ÚVOD A PROBLEMATIKA

1. Obsah 1.

OBSAH...................................................................................................................... 1

2.

POUŽITÉ ZKRATKY............................................................................................. 3

3.

ÚVOD A PROBLEMATIKA.................................................................................. 5 3.1. PROTINÁDOROVÁ LÉČBA NA BÁZI CISPLATINY .................................................... 5 3.1.1. Cis-diamindichlorplatina(II).......................................................................... 5 3.1.2. Typy cisplatinových DNA aduktů ................................................................... 6 3.2. MECHANISMUS NUKLEOTIDOVÉ EXCIZNÍ OPRAVY ............................................... 7 3.2.1. Protein XPA.................................................................................................... 8 3.2.2. Vlastnosti a funkce reparačního proteinu XPA.............................................. 8 3.2.3. Model vazebné reakce XPA proteinu s místem poškození na DNA.............. 10 3.2.4. Neobvyklé elektroforetické chování XPA proteinu....................................... 10 3.3. KOMPLEX PROTEINŮ XPF-ERCC1.................................................................... 11 3.4. PRINCIP ELEKTROFORETICKÝCH METOD, VYUŽÍVANÝCH PRO SEPARACI BIOMAKROMOLEKUL ......................................................................................... 11 3.4.1. Faktory ovlivňující pohyb iontů v elektrickém poli ...................................... 11 3.4.2. Klasifikace elektroforetických metod ........................................................... 12 3.4.3. Určení molekulové hmotnosti proteinů ....................................................... 13 3.4.3.1. Polyakrylamidové gely ............................................................................ 13 3.4.4. Analýza oligomerních struktur proteinů ...................................................... 15 3.4.4.1. Elektroforetická separace proteinů za nativních podmínek: PFO-PAGE 15

4.

CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE ............................................................................ 16

5.

MATERIÁLY A METODY .................................................................................. 17 5.1. PROTEINY .......................................................................................................... 17 5.2. BAKTERIÁLNÍ KMENY ........................................................................................ 17 5.3. CHEMIKÁLIE ...................................................................................................... 17 5.4. ROZTOKY A PUFRY ............................................................................................ 18 5.4.1. Roztoky a pufry použité při SDS-PAGE ....................................................... 18 5.4.2. Roztoky a pufry použité při nativní elektroforéze......................................... 19 5.5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY...................................................................................... 20 5.6. METODY............................................................................................................ 20 5.6.1. Určení molekulové hmotnosti....................................................................... 20 5.6.2. Provedení SDS-PAGE , aparatura Mini Protean II.................................... 20 5.6.3. Nativní elektroforéza proteinů (PFO-PAGE) .............................................. 21 5.6.4. Barvení proteinů v PAA gelech (SDS, PFO) po elektroforéze..................... 21 5.6.5. Dokumentace výsledků, uchování gelů po SDS-PAGE a nativní elektroforéze sušením ......................................................................................................... 21 5.6.6. Příprava buněčných lyzátů........................................................................... 22 5.6.7. Zahuštění buněčných lyzátů ......................................................................... 22

6.

VÝSLEDKY............................................................................................................ 23 6.1. SDS-PAGE MODELOVÉHO PROTEINU BSA....................................................... 23 6.1.1. Ověření molekulové hmotnosti BSA proteinu............................................... 25 -1-

6.1.2. Možnosti využití metody SDS-PAGE při optimalizaci exprese rekombinantních proteinů v buňkách E. coli ............................................... 25 6.1.2.1. Exprese proteinu p50 ............................................................................... 25 6.1.2.2. Exprese komplexu proteinů XPF-ERCC1 ............................................... 26 6.2. ELEKTROFORÉZA PROTEINŮ ZA NATIVNÍCH PODMÍNEK (PFO-PAGE)............... 28 6.2.1. PFO-PAGE modelového proteinu BSA........................................................ 28 6.2.2. Elektroforetické chování proteinu HMGB1b7 za podmínek PFO-PAGE .... 31 6.2.3. Využití metody elektroforézy proteinů za podmínek PFO-PAGE ................ 32 6.2.3.1. Chování komplexu proteinů XPF-ERCC1 za nativních podmínek......... 32 6.2.3.2. PFO-PAGE analýza buněčných lyzátů při expresi XPF-ERCC1............ 33 6.3. NEOBVYKLÉ ELEKTROFORETICKÉ CHOVÁNÍ PROTEINU XPA............................. 34 6.3.1. SDS-PAGE chování proteinu XPA............................................................... 34 6.3.2. PFO-PAGE chování XPA proteinu ............................................................. 35 7.

DISKUSE ................................................................................................................ 36

8.

ZÁVĚR.................................................................................................................... 38

9.

LITERATURA ....................................................................................................... 39

-2-

2. Použité zkratky APS AIDA bp BSA DTT DNA EMSA ERCC1 HMG HPA HR23B IPTG kDa Mili Q H2O NER NFκB PAA PCNA PFO PFO-PAGE RFC RPA rpm RTS SDS SDS-PAGE TEMED TFIIH TrisHCl UV záření v/v w/v w/w

persulphate of ammonium - persíran amonný advanced image data analyse – program pro analytické vyhodnocení gelu base pairs – párů bází albumin, bovine serum - bovinní sérum albumin dithiothreitol deoxyribonucleic acid – deoxyribonukleová kiselina electrophoretic mobility shift assay – test změny elektroforetické pohyblivosti DNA s proteinem v gelu excision repair cross complementing group 1 – excizní reparační protein komplementační skupiny 1 high mobility group protein - protein skupiny vysoké pohyblivosti hydroxyapatit lidský homolog kvasinkového proteinu RAD23 isopropyl-β-D-thiogalaktosid kilodalton demineralized water - deionizovaná voda nucleotide excision repair - nukleotidová excizní oprava transcrioption factor – transkripční faktor polyacrylamide - polyakrylamidový proliferating cell nuclear antigen – antigen buněčný jaderný proliferační pentadekafluoroctane acid - kyselina pentadekafluorooktanová polyakrylamidová gelová elektroforéza s perfluoro-oktanovou kyselinou replication factor C – faktor C replikační replication protein A – replikační protein A rate per minute - počet otáček za minutu rapid translation system – systém pro in vitro translaci sodium dodecylsulphate - dodecylsulfát sodný polyakrylamidová gelová elektroforéza s dodecylsulfátem sodným tetramethylethylendiamin transcription factor IIH – transkripční faktor IIH tris(hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid ultraviolet - ultrafialové záření ratio volumes - poměr objemů ratio weight and volume - poměr hmotnosti a objemu ratio weights - poměr hmotností

-3-

XPA XPB XPC XPD XPE XPF XPG XPV

xeroderma pigmentosum complementation group A protein – protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny A xeroderma pigmentosum complementation group B protein – protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny B xeroderma pigmentosum complementation group C protein – protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny C xeroderma pigmentosum complementation group D protein – protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny D xeroderma pigmentosum complementation group E protein – protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny E xeroderma pigmentosum complementation group F protein – protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny F xeroderma pigmentosum complementation group G protein – protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny G xeroderma pigmentosum complementation group V protein – protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny V

-4-

3. ÚVOD A PROBLEMATIKA V současné době jsou intenzivně hledány cesty pro zvýšení účinnosti protinádorové terapie. Dosud nejúčinnější jsou látky na bázi cisplatiny, které jsou schopny za podmínek in vivo se vázat k DNA, způsobit zástavu dělení a posléze smrt buňky. Přes tyto nesporné výhody, má terapeutické použití cisplatinových derivátů i některé nežádoucí účinky, které spočívají především v nefrotoxicitě či v přirozené rezistenci některých typů nádorů k působení léčby nebo po opakovaném podání vyvolat sekundární nádorovou resistenci. Jednou z možných příčin rezistence nádorových buněk k působení cisplatinových derivátů je rozpoznávání vzniklých lézí na DNA některými proteiny, které jsou schopné aktivovat účinné reparační mechanismy buňky. Proto se výzkumu reparačních mechanismů, rozpoznávajících poškození DNA vyvolanými platinovými komplexy věnuje velká pozornost a za podmínek in vitro jsou studovány interakce mezi cíleně modifikovanou DNA a vybranými proteiny, které jsou připraveny rekombinantní technologií. Jedním ze základních opravných mechanismů buňky je nukleotidová excizní reparace (NER), spočívající v rozeznání a vyštěpení poškozeného místa na DNA. Nukleotidové excizní opravy se v lidských buňkách účastní několik desítek proteinům a jedním z nich je protein xeroderma pigmentosum skupiny A (XPA), který v mechanismu NER hraje klíčovou roli, stejně tak komplex strukturně specifické endonukleázy XPF-ERCC1. Experimentální část práce je zaměřena na uplatnění elektroforetických metod při charakterizaci proteinů připravených rekombinantní technologií a současně také na získání podrobnějších informací o elektroforetickém chování reparačních proteinů zejména XPA a XPF-ERCC1 v různých typech polyakrylamidových (PAA) gelů jak v přítomnosti dodecylsulfátu sodného tak i za podmínek tzv. nativní elektroforézy s použitím kyseliny pentadekafluoroktanové (PFO) a její sodné soli .

3.1. Protinádorová léčba na bázi cisplatiny Při nádorové léčbě se používají cytostatika, což jsou látky, které tlumí růst a dělení buněk. Přes vysokou účinnost , která vykazují cytostatika odvozená od platiny, vyskytují se nežádoucí jevy, jako opravné mechanismy buňky, které vzniklé adukty DNA-platina odstraňují a tím významné přispívají ke snížení terapeutického efektu. Jedním z kandidátních mechanismů je nukleotidová excizní oprava, které je experimentálně věnována velká pozornost. V případě objevení účinného in vivo mechanismu ochrany vzniklých DNA lézí před reparačním mechanismem buňky v rámci nádorové tkáně, by bylo možné zvýšit účinnost léčby.

3.1.1. Cis-diamindichlorplatina(II) Cisplatina byla první anorganické léčivo nádorových onemocnění aplikované v klinické praxi. Je to jednoduchá molekula skládající se z 11 atomů (obr. č. 1). Chemoterapie založená na cisplatině je úspěšná především při léčbě rakoviny varlat, vaječníků, mozku a plic. Některé nádory však mají přirozenou rezistenci k cisplatině. Příčinou rezistence může být snížená hladina léčiva dostupná v buňce, inaktivace cisplatiny prostřednictvím glutathionu a thiol obsahujících proteinů, zvýšená oprava cisplatinových aduktů, aktivace reparačních -5-

mechanismů a zvýšená tolerance DNA cisplatinové léze k opravě. Adukty cisplatiny inhibují replikaci a transkripci, ale také mohou být přemostěny DNA a RNA polymerázou. Studie naznačují, že cisplatina inhibuje růst některých typů nádorových buněk a může způsobit zástavu v G2 fázi buněčného cyklu a apoptózu (Brabec, 2002).

cisplatina transplatina Obr. č. 1: Struktura cisplatiny a transplatiny (Kartalou a Essigmann, 2001 a)

3.1.2. Typy cisplatinových DNA aduktů Cisplatina především reaguje v buněčném jádře (obr. č. 2). Po vstupu do buňky cisplatina ztrácí své chloridové ligandy v prostředí obsahujícím nízkou koncentraci chloridových iontů. Jsou substituovány molekulami vody a tímto se stává pozitivně nabitou. Bylo prokázáno, že jen tato struktura je schopna se vázat na DNA. Cisplatina vytváří vnitrořetězcové křížové vazby mezi sousedními guaninovými zbytky nebo mezi adeninem a guaninem. Vznikají adukty - ze 65 % 1,2-d(GpG), z 25 % 1,2-d(ApG) a také z 5-10 % 1,3-d(GpNpG). V menší míře vznikají také monofunkční adukty a meziřetězcové křížové vazby. (Brabec, 2002) Ttrans-diammindichloroplatina (transplatina) (obr. č. 1) vytváří hlavně meziřetězcové křížové vazby mezi guaninem a cytosinem a asi 50% monofunkčních aduktů. Za protinádorovou aktivitu jsou zodpovědné především 1,2 vnitrořetězcové křížové vazby cisplatiny. Transplatina tento typ aduktů nevytváří, proto je terapeuticky neúčinná a nepoužívá se k léčbě (Brabec, 2002). Cisplatina inhibuje syntézu DNA in vitro a in vivo. Inhibice je způsobena přítomností vnitrořetězcových křížových vazeb mezi sousedními guaniny a cisplatinou. Monofunkční adukty cisplatiny nebo transplatiny ovlivňují replikaci zanedbatelně (Pinto a Lippard, 1985).

Obr. č. 2: Tvorba cisplatinových aduktů v buňce (Kartalou a Essigmann, 2001 b) -6-

3.2. Mechanismus nukleotidové excizní opravy Jak již bylo výše uvedeno, buňka je vybavena reparačními mechanismy, které dovolují zachování integrity genomu právě schopnností odstranit poškození vzniklá na DNA ať již po působení nežádoucích látek z okolního prostředí, nebo vlivem UV záření, ale také po působení protinádorových terapeutik na bázi cisplatiny. Právě aktivace reparačních mechanismů v nádorových buňkách pak významně snižuje léčebný efekt cisplatiny. Existuje několik modelů průběhu nukleotidové excizní opravy za účasti celé řady proteinů Xeroderma pigmentosum komplementačních skupin A – G, a V (XP). Nukleotidová excizní oprava (NER) je pro organismy velice důležitá, narušení tohoto procesu může mít fatální následky. Mutace v genech kódujících proteiny, zúčastňující se mechanismu NER způsobuje u lidí výskyt dědičných onemocnění. Mutace u některých z genů XPA až XPG zapříčiňují autozomálně recesivní dědičné onemocnění Xeroderma pigmentosum. Nejtěžší forma je spojena s mutacemi v genu XPA. Z toho vyplývá důležitost funkce XPA proteinu při nukleotidové excizní opravě. Onemocnění nastupuje již v ranném věku a projevuje se vysokou citlivostí k UV záření, abnormální pigmentace, zvýšenou incidencí rakoviny kůže, mentální retardací. Frekvence výskytu onemocnění je 1 : 250 000, nejvyšší procentuální zastoupení je v Japonsku a u obyvatel středomoří, u černošské populace se onemocnění nevyskytuje. (Lehmann, 2003) Jeden z posledních navržených modelů NER, konkrétně pro opravu cisplatinového aduktu je uveden na obr. č. 3 (Dip a kol., 2004): DNA - cisplatinový adukt (obr. 3A) je nejdříve rozeznán komplexem proteinů XPC.HR23B (obr. 3B). Transkripční faktor IIH (TFIIH) se připojí k místu poškození na DNA jako druhý. TFIIH obsahuje dva faktory s helikázovou aktivitou, a to XPB (ve směru 3´5´) a XPD (ve směru 5´-3´) (Araújo a Wood, 2000). Přítomnost ATP dovoluje těmto helikázám odvinout DNA kolem místa poškození (obr. 3C). Protein RPA obsadí nepoškozený komplementární řetězec DNA (obr. 3D). Poté se připojí protein XPA. Připojení je řízeno kontaktem XPA s TFIIH a RPA. XPA dává možnost uskupení dalších faktorů RPA, XPG a konečně XPF-ERCC1. RPA, který se váže na odvinutý řetězec DNA, který je bez poškození, interaguje s XPA a zesiluje jeho interakce s DNA. RPA stabilizuje nejen XPA v komplexu, ale také XPG (obr. 3E). Vazba XPF-ERCC1 ke komplexu (obr. 3F) je podmíněna otevřením řetězců DNA prostřednictvím TFIIH a přítomností XPA, RPA a XPG . Během reakce je odvinut úsek v rozsahu až 32 nukleotidů, čímž se vytvoří substrát pro štěpení dvou specifických endonukleáz XPG na 3´ konci od místa poškození a XPF-ERCC1 na 5´konci. Působením komplexu proteinů (obr. 3F) je vyštěpen až - 32 nukleotidů oligomer s místem poškození. (Araújo a Wood, 2000) Faktory jako XPC-HR23B, TFIIH a XPA jsou postupně uvolněny buď během reakce, při které dochází k vyštěpení, nebo po nasednutí faktorů pro syntézu DNA. Jediný protein RPA zůstavá přítomen, chrání templátový úsek DNA a účastní se obou procesů. Potřebnými faktory pro novou syntézu DNA jsou PCNA, RFC, RPA, DNA polymeráza δ nebo ε a ligáza (Riedl a kol., 2003).

-7-

Obr. č. 3: Schéma nukleotidové excizní opravy (Dip a kol., 2004)

3.2.1. Protein XPA Gen XPA (xeroderma pigmentosum complementační skupina A) je lokalizován na lidském chromozomu v lokusu 9q22.3´a kóduje jaderný metaloprotein XPA a obsahu 273 aminokyselin. Velikost genu je 25 kbp a obsahuje šest exonů. Pomocí místně řízené mutageneze byl zjištěn vztah exonů k funkci XPA proteinu (Miyamoto a kol., 1992). V procesu nukleotidové excizní opravy XPA působí zejména jako koordinátor funkce dalších proteinů. Je-li XPA nefunkční nebo není-li exprimován, tak nukleotidová excizní oprava neprobíhá a není vyštěpeno místo poškození na DNA. Komplex proteinů XPA a RPA hraje důležitou úlohu v NER připojením a stabilizací ostatních funkčně potřebných proteinů do spravné pozice (Batty a Wood, 2000).

3.2.2. Vlastnosti a funkce reparačního proteinu XPA Protein XPA obsahuje několik funkčních domén (obr. č. 5). Jeho N-konec (aminokyselinové zbytky 4-97) se váže k proteinům RPA p34 a ERCC1. Část proteinu vázající se k RPA p34 je kódována exonem 1 a část proteinu vázající se k ERCC1 je kódována exonem 2. Sekvence aminokyselin nezbytná k interakci XPA s ERCC1 je oblast sedmi glutamových kyselin (Glu78-Glu84) a také tetrapeptid (Gly72-Phe75) v exonu 2. Delece těchto částí vede ke snížení funkce XPA proteinu. Interakce XPA s ERCC1 je nezbytná pro 5' endonukleázovou aktivitu komplexu XPF-ERCC1 (Li a kol., 1995). XPA-RPA komplex má vyšší afinitu k místu poškození na DNA než každý protein samostatně. Vazba XPA k RPA je nezbytná pro nukleotidovou excizní opravu. RPA je heterotrimerický protein obsahující tři podjednotky 70kDa, 34kDa a 14kDa (Cleaver a States, 1997).

-8-

C-koncem (aminokyseliny 226-273) XPA protein váže komplex TFIIH, který obsahuje helikázy XPB a XPD. Tato část XPA je kódována exonem 6, jehož delece je také fatální pro funkci XPA. (Cleaver a States, 1997) Centrální doména (aminokyselinové zbytky 98-219) XPA proteinu byla identifikována jako minimální oblast pro preferenční vazbu k poškození na DNA (obr. č. 5). Tato doména obsahuje také sekvenci nezbytnou pro vazbu k RPA p70 - největší podjednotky heterotrimerického proteinu RPA.XPA centrální doména má dvě subdomény, a to subdoménu s motivem zinkového prstu (aminokyseliny 102-129) a C-terminální subdoménu. Subdoména obsahující zinek je složena z antiparaleleních β-řetězců a α-šroubovice. Zinečnatý iont váže cysteiny 105, 108, 126 a 129. Tato subdoména obsahuje hydrofobní jádro vytvářené prostřednictvím β-listů z C-terminální subdomény a α-šroubovice ze subdomény se zinečnatým iontem. V oblasti se zinečnatým iontem se také vyskytují zbytky kyselých aminokyselin, a tímto se struktura odlišuje od motivů zinkových prstů jiných transkripčních faktorů (Ikegami a kol., 1998). Zinkový prst je kódován exonem 3 (obr. 4). Tato subdoména je nezbytná pro vazbu k DNA. Mutace některého z cysteinů tvořícího motiv zinkového prstu snižuje funkci XPA proteinu a delece exonu 3 úplně eliminuje správnou funkci XPA proteinu (Cleaver a States, 1997).

Obr. č. 4: Schematické znázornění struktury a vazebných domén XPA proteinu ukazující pořadí jednotlivých exonů, přímka vyznačuje aminokyselinovou sekvenci, na ní jsou strukturní motivy (NLS – jaderný lokalizační signál), pod přímkou a nad přímkou jsou vazebná místa pro DNA a pro proteiny nukleotidové excizní opravy (upraveno dle Cleaver a States, 1997).

Obr. č. 5: Strukturní model centrální domény XPA proteinu (Ikegami a kol., 1998) -9-

3.2.3. Model vazebné reakce XPA proteinu s místem poškození na DNA Substráty pro opravný proces byly zkoumány iv vivo a in vitro a výsledky naznačují velmi mnohostranou opravnou kapacitu a vysokou afinitu XPA proteinu k lézím na DNA. Jsou to například fotoprodukty, benzo(a)pyrenové adukty, cisplatinové adukty, aflatoxinové adukty, syntetické cholesterolové pseudonukleotidy, triplexy DNA, pyrimidinové dimery, psoralenové adukty, apurinová místa a oxidativní poškození (Huang a kol., 1994; Missura a kol., 2001). Díky znalostem o struktuře proteinu XPA byl navržen model vazebné reakce XPA u místa poškození. Vazebná oblast XPA proteinu, která obsahuje jádro se 122 aminokyselinami, které je kódováno exonem 3, 4 a 5, obsahuje motiv zinkového prstu a větší část s velkým množstvím α-šroubovic, která interaguje s RPA (obr.5). Zinkový prst se váže k DNA v okolí léze a díky němu je XPA v DNA zakotven. Zinkový prst přímo neinteraguje s poškozením na DNA, se kterými ale reaguje oblast proteinu kódovaná exonem 4 a 5. Předpokládá se, že tento region je přizpůsobivý okolí poškození DNA a současně obsahuje doménu schopnou se vázat na jeden řetězec DNA. Tedy tato část XPA se vsune do strukturně deformované dvoušroubovice DNA v důsledku poškození, váže se na jeden řetězec a tudíž dovoluje rozpoznat široké spektrum poškození. (Hermanson a Turchi, 2000, Cleaver a States, 1997) In vivo experimenty prokázaly, že v buňkách ozářených UV světlem dochází k aktivaci exprese XPA proteinu v jádře. Množství shromážděných molekul závisí na množství lézí. Bylo zjištěno, že XPA je imobilizován během 4 až 6 minut u genomových míst poškozených UV zářením (Rademakers a kol., 2003).

3.2.4. Neobvyklé elektroforetické chování XPA proteinu Při analýze XPA proteinu pomocí polyakrylamidové elektroforézy v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) byla zjištěna snižená pohyblivost tohoto proteinu v elektrickém poli, která neodpovídala jeho molekulové hmotnosti. Na základě znalostí o sekvenci aminokyselin byla vypočítaná hmotnost přibližně 31 kDa., ale v SDS-PAA gelech se XPA jeví, jako by jeho hmotnost byla podstatně vyšší, nejméně 40-42 kDa. Z dalších empiricky zjištěných vlastností, dosud neobjasněných, je vztah mezi aktivní formou XPA proteinu, interagující s lézemi na DNA a zastoupením dvou až tří satelitních proužků na SDS-PAA gelech. (Robins a kol., 1991; Jones a Wood, 1993; Hermanson a Turchi, 2000; Iakoucheva a kol., 2001; Pushnova a kol., 2001). Dosud tyto neobvyklé vlastnosti XPA proteinu nebyly uspokojivě vysvětleny. Byly zkoumány příčiny anomální pohyblivosti XPA proteinu. Pomocí hmotnostní spektrometrie bylo zjištěno, že anomální pohyblivost není důsledkem posttranslační modifikace, neboť se tyto modifikace v proteinu nevyskytují a nejsou vyžadovány pro funkční formu XPA. Pomocí částečné proteolýzy XPA proteinu, hmotnostní spektrometrie a SDSPAGE bylo zjištěno, že původ anomální pohyblivosti není lokalizován pouze do jedné oblasti proteinu. Na odchylnou elektroforetickou pohyblivost XPA proteinu má pravděpodobně vliv zejména oblast obsahující posloupnost sedmi se opakujících zbytků kyseliny glutamové, která nese vysoký náboj a stejně tak i obě terminální domény. (Iakoucheva a kol., 2001) Experimenty s použitím glutaraldehydu pro vytvoření intermolekulárních a intramolekulárních křížových vazeb prokázaly, že v případě tvorby intramolekulárních - 10 -

křížových vazeb XPA protein na SDS-PAGE odpovídal vypočítané molekulové hmotnosti. (Iakoucheva a kol.) Za nativních podmínek gelové filtrační chromatografie byla molekulová hmotnost XPA proteinu překvapivě pozorována v oblasti okolo 92 kDa. Tento výsledek se nezměnil, ani když byla při měření hmotnosti proteinu pomocí filtrační chromatografie použita DNA pro vazbu. Tato naměřená anomální hmotnost je vysvětlena tak, že protein zaujímá za nativních podmínek neobvykle rozlehlý tvar. (Iakoucheva a kol., 2001) Jedním z posledních vysvětlení pro neobvyklé elektroforetické chování XPA proteinu je hypotéza o vytváření homodimerů XPA proteinu za nativních podmínek a ve vysoké koncentraci. Při nukleotidové excizní opravě by pak byl spojen s RPA proteinem a vytvářel tak vysokomolekulární komplex. (Yang a kol., 2002)

3.3. Komplex proteinů XPF-ERCC1 Heterodimerní proteinový komplex XPF-ERCC1 je nedílnou součástí nukleotidové excizní opravy (obr. 3). (Dip a kol., 2004) Podjednotky XPF a ERCC1 jsou jadernými proteiny u savců o molekulární hmotnosti přibližně 110 kDa pro XPF a 34 kDa pro ERCC1. Komplex XPF a ERCC1 tvoří stabilní heterodimer v buňkách i za experimentálních podmínek in vitro za předpokladu, že rekombinantní proteiny utvořily komplex v průběhu exprese jak na úrovni prokaryontních buněk E.coli tak i např. v baculovirovém systému hmyzích buněk. Současně ale bylo prokázáno, že tyto dva proteiny samostatně jsou nestabilní. Zatím se nepodařilo rekonstituovat komplex XPF-ERCC1 za podmínek in vitro tak, aby zůstala zachována jeho strukturně specifická endonukleázová aktivita pro štěpení na 5´ konci od poškozeného místa na DNA. ERCC1 také váže XPA protein za tvorby objemného proteinového komplexu v místě poškození DNA Kromě toho, že XPF-ERCC1 hraje roli v NER, má ještě další funkce v metabolismu, které zatím nejsou známy. (Araújo a Wood, 2000)

3.4. Princip elektroforetických metod, využívaných pro separaci biomakromolekul Elektroforéza (z řeckého nesený elektřinou) využívá pohybu nabitých částic v stejnosměrném elektrickém poli. Směs látek se při ní dělí podle různé pohyblivosti iontů na oddělené zóny jednotlivých složek směsí. Pohyblivost iontů závisí na velikosti náboje, velikosti a tvaru molekul, na povaze nosičů, elektrolytů aj. U amfoterních iontů jako jsou bílkoviny, velikost náboje závisí na pH. Elektroforéza má široké uplatnění při dělení látek biologického původu. (Prosser a kol., 1989)

3.4.1. Faktory ovlivňující pohyb iontů v elektrickém poli Na kulovitou částici, nesoucí náboj q (C) v elektrickém poli o intenzitě E (V m-1) působí síla F daná výrazem F1 = qE. - 11 -

Proti ní působí síla vnitřního tření daná Stokusovým zákonem F2 = 6πη rv, Kde v je rychlost (m s-1), r poloměr částice, η viskozita. Z podmínek rovnováhy (F1 = F2) můžeme vypočítat rychlost pohybu částice qE v= . 6πηrv V praxi se však místo toho více používá pohyblivost µ, což je rychlost částice při jednotkové intenzitě elektrického pole (gradientu napětí) v q µ= = (m2s-1V-1). E 6πηrv Z výrazu je patrné, že rychlost je přímo úměrná síle pole a nepřímo viskozitě. Ta je silně ovlivněna teplotou. Rychlost závisí také na tvaru a velikosti nabité částice. Uvedené výrazy platí pro velmi zředěné roztoky. V koncentrovaných roztocích se uplatňují se uplatňují některé nežádoucí jevy, které komplikují situaci: a) Kolem centrálního iontu se vytvoří iontový obal z iontů opačně nabitých. Tak se značně snižuje pohyblivost. Vliv elektrolytu vyjadřuje iontová síla I a menší pohyblivosti jsou charakterizovány přibližně vztahem µ1 I 21 2 ≈ . µ 2 I 11 2 b) Elektrolýza. Působením stejnosměrného proudu se elektrolyt v okolí elektrod rozkládá. Tím se postupně mění i pH v tomto prostoru – u katody roste, u anody klesá. Proto se pufr v elektrodovém prostoru buď kontinuálně vyměňuje, nebo se účinnými přepážkami (diafragma) mezi elektrodovým a separačním prostorem zabraňuje konvekci, resp. difúzí. c) Elektroosmóza. Její podstatou je transport vody hydratovanými ionty od jedné elektrody k druhé podél rozhraní kapalné a pevné fáze. Smysl proudění závisí na povaze rozhraní, kvalitě pevné fáze a složení elektrolytu. Elektroosmotický tok ovlivňuje pohyb všech částic, tedy i neutrálních. Při určování pohyblivosti elektricky migrujících částic je nutné provést korekci. Ta se dělá právě pomocí zdánlivého elektroforetického pohybu neutrálních částic. d) Jouleovo teplo Q, které vzniká průchodem elektrického proudu elektrolytem je další problém elektroforézy. Platí pro něj vztah U 2t Q= , R kde R je odpor (Ω), t čas v (s) a U napětí (V). Uvolněné teplo může způsobit změnu viskozity, a tím pohyblivost, odpařování, změnu vodivosti a konečně i denaturaci labilních látek. Proto jsou elektroforetická zařízení, pracující s vyšším napětím, vybavena účinným chlazením. (Prosser a kol., 1989)

3.4.2. Klasifikace elektroforetických metod Elektroforetické metody můžeme dělit podle několika hledisek – např. podle děleného množství na analytické a preparativní. Dále podle vloženého napětí na vysokonapěťovou - 12 -

elektroforézu (U > 1000 V), která se využívá hlavně pro dělení nízkomolekulárních látek a nízkonapěťovou (U ~ 220V) pro látky vysokomolekulární. Významné je třídění na elektroforetické metody základní a kombinované a dále podle způsobu stabilizace prostředí (volná elektroforéza a na nosiči). Elektroforéza na nosičích, zónová. Vzorky látek se nanášejí na vhodný nosič, čímž je např. polyakrylamidový gel nebo agaróza. Nosič je pak přímo ponořen do roztoku pufru do něhož jsou rovněž zavedeny elektrody. Po zavedení elektrického proudu dochází k migraci nabitých částic k opačně nabitým elektrodám stejně jako u volné elektroforézy, ovšem pohyb se děje na nosiči, což umožňuje lepší průběh, zpracování a vyhodnocení elektroforetického dělení. Částice pak na nosiči vytváří zóny, které jsou seřazené podle elektroforetické pohyblivosti. Protože je hodnota elektrického proudu nastavena na určitou konstantní hodnotu, pohybují se zóny konstantní rychlostí, ale vytváří se stupňovitý gradient potenciálu. Projevuje se zde tzv. samozaostřující efekt. Zpozdí-li se některý ion za „svou“ zónou, tj. za zónou odpovídající příslušné pohyblivosti, octne se tak v prostředí s větší hodnotou potenciálu, který ho urychlí tak, aby dohnal svou zónu (a naopak). Zónovou elektroforézu lze realizovat buď v kontinuálním nebo diskontinuálním systému. Diskontinuita může být jak v koncentracích gelu, tak především v pH a iontové síle. V případě pH se diskontinuita volí použitím různé hodnoty pH pufru elektrodového a pufru v gelu. Při diskontinuální elektroforéze získáváme ostřejší zóny než v případě kontinuální elektroforézy. Jako elektrodového pufru se mimo jiné používá Tris(hydroxymethyl)aminomethan/glycinátový pufr pH 8,3 (Tris/glycin). Gel pak obsahuje pufr Tris/HCl pH = 9,2. Po skončení elektroforézy se rozdělené bílkoviny v gelu fixují v 10% roztoku kyseliny octové a poté obarví např. pomocí Coomassie Brilliant Blue R 250. Nakonec se gel odbarví v roztoku methanolu a kyseliny octové, přičemž zóny bílkovin zůstanou zbarveny modře. (Prosser V. a kol. 1986)

3.4.3. Určení molekulové hmotnosti proteinů Pro elektroforetické stanovení molekulové hmotnosti (M) u bílkovin a malých molekul nukleových kyselin se používají polyakrylamidové gely (PAAG), zatímco v případě nukleových kyselin velkých rozměrů se častěji používají agarosové gely (AG).

3.4.3.1. Polyakrylamidové gely Polyakrylamidové gely jsou v praxi velice často využívané. Jsou inertní, mechanicky pevné, průhledné a nabízí možnosti přípravy nosiče různých předem určených vlastností (hustota, zesiťování gelu, gradient hustoty gelu aj.). Polyakrylamidový gel se připravuje polymerizací pufrovaných roztoků akrylamidu a N,N-methylenbisakrylamidu (BIS), která je zahájena volnými radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného. Do reakce se přídává stabilizátor volných radikálů TEMED (N,N,N,N-tetramethylethylendiamin). CH2=CH-CO-NH2 + CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 => polyakrylamid Fyzikální vlastnosti tohoto gelu jsou dány podílem akrylamidu v gelu a stupněm zesíťování. Lineární řetězce vznikají spojováním monomerů akrylamidu, příčné vazby mezi nimi jsou tvořeny BIS. Velikost pórů polyakrylamidového gelu závisí nepřímo úměrně na koncentraci akrylamidu. Čím vyšší je tedy koncentrace akrylamidu, tím jsou menší póry. - 13 -

Nejčastější koncentrace akrylamidu je (3 – 15)%. Koncentrace BIS obvykl odpovídá 5 % celkové koncentrace akrylamidu. Pro stanovení molekulové hmotnosti M bílkoviny je nutná interakce s iontovými detergenty. Nejčastěji je používán dodecylsulfát sodný (SDS), kdy při reakci dochází k disociaci polypeptidických řetězců a ke konformační změně takového charakteru, že Stokesův poloměr komplexu řetězce s detergentem je úměrný exponenciální funkci M. Pohyblivosti neznámých bílkovin jsou porovnávány se standardními bílkovinami o známé molekulové hmotnosti. Metoda SDS-PAGE je považována za standartní jednoduchou metodu pro stanovení molekulové hmotnosti proteinů. Při standardním provedení elektroforézy se používá 1,4 mg SDS na 1 mg bílkoviny. Za těchto podmínek se polypeptidy protahují do podlouhlého elipsoidu o délce malé poloosy 0,8 µm. Délka velké poloosy se mění v závislosti na počtu aminokyselinových zbytků v polypeptidu. To ovšem platí jen pro nevětvené polypeptidy. Proto je třeba redukovat S-S vazby přebytkem β-merkaptoethanolu při zvýšené teplotě. (Prosser V. a kol. 1986) Grafické stanovení molekulové hmotnosti proteinů na základě jejich relativní pohyblivost k PAA gelech. Relativní mobilita proteinů je vypočtena pomocí rozdělení migračních vzdáleností vyznačených na gelu bromfenolovou modří. Všechna měření vzdáleností obarvených proužků elektroforeticky rozdělených proteinů od startů jsou prováděna uprostřed proužků. Nerovné změny ve velikosti gelu, které mohou vzniknout během barvící procedury jsou kompenzovány měřením velikosti gelu před sušením a po něm.

Sestrojí se přímá závislost log10 molekulárních hmotností jednotlivých proteinů o známé molekulové hmotnosti ku vypočtené relativní pohyblivosti. Poté se vnese relativní mobilita neznámého proteinu a z lineární závislosti se odečte jeho molekulová hmotnost. (Piljac, V., Piljac, G. 1986) Pro stanovení molekulové hmotnosti neznámých proteinů nebo pro sledování jejich anomálních elektroforetických vlastností je vhodné použít více typů pufrů, rozdílných koncentrací gelů a různé metody samotné přípravy vzorku. Obvykle je ale možné přibližně stanovit molekulovou hmotnost proteinu s chybou v rozmezí ± 10%. (Piljac, V., Piljac, G. 1986)

- 14 -

3.4.4. Analýza oligomerních struktur proteinů 3.4.4.1. Elektroforetická separace proteinů za nativních podmínek: PFOPAGE Jak bylo uvedeno, SDS-PAGE je metoda vhodná k určení molekulové hmotnosti proteinů viz. kap. (1.4.2). Použitím SDS a 2-merkaptoethanolu v gelové elektroforéze jsou proteiny disociovány na jednotlivé části polypeptidového řetězce, přičemž SDS udává jeden negativní náboj na vazbu molekuly. (Prosser V. a kol. 1986). Narušení homo-multimerních interakcí proteinů za podmínek SDS-PAGE nedovoluje analýzu multimerních komplexů proteinů, sledování vzájemných interakcí mezi rozdílnými proteiny i sledování stability komplexů proteinů během uchovávání. Zcela nedávno byla navržena nová elektroforetická metoda proteinů, právě pro sledování interakcí mebránových proteinů, či pro sledování multimerních forem a vzájemných vazeb.Princip metody spočívá v použití kyseliny pentadekafluoroktanové (PFO) a její sodné soli (NaPFO) jako mírného detergentu v PAGE. Za uvedených podmínek, proteiny v nanášecím pufru s NaPFO získávají negativní náboj a putují v elektrickém poli směrem ke kladnému pólu při zachování oligomerních struktur vytvořených za nativních podmínek. Kyselina PFO (chem. vzorec CF3(CF2)6CO2H) je schopna chránit a zachovat vysoce afinitní proteinové interakce i během elektroforetické separace. (Ramjeesingh a kol. 1999) Výhodou uvedené PFO-PAGE metody, na rozdíl od centrifugace v hustotním gradientu sacharózy nebo gelové filtrační chromatografie, které jsou běžně používány ke sledování vlastností proteinů a jejich interakcí za nativních podmínek, tak při PFO-PAGE je možné analyzovat jen velmi malé množství vzorku proteinů, méně jak µg. Další výhodou PFO PAGE metody je relativní nenáročnost na přístrojové vybavení a snadná proveditelnost ve většině laboratoří. Uvedená metoda vhodně doplňuje možnosti elektroforetické separace proteinů jak za podmínek SDS-PAGE pro stanovení molekulových hmotností, tak po stránce analýzy vzájemných interakcí proteinů, sledování tvorby komplexů za nativních mírných podmínek PFO-PAGE. (Ramjeesingh a kol. 1999). Zatím ještě nebyly ještě všechny možnosti aplikace této nové metody pro analýzu chování proteinů za nativních podmínek.

- 15 -

4. CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Současně s výzkumem nových typů terapeuticky aktivních látek na bázi kovů, zejména platiny vážící se na DNA se studuje in vitro možnost rozpoznání vzniklých lézí vybranými reparačními proteiny, které jsou připraveny rekombinantní technologií. Při studiu a charakterizaci vlastností těchto rekombinantních proteinů se s výhodou uplatňují elektroforetické metody jak pro stanovení molekulové hmotnosti, tak v rámci analýzy souboru proteinů z buněčných lyzátů a současně jsou hledány metodické možnosti pro analýzu oligomerních stavů proteinů za nativních podmínek. Cíle práce jsou následující: Ověřit chování vybraných proteinů za podmínek elektroforézy v polyakrylamidových gelech v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Zjistit využitelnost metody SDS-PAGE při analýze buněčných lyzátů pro optimalizaci podmínek exprese rekombinantních proteinů. Zavést elektroforetickou metodu separace proteinů v přítomnosti pentafluorooktanu sodného (PFO-PAGE).

v polyakrylamidových

gelech

Ověřit, za podmínek PFO-PAGE, stabilitu oligomerních komplexů vybraných modelových proteinů. Prohloubit znalosti o elektroforetickém chování rekombinantního XPA v polyakrylamidových gelech v přítomnosti různých detergentů (SDS, PFO).

proteinu

Pokusit se elektroforeticky stanovit reparační komplex proteinů XPF-ERCC1 metodou PFOPAGE.

- 16 -

5. MATERIÁLY A METODY 5.1. Proteiny BSA Bovinní sérum albumin (Sigma, St. Louis, USA) Rekombinantní proteiny byly připraveny v Laboratoři molekulární biofyziky a farmakologie: XPA (xeroderma pigmentosum komplementační skupina A) - preparát připraven v bezbuněčném systému RTS (Roche) - preparát pripraven v buňkách E. coli BL21SI - postup pro přípravu XPA proteinu a jeho purifikace uveden v Sedlářová I., Diplomová práce ,Brno 2005) XPF-ERCC1, preparát připraven v buňkách E. coli BL21SI a částečně purifikován na koloně hydroxyapatitu (Ambrožová K., Bakalářská práce, Brno 2004) HMGB1b7 připraven v buňkách E. coli BL21DE3 a chromatografiky purifikován p50 NFκB, exprese v buňkách E. coli pLysS

5.2. Bakteriální kmeny Escherichia coli BL21DE3 Escherichia coli BL21pLysS Escherichia coli BL21SI

5.3. Chemikálie Pro experimenty byly použity chemikálie: Akrylamid (Sigma, St. Louis, USA) Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Mnichov, Německo) Bisakrylamid (Sigma, St. Louis, USA) Bromfenolová modř (Sigma, St. Louis, USA) Dithiothreitol (DTT) (Sigma, St. Louis, USA) Dodecylsulfát sodný (SDS) (Sigma, St. Louis, USA) EZBlue Gel Staining Reagent (Sigma, St. Louis, USA) Glycerol (Sigma, St. Louis, USA) Glycin (Sigma, St. Louis, USA) Hydroxid sodný Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) (Sigma, St. Louis, USA) Kyselina octová (Sigma, St. Louis, USA) Kyselina pentadekafluoroktanová (PFO) (Sigma – Aldrich Chemie, Steinheim, Německo) Metanol (Sigma, St. Louis, USA) - 17 -

Persíran amonný (APS) (Sigma, St. Louis, USA) Standard molekulových hmotností proteinů (Sigma, St. Louis, USA) Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Sigma, St. Louis, USA) Tris báze (Carl Roth, Karlsruhe, Německo) Tris(hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid (Tris HCl) (Sigma, St. Louis, USA)

5.4. Roztoky a pufry 5.4.1. Roztoky a pufry použité při SDS-PAGE Příprava 12 % SDS-PAAG (8,3 cm × 8,1 cm): 3,4 ml Mili Q H2O 4,0 ml 30% akrylamid/ 2,67% bisakrylamid (29:1) 2,5 ml 1,5 M TrisHCl pufru pH 8,6 0,1 ml 10% (w/v) SDS 50 µl 10% (w/v) persíran amonný (APS) 10 µl TEMED Roztok nanést mezi elektroforetické skla přichycené ve stojanu, zasunout hřebínek pro starty a uložit v horizontální poloze 30% akrylamid: 29,2 g akrylamid 2,67% N‘N‘-bis-methylen-akrylamid: 0,8 g N‘N‘-bis-methylen-akrylamidu 100 ml Mili Q H2O 1,5 M Tris HCl pH = 8,6 27,23 g Tris báze 80 ml H2O upravit pH kyselinou HCl Nanášecí pufr pro SDS-PAGE: 3,55 ml Mili Q H2O 1,25 ml 0,5 M TrisHCl, pH = 6,8 2,5 ml glycerolu 2,0 ml 10% (w/v) SDS 0,2 ml 0,5% (w/v) bromfenolové modři Před použitím, k 950 µl přidat 50 µl beta – mercaptoethanolu ( Merck) Elektroforetický pufr SDS-Tris-glycinový (10 × koncentrovaný): 30,3 g Tris báze 144 g glycinu 10 g SDS pH = 8,3 - 18 -

destilovanou vodou doplnit do 1 litru Pro elektroforézu zásobní roztok pufru ředit 10krát

5.4.2. Roztoky a pufry použité při nativní elektroforéze Příprava 8 % PFO-PAAG (8,3 cm × 8,1 cm): 4,8 ml Mili Q H20 2,7 ml 30% akrylamid/2,67% bisakrylamid (29:1) 2,5 ml 1,5 M TrisHCl pufr pH 8,6 50 µl 10% (w/v) persíran amonný (APS) 10 µl TEMED Nanášecí PFO pufr pro nativní elektroforézu (2x koncentrovaný): 100 mM Tris báze 20% glycerol (v/v) 0,005% bromfenolová modř přidat: 10% w/v NaPFO pH 8 (upraveno 4M NaOH) Připravit pufry o koncentraci NaPFO: 0.4%, 1%, 2%, 4%, 6% Podle experimentu 2x cc nanášecí PFO pufry doplnit o 25mM DTT K jednomu objemovému dílu vzorku proteinů přidat jeden objemový díl nanášecího pufru. Elektroforetický 0,2% PFO-Tris-glycinový pufr pH 8,0: 1l 1×Tris-glycin 2g PFO 1ml 4M NaOH 10 × koncentrovaný Tris – glycinový pufr: 30,3 g Tris báze 144 g glycinu destilovanou vodou doplnit do 1 litru Pro elektroforézu zásobní roztok pufru ředit 10krát, doplnit o NaPFO. Fixační roztok pro barvení proteinů po SDS – PAGE a nativní elektroforéze za použití EzBlue (Sigma): 50% methanol 10% kyselina octová

- 19 -

5.5. Přístroje a pomůcky Autokláv Vaposteri (BMT a. s., Brno, Česká republika) Centrifuga 4K15 (Sigma, Německo) Centrifugační filtry (Microcon, USA) Laboratorní váhy CT600-S (Ohaus, USA) Mikropipety (Labsystems, Finsko) Minicentrifuga (Maneko, Praha, Česká republika) Mrazící box - pro teploty – 70o C (Environmental equipment, Cincinnati, USA) Termostat BT-120 (BMT a. s., Brno, Česká republika) Termostat s třepačkou (LabTherm, Kühner, Švýcarsko) Třepačka LT2 (Kavalier a. s., Votice, Česká republika) Vakuová sušička gelu Slabgeldryer 4050 (prodejce Biotech, Česká republika) Vortex VX100 (Labnet, Woodbridge, USA) Zařízení pro elektroforézu, vertikální MiniProtean II (BioRad, Richmond, USA) Zdroj pro elektroforézu Power Pack 300 ( Bio Rad, Richmond USA)

5.6. Metody 5.6.1. Určení molekulové hmotnosti 1. Po elektroforéze změřit velikost gelu a vzdálenost od startu k bromfenolové modři. 2. Gel fixovat, obarvit a vysušit. 3. Po vysušení gelu změřit jeho velikost a vzdálenost mezi startem a jednotlivými elektroforetickými proužky. 4. Použít vzorec pro výpočet relativní mobility R.

5. K jednotlivým vzdálenostem od startů elektroforetických proužků hmotnostního standartu proteinů (Sigma) přiřadit molekulární hmotnosti z tabulky (Sigma Markers). 6. Sestrojit logaritmickou závislost molekulární hmotnosti na relativní mobilitě. 7. Vnesení relativní pohyblivosti neznámého proteinu do grafu a odečtení molekulové hmotnosti (M) z přímky, představující lineární závislost standartu mol. hmotností na relativní pohyblivosti v příslušném SDS-PAA gelu po elektroforéze.

5.6.2. Provedení SDS-PAGE , aparatura Mini Protean II. 1. Připravit roztok 12% PAA gelu, aplikovat mezi dvě skla umístěné v elektroforetickém stojanu a nechat polymerizovat cca 1 hod. Pokud se s gelem nepracuje ihned, uložit v komorové lednici. 2. Gel umístit do elektroforetické vany, vyčistit starty , přelít elektroforetickým pufrem . 3. Ke vzorkům proteinů přidat nanášecí SDS pufr. 4. Vzorky mírně centrifugovat. 5. Nechat inkubovat 5 minut při 95°C, poté opět mírně centrifugovat. - 20 -

6. Inkubované vzorky nanést do startů, do dráhy jedna vložit hmotnostní standard proteinů (Sigma). 7. Elektroforetickou aparaturu MiniProtean II zaplnit SDS – elektroforetickým pufrem . 8. Připojit ke zdroji stejnosměrného napětí Power Pack 300. Elektroforézu nechat probíhat při konstatním protudu 10 mA až bromfenolová modř doputuje k dolnímu okraji gelu. 9. Směr elektroforetické separace proteinů probíhá o ke kladnému pólu v dolní části gelu.

5.6.3. Nativní elektroforéza proteinů (PFO-PAGE) 1. Připravit reakční směs pro 8% PAA gel, aplikovat mezi dvě skla a nechat polymerizovat nejméně 1 hod. Umístit gel do elektroforetické vany. 2. Ke vzorkům přidat PFO nanášecí pufr, promíchat, centrifugovat. 3. Vzorky nanést do vyčištěných startů, do dráhy jedna přidat hmotnostní standard roteinů (Sigma). 4. Elektroforetickou aparaturu MiniProtean II zaplnit 0.2% PFO-elektroforetickým pufrem. 5. Připojit ke zdroji Power Pack 300. Elektroforézu nechat probíhat při konstantním napětí nebo proudu až bromfenolová modř doputuje k dolnímu okraji gelu. 6. Směr elektroforetické separace proteinů od záporného pólu u startů ke kladnému pólu v dolní části gelu. Orientace na obrázcích – od startů ke spodnímu okraji.

5.6.4. Barvení proteinů v PAA gelech (SDS, PFO) po elektroforéze 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Gel uvolnit z prostoru mezi dvěmy skly. Gel promýt ve vaničce třikrát po 5 minutách v destilované vodě. Fixovat 15 minut v roztoku (50% MetOH, 10% kys. octová). Opláchnout gel 10 - 15 minut v destilované vodě. Proteiny barvit roztokem EZBlue (Sigma), v temnu nejméně 1 hod. případně déle. Odbarvit pozadí na gelu destilovanou vodou v chladu.

5.6.5. Dokumentace výsledků, uchování gelů po SDS-PAGE a nativní elektroforéze sušením 1. Obarvené proteiny na gelu byly snímány pomocí zařízení HP Scanjet 5590P s připojením na osobní počítač a záznam byl uložen na disketu. 2. Poté byl gel imobilizován na filtračním papíru Whatman, překryt fólií Saran a umístěn na sušičku gelů. Gel byl sušen pod vakuem, 40 minut při 75°C. 3. Záznam elektroforetické separace proteinů v příslušeném typu gelů na disketě byl zpracován pomocí programu pro kvantitativní vyhodnocení gelů AIDA (Advanced Image Data Analyser).

- 21 -

5.6.6. Příprava buněčných lyzátů 4. Sediment z l ml buněk po indukci exprese rekombinantních proteinů byl rozmíchán ve 100 µl lyzačního pufru (B-PER, Pierce) s přidání roztoku inhibitorů proteáz (Roche). Inkubace 10 min při pokojové teplotě (nebo 4oC) podle typu proteinů. 5. Lyzáty centrifugovat při 15000 rpm po dobu 15 min při teplotě 15°C. 6. Jímat supernatanty pro elektroforetickou analýzu.

5.6.7. Zahuštění buněčných lyzátů 1. Na zkumavku (Microcon) (1,5 ml) nasadit centrifugační filtr (Microcon YM-30). Na filtr nanést vzorek proteinů (max 0,5 ml) supernatantů buněčných lyzátů. 2. Centrifugovat při 14000 rpm 3 až 4 min při teplotě 4°C. Proteiny o větší molekulové hmotnosti než 30 kDa zůstanou nad filtrem, část objemu lyzačního pufru a nízkomolekulární proteiny protečou do spodní zkumavky. 3. Opatrně filtry ze zkumavky vyndat a obráceně vsunout do nové zkumavky téhož typu. 4. Centrifugovat při 1000 g po dobu 3 min. Zahuštěný vzorek proteinů elektroforeticky analyzovat.

- 22 -

6. VÝSLEDKY Příprava a purifikace rekombinantních proteinů, které jsou používány pro in vitro studie reparačních mechanismů a interakcí s cíleně modifikovanou DNA platinovými deriváty v sobě zahrnuje celou řadu postupů od transformace rekombinantních plasmidů do příslušných bakteriálních buněk E. coli, kultivaci, optimalizaci podmínek exprese příslušného rekombinantního proteinu v závislosti na čase a teplotě, izolaci proteinů, chromatografickou purifikaci a charakterizaci získaného preparátu. Jako červená niť se výše popsanými postupy rekombinantních technologií nese využití elektroforetických metod ať pro kontrolu správné velikosti vklonovaného fragmentu DNA do expresního vektoru na úrovni agarózové elektroforézy nukleových kyselin, nebo např. využití elektroforetických metod pro separaci proteinů při optimalizaci a kontrole exprese proteinů na úrovni lyzátů buněk, nebo při ověření čistoty a kvality připravených rekombinantních proteinů.

6.1. SDS-PAGE modelového proteinu BSA Komerčně dostupný protein bovinní sérum albumin (BSA) od firmy Sigma o koncentraci 1,4 mg/ml byl v různém váhovém množství nanesen na SDS-PAA gel a elektroforeticky separován. Zjišťovalo se minimální množství BSA proteinu, které je detekovatelné na SDSPAGE za použití barvícího roztoku EZBlue Gel Staining Reagent (Sigma) a současně tak byla ověřována kvalita elektroforetického dělení v PAA gelech o rozměrech 84 x 81 mm v elektroforetické vaně MiniProtean II.Výsledek je uveden na obr.6 A. Připravené vzorky obsahovaly protein BSA ve váhovém množství od 1,4 µg do 20 ng. EZBlue barvení prokázalo ještě 40 ng proteinu, 20 ng bylo hraničních, elektroforetický proužek proteinu byl pod hranicí detekce. V SDS-PAGE protein BSA poskytuje jeden elektroforetický proužek a jak ukazuje záznam profilu SDS-PAGE linie BSA proteinu v množství 1,4 µg, BSA protein je monomer (obr.6 A). Kvantitativním vyhodnocením gelu (obr 6B) pak byl prokázán lineární vztah mezi množstvím BSA proteinu ve vzorku a intenzitou elektroforetických proužků (obr. 6C) až do 80 ng. U nižších hodnot (60 – 20) ng BSA, byla zjištěna větší nepřesnost. Počítačový program AIDA vyhodnocuje plochu píku vyjadřující intenzitu elektroforetického proužku. Tyto hodnoty vynesené v závislosti na množství proteinu analyzovaného na gelu, tvořily lineární závislost.

- 23 -

A

B

C 100 000

integrál (QL)

80 000 60 000 40 000 20 000 0 0

500

1000

1500

m(ng)

obr .6. Elektroforetické chování proteinu BSA (A) 12% SDS-PAGE, Ik = 12 mA, při pokojové teplotě; linie (1) standart molekulových hmotností proteinů; linie 2. - 9, vzorky BSA v klesajícím v ng. (B) Profilový záznam elektroforézy BSA proteinu v množství 1,4 ug. (C) kvantitativní vyhodnocení SDS-PAGE; (A) Graf závislosti ploch píků na množství BSA ve vzorku. V grafu je vyneseno množství proteinu BSA od 80 ng do 1400 ng.

- 24 -

6.1.1. Ověření molekulové hmotnosti BSA proteinu Pro ověření molekulové hmotnosti BSA proteinu bylo využito SDS-PAGE uvedené na obr. 6A. Nejprve byla sestrojena kalibrační křivka vyhodnocením vzdáleností jednotlivých elektroforeticky separovaných proteinů o známé molekulové hmotnosti, které byly součástí komerčně připraveného standardu (Sigma). Hodnoty vyneseny do grafu (obr. 7). Z kalibrační křivky pak byla odečtena molekulová hmotnost vzorku proteinu BSA. Získaná hodnota činí 65 kDa a liší se od uváděné molekulové hmotnosti 66 kDa, či-li chyba stanovení metodou SDS-PAGE pro vzorek BSA proteinu činila 1,5%. Za podmínek SDS-PAGE je BSA protein v monomerní formě a odpovídající uváděné mol. hmotnosti. 2,10

β-galactosidase

2

y=2,26-1,25x, r =0,97

2,05

phosphorylase b

2,00

fructose-6-phosphate kinase

log M

1,95 1,90 1,85

albumin

testovaný albumin

1,80

glutamic dehydrogenase

1,75 1,70 1,65 0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

R

. obr.7. Určení molekulové hmotnosti BSA na základě SDS-PAGE (obr. 6). Z vypočtené relativní pohyblivost R proteinu BSA (testovaný albumin) byla vypočítána jeho molekulová hmotnost. Koeficient spolehlivosti r2 = 0,970 byl určen z lineární závislostirelativní pohyblivosti standartních proteinů o známých molekulových homotnostech (Sigma): myosin z králičích svalů (205 kDa), β-Galactosidasa z E. coli (116 kDa), phosphorylasa b z králičích svalů (97 kDa), fructoso-6-phosphat kinasa z králičích svalů (84 kDa), albumin z hovězího séra (66 kDa), glutamová dehydrogenasa z hovězích jater (55 kDa).

6.1.2. Možnosti využití metody SDS-PAGE při optimalizaci exprese rekombinantních proteinů v buňkách E. coli 6.1.2.1. Exprese proteinu p50 Byly připraveny lyzáty buněk E. coli kmene BL21pLysS nesoucí rekombinantní plasmid pET23a.p50 a pomocí SDS-PAGE byla studována optimalizace podmínek exprese proteinu p50 podjednotky proteinu NFκB po chemické indukci 1mM IPTG při teplotě 26oC a 37oC v různých časových intervalech (obr. 8). Buněčné lyzáty v objemu 100 µl byly připraveny - 25 -

z jednoho ml kultury a na SDS-PAGE byly analyzovány vzorky o objemu 6 µl. SDS-PAGE analýza lyzátů buněk prokázala optimum preferenční exprese proteinu p50 v čase 120 minut po indukci, při teplotě 26oC (obr. 8A, linie 5). Při teplotě 37oC pak vzrůstá celkové množství buněčných proteinů. Kvantitativní vyhodnocení exprese proteinu p50 za různých podmínek je graficky znázorněno na obr. 8B. Získané údaje optimalizace podmínek exprese proteinu p50 v buňkách E. coli kmene BL21pLysS budou využity k preparativní přípravě většího množství proteinu p50 pro další experimentální práci. A

B Exprese proteinu p50

integrál (QL)

50000 40000 30000 20000

26 °C

10000

37 °C

0 0

50

100

150

čas (min)

obr.8 Optimalizace podmínek exprese proteinu p50, (A) 12% SDS-PAGE, Ik = 10 mA, (1) standart molekulové hmotnosti proteinů; (2)kontrolní protein p50; lyzáty buněk po indukcí exprese proteinu p 50 (3, 7) 0 h, (4, 8) 1h, (5, 9) 2h, (6, 10) 3h. (3, 4, 5, 6). Exprese proteinů probíhala za teploty 26°C (3, 4, 5, 6) a 37°C (7, 8, 9, 10). (B) Grafické znázornění kvantitativního vyhodnocení ploch píků, odpovídající expresi proteinu p50 programem AIDA .

6.1.2.2. Exprese komplexu proteinů XPF-ERCC1 Další rekombinantní proteiny, u kterých byly hledány optimální podmínky pro expresi, byly proteiny, zúčastňující se reparačních mechanismů v lidských buňkách, ale v nádorových buňkách pak mohou působit proti účinné terapii cytostatiky na bázi cisplatiny. Do buněk E. coli BL21SI byl transformován rekombinantní plasmid pET30b. XPF-ERCC1, nesoucí uspořádání genů pro synchronizovanou expresi proteinů XPF a ERCC1. Právě komplex XPFERCC1 s endonukleázovou aktivitou se účastní nukleotidové excizní opravy a štěpí DNA řetězec na 5´konci od místa poškození na DNA. Endonukleázovou aktivitu nese pouze komplex obou proteinů nikoli samotné proteiny. Pro přípravu XPF-ERCC1 endonukleázy pro in vitro experimenty byly hledány podmínky optimální exprese v buňkách E. coli tohoto komplexu proteinů tak, aby komplex vykazoval enzymatickou aktivitu. Byla sledována časová závislost exprese proteinů XPF a ERCC1 v buňkách E. coli BL21SI po indukci provedenou přidáním 0,3 M NaCl do kultivačního media. V časových intervalech (30 až 180 min.) byly odebírány vzorky po jednom ml buněk, centrifugovány, lyzovány a lyzáty zahuštěny na YM 100 centrifugačních filtrech. Vzorky lyzátů (10 µl) z jednotlivých časových intervalů po indukci exprese proteinů byly analyzovány na 10% SDS-PAGE (obr. 9). Orientační kvantitativní vyhodnocení jednotlivých časových intervalů exprese programem AIDA prokázalo postupné narůstání množství XPF a ERCC1 proteinů s dosažením optimálního poměru XPF-ERCC1 v čase 150 minut od počátku - 26 -

200

exprese. Množství proteinů se zvyšovalo s časem od počátku až do 150 min (obr. 9, linie 6), pak se exprese XPF a ERCC1 zpomalovala v souladu s chováním, odpovídajícímu genotypu hostitelského kmene BL21SI.

obr. 9. Časová závislost exprese proteinů XPF-ERCC1 v lyzátech buněk E. coli kmene BL21SI zahuštěných na kolonkách YM 100, 10% SDS-PAGE, Ik = 12 mA, linie (1) standart molekulových hmotností proteinů; (2 – 8) doba exprese proteinů XPF a ERCC1 v minutách (30, 60, 90, 120, 150, 180). Pro kontrolu byla provedena SDS-PAGE analýza purifikovaného komplexu XPF-ERCC1 s endonukleázovou aktivitou, která prokázala dvě monomerní jednotky proteinů XPF (o mol. hmotnosti přibližně 110 kDa) a ERCC1 (o mol. hmotnosti okolo 34 kDa). V přítomnosti iontového detergentu SDS komplex disociuje na samostatné monomerní jednotky proteinů XPF a ERCC1 a tudíž nebylo možno určit, zda za nativních podmínek spolu XPF-ERCC1 tvoří v tomto preparátu komplex. Ukázalo se, že metodu SDS-PAGE v principu není možno využít pro studium vzájemných interakcí proteinů a jejich homo či heterodimerních komplexů.

obr. 10. 12% SDS-PAGE komplexu XPF-ERCC1 s endonukleázovou aktivitou po chromatografické purifikaci. Linie (1) standart mol. hmotností proteinů, linie 2, komplex XPF-ERCC1, množství 240 ng.

- 27 -

6.2. Elektroforéza proteinů za nativních podmínek (PFO-PAGE) Chování proteinů za nativních podmínek v roztoku, je často studováno pomocí jiných než elektroforetických metod. Např. centrifugací v hustotním gradientu sacharózy nebo různými chromatografickými metodami, které ale jsou náročné na množství analyzovaného materiálu, experimentální čas a také vyžadují drahé laboratorní vybavení. Proto byly hledány cesty jak analyzovat proteiny, zejména ty, které tvoří multimerní komplexy a nebo jsou obtížně na SDS-PAGE separovatelné např. membránové proteiny tak, aby nedocházelo k disociaci jednotlivých složek proteinů a komplexy zůstaly v průběhu elektroforézy zachovány. V roce 1999 Ramjeesingh M. a kol. publikovali novou elektroforetickou metodu pro vyhodnocení oligomerních struktur membránových proteinů, která v principu spočívala v náhradě iontového detergentu dodecylsulfátu sodného, za sodnou sůl kyseliny pentadekafluorooktanovou (Na PFO ) se zachováním všech ostatních výhod elektroforézy. Zajímalo nás, zda metodu PFO-PAGE můžeme využít pro analýzu chování různých rekombinantních proteinů, které za nativních podmínek tvoří komplexy (např. XPF-ERCC1), jak bylo ukázáno chromatografickými metodami, či zda za nativních podmínek nevytváří některé proteiny homodimery (např. XPA protein) apod. V další části experimentů byla zavedena metoda PFO-PAGE pro studium vlastností rekombinantních proteinů za nativních podmínek.

6.2.1. PFO-PAGE modelového proteinu BSA Jak bylo ukázáno v kap. 4.1 protein BSA je monomer o mol. hmotnosti 66 kDa. BSA protein byl použit jako model pro zavedení metody PFO-PAGE. Byl připraven nativní 8% PAA gel (bez SDS), 0,2% NaPFO elektroforetický Tris-glycinový pufr a nanášecí pufry, které v dvojnásobné koncentraci obsahovaly od 0,4% do 6% NaPFO. Ostatní podmínky elektroforézy byly stejné. Použití elektroforetické vany MiniProteanu II pak dovolilo snadné uspořádání a dodržení teploty 4oC při elektroforéze vložením aparatury do kontejneru s ledem. Vzorky BSA proteinu o zásobní koncentraci 1,4 mg/ml pro PFO-PAGE byly připraveny smícháním 3 µl BSA (4,2 µg) se stejným objemem 2x cc nanášecího pufru s 0,4% nebo 2% NaPFO. Současně byl sledován vliv redukčního činidla dithiothreitolu DTT o výsledné koncentraci 12,5 mM v nanášecím pufru. Polyakrylamidové gely po elektroforéze byly obarveny EZBlue roztokem. Bylo ukázáno, že protein BSA v množství 4,2 µg za uvedených podmínek nativní elektroforézy PFO-PAGE (obr. 11, linie 2 – 5) vykazuje stabilní množství homodimerů, při dvou koncentracích NaPFO (0,2% nebo 1%), linie 2, 4, které nebyly redukovány 12,5 mM DTT v nanášecím pufru a linie 3, 5 s DTT. Profil analýzy BSA proteinu na PFO-PAGE ukázal dva píky (obr. 11C), pík 1 představuje dimer, odpovídající 23% celkového množství BSA ve vzorku. (4,2 µg), pík 2 odpovídá 77% monomeru BSA proteinu. Kvantitativní vyhodnocení profilů proteinů z linií 2 - 5 obr. 11A jsou uvedeny v tabulce na obr. 11B. Při vyšším zastoupení NaPFO v nanášecím pufru (1%) bylo pozorováno méně homodimérů (pouze 11%), což odpovídá vlastnostem mírného detergentu NaPFO.

- 28 -

A

B Nanášecí pufr 0,2% 0,5%

Protein XPA monomer dimer monomer dimer

Vliv DTT --DTT 77% 83% 23% 17% 89% 83% 11% 17%

C

obr. 11. Elektroforetické chování BSA proteinu za nativních podmínek; (A), linie (1) standartní směs známých proteinů ( Sigma); 4,2 µg BSA, nanášecího pufru s NaPFO: (2, 3) 0,2 %, (4, 5) 1,0 %; 12,5 mM DDT (3, 5). (B) Tabulka kvantitivního vyhodnocení monomerní a dimerní formy BSA, údaje získány programem AIDA. (C) Profily intenzity elektroforetických proužků v gelu (linie 2), pík 1odpovídá dimeru, pík 2 představuje pozici monomeru BSA . 8% PFO-PAGE, Uk = 100 V, t = 120 min, 0,2% NaPFO 1xTris-glycinový elektroforetický pufr; Bylo zjištěno, že NaPFO-PAGE citlivě odhaluje tvorbu multimerních forem proteinu BSA za nativních podmínek v zásobním roztoku o koncentraci 1,2 mg/ml. V dalších experimentech byla pozornost zaměřena na vztah mezi multimerní formou BSA proteinu a podmínkami elektroforézy v PAA a přítomnosti NaPFO. Byly připraveny vzorky BSA proteinu v rozmezí 8,4 µg až 1,4 µg a smíchány v poměru 1:1 s 2 x cc nanášecím pufrem s 0,4% nebo 6% koncentrací NaPFO. Výsledek NaPFO PAGE vzorků BSA je uveden na obr. 12. Kvantitativní vyhodnocení profilů jednotlivých píků (jak uvedeno u obr. 11) prokázalo, že s klesajícím množstvím analyzovaného BSA, klesá zastoupení homodimerů ve vzorku a současně, že nejšetrnější pro detekci dimerů ve vzorcích proteinů je použití nanášecího pufru o koncentraci 0,2% NaPFO. Výsledná koncetrace 3% NaPFO ve vzorku BSA při nanášení na gel snižuje množství dimerů a proteiny disociují do monomerních jednotek podobně jako při SDS-PAGE.

- 29 -

A

B Množství 4,2 µg 2,8 µg 1,4 µg 0,7 µg

Protein BSA monomer dimer monomer dimer monomer dimer monomer dimer

Nanášecí pufr 0,2% 0,5% 87% 91% 13% 9% 89% 91% 11% 9% 95% 100% 5% 100% 100% -

obr.12. Vliv koncentrace NaPFO nanášecího pufru na detekci dimerů proteinu BSA; (A), linie (1) standart molekulových hmotností proteinů; množství BSA ve vzorcích (2, 6) 4,2 µg, (3, 7) 2,8 µg, (4, 8) 1,4 µg, (5, 9) 0,5 µg; výsledná koncentrace NaPFO v nanášecím pufru: (2, 3, 4, 5) 0,2 %, (6, 7, 8, 9) 3%. (B) Tabulka. Kvantitativního vyhodnocení zastoupení monomerů a dimerů proteinu BSA ve vzorcích, vyjádřená v % celkového množství proteinu. 8% PFO-PAGE, Ik = 12 mA, t = 90 min, 0,2% NaPFO 1xTris-glycinový pufr, Bylo ověřeno, že detekce multimerních forem proteinu BSA za nativních podmínek PFO-PAGE je ovlivněna množstvím analyzovaného materiálu a koncentrací NaPFO v nanášecím pufru. V následujícím experimentu na modelovém proteinu BSA byla ověřena citlivost barvení proteinů v gelech roztokem EZBlue po elektroforéze za podmínek PFO–PAGE. Byly připraveny vzorky BSA o různém množství od 0,7 do 2,1 µg a ve třech výsledných NaPFO koncentracích (0,2%, 1%, 3%), (obr. 13). Citlivost detekce proteinů barvením EZBlue nativních gelů nebyla ovlivněna přítomností NaPFO ve vzorcích a odpovídala citlivosti barvení proteinů po SDS-PAGE. Mezní hranice citlivosti barvení dimerní formy (obr. 13, linie 3) proteinu BSA se pohybuje okolo 5% z celkového množství 1,4 µg proteinu, tudíž citlivost detekce odpovídá cca 70 ng .

Obr. 13. Citlivost EZBlue barvení proteinů BSA po PFO-PAGE, Linie (1) marker molekulové hmotnosti; množství BSA (linie 2, 5, 8) 2,1 µg, (linie 3, 6, 9) 1,4 µg, (linie 4, 7, 10) 0,7 µg; výsledná koncentrace NaPFO nanášecího pufru: (2, 3, 4) 0,2 %, (5, 6, 7) 1%, (8, 9, 10) 3%. 8% PFO-PAGE, Uk = 100 V, t = 90 min, 0,2% NaPFO-Tris-glycinový pufr

- 30 -

6.2.2. Elektroforetické chování proteinu HMGB1b7 za podmínek PFOPAGE Výše popsaná elektroforetická metoda PFO-PAGE proteinů prokázala tendenci modelového proteinu BSA vytvářet homodimery při vysoké koncentraci 1,4 mg/ml. Byl proveden kontrolní experiment s rekombinantním proteinem HMGB1b7, který byl připraven pro in vitro studie interakcí tohoto proteinu s adukty platiny na DNA. Na rozdíl od BSA, protein HMGB1b7 má molekulovou hmotnost 11 kDA. Pro PFO-PAGE byly připraveny vzorky HMGB1b7 o 880 ng (koncentrace zásobního preparátu proteinu byla 0,44 mg/ml), které byly smíchány v poměru 1:1 s 2 x cc nanášecími pufry s různou koncentrací NaPFO (0,4%, 2%, 6%). Výsledek PFO-PAGE je uveden na obr. 14 A,B). Bylo prokázáno, že protein HMGB1b7 za nativních podmínek je monomer a netvoří dimery. A

B

obr.14. Protein HMGB1b7, (A), linie (1) kontrolní soubor standartních proteinů; vzorky proteinů v množství 440 ng a při koncentraci NaPFO: (2) 0,2% (3)1% (4) 3%. (B), Profil záznamu elektroforetické separace HMGB1b linie 2 při 0,2% NaPFO, znázorňující pozici proužku proteinu v gelu. 8% PFO-PAGE, konstantní proud Ik = 10 mA, t = 30 min, 0,2% NaPFO 1xTris – glycinový pufr;

- 31 -

6.2.3. Využití metody elektroforézy proteinů za podmínek PFO-PAGE Zajímalo nás, zda lze metodu PFO-PAGE použít i při studiu vlastností rekombinantních proteinů, které se zúčastňují in vivo nukleotidové excizní opravy a za podmínek in vitro rozeznávají a interagují s adukty platiny na DNA. Zaměřili jsme se na komplex proteinů XPFERCC1 s endonukleázovou aktivitou těsně související s heterodimerním uspořádáním proteinového komplexu. Dále nás zajímala otázka neobvyklého chování XPA proteinu v SDS-PAGE gelech, výskyt více komigrujících proužků v závislosti na jeho vazebné aktivitě k lézím na DNA a také tvorby multimerů za nativních podmínek.

6.2.3.1. Chování komplexu proteinů XPF-ERCC1 za nativních podmínek Proteiny XPF a ERCC1 za nativních podmínek vytváří komplex heterodimeru XPF. ERCC1 s endonukleázovou aktivitou. Zajímalo nás, zda v preparátu rekombinantního XPFERCC1 proteinu, připraveného expresí v buňkách E. coli BL21SI a purifikovaného na koloně hydroxyapatitu, který vykazoval endonukleázovou aktivitu invertující superhelikální formu plasmidu pUC19 do otevřené kruhové formy, obsahující přerušení nejméně jedné fosfodiesterické vazby na molekulu DNA. Na PFO-PAGE byly naneseny vzorky XPFERCC1 proteinu v množství 300, 200 a 100 ng v 0,2% NaPFO nanášecím pufru, (obr. 15A). Densitometrické vyhodnocení programem AIDA (obr. 15B) gelu po obarvení prokázalo z celkového množství proteinu zastoupení 20% komplexu, 25% monomeru XPF a 55% monomeru ERCC1 v daném preparátu. Dosažení teoretické hodnoty 100% komplexu není experimentálně možné. Srovnání dvou elektroforetických metod (tabulka 15B) pro separaci proteinů XPF-ERCC1 a to SDS a PFO-PAGE (obr. 10, obr. 15A) pak prokázalo výhodnost zařazení PFO-PAGE do souboru elektroforetických metod právě pro možnost kontroly zastoupení heterodimerního komplexu XPF-ERCC1 v preparátech daného proteinu v průběhu přípravy a purifikace. A

B

Protein XPFERCC1 XPF ERCC1

Procentuální zastoupení na SDS-PAGE PFO-PAGE teorie 69% 31%

20% 25% 55%

100% -

Obr. 15. 8% PFO-PAGE endonukleázy XPF-ERCC1 purifikované HPA chromatografií. (A), linie (1) kontrolní soubor standartních proteinů; vzorky proteinu XPF-ERCC1 v množství 300 ng, 200 ng a 100 ng ( linie 2 – 4) při koncentraci 0,2% NaPFO. 8% PFO-PAGE, konstantní proud Ik = 10 mA, t = 30 min, 0,2% NaPFO 1xTris – glycinový pufr; (B), Tabulka densitometrického vyhodnocení programem AIDA zastoupení komplexu, XPF-ERCC1 a monomerních forem vyjádřena v % celkového proteinu. - 32 -

6.2.3.2. PFO-PAGE analýza buněčných lyzátů při expresi XPF-ERCC1 Zabývali jsme se optimalizací podmínek exprese proteinu XPF-ERCC1 v buňkách E.coli BL21SI za podmínek jak je uvedeno v kap. 4.1.3.2. a připravené lyzáty buněk analyzovali na SDS-PAGE (obr. 9). Po prvních experimentálních zkušenostech s elektroforetickou separací proteinů za podmínek nativní PFO-PAGE a po zjištění, že lze komplex XPF-ERCC1 v purifikovaných preparátech detekovat (obr. 15) jsme se pokusili analyzovat vzorky lyzátů z buněk E. coli kmene BL21SI po indukci exprese proteinu XPFERCC1 také za podmínek nativní elektroforézy PFO-PAGE. (obr. 16) v 0,2% NaPFO nanášecím pufru. Komplex XPF-ERCC1 v lyzátech nebyl detekován, pravděpodobně byl pod hranicí možnosti detekce na gelu při analýze 10 µl vzorků z 1 ml lyzovaných buněk. Porovnání výsledků SDS-PAGE (obr. 9) a PFO-PAGE stejným způsobem připravených lyzátů buněk se nejeví metoda PFO-PAGE jako vhodná pro analýzu komplexu XPF-ERCC1. Nelze rozhodnout, zda komplex v průběhu exprese v buňkách byl vytvořen nebo byl pod hranicí detekovatelnosti. Jedná se o první aplikaci PFO-PAGE pro studium komplexu XPFERCC1 za nativních podmínek elektroforézy a v experimentech bude pokračováno.

Obr. 16. PFO-PAGE lyzátů buněk v závislosti na době exprese XPF-ERCC1 Exprese proteinu XPF-ERCC1 v lyzátech buněk E. coli kmene BL21SI; linie (1) směs proteinů o známé molekulové hmotnosti; 10 µl buněčných lyzátů, 0,2 % NaPFO v nanášecím pufru: linie (2 – 8) exprese proteinů v min.: 30, 60, 90, 120, 150, 180, respektive. 8% PFO-PAGE, Ik = 10 mA, t = 120 min, 0,2% NaPFO 1xTris-glycinový pufr;

- 33 -

6.3. Neobvyklé elektroforetické chování proteinu XPA XPA protein hraje klíčovou roli v nukleotidové excizní opravě. Pro in vitro experimenty byl připraven rekombinantní technologií, a to v buňkách E. coli, a také v bezbuněčném systému RTS od firmy Roche. Podrobné studie exprese XPA proteinu v E. coli kmenech o různém genotypu (BL21DE3, BL21pLysS, BL21SI) prokázaly významný vztah mezi genotypem hostitele a vazebnou aktivitou XPA proteinu. Připravené preparáty XPA z různých kmenů a RTS systému byly testovány na vazebnou afinitu k lézím na DNA na modelovém systému cisplatinou modifikovaných oligonukleotidech metodou retardace elektroforetické pohyblivosti komplexů DNA-protein v nativních polyakrylamidových gelech (EMSA). Bylo zjištěno, že XPA protein připravený expresí v buňkách kmene BL21SI není aktivní a naopak XPA protein z RTS vykazoval vysokou vazebnou aktivitu. (Sedlářová I., 2005)

6.3.1. SDS-PAGE chování proteinu XPA Jak je ukázáno na obr. 17 XPA protein vykazuje na SDS-PAGE unikátní vlastnosti, jednak aberantní pohyblivost za podmínek SDS–PAGE spočívající v rozdílu mezi mol. hmotností. 31kDa (273 a.k.) a pozicí „jako“ protein o mol. hmotnosti v rozmezí velikosti 42 – 48 kDa, (obr. 17 ). Na SDS-PAGE byly analyzovány dva preparáty XPA proteinu a to na obr. 17A, preparát připravený expresí v RTS systému s vysokou vazebnou aktivitou, vykazující triplet proužků v rozmezí 42 – 48 kDa, na rozdíl od vazebně neaktivního preparátu XPA připraveného expresí v buňkách E. coli BL21SI, který byl elektroforeticky homogenní a vykazoval pouze jeden elektroforetický pás (obr. 17 B). Dosud není spolehlivě vysvětlen vztah mezi existencí několika proužků na SDS – PAGE a vazebnou aktivitou preparátů XPA proteinu. A

B

Obr. 17. SDS- PAGE rekombinantního XPA proteinu připraveného A) v RTS systému B) v buňkách E. coli BL21SI. (Obr. 17 převzato z práce Sedlářová I., 2005)

- 34 -

6.3.2. PFO-PAGE chování XPA proteinu Metoda PFO-PAGE byla použita pro analýzu chování XPA proteinu za nativních podmínek, tudíž za podmínek, kdy není přítomen při elektroforéze detergent SDS. Byly použity dva preparáty XPA proteinu stejných jak uvedeno v kap. 4.3.1 a to XPARTS a XPAE. coli BL21 SI, čili vazebně aktivní a neaktivní. Vzorky XPA proteinů byly připraveny v množství 100 a 300 ng v 0,2% NaPFO nanášecím pufru. Jak je uvedeno na obr. 18, neaktivní XPAE. coli BL21 SI netvoří za nativních podmínek žádné multimerní formy na rozdíl od aktivní formy proteinu XPARTS . Densitometrické vyhodnocení vzorku XPARTS a poměrného zastoupení jednotlivých homodimerů (až trimerů) je uvedeno v tab. 18B, kdy bylo pozorováno 64% multimerních forem a pouze 36 % monomeru u vzorku aktivního XPARTS proteinu. První experimenty při použití nativní PFO-PAGE proteinu XPA prokázaly vztah mezi aktivní formou a tendencí vytvářet za nativních podmínek multimerní komplexy, jejichž molekulová hmotnost odpovídala dvou až trojnásobku molekulové hmotnosti monomeru. PFO-PAGE analýza dále prokázala, že za uvedených nativních podmínek elektroforézy, XPA protein v monomerní formě migruje podobně jako protein ERCC1 (obr. 18). Tyto předběžné výsledky budou předmětem dalšího intenzivního výzkumu souvisejícího s objasněním neobvyklého elektroforetického chování XPA proteinu. A

B

XPA Procentuální zastoupení monomer 36% dimer 26% trimer 38%

obr. 18. PFO-PAGE dvou vazebně rozdílných preparátů proteinu XPA. (A), Linie 1, XPFERCC1 protein, 300ng, 0,2 % NaPFO nanášecího pufru; linie 2, (M) směs proteinů o známé molekulové hmotnosti, linie 3, protein XPA-E 100 ng (exprese E. coli BL21SI), linie 4, protein XPA-RTS 300 ng, (XPARTS). V obou XPA vzorcích bylo použité 0,2% NaPFO nanášecího pufru; (B), vyhodnocení multimerů v XPARTS v % celkového množství proteinu. 8% PFO-PAGE, Uk =80 V, t = 120 min, 0,2% NaPFO1xTris-glycinový pufr;

- 35 -

7. DISKUSE Jak bylo v této práci ukázáno, elektroforetická separace proteinů skýtá celou řadu možností pro sledování chování proteinů za různých podmínek, atˇ se již jedná o klasickou elektroforézu proteinů v SDS-PAGE, využívanou pro stanovení molekulové hmotnosti převážné většiny proteinů, nebo při sledování vzájemných interakcí proteinů s DNA na úrovni retardace komplexu protein-DNA v nativních gelech, nebo také nové možnosti při sledování vzájemných interakcí mezi proteiny za nativních podmínek elektroforézy v přítomnosti sodné soli kyseliny pentadekafluorooktanové. Těžiště výsledků se pojí právě k zavedené nové metodě PFO-PAGE a její aplikace pro dva reparační proteiny XPA a endonukleázu XPFERCC1 připravené rekombinantní technologií. Podmínky PFO-PAGE byly nejprve ověřeny na modelovém proteinu BSA, který za podmínek SDS-PAGE se chová jako monomer o mol. hmotnosti 66 kDa ( obr. 6), ale při použití PFO-PAGE byly detekovány homodimery, odpovídající dvojnásobku mol. hmotnosti (více jak 100 kDa), které závisely na množství aplikovaného vzorku proteinu a také současně závisely na koncentraci NaPFO v nanášecím pufru. Bylo právě ukázáno (obr.12), že nejšetrnější k nativním podmínkám proteinů je koncentrace 0,2% NaPFO na rozdíl od 3% NaPFO, kdy tato koncentrace již působí více jako detergent. Proto také při analýze chování za nativních podmínek proteinů XPA a XPF-ERCC1 byly použita koncentrace 0,2% NaPFO nanášecího pufru. Striktně také byla dodržována teplota 4oC během elektroforézy tím, že celá elektroforetická aparatura MiniProtean II byly vložena do kontejneru s ledem. Při použití gelů větších rozměrů by bylo možné pracovat v komorovém chladicín boxu nebo využít elektroforetických zařízení s chlazením pro odvod Jouleova tepla. V našem případě jsme po ukončení elektroforézy opakovaně měřili teplotu elektroforetického pufru ve vnitřním elektrodovém prostoru jejíž hodnota se pohybovala v rozmezí 4 – 6 oC. Elektroforetický pufr Tris-glycinový byl používán s koncentrací 0,2% NaPFO, při koncentraci 0,1% NaPFO nebylo dosaženo kvalitní separace, proužky proteinů byly neostré. Jak bylo ukázáno na příkladu BSA proteinu za nativních podmínek, při vysoké koncentraci mají proteiny tendenci tvoři nahodilé homodimery, které již nebyly pozorované při koncentracích okolo 700 ng (obr.13), tudíž tvorba homodimérů proteinu BSA se silně odvíjí od vstupní koncentrace zásobního preparátu (1,4 mg/ml) a také pravděpodobně od mol. hmotnosti. Jako kontrola zda i relativně malé proteiny tvoří za nativních podmínek homodimery, byl do experimentů zařazen HMG1b7 protein o mol. hmotnosti 11 kDa (Huang J. a kol. 1994). Bylo ukázáno, že tento protein i v množství 880 ng homodimery netvoří, čili není tvorba homodimérů záležitostí jen koncentrace proteinů, ale také velmi pravděpodobně jejich vnitřních strukturních vlastností. Podrobnější analýza vztahu mezi tvorbou homodimérů v závislosti na koncentraci proteinů při uchovávání, v závislosti na iontové síle zásobního skladovacího pufru, v závislosti na mol. hmotnosti a apod. bude podrobně postupně rozpracována právě s ohledem na přípravu a in vitro experimenty s proteiny připravenými rekombinantními technologiemi. Na základě našich prvních podrobnějších experimentálních zkušeností s analýzou chování proteinů za nativních podmínek PFO-PAGE se otevírá celá řada možností pro využití této metody zejména při sledování vzájemných interakcí proteinů a vytváření komplexů heterodimerů. Jedním ze žhavých kandidátů pro sledování kvality proteinu je replikační protein RPA, který je složen ze tří podjednotek p14, p32 a p70 a který hraje také nezastupitelnou roli při nukleotidové excizní opravě. Dosud není zcela objasněna funkce - 36 -

nejmenší podjednotky p14 a nakolik pro některé funkce RPA proteinu musí být zachována integrita všech jeho tří částí. (Missura M. a kol. 2001) V této práci byly současně získány nové poznatky o chování některých vybraných proteinů za podmínek nativní elektroforézy PFO-PAGE podle Ramjeesingh M a kol. 1999 a to proteinu ERCC1. XPF a XPA. Bylo prokázáno, že v purifikovaných preparátech komplexu XPF-ERCC1 se vyskytuje cca ve 20%. Bylo by zajímavé sledovat vztah mezi množstvím komplexu XPF-ERCC1 a endonukleázovou aktivitou proteinu. Dosud byla používána pouze analýza pomocí SDS-PAGE, která prokázala dva vzájemně disociované proteiny XPF a ERCC1. Zajímalo nás, zda by bylo možné metodu PFO-PAGE využít pro sledování tvorby komplexu v průběhu exprese proteinů v bakteriálních buňkách (obr. 16) a tím určit optimální podmínky pro expresi. Bylo prokázáno, že pro endonukleázovou aktivitu je velmi důležitá současná exprese obou proteinů na jednom templátu a dosud se nepodařilo z obou proteinů XPF a ERCC1 in vitro připravit komplex s endonukleázovou aktivitou. Nezávisle na sobě se sdružují velmi těžko a mají tendenci agregovat (Gaillard P.-H.L., Wood R. D. 2001). Za podmínek SDS-PAGE lyzátů buněk E. coli BL 21SI po indukci exprese proteinů XPF a ERCC1 (obr. 9) jsme pozorovali rozdílnou rychlost exprese a současně také rozdílné množství obou proteinů při stejných podmínkách, čili optimalizací podmínek by pravděpodobně bylo možné získat i z poměrně malého množství buněčné kultury dostatečné množství aktivního preparátu na rozdíl od množství uváděné autory (Araújo a Wood, 2000), kteří zpracovali až 10 l E. coli buněk při izolaci XPF-ERCC1. Metoda RTS, která byla úspěšně použita pro expresi proteinu XPA, pro komplex XPF-ERCC1 není vhodná vzhledem k mol. hmotnosti proteinu XPF nad 100 kDa. (RTS Manual, Roche) Protein XPA, reparační protein, který hraje důležitou roli v nukleotidové excizní opravě (Dip R. 2004) je charakterizován neobvyklým chováním na SDS-PAGE (obr. 17) Iakoucheva L a kol. 2001) a neobjasněným vztahem mezi výskytem satelitních komigrujících proužků na SDS-PAGE a vazebnou aktivitou k lézím na DNA. Naše předběžné výsledky za použití PFO–PAGE (obr. 18) ukazují na tvorbu homomultimerních forem aktivního XPA proteinu na rozdíl od XPA proteinu, který se nevázal na poškozenou DNA a také nebyly na PFO-PAGE pozorovány multimerní formy. U obou preparátů XPA proteinu pak byla za nativní elektroforézy pozorována stejná pohyblivost v gelu, odpovídající pohyblivosti proteinu ERCC1 o mol. hmotnosti 34 kDa (obr. 18). Pravděpodobně, aberantní pohyblivost proteinu XPA na SDS-PAGE bude souviset s primární sekvencí aminokyselin, které v přítomnosti iontového detergentu SDS v PAGE, pravděpodobně brání správnému obalení a vytvoření micel(Iakoucheva L a kol. 2001). Také je uvažováno (Yang Z. a kol. 2002), že aktivní forma proteinu XPA se na místa poškození DNA váže ve formě homodimeru. Závěrem lze konstatovat, že metoda nativní elektroforézy proteinů PFO-PAGE je metodou velmi vhodnou v práci s rekombinantními proteiny zejména pro analýzu heterodimerních komplexů proteinů, vzájemnou interakci či ke sledování chování multifunkčních komplexů.

- 37 -

8. ZÁVĚR V rámci bakalářské práce: byla provedena optimalizace exprese proteinu p50, podjednotky proteinu NFκB, vyhodnocením kvality a kvantity lyzátů buněk analýzou na SDS-PAGE. Optimální doba exprese proteinu p50 byla určena na 120 minut, indukce při teplotě 26oC byla provedena optimalizace exprese komplexu proteinů XPF-ERCC1 v buňkách E. coli BL21SI po indukci 0,3 M NaCl, analýzou lyzátů na SDS-PAGE a byla zjištěna maximální doba indukce 150 minut při teplotě 26oC byla zavedena metoda nativní elektroforézy proteinů PFO-PAGE a na modelovém proteinu BSA provedena optimalizace podmínek byla zjištěna za pomoci PFO-PAGE přítomnost komplexu XPF-ERCC1 o mol. hmotnosti cca 150 kDa s endonukleázovou aktivitou bylo zjištěno, že metoda PFO-PAGE není vhodná pro analýzu lyzátů buněk byla prokázána tvorba homomultimerních komplexů za nativních podmínek u aktivně vazebného proteinu XPA, odpovídající dvou až trojnásobku mol. hmotnosti monomeru proteinu XPA usuzuje se na souvislost mezi vazebnou aktivitou proteinu XPA a tvorbou homomultimerních komplexů za nativních podmínek bylo zjištěno, že XPA protein za podmínek PFO-PAGE vykazuje homogenitu monomerní formy s pohyblivostí odpovídající jeho mol. hmotnosti pravděpodobně anomální chování XPA proteinu v SDS-PAGE souvisí s typem detergentu SDS získané výsledky s aplikací elektroforetické metody proteinů za nativních podmínek PFOPAGE naznačují možnosti širokého uplatnění v dalším výzkumu

- 38 -

9. LITERATURA Ambrožová K., Brno 2004, Bakalářská práce: Úloha XPF-ERCC1 nukleázy v procesu nukleotidové excizní opravy. Araújo, S. J., and Wood, R. D. 2000. Protein complexes in nucleotide excision repair. Mutation Research 435: 23-33.. Batty, D. P., and Wood, R. D. 2000. Damage recognition in nucleotide excision repair of DNA. Gene 241: 193-204. Brabec, V. 2002. DNA modifications by antitumor platinum and ruthenium compounds: their recognition and repair. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 71: 1-68. Cleaver, J. E., and States, J. C. 1997. The DNA damage-recognition problem in human and other eukaryotic cells: the XPA damage binding protein. Biochemistry 328: 1-12. Dip, R., Camenisch, U., and Naegeli, H. 2004. Mechanisms of the DNA damage recognition and strand discrimination in human nucleotide excision repair. DNA Repair 3: 1409-1423. Gaillard P.-H.L., Wood R. D. 2001. Activity of individual ERCC1 and XPF subunis in DNA nucleotide excision repair. Nucleic Acids Research 29(4): 872-879. Hermanson, I. L., and Turchi, J. J. 2000. Overexpression and purification of human XPA using a baculovirus expression system. Protein Expression and Purification 19: 1-11. Huang, J., Zamble, D. B., Reardon, J. T., Lippard, S. J., and Sancar, A. 1994. HMGdomain proteins specifically inhibit the perair of the major DNA adduct of the anticancer drug cisplatin by human excision nuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10394-10398. Iakoucheva, L. M., Kimzey, A. L., Masselon, C.D., Smith, R. D., Dunker, A. K., and Ackerman, E. J. 2001. Aberrant mobility phenomena of the DNA repair protein XPA. Protein Science 10: 1353-1362. Ikegami, T., Kuraoka, I., Saijo, M., Kodo, N., Kyogoku, Y., Morikawa, K., Tanaka, K., and Shirakawa, M. 1998. Solution structure of the DNA- and RPA-binding domain of the human repair factor XPA. Nature structural biology 5: 701-706. Jones, C. J., and Wood, R. D. 1993. Preferential binding of the xeroderma pigmentosum group A complementing protein to damaged DNA. Biochemistry 32: 12096-12104. Kartalou, M., and Essigmann, J. M. 2001a. Mechanisms of resistance to cisplatin. Mutation Research 478: 23-43. Kartalou, M., and Essigmann, J. M. 2001b. Recognition of cisplatin adducts by cellular proteins. Mutation Research 478: 1-21. Lehmann, A. R. 2003. DNA repair-deficient diseases, xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Biochimie 85: 1101-1111. Li, L., Peterson, C. A., Lu, X., and Legerski, R. J. 1995. Mutations in XPA that prevent association with ERCC1 are defective in nucleotide excision repair. Molecular and Cellular Biology 15: 1993-1998. Missura, M., Buterin, T., Hingdes, R., Hubscher, U., Kaspárková, J., Brabec, V., and Naegeli, H. 2001. Double-check probing of DNA bending and unwinding by XPA-RPA: an architectural function in DNA repair. The EMBO Journal 20: 3554-3564. Miyamoto, I., Miura, N., Niwa, H., Miyazaki, J., and Tanaka K. 1992. Mutational analysis of the structure and function of the xeroderma pigmentosum group A complementing protein. The Journal of Biological Chemistry 267: 12182-12187. Pinto, A. L., and Lippard, S. J. 1985. Sequence-dependent termination of in vitro DNA synthesis by cis- and trans-diamminedichloroplatinum(II). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4616-4619. - 39 -

Piljac, V., Piljac, G. 1986. Genetic engineering, Centrifugation and Electrophoresis. TIZ Zrinski – Čakovec. Prosser V. a kol. 1989. Experimentální metody biofyziky, Academia/Praha. Pushnova, E. A., Ostanin, K., and Thelen, M. P. 2001. Human XPA and XRCC1 DNA repair proteins expressed in yeast, Saccharomyces cerevisiae. Molecular Genetics and Metabolism 74: 380-384. Rademakers, S., Volker, M., Hoogstraten, D., Nigg, A. L., Moné, M. J., van Zeeland, A. A., Hoeijmakers, J. H. J., Houtsmuller, A. B., and Vermeulen, W. 2003. Xeroderma pigmentosum group A protein loads as a separate factor onto DNA lesions. Molecular and cellular biology 23: 5755-5767. Ramjeesingh M., Huan L.-J., Garami E., Bear E. Ch. 1999. Novel mothod for evaluation of the oligomeric structure of membrane ptoteins. Biochemistry 342: 119-123. Riedl ,T., Hanaoka, F. , and Egly, J. 2003. The comings and goings of nucleotide excision repair factors on damaged DNA. The EMBO Journal 22: 5293-5303. Robins, P., Jones, C. J., Biggerstaff, M., Lindahl, T., and Wood, R. D. 1991. Complementation of DNA repair in xeroderma pigmentosum group A cell extracts by a protein with affinity for damaged DNA. The EMBO Journal 10: 3913-3921. RTS application manual, 2003. Roche Diagnostics GmbH. Sedlářová I., Brno 2005, Diplomová práce: Studium úlohy XPA proteinu v procesu reparace poškození DNA po UV záření a působení cytostatik. Yang, Z., Liu, Y., Mao, L. Y., Zhang, J., and Zou, Y. 2002. Dimerization of human XPA and formation XPA2-RPA protein complex. Biochemistry 41: 13012-13020.

- 40 -