UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd

Možnosti zvýšení účinnosti vybraných cytostatik Disertační práce Mgr. Veronika Hanušová

Vedoucí disertační práce:

Hradec Králové, 2013

Prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.

Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat zejména své školitelce Prof. RNDr. Lence Skálové, Ph.D. za odborné vedení v průběhu mého doktorského studia, trpělivost, toleranci, lidský přístup a nikdy nekončící optimistický postoj k vědě i životu. Děkuji svým spolupracovníkům, Mgr. Marii Přibylové, za přípravu derivátů a přínosnou spolupráci, paní Aleně Pakostové za každodenní obětavou pomoc a ochotu a Doc. Ing. Barboře Szotákové, Ph.D., za cenné rady a přátelský přístup. Děkuji pracovnímu kolektivu Katedry biochemických věd, zejména kolegům z dětského pokoje za přátelskou atmosféru a ochotu pomoci s čímkoliv. Děkuji Prof. Dr. Andree Huwiler, Prof. Dr. Uwe Zangemeister-Wittke, Dr. Natalje Koletevets a ostatním členům jejich skupiny na Univerzitě v Bernu za přátelské přijetí a podělení se o cenné zkušenosti. Dík patří samozřejmě rodině a přátelům za podporu po celou dobu studia. Velký dík patří Adamovi, který má pochopení pro mé rozmary i nedostatky. Za finanční podporu děkuji Grantové agentuře České republiky a Univerzitě Karlově: GA ČR – P502/10/0217; GA ČR – P303/12/G163; SVV 267 004.

2

Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Veronika Hanušová

3

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát:

Mgr. Veronika Hanušová

Školitel:

Prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.

Název disertační práce: MOŽNOSTI ZVÝŠENÍ ÚČINNOSTI VYBRANÝCH CYTOSTATIK Nádorová onemocnění patří mezi nejzávažnější nemoci a jednu z nejčastějších příčin úmrtí v civilizovaných zemích. Významnou část nádorových onemocnění lze léčit chirurgicky, radioterapií nebo chemoterapií, zejména pokud jsou zjištěna včas. Přes mnohé úspěchy je v řadě případů chemoterapie nedostatečně účinná a použití vyšších dávek cytostatik je limitováno jejich systémovou či orgánovou toxicitou. Proto jsou v poslední době intenzivně hledány nové strategie, které by vedly ke zvýšení účinnosti cytostatik v nádorových buňkách a současně ke snížení toxicity těchto léčiv pro normální zdravé buňky. Cílem předložené disertační práce bylo hledání a testování nových možností, jak zvýšit účinek protinádorové léčby. K dosažení stanovených cílů byly provedeny in vitro testy (různé buněčné linie, subcelulární frakce homogenátu z buněk, potkanů a myší) a in vivo experimenty (tumorizované myši). Prvním testovaným přístupem byla inhibice deaktivace doxorubicinu (DOX). DOX, patřící mezi nejvýznamnější cytostatika využívaná v protinádorové terapii, je metabolizován

na

méně

cytostaticky

aktivní

a

více

kardiotoxický

metabolit

doxorubicinol (DOXOL). V nádorové a nenádorové prsní tkáni byl studován inhibiční účinek isochinolinového derivátu oracinu (ORC) na redukci DOX. V testech in vitro ORC inhiboval redukci DOX a zvyšoval antiproliferační účinek v prsní nádorové linii MCF7. Navíc, ORC výrazně snižoval toxicitu DOX v nenádorové buněčné linii MCF10A a v potkaních hepatocytech. In vivo byl ORC schopný zpomalit tvorbu

4

toxického metabolitu DOXOLu, avšak nebyl schopen zlepšit účinnost DOX v myších s Ehrlichovým tumorem (EST). Cílenou

terapii,

založenou

na použití specifické molekuly pro

selektivní

transport léčiva do nádorové buňky, jsme použili pro zlepšení účinku paklitaxelu (PTX), dalšího účinného chemoterapeutika. PTX byl konjugován s gonadotropním hormonem (GnRH), jehož receptor je ve zvýšené míře exprimován na prsním a ovariálním karcinomu. Bylo zjištěno, že tento konjugát zvyšoval cytostatický efekt, v porovnání se samotným PTX v buňkách MCF7 prsního karcinomu. Dalším studovaným přístupem bylo zjišťování antiproliferativního účinku léčiv, které jsou schváleny a využívany v jiných indikacích. Konkrétně se jednalo o benzimidazolová anthelmintika flubendazol (FLU) a albendazol (ABZ), u kterých byl v posledních letech zjištěn cytostatický účinek na některé typy nádorů. V naší studii byl zjištěn jejich významný antiproliferativní účinek na střevní nádorové buněčné linie. Navíc ABZ i FLU potencoval účinek PTX v těchto nádorových buňkách. V neposlední řadě, možným přístupem, jak zvýšit úspěšnost protinádorové léčby, je nalezení nových látek s cytostatickým účinkem např v přírodních extraktech. V našich experimentech jsme zkoušely různé extrakty a oleje z tropického stromu Myrica rubra. Zejména olej lisovaný z listů působil výrazně antiproliferativně na střevní nádorové linie Caco2 a HCT8. Na identifikaci účinných látek a studiu možného mechanismu účinku se v současnosti intenzivně pracuje. Výsledky disertační práce rozšířily poznatky o možném zvýšení účinnosti protinádorové terapie a pomohly alespoň k částečnému nastínění dalších vhodných směrů v této oblasti

5

Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences

Candidate:

Mgr. Veronika Hanušová

Supervisor:

Prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.

Title of Doctoral Thesis: POSSIBILITIES TO INCREASE THE EFFECTIVENESS OF SELECTED CYTOSTATICS Cancer belongs among the most serious diseases and one of the most common causes of death in civilized countries. Many cancers can be cured by surgery, radiotherapy or chemotherapy, especially if they are detected early. The efficacy of anticancer treatments is frequently insufficient; the use of higher doses is limited by the development of systemic or organ toxicity. Recently, new strategies how to improve efficacy of cytostatics in cancer cells and decrease their toxicity in normal healthy cells have been intensively investigated. The aim of present thesis was to search and test the new possibilities, how to increase effectiveness of anticancer drugs. To achieve our goals, in vitro experiments (various cell culture, subcellular fractions of homogenate from cells, rats and mice) and in vivo experiments (tumor bearing mice) were performed. First tested approach was based on the inhibition of doxorubicin deactivation (DOX), which belongs among the most important antineoplastic drugs used in cancer therapy. DOX is metabolized to less cytostatically active and more cardiotoxic metabolite doxorubicinol (DOXOL). The inhibitory effect of isoquinoline derivative oracin (ORC) on DOX reduction in tumorous and non-tumorous breast cancer was studied. In vitro, ORC inhibited DOX reduction and increased the antiproliferative effect of DOX in MCF7 breast cancer cells. Moreover, ORC significantly decreases DOX toxicity in non-cancerous MCF10A breast cells and in hepatocytes. In vivo, ORC was able to reduce DOXOL formation but was not able to improve DOX efficacy in EST-bearing (Ehrlich solid tumor) mice.

6

Tumor-target therapy based on specific molecule for selective transport of drugs into cancer cells was used to improve the effect of paclitaxel (PTX), other potent chemotherapeutic drug. PTX was conjugated with gonadotropin-releasing hormone (GnRH), whose receptor is mostly expressed in breast and ovary carcinoma. This conjugate was found to be more effective than PTX alone in decrease of cell proliferation in MCF7 human breast cancer cells. Further studied approach comprised the tests of antiproliferative effect of drugs, which are approved for administration in other indications.Our study was focused on benzimidazole anthelmintics, flubendazole (FLU) and albendazole (ABZ), which were recently found to be cytostatically active in several types of tumors. In our study, significant antiproliferative effect of FLU and ABZ was observed in intestinal cancer cells. In addition, ABZ and FLU potentiated efficacy of PTX in these cancer cells. The search of new drugs with cytostatic effects, e.g. from natural extracts represents another possible approach to increase the effectiveness of anticancer treatment. In our experiments, different extracts and oils from tropical tree Myrica rubra were tested. The oil pressed from the leaves had significant antiproliferative effect on intestinal tumor cell lines Caco2 and HCT8. Identification of active substances and possible mechanisms of action is now intensively studied. The obtained results extend the knowledge of possible ways how to increase the effectiveness of anticancer therapy and at least partially helped to understand other relevant approaches in this area.

7

Obsah:

1

Úvod: ............................................................................................ 10

2

Teoretická část: ............................................................................ 11 2.1

Nádorová onemocnění...................................................................................... 11

2.1.1

Fáze nádorového procesu.......................................................................... 11

2.1.2

Cytostatika působící na proliferaci a buněčný cyklus............................... 12

2.2

Možnosti zvýšení účinku cytostatik ................................................................. 20

2.2.1

Liposomální enkapsulace .......................................................................... 20

2.2.2

Konjugace se specifickou molekulou ....................................................... 24

2.2.3

Omezení biotransformace cytostatik......................................................... 30

2.2.4

Ovlivnění efluxních transportérů .............................................................. 32

2.3

Hledání protinádorových vlastností léčiv používaných pro jiné indikace ....... 36

2.4

Hledání nových přírodních látek s cytostatickým účinkem ............................. 38

3

Cíle práce: .................................................................................... 40

4

Výsledky a diskuze: ...................................................................... 41 4.1

Možnosti zvýšení účinnosti DOX v protinádorové terapii............................... 41

4.2

Zvýšení účinnosti DOX v prsních nádorových buňkách inhibicí jeho

deaktivace.................................................................................................................... 41 4.3

Vliv ORC na toxicitu DOX v nenádorové tkáni .............................................. 43

4.4

Efekt oracinu na redukci, distribuci a účinnost DOX in vivo........................... 44

4.5

Konjugace paklitaxelu s analogem gonadotropního hormonu ......................... 46

4.6

Efekt benzimidazolových anthelmintik na účinnost paklitaxelu a střevní

nádorové linie.............................................................................................................. 47 4.7

Účinek olejového extraktu voskovníku červeného (Myrica rubra) na střevní

nádorové linie.............................................................................................................. 49

5

Závěr: ........................................................................................... 52 8

6

Seznam použité literatury: ........................................................... 53

7

Přílohy .......................................................................................... 62 7.1

Publikace vztahující se k tématu disertační práce ............................................ 62

7.1.1

Publikace I................................................................................................. 63

7.1.2

Publikace II ............................................................................................... 82

7.1.3

Publikace III .............................................................................................. 93

7.1.4

Publikace IV............................................................................................ 103

7.1.5

Publikace V ............................................................................................. 112

7.1.6

Publikace VI............................................................................................ 119

7.2

Ostatní publikace v recenzovaných časopisech: ............................................ 140

7.3

Abstrakta z konferencí: .................................................................................. 140

7.4

Seznam zkratek: ............................................................................................. 141

9

1 Úvod: Zhoubná nádorová onemocnění představují závažný celospolečenský problém. Rakovině je v mnoha případech možno zabránit a brzká detekce podstatně zvýší šance na vyléčení. Po kardiovaskulárních chorobách je rakovina nejvýznamnější příčinou úmrtí a nemocnosti v Evropě, kde ročně způsobí 1,7 milionu úmrtí – 20 %celkové úmrtnosti - a zároveň se objeví více než 3 miliony nových případů (WHO). V České republice jsou nádorová onemocnění druhou nejčastější příčinou smrti, ročně zde na nádorová onemocnění umírá více než 27 tisíc osob – 23 % z celkové úmrtnosti - (SZÚ). Mezi nejčastější případy patří karcinom plic, žaludku, jater, kolorektální karcinom, karcinom prsu a karcinom děložního čípku (Cancer worldwide – the global picture). Podstatou zhoubných nádorových onemocnění je změna genetické informace a regulačních mechanismů v buňce. To vede k nekontrolovanému dělení buňky, vzniká celý nový klon takto postižených buněk, který se nekontrolovaně množí (Příčiny rakoviny). Nekontrolovaný růst vede ke zvětšení takto postižené tkáně, která může stlačovat okolní struktury, k postupné invazi do okolních struktur a k metastazování (Klener, 2002). Léčiva proti zhoubnému bujení potlačují rozvoj a množení rychle rostoucích buněk. Používají se proto k inhibici růstu nádorů a neoplazmat hematopoetického systému. Běžně se tyto látky označují jako cytostatika, ačkoliv mohou vyvolávat i účinky cytocidní a vyvolat tak zřetelný úbytek počtu nádorových buněk (Lüllmann et al., 2002). Používaná léčba cytostatiky tlumí zejména růst tkání s vysokou proliferační rychlostí, proto nejvíce postihuje nádorově zvrhlou tkáň. Společně s ní však negativně působí i na tkáň zdravou. Hlavní léčebnou strategií je specifická terapie, tj. eliminace maligně zvrhlých nádorových buněk při zachování integrity buněk zdravých. Tato disertační práce si proto klade za cíl alespoň částečně přispět k rozšíření možností zvýšení účinnosti cytostatik na nádorové buňky a zároveň omezit negativní účinky na zdravou tkáň.

10

2 Teoretická část: 2.1 Nádorová onemocnění Nádorové onemocnění lze charakterizovat jako neregulovaný růst buněk o autonomní povaze buněčné proliferace spojenou s poruchou kontrolních mechanismů a se změnou buněčné diferenciace. Nádorová onemocnění jsou způsobena kumulací genetických změn, které jsou vyvolány různými karcinogeny působícími během života. Předpokládá se, že kolem 90 % nádorových onemocnění je náhodně vzniklých díky různým vlivům zevního prostředí, stárnutí organizmu i dalším faktorům, pouze malá část vzniká díky zděděné zárodečné mutaci. Geny, které mohou způsobovat dědičnou dispozici k nádorům,

se mohou také účastnit vývoje sporadického onemocnění

(Bajčiová et al., 2011). 2.1.1 Fáze nádorového procesu Nádor není pouze výsledkem autonomní a neregulované proliferace, ale též významným faktorem inhibice programované smrti buněk – apoptózy, která u některých typů nádorových onemocnění hraje dokonce významnější úlohu než vystupňovaná proliferace (Klener a Klener, 2010). Biologie buněčného dělení, diferenciace a apoptóza je u nádorových buněk mimořádně podobná jako v buňkách normálních. Nádorové buňky obvykle obsahují všechny potřebné biomolekuly, které jsou nezbytné k přežití, proliferaci, diferenciaci, buněčné smrti a expresi mnoha buněčných specifických funkcí. Neschopnost regulovat tyto funkce má za následek změnu ve fenotypu a vznik rakoviny. Velké množství nádorových buněk se nachází v mitóze, která je pro většinu normálních tkání vzácným jevem. Nádorové buňky také postrádají některé vlastnosti, jako je např. kontaktní inhibice a redukce buněk v závislosti na přítomnosti růstových faktorů v prostředí (Klener a Klener, 2010). Cílem současné nádorové léčby je většinou redukce počtu nádorových buněk a prevence jejich další akumulace. Buněčné dělení reprezentuje čas, který je potřeba k dokončení buněčného cyklu. Buněčné dělení můžeme rozdělit na dvě funkční fáze, S a M fázi a dvě přípravné fáze, G1 a G2. S fáze je definovaná jako fáze, kde je replikována DNA. G1 a G2 fáze jsou důležité pro syntézu buněčných komponent potřebných pro podporu následné fáze a také k dokončení buněčného dělení. V M-fázi, mitóze, se růst buňky zastaví a dojde nejprve k rozdělení jádra a pak začne samotné

11

buněčné dělení. Mitózu dále dělíme na profázi, metafázi, anafázi a telofázi, přičemž již během anafáze dochází k cytokinesi (Obr. 1.) (Bast et al., 2000; Alberts et al., 2004). Pro růst a šíření nádoru má mimořádný význam též indukce novotvorby cév – angiogeneze a vaskulogeneze, schopnost vytvářet aberantní vztahy s nenádorovými buňkami nádorového mikroprostředí a schopnost invazivního růstu a/nebo vytváření vzdálených mestastáz (Klener a Klener, 2010). Pro růst a metastazování solidních tumorů je kritický růst nových krevních tělísek. Angiogeneze je základním procesem pro růst nádoru, invazi a šíření metastáz v mnoha lidských tumorech. Je regulována celkovou rovnováhou mezi promotory a inhibitory. Angiogeneze je komplexní proces, vyskytující se

v řadě

vzájemně

propojených

kroků

a

zahrnuje

uvolnění pro-

angiogenních faktorů (Harmey, 2004). 2.1.2 Cytostatika působící na proliferaci a buněčný cyklus Cílem působení chemoterapeutik jsou převážně proliferující buňky. Účinek chemoterapeutik je neselektivní, takže ovlivňují i buňky zdravých tkání. U nádorových buněk dochází k poruše regulačních mechanismů buněčné proliferace a k rozdílům v trvání jednotlivých fází buněčného cyklu. Delší generační poločas nádorových buněk ve srovnání s normálními buňkami lze využít v léčebné strategii. Podle zásahu do buněčného cyklu cytostatika dělíme na a) cyklus-nespecifická, která nejsou závislá na proliferační aktivitě buněk a působí i na nedělící se buňky, a b) cyklus-specifická, která můžeme dál dělit na 1) fázově specifická a 2) fázově nespecifická cytostatika (Bast et al., 2000; Alberts et al., 1997; Roztočil et al., 2011).

Obr. 1: Mikroskopické znázornění části buněčného dělení. a) G2 fáze buněčného cyklu, b)

profáze

c)

metafáze,

d)

anafáze,

e)

cytokineze,

f)

telofáze

(http://user.mendelu.cz/sladek/cytologie/mitosis.jpg). 12

2.1.2.1 Fázově specifická cytostatika Působí v určité fázi buněčného cyklu, nejčastěji poškozují tvorbu DNA a/nebo inhibují buněčné dělení. 2.1.2.1.1 G1-fáze Antracyklinové antibiotikum doxorubicin (DOX) je jedním z nejpoužívanějších protinádorových

léčiv.

