997; Takayanagi és mtsai, 2002), melyek szerint megfelelő körültekintéssel ez a komponens terápiásan alkalmazható lehet a posztmenopauzás csontritkulásban. A kortizol metabolitok csökkenése ellentmondásosnak tünik a glükokortikoidok ismert, csontritkulást indukáló hatásával, melynek magyarázatához további vizsgálatok szükségesek. Lehetséges, hogy ez a csökkenés nem más, mint a szervezet belső kompenzációja? Premenopauzás, miómás betegek vizeletszteroid-profiljának a jellegzetességeit tanulmányoztuk méheltávolító műtét előtt és után. Vizsgálataink célja volt a petefészkek eltávolításának hatására bekövetkező szteroid metabolizmus változásainak a feltárása.
73
Eredményeink szerint, eltérő változásokat tapasztaltunk a miómás betegeknél műtét előtt és után. A betegség kialakulásában és növekedésében feltételezett ösztrogénhormonok jelentőségét több tényező alátámasztja, azonban az esetek egy részénél az ösztrogénhormonok daganat serkentő hatása nem bizonyított. A betegek szérum E2 szintjeit a premenopauzás kontrollokéhoz viszonyítva nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget. A szérum E2 szint mellett a P, DHEAS, T, FSH és LH szintjeiben sem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a műtéti kezelés előtt álló betegeknél a premenopauzás kontrollokhoz viszonyítva. A műtéti kezelés után, a petefészkek eltávolításának következményeként szignifikánsan alacsonyabb E2 szintet és szignifikánsan magasabb FSH és LH szintet tapasztaltunk. A vizeletszteroid-profilokat elemezve a műtét előtt álló betegeknél az androgén és a progeszteron metabolitok szintjében nem tapasztaltunk különbséget. Ez a megállapítás ellentmond Jung és mtsai (2004) eredményeinek, akik a 24 órás vizeletszteroid-metabolitok szintjeit elemezve a gyenge androgén hatású kortizol metabolitok esetében szignifikánsan magasabb értékeket tapasztaltak a miómás betegeknél. Jung és mtsai (2004) eredményeihez viszonyítva, a kortikoszteroid szinteket vizsgálva hasonló eredményekre jutottunk. Szignifikánsan magasabb értékeket tapasztaltunk a kortizol metabolitok, egy kortizon és egy kortikoszteron metabolit szintjében. A kortikoszteroid metabolitok
szintjének
szignifikánsan
magasabb
értékei
megerősíti
azt,
hogy
a
glükokortikoidok szerepet játszhatnak a miómás folyamatban. A betegeknél több kortizon alakul át aktív kortizollá, mint a premenopauzás kontrolloknál, ami a 11β-hidroxiszteroiddehidrogenáz enzimrendszer működésének változását jelzi. A mióma műtéti kezelését követő szteroid-profil nyomon követésére nem álltak rendelkezésre korábbi irodalmi adatok. A betegek műtét utáni szteroid-profiljait vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy szignifikánsan alacsonyabb volt több androgén metabolit és a PD progeszteron metabolit szintje a premenopauzás kontrollokéhoz képest. A kortikoszteroidok közül csak egy kortikoszteron metabolit szintje volt szignifikánsan alacsonyabb, ami arra utalhat, hogy a műtét hatására a 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzimrendszer működése egyensúlyt teremtett a kortizon-kortizol átalakulásban. A betegek műtét előtti és utáni vizeletszteroid-profiljait egymáshoz viszonyítva jelentős eltéréseket tapasztaltunk az egyes szteroid metabolit csoportoknál. Amíg a műtét előtti beteg csoportban a kortikoszteroidok szintjének szignifikánsan magasabb értékeit detektáltuk, addig a kezelés következményeként a műtét utáni beteg csoportban szinte valamennyi androgén, progeszteron és kortikoszteroid metabolit szintje szignifikánsan alacsonyabb lett. 74
A miómás betegek műtét utáni vizeletszteroid-profiljait a posztmenopauzás kontrollokéhoz viszonyítva azt tapasztaltunk, hogy szignifikánsan alacsonyabb volt több androgén metabolit szintje. Eredményeink rámutatnak arra, hogy a premenopauzában kialakuló mióma esetén a petefészkek műtéti eltávolításának hatására változások játszódnak le a szteroidok metabolizmusában. Posztmenopauzás,
méhnyálkahártyarákos
betegek
vizeletszteroid-metabolit
szintjeinek vizsgálata során hangsúlyt kapott az androgének szintjének alakulása, illetve a túlsúly, mint kockázati tényező érintettsége, ezért a szteroid-metabolitok mennyiségeit átszámoltuk egységnyi testtömeg indexre is. Komplex kapcsolatot feltételeznek az ösztrogének, androgének és a túlsúly között a posztmenopauzás,
méhnyálkahártyarák
kialakulása
során.
A
nők
posztmenopauzás
életszakaszában a petefészkek hormontermelésének leállása miatt minimálisra csökken az ösztrogén hormonok termelése. Az alacsony plazma koncentrációjú androgének kisebb részt az
androgéntermelő
mirigyekké
alakult
petefészkekből,
döntő
részt
pedig
a
mellékvesekéregből származnak. Ekkor az ösztrogének a mellékvesekéreg androgénjeinek a zsírszövetben történő aromatizációja révén keletkeznek. Túlsúly esetén nagyobb a valószínűsége az emelkedett ösztrogének szintjével kapcsolatba hozható méhnyálkahártyarák kialakulásának. A daganat kialakulásában az ösztrogénhormonok feltételezett szerepe bizonyítottnak tekinthető, azonban az esetek egy részénél nem mutatható ki az ösztrogének emelkedett szintje, ezért a szakirodalmi adatok a szérum ösztrogének esetében ellentmondásosak. Vizsgálataink során nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a szérum E2 szintjében a kontrollokéhoz képest. Az irodalmi adatok ellentmondásosak a szérum androgének esetében is. Az adatok nagyobb része a szérum androgének emelkedett szintjét igazolják, ennek ellenére az általunk vizsgált szérum T és DHEAS szintek eredményei azon kutatási eredményekkel egyeznek meg, melyek nem igazolják az androgének magasabb szintjét (Judd és mtsai, 1980; Falsetti és mtsai, 1983; Bonney és mtsai, 1986). A
vizeletszteroid-profilokat
vizsgálva
szignifikánsan
alacsonyabb
értékeket
tapasztaltunk több androgén és gyenge androgén hatású kortizol metabolit szintjeiben a méhnyálkahártyarákos nőknél a kontroll csoporthoz képest. Lehetséges, hogy ezen megállapítás igazolhatja az androgének ösztrogénekké történő aromatizációját? Valamint lehetséges, hogy a csökkenés nem más, mint a szervezet belső kompenzációja? Feltételezések szerint a progeszteron protektív hatású lehet a daganat kialakulásában. A vizelet szteroid metabolitokat elemezve nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a 75
progeszteron metabolit szintjében a kontrollokéhoz képest. Ezt az általunk vizsgált szérum P szintek is alátámasztották. Eredményeink szerint a legtöbb kortikoszteroid metabolit szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a beteg csoportban a kontroll csoporthoz képest. Alevizaki és mtsai (2006) megállapításai szerint pozitív kapcsolat van a mellékvesekéreg kortizol termelése és a krónikusan emelkedett szérum LH szint között a posztmenopauzában lévő nőknél. Eredményeink ezen megállapítást nem igazolták, mivel a szérum LH szintjében nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a posztmenopauzás, méhnyálkahártyarákos nőknél a kontrollokéhoz képest. A csökkent kortikoszteroid metabolitok szintje ráirányítja a figyelmet a glükokortikoidok esetleges szerepére, és megfontolandó lehetőséget vet fel az alkalmazott gyógyszeres kezelés szempontjából. Posztmenopauzás, hám eredetű petefészek daganatos betegek vizeletszteroidprofiljának a jellegzetességeit tanulmányoztuk. Célunk volt az androgén és progeszteron metabolitok szintjének vizsgálata, valamint megbízhazó szűrőmódszerek hiányában egy lehetséges diagnosztikai értékű egyedi vizeletszteroid-profil felállítása. Irodalmi adatok szerint feltételezik, hogy a szteroid-hormonoknak is szerepe lehet a daganat kialakulásában (Lukanova és Kaaks, 2005; Zheng és mtsai, 2007). Az ösztrogének szerepét tekintve többségében olyan irodalmi adatokkal találkozunk, melyek szerint az emelkedett ösztrogénhatás szerepet játszhat a daganat kialakulásában, azonban vannak ennek ellentmondó feltételezések is. Vizsgálataink során nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a betegek szérum E2 szintjében a kontrollokhoz képest. Eredményeink alátámasztják azon feltételezéseket, melyek szerint az androgének emelkedett szintje elősegítheti a daganat kifejlődését (Wiegratz és mtsai, 1995; Helzlsouer és mtsai, 1995; Coenen és mtsai, 1996; Schildkraut és mtsai, 1996; Ilekis és mtsai, 1997; Cottreau és mtsai, 2003). A vizeletszteroid-profilok vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy az androgének közül a DHEA és metabolitjainak a szintje szignifikánsan magasabb volt a posztmenopauzás, hám eredetű daganatos betegeknél a kontrollokéhoz viszonyítva. A szérum T
és
DHEAS
szintekben
azonban
nem
tapasztaltunk
szignifikáns
különbséget.
Megállapításunk azt a nézetet erősíti, mely szerint az androgének ösztrogénekké történő aromatizáció útján fejtik ki hatásukat a daganat kialakulásában. Feltételezik, hogy a progeszteron protektív hatású lehet a hám eredetű petefészek daganatnál. Eredményeink szerint a progeszteron metabolit szintje szignifikánsan magasabb volt a beteg csoportban a kontroll csoporthoz képest, viszont a szérum P szint ezt nem
76
igazolta. Lehet, hogy a szervezet a magasabb progeszteron szinttel kompenzálja az androgének aromatizációjából kialakult ösztrogének hatását? Vizsgálataink során a kortikoszteroidok közül egy kortizol és a kortikoszteron metabolitok szintjeiben tapasztaltunk szignifikánsan magasabb értékeket a beteg csoportban a kontroll csoporthoz képest, valamint a szérum LH szint is szignifikánsan magasabb volt a beteg csoportban. Eredményeink igazolják Alevizaki és mtsai (2006) megállapításait, melyek szerint pozitív kapcsolat van a mellékvesekéreg kortizol termelése és az emelkedett szérum LH
szint
között
a
posztmenopauzában
lévő
nőknél.
Megállapításunk
felveti
a
kortikoszteroidok lehetséges szerepét a laphám eredetű petefészek daganatnál. Célunk volt két premenopauzás, granulózasejtes petefészek daganatos beteg vizeletszteroid-profiljainak megismerése. Igazolni kívántuk az androgének feltételezett szerepét. Eredményeink a szérum E2 szintjének tekintetében megfelelnek azon szakirodalmi adatoknak, melyek igazolják, hogy a granulózasejtes petefészek daganat hormonálisan aktív és főként ösztrogéneket termel (Kaye és Davies, 1986; Lappohn és mtsai, 1989; Rey és mtsai, 1996). Irodalmi adatok szerint (Lappohn és mtsai, 1989) az esetek egy részénél nem ösztrogéneket, hanem androgéneket termel a daganat. Ezen megállapítást nem tudtuk igazolni a szérum T és DHEAS szintjeinek vizsgálata során. Eredményeink szerint a vizelet androgén metabolitok közül csak egy metabolit mennyisége haladta meg ugyanazon metabolit kontrolloknál mért Max értékét. Azonban a gyenge androgén hatású kortizol metabolitok is meghaladták a kontrolloknál mért Max értékeket. A progeszteron metabolit mennyiségének magasabb értékét tapasztaltuk az egyik granulózasejtes petefészek daganatos betegnél, azonban a szérum P szint vizsgálatánál ezt nem tudtuk megerősíteni. Ezen megállapítás ráirányíthatja a figyelmet arra, hogy a granulózasejtes petefészek daganat progeszteront is termelhet. Eredményeink szerint szinte valamennyi kortikoszteroid metabolit mennyisége meghaladta mindkét granulózasejtes petefészek daganatos betegnél a kontrolloknál mért kortikoszteroid metabolitok Max értékeit. Ezen megállapítás kiemeli a glükokortikoidok lehetséges szerepét is a daganat kialakulásában. Lényeges és az eddigi információk alapján várt eredmény a szérum E2 szintjeinek emelkedése a betegeknél. Azonban az, hogy nem tapasztaltunk különbséget a betegek szérum FSH és LH szintjeiben a kontrollokéhoz képest, felveti azt, hogy a vizeletszteroid-profil meghatározás alkalmasabb módszer lehet a granulózasejtes petefészek daganatos betegek nyomonkövetésére. 77
Posztmenopauzás, méhnyakrákos betegek vizeletszteroid-metabolit szintjeinek vizsgálata során hangsúlyt kapott az androgének szintjének alakulása. Irodalmi adatok szerint az ösztrogének módosult metabolizmusa a méhnyakrák egyik kockázati tényezője lehet (Auborn és mtsai, 1991; Sepkovic és mtsai, 1995), ill. az emelkedett ösztrogének szintje fokozhatja a daganat kialakulásában kulcsfontosságú papillomavírus fertőzés terjedését (Schneider és mtsai, 1987). Eredményeink nem igazoltak szignifikáns különbséget a szérum E2 szintjében, a beteg csoportban a kontroll csoporthoz képest. Lee és mtsai (2003) korábban vizsgálták a vizeletszteroid-profilokat premenopauzás, méhnyak daganatos nőknél. Az általunk vizsgált posztmenopauzás, méhnyakrákos betegek szteroid-profiljait elemezve eltérést találtunk. Lee és mtsai (2003) eredményeivel megegyezően az androgén és a gyenge androgén hatású kortizol metabolitok szintjében szignifikánsan alacsonyabb értékeket detektáltunk. A szérum T és DHEAS szintekben azonban nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget. Több kortizon és kortizol metabolit szintjében viszont szignifikánsan alacsonyabb értékeket tapasztaltunk ellentétben Lee és mtsai eredményeivel. Ezen megállapításunk rámutathat
arra,
hogy
a
kortikoszteroidoknak
eltérő
szerepe
lehet
a
pre-
és
posztmenopauzában kialakult méhnyakráknál. Fiatal, endometriózisos betegek vizeletszteroid-profiljának a jellegzetességeit tanulmányoztuk GnRH analóg kezelés közben. Vizsgálataink célja volt a kezelés hatására bekövetkező szteroid metabolizmus változásainak a feltárása. Az endometriózis csomók a méh nyálkahártyájához hasonlóan reagálnak az ösztrogén és progeszteron hormonokra a menstruációs ciklus során. A betegség kezelésénél a gyógyszerek alkalmazása esetén nagy szerep jut a petefészkek működését (ösztrogén termelést) gátló különböző szereknek. Legelterjedtebb a GnRH analógok alkalmazása, ugyanis
bizonyított
tény,
hogy
ösztrogénszegény
környezetben
az
endometriózis
visszafejlődik, és a tünetek javulnak (Hughes és mtsai, 1993; Lessey, 2000). A szakirodalomból ismert a szérum E2, FSH és LH szintek csökkenése a GnRH analóg kezelés alatt álló beteg csoportban, melyet eredményeink is igazoltak. Endometriózis esetén a vizeletszteroid-metabolitok szintjével kapcsolatos korábbi irodalmi adatok nem álltak a rendelkezésünkre. Vizsgálataink szerint az egyik androgén metabolit szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a beteg csoportban a kontroll csoporthoz képest, ami a kezelés várt hatásával magyarázható. A kortikoszteroidok közül egy kortizol metabolit szintje volt szignifikánsan alacsonyabb. Az egyik kortikoszteron metabolit szintje szignifikánsan alacsonyabb, egy másiké pedig szignifikánsan magasabb volt. A kapott 78
eredmény rámutat arra, hogy a GnRH analóg kezelés befolyásolja a glükokortikoidok metabolizmusát. Lényeges és az eddigi információk alapján várt eredmény a szérum E2, FSH és LH szintjeinek csökkenése. Eredményeink rámutatnak arra, hogy az endometriózis GnRH analóg kezelésének hatására változások játszódnak le a szteroidok metabolizmusában.
79
Összefoglalás Jellegzetes vizeletszteroid-profillal rendelkeznek egyes mellékvese és ivarmirigy eredetű betegségek, amelyeknél jelentős a profilok diagnosztikai értéke, ezért a módszert széleskörűen alkalmazzák a gyermekgyógyászat, bőrgyógyászat, belgyógyászat és a nőgyógyászat területén is. Az általunk vizsgált nőgyógyászati megbetegedések komplex endokrin háttérrel rendelkeznek, és patofiziológiájukban a szteroid hormonoknak összetett szerepe van. A vizsgált betegségeknél változásokat tapasztaltunk a vizeletszteroid-profilban az azonos nemű és hasonló korú kontroll csoportokéhoz képest. Fontosabb eredményeink: - Rámutattunk, hogy a premenopauzában kialakuló mióma műtéti kezelésének következtében megváltozik a szteroidok metabolizmusa. Felhívtuk a figyelmet arra, hogy a még nem kezelt betegeknél több kortizon alakul át aktív kortizollá, ami a 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzimrendszer működésének változását jelzi. A műtétet követően az androgén és progeszteron metabolitok szintjében igazolódott csökkenés. - A posztmenopauzás méhnyálkahártyarák esetén igazolódott a túlsúly kockázati szerepe. Az androgén metabolitok szintjében igazolódott csökkenés, mely a feltételezett ösztrogénekké történő aromatizációt mutatja. Ráirányítottuk a figyelmet a glükokortikoidok szerepére is. - A posztmenopauzás hám eredetű daganat esetén számos androgén metabolit szintjében igazolódott szignifikáns emelkedés, mely egyben jelezheti az androgének szerepét a daganat kialakulásában. A progeszteron metabolit szintjében igazolt szignifikáns emelkedés a hormon protektív hatását igazolta. Igazoltuk, hogy az emelkedett szérum LH szint hatással van a mellékvesekéreg kortizol termelésére posztmenopauzás nőknél. - Az esettanulmányként vizsgált premenopauzás granulózasejtes petefészek daganat esetében igazoltuk a daganat ösztrogén termelését emellett felvetettük annak lehetőségét, hogy progeszteront is termelhet. Továbbá számos androgén, progeszteron és glükokortikoid metabolit
szintjében
igazoltunk
emelkedést,
mely
felveti
azt,
hogy
a
betegség
80
nyomonkövetésének szempontjából a vizeletszteroid-metabolitok vizsgálatára kidolgozott módszer alkalmasabb lehet a szérum hormonok meghatározására használt módszerekhez képest. - Felhívtuk a figyelmet arra, hogy a menopauza különböző szakaszaiban megbetegedett méhnyakrákos nőknél eltérő hormonális változások figyelhetők meg. A posztmenopauzában kialakuló méhnyakrák esetén több kortizon és kortizol metabolit szintjében igazolódott szignifikáns csökkenés, mely rámutat a glükokortikoidok eltérő szerepére. - Rámutattunk, hogy az endometriózis GnRH analóg kezelésének hatására változások játszódnak le a szteroidok metabolizmusában. Igazoltuk a várt, kezelés hatására bekövetkező szérum E, FSH és LH szintek szignifikáns csökkenését. - A vizeletszteroid-profil meghatározás továbbfejlesztése révén új módszert hoztunk létre, melynek segítségével gyorsabbá vált a minták feldolgozása és pontosabbá vált a szteroidmetabolitok minőségi és mennyiségi analízise. Az
egyes
metabolitok
szintjében
tapasztalt
hasonló
változások
az
egyes
megbetegedéseknél különböző tünetekkel járnak. Ebből következik, hogy a vizeletszteroidprofil módszer alkalmas a változások detektálására, de az egyes komponensek pontos szerepének tisztázásához további szövet-specifikus vizsgálatok szükségesek.
81
Hivatkozások jegyzéke Adami HO, Hsieh CC, Lambe M, Trichopoulos D, Leon D, Persson I, Ekbom A, Janson PO (1994) Parity, age at first child-birth, and risk of ovarian cancer. Lancet 344:1250-1254. Akhmedkhanov A, Zeleniuch-Jacquotte A, Toniolo P (2001) Role of exogenous and endogenous hormones in endometrial cancer: review of the evidence and research perspectives. Ann NY Acad Sci 943:296-315. Andrew R (2001) Clinical measurement of steroid metabolism. Best Practice Res 15:1-16. Auborn KJ, Woodworth C, Dipaolo JA, Brandlow HL (1991) The interaction between HPV infection and estrogen metabolism in cervical carcinogenesis. Int J Cancer 49:867-869. Austin H, Austin JM Jr, Partridge EE, Hatch KD, Shingleton HM (1991) Endometrial cancer, obesity, and body fat distribution. Cancer Res 51:568-572. Bablok W, Passing H, Bender R, Schneider B (1988) A general regression procedure for method transformation. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part III. J Clin Chem Clin Biochem 26:783-790. Barett-Connor E, Goodman-Gruen D (1998) Gender differences in insulin-like growth factor and bone mineral density association in old age. J Bone Miner Res 13:1343-1349. Bartels H, Böhmer M, Heierli C (1972) Serum creatinine determination without protein precipitation. Clin Chim Acta 37:193-197. Bennington JL, Ferguson BR, Haber SL (1968) Incidence and relative frequency of benign and malignant ovarian neoplasms. Obstet Gynecol 32:627-632. Bjorge T, Engeland A, Tretli S, Weiderpass E (2007) Body size in relation to cancer of the uterine corpus in 1 million Norwegian women. Int J Cancer 120:378-383. Bonney RC, Scanlon MJ, Jones DL, Reed MJ, Anderson MC, James VH (1986) The relationship between oestradiol metabolism and adrenal steroids in the endometrium of postmenopausal women with and without endometrial cancer. Eur J Cancer Clin Oncol 22:953-961. Brandon DD, Erickson TE, Keenan EJ, Strawn EZ, Novy MJ, Burry KA, Warner C, Clinton GM (1995) Estrogen receptor gene expression in human uterine leiomyomata. J Clin Endocrinol Metab 80:1876-1881. Bray F, Loos AH, Oostindier M, Weiderpass E (2005) Geographic and temporal variations in cancer of the corpus uteri: Incidence and mortality in pre- and postmenopausal women in Europe. Int J Cancer 117:123-131. Bu SZ, Yin DL, Ren XH, Jiang LZ, Wu ZJ, Gao QR, Pei G (1997) Progesterone induces apoptosis and up-regulation of p53 expression in human ovarian carcinoma cell lines. Cancer 79:1944-1950.
82
Bufa A, Poór V, Bálint A, Molnár Sz, Jeges S, Pótó L, Gőcze P, Kilár F (2008) Endogenous urinary steroids in postmenopausal women with epithelial ovarian cancer. Chromatography 68:131-135. Chen LM, Yang KY, Little SE, Cheung MK, Caughey AB (2007) Gynecologic cancer prevention in Lynch syndrome/hereditar nonpolyposis colorectal cancer families. Obstet Gynecol 110:18-25. Choi JH, Wong AS, Huang HF, Leung PC (2007) Gonadotropins and ovarian cancer. Endocr Rev 28:440-461. Coenen CM, Thomas CM, Borm GF, Hollanders JMG, Rolland R (1996) Changes in androgens during treatment with four low-dose contraceptives. Contraception 53:171-176. Cottreau CM, Ness RB, Modugno F, Allen GO, Goodman MT (2003) Endometriosis and its treatment with danazol or lupron in relation to ovarian cancer. Clin Cancer Res 9:5142-5144. Davis S, McCloud P, Strauss B, Burger H (1994) Testosterone enhances estradiol's efects on postmenopausal bone density and sexuality. Maturitas 21:227-236. Davis S (1997) Androgens and bone function. Maturitas 27:8. Dunlop MG, Farrington SM, Carothers AD, Wyllie AH, Sharp L, Burn J, Liu B, Kinzler KW, Vogelstein B (1997) Cancer risk associated with germline DNA mismatch repair gene mutations. Hum Mol Genet 6:105-110. Emons G, Fleckenstein G, Hinney B, Huschmand A, Heyl W (2000) Hormonal interactions in endometrial cancer. Endocr Relat Cancer 7:227-242. Escobedo LG, Lee NC, Peterson HB, Wingo PA (1991) Infertility-associated endometrial cancer risk may be limited to specific subgroups of infertile women. Obstet Gynecol 77:124128. Evans AT, Gaffey TA, Malkasian GD, Annegers JF (1980) Clinicopathologic review of 118 granulosa and 82 theca cell tumors. Obstet Gynecol 55:231-238. Falsetti L, Omodei U, Dordoni D, Scagliola P, Turla R, Zotti L, Archetti L (1983) Profiles and endocrine correlations in endometrial carcinoma. Eur J Gynaecol Oncol 4:30-34. Folsom AR, Anderson JP, Ross JA (2004) Estrogen replacement therapy and ovarian cancer. Epidemiology 15:100-104. Foster-Swanson A, Swartzentruber M, Roberts P, Feld R, Johnson M, Wong S, Bartsch J, Dees K, Toner M, Cloyd D, Dacquette J, Wu A, Bradley H, Trundle D (1997) Reference interval studies on the rate-blanked Creatinine/Jaffe method on BM/Hitachi systems in six U.S. laboratories. Clin Chem 40:1057 (Abstract) Fujii S (1992) Uterine leiomyoma: pathogenesis and treatment. Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi 44(8):994-999.
83
Gimes G, Szarvas Z, Siklosi G (1986) Endocrine factors in the etiology of endometrial carcinoma. Neoplasma 33:393-397. Giudice L (2004) Endometriosis. Lancet 364:1789-1799. Goeretzlehner G (2001) The role of progestogens in hormone replacement. Drugs Today 37:1-8. Helzlsouer KJ, Alberg AJ, Gordon GB, Longcope C, Bush TL, Hoffman SC, Comstock GW (1995) Serum gonadotropins and steroid hormones and the development of ovarian cancer. JAMA 274:1926-1930. Hill HA, Austin H (1996) Nutrition and endometrial cancer. Cancer Causes Control 7:19-32. Ho SM (2003) Estrogen, progesterone and epithelial ovarian cancer. Reprod Biol Endocrinol 1:73. Homma K, Hasegawa T, Masumoto M, Takeshita E, Watanabe K, Chiba H, Kurosawa T, Takahashi T, Matsuo N (2003) Reference values for urinary steroids in japanese newborn infants: gas chromatography/mass spectrometry in selected ion monitoring. Endocr J 50(6):783-792. Homoki J, Holl R, Teller WM (1987) Harnsteroidprofile bei Cushing Syndrom und tumoren der Nebennierenrinde. Klin Wochenschr 65:719-726. Honour JW (1990) Steroid profile for urine reference values. Clin Chem 36(8):1528-1529. Honour JW (1997a) Steroid profiling. Ann Clin Biochem 34:32-44. Honour JW, Brook CGD (1997b) Clinical indications for the use of urinary steroid profiles in neonates and children. Ann Clin Biochem 34:45-54. Hughes EG, Fedorkow DM, Collins JA (1993) A quantitative overview of controlled trials in endometriosis-associated infertility. Fertil Steril 59:963-970. Ichibura T, Kawamura N, Ito F, Shibata S, Minakuchi K, Tsujimura A, Umesaki N, Ogita S (1998) Correlation between the growth of uterine leiomyomata and estrogen and progesterone receptor content in needle biopsy specimens. Fertil Steril 70:967-971. Ilekis JV, Connor JP, Prins GS, Ferrer K, Niederberger C, Scoccia B (1997) Expression of epidermal growth factor and androgen receptors in ovarian cancer. Gynecol Oncol 66:250254. Judd HL, Davidson BJ, Frumar AM, Shamonki IM, Lagasse LD, Ballon SC (1980) Serum androgens and estrogens in postmenopausal women with and without endometrial cancer. Am J Obstet Gynecol 136:859-871.
84
Juricskay Z, Mezey B (1994) Effect of regular training on the anthropometric parameters and urine steroids in childhood. Eur J Appl Physiol 68:367-372. Juricskay S, Szabó I, Kett K (1997) Urinary steroids at time of surgery in postmenopausal women with breast cancer. Breast Cancer Res Tr 44:83-89. Juricskay S, Telegdy E (2000) Urinary steroids in women with androgenic alopecia. Klin Biochem 33:97-101. Kaaks R, Lukanova A, Kurzer MS (2002) Obesity, endogenous hormones , and endometrial cancer risk. American Association for Cancer Research 11:1531-1543. Kasperk C, Wakley G, Hierl T, Ziegler R (1997) Gonadal and adrenal androgens are potent regulators of human bone cell metabolism in vitro. J Bone Miner Res 12:464-471. Kaye SB, Davies E (1986) Cyclophosphamide, adriamycin, and cis-platinum for the treatment of advanced granulosa cell tumor, using serum estradiol as a tumor marker. Gynecol Oncol 24:261-264. Kokawa K, Yamoto M, Yata C, Mabuchi Y, Umesaki N (2002) Postmenopausal intravenous leiomyomatosis with high levels of estradiol and estrogen receotor. Obstet Gynecol 100:11241126. Labrie F, Diamond P, Cusan L (1997) Effect of 12 month DHEA replacement therapy on bone mineral density in 60- to 70-year-old women. Maturitas 27:119. Lappohn RE, Burger HG, Buoma J, Bangah M, Krans M, de Bruijn HW (1989) Inhibin as a marker for granulosa-cell tumors. N Engl J Med 321:790-793. Lee SH, Yang YJ, Kim KM, Chung BC (2003) Altered urinary profiles of polyamines and endogenous steroids in patients with benign cervical disease and cervical cancer. Cancer Letters 201:121-131. Leitao MM, Soslow RA, Nonaka D, Olshen AB, Aghajanian C, Sabbatini P, Dupont J, Hensley M, Sonoda Y, Barakat RR, Anderson S (2004) Tissue microarray immunohistochemical expression of estrogen, progesterone, and androgen receptors in uterine leiomyomata and leiomyosarcoma. American Cancer Society 101:1455-1462. Lessey BA (2000) Medical management of endometriosis and infertility. Fertil Steril 73:1089-1096. Lindgren P, Backstrom T, Mahlck CG, Ridderheim M, Cajander S (2001) Steroid receptors and hormones in relation to cell proliferation and apoptosis in poorly differentiated epithelial ovarian tumors. Int J Oncol 19:31-38. Lindsay R, Tohme J (1990) Estrogen treatment of patient with established postmenopausal osteoporosis. Obstet Gynecol 72:290-295.
85
Lindström A, Backström T, Hellberg D, Tribukait B, Strang P, Stendahl U (2000) Correlations between serum progesterone and smoking, and the growth fraction of cervical squamous cell carcinoma. Anticancer Res 20:3637-3640. Lindström AK, Ekman K, Stendahl U, Tot T, Henriksson R, Hedman H, Hellberg D (2008) LRIG1 and squamous epithelial uterine cervical cancer: correlation to prognosis, other tumor markers, sex steroid hormones, and smoking. Int J Gynecol Cancer 18:312-317. Lukanova A, Lundin E, Akhmedkhanov A, Micheli A, Rinaldi S, Zeleniuch-Jacquotte A, Lenner P, Muti P, Biessy C, Krogh V, Berrino F, Hallmans G, Riboli E, Kaaks R, Toniolo P (2003) Circulating levels of sex steroid hormones and risk of ovarian cancer. Int J Cancer 104:636-642. Lukanova A, Lundin E, Micheli A, Arslan A, Ferrari P, Rinaldi S, Krogh V, Lenner P, Shore RE, Biessy C, Muti P, Riboli E, Koenig KL, Levitz M, Stattin P, Berrino F, Hallmans G, Kaaks R, Toniolo P, Zeleniuch-Jacquotte A (2004) Circulating levels of sex steroid hormones and risk of endometrial cancer in postmenopausal women. Int J Cancer 108:425-432. Lukanova A, Kaaks R (2005) Endogenous hormones and ovarian cancer: epidemiology and current hypotheses. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 14:98-107. Manelli F, Giustina A (2000) Glucocorticoid induced osteoporosis. Trends Endocrin Met 11:79-85. Matsuura K (1994) Coelomic metaplasia theory of endometriosis: evidence from in vivo studies and an in vitro experimental model. Gynecol Obstet Invest 47:18-20. Mitchell H, Drake M, Medley G (1986) Prospective evaluation of risk of cervical cancer after cytological evidence on human papillomavirus infection. Lancet 1 573-575. Mitchell MF, Luna GT, Lee JJ, Hittelman WK, Lotan R, Wharton JT, Hong WK, Nishioka K (1997) Polyamine measurements in the uterine cervix. J Cell Biochem Suppl 28:125-132. Modan B, Ron E, Lerner GL, Blumstein T, Menczer J, Rabinovici J, Oelsner G, Freedman L, Mashiach S, Lunenfeld B (1998) Cancer incidence in a cohort of infertile women. Am J Epidemiol 147:1038-1042. Mori M, Sagae S (2001) Recent progress in epidemiological research of uterine cancer. Gan To Kagaku Ryoho 28:174-178. Munoz-Torres M, Jodar M, Quesada M, Escobar-Jimenez F (1995) Bone mass in androgeninsensitivity syndrome: response to hormonal replacement therapy. Calcified Tissue Int 57:94-96. Nagamani M, Hannigan EV, Dillard EA Jr, Van Dinh T (1986) Ovarian steroid secretion in postmenopausal women with and without endometrial cancer. J Clin Endocrinol Metab 62:508-512.
86
Ness RB, Cramer DW, Goodman MT, Kjaer SK, Mallin K, Mosgaard BJ, Purdie DM, Risch HA, Vergona R, Wu AH (2002) Infertility, fertility drugs, and ovarian cancer: a pooled analysis of case-control studies. Am J Epidemiol 155:217-224. Niwa K, Imai A, Hashimoto M, Yokoyama Y, Mori H, Matsuda Y, Tamaya T (2000) A casecontrol study of uterine endometrial cancer of pre- and post-menopausal women. Oncol Rep 7:89-93. Ohel G, Kaneti H, Schenker JG (1983) Granulosa cell tumors in Israel: a study of 172 cases. Gynecol Oncol 15:278-286. Otremski I, Lev-Ran M, Salama R, Edelstein S (1997) The metabolism of vitamin D3 in response to testosterone. Calcified Tissue Int 60:485-487. Parazzini F, La Vecchia C, Bocciolone L, Franceschi S (1991) The epidemiology of endometrial cancer. Gynecol Oncol 41:1-16. Pectasides D, Pectasides E, Psyrri A (2008) Granulosa cell tumor of the ovary. Cancer Treatment Reviews 34:1-12. Petraglia F, Luisi S, Pautier P, Sabourin JC, Rey R, Lhomme C, Bidart JM (1998) Inhibin B is the major form of inhibin/activin family secreted by granulosa cell tumors. J Clin Endocrinol Metab 83:1029-1032. Poór V, Bufa A, Bíró I, Wilhelm F, Juricskay S (2004) Examination of sex steroids in the urines of postmenopausal women with osteoporosis. Chromatographia 59:1-4. Poór V, Bufa A, Bíró I, Telegdy E, Tényi T, Gáti Á, Osváth P, Wilhelm F, Juricskay S (2005) Urinary steroid measurements in some endocrine and psychiatric diseases. Current Medical Chemistry 12:763-771. Potgieter HC, Magagane F, Bester MJ (1995) Oestrogen and progesterone receptor status and PgR/ER ratios in normal and myomatous human myometrium. East Afr Med 72:510-514. Potischman N, Hoover RN, Brinton LA, Siiteri P, Dorgan JF, Swanson CA, Berman ML, Mortel R, Twiggs LB, Barrett RJ, Wilbanks GD, Persky V, Lurain JR (1996) Case-control study of endogenous steroid hormones and endometrial cancer. J Natl Cancer Inst 88:11271135. Ramus SJ, Harrington PA, Pye C, DiCioccio RA, Cox MJ, Garlinghouse-Jones K, OakleyGirvan I, Jacobs IJ, Hardy RM, Whittemore AS, Ponder BAJ, Piver MS, Pharoah PDP, Gayther SA (2007) Contribution of BRCA1 and BRCA2 mutations to inherited ovarian cancer. Human Mutation 28:1207-1215. Rey RA, Lhomme C, Marcillac I, Lahlou N, Duvilland P, Josso N (1996) Antimullerian hormone as a serum marker of granulosa cell tumors of the ovary: comparative study with serum alpha-inhibin and estradiol. Am J Obstet Gynecol 174:958-965.
87
Riman T, Dickman PW, Nilsson S, Correia N, Nordlinder H, Magnusson CM, Weiderpass E, Persson IR (2002) Hormone replacement therapy and the risk of invasive epithelial ovarian cancer in Swedish women. J Natl Cancer Ints 94:497-504. Risch HA (Hormonal etiology of epithelial ovarian cancer, with a hypothesis concerning the role of androgens and progesterone. J Natl Cancer Inst 90:1774-1786. Robertson DM, Cahir N, Burger HG, Mamers P, Groome N (1999) Inhibin forms in serum from postmenopausal women with ovarian cancers. Clin Endocrinol 50:381-386. Rossing MA, Daling JR, Weiss NS, Moore DE, Self SG (1994) Ovarian tumors in a cohort of infertile women. N Engl J Med 331:771-776. Salazar EL, Sojo-Aranda I, López R, Salcedo M (2001) The evidence for an etiologocal relationship between oral contraceptive use and dysplastic change in cervical tissue. Gynecol Endocrinol 15:23-28. Sasano H, Uzuki M, Sawai T (1997) Aromatase in human bone tissue. J Bone Miner Res 12:1416-1423. Savage P, Constenla D, Fisher C, Shepherd JH, Barton DP, Blake P, Gore ME (1998) Granulosa cell tumors of the ovary: demographics, survival and the management of advanced disease. Clin Oncol 10:242-245. Schildkraut JM, Schwingl PJ, Bastos E, Evanoff A, Hughes C (1996) Epithelial ovarian cancer risk amoung women with polycystic ovary syndrome. Obstet Gynecol 88:554-559. Schildkraut JM, Calingaert B, Marchbanks PA, Moorman PG, Rodriguez GC (2002) Impact of progestin and estrogen potency in oral contraceptives on ovarian cancer risk. J Natl Cancer Inst 94:32-38. Schneider A, Holz M, Gissmann L (1987) Increased prevalence of human papillomaviruses in the lower genital tract of pregnant women. Int J Cancer 40:198-203. Schumer ST, Cannistra SA (2003) Granulosa cell tumor of the ovary. J Clin Oncol 21:11801189. Sepkovic DW, Brandlow HL, Ho G, Hankinson SE, Gong L, Osborne MP, Fishman J (1995) Estrogen metabolite ratios and risk assessment of hormone-related cancers; assay validation and prediction of cervical cancer risk. Ann N Y Academy Sci 30:312-315. Shackleton CHL, Honour JW (1976) Simultaneous estimation of urinary steroids by semiautomated gas chromatography. Investigation of neo-natal infants and children with abnormal steroid synthesis. Clin Chim Acta 69:267-283. Shackleton CHL, Whitney JO (1980) Use of Sep-pak ®cartridges for urinary steroid extraction: evaluation of the method for use prior to gas chromatographic analysis. Clin Chim Acta 107:231-243.
88
Shackleton CHL (1986) Review. Profiling steroid hormones and urinary steroids. J Chromatogr 379:91-156. Shackleton CHL, Merdinck J, Lawson AM (1990) Steroid and bile acid analyses. McEwen CN, Larsen BS (Eds) In: Mass spectrometry of biological materials. 297-375. Shamim W, Yousufuddin M, Bakhai A, Coats AJS, Honour JW (2000) Gender differences in the urinary excretion rates of cortisol and androgen metabolites. Ann Clin Biochem 37:770774. Sowers M, Clarc M, Jannausch M, Wallace R (1993) Body size, estrogen use and thiazide diuretic use affects 5-year radial bone loss in postmenopausal women. Osteoporosis Int 3:314321. Sólyom J (1998) Gyermekgyógyászati diagnosztika és hormonvizsgálatok. Medicina Könyvkiadó, Bp. Sólyom J (2001) Congenitalis adrenalis hyperplasia. Leövey András (Szerk.) A klinikai endokrinológia és anyagcsere-betegségek kézikönyve, Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 419-429. Sudan O, van Iddekinge B, van Gelderen CJ, Savage N, Becker PJ, van der Walt LA (1987) Oestrogen and progesterone receptor concentrations in leiomyoma and normal myometrium. Ann Clin Biochem 24:263-267. Syed V, Ulinski G, Mok SC, Yiu GK, Ho SM (2001) Expression of gonadotropin receptor and growth responses to key reproductive hormones in normal and malignant human ovarian surface epithelial cells. Cancer Res 61:6768-6776. Szilágyi A, Homoki J, Bellyei Sz, Szabó I (2000) Hormonal and clinical effects of chronic gonadotropin-releasing hormone agonist treatment in policistic ovary syndrome. Gynecol Endocrinol 14:337-341. Takayanagi R, Goto K, Suzuki S, Tanaka S, Shimoda S, Nawata H (2002) Dehydroepiandrosterone (DHEA) as a possible source for estrogen formation in bone cells: correlation between bone mineral density and serum DHEA-sulfate concentration in postmenopausal women, and the presence of aromatase to be enhanced by 1, 25 dihydroxivitamin D in human osteoblast. Mech Ageing Dev 123:1107-1114. Tok EC, Ertunc D, Oz U, Camdeviren H, Ozdemir G, Dilek S (2004) The effect of circulating androgens on bone mineral density in postmenopausal women. Maturitas 48:235-245. Troisi R, Potischman N, Hoover RN, Siiteri P, Brinton LA (1997) Insulin and endometrial cancer. Am J Epidemiol 146:476-482. Tung KH, Wilkens LR, Wu AH, McDuffie K, Nomura AM, Kolonel LN, Terada KY, Goodman MT (2005) Effect of anovulation factors on pre- and postmenopausal ovarian cancer risk: revisiting the incessant ovulation hypothesis. Am J Epidemiol 161:321-329.
89
Weiderpass E, Adami HO, Baron JA, Magnusson C, Lindgren A, Persson I (1999) Use of oral contraceptives and endometrial cancer risk (Sweden). Cancer Causes Control 10:277-284. Weiss NS, Hill DA (1996) Postmenopausal estrogens and progestogens and the incidence of gynecologic cancer. Maturitas 23:235-239. Westfall G, Littlefield R, Heaton A, Martin S (2001) Methodology for identifying patients at high risk for osteoporotic fracture. Clin Ther 23:1570-1588. Weykamp CW, Penders TJ, Schmidt NA, Borburgh AJ, van de Calseyde JF, Wolthers BJ (1989) Steroid profile for urine: Reference Values. Clin Chem 35(12):2281-2284. Wiegratz I, Jung-Hoffmann C, Kuhl H (1995) Effect of two oral contraceptives containing ethinylestradiol and gestodene or norgestimate upon androgen parameters and serum binding proteins. Contraception 51:341-346. Wilson EA, Yang F, Ress ED (1980) Estradiol and progesterone binding in uterine leiomyomata and in normal uterine tissues. Obstet Gynecol 55(1):20-24. Wu J, Cheng Y (1995) Research on the relationship between estrogen receptor, progesterone receptor, cell proliferation associated antigen in uterine leiomyoma and nuclear body density of myoma, serum reproductive hormone concentration. Chung-Hua FU Chan Ko Tsa Chih 30:603-607. Wudy SA, Hartman MF (2004) Gas chromatography-mass spectrometry profiling of steroids in times of molecular biology. Horm Metab Res 36:415-422. Yu S, Lee M, Shin S, Park S (2001) Apoptosis induced by progesterone in human ovarian cancer cell line SNU-840. J Cell Biochem 82:445-451. Zeleniuch-Jacquotte A, Akhmedkhanov A, Kato I, Koenig KL, Shore RE, Kim MY, Levitz M, Mittal KR, Raju U, Banerjee S, Toniolo P (2001) Postmenopausal endogenous estrogens and risk of endometrial cancer: results of a prospective study. Br J Cancer 84:975-981. Zheng W, Li N, Wang J (2005) Initial endometriosis showing direct morphologic evidence of metaplasia in the pathogenesis of ovarian endometriosis. Int J Gynecol Pathol 24:164-172. Zheng H, Kavanagh JJ, Hu W, Liao Q, Fu S (2007) Hormonal therapy in ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer 17:325-338. Zofková I, Bahbouh R, Hill M (2000) The pathophysiological implications of circulating androgens on bone mineral density in a normal female population. Steroids 65:857-861. Internetes források jegyzéke www.skzl-mca.nl: Holland külső minőségbiztosítási program
90
Függelék 1.
táblázat
Vizeletszteroid-metabolitok
szerkezeti
és
összegképlete,
valamint
molekulatömege (g/mol) 1.1
5α-androsztán 5α-androsztán-3α-ol-17-on androszteron An C19 H30 O2 290
5α-androsztán-3α, 11β-diol-17-on 11β-hidroxi-androszteron 11-OH-An C19 H30 O3 306
1.2
5β-androsztán 5β-androsztán-3α-ol-17-on etiokolanolon Et C19 H30 O2 290
5β-androsztán-3α, 11β-diol-17-on 11β-hidroxi-etiokolanolon 11-OH-Et C19 H30 O3 306
91
1.3
5-androsztén 5-androsztén-3β-ol-17-on dehidroepiandroszteron DHEA C19 H28 O2 288
5-androsztén-3β,16α-diol-17-on 16α-hidroxi-DHEA 16-OH-DHEA C19 H28 O3 304
5-androsztén-3β, 16α, 17β-triol androszténtriol ∆5-AT C19 H30 O3 306
1.4
5α-pregnán 5α-pregnán-3α, 11β, 21-triol-20-on allo-tetrahidrokortikoszteron aTHB C21 H34 O4 350
5α-pregnán-3α, 11β, 17α, 21-tetrol-20-on allo-tetrahidrokortizol aTHF C21 H34 O5 366
92
1.5
4-pregnén 4-pregnén-11β, 17α, 21-triol-3, 20-dion kortizol F C21 H30 O5 362
1.6
5-pregnén 5-pregnén-3β,20α-diol pPregnéndiol ∆5-PD C21 H34 O2 318
5-pregnén-3β, 17α, 20α-triol pregnéntriol ∆5-PT C21 H34 O3 334
1.7
5β-pregnán 5β-pregnán-3α,20α-diol Pregnándiol PD C21 H36 O2 320
5β-pregnán-3α,17α,20α-triol Pregnántriol PT C21 H36 O3 336
93
5β-pregnán-3α, 17α 21-triol-20-on Tetrahidro-11-deoxikortizol THS C21 H34 O4 350
5β-pregnán-3α, 17α, 20α-triol-11-on 11-keto pregnántriol 11-O-PT C21 H34 O4 350
5β-pregnán-3α, 17α, 21-triol-11, 20-dion Tetrahidrokortizon THE C21 H32 O5 364
5β-pregnán-3α, 21-diol-11, 20-dion Tetrahidro-11-dehidrokortikoszteron THA C21 H32 O4 348
5β-pregnán-3α, 11β, 21-triol-20-on Tetrahidrokortikoszteron THB C21 H34 O4 350
5β-pregnán-3α, 11β, 17α, 21-tetrol-20-on Tetrahidrokortizol THF C21 H34 O5 366
5β-pregnán-3α, 17α, 20α, 21-tetrol-11-on α-kortolon α-CL C21 H34 O5 366
94
5β-pregnán-3α, 17α, 20β, 21-tetrol-11-on β-kortolon β-CL C21 H34 O5 366
5β-pregnán-3α, 11β, 17α, 20α, 21-pentol-11on α-kortol α-C C21 H36 O5 368
95
2. táblázat A vizeletszteroid-profil módszerrel meghatározott, származékképzett szteroidok szerkezeti képletei és molekulatömegei (m/z), valamint a tömegspektrometriai detektálás során, az ionizáció következtében, a teljes molekuláról leváló csoportok, illetve molekulatömegek (m/z) a célion és a minősítő ionok esetében Vizeletszteroidok
Származékképzett szteroidok, molekulatömeg (m/z)
An
Célion, molekulatömeg (m/z)
CH3
CH3
N O
H
391,1
Et
H
270,1
N O
H3C O H3C Si CH3
H3C
Si
O
CH3 N O
H3C
H
479,1
H3C O H3C Si CH3
Si
CH3 O
N O
360,2
H3C O H3C Si CH3
H
391,1
CH3
CH3
N O
260,2 H3C
391,1 CH3
H
N O
389,3 CH3
H3C O H3C Si CH3
CH3
H3C O H3C Si CH3
H
N O
270,1
N O
H3C
360,2
O H3C Si CH3
CH3
H
CH3
H3C O H3C Si CH3
H
N O
391,1
DHEA
H3C
O H3C Si CH3
CH3
H
N O
H3C
O H3C Si CH3
CH3
H3C O H3C Si CH3
CH3
N O
H3C
O H3C Si CH3
H3C O H3C Si CH3
CH3
N O
H3C
11-OH-An
Minősítő ionok, molekulatömeg (m/z)
H3C O H3C Si CH3
CH3
358,2 H3C
N O
H3C
H
448,2
H3C O H3C Si CH3
N O
Si
CH3 O
H3C O H3C Si CH3
CH3
389,3 H3C
N O
H3C
H
358,2
H3C O H3C Si CH3
Si
CH3 O
CH3 N O
H
479,1
96
11-OH-Et
H3C
Si
H3C
CH3
CH3
H3C
N O
O
Si
H3C
H3C
CH3
CH3 O
H
479,1
16-OH-DHEA
H
448,2
477,3 CH3
H3C O H3C Si CH3
CH3
∆5-PD
464,1
552,1
H3C O H3C Si CH3
CH3
HC O Si CH 3
H3C O H3C Si CH3
462,3
H
479,1 O CH3
356,2
CH3 O Si CH3 H3C
H3C O H3C Si CH3
477,3
CH3
CH3
H3C O H3C Si CH3
H
CH3
284,1
H3C O H3C Si CH3
H
H3C CH 3 CH3 Si CH3 HC O CH3 O Si CH3 CH3
H
255,1
H3C O H3C Si CH3
CH3
435,3
H3C O H3C Si CH3
CH3
552,1 CH3
HC O Si CH 3
CH3
372,1
H CH3
HC O Si CH 3
H3C O H3C Si CH3
449,3 H3C CH 3 CH3 Si CH3 HC O CH3 O Si CH3 CH3
H CH3
CH3
HC O Si CH3
CH3
CH3
H3C O H3C Si CH3
O H3C Si CH3
HC O Si CH3
HC O Si CH 3
CH3
O
N
CH3
269,1
CH3
N O
CH3 O Si CH3 H3C
H3C CH 3 CH3 Si CH3 HC O CH3 O Si CH3 CH3
H CH3
H3C O H3C Si CH3
358,2
CH3
H
H3C CH 3 CH3 Si CH3 HC O CH3 O Si CH3 CH3 H3C O H3C Si CH3
H
CH3
H3C O H3C Si CH3
CH3
CH3
H3C
O H3C Si CH3
HC O Si CH3
CH3
H
H3C
N
446,2
CH3
Si
O CH3
CH3 O Si CH3 H3C
HC O Si CH3
PT
O
N CH3 O Si CH3 H3C
H3C
N O
O CH3
N
PD
CH3
CH3
H3C
O H3C Si CH3
O CH3
H3C O H3C Si CH3
Si
H3C
H3C
O H3C Si CH3
H3C O H3C Si CH3
H3C
N O
CH3
462,3
H3C O H3C Si CH3
447,2
97
∆5-AT
CH3 H3C Si CH3 O
CH3 H3C Si CH3 O
CH3 O Si CH3 H3C
H3C O H3C Si CH3
522,4
THS
H3C H2C
O
CH3 O Si CH3 H3C
H3C O H3C Si CH3
432,2
CH3 Si CH3
N O O Si
H3C H2C
CH3 CH3
O Si
595,4
H3C O H3C Si CH3
O Si
∆5-PT
CH3
O
CH3
O Si
566,2
H3C O H3C Si CH3
H3C O H3C Si CH3
3
CH3
550,1
H3C O H3C Si CH3
O Si
449,3
H3C O H3C Si CH3
H3C O H3C Si CH3
CH3
H
595,4
O
359,2
H3C O H3C Si CH3
433,2
H3C O H3C Si CH3
CH3
H
566,2 H3C CH 3 CH3 Si O CH HC
3
Si 3 CHCH 3
O Si
CH CH3 3
H
O
CH3
H3C CH 3 CH3 Si CH3 HC O
H3C CH 3 CH3 Si O CH HC
CH3
CH3
CH CH3 3
474,3
O Si
O
CH3 Si CH3
N O
CH3
CH CH3 3
3
Si 3 CHCH 3
H2C
CH3
H
O
H
O
329,3 H3C
H3C CH 3 CH3 Si CH3 HC O
H3C CH 3 CH3 Si O CH HC
CH3
H3C O H3C Si CH3
CH CH3 3
CH CH3 3
H3C CH 3 CH3 Si O CH HC
H3C O H3C Si CH3
O Si
O
CH3 O Si CH3 H3C
CH3 Si CH3
N O
H3C CH 3 CH3 Si CH3 HC O
H
O
H2C
CH3
564,3
CH CH3 3
H3C O H3C Si CH3
522,4 H3C
H
H3C CH 3 CH3 Si CH3 HC O O
H3C O H3C Si CH3
CH CH3 3
H
11-O-PT
O
CH3 H3C Si CH3 O
CH3 O Si CH3 H3C
CH3 Si CH3
N O
CH CH3 3
H3C O H3C Si CH3
CH3 H3C Si CH3 O
3
CH3
O
Si 3 CHCH 3
343,2
H3C O H3C Si CH3
CH3
Si 3 CHCH 3
253,1
98
THE
H3C H2C
O
CH3 Si CH3
N O O
O Si
H3C H2C
CH3
N O
CH3
O
CH CH3 3
H3C O H3C Si CH3
609,2
O
H3C O H3C Si CH3
H3C H3C
H3C O H3C Si CH3
CH3 O
H3C H3C
H3C O H3C Si CH3
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
CH3 O
O
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H3C O H3C Si CH3
H3C H3C
H
595,4
H3C O H3C Si CH3
CH3 O
O
H2C
CH3 O
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H3C H3C
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H3C O H3C Si CH3
H3C H3C
H
474,3
H3C O H3C Si CH3
O
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
O
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
521,4
Si
H3C O H3C Si CH3
H3C H3C
H
564,4
H3C O H3C Si CH3
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H
H3C
564,4
CH3
506,2
H3C O H3C Si CH3
H3C
H
Si
CH3
H
O
490,2
CH3
H3C O H3C Si CH3
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H
Si
O Si
CH3
CH CH3 3
488,3
H3C O H3C Si CH3
O
CH3 Si CH3
N O
CH3
H
O
474,3
CH3
H3C O H3C Si CH3
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H
Si
O Si
H3C
CH CH3 3
431,3
H3C
595,4
Si
CH3
H
Si
O
CH3 Si CH3
N O
578,3
H3C O H3C Si CH3
H3C
H
aTHB
H2C
CH3
H
O
521,4
Si
H3C O H3C Si CH3
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H
THB
O Si
H3C
CH CH3 3
H
THA
O
CH3 Si CH3
CH3 O
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H
595,4
Si
CH3 O
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3
H
595,4
99
THF
H3C CH 3
H2C H3C
Si
H3C
O Si
CH3
N O
O
O
H3C CH 3
CH3
H2C H3C
CH3
Si
H3C
Si CH3 CHCH3
O Si
CH3
N O
O
O
3
H
683,2
aTHF
Si
CH3 O
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3 O Si CH3 CHCH3
O H3C Si CH3
H3C H3C
683,2 H3C
H3C O H3C Si CH3
472,3
Si
CH3 O
H3C
O
O
H3C O H3C Si CH3
O
H3C
Si CH3
H3C O H3C Si CH3
Si
CH3 O
654,2
H3C O H3C Si CH3
O H3C Si CH3
H3C H3C
O
O
H3C
O
O
H3C O H3C Si CH3
580,2
Si
CH3 O
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3 O Si CH3 CHCH3
H
580,2 H3C
Si CH3
H2C
O
O
551,3 H3C
Si CH3
H3C O H3C Si CH3
O
449,3
CH3
Si CH3 CHCH3
359,2 H3C
Si CH3
H2C
O
CH3 Si CH3 CH3 CH3
HC O Si O
3
H3C O H3C Si CH3
CH3 CH3
H
CH3
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
H2C O
O
Si CH3
3
H
CH3
CH3
HC O Si
3
H
CH3 Si CH3 CHCH3
H
CH3
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
H2C
H3C O H3C Si CH3
CH3
3
562,3
3
H
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3 O Si CH3 CHCH3
H
Si CH3
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
H2C O
O
N O
3
562,3
CH3
449,3
CH3
Si
H3C
CH3
3
H
3
H3C O H3C Si CH3
CH3 Si CH3 CHCH3
H
3
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
H2C
H3C
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
H2C
654,2 O
O
H2C H3C
H3C
O H3C Si CH3
H3C
472,3
Si CH3
H
H3C
H3C CH 3 O Si CH3 H2C N O CH3 O Si CH3 CHCH3
H
3
β-CL
O
CH3
O Si
3
H
CH3
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
H2C O
O
Si
H3C
N O
3
H
α-CL
H3C O H3C Si CH3
CH3 Si CH3 CHCH3
CH3
H3C CH 3
H3C
3
H3C O H3C Si CH3
H2C H3C
H3C
O H3C Si CH3
H3C
CH3
3
H3C
H3C
H3C CH 3
O Si
O
CH3
Si CH3 CHCH3 3
H
551,3
H3C O H3C Si CH3
H
359,2
100
α-C
CH3
H3C CH3 Si H3C O H3C
O
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
H2C
CH3 Si H3C O H3C
3
H
728,1 H3C
CH3 Si H3C O
H2C
O
343,2 H3C
CH3 Si H3C O H3C
CH3
Si CH3 3 CHCH 3
H2C
O
CH3 Si H3C O H3C
CH3
Si CH3 3 CHCH 3
436,1
H2C
O
O
CH3 Si H3C O H3C
CH3
Si CH3 3 CHCH 3
H2C
O
CH3 Si CH3
N O O
CH3
Si CH3 3 CHCH 3
N
361,2
H3C O
H3C CH3 Si O CH3
425,1 H3C CH3 Si O CH3
H3C
421,2
CH3
Si CH3 CHCH3
548,1 H3C
Si CH3
H3C O
Si O H3C CH3
CH3 CH3
HC O Si
H
CH3
N O O
O H3C Si CH3
N
515,2
H3C
Si O H3C CH3
O
H2C
3
523,2 H3C
H3C CH3 Si O CH3
H3C
CH3 Si H3C O H3C
H
Si CH3
H3C O
H3C CH3 Si O CH3
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
Si CH3
H3C
CH3
N O O
O H3C Si CH3
N
636,2
O
H2C
3
H
Si CH3
N O O
O H3C Si CH3
N
Si O H3C CH3
CH3 Si H3C O H3C
CH3
H3C
Si CH3
H3C
CH3
H3C O
IS
CH3 CH3 HC O Si CH3 O Si CH3 CHCH3
H3C
F
H3C
O
H2C
CH3
H3C
Si CH3
3
H3C
O H3C Si CH3
CH3
H3C
Si CH3
H3C
346,2
H3C
Si O CH3
436,1
SS
H3C
Si O H3C CH3
H3C
484,3
Si O H3C CH3
H3C
484,3
Si O H3C CH3
H3C
394,2
H3C
Si O CH3
255,1
101
KB
O
O N O CH 3
485,2
O N O CH 3
368,3
O N O CH 3
353,2
N O CH 3
326,2
A tömegspektrometriai detektálás során, az ionizáció eredményeképpen leváló csoportokat a célion és a minősítő ionok esetében zöld keretezéssel jelöltük. Az ionok esetében a megadott molekulatömegek a lehasadás utáni értékek.
102
y = 1,89 x2 + 2,97 x −0,00278
y = An csúcs alatti terület / IS csúcs alatti terület
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
x = An konce ntráció / IS konce ntráció
1. ábra Az An szteroid-metabolit alacsony koncentráció-tartományú kalibrációs görbéje IS koncentráció 5 µg / 200 µl.
y = An csúcs alatti terület / IS csúcs alatti terület
y = 0,167 x2 + 4,36 x −0,183
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
x = An konce ntráció / IS konce ntráció
2. ábra Az An szteroid-metabolit magas koncentráció-tartományú kalibrációs görbéje IS koncentráció 5 µg / 200 µl.
103
3. táblázat Vizeletszteroid-metabolitok LOD és LLOQ értékei LOD
LLOQ
(ng/200µl)
(ng/200µl)
Androszteron
15,22
50,41
Etiokolanolon
14,32
37,22
Dehidroepiandroszteron
13,21
42,54
11β-hidroxi-androszteron
13,18
40,57
11β-hidroxi-etiokolanolon
12,99
36,99
16α-hidroxi-DHEA
18,18
86,09
Pregnándiol
13,92
40,39
Pregnántriol
15,39
40,39
Pregnéndiol
13,58
33,50
Androszténtriol
14,56
36,24
Tetrahidro-11-deoxikortizol
37,61
104,80
11-keto pregnántriol
13,55
43,34
Pregnéntriol
15,07
48,59
Tetrahidrokortizon
21,26
76,86
Tetrahidro-11-dehidrokortikoszteron
13,77
61,65
Tetrahidrokortikoszteron
7,43
47,40
Allo-tetrahidrokortikoszteron
15,65
61,59
Tetrahidrokortizol
29,80
83,21
Allo-tetrahidrokortizol
32,27
87,94
α-kortolon
25,72
71,74
β-kortolon
31,89
93,54
α-kortol
22,87
64,08
Kortizol
43,61
156,07
Komponensek
104
Az értekezés alapját képező közlemények Cikkek: Poór V, Bufa A, Bíró I, Wilhelm F, Juricskay S, Examination of sex steroids in the urines of postmenopausal women with osteoporosis, Chromatographia 2004; 60:S165-S168. IF 1,145 Poór V, Bufa A, Bíró I, Szabó I, Wilhelm F, Juricskay I, Gőcze P, Androgén hatású szexuálszteroidok csökkenése szerepet játszik a posztmenopauzában kialakult fokozott csontvesztésben, Osteologiai közlemények 2004; 3:155-157. Poór V, Bufa A, Bíró I, Telegdy E, Tényi T, Gáti Á, Osváth P, Wilhelm F, Juricskay S, Urinary steroid measurements in some endocrine and psychiatric diseases, Current Medical Chemistry 2005; 12:1339-1342. IF 4,382 Bufa A, Poór V, Bálint A, Molnár Sz, Jeges S, Pótó L, Gőcze P, Kilár F, Endogenous urinary steroids in postmenopausal women with epithelial ovarian cancer, Chromatographia 2008; 68:S131-S135. IF 1,145 Bufa A, Bíró I, Poór V, Molnár G, Kovács KA, Felinger A, Jeges S, Kilár F, Gőcze PM, Altered urinary profiles of endogenous steroids in postmenopausal women with adenocarcinoma endometrii, közlésre elküldve a Gynecological Endocrinology folyóirathoz. Poszterek: Bufa A, Bíró I, Poór V, Wilhelm F, Juricskay S, Examination of sex steroids in the urines of postmenopausal women with osteoporosis, Balaton Symposium’03 on HighPerformance Separation Methods, Siófok, September 3-5, 2003 Bufa A, Bíró I, Wilhelm F, Poór V, Kilár F, Gőcze P, Vizelet szteroid profil vizsgálatok jelentősége a posztmenopauzában, Magyar Menopauza Társaság VI. Országos Kongresszusa, Siófok, Június 9-11, 2005 Bufa A, Bíró I, Bálint A, Gőcze P, Kilár F, Endogenous urinary steroids in postmenopausal women with ovarial cancer, 7th Balaton Symposium On HighPerformance Separation Methods In Memoriam Szabolcs Nyiredy, Siófok, September 5-7, 2007 Bufa A, Bíró I, Molnár G, Kilár F, Gőcze P, Altered urinary profiles of endogenous steroids in patients with uterine leiomyomas and adenocarcinoma endometrii, 7th Balaton Symposium On High-Performance Separation Methods In Memoriam Szabolcs Nyiredy, Siófok, September 5-7, 2007 Bufa A, Poór V, Kilár F, Gőcze P, Endogenous urinary steroids in postmenopausal women with cervical cancer, 32nd International Symposium on Capillary 105
Chromatography and 5th GCxGC Symposium, Riva del Garda, Italy, May 26-30, 2008 Előadás: Bufa A, Bíró I, Poór V, Wilhelm F, Juricskay I, Gőcze P, A postmenopausális osteoporosis egyik oki tényezője az androgén hatású szexuálszteroidok csökkenése lehet, Magyar Szülészeti és Nőgyógyászati Endokrinológiai Társaság III. Kongresszusa, Harkány, Április 23-24, 2004
106
Egyéb közlemények Cikk: Poór V, Bíró I, Bufa A, Gáti Á, Fenyvesi I, Juricskay S, Tényi T, Urinary steroids in young women with eating disorders, Journal of Biochem and Biophys 2004; 61:199205. IF 1,218 Bíró I, Bufa A, Poór V, Wilhelm F, Jeges S, Kilár F, Gőcze PM, Comparisons of urinary steroids in poor responder and normoresponder patients undergoing in vitro fertilization, közlésre elküldve az European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology folyóirathoz. Poszterek: Bíró I, Poór V, Bufa A, Juricskay S, Gáti Á, Fenyvesi I, Urinary steroids in young women with eating disorders, 7th International Symposium on Instrumental Analysis, Pécs, September 21-24, 2003 Poór V, Juricskay S, Bufa A, Bíró I, Telegdy E, Tényi T, Gáti Á, Osváth P, Wilhelm F, Urinary steroid measurements in some endocrine and psychiatric diseases, Advances in Chromatography and Electrophoresis-Conferentia Chemometria, Budapest, 2003 Bui A, Bufa A, Poór V, Kocsis B, Kilár F, Examination of sugar content of bacterial endotoxins by GC-MS, 7th Balaton Symposium On High-Performance Separation Methods In Memoriam Szabolcs Nyiredy, Siófok, September 5-7, 2007 Bui A, Bufa A, Poór V, Kocsis B, Kilár F, Examination of sugar content of bacterial endotoxins by GC-MS, 7th International Symposium and Summer School on Bioanalysis, Pécs, June 10-15, 2007
107