DOX

byl

spolu

s daunorubicinem

(DAU)

prvním

antracyklinem izolovaným ze Streptomyces peucetius. DAU se liší od DOX velmi nepatrně, na postranním řetězci je navázána metylová skupina namísto primárního alkoholu. Za cytotoxický efekt je pravděpodobně zodpovědných několik mechanismů: 1) interkalace mezi řetězce DNA, 2) inhibice topoisomerasy II, 3) uvolnění cytochromu c z mitochondrií a 4) tvorba volných radikálů způsobujících oxidativní stres. DOX má široké spektrum použití, obvykle se aplikuje při léčbě karcinomu prsu, ovaria,

neuroblastomu,

dětských

solidních

tumorů,

sarkomů

měkkých

tkání,

osteosarkomů, Hodgkinovy choroby, agresivních lymfomů a dalších. DAU je účinný při léčbě akutní lymfoblastické a myeloblastické leukemie. Mezi nejzávažnější nežádoucí účinky DOX patří zejména kardiotoxicita, dále pak neutropenie, nauzea, anémie, infekční komplikace, lokální toxicita a jiné. Velmi častý je vznik rezistence. Pro omezení nežádoucích účinků byl připraven analog DOX, epirubicin, který však nežádoucí toxicitu výrazně nezlepšil. Analogem DAU je idarubicin, který v několika studiích vykazuje lepší antileukemický efekt a také snížení chronické kardiotoxicity oproti DAU (Minotti, 2004; Klener a Klener, 2010; Thigpen, 2005; Tidefelt et al., 1996; Lotfi et al., 2002). Aktinomycin D je cytotoxické antibiotikum, které se interkaluje mezi řetězce DNA, zabraňuje pohybu RNA polymerasy a tím i transkripci. Podobně jako antracykliny inhibuje topoisomerasu II. Většinou je používán při léčbě dětských malignit. Vyjma kardiotoxicity jsou vedlejší účinky podobné jako u antracyklinů (COSMEGEN® LYOVAC, Dale et al., 2007). 2.1.2.1.2 G1/S-fáze Metotrexát (MTX) je jeden z nejpoužívanějších antimetabolitů v nádorové terapii. Léčebným cílem MTX je enzym dihydrofolátreduktasa, která katalyzuje redukci folátu a 7,8-dihydrofolátu na 5,6,7,8-tetrahydrofolát. Dihydrofolátreduktasa je nezbytná při syntéze DNA. MTX se používá se při léčbě akutní lymfoblastické leukémie, maligních

lymfomů

non-Hodgkinova

typu,

osteosarkomu,

choriokarcinomu

a 13

karcinomu hlavy a krku. Mezi jeho nežádoucí účinky patří hepatotoxicita, jaterní fibróza a cirhóza (Jolivet et al., 1983; Zachariae, 1990; Nogueira et al., 2013). 5-Fluorouracil 2´deoxythymidylátu

(5-FU)

je

analog

uracilu.

a nevratně inhibuje thymidylátsyntetasu.

Zasahuje

do

syntézy

Výsledkem je inhibice

DNA syntézy. Během S-fáze dochází k oboustranným (i jednostranným) zlomům na DNA. 5-FU se používá zejména při léčbě kolorektálního a pankreatického karcinomu. Jeho

nejzávažnější

vedlejší

účinek

je

poškození gastroinstestinálního

epitelu

a

myelotoxicita (De Angelis et al., 2006; Dale et al., 2007). 2.1.2.1.3 S-fáze 6-Merkaptopurin (6-MP), analog hypoxantinu, je nejprve metabolizován na aktivní formu uvnitř buňky. Tento metabolit inhibuje aktivitu několika enzymů při syntéze purinových nukleotidů de novo. Později je přeměněn na thioguanin, který se inkorporuje mezi nukleové kyseliny a indukuje cytotoxicitu zastavením buněk v G2/M a S fázi. 6-MP se používá při léčbě akutní lymfoblastické leukemie a také jako imunosupresivum. Mezi nežádoucí účinky patří nauzea, zvracení, tmavnutí kůže a ztráta vlasů (Kaori et al., 2007; Kanemitsu et al., 2009). Další důležité analogy purinu jsou fludarabin, pentostatin nebo tioguanin (Dale et al., 2007). Hydroxyurea neboli hydroxykarbamid je orální cytostatikum, které inhibuje ribonukleotidreduktasu, tvorbu deoxynukleotidů a DNA syntézu. Je široce používaná při myelosupresivní terapii u pacientů s polycytemie vera, kde také chrání před ischemickou

chorobou

srdeční

a

esenciální

trombocytémií,

pravděpodobně

prostřednictvím produkce oxidu dusnatého a vasodilatace. Hydroxyurea má také řadu vedlejších efektů, zejména při dlouhodobém podávání, nejzávažnější je útlum kostní dřeně. U třetiny pacientů dochází ke vzniku resistence nebo intolerance k hydroxyuree. Vedlejším účinkům se dá předejít použitím kombinace s jiným léčivem (Calzada et al., 2013). Po chemické nebo enzymatické aktivaci mitomycin C funguje jako bifunkční alkylační agens. Tento proces probíhá za hypoxických podmínek a dochází při něm k tvorbě volných radikálů a tím k degradaci DNA. Je používán v terapii různých gynekologických a gastrointestinálních malignit, nemalobuněčného karcinomu plic a nádoru hlavy a krku. Způsobuje myelosupresi a také může docházet k poškození ledvin a plicní fibróze (Kahmann et al., 2010; Dale et al., 2007).

14

Cytarabin

(Ara-C)

je

pyrimidinový

analog

přirozeně

se

vyskytujícího

nukleosid 2´deoxycytidinu. Léčivo vstupuje do buňky a podléhá fosforylační reakci. Vzniklý

cytosinarabinosidtrifosfát

inhibuje

DNA-polymerasu

a

zároveň

způsobuje

tvorbu reaktivních forem kyslíku (ROS). Nejčastěji je používán při léčbě akutní myelodní leukémie

a non-Hodgkinova lymfomu. Nežádoucí účinek se projevuje

toxicitou kostní dřeně a GIT, častá je nevolnost a zvracení (Dale et al., 2007; HorvátKarajz et al., 2009). 2.1.2.1.4 G2-fáze Bleomycin je izolován z bakterie Streptomyces verticillus a patří do skupiny kov-chelatujících glykopeptidových antibiotik, které degradují DNA. Jeho působením dochází k fragmentaci DNA řetězce a uvolnění volných bazí. Zároveň dochází k tvorbě superoxidových a hydroxylových radikálů. Bleomycin je nejúčinnější v G2 fázi a mitóze, je ale aktivní i na nedělící se buňky v G0 fázi. Používá se na léčbu nádorů zárodečných buněk, Hodgkinova lymfomu a spinocelulárních karcinomů. Bleomycin způsobuje lehkou myelosupresi, nejzávažnější vedlejší účinek je plicní fibróza, častá je alergická reakce ( Dale et al., 2007; Alomrani et al., 2011). Oracin

(ORC) (6-[2-(2-hydroxyethyl)aminoethyl]-5,11-dioxo-5,6-dihydro-11H-

indeno[1,2-c]isochinolin)

je

potenciální protinádorové

léčivo,

strukturně

podobné

mitoxantronu. Mechanismus účinku se podobá antracyklinům a antrachinonům. Na cytotoxickém účinku se podílí interkalace či inhibice topoisomerasy II, inhibuje replikaci a transkripci a tím i syntézu nukleových kyselin a bílkovin v buněčných kulturách. ORC byl testován na několika nádorových buněčných liniích a zvířecích modelech. Testování skončilo ve II. fázi klinických zkoušek. Z nežádoucích účinků se předpokládá mírná hematologická toxicita, nevolnost a pyretická reakce. Ve srovnání s antracykliny nebyla v preklinických studiích prokázána kardiotoxicita (Klener, 2002; Melka, 1994). 2.1.2.1.5 G2/M-fáze Albendazol (ABZ) patří do skupiny benzimidazolů. Toto anthelmintikum má široké spektrum účinku ve veterinární i humánní medicíně při prevenci a léčbě infekcí způsobených nebo přenášených parazity. Další benzimidazol flubendazol (FLU) je používán jako anthelmintikum pro léčbu intestinálních parazitů a systémových infekcí způsobených červy ve veterinární medicíně, v Evropě je registrován v humánní medicíně pro léčbu intestinálních nematod. Mechanismus působení benzimidazolů je 15

inhibice

aminopeptidasove aktivity a glutamátového

katabolismu,

redukce příjmu

glukózy, zvýšení hladiny vnitrobuněčného vápníku a inhibice polymerizace tubulinu. U ABZ se nyní zjišťuje protinádorová aktivita např. u hepatocelulárního karcinomu, metastatických melanomových buněk a buněk malobuněčného karcinomu plic. U FLU byla pozorována jeho potenciální protinádorová aktivita např. u myelomových a leukemických buněčných linií. K nežádoucím účinkům benzimidazolů patří mírná hepatotoxicita, leukopenie, vypadávání vlasů a zažívací obtíže (Pourgholami et al., 2001; Patel et al., 2011; Mackenzie a Geary, 2011;Spagnuolo et al., 2010; Santivanez a Garcia, 2010). Paklitaxel (PTX), známý také pod obchodním názvem Taxol, patří do skupiny taxanů, přírodních diterpenoidů. Je izolován z tisu Taxus brevifolia. PTX se navazuje na β-tubulinové podjednotky mikrotubulů a tímto způsobem inhibuje jejich depolymerizaci zpět na tubulin. Zásahem do funkce mikrotubulů je inhibice mitózy. Polosyntetickým derivátem PTX je docetaxel. PTX je používán při léčbě karcinomu prsu, vaječníků a určitých forem karcinomu plic, často se používá v kombinaci s jinými cytostatiky. Docetaxel je využíván zejména při léčbě karcinomu prostaty. U pacientů léčených PTX se objevují reakce z přecitlivělosti, neutropenie či periferní neuropatie (Pribylova et al., 2010; Lüllman et al., 1997; Schiff et al., 1979). Vinblastin a vinkristin patří mezi vinca alkaloidy a získávají se z rostliny Vinca rosea. Váží se na konce mikrotubulů a způsobují jejich depolymerizaci. Důsledkem je zastavení buněčného cyklu v G2/M fázi a metafázi, inhibice buněčné proliferace a indukce apoptózy. Tyto látky se používají k terapii akutní leukemie a dalších hematologických malignit v kombinaci s dalšími cytostatiky, nebo radioterapií. Jejich hlavním nežádoucím účinkem je neurotoxicita. Větší uplatnění v terapii karcinomu prsu, plic a ovaria našel polosyntetický derivát vinorelbin, který je i méně neurotoxický ve srovnání s vinkristinem (Klener et al., 2010; Lullman et al., 1997; Skladanowski et al., 2005; Sui a Fan, 2005; Lowrey a Eastman, 2010). Etoposid a tenipozid jsou polosyntetické deriváty podofylotoxinu a patří mezi inhibitory toposiomerasy II. Používají se k léčbě malobuněčného karcinomu plic, leukémie, lymfomů, testikulárních nádorů, intrakraniálního maligního tumoru a dalších. Mezi nežádoucí účinky patří myelosuprese, hypersenzitivita a gastrointestinální toxicita (Zhang et al., 2013; Schonn et al., 2010; Li et al., 2006).

16

2.1.2.1.6 M-fáze Kolchicin je alkaloid izolovaný z rostliny Colchicum autumnale. Jde o velmi účinný mitotický jed, který působí na mikrotubuly dělícího se vřeténka a narušuje tak správný rozchod chromosomů při mitóze, resp. v metafázi. Kolchicin také snižuje motilitu a aktivitu neutrofilů a působí tak protizánětlivě. Některé semisyntetické deriváty kolchicinu jsou méně toxické. Využívá se k léčbě chronické myeloidní leukémie, nebo při léčbě záchvatů dny a jako antiuretikum. Z nežádoucích účinků se nejčastěji objevuje nevolnost, zvracení a abdominální bolesti. Vysoké dávky provází gastrointestinální hemoragie a poškození ledvin (Sivakumar, 2012; Dale et al., 2007). Prokarbazin inhibuje syntézu DNA, RNA a proteinů a působí zejména v interfázi mitózy buněčného cyklu. Jeho efekt je zprostředkován produkcí aktivních metabolitů. Používá se zejména při léčbě Hodgkinovy choroby a nádorů CNS. Nejčastější vedlejší efekty jsou gastrointestinální poruchy, myelosuprese a nežádoucí vliv na CNS. V kombinaci s alkoholem může způsobovat disulfiramový efekt, zvyšuje efekt barbiturátů, fenothiazinů a narkotik, která jsou běžně metabolizována enzymy CYP450 (Dale et al., 2007; Armand et al., 2007).

17

Tab. 1: Působení fázově specifických cytostatik na jednotlivé fáze buněčného cyklu. Fáze

Léčivo

Mechanismus účinku

G1

Doxorubicin

Interkalace

Daunorubicin

mezi

DNA,

inhibice

Karcinom

prsu,

ovaria,

topoisomerasy II, tvorba ROS.

neuroblastom, osteosarkomy.

Interkalace mezi DNA, inhibice

Lymfoblastická a myeloblastická

topoisomerasy Aktinomycin D

Aplikace

Interkalace

II,

mezi

tvorba DNA,

ROS.

zabráňuje

leukemie. Dětské malignity.

transkripci.

G1/S

S

Metotrexát

Inhibice

syntézy

purinu,

inhibice

ALL,

non-Hodgkinův

lymfom,

reduktasy kyseliny dihydrolistové.

nádory krku a hlavy.

5-Flurouracil

Inhibice rekuktasy kyseliny listové.

Nádory pankreatu a kolorekta.

6-Merkaptopurin

Inhibice

ALL, imunosupresivum.

syntézy

purinu,

inhibice

nukleotidové interkonverze. Hydroxyurea

Inhibice ribonukleotidové reduktázy,

Polycytemia vera.

syntézy DNA. Mitomycin C

Tvorba ROS.

Gynekologické a GIT nádory.

Cytarabin (Ara-C)

Inhibice DNA polymerasy, inhibice

AML, non-Hodgkinův lymfom.

RNA funkce, tvorba ROS.

G2

Bleomycin

Poškození DNA a zábrana oprav.

Nádory zárodečných buněk.

Oracin

Interkalace

-

mezi

DNA,

inhibice

replikace a transkripce.

G2/M Albendazol Flubendazol

Inhibice polymerizace tubulinu.

Anthelmintikum,

experimentálně

Inhibice polymerizace tubulinu.

hepatocelulární,

melanomové

buňky, leukemické bun. Linie. Paklitaxel

Inhibice depolymerizace mikrotubulů.

Karcinom prsu, vaječníků, plic.

6-Merkaptopurin

Inhibice

ALL, imunosupresivum.

syntézy

purinu,

inhibice

nukleotidové interkonverze. Vinkristin

Inhibice polymerizace tubulinu.

Hematologické malignity, akutní

Vinblastin

Inhibice polymerizace tubulinu.

leukemie.

Etoposid,

Inhibice topoisomerasy II.

Malobuněčný

plic,

leukemie, lymfomy, nádor varlat.

Tenipozid

M

karcinom

Vinkristin

Inhibice polymerizace tubulinu.

Hematologické malignity, akutní

Vinblastin

Inhibice polymerizace tubulinu.

leukemie.

Kolchicin

Inhibice polymerizace tubulinu.

CML, antiuretikum.

Cytarabin (Ara-C)

Inhibice DNA polymerasy, inhibice

AML, non-Hodgkinův lymfom.

RNA funkce. Prokarbazin

Inhibice DNA a RNA syntézy.

Hodgkinův lymfom, nádory CNS

18

2.1.2.2 Fázově nespecifická cytostatika Jsou účinná v průběhu celého buněčného cyklu. Patří mezi ně např. alkylační cytostatika. Alkylační cytostatika obsahují chemické skupiny, které mohou tvořit kovalentní vazby s nukleofilními částicemi v buňce. Většina alkylačních cytostatik je bifunkčních, tj. mají dvě alkylační skupiny, které interagují s DNA a její poškození způsobí smrt buněk. Cyklofosfamid je pravděpodobně nejpoužívanější alkylační cytostatikum. Na aktivní formu je metabolizován v játrech. Výrazně působí na lymfocyty, proto se používá u chronické lymfatické leukemie, mnohočetného myelomu a může být používán jako imunosupresivum. Je součástí kombinované chemoterapie např. u karcinomu prsu. Mezi nežádoucí účinky patří nevolnost a zvracení, útlum kostní dřeně a hemoragická cystitida. Karmustin je v tucích rozpustné nitrosomočovinové cytostatikum, které může procházet hematoencefalickou bariérou. Z tohoto důvodu může být proto používáno v léčbě mozkových nádorů a nádorů mozkových blan. Nevýhodou je těžký útlum kostní dřeně již 3-6 týdnů po zahájení léčby. Cisplatina je analogem alkylačních cytostatik a působí na buňky i stejným mechanismem. Je využívána zejména při léčbě karcinomu varlat a vaječníků. Způsobuje těžkou nefrotoxicitu, velmi často vyvoláva nevolnost, zvracení a slabou myelotoxicitu. Pro nižší nefro-, neuro- a ototoxicitu je někdy používán derivát cisplatiny – karboplatina (Dale et al., 2007, Bast et al., 2000).

19

2.2 Možnosti zvýšení účinku cytostatik Ačkoliv o výskytu zhoubných nádorů jsou zmínky již v prehistorické době, dlouhou dobu zůstávala jedinou léčebnou metodou léčba chirurgická. Později došlo k rozšíření léčby o radio- chemo- či imunoterapii a začaly se zveřejňovat také příznivé zkušenosti se vzájemnou kombinací různých metod. Konvenční chemoterapií lze ovlivnit především proliferaci, replikaci a apoptózu nádorových buněk, cílená terapie může více či méně selektivně zasáhnout i do dalších deregulovaných procesů jako je invazivita, metastazování, angiogeneze, sebeobnova, diferenciace aj. V poslední době se často při chemoterapii užívají různé kombinace cytostatik s různým mechanismem účinku, což v mnoha případech přináší výrazné zvýšení účinnosti léčby (Klener a Klener, 2010). Přesto jsou stále hledány nové přístupy, jak zvýšit citlivost nádorových buněk na protinádorovou chemoterapii a zároveň chránit zdravou tkáň. Mezi nejvíce zkoumané přístupy patří: 

selektivní transport cytostatik pouze do nádorových buněk



aktivace proléčiva na účinné cytostatikum uvnitř nádorové buňky



snížení deaktivace cytostatika nádorovou buňkou



snížení efluxu cytostatika nádorovou buňkou

Pro selektivní transport cytostatik do nádorových buněk jsou používany látky, které po navázání na léčivo fungují jako nosiče nebo navigátory ke specifickým strukturám a pomáhají při vstupu cytostatika do buňky. Dvě základní strategie cíleného transportu cytostatik jsou: enkapsulace do liposomů a konjugace se specifickou molekulou. 2.2.1 Liposomální enkapsulace Liposomy

(fosfolipidová

dvojvrstva)

je

nejpokročilejší

forma

nosičů

chemoterapeutik. Obecně platí, že liposomální enkapsulace mění farmakokinetiku a biodistribuci léčiv.

Liposomální enkapsulace

chemoterapeutik

redukuje

distribuční

objem a výrazně zvyšuje akumulaci v nádorové tkáni. Pro mnoho chemoterapeutik je nespecifická in vivo distribuce často výsledkem významné akumulace v kostní dřeni, která vede k těžké myelosupresi a jiným obvyklým nežádoucím toxickým vlivům závislým na dávce. Největším problémem použití liposomální formy je dlouhodobá stabilita a obtížná příprava sterilních liposomů. Ačkoliv účinnost extravazace se liší

20

v závislosti

na

umístění

nádoru

a

různých

fyzikálně-chemických

vlastnostech

liposomálních nosičů, včetně velikosti a povrchového náboje, maximální akumulace dlouho cirkulujících liposomů v tumoru byly zjištěny zhruba 24-48 hod po podání. Nejčastěji studovanými cytostatiky upravovanými do formy liposomů jsou antracykliny. V případě DOX, nespecifická distribuce a zvýšená hladina DOX v srdci vede k poškození srdečních myofilament a inhibici srdečních enzymů. Liposomální forma

DOX

kardiotoxicitu

snižuje.

Pro

klinické

použití

existují

dvě

formy

liposomálního DOX lišící se obsahem polyethylenglykolu (PEG): tzv. „nePEGylovaný“ DOX (Myocet®) a „PEGylovaný“ DOX (Caelyx® a Doxil®). Obě dvě formy mají rozdílné farmakokinetické a toxicitní profily. PEGylovaná forma DOX chrání liposomy před zachycením mononuklárním-fagocytárním systémem. V Evropské unii a Kanadě je PEGylovaný DOX schválen pro použití jako monoterapie při metastatickém karcinomu prsu. Při použití nePEGylovaného DOX se hladina celkového DOX v krvi podstatně zvýší a jeho clearence je mnohem pomalejší, než u konvenční formy, avšak ne tak pomalá

jako

vychytávání

u formy PEGylované.

Problémem nePEGylované

mononukleárním-fagocytárním

systémem.

formy je také

V Evropské

unii

se

nePEGylovaná forma používá v kombinaci s cyklofosfamidem jako první volba pro pacienty s metastatickým karcinomem prsu, ve Spojených státech je v současné době předmětem řízení pro používání na další typy nádorů (Harris et al., 2002; Theodoulou et al., 2004; Leonard et al., 2009; Robert et al., 2004). Jedním z nejvýraznějších omezení použití PTX je jeho nízký terapeutický index a špatná rozpustnost ve vodě. Komerční preparát paclitaxelu (Taxol®) je navázán na nosič složený z Cremophor EL® (polyethoxylovaný ricinový olej použitý jako solubilizační detergent) a dehydratovaného ethanolu. Nežádoucí vedlejší efekt zahrnuje vážnou hypersenzitivní reakci, nefrotoxicitu a neurotoxicitu a omezuje použití ve vyšších dávkách, které mohou být terapeuticky výhodné. Kvůli nedostatkům spojených s konvenčními formami PTX byl zaznamenán vývoj několika nových forem PTX, které jsou buď bez použití Cremophor-EL®, jako je ABI-007 (nanopartikulární forma PTX) a Genexol-PM®,

nebo

deriváty vyrobeny s malým množstvím Cremophor-EL® pro

zvýšení bezpečnosti jako je BMS-184476. Preparáty založené na konvenčních liposomech reprezentují první generaci liposomálního enkapsulovaného PTX. Druhá generace liposomálního enkapsulovaného PTX je založena na tzv. aktivních liposomech (kationické a ligand-cílené), které jsou ve vývoji v různých stádiích preklinických a klinických studií. Příkladem může být nová 21

forma kationického liposomálního PTX – EndoTAG-1, který byl vyvinut pro léčbu solidních tumorů. Působí cílenou aktivací negativně nabitých endoteliálních buněk nádorových cév. Inkorporace PTX do liposomů eliminuje hypersenzitivní reakci spojenou s Cremophor EL®, ale také snižuje toxicitu na zdravé tkáně při podstatném zvýšení maximální tolerované dávky v testech in vitro i in vivo. Zároveň působením enkapsulovaného PTX dochází až k dvacetinásobnému snížení embryotoxicity oproti působení konvenčního PTX. Použitím PEGylovaných liposomů dochází ke snížení vychytávání léčiva v játrech a slezině. Při porovnání konvenční, nanopartikulární a liposomální formy PTX na cytotoxickou účinnost se liposomální forma ukazuje jako stejně účinná nebo ještě účinnější (Ceruti et al., 2000; Sampedro et al., 1994; Bartoli et al., 1990; Surapaneni et al., 2012; Lim et al., 2010; Loehr et al., 2009). Vinca alkaloidy jsou v liposomální formě méně stabilní in vivo v porovnání s více

studovanými

antracykliny.

DOX

je

vysoce

stabilní

uvnitř

liposomů

a

k uvolňování DOX z liposomů in vivo dochází v rámci asi 100 hod. Použitím stejného složení lipidů a stejné strategie přípravy jako u liposomálního DOX docházi k uvolnění vinca alkaloidů již kolem sedmnácté hodiny. Rychlé uvolnění z nanočástic je nepříznivé pro schopnost léku těžit z tzv. „EPR efektu“ (enhanced permeability and retention effect) v léčených solidních tumorech. Pro zlepšení stability liposomů in vivo bylo vyvinuto

několik

forem.

Sfingomyelin

byl úspěšně

nahrazen

za

fosfatidylcholin

v liposomech s vinkristinem obsahujících cholesterol k omezení difuze léčiva skrz membránu a tím došlo k téměř dvojnásobnému zvýšení poločasu vinkristinu z 17 na 33 hodin. Tyto „Sfingosomy“ (Hana Biosciences - South San Francisco, CA) jsou v současné lymfoblastické

době

používány

leukémie.

pro

Použitím

léčbu

non-Hodgkinova

kombinace

lymfomu

sfingomyelin/cholesterol

a

akutní

s vysokým

poměrem léčivo/lipid se pravděpodobně zvýší rozpustnost produktu léčiva uvnitř liposomů a stabilita liposomálního vinkristinu může vzrůst až na T1/2 = 65 hodin. Na druhou stranu, dochází k nežádoucím důsledkům jako je velmi rychlá clearence a vychytávání mononukleárním fagocytárním systémem. Kationická léčiva, jako např. vinca alkaloidy, jsou účinkem oktasulfátu sacharosy imobilizována uvnitř liposomů. Dochází ke zlepšení výměny kationu za léčivo

přes

liposomální membránu

během nanášení léčiva.

Takto

připraveným

liposomům se říká nanoliposomy. Tato forma vinblastinu je výrazně stabilnější než dříve popsaná sfingosomální forma. Pro vinkristin i vinblastin je stabilita dostatečná k akumulaci v solidním tumoru a je tak plně využit EPR fenomén. Zároveň dochází k 22

prodloužení

cirkulace.

enkapsulovaných

K dalšímu

zlepšení

chemoterapeutik

se

protinádorové

využívá

tzv.

aktivity

liposomálně

imunoliposomů,

liposomů

konjugovaných s protilátkou např. proti HER2/neu. Výrazně vyšší účinnost byla pozorována také u HER2 cílených nanoliposomů vinkristinu oproti necíleným. Použitím cílených nanoliposomů je možné rozšíření léčebného spektra vinca alkaloidů na další typy solidních tumorů (Noble et al., 2009; Webb et al., 1995; Johnston et al., 2006). Vodozova et al. (2008) vytvořili liposomální formu MTX připravenou ze směsi přírodních

fosfolipidů

a

proléčiva

(fosfatidylcholin-fosfatidylinositol-proléčivo

v poměru 8:1:1). Výsledky z in vitro testů ukazují, že použitím liposomální formy MTX je možné překonat buněčnou rezistenci, která souvisí s poruchou transmembránového transportu. Léková rezistence leukemických buněk, související se snížením aktivity folátového transportéru, je u liposomálního MTX nižší ve srovnání s parentním léčivem. Hong et al. (2001) zjišťoval vliv složení liposomálního MTX na celkovou clearence.

Různé složení liposomů připravených z fosfatidylcholinu a cholesterolu

v PEGylované či nePEGylované formě

výrazně snižovalo clearence ve srovnání

s konvenčním MTX. Při použití liposomální formy, obzvláště pak PEGylované, byla zjištěna menší akumulace MTX v ledvinách, kde obvykle způsobuje jejich vážnou toxicitu. Liposomální MTX prodloužil cirkulaci léčiva v krvi a snížil jeho vychytávání v játrech, slezině a ledvinách. Použití liposomální formace má šanci na klinické uplatnění nejen pro MTX, ale také další polární protinádorová léčiva v léčbě nádoru CNS (Vodozova et al., 2008; Noble et al., 2009; Woo et al., 1983; Hong et al., 2001). Thomas et al. (2011) použil novou technologii vnesení 5-FU do liposomu použitím ternárního komplexu obsahujícího měď. Použitou liposomální formou došlo ke snížení velikosti nádoru (zejména u koncentrace 20 mg/kg), ve srovnání s léčbou samotným 5-FU při použití stejné koncentrace. Použití 5-FU, stejně tak výše uvedené liposomální formy, způsobuje toxicitu GIT, což se projevuje i na ztrátě tělesné hmotnosti. Dalším omezením 5-FU je léková rezistence a těžká toxicita. Fanciullino et al. (2013) vyvinul liposomální formu 5-FU kombinovanou s 2´-deoxyinosinem a kyselinou listovou pro zlepšení rovnováhy účinnost-toxicita. Antiproliferační aktivita liposomů, tzv. Lipofufolu, byla testována na lidských kolorektálních a prsních nádorových modelech

použitím

liposomální

formy

senzitivních byl

a

pozorován

resistentních vyšší

buněčných

antiproliferační

liniích.

účinek

Při

použití

než při léčbě

konvenčním 5-FU. In vivo studie, provedená na hlodavcích, ukázala nižší clearence a 23

prodloužený poločas léčiva. Pomocí fluorescenčního mikroskopu byla zjištěna vyšší akumulace léčiva v tumoru. U myší s kolorektálním karcinomem léčených Lipofufolem bylo dosaženo o 55 % delší přežití, než u zvířat léčených konvenční formou. Z nežádoucích účinků se u léčby Lipofufolem objevila lehčí neutropenie ve srovnání s použitím volného 5-FU (Thomas et al., 2011; Fanciullino et al., 2013). Hlavním omezením podání etoposidu je jeho silná lipofilita a použité nosiče, jako

např.

solubilizátory,

často

způsobují nežádoucí efekty.

Bylo

zjištěno,

že

enkapsulovaný etoposid byl po i.v. podání účinný a zároveň byl zjištěn pokles hematologické

toxicity.

Etoposid

se používá zejména při léčbě

malobuněčného

karcinomu plic a proto je výhodné liposomy specificky cílit na alveolární makrofágy pro zlepšení vychytávání léčiva. Liposomy jsou zároveň kompatibilní s částmi plicního surfaktantu. Liposomální forma etoposidu v plicích zajišťuje lepší zadržení léčiva, stejně tak snížení jeho biodistribuce a tím se snižuje výskyt nežádoucích efektů. Dlouhodobé uvolňování liposomálního etoposidu může poskytnout prodloužený efekt léčiva a tím i lepší protinádorovou aktivitu. Dalšími studiemi bylo zjištěno, že enkapsulace etoposidu do kationického liposomu výrazně zpomaluje

růst tumoru u myší s fibrosarkomem v porovnání

s neliposomálním etoposidem. V obou skupinách byl pozorován přechodný pokles hmostnosti.

Maximální tolerovaná dávka byla výrazně vyšší ve skupině léčené

liposomálním etoposidem, kde byl zároveň zjištěn nižší stupeň myelosuprese, než u zvířat ve skupině léčené neliposomálním etoposidem (Parmar et al., 2011; Sengupta et al., 2001, Sistla et al., 2009). 2.2.2 Konjugace se specifickou molekulou V poslední dekádě bylo vyvinuto mnoho protinádorových léčiv, která jsou navázána na specifickou molekulu, která by měla donést cytostatikum pouze do nádorových buněk. Tato strategie by mohla zvýšit selektivitu terapie vůči nádoru a snížit toxicitu vůči zdravé tkáni. 2.2.2.1 Konjugace s protilátkou Slibnou strategií pro zvýšení aktivity cytostatik je konjugace s protilátkami. Jedná se o cílenou terapii, při níž protilátka zprostředkovává doručení cytostatika přímo k nádoru. Problémem je imunogenicita těchto léčiv a nedostatek povrchových antigenů, které by zajistily specifický příjem pouze v nádorové buňce. Některé antigeny jsou

24

většinou exprimovány na povrchu nádorových buněk ve zvýšené míře a na normální tkáni pouze omezeně (Senter, 2009; Carter a Senter, 2008). Dosud

bylo

připraveno

několik

cytostatik

konjugovaných

s protilátkou.

Příkladem je BR96-doxorubicin, který byl cílen na LeY tetrasacharidový antigen na lidských karcinomech. Mechanismus účinku je stejný jako u konvenčního DOX. V obou klinických studiích byla zjištěna pouze mírná protinádorová aktivita a krátký poločas, a proto se odstoupilo od používání (Carter a Senter, 2008). Přírodní antibiotikum kalicheamicin bylo významným objektem pro studium cílení léčiv, díky své schopnosti vázat se na DNA a účinku zabíjet buňky při koncentracích běžně používaných při chemoterapii. Imunokonjugát kalicheamicinu a antiCD33 monoklonální protilátky, Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg), byl vyvinut na léčbu akutní myeloidní leukémie. Výrazná protinádorová aktivita byla také zjištěna s monoklonální protilátkou navázánou na kalicheamicin např. na CD22 lymfomech a epiteliálních nádorech již ve velmi nízkých dávkách (2 mg/kg) (Carter a Senter, 2008). Auristatin je syntetické antimitotické agens, které je při samostatném použití velmi toxické a proto se používá navázané s monoklonální protilátkou (mAb-MMAE). Auristatin působí inhibici polymerizace tubulinu. Protilátky se používají přímo proti CD30 antigenu na Hodgkinově chorobě, prostatický specifický membránový antigen na karcinomu prostaty, nebo LEY antigen na různých karcinomech (Alley et al., 2009). Maytansin a jeho analogy (maytansinoidy) jsou účinnými látkami, které inhibují proliferaci buněk v mitotické prometafázi/metafázi. Konjugáty maytansinoidů (DM1 a DM4) s protilátkou se ukazují jako slibné klinické řešení léčby nádorů. Volné maytansinoidy,

konjugáty

a

jejich

metabolity

působí

mechanismem

tubulinové

depolymerizace. Tyto konjugáty působí např. na Can antigen na kolorektálním karcinomu, CD33 na leukemických buňkách, nebo prostatický specifický membránový antigen na karcinomu prostaty (Oroudjev et al., 2010). Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg) je jediná klinicky schválená konjugovaná protilátka. Po jeho schválení vstoupilo do klinických zkoušek mnoho dalších, zejména konjugáty s auristatinem (SGN-35, CRO11-vc-MMAE), s maytansinem (TrastuzumabDM1; AVE9633; HuC242-DM4; HuN901-DM1) a s kalicheamicinem (Inozutumab Ozogamicin) (Carter a Senter, 2008). Safavy et al. (2003) konjugovali PTX s monoklonální protilátkou (Erbitux, C225) proti receptoru epidermálního růstového faktoru. Porovnávali cytotoxický efekt PTX,

konjugátu PTXC225 a směsi PTX a C225 na buněčné linii lidského 25

spinocelulárního karcinomu A431 a nádorových buňkách hlavy a krku UM-SCC-1 a UM-SCC-6.

V buněčné linii A431 bylo prokázáno zvýšení apoptózy o 25 %

v porovnání se směsí PTX a C225. V experimentech in vivo byla zjištěna inhibice růstu tumoru v porovnání s neléčenou kontrolou, nebyl však pozorován výraznější rozdíl oproti léčbě volným PTX. Během experimentu nedošlo ke vzniku imunoreaktivity vůči PTXC225. 2.2.2.2 Konjugace s hormony Dalším

intenzivně

studovaným

mechanismem

pro

zvýšení

selektivity

chemoterapie je kovalentní připojení chemoterapeutika k různým hormonům, jejichž receptory jsou exprimovány na povrchu nádorových buněk. Hypotalamický hormon gonadotropní hormon (LH-RH) je primární regulátor gonádových funkcí a reprodukce u obratlovců. Vysoká hladina tohoto hormonu byla zjištěna v některých nádorech pohlavních orgánů, jako jsou nádory prsu, prostaty a také v nádorech, které nepřímo souvisí s hypofýzou, jako např. nádory pankreatu, ledviny, jater, CNS, nebo melanomech. LH-RH receptory jsou exprimovány také na zdravých pohlavních orgánech, ale v mnohem menší míře v porovnání s expresí nádorovými buňkami. Tato zjištění dělají z LH-RH receptoru vhodný cíl pro chemoterapeutika konjugovaná s LH-RH (Szepeshazi et al., 2007). AN-152 je konjugát, ve kterém je LH-RH kovalentně vázaný s DOX. Günthert et al. (2004) zjistili, že tento analog je mnohem účinnější než samotný DOX v indukci apoptózy u prsní buněčné linie pozitivní na LH-RH receptor in vitro. Při experimentech in vivo byl účinnější proti LH-RH receptor pozitivnímu nádoru, kde byla zároveň zjištěna

nižší toxicita,

než při použití konvenčního

DOX.

Dalším testovaným

konjugátem DOX a LH-RH je AN-207 a AN-201. Z nežádoucích účinků těchto konjugátů bylo pozorováno selektivní, ale přechodné poškození gonadotropních buněk hypofýzy vlivem AN-207. AN-201 působil neselektivně poškození hypofyzární funkce luteinizačního hormonu (LH), růstového hormonu (GH) a tyreotropního hormonu (TSH). Bylo prokázáno, že AN-207 snižuje hladinu mRNA pro LH-RH receptor v hypofýze potkana. Použitím AN-152 byl popsán efekt snížení hladiny LH-RH receptoru na nádoru prostaty. Emons et al. (2010) připravili konjugát DOX navázaný na [D-Lys6 ]LH-RH a testoval tento konjugát u žen s LH-RH receptor pozitivním tumorem, kde byly zjištěny velmi slibné výsledky a konjugát byl navržen pro II. fázi klinické

26

studie (Szepeshazi et al., 2007; Gunthert et al., 2004; Nagy and Schally, 2005; Emons et al., 2010). Somatostatin (SST) je dalším hormonem, jehož receptory byly detekovány na povrchu mnoha nádorových buněk. Několik experimentálních studií zjistilo inhibici růstu některých malignit při použití somatostatinu a jeho oktapeptidového analogu. Příkladem je analog AN-238, který inhiboval růst myšího karcinomu prsu nezávislého na estrogenu a MDA-MB-231 lidského prsního nádoru nezávislého na estrogenu u imunodeficitních myší (Florent a Moneret, 2008). K receptoru somatostatinu, zejména podtypu 2, má vysokou afinitu také oktreotid, který je exprimován ve zvýšené míře na mnoha nádorových buňkách. Zhang et al. (2010) vytvořil konjugát oktreotidu se stericky stabilizovanými liposomy. Použitím tohoto konjugátu došlo ke zvýšení intracelulárního transportu DOX do buněk pozitivních

na somatostatin receptor 2

zprostředkované

receptorem.

(SSTR2),

díky mechanismu endocytózy

Zároveň byla zvýšena cytotoxicita v těchto SSTR2

pozitivních nádorových buňkách, zvýšila se kumulace léčiva v nádorové tkáni a došlo ke zlepšení protinádorové účinnosti v nádorovém modelu se zvýšenou expresí SSTR2 (Zhang et al., 2010). Dalším zajímavým cílem pro protinádorovou terapii je receptor lidského choriogonadotropinu (hCG), který umožňuje přímý transport k nádorové buňce. Po navázání na hCG receptor, je celý komplex přenesen do buňky. Gebauer et al. (2003) porovnával vliv DOX, směs DOX-hCG, konjugát DOX-hCG a konjugát DOX-albumin na ovariálních nádorových buňkách a prsních nádorových buňkách. Při použití konjugátu bylo pozorováno zvýšení účinnosti DOX. Toto zvýšení toxicity nebylo zjištěno u buněčné linie bez hCG receptoru (Gebauer et al., 2003; Janssens et al., 2007). Zvýšení účinnosti PTX pomocí konjugace s hormonem byla zatím popsána pouze s oxytocinem. Oxytocin je hypotalamický nonapeptidový hormon, který kromě fyziologické funkce hraje důležitou roli v nádorové tkáni odvozené z některých orgánů. Mnoho prsních nádorových buněčných linií, včetně MCF7, exprimuje ve zvýšené míře specifický G-protein spojený s povrchovým receptorem vázající oxytocin (OTR) na úrovni RNA i proteinu. Zvýšená exprese OTR na povrchu nádorových buněk znamená důležitý cíl pro specifickou protinádorovou léčbu. Konjugace PTX s PHEA (α,βpoly(N-2-hydroxyetyl)-DL-aspartamid) se ukázal jako stabilní v plazmě a schopný prodlouženého uvolňování léčiva při pH 5,5. V experimentech in vitro bylo prokázáno,

27

že připravený konjugát s cílenou skupinou je mnohem účinnější a specifičtější, než léčivo bez této skupiny (Cavallaro et al., 2007). 2.2.2.3 Konjugace se syntetickými polymery Další možností,

jak

s rozpustnými polymery.

zvýšit účinnost a specifitu cytostatik

Nejzajímavějším kopolymerem,

je konjugace

který byl syntetizován a

testován je N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA). V I. a II. fázi klinických zkoušek kombinace HPMA kopolymeru s DOX způsobila čtyři až pětkrát nižší toxicitu, než antracykliny a při použití vyšší kumulativní dávky nebyla pozorována kardiotoxicita (Duncan et al., 2005). Vincent et al. (2005) testoval

HPMA

kopolymer-DOX

aminoglutetimidem (HPMA-DOX-AGM). zvyšoval

cytotoxicitu

ve

s navázaným Ukázalo

srovnání s HPMA

se,

inhibitorem že tento

kopolymerem-DOX,

aromatás

konjugát značně pravděpodobně

prostřednictvím inhibice aromatasy díky použitému AGM (Greco et al., 2005; 2007). Použití HPMA kopolymeru s

PTX a kamptotecinem v klinické studii

neukázalo výraznější efekt. V obou případech to bylo pravděpodobně z důvodu nestability

esterové

vazby

během

cirkulace

a

vylučováním ledvinami.

HPMA

kopolymer-PTX způsoboval stejnou toxicitu jako PTX nenavázaný. Zároveň byly pozorovány

běžné

nežádoucí

účinky

jako

lehká

nevolnost,

zvracení,

lehká

hematologická toxicita a neuropatie (Duncan et al., 2005). Pro konjugaci s HPMA kopolymerem bylo použito několik dalších cytostatik, včetně struktur cisplatiny, karboplatiny a oxaliplatiny. V in vitro testech na myších melanomových

buňkách

byla

zjištěná

hodnota

IC 50

10 µg/ml.

In

vivo

byla

protinádorová aktivita hodnocena na myším melanomovém tumoru a myší lymfocytární leukemii, kde po i.v. podání konjugátu HPMA kopolymer-cisplatina se v obou případech projevila značná protinádorová aktivita, ve srovnání s volnou cisplatinou, která aktivní nebyla. S použitím konjugátu bylo možno použít vyšší léčebnou dávku oproti léčbě volnou cisplatinou (Gianasi et al., 1999; 2002). V posledních letech bylo připraveno mnoho konjugátů DOX se syntetickým polymerem.

Např. Lu et al. (2009) připravil syntetický konjugát III s dvěma

hydrofilními řetězi a dvěma jednotkami DOX, Liu et al. (2010) syntetizoval konjugát fulleren-DOX, nebo Cao a Feng (2008) připravili konjugát DOX a D-α-tokopheryl glykol 1000 sukcinát. Ve všech připravených konjugátech byl zjištěn výraznější

28

cytotoxický efekt na nádorových buňkách in vitro, v porovnání s použitím volného DOX. Chen et al. (2005) stanovoval protinádorovou aktivitu PTX konjugovaného s bicyklickým peptidem E[c(RGDyK)](2) (RGD) v metastatické buněčné linii MDAMB-435. RGD peptid selektivně váže receptor α(v) integrinu, který je zvýšeně exprimován na povrchu metastatických prsních buněk. Experimenty ukázaly inhibici buněčné

proliferace

v G0/G1

fázi.

Konjugát PTX-RGD i nekonjugovaný PTX

způsobovaly zastavení buněčného cyklu v G2/M fázi a zároveň bylo prokázáno, že specifická vazba zvýšila zabíjení nádorových buněk. Významnou formou konjugace polymeru s PTX je konjugát polyglutamát-PTX, nazývaný Xyotax (Cell Therapeutics, Seattle, WA, USA). Nyní probíhá II/III fáze klinických zkoušek, zaměřená na pacienty s malobuněčným karcinomem plic,

kde je Xyotax použit jako monoterapie, či

v kombinaci s karboplatinou (Li et al., 1998; Auzenne et al., 2002). Zhao et al. (2012) připravil dvanáct konjugátů 5-FU a emodinu. Měřením biologické aktivity se zjistilo, že některé konjugáty měly výraznější nebo srovnatelnou protinádorovou

aktivitu

s pozitivní

kontrolou

a

vykazovaly

nízkou

toxicitu

v normálních buňkách. Například konjugát 7f s benzylem ukázal větší cytotoxicitu na ovariální a žaludeční nádorovou linii a nebyla zjištěna žádná toxicita na normální embryonální

ledvinné

buňky.

Dále

pak

u

sloučeniny

7k

s konjugovaným 2-

cyanobenzylem bylo zjištěno široké spektrum protinádorové aktivity u všech třech testovaných nádorových linií, při zachování velmi nízké toxicity vůči nenádorové linii. Studovaný vztah struktury a aktivity ukázal důležitost přítomnosti N 3 aromatického substituentu na studovaných konjugátech, který zvýšoval cytotoxicitu (Zhao et al., 2012). Singh et al. (2008) ve svém přehledovém článku mimo jiné detailně popsal konjugace léčiv s kyselinou listovou. Proléčivo EC145 syntetizované skupinou Leamon et al. je pravděpodobně nejslibnější cílené folátové proléčivo v klinických studiích. Skládá se z desacetylvinblastin monohydrazidu navázaného ke kyselině listové pomocí redukovatelného disulfidického můstku. V preklinických studiích in vivo byl EC145 mnohem aktivnější a tolerovanější organismem, než volné léčivo a ukázal výraznější protinádorovu aktivitu. Dalším konjugátem kyseliny listové je např. EC17 (Foláthapten), který je nyní v II. fázi klinických zkoušek a EC0225 (Folát konjugovaný s vinca alkaloidy a mytomycinem C), který je v I. fázi klinického testování. Všechny

29

tyto konjugáty jsou cíleny na nádorové buňky exprimující kyselinu listovou (Singh et al., 2008). Dva

konjugáty

v MTX-citlivých

a

polyamidoaminového

MTX-rezistentních

dendrimeru

s MTX

byly

testovány

buňkách akutní lymfoblastické leukemie a

buněčné linie CHO. Konjugát A byl schopen zvýšit protinádorovou aktivitu ve srovnatelné koncentraci použitého volného MTX v citlivé i rezistentní linii, oproti konjugátu B, u kterého nebyla pozorována žádná výraznější aktivita ani u jedné z linií. Z dalších testů bylo zjištěno, že konjugát A působí na enzym dihydrofolátreduktasu stejným mechanismem jako volný MTX (Gurdag et al., 2006). 6-MP konjugovaný s karboxymetylchitosanem (6-MP-CMC) byl syntetizován pro cílený transport 6-MP do buněk. Zhang et al. (2011) zjistili, že uvolnění 6-MP z 6MP-CMC závisí na koncentraci glutathionu (GSH) a pH média. Čím vyšší byla hladina GSH v médiu, tím rychlejší bylo uvolnění 6-MP z připraveného konjugátu. Při použití pufru při pH 7,4 a koncentraci GSH 2 µM nedocházelo k uvolňování 6-MP, zatímco při pH 5,0 a 10 mM koncentraci GSH bylo uvlňování 6-MP z konjugátu velmi rychlé. 2.2.3 Omezení biotransformace cytostatik Enzymy metabolizující léčiva a lékové transportéry jsou klíčovými faktory farmakokinetiky a farmakodynamiky mnoha protinádorových léčiv. Metabolismus a transport ovlivňuje cytotoxický efekt cytostatik v cílových nádorových buňkách a normální tkáni. DOX je biotransformován na DOXOL a aglykony, doxorubicinon a 7deoxydoxorubicinon. Hlavní metabolit DOXOL, který vzniká redukcí karbonylové skupiny na C13 je na rozdíl parentní látky kardiotoxický a méně cytostaticky účinný. Hlavním cílem je proto inhibice biotransformace DOX na tento toxický metabolit. V in vitro testech působily jako inhibitory karbonylreduktasy 1 (CBR1) některé flavonoidy (rutin, quercetin, quercitrin, nebo 7-monohydroxyetyl rutosid), deriváty flavonoidů, menadion a analogy zearalenonu (Carlquist et al., 2008; Erlund et al., 2002; GonzalesCovarrubias et al., 2008; Vaclavikova et al., 2008; Zimmermann et al., 2009). Avšak nízká biologická dostupnost, vysoká hodnota IC 50 nebo systémová toxicita omezují jejich

použití in

vivo.

Zjištěné

antioxidační vlastnosti flavonoidů navíc snižují

cytotoxický efekt DOX. Kaiserová et al. (2007) zjišťovali efekt flavonoidů na neonatálních potkaních kardiomyocytech, kde se po 72hodinové inkubaci snižovala kardioprotekce flavonoidů. Václavíková et al. (2008) zjistili, že v rezistentní prsní

30

nádorové linii NCI-ADR-RES flavonoidy nezpůsobily výraznější cytotoxický efekt na rozdíl od citlivé linie MDA-MB-435. Dalšími enzymy podílejícími se na biotransformaci DOX jsou mikrosomální reduktasy. U pacientů s nádory byl testován vliv cyklosporinu, substrátu CYP3A, na biotransformaci DOX. Při použití nižších dávek cyklosporin ukázal výrazný efekt na snížení biotransformace a exkrece DOX v porovnání s DOX samotným. V další studii zjišťující vzájemné působení cyklosporinu a DOX byla u pacientů s malobuněčným karcinomem plic pozorována zvýšená nevolnost a zvracení. U všech pacientů byla zároveň pozorována zvýšená toxicita související s podáním vyšší dávky cyklosporinu. Dalším substrátem pro CYP3A je i PTX. Pokud byl PTX a DOX podávány zároveň, v plasmě nebyla pozorována změna koncentrace DOX ani PTX. Koncentrace DOXOL byla výrazně vyšší při použití kombinace, což může být způsobeno tím, že PTX inhibuje přeměnu DOXOL na aglykony (Kivistö, 1995). Na redukci DOX se dále podílí i aldoketoreduktasy (AKR). Veitch et al. (2009) popsal, že zvýšená exprese AKR v nádorových buňkách zvyšuje rezistenci k DOX, pravděpodobně z důvodu intenzivnější redukce. Na základě těchto faktů je možno říci, že inhibitory AKR jsou schopny zvýšení účinnosti DOX v nádorových buňkách. Inhibitory AKR1C3 jsou např. deriváty kyseliny skořicové, které jsou zapojeny v regulaci

androgenních

a

estrogenních

prereceptorů

v hormon

dependentních

nádorových buňkách (Brozic et al., 2006). Dalším inhibitorem AKR1C je kyselina 5βcholová, která výrazně zvýšila citlivost k DOX v buňkách rezistentních k DOX bez ABCB1 genu (Veitch et al., 2009). Dalším slibným inhibitorem CBR1 se zdá být pyrazolopyrimidinový derivát hydroxy-PP-Me. Na buněčné linii A549 byla zjišťována schopnost hydroxy-PP-Me zablokovat CBR1 v metabolizaci DAU. DAU je přeměňován CBR1 na daunorubicinol (DAUNOL). V porovnání s DAU samotným byla zjištěna o 25 % vyšší účinnost při použití kombinace DAU a hydroxyl-PP-Me, avšak koncentrace derivátu byla relativně vysoká (4-8 µM) (Tanaka et al., 2005). Z lidské žluči a jaterních mikrosomů byly zjištěny tři hlavní metabolity PTX: 6α-hydroxypaklitaxel, enzymem

3´-p-hydroxypaklitaxel a 6α-3´-p-dihydroxypaklitaxel.

metabolizujícím 6α-hydroxypaklitaxel je

hydroxypaklitaxel

a

6α-3´-p-dihydroxypaklitaxel

CYP2C8 jsou

a

Hlavním

metabolity

biotransformovány

3´-p-

zejména

CYP3A4. Desai et al. (1998) zjistili, že použitím R-verapamilu, tamoxifenu a etoposidu dochází k výrazné inhibici tvorby 6α-hydroxypaklitaxelu a 3´-p-hydroxypaklitaxelu. 31

Dále bylo zjištěno, že použitím DOX se výrazně sníží tvorba 3´-p-hydroxypaklitaxelu a cyklosporin A inhibuje tvorbu 6α-hydroxypaklitaxelu (Desai et al., 1998). Všechny vinca alkaloidy jsou metabolizovány v mikrosomech lidských jater pomocí

CYP3A4.

Vinblastin

je

přeměňován

na

jeden

hlavní

metabolit

deacetylvinblastin. Další vinca alkaloidy vindesin, vinkristin a navelbin, nebo další léčiva jako DOX, etoposid nebo teniposid značně inhibovaly metabolismus vinblastinu. Inhibičním efektem na metabolizaci vindesinu působí stejné látky jako u vinblastinu (Kivistö et al., 1995). Cyklofosfamid je metabolizován na několik metabolitů, přičemž v plasmě a moči byly jako dva hlavní metabolity identifikovány aktivní alkylační agens fosforamid mustard a produkt detoxikace karboxyfosfamid. Reakce je katalyzována cytosolickou aldehyddehydrogenasou (ALDH1). Dalším enzymem podílejícím se na metabolizaci je CYP2B6.

Ovlivnění farmakokinetiky cyklofosfamidu bylo pozorováno při použití

fenobarbitonu a allopurinolu (Tasso et al., 1992; Kivistö et al., 1995). Etoposid a teniposid jsou primárně metabolizovány CYP3A4 a CYP3A5 na katechol. Několik substrátů, jako např. midazolam, erytromycin a cyklosporin byly identifikovány jako silné inhibitory tvorby katecholu z etoposidu i teniposidu. U pacientů

cyklosporin významně ovlivnil farmakokinetiku etoposidu v závislosti na

koncentraci. Kishi et al. (2004) zjistili inhibiční vliv prednisonu na CYP3A, čímž došlo ke zvýšení clearence etoposidu (Kivistö et al., 1995; Kishi et al., 2004). Cyklosporin a blokátory kalciových kanálů mohou mít vliv nejen na inhibici metabolizace cytostatik, ale mohou také sloužit jako inhibitory P-glykoproteinu a efluxních transportérů. 2.2.4 Ovlivnění efluxních transportérů Aktivní

eflux

protinádorových

léčiv

zprostředkovaný

ABC

transportérem

reprezentuje účinnou strategii buněk proti potenciálně škodlivým agens. P-glykoprotein (P-gp) je lokalizován v apikální membráně epiteliálních buněk a patří do skupiny transportních proteinů, které se nazývají efluxní pumpy. Dalšími důležitými efluxními pumpami jsou proteiny vícečetné lékové rezistence MRP1 a 2 a nebo tzv. „breast cancer resistance protein“ (BCRP). Tyto transportéry mohou aktivně přenášet široké spektrum látek ven z buněk, včetně protinádorových léčiv (Tab. 2), imunosupresiv, steroidních hormonů,

blokátorů kalciových kanálů apod.

V nádorových buňkách jsou tyto

transportéry zvýšeně exprimovány a jsou odpovědné za vícečetnou lékovou rezistenci.

32

Krom toho jsou exprimovány i ve zdravé tkáni jater, placenty, proximálním tubulu ledvin, kapilárních endoteliálních buňkách mozku a varlat nebo epiteliálních buňkách střeva. V kombinaci s CYP3A hrají efluxní pumpy důležitou úlohu v detoxifikačním systému a ovlivňují absorpci, distribuci, metabolismus a eliminaci (Werle, 2006). Inhibice efluxních transportérů může být použita pro zlepšení transportu cytostatik do nádorových buněk a jejich akumulaci v nich, na druhou stranu, inhibicí efluxních pump u nenádorových buněk může dojít ke zvýšené akumulaci cytostatik ve zdravé tkáni (Ozben, 2006; Werle 2008). Tab. 2: Přehled efluxních transportérů vybraných cytostatik (Pharmacology weekly – přehled efluxních transportérů). Transportér

BCRP

BSEP

MDR1/PgP

MDR3

MRP2

MRP3

MRP4

MRP5

MRP6

Gen

ABCG2

ABCB11

ABCB1

ABCB4

ABCC2

ABCC3

ABCC4

ABCC5

ABCC6

5-fluorouracil

+

+

Cisplatina

+

Kolchicin

+

+

Daunorubicin

+

+

Docetaxel

+

+

Doxorubicin

+

+

Etoposid

+

+

Idarubicin

+

+

+

Mercaptopurin Metotrexát

+ +

+

Paklitaxel

+

Teniposid

+

Topotekan

+

+

+

+

+

Vinblastin

+

+

Vinkristin

+

Vindesin

+

+

2.2.4.1 Přírodní inhibitory efluxních transportérů Různé inhibitory efluxních pump se nacházejí v přírodě a jsou zejména rostlinného původu. Sadzuka et al. (2010) prokázal vliv kukurbitacinu, rostlinného steroidu, na inhibici efluxu DOX a zvýšení hladiny DOX uvnitř ovariálního sarkomu M5076. Navíc

33

použití kombinace kukurbitacinu s DOX snižovala akumulaci DOX ve zdravé tkáni. Flavonoid 5,7-dimethoxyflavon významně působil stimulaci akumulace a cytotoxicity DOX v linii rezistentní k DOX A549 se zvýšenou expresí MRP1 a 2 (Patanasethanont et al., 2007). Další flavonoid naringenin také zvyšoval buněčnou akumulaci DOX prostřednictvím selektivní inhibice MRP1. 100 µM koncentrace naringeninu navíc zlepšovala citlivost buněk MCF7 k DOX, kde hodnota IC 50 DOX a jeho kombinace s naringeninem byla 1,06 resp. 0,53 µM (Zhang et al., 2009a). Dalším účinným flavonoidem je biochanin A, který výrazně inhiboval P-gp a byl schopen 2,5krát zvýšit koncentraci cytostatika v nádorových buňkách. V experimentech in vivo však tyto výsledky

nebyly

potvrzeny,

pravděpodobně

z důvodu

nedostatečné

biologické

dostupnosti (Zhang et al., 2010b). Liang et al. (2010) v experimentech in vivo při podání DOX v kombinaci s katechiny a flavonoly ze zeleného čaje výrazně zvýšilo akumulaci DOX a byla snížena exprese P-gp v DOX rezistentních tumorizovaných myších. Použitím xantanové

gumy

došlo

ke

zvýšení akumulace substrátů P-gp,

vinblastinu a DOX, ve střevních buňkách. Také byl pozorován zlepšený transport vinblastinu, nikoli však DOX. Při použití stejné koncentrace gellanové gumy byl zlepšen transport vinblastinu, avšak množství v tkáni zůstalo nezměněno. Gellanová guma zároveň zlepšila akumulaci a transport DOX. Další přírodním inhibitorem je askophyllum, který byl schopný zvýšit akumulaci vinblastinu a DOX v buňkách. Na rozdíl od DOX se také zvýšil transport vinblastinu (Werle, 2008). Václavíková et al. (2006) zjistili, že aurony CB-284, CB-285, CB-287, a ML-50 nejúčinněji inhibují transport zprostředkovaný P-gp v rezistentní linii s vysokou expresí P-gp

v porovnání

NCI/ADR-RES

chromonovými

a

s chalkonovými,

isoflavonovými deriváty

a

tímto

flavonovými,

flavonolovými,

způsobem zvýšily

akumulaci

[14 C]PTX a snížily jeho eflux z buněk. Naopak v citlivé buněčné linii MDA-MB-435 byly výsledky opačné.

Deriváty auronů,

zejména CB-287 inhibovaly akumulaci

[14 C]PTX a výrazně stimulovaly jeho eflux. Některá data korelovala se schopností navázání derivátů flavonoidů na P-gp, avšak tato vazba není jediným faktorem ovlivňujícím transport.

PTX

není pravděpodobně

transportován

pouze P-gp

a

předpokládá se účast MRP2 a 5. 2.2.4.2 Syntetické inhibitory efluxních transportérů Mezi

syntetické

polymery

inhibující

efluxní

pumpy

patří

např.

polyethylenglykol (PEG). Při podání PEG 300 se zlepšila prostupnost DOX a PTX

34

monovrstvou Caco2 buněk. PEG 300 ovlivnil transport PTX v závislosti na koncentraci. Mechanismus inhibice efluxní pumpy byl pravděpodobně zprostředkován změnami mikroprostředí buněčné membrány Caco2 buněk. Dále byl zjištěn téměř kompletní inhibiční vliv PEG 300 (20 %, v/v) v Caco2 buněčné linii a MDR1 transfekované MDCK buněčné linii, zatímco Cremophor EL (0,1 %, w/v) a polysorbát Tween® 80 (0,05 %, w/v) inhiboval aktivitu P-gp pouze částečně v Caco2 buněčné linii a v buňkách MDR1-MDCK se ukázal jako neaktivní v inhibici P-gp. Závěrem bylo zjištěno, že PEGylované látky byly schopny vyhnout se efluxu P-gp a CYP3A metabolismu, což vysvětluje výrazné zlepšení absorpce (Werle, 2006). Použitím D-alpha- Tocopheryl Poly(ethylene glycol) Succinate 1000 (TPGS) (50 mg/kg) došlo k šestinásobnému zlepšení biologické dostupnosti PTX (25 mg/kg) u potkanů po p.o. podání v porovnání s podáním PTX samotného. Při porovnávání délky alkylačního řetězce různých TPGS na inhibici efluxní pumpy byl nejúčinnější TPGS 1000. Při použití polysorbátu Tween®80, který je účinným inhibitorem efluxních pump, se zvyšovala akumulace DAU v rezistentních Ehrlichových ascitických nádorových buňkách.

V přítomnosti

polyoxyethylen-40-stearátu

byla

zvýšena

vnitrobuněčná

akumulace epirubicinu v Caco2 buňkách. Navíc byl zvýšen transport epirubicinu v Caco2 buňkách z apikální na basolaterální stranu, zatímco opačný transport byl snížen. Tyto výsledky ukazují, že polyoxyethylen 40 stearát zprostředkovává inhibici efluxních

pump.

Stejných

výsledků

bylo

dosaženo

při použití polyoxyethylen-

lauryletheru (Brij® 30) (Werle, 2006). Poloxamery jsou používány v nádorové terapii pro překonání MDR pomocí dvou různých přístupů: využití jiného transportu než přes efluxní pumpy nebo inhibicí proteinů efluxních transportérů. Například HPMA-DOX je transportován do buněk endocytózou, tj. transportem nezávislým na P-gp, zatímco volný DOX je transportován pomocí efluxních pump. V buňkách exprimujících P-gp in vitro, přítomnost poloxameru Pluronics® zvýšila akumulaci DOX, naopak v buňkách bez P-gp se tento efekt neprokázal. Pluronics® inhibuje kromě P-gp také MRP1 a 2, ale efekt na P-gp je mnohem vyšší. Zároveň je Pluronics® součástí GSH/GST detoxifikačního systému. Dendrimer

PAMAM

je

používaným transportním systémem pro

mnohá

protinádorová léčiva. Tento dendrimer zlepšoval transport z apikální na basolaterální stranu přes monovrstvu Caco2 buněk, opačný transport byl snížen. Mechanismus působení je zprostředkován jinou cestou, než inhibicí P-gp. V přítomnosti dendrimeru G3 se 3-4krát zvýšila akumulace DOX a vinblastinu ve střevním modelu. Bylo 35

prokázáno, že kombinací dendrimerů se substráty efluxní pumpy dochází ke zlepšení transportu. Tyto výsledky naznačují možnou inhibici efluxních pump (Werle, 2006). Furoxan substituovaný 3-fenylsulfonylem ukázal slibný inhibiční efekt a zvýšení citlivosti ledvinných MDCK buněk k DOX (Fruttero et al., 2010). Za cílem nalezení selektivního inhibitoru P-gp byly nasyntetizovány deriváty fenotiazinu. Nejaktivnější derivát byl schopný zvýšit akumulaci DOX a ukázal synergistický efekt při použití kombinace s DOX na indukci apoptózy v nádorových buňkách. Apatinib, inhibitor tyrosinkinasy, výrazně zvyšoval intracelulární akumulaci DOX přímou inhibicí P-gp a BCRP (Mi et al., 2010). Látka NSC23925 byla také identifikována jako účinný inhibitor Bylo

P-gp.

pozorováno

zvýšení

akumulace

DOX

v buňkách

pomocí

přímé

nekompetitivní inhibice aktivity P-gp beze změny v expresi (Duan et al., 2009). Do fáze klinických testů se dostal např. pipekolinátový derivát VX-710. Tento velmi účinný inhibitor efluxních transportérů prošel do II.fáze klinických zkoušek, avšak nebyl zjištěn žádný efekt na účinnost DOX u pacientů s nádory (Gandhi et al., 2007).

2.3 Hledání protinádorových vlastností léčiv používaných pro jiné indikace Léčiva schválená nebo testovaná pro jiné indikace, než je léčba rakoviny, u kterých byly následně zjištěny protinádorové vlastnosti, mohou být rychleji využity pro tuto novou indikaci s ohledem na jejich předchozí testování na zvířatech a lidech. Příkladem je perorální antidabetikum metformin, který inhibuje růst prostatických a střevních nádorových buněk a zpomaluje růst nádoru v xenograftech ve farmakologicky dosažitelné koncentraci. Kromě toho u diabetických pacientů užívajících metformin bylo pozorováno nižší riziko vzniku karcinomu pankreatu v porovnání s diabetiky, kteří metformin neužívali. V současné době je metformin testován v klinických studiích pro léčbu pacientů s pokročilými solidními tumory (Spagnuolo et al., 2010). Dalším případem je immunosepresivum thalidomid, u kterého byla v několika studiích

pozorována

antimyelomová a antiangiogenní aktivita.

Hlavním omezením

použití thalidomidu je riziko teratogenicity a vedlejší efekty jako ospalost, únava, vyrážka či neuropatie. Analog thalidomidu lenalidomid byl připraven pro zvýšení imunologických a protinádorových vlastností a snížení neurotoxických a teratogenních vlastností

původní

látky.

Zjištění

protinádorové

aktivity

lenalidomidu

rozšířilo

36

terapeutické spektrum hematologických malignit včetně mnohočetného myelomu a Bbuněčných nádorů,

chronické lymfocytární leukémie a non-Hodgkinova lymfomu

(Rajkumar a Kyle, 2001; Liberati et al., 2013). Ve studii Lin et al. (2006) byl thalidomid testován v lidských plicních nádorech a byl zjištěn inhibiční efekt na buněčnou invazi in vitro a metastázy in vivo. Zároveň thalidomid in vivo ukázal výrazný efekt na tvorbu nádoru v xenograftovém modelu. V posledních

letech

se

objevují

studie,

kde

betablokátory

jako

např.

propranolol zvyšují přežití pacientů s prsním karcinomem. Pasquier et al. (2011) in vitro ukázali antiproliferační efekt v 9 lidských nádorových a normálních buněčných liniích. Propranolol působí účinně antiangiogenně již při netoxické koncentraci, aniž by bylo pozorováno narušení cév. Kombinace 5-FU nebo PTX s propranololem v nízkých účinných

koncentracích

v závislosti

na

různých

buněčných

typech

vykazovaly

synergistický, aditivní či antagonistický efekt na buněčnou proliferaci. Bylo prokázáno, že nízká koncentrace propranololu potencuje antiangiogenní efekt 5-FU a PTX. Tato studie

a

předchozí klinické údaje naznačují,

že použití propranololu společně

s chemoterapií může zlepšit výsledky u pacientů s rakovinou prsu. Buckmiller et al., (2010) testoval efekt propranololu u dětí s hemangiomem a zjistil, že zlepšuje přežití pacientů s hemangiomy. V terapeutických dávkách se propranolol ukázal jako bezpečný a účinný u většiny pacientů. Ve studii byly pozorovány slabší nežádoucí účinky. Parker et al. nortriptylin metastatických

a

(2012) testovali tři tricyklická antidepresiva: amitriptylin,

klomipramin melanomů.

na

Všechna

buněčných tři léčiva

liniích se

a

ukázala

primárních aktivní,

kulturách

nicméně

ve

všech testovaných modelech byl nejúčinnější nortriptylin. Tato léčiva pravděpodobně působí na základě svých kationických amfifilních vlastností, nebo působením na mitochondriální

membránu.

Další

antidepresivum

sertralin

byl

schopný

antiproliferativní aktivity prostřednictvím cílení na mTOR signalizační dráhu a zvyšoval chemosenzitivitu k DOX (Lin et al., 2010). Benzimidazolová

anthelmintika

jsou

používána

pro

léčbu

intestinálních

parazitóz u lidí a zvířat. V několika studiích byl zjišťován vliv mebendazolu na plicní nádorové linie. Byla prokázána inhibice buněčného cyklu v G2/M fázi a indukce apoptózy v závislosti na dávce a času. V in vivo studii u myší mebendazol silně inhiboval růst štěpu lidského nádoru a výrazně snížil množství a velikost tumoru v experimentálním modelu plicních metastáz. Dále byla zjištěna snížené angiogeneze u myší léčených mebendazolem v porovnání s kontrolní skupinou myší. Mebendazol by 37

mohl být proto účinným v léčbě nádorů a dalších chorob závislých na angiogenezi (Mukhopadhyay et al., 2002). V další studii byl pozorován vliv mebendazolu v léčbě multiformního glioblastomu a zjištěná hodnota IC50 byla v rozmezí od 0,1 do 0,3 µM. Zároveň došlo až k 63 % vyššímu přežití v syngenním a xenograftovém modelu myšího gliomu (Bai et al., 2011). Dalším benzimidazolem ,testovaným pro protinádorový efekt, je fenbendazol. In vitro byl toxický na EMT6 buňky, toxicita se zvyšovala s časem inkubace a za podmínek těžké hypoxie. Fenbendazol však neovlivnil růst nádorů EMT6 a ani nezvýšil antineoplastické účinky záření (Duan et al., 2013).

2.4 Hledání nových přírodních látek s cytostatickým účinkem V posledních letech bylo vyizolováno velké množství přírodních látek, které inhibují proliferaci,

apoptózu,

potlačují angiogenezi,

omezují metastázy a zvyšují

účinnost chemoterapie in vitro a in vivo. V klinické praxi, či ve fázi klinických zkoušek se nachází mnoho protinádorových léčiv odvozených z rostlin (např. vinca alkaloidy, PTX, docetaxel, topotecan, či irinotecan), které již byly diskutovány výše. Mezi další slibné látky patří některé flavonoidy, alkaloidy, terpeny, chinony, nebo saponiny (da Rocha et al., 2001; Tan et al., 2011). Tan et al. (2011) ve svém přehledovém článku shrnul dosavadní poznatky o přírodních látkách, izolovaných z čínských rostlin. Mechanismem účinku těchto látek, je většinou indukce apoptózy, vnější i vnitřní cestou, tvorba ROS, ovlivnění buněčného cyklu na úrovni cyklin dependentních kinas (CDK), nebo inhibice proangiogenních faktorů. Řada z nich je úspěšně testována v kombinaci s klinicky používanými léčivy. Například kurkumin zvyšoval účinnost oxaliplatiny v nádorovém modelu rezistentním na oxaliplatinu, kombinace dihydroartemisininu s carboplatinou výrazně snižoval rozvoj ovariálního karcinomu, β-elemen zvyšoval účinek docetaxelu, taxanů a cisplatiny u buněk prostatického karcinomu, nebo kombinace triptolidu s 5-FU se ukázala být zlepšením pro

léčbu

střevních

karcinomů.

Přehled

jednotlivých látek

a jejich

mechanismů účinku lze nalézt v Tab. 3.

38

Tab. 3: Potenciální protinádorová léčiva odvozená z přírodních produktů (Tan et al., 2011). Látka

Skupina

Mechanismus účinku

In vitro a in vivo studie

Kyselina

alkaloid

Spuštění apoptózy navázáním na

B16-F10 melanomové buňky; plicní metastatické

transferinový receptor; antagonista

buňky prsní linie MDA-MB-435. In vivo; v Číně ve

rodiny Bcl-2 ;

fázi klinických studií

Efekt na inhibici DNA, RNA,

In vitro: prsní MDA-MB-231 a MCF7, plicní H1299

mitochondrie, ER, p53, MMP;

a A549; hepatocelulární HepG2 a MHCC97 -L

inhibuje telomerasu a topoisomerasu

nádorové buňky. In vivo: nasopharyngeální karcinom.

Indukce apoptózy; navázání na

In vitro: karcinom prsu, střeva, prostaty, žaludku,

regulační proteiny (NF-κβ; EGFR;

leukemie, lymfom a melanom; II. fáze klinických

HER2; MAPK,…); autofagocytóza

studií u pacientů s karcinomem pankreatu

Indukce apoptózy prostřednictvím

In vitro: buňky cervikálního karcinomu HeLa, buňky

CA2+ a/nebo inhibicí NFκβ; poško-

akutní monocytární leukemie T HP -1;

gambogová Berberin

Kurkumin

Wogonin

alkaloid

flavonoid

flavonoid

zení mitochondrií, inhibice VEGF receptoru 2

Silibinin

flavonoid

Indukce apoptózy, reguluje hladiny

In vitro: prsní MCF7, plicní H1299, H460,

CDK, cyklinů a inhibitory CDK, NF-

bronchoalve-olární H322 nádorové linie. In vivo:

κβ, ST AT 3

myší

adenokarcinom

prostaty

(T RAMP),

hepatocelulární karcinom

Artemisinin

β-elemen

terpen

terpen

T vorba

poškození

In vitro: nádorové linie jaterní HepG2, Hep3B,

endoplasmatického retikula, inhibice

ROS,

střevní HCT 116, ovariální OVCA-420, pro-

exprese VEGF receptorů,

myelocytární leukemie HL-60

Indukce apoptózy, fosforylace p38

In vitro: buňky nemalobuněčného karcinomu,

MAPK, regulace CDK

ovariální linie, glioblastomu. In vivo: lidské epidermoidní a thyreoidální nádorové buňky. V Číně adjuvantní terapie některých nádorů.

Oridonin

terpenoid

Indukce apoptózy, zvýšená regulace

In vitro: epidermoidní A431, prsní MCF7, cervikální

Fas a Fas Ligand, tvorba ROS,

HeLa nádorová linie. In vivo: Ehrlichův tumor,

inhibice syntézy DNA, RNA a

solidní sarkom-180, leukemický myší model.

proteinů, inhibice telomerasy

Triptolid

Kyselina

terpenoid

terpenoid

ursolová Shikonin

Emodin

antrachinon

antrachinon

Indukce apoptózy, snížení exprese

In vitro: endoteliální umbilikální buňky HUVEC,

proangiogenních faktorů T ie2 a

prsní, ovariální nádorové linie. In vivo: myší

VEGF receptoru 2

experimentální melanomové buňky do plic a sleziny.

Indukce apoptózy, regulace MMP,

In vitro: lidské ovariální CAOV3, jaterní DOX

snížení exprese proangiogenních

rezistentní HepG2, cervikální HeLa, prsní MDA-MB-

faktorů HIF-1α, VEGF a IL-8

231 nádorové linie. In vivo: potkaní C6-gliom

Indukce apoptózy, deaktivace NF-κβ,

In vitro: Prsní MCF7 nádorová linie, promyelocytární

zvýšená exprese CD95, tvorba ROS,

leukemie HL-60, myelogenní leukemie K562, vysoce

inhibice topoisomerasy II

metastatický cystický adenokarcinom

Indukce apoptózy, oxidativní po-

In vitro: nemalobuněčný karcinom plic, prostatická

škození, stabilizace komplexu štěpí-

DU-145, nádorová linie žlučníku SGC996

cího topoisomerasu II, inhibice FGF

Ginsenosid Rg 3

saponin

Deaktivace NF-κβ, inhibice mitózy,

In vitro: kolorektální HCT -116, plicní metastázy

DNA replikace, oprav DNA a signa-

ovariálního nádoru. Ex vivo: potkaní aortální prstenec

lizace růstových faktorů.

39

3 Cíle práce: Náplní mé disertační práce bylo najít a zkoušet nové přístupy pro zlepšení účinnosti vybraných klinicky používaných cytostatik na nádorovou tkáň, při omezení toxicity na tkáň zdravou. Dílčími cíli projektu bylo studovat možnosti: 1) Zvýšení účinnosti DOX v prsních nádorových buňkách inhibicí jeho deaktivace. 2) Omezení toxického

působení PTX

na

normální buňky

konjugací PTX

s peptidem zajišťujícím selektivní vstup do nádorových buněk. 3) Zesílení

účinku

PTX,

který

stabilizuje

mikrotubuly,

jeho

kombinací

s benzimidazolovými anthelmintiky, která inhibují syntézu mikrotubulů. 4) Nalezení

nových

látek

s cytostatickým

účinkem

v extraktech

a

oleji

z voskovníku červeného (Myrica rubra).

40

4 Výsledky a dikuze:

4.1 Možnosti zvýšení účinnosti DOX v protinádorové terapii I.

Hanušová V., Boušová I., Skálová L. (2011) – Possibilities to increase the effectiveness of doxorubicin in cancer cells killing. Drug Metabolism Reviews 43(4):540-557. DOX je často používaným a mnohokrát diskutovaným léčivem v nádorové

terapii. Protinádorový účinek je bohužel velmi často doprovázen systémovou toxicitou, zejména kardiotoxicitou. Mnoho vědeckých pracovišť se proto zaměřilo na hledání nových možností, jak zvýšit účinnost tohoto cytostatika při omezení toxicity na zdravou tkáň. Cílem této práce bylo shrnout různé přístupy a modifikace DOX ke zvýšení jeho účinnosti, jejich výhody i nevýhody a budoucí perspektivy. Bližší informace lze nalézt v práci samotné v sekci Přílohy.

4.2 Zvýšení účinnosti DOX v prsních nádorových buňkách inhibicí jeho deaktivace

II.

Hanušová V., Králová V., Schröterová L., Trilecová L., Pakostová A., Skálová L. (2010): The effectiveness of oracin in enhancing the cytotoxicity of doxorubicin through the inhibition of doxorubicin deactivation in breast cancer MCF7 cells. Xenobiotica 40(10):681-690. DOX je metabolizován redukcí na karbonylové skupině na DOXOL, který je

méně cytostaticky účinný a více kardiotoxický, než jeho parentní látka (Sereno et al., 2008). Na základě těchto faktů byla intenzivně studována redukce DOX a za ní zodpovědné enzymy (Trédan et al., 2007; Di Nicolantonio et al., 2005; O´Connor et al., 2007). V prsní nádorové linii MCF7 byla zjištěna výrazná tvorba DOXOL a cytosolická CBR1 byla identifikována jako hlavní enzym katalyzující redukci DOX (Gavelova et 41

al., 2008). Z těchto faktů vyplynulo, že by CBR1 mohla přispívat k přežití nádorových buněk při léčbě DOX a inhibice CBR1 by mohla znamenat slibnou strategii pro zvýšení účinnosti DOX v buňkách prsního nádoru. Isochinolinový derivát ORC je stejně jako DOX metabolizován redukcí karbonylové skupiny (Škarydová et al., 2009a). Při porovnávání kinetických parametrů redukce DOX a ORC bylo zjištěno, že ORC je výrazně lepším substrátem pro CBR1 než DOX (Gavelová et al., 2008). Na základě těchto skutečností jsme se rozhodli zjistit, zda ORC působí jako kompetitivní inhibitor redukce DOX a zda dojde při současném použití ORC a DOX ke zvýšení antiproliferačního a cytotoxického efektu DOX v prsní nádorové linii. Pro účely studia byla použita prsní nádorová buněčná linie MCF7. Pro kinetickou studii byla připravena cytosolická frakce této linie a získané vzorky byly po extrakci analyzovány

pomocí HPLC

s fluorescenčním detektorem.

Proliferace a

cytotoxicita byla zjišťována použitím testů životnosti buněk, měřením kaspázové aktivity a monitorováním v čase použitím systému X-celligence. V provedených experimentech se ukázalo, že ORC významně inhibuje redukci DOX. Podle vypočtených kinetických parametrů bylo zjištěno, že působí jako silný kompetitivní inhibitor tvorby DOXOL již při použití nízké koncentrace ORC, které může být dosaženo in vivo. Tato hypotéza byla ověřena na proliferujících a neproliferujících buňkách nádorové linie MCF7. Při použití kombinace DOX a ORC bylo dosaženo významně vyššího efektu, než při použití samotného DOX, přičemž všechny použité kombinace účinněji působily na proliferující buňky. Přidání netoxické koncentrace ORC k DOX způsobilo 40 % pokles hodnoty IC 50 . Zároveň bylo prokázáno, že pokud je ORC použit v kombinaci s DOX, potencuje aktivitu kaspáz 8 a 9

v buňkách MCF7.

Použitím kombinace byla

změřena výrazně vyšší hladina

iniciátorových kaspáz oproti DOXu samotnému. ORC samotný aktivitu neovlivnil.

42

4.3 Vliv ORC na toxicitu DOX v nenádorové tkáni III.

Hanušová V., Boušová I., Pakostová A., Skálová L. (2012): The influence of oracin on reduction and toxicity of doxorubicin in hepatocytes and mammary epithelial cells MCF10A. Xenobiotica 42(6):571-579. Po zjištění, že ORC může zvýšit antiproliferativní působení DOX v nádorových

buňkách, vyvstala otázka, jak ORC v kombinaci s DOX ovlivní účinek DOX na zdravou tkáň. Zajímalo nás, zda nebude ORC snižovat deaktivaci DOX a tím zvyšovat jeho toxicitu v normálních nenádorových buňkách. Z tohoto důvodu jsme se rozhodli zjistit vliv ORC na kinetiku DOX v nenádorové tkáni, porovnat expresi a aktivitu CBR1 v nádorové a nenádorové linii a otestovat, jaký vliv bude mít DOX v kombinaci s ORC na zdravou tkáň. K testování byla použita nenádorová prsní buněčná linie MCF10A a primární hepatocyty izolované z potkana. Pro porovnání kinetických parametrů byla připravena cytosolická frakce z lidských a potkaních hepatocytů a nenádorové buněčné linie. Aktivita a exprese CBR1 byla stanovena použitím specifického substrátu menadionu, a analýzou western blot. Inhibiční efekt ORC na redukci DOX byl v nenádorových buňkách MCF10A téměř nulový v porovnání s nádorovými MCF7. V cytosolu potkaních hepatocytů byl zjištěn pouze slabý inhibiční efekt ORC, avšak v cytosolu z lidských jater se ORC ukázal jako středně silný inhibitor redukce DOX. S ohledem na pravděpodobnou koncentraci v plazmě však může být předpokládán pouze nevýznamný efekt ORC na farmakokinetiku DOX. Rozdíly inhibičního efektu u nádorové a nenádorové tkáně mohou spočívat v různé expresi, afinitě a aktivitě enzymů redukujících DOX. Stanovením exprese enzymů v nádorové a nenádorové tkáni se zabývalo několik studií. Exprese biotransformačních enzymů výrazně kolísá mezi orgány a tkáněmi, stejně tak je pozorován rozdíl mezi nádorovými a nenádorovými buňkami (Bae et al., 2007; Fischer et al., 2007; Lewis et al., 2004). Lopez de Cerain et al. (1999) zjistil zvýšenou expresi CBR1 v nádorové prsní tkáni v porovnání s tkání nenádorovou. CBR1 se podílí na biotransformaci mnoha xenobiotik s karbonylovou skupinou, včetně. DOX, nebo ORC, u kterých je CBR1 hlavní cestou metabolizace v prsní nádorové linii MCF7 (Gavelová et al., 2008).

43

Naměřená specifická enzymová aktivita a exprese CBR1 prokázala vyšší hladiny v nádorových buňkách MCF7 oproti MCF10A buňkám nenádorovým, avšak redukce DOX byla v obou liniích srovnatelná. Na základě těchto informací je pravděpodobné, že na redukci DOX se v buňkách MCF10A podílí jiné redukční enzymy, než CBR1, které však nejsou inhibovány ORC. Proto předpokládáme, že současné podání ORC a DOX nesníží deaktivaci DOX v nenádorové prsní linii a tím ani nezvýší toxicitu. Tato teorie byla potvrzena proliferačními testy v buněčné linii MCF10A. ORC v kombinaci s DOX nejenže nezvyšoval toxicitu DOX, ale překvapivě ji významně snižoval, čímž chránil nenádorové buňky. Podobné výsledky přinesly testy cytotoxicity na primárních potkaních hepatocytech. ORC samotný působil toxicky až při velmi vysokých koncentracích (25 a 50 µM), které nejsou dosažitelné v organismu, na rozdíl od DOX, který působil hepatotoxicky již při koncentraci 0,5 µM. Všechny použité koncentrace ORC v kombinaci s DOX snižovaly negativní efekt DOX. Mechanismus protektivního působení ORC není zřejmý, neboť ORC ani jeho hlavní metabolit dihydrooracin nebyly schopny snižovat tvorbu volných radikálů. Je však možné, že ORC inhibuje některé enzymy katalyzující redoxní cyklování DOX.

4.4 Efekt oracinu na redukci, distribuci a účinnost DOX in vivo IV.

Hanušová V., Tomšík P., Kriesfalusyová L., Pakostová A., Boušová I., Skálová L. (2013): In vivo effect of oracin on doxorubicin reduction, biodistribution and efficacy in Ehrlich tumor bearing mice. Pharmacological Report 65(2):445-452. ORC, který byl původně připraven jako potenciální protinádorové léčivo, se

ukázal jako slibný inhibitor CBR1. ORC je rychle absorbován z GIT a má dobrou biologickou dostupnost. V klinických studiích na laboratorních zvířatech byla zjištěna jeho nízká akutní, subchronická a chronická toxicita a nebyla prokázána kardiotoxicita (Adamcová et al., 1999; Gersl et al., 1996). V předchozích experimentech in vitro, se ORC ukázal jako významný inhibitor redukce DOX a byl prokázán jeho výrazný efekt na zvýšení účinnosti DOX v nádorových buňkách. Naopak v nenádorové buněčné linii ORC překvapivě chránil před nežádoucí toxicitou DOX. Na základě těchto výsledků

44

jsme se rozhodli provézt experiment in vivo, kde bychom zjistili vliv ORC na množství DOX a DOXOL v plazmě, játrech a srdci po i.v. podání zdravým myším. Dále byl zjišťován a porovnáván vliv DOX, ORC a jejich kombinace na růst solidního Ehrlichova tumoru (EST) v tumorizovaných myších. Pro zjištění koncentrací DOX a DOXOL byla zdravým myším podána jednorázová dávka DOX a kombinace DOX a ORC (1:2 a 1:5). Plazma, játra a srdce byly odebírány během následujících 48 hodin a poté bylo množství DOX a DOXOL vyhodnocováno použitím HPLC s fluorescenčním detektorem. Myším tumorizovaným EST byly opakovaně podávány dávky samotného DOX, samotného ORC a dvou kombinací DOX + ORC (1:2 a 1:10) a byly zjišťovány změny ve velikosti tumoru. Při porovnávání koncentrace DOX v plazmě, játrech a srdci nebyl pozorován žádný významný rozdíl mezi testovanými skupinami myší a nebyl tak prokázán vliv ORC na farmakokinetiku a tkáňovou distribuci DOX. Hladina metabolitu DOXOL v plazmě byla během prvních čtyř hodin po podání výrazně nižší u myší léčených kombinací DOX a ORC (1:5), než u myší léčených pouze DOX. Tímto bylo zjištěno, že ORC je schopný inhibovat tvorbu DOXOL in vivo, bohužel je tato inhibice časově omezena. Po osmi hodinách po podání ORC se hladina DOXOL zvýšila v plazmě, játrech i srdci. Důvodem může být rychlý pokles množství ORC v plazmě a nízká akumulace ORC ve tkáních, která byla pozorována i po jednorázovém podání u králíků (Geršl et al., 1996). Opakované podání ORC by mohlo tento problém vyřešit. V druhé části studie byl porovnáván vliv DOX, ORC a jejich kombinací (1:2 a 1:10) na velikost EST. Nejvýraznější léčebný efekt byl zjištěn u skupiny léčené samotným DOX, zatímco použitím samotného ORC se velikost tumoru nezmenšila. Podáním kombinace DOX a ORC nebyla zvýšena účinnost DOX na růst tumoru v myších s EST. Z důvodu nesouladu ve výsledcích experimentů in vitro a in vivo jsme testovali inhibiční schopnosti ORC na DOX redukci v homogenátu z EST. V EST nebyla pozorována žádná inhibice redukce DOX, i když v předchozí studii s použitím nádorové linie MCF7 byla zjištěna výrazná inhibice. ORC tedy nemohl zvyšovat účinnost DOX v protinádorové terapii u myší s EST, pravděpodobně z důvodu rozdílného zastoupení a chování reduktas DOX v myších buňkách EST oproti lidským buňkám MCF7.

45

4.5 Konjugace paklitaxelu s analogem gonadotropního hormonu Přibylová M., Dvořáková M., Hanušová V., Neméthová I., Skálová L., Vaněk

V.

T. (2011): Paclitaxel conjugation with the analog of the gonadotropinreleasing hormone as a targeting moiety. International Journal of Pharmaceutics 415(1-2):175-180. PTX je mitotický inhibitor, který se používá zejména k léčbě karcinomu ovaria, prsu a plic. Má, podobně jako ostatní cytostatika, řadu nežádoucích účinků, které by mohly být omezeny selektivním transportem PTX pouze do nádorových buněk pomocí jeho konjugace se specifickou molekulou. Konjugace PTX byla popsána např. s protilátkou (Safavy et al., 2003) peptidickým hormonem (Cavallaro et al., 2007) nebo mastnou kyselinou (Bradley et al., 2001). GnRH je hormon stimulující vylučování a biosyntézu LH a folikulo-stimulační hormon (FSH) z hypofýzy. Jeho receptor je ve zvýšené míře exprimován v nádorové tkáni např. v karcinomu prostaty, ovaria a maligním prsním karcinomu (Limonta et al., 2003; Harrison et al., 2004), což z něj dělá zajímavý terapeutický cíl. Cílená terapie založená na konjugaci DOX s GnRH byla úspěšně testována na několika buněčných liniích (Nagy a Schally, 2005). Konjugace PTX s GnRH však dosud vyzkoušena nebyla, proto bylo ve spolupráci s Ústavem experimentální botaniky AV připraveno několik konjugátu PTX s různými analogy GnRH. Pro testování antiproliferačního efektu byly vybrány dva deriváty MP264 a MP265. Jako modelová linie byla vybrána prsní nádorové linie MCF7, kde byla v několika studiích popsána exprese GnRH receptoru (Günthert, 2005; Gründker et al., 2010), který může zprostředkovat transport konjugátu do buněk. Životnost buněk byla měřena testy MTT a neutrální červeně. Při saturačním testu byl zjišťován vliv volného GnRH na působení konjugátu a proliferaci buněk. Výsledky obou testů ukázaly, že konjugát MP265 působil účinněji na snižování životnosti

buněk,

v porovnání

s

volným

PTX

a

konjugátem MP264.

Vyšší

antiproliferační efekt konjugátu MP265 oproti MP264 může být způsoben rychlejším uvolněním PTX v buňkách vzhledem k použití odlišného spojení obou molekul. Při použití volného GnRH pro vysycování receptoru docházelo k poklesu účinnosti konjugátu MP265 v závislosti na koncentraci a čase.

46

4.6 Efekt benzimidazolových anthelmintik na účinnost paklitaxelu a střevní nádorové linie Králová V., Hanušová V., Staňková P., Knoppová K., Čáňová K., Skálová L.

VI.

(2013): Antiproliferative effect of benzimidazole anthelmintics albendazole, ricobendazole and flubendazole in intestinal cancer cell lines. Submitted. Benzimidazolová anthelmintika jsou široce používaná a vysoce účinná při léčbě helmintóz ve veterinární i humánní medicíně. Molekulární mechanismus působení benzimidazolů je založen na specifické vazbě k mikrotubulům, což vede k narušení jejich struktury a funkce. Výhodou podání těchto anthelmintik je také jejich nízká systémová toxicita (Dayan, 2003). Díky těmto vlastnostem mohou být deriváty benzimidazolů

slibným protinádorovým agens.

V

několika

studiích

byl popsán

významný protinádorový efekt benzimidazolů in vitro a na zvířecích modelech. ABZ účinně působil např. proti buňkám hepatocelulárnímu karcinomu, ovariálním buňkám rezistentním k PTX, nebo metastatickému melanomu (Pourgholami et al., 2001; Chu et al., 2009; Patel et al., 2011). FLU snižoval proliferaci leukemických a myelomových buněk, včetně buněk rezistentních na vinblastin (Spagnuolo et al., 2010). Účinek ABZ a rikobendazolu (RBZ) na střevní nádory byl zatím zkoumán pouze jednou na buněčné linii HT-29, vliv FLU zatím zkoumán nebyl a proto jsme navrhli studii zabývající se touto problematikou. Zároveň jsme se zajímali o vliv těchto léčiv, působících inhibici polymerizace tubulinu na účinnost PTX, který naopak stabilizuje mikrotubuly. Ke splnění daných cílů jsme použili pět různých střevních nádorových linií SW480, SW620, NCM460, HCT8 a Caco2 s odlišnými charakteristikami původu a růstu. Antiproliferační účinek ABZ, RBZ a FLU a jejich kombinace s PTX byly testovány

třemi

různými

proliferačními

testy

(NR,

WST,

BrDU),

analýzou

v čase - systémem X-celligence - a byla provedena analýza buněčného cyklu. Testy životnosti ukázaly, že RBZ (ABZ-sulfoxid) nepůsobil antiproliferačně u žádné z testovaných linií, na rozdíl od již dříve testované linie HT-29, kde Pourgholami et al. (2005) zjistil silný antiproliferativní účinek (IC50 =2,35 µM). Na rozdíl od RBZ, ABZ a FLU v našich testech významně inhibovaly buněčnou proliferaci v závislosti na čase a koncentraci ve všech použitých liniích. Ze stanovených hodnot IC 50 (Tab. 4) je

47

patrné, že jednotlivé buněčné linie se lišily v citlivosti k FLU a ABZ, přičemž nejcitlivější k oběma léčivům byla linie HCT8. Zjištěné hodnoty IC50 u dalších buněčných linií byly lehce vyšší a odpovídaly hodnotám IC 50 pro ABZ v prsních, plicních a myelomových buněčných liniích (Belaz et al., 2012). Porovnáním účinnosti FLU a ABZ na proliferaci jednotlivých linií ukázaly výrazné rozdíly působení, např. ABZ byl třikrát účinnější než FLU na linii HCT8, zatímco linie SW480 byla k FLU citlivější,

pravděpodobně

z důvodu

rozdílného

mechanismu

působení.

Měření

buněčného cyklu však neukázalo výrazné změny mezi těmito léčivy. FLU stejně jako ABZ vedl k zastavení buněčného cyklu v G2/M fázi. Tab. 4: Hodnoty IC50 [µM] střevních nádorových buněčných linií po 48 hodinové expozici ABZ a FLU. SW 480

SW 620

NCM 460

CACO2

HCT8

ABZ

4,4 ± 0,2

6,8 ± 0,2

3,5 ± 0,2

1,2 ± 0,2

0,3 ± 0,1

FLU

1,9 ± 0,2

6,5 ± 0,2

6,5 ± 0,2

1,9 ± 0,3

0,9 ± 0,2

I když PTX není běžně používán k léčbě střevních nádorů, mnoho nedávných studií ukázalo, že při použití ve vhodné formě (např. liposomální enkapsulace nebo vazba s nosičem) může být účinným při léčbě i těchto typů karcinomu (Yoshizawa et al., 2011; Lee et al., 2012). V druhé části této studie, zaměřené na zjištění vlivu ABZ a FLU na účinnost PTX, bylo prokázáno zesílení účinku tohoto cytostatika vlivem benzimidazolů. Pro testování účinku kombinace FLU a PTX resp. ABZ a PTX byla použita neměnná 10 nM koncentrace PTX, která inhibovala proliferaci buněk jen velmi slabě. Použitím kombinace došlo k výraznému zvýšení účinnosti PTX v buňkách HCT8 v porovnání s linií Caco2, přičemž PTX samotný byl na linii Caco2 účinnější.

48

4.7 Účinek olejového extraktu voskovníku červeného (Myrica rubra) na střevní nádorové linie

Myrica jsou rostliny patřící do čeledi Myricaceae. Myrica gale L. se využívá při léčbě žaludečních a srdečních nemocí (Svoboda et al., 1998). Esenciální olej z listu M. gale má mukolytický účinek a abortivní efekt (Sylvestre et al., 2005). Kromě toho se sušené listy a plody používají jako koření do polévek a dušených pokrmů. Cheng et al. (2003) studoval antivirové vlastnosti B-2 3,3´-di-O-gallátu izolovaného z druhu Myrica rubra, v kterých se ukázal účinek proti herpes simplex virus typu 2. M. rubra se také používá do směsi čajů na povzbuzení imunity a zlepšení krevního oběhu. Sylvestre et al. (2005) prokázal významný antiproliferativní účinek olejových extraktů M. gale, na plicní nádorové buněčné linii A-549 a střevní nádorové linii DLD-1. U druhu M. rubra zatím protinádorová aktivita studována nebyla. V laboratoři rostlinné biotechnologie Ústavu experimentální botaniky (ÚEB) AVČR byly připraveny extrakty a olej z voskovníku červeného (Myrica rubra). V naší laboratoři jsme nejprve monitorováním buněčné proliferace systémem X-Celligence otestovali

antiproliferační

účinek

několika

různých

extraktů

(vodný,

ethanolový,

ethylacetátový, butylmetyletherový) a oleje (lisovaného za studena) z listu Myrica rubra na střevní nádorovou linii HCT8. Zatímco extrakty měly pouze slabý nebo žádný antiproliferativní účinek, olej vykazoval výrazný antiproliferativní účinek již v nízkých koncentracích. V dalších experimentech jsme se proto zabývali již pouze tímto olejem. Testovali jsme jeho antiproliferační účinek na střevní nádorové linie HCT8 a Caco2 s využitím několika různých testů buněčné proliferace. Buněčná linie Caco2 byla citlivější k působení testovaného extraktu v porovnání s linií HCT8. Při testování extraktu z M. gale byla zjištěná hodnota IC 50 88 µg/ml u linie A-549 i DLD-1. Při použití extraktu z M. rubra byla testem neutrální červeně zjištěna téměř 3krát nižší hodnota IC50 u námi testované linie Caco2 v porovnání s extraktem z M. gale, u linie HCT8 byla tato hodnota téměř poloviční (Tab. 5). Testováním analýzy v čase byl pozorován výrazný antiproliferativní účinek již při koncentraci 10 µg/ml v buněčné linii HCT8 a 5 µg/ml koncentraci u buněčné linie Caco2 (Obr. 2). Tento výrazný rozdíl ve výsledcích získaných různými metodami bude nutno vysvětlit dalšími experimenty.

49

Tab. 5: Porovnání hodnot IC 50 [µg/ml] střevních buněčných linií po 72 hodinové expozici olejovým extraktem Myrica rubra. HCT8

Caco2

Test neutrální červeně

49,5 ± 0,02

32,0 ± 0,04

Analýza v čase – X-celligence

5,93 ± 0,05

1,48 ± 0,11

Obr. 2: Vliv olejového extraktu Myrica rubra na proliferaci v čase vyhodnocené systémem X-celligence po 72hodinové expozici. S cílem zjistit mechanismus antiproliferačního účinku oleje z M. rubra byl zjišťován jeho vliv na tvorbu ROS metodou využívající dichlorofluorescein, buněčný indikátor tvorby kyslíkových radikálů.

50

Vlivem olejového extraktu M. rubra docházelo k výraznému zvyšování tvorby ROS v závislosti na koncentraci v obou testovaných liniích. Proto je pravděpodobně, že jedním z možných mechanismů účinku na střevní nádorové buňky je tvorba volných radikálů. Závislost tvorby ROS na čase je znázorněna na Obr. 3.

Obr. 3: Vliv olejového extraktu Myrica rubra na produkci ROS ve střevních buněčných liniích Caco2 a HCT8. Jako pozitivní kontrola byl použit 3% roztok H2 O2 . Nyní je olej z M. rubra v ÚEB frakcionován a antiproliferativní účinek jednotlivých frakcí bude testován v naší laboratoři. Současně probíhá identifikace složek jednotlivých frakcí pomocí GC-MS analýzy.

51

5 Závěr: V disertační práci jsem se zabývala studiem možného

zvýšení účinnosti

cytostatik na nádorové buňky a současného snížení jejich nežádoucí toxicity na normální zdravé buňky. Vyzkoušela jsem několik rozdílných přístupů a dosažené výsledky lze shrnout do následujících závěrů: 

ORC výrazně inhibuje deaktivaci DOX a zvyšuje antiproliferativní účinek DOX v prsní nádorové linii MCF7. Navíc, ORC výrazně snižuje toxicitu DOX v nenádorové buněčné linii MCF10A a v potkaních hepatocytech. In vivo, je ORC schopný zpomalit tvorbu toxického metabolitu DOXOL, avšak nedokáže zlepšit účinnost DOX v myších s Ehrlichovým tumorem.



Konjugace PTX s analogem GnRH přinesla zvyšení antiproliferativního účinku v porovnání se samotným PTX v prsních nádorových buňkách MCF7. Použití volného GnRH prokázalo vstup konjugátu pomocí receptoru pro GnRH.



Benzimidazolová

anthelmintika

FLU

a

ABZ

významně

snižují proliferaci

střevních nádorových buněk. Použití kombinace PTX s FLU resp. PTX s ABZ vede k výraznému zvýšení účinnosti PTX ve střevních nádorových buňkách. 

Olej z voskovníku červeného (M. rubra) vykazuje významné antiproliferativní účinky na střevní nádorové linie a není toxický pro nenádorové jaterní buňky. Jedním z možných mechanismů jeho účinku je zvyšování tvorby ROS v nádorových buňkách. Dosažené výsledky nastínily několik slibných možností, jak by se v budoucnu

mohlo

docílit

zlepšení

účinnosti

chemoterapie.

K reálnému

posouzení

jejich

potenciálního přínosu však bude zapotřebí ještě mnoho dalších studií a experimentů.

52

6 Seznam použité literatury: 1.

2. 3.

4. 5.

6.

7. 8.

9.

10. 11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

Adamcova M, Gersl V, Hrdina R, Melka M, Mazurova Y, Vavrova J: Cardiac troponin T as a marker of myocardial damage caused by antineoplastic drugs in rabbits. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 125:268−274, 1999. Alberts B, Bray D, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P: Základy buněčné biologie: Kapitola 17 – Buněčné dělení. Espero Publishing, ISBN: 80-902906-0-4, přeloženo 2004. Alley SC, Zhang X, Okeley NM, Anderson M, Law C-L, Senter PD, Benjamin DR: The pharmacologic basis for antibody-auristatin conjugate activity. The journal of pharmacology and experimental therapeutics 330:932-938, 2009. Alomrani AH, Maghraby GME, Alanazi FK, Al-mohannaM, Alaiya AA, Alsarra IA: Liposomes for enhanced cytotoxic activity of bleomycin. Drug development research 72:265-273, 2011. Armand JP, Ribrag V, Harrousseau JL, Abrey L: Reappraisal of the use of procarbazine in the treatment of lymphomas and brain tumors. Therapeutics and clinical risk management 3:213224, 2007. Auzenne E, Donato NJ, Leroux E, Price RE, Farquhar D, Klostergaard J: Superior therapeutic profile of poly-L-glutamic acid-paclitaxel copolymer compared with taxol in xenogeneic compartmental models of human ovarian carcinoma. Clinical Cancer Research 8:573-581, 2002. Bae JY, Ahn SJ, Han W, Noh DY: Peroxiredoxin I and II inhibit H2O2-induced cel death in MCF-7 cell lines. Journal of Cellular Biochemistry 101:1038-1045, 2007. Bai R-Y, Staedtke V, Aprhys CM, Gallia GL, Riggins GJ: Antiparasitic mebendazole shows survival benefit in 2 preclinical models of glioblastoma multifo rme. Neuro-oncology 13:974982, 2011. Bajčiová V, Tomášek J, Štěrba J a kolektiv: Nádory adolescentů a mladých dospělých: Kapitola 21 Dispenzarizace adolescentů s genetickou predispozicí k nádorovým onemocněním. Grada Publishing, ISBN: 978-80-247-3554-2, 2011. Bartoli MH, Boitard M, Fessi H: In vitro and in vivo antitumoral activity of free and encypsulated taxol. Journal of microencapsulation 7:191-197, 1990. Bast RC, Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Holland JF, Frei E: Cancer Medicine 5: Chapter 2 - Cell proliferation, differantiation and apoptosis. Hamilton (ON): BC Decker, ISBN10: 1-55009-113-1, 2000. Bast RC, Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Holland JF, Frei E: Cancer medicine 5: Chapter 48 - Alkylating agents and platinum antitumor compound s. Hamilton (ON), BC Decker, ISBN-10: 1-55009-113-1, 2000. Belaz KRA, Denadai M, Almeida AP, Lima RT, Vasconcelos MH, Pinto MM, Cass QB, Oliviera RV: Enantiomeric resolution of albendazole sulfoxide by semipreparative HPLC and in vitro study of growth inhibitory effects on human cancer cell lines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 66:100-108, 2012. Belaz KRA, Denadai M, Almeida AP, Lima RT, Vasconcelos MH, Pinto MM, Cass QB, Oliveira RV: Enantiomeric resolution of albendazole sulfoxide by semipreparative HPLC and in vitro study of growth inhibitory effects on human cancer cell lines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 66:100-108, 2012. Bradley MO, Webb NL, Anthony FH, Devanesan P, Witman PA, Hemamalini S, Chander MC, Baker SD, He L, Horwitz SB, Swindell CS: Tumor targeting by covalent conjugation of a natural fatty acid to paclitaxel. Clinical Cancer Research 7:3229-3238, 2001. Brozic P, Golob B, Gomboc N, Rizner TL, Gobec S: Cinnamic Acids As New Inhibitors of 17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 5 (AKR1C3). Molecular and Cellular Endocrinology 248:233-235, 2006. Buckmiller LM, Munson PD, Dymenahalli U, Dai Y, Richter GT: Propranolol for infantile hemangiomas: Early experience at a tertiary vascular anomalies center. The Laryngoscope 120:676-681, 2010.

53

18. Calzada AA, Pedrini O, Finazzi G, Leoni F, Mascagni P, Introna M, Rambaldi A and Golay J: Givinostat and hydroxyurea synergize in vitro to induce apoptosis of cells from JAK2 V617F myeloproliferative neoplasm patients. Experimental hematology, doi: 10.1016/j.exphem.2012.10.013, 2013 19. Cancer worldwide – the global picture: http://www.cancerresearchuk.org/cancerinfo/cancerstats/world/the-global-picture/cancer-overall-world – staženo 15. 2. 2013. 20. Cao N, Fang SS: Doxorubicin conjugated to D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS):conjugation chemistry, characterisation, in vitro and in vivo evalu ation. Biomaterials 29:3856-3865, 2008. 21. Carlquist M, Frejd T, Gorwa-Grauslund MF: Flavonoids As Inhibitors of Human Carbonyl Reductase 1. Chemical Biological Interactions 174:98-108, 2008. 22. Carter PJ and Senter PD: Antibody-drug conjugates for cancer therapy. The Cancer Journal 14:154-169, 2008. 23. Cavallaro G, Maniscalco L, Campisi M, Schillaci D, Giammona G: Synthesis, characterization and in vitro cytotoxicity studies of a macromolecular conjugate of paclitaxel bearing oxytocin as targeting moiety. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 66: 182-192, 2007. 24. Ceruti M, Crosasso P, Brusa P, Arpico S, Dosio F, Cattel L: Preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing water-soluble prodrugs of paclitaxel. Journal of controlled release 63:141-153, 2000. 25. Chen X, Plasencia C, Hou Y, Neamati N: Synthesis and biological evaluation of dimeric RGD peptide-paclitaxel conjugate as a model for integrin-targeted drug delivery. Journal of Medicinal Chemistry 48:1098-1106, 2005. 26. Cheng HY, Lin TC, Ishimaru K, Yang CM, Wang KC, Lin CC: In vitro antiviral activity of prodelphinidin B-2 3,3´-di-O-gallate from Myrica rubra. Planta Medica 69:953-956, 2003. 27. Chu SW, Badar S, Morris DL and Pourgholami MH: Potent inhibition of tubulin polymerisation and proliferation of paclitaxel-resistant 1A9PTX22 human ovarian cancer cells by albendazole. Anticancer Research 29:3791-3796, 2009. 28. COSMEGEN® LYOVAC: http://www.lundbeck.com/upload/us/files/pdf/Products/Cosmegen_PIL_IE_EN.pdf – staženo 28. 2. 2013. 29. Da Rocha AB, Lopes RM, Schwartsmann G: Natural products in anticancer therapy. Current opinion in Pharmacology 1:364-369, 2001. 30. Dale MM, Rang HP, Dale MM et al.: Pharmacology 6th edition: Chapter 51 – Cancer chemotherapy. Elsevier Science health science, ISBN: 9780443069116 0443069115 9780808923541 0808923544, 2007. 31. Dayan AD: Albendazole, mebendazole and praziquantel. Review of non-clinical toxicity and pharmacokinetics. Acta Tropica 86:141-159, 2003. 32. De Angelis PM, Svensrud DH, Kravik KL a Stokke T: Cellular response to 5-fluorouracil (5FU) in 5-FU-resistant colon cancer cell lines during treatment and recovery. Molecular cancer 5:20, 2006. 33. Desai PB, Duan JZ, Zhu Y-W, Kouzi S: Human liver microsomal metabolim of paclitaxel and drug interactions. European Journal of Drug Metabolim and Pharmacokinetics 23:417-424, 1998. 34. Di Nicolantonio F, Mercer SJ, Knight LA, Gabriel FG, Whitehouse PA, Sharma S, Fernando A, Glaysher S, Di Palma S, Johnson P, Somers SS, Toh S, Higgins B, Lamont A, Gulliford T, Hurren J, Yiangou C, Cree IA: Cancer cell adaptation to chemotherapy. BMC Cancer 5:78, 2005. 35. Duan Z, Choy E, Hornicek FJ: NSC23925, Identified in a High-Throughput Cell-Based Screen, Reverses Multidrug Resistance. PLoS One 4:e7415, 2009. 36. Duncan R, Vicent MJ, Greco F, Nicholson RI: Polymer-drug conjugates: towards a novel approach for the treatment of endocrine-related cancer. Endocrine-Related Cancer 12: 189-199, 2005.

54

37. Emons G, Kaufmann M, Gorchev G, Tsekova V, Grundker C, Gunthert AR et al.: Dose escalation and pharmacokinetic study of AEZS-108 (AN-152), an LHRH-agonist linked to doxorubicin, in women with LHRH receptor-positive tumors. Gynecologic Oncology 119:457461, 2010. 38. Erenpreisa J, Cragg MS: Mitotic death, a mechanism of survival? A review. Cancer Cell International 1:1−15, 2001 39. Erlund I, Silaste ML, Alfthan G, Rantala M, Kesaniemi YA, Aro A: Plasma Concentrations of the Flavonoids Hesperetin, Naringenin and Quercetin in Human Subjects Following Their Habitual Diets, and Diets High or Low in Fruit and Vegetables. European Journal of Clinical Nutritients 56:891-898, 2002. 40. Fanciullino R, Mollard S, Giacometti S, Haddad YB, Chefrour, Aubert C, Illiadis A, Ciccolini J: In vitro and in vivo evaluation of Lipofufol, a new triple stealth liposomal formulation of modulated 5-FU: Impact on efficacy and toxicity. Pharmaceutical Research doi: 10.1007/s11095-012-0967-2, 2013. 41. Fischer D, Seifert M, Becker S, Ludders D, Cordes T, Reichrath J et al.: 25-Hydroxyvitamin D3 1-αhydroxylase splice variants in breast cell lines between MCF-7 and MCF-10. Cancer Genomics and Proteomics 4:295-300, 2007. 42. Florent JC, Monneret C: Doxorubicin conjugates for selective delivery to tumors. In: Krohn K. (Ed.), Anthracycline chemistry and biology II:99-140. Heidelberg, Germany: Springer Berlin, 2008. 43. Fruttero R, Crosetti M, Chegaev K, Guglielmo S, Gasco A, Berardi F, Niso M, Perrone R, Panaro MA, Colabufo NA: Phenylsulfonylfuroxans As Modulators of Multidrug -ResistanceAssociated Protein-1 and P-Glycoprotein. Journal of Medicinal Chemistry 53:5467-5475, 2010. 44. Gandhi L, Harding MW, Neubauer M, Langer CJ, Moore M, Ro ss HJ, Johnson BE, Lynch TJ A: Phase II Study of the Safety and Efficacy of the Multidrug Resistance Inhibitor VX-710 Combined With Doxorubicin and Vincristine in Patients With Recurrent Small Cell Lung Cancer. Cancer 109:924-932, 2007. 45. Gavelova M, Hladikova J, Vildova L, Novotna R, Vondracek J, Krcmar P, Machala M, Skalova L: Reduction of doxorubicin and oracin and induction of carbonyl reductase in human breast carcinoma MCF-7 cells. Chemical and Biological Interactions 176:9-18, 2008. 46. Gebauer G, Fehm T, Beck EP, Berkholz A, Licht P, Jager W: Cytotoxic effect of conjugates of doxorubicin and human chorionic gonadotropin (hCG) in breast cancer cells. Breast Cancer Reserach and Treatment 77:125-131, 2003. 47. Gersl V, Mazurova Y, Bajgar J, Melka M, Hrdina R, Palicka V: Lack of cardiotoxicity of a new antineoplastic agent, a synthetic derivative of indenoisochinoline, comparison with daunorubicin in rabbits. Archives of Toxicology 70:645−651, 1996. 48. Gianasi E, Buckley RG, Latigo J, Wasil M, Duncan R: HPMA copolymers platinates containing dicarboxylato ligands. Preparation, characterisation and in vitro and in vivo evaluation. Journal of Drug Targeting 10:549-556, 2002. 49. Gianasi E, Wasil M, Evagorou EG, Keddle A, Wilson G, Duncan R: HPMA copolymer platinates as novel antitumor agents: in vitro properties, pharmacokinetics and antitumour activity in vivo. European Journal of Cancer 35:994-1002, 1999. 50. Gil-Ad I, Zolokov A, Lomnitski L, Taler M, Bar M, Luria D, Ram E, Weizman A: Evaluation of the potential anti-cancer activity of the antidepressant sertraline in human colon cancer cell lines and in colorectal cancer-xenografted mice. International Journal of Oncology 33:277-286, 2008. 51. Gonzalez-Covarrubias V, Kalabus JL, Blanco JG: Inhibition of Polymorphic Human Carbonyl Reductase 1 (CBR1) by the Cardioprotectant Flavonoid 7-Monohydroxyethyl Rutoside (MonoHER). Pharmacological Research 25:1730-1734, 2008. 52. Greco F, Vicent MJ, Gee S, Jones AT, Gee J, Nicholson RI et al.: Investigating the mechanism of enhanced cytotoxicity of HPMA copolymer-Dox-AGM in breast cancer cells. Journal of Controlled Release 117:28-39, 2007.

55

53. Greco F, Vicent MJ, Penning NA, Nicholson RI, Duncan R: HPMA copolymeraminoglutethimide conjugates inhibit aromatase in MCF-7 cell lines. Journal of Drug Targeting 13:459-470, 2005. 54. Gründker C, Föst C, Fister S, Nolte N, Günthert AR, Emons G: Gonadotropin -releasing hormone type II antagonist induces apoptosis in MCF-7 and triple-negative MDA-MB-231 human breast cancer cells in vitro and in vivo. Breast Cancer Research 12:R49, 2010. 55. Gurdag S, Khandare J, Stapels S, Matherly LH, Kannan RM: Activity of dendrimermethotrexate conjugates on methotrexate-senzitive and resistant cell lines. Bioconjugate Chemistry 17:275-283, 2006. 56. Günthert AG, Gründker C, Bongertz T, Nagy A, Schally AV, Emons G: Induction of apoptosis by AN-152, a cytotoxic analog of luteinizing-releasing hormone (LHRH) in LHRH-R positive human breast cancer cells is independent of multidrug resistence-1 (MDR-1) system. Breast cancer research and treatment 87:255-264, 2004. 57. Günthert AR, Gründker C, Olota A, Läsche J, Eicke N, Emons G: Analogs of GnRH-I inhibit epidermal growth factor-induced signal transduction and resensitize resistant human breast cancer cells to 40H-tamoxifen. European Journal of Endocrinology 153: 613-625, 2005. 58. Harmey JH: VEGF and cancer, Kluwer Academic/ Plenum Publishers, 2004. 59. Harris L, Batist G, Belt R, Rovira D, Navari R, Azarnia N et al.: Liposome-encapsulated doxorubicin compared with conventional doxorubicin in randomized multicenter trial as first line therapy of metastatic breast carcinoma. Cancer 94:25-36, 2002. 60. Harrison GS, Wierman ME, Nett TM, Glode LM: Gonadotropin -releasing hormone and its receptor in normal and malignant cells. Endocine-Related Cancer 11:725-748, 2004. 61. Hong MS, Lim SJ, Lee M-K, Kim YB, Kim C-K: Prolonged blood circulation of methotrexate by modulation of liposomal composition. Drug delivery 8:231-237, 2001. 62. Horvát-Karajz K, Balogh Z, Kovacs V, Hamori A, Sreter L and Uher F: In vitro effect of carboplatin, cytarabine, paclitaxel, vincristine and low-power laser irradiation on murine mesenchymal stem cells, Lasers in surgery and medicine 41:463-469, 2009. 63. Janssens JP, Russo J, Russo I, Michiels L, Donders G, Verjans M et al.: Human chorionic gonadotropin (hCG) and prevention of breast cancer. Molecular and Cellular Endocrionology 269:93-98, 2007. 64. Johnston MJ, Semple SC, Klimuk SK, Edwards K, Eisenhardt ML, Leng EC, Karlsson G, Yanko D, Cullis PR: Therapeutically optimized rates of drug release can be achieved by varying the drug-to-lipid ration in liposomal vincristine formulations. Biochimica et Biophysica Acta 1758:55-64, 2006. 65. Jolivet J., Cowan KH, Curt GA, Clendeninn NJ, Chabner BA: The pharmacology and clinical use of methotrexate, The New England Journal of Medicine 309:1094-1104, 1983. 66. Kahmann L, Beyer U, Mehlhorn G, Thiel FC, Strnad V, Fasching PA, Lux MP: Mitomycin C in patients with gynecological malignancies. Oncologie 33:547-557, 2010. 67. Kaiserova H, Simunek T, van der Vijgh WJ, Bast A, Kvasnickova E: Flavonoids As Protectors Against Doxorubicin Cardiotoxicity: Role of Iron Chelation, Antioxidant Activity and Inhibition of Carbonyl Reductase. Biochimica and Biophysica Acta 1772:1065-1074, 2007. 68. Kanemitsu H, Yamauchi H, Komatsu M, Yamamoto S, Okazaki S, Uchida K, Nakayama H: 6Mercaptopurin (6-MP) induces cell cycle arrest and apoptosis of neural progenitor cells in the developing fetal rat brain. Neurotoxicology and Teratology 31:104-109, 2009. 69. Kishi S, Yang W, Boureau B, Morand S, Das S, Chen P, Cook EH, Rosner GL, Schuetz E, Pui CH, Relling MV: Effects of prednisone and genetic polymorphisms on etoposide disposition in children with acute lymphoblastic leukemia. Blood 103:67-72, 2004. 70. Kivistö KT, Kroemer HY, Eichelbaum M: The role of human cytochrome P450 enzymes in the metabolism of anticancer agents: implications for drug interactions. British Journal of Clinical Pharmacology 40:523-530, 1995. 71. Klener P, Klener P jr: Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii. Grada Publishing, ISBN: 978-80-247-2808-7, 2010. 72. Klener P: Klinická onkologie, Galén, Karolinum, ISBN-10: 80-7262-151-3, 2002.

56

73. Lee SJ, Hong GY, Jeong YI, Kang MS, Oh JS, Song CE, Lee HC: Paclitaxel-incorporated nanoparticles of hydrophobized polysaccharide and their antitumor aktivity. International Journal of Pharmaceutics 43:121-128, 2012. 74. Lee SJ, Hong GY, jeong YI, Kang MS, Oh JS, Song CE, Lee HC: Paclitaxel-incorporated nanoparticles of hydrophobized polysaccharide and their antitumor activity. International Journal of Pharmaceutics 43: 121-128, 2012. 75. Leonard RC, Wiliams S, Tulpule A, Levine AM, Oliveros S: Improving the thera peutic index of anthracycline chemotherapy: focus on liposomal doxorubicin (Myocet). Breast 18:218-224, 2009. 76. Lewis MJ, Wiebe JP, Heathcote JG: Expression of progesterone metabolizing enzyme genes (AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, SRD5A1, SRD5A2) is altered in human breast carcinoma. BMC Cancer 4:27, 2004. 77. Li C, Yu D, Newman R, Cabral F, Stephens LC, Hunter N, Milas L, Wallace S: Complete regression well-established tumors using a novel water-soluble poly (L-glutamic acid)-paclitaxel conjugate. Cancer Research 58:2404-2409, 1998. 78. Li J, Chen W, Zhang P, Li N: Toposiomerase II trapping agent teniposide induces apoptosis and G2/M or S phase arrest of oral squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology 4:41, 2006. 79. Liang G, Tang A, Lin X, Li L, Zhang S, Huang Z, Tang H, Li QQ: Green Tea Catechins Augment the Antitumor Activity of Doxorubicin in an in Vivo Mouse Model for Chemoresistant Liver Cancer. International Journal of Oncology 37:111-123, 2010. 80. Liberati AM, Vitolo U, Palumbo A, Cortelezzi A: Lenalidomide in the treatment of lymphoproliferative disorders and multiple myeloma. Advances in Hematology doi.org/10.1155/2013/812605, 2013. 81. Lim WT, Tan EH, Toh CK, Hee SW, Leong SS, Ang PCS, Wong NS, Chowbay B: Phase I pharmacokinetic study of a weekly liposomal paclitaxel formulation (Genexol-PM) in patients with solid tumors. Annals of oncology 21:382-388, 2010. 82. Limonta P, Morreti RM, Marelli MM, Motta M:The biology of gonadotropin hormone -releasing hormone: role in the control of tumor growth and progression in humans. Frontiers in Neuroendocrinology 24:279-295, 2003. 83. Lin C-J, Robert F, Sukarieh R, Michnick S, Pelletier J: The antidepressant sertraline inhibits translation intiation by curtailing mammalian target of rapamycin signaling. Cancer Research 15:3199, 2010. 84. Lin YC, Shun CT, Wu MS, Chen CC: A novel anticancer effect of thalidomide: inhibition of intercellular adhesion molecule-1-mediated cell invasion and metastasis through supression of nuclear factor-kappaB. Clinical Cancer Research 1:7165-7173, 2006. 85. Liu JH, Cao L, Luo PG, Yang ST, Lu F, Wang H et al.: Fullerene-conjugated doxorubicin in cells. ACS Applied Materials & Interfaces 2:1384-1389, 2010. 86. Loehr M, Bodoky G, Fölsch U, Märten A, Karrasch M, Lilla C, Meyer I, Osinsky D, Szanto J, Lutz M: Cationic liposomal paclitaxel in combination with gemcitabine in patients with advanced pancreatic cancer: A phase II trial. Journal of clinical oncology 27:4526, 2009. 87. Lopez de Cerain A, Marian A, Idoate MA, Tunon MT, Bello J: Carbonyl reductase and NADPH cytochrome P450 reductase activities in human tumoral versus normal tissues. European Journal of Cancer 35:320-324, 1999. 88. Lotfi K, Zackrisson AL, Peterson C: Comparison of idarubicin and daunorubicin regarding intracellular uptake, induction of apoptosis, and resistance. Cancer Letters 178:141-149, 2002. 89. Lowrey CH and Eastman A: Vinblastine induces acute, cell cycle phase-independent apoptosis in some leukemias and lymphomas and can induce acute apoptosis in others when Mcl-1 is supressed. Molecular Cancer therapeutics 9:791-802; Salemi BL, Bates DJ, Albershardt, 2010. 90. Lu F, Haque SA, Yang ST, Luo PG, Gu L, Kitaygorodskiy A, et al.: Aqueous compatible fullerene-doxorubicin conjugates. Journal of Physical Chemistry. C, Nanomaterials and Interfaces 113:17768-17773, 2009.

57

91. Lüllmann H, Mohr K, Wehling M: Farmakologie a toxikologie, Grada Publishing, ISBN: 80247-0836-1, přeloženo 2004. 92. Mackenzie CD, and Geary TG: Flubendazole: a candidate macrofilaricide for lymphatic filariasis and onchocerciasis field programs. Expert Review of Anti-Infective Therapy 9:497-501, 2011. 93. Melka, M. (1994) Oracin. Expert report on pharmacological; biochemical and toxicological documentation. Archives of the research inst. For Pharmacy and Biochemistry. Prague 94. Mi YJ, Liang YJ, Huang HB, Zhao HY, Wu CP, Wang F, Tao LY, Zhang CZ, Dai CL, Tiwari AK, Ma XX, To KK, Ambudkar SV, Chen ZS, Fu LW: Apatinib (YN968D1) Reverses Multidrug Resistance by Inhibiting the Efflux Function of Multiple ATP-Binding Cassette Transporters. Cancer Research 70:7981-7991, 2010. 95. Minotti G, Menna P, Salvatorelli E, Cairo G, Gianni L: Anthracyclines: Molecular Advances and Pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. Pharmacological reviews 56:185-229, 2004. 96. Mukhopahyay T, Sasaki J, Ramesh R, Roth JA: Mebendazole elicits a potent antitumor effect on human cancer cell lines both in vitro and in vivo. Clinical Cancer Research 8:2963, 2002. 97. Nagy A, Schally AV:Targeting of cytotoxic luteinizing hormone-releasing hormone analogs to breast, ovarian, endometrial and prostate cancers. Biology of Reproduction 73:851-859, 2005. 98. Noble CO, Guo Z, Hayes ME, Marks JD, Park JW, Benz CC, Kirpotin DB, Drummond DC: Characterization of highly stable liposomal and immunoliposomal formulations of vincristine and vinblastine. Cancer chemotherapy and Pharmacology 64:741-751, 2009. 99. Nogueira DR, Tavano L, Mitjans M, Pérez L, Infante MR, Vinardell MP: In vitro antitumor activity of methotrexate via pH-sensitive chitosan nanoparticles. Biomaterials 34:2758-2772, 2013. 100. O´Connor R, O´Leary M, Ballot J, Collins CD, Kinsella P, Mager DE, Arnold RD, O´Driscoll L, Larkin A, Kennedy S, Fennelly D, Clynes M, Crown J: A phase I clinical and pharmacokinetic study of the multi-drug resistance protein -1 (MRP-1) inhibitor sulindac, in combination with epirubicin in patients with advanced cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 59:7987, 2007. 101. Obrázek fází mitózy: http://user.mendelu.cz/sladek/cytologie/mitosis.jpg staženo 25.4.2013 102. Ono K, Mawatari K, Harada N, Takahashi A, Sakai T, Ogoshi S, Nakaya Y: The nucleoside and nucleotide mixture (OG-VI) rescues intestinal-like epithelial cells from the cytotoxicity of chemotherapeutic agents. The Journal of Medical Investigation 54:235-242, 2007 103. Oroudjev E, Lopus M, Wilson L, Audette C, Provenzano C, Erickson H, Kovtun Y, Chari R, Jordan MA: Maytansinoid-antibody conjugates induce mitotic arrest by suppressing microtubule dynamic instability. Molecular cancer therapy 9: 2700-2713, 2010. 104. Ozben T: Mechanisms and strategies to overcome multiple drug resistance in cancer. FEBS Letter 580:2903-2909, 2006. 105. Parker KA, Glaysher S, Hurren J, Knight LA, McCormick D, Suovouri A, Amberger-Murphy V, Pilkington GJ, Cree IA: The effect of tricyclic antidepresants on cutaneous melanoma cell lines and primary cell cultures. Anti-cancer drugs 23:65-69, 2012. 106. Parmar JJ, Singh DJ, Lohade AA, Hegde DD, Soni PS, Samad A, Menon MD: Inhalational system for etoposide liposomes: Formulation development and in vitro deposition. Indian journal of pharmaceutical sciences 73:656-662, 2011. 107. Pasquier E, Ciccolini J, Carre M, Giacometti S, Fanciullino R, Pouchy C, Montero M-P, Serdjebi C, Kavallaris M, Andre N: Propranolol potentiates the anti-angiogenic effects and anti-tumor efficacy of chemotherapy agents: implication in breast cancer treatment. Oncotarget 2:797-809, 2011. 108. Patanasethanont D, Nagai J, Matsuura C, Fukui K, Sutthanut K, Sripanidkulchai BO, Yumoto R, Takano M: Modulation of Function of Multidrug Resistance Associated -Proteins by Kaempferia Parviflora Extracts and Their Components. European Journal of Pharmacology 566:67-74, 2007.

58

109. Patel K, Doudican NA, Schiff PB, Orlow SJ: Albendazole sensitizes cancer cells to ionizing radiation. Radiation Oncology 6:160, 2011. 110. Pharmacology weekly: seznam efluxních transportérů http://www.pharmacologyweekly.com/content/pages/medications -drugs-substrates-inhibitorsinducers-efflux-transporters staženo 25.4.2013 111. Pourgholami MH, Woon L, Almajd R, Akhter J., Bowery P, Morris DL: In vitro and in vivo suppression of growth of hepatocellular carcinoma cells by albendazole. Cancer Letters 165:4349, 2001. 112. Pribylova M, Dvořáková M, Vaněk T: Deriváty paklitaxelu pro cílen ý transport cytostatika. Chemické listy 104:1023-1028, 2010. 113. Příčiny rakoviny: http://www.cba.muni.cz/prevencenemoci/modules.php?name=Content&pa=showpage&pid=4 – staženo 15. 2. 2013. 114. Rajkumar SV, Kyle RA: Thalidomide in the treatment of plasma cell malignancies. Journal of Clinical Oncology 19: 3593-3595, 2001. 115. Robert NJ, Vogel CL, Henderson IC, Sparano J, Moore MR, Silverman P et al.: The role of the liposomal anthracyclines and other systemic therapies in the management of advanced breast cancer. Seminars in Oncology 31: 106-146, 2004. 116. Roztočil A a kolektiv: Moderní gynekologie: Kapitola 20 – Onkogynekologie. Grada Publishing, ISBN: 978-80-247-2832-2, 2011. 117. Sadzuka Y, Hatakeyama H, Sonobe T: Enhancement of Doxorubicin Concentration in the M5076 Ovarian Sarcoma Cells by Cucurbitacin E Co-Treatment. International Journal of Pharmacology 383:186-191, 2010. 118. Safavy A, Bonner JA, Waksal HW, Buchsbaum DJ, Gillespie GY, Khazaeli MB, Arani R, Chen D-T, Carpenter M, Raisch KP: Synthesis and biological evaluation of Paclitaxel-C225 Conjugate as a model for targeted drug delivery. Bioconjugate Chemistry 14:302-310, 2003. 119. Sampedro F, Partika J, Santalo P, Molins-Pujol A-P, Bonal J, Perez-Soler R: Liposomes as carriers of different new lipophilic antitumor drugs: a preliminary report. Journal of microencapsulation 11:309-318, 1994. 120. Santivanez S, Garcia HH: Pulmonary cystic echinococcosis. Current Opinium in Pulmonary Medicine 16:257-261, 2010. 121. Schiff PB, Fant J, Horwitz SB: Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature 277:665-667, 1979. 122. Schimmel KJ, Richel DJ, van den Brink RB, Guchelaar HJ: Cardiotoxicity of cytotoxic drugs. Cancer Treatment Reviews 30:181−191, 2004. 123. Schonn I, Hennesen J, Dartsch DC: Cellular responses to etoposide: cell death despite cell cycle arrest and repair of DNA damage. Apoptosis 15:162-172, 2010. 124. Sengupta S, Tyagi P, Chandra S, Kochupillai V, Gupta SK: Encapsulation in cationic liposomes enhances antitumor efficacy and reduces the toxicity of etoposide, a topoisomerase II inhibitor. Pharmacology 62:163-171, 2001. 125. Senter PD: Potent antibody drug conjugates for cancer therapy. Current opinion in chemical biology 13:235-244, 2009. 126. Sereno M, Brunello A, Chiappori A, Barriuso J, Casado E, Belda C, de Castro J, Feliu J, Gonzáles-Barón M: Cardiac toxicity: old and new issues in anti-cancer drugs. Clinical & Translation Oncology 10:35-46, 2008. 127. Singh Y, Palombo M, Sinko PJ: Recent Trends in Targeted anticancer prodrug and conjugate design. Current Medicinal Chemistry 15:1802-1826, 2008. 128. Sistla A, Smith DJ, Kobrinsky NL, Kumar K: Pharmacokinetics and tissue distribution of liposomal etoposide in rats. Drug delivery 16:423-429, 2009. 129. Sivakumar G: Colchicine Semisyntehtics: Chemotherapeutics for cancer? Current Medicinal Chemistry 20:892-898, 2012.

59

130. Škarydová L, Skarka A, Novotna R, Zivna L, Martin HJ, Wsol V, Maser E: Partial purification and characterisation of a new human membrane-bound carbonyl reductase playing a role in the deactivation of the anticancer drug oracin. Toxicology 264:52-60, 2009a. 131. Skladanowski A, Come MG, Sabisz M, Escargueil AE, Larsen AK: Down-regulation of DNA topoisomerase Ilα leads to prolonged cell cycle transit in G2 and early M phas es and increased survival to microtubule-interacting agents. Molecular Pharmacology 68:625-634, 2005. 132. Spagnuolo PA, Hu J, Hurren R et al.: The antihelmintic flubendazole inhibits microtubule function through a mechanism distinct from Vinca alkaloids and displays preclinical activity in leukemia and myeloma. Blood 115:4824-4833, 2010. 133. Sui M, Fan W: Combination of γ-radiation antagonizes the cytotoxic effects of vincristine and vinblastine on both mitotic arrest and apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics 61:1151-1158, 2005. 134. Surapaneni MS, Das SK Das NG: Designing Paclitaxel drug delivery systems aimed at improved patient outcomes: current status and chalenges. ISRN pharmacology, doi: 10.5402/2012/623139, 2012. 135. Svoboda KP, Inglis A, Hampson J, Galambosi B, Asakawa Y: Biomass production essential oil yield and composition of Myrica gale L. harvested from wild population in Scotland and Finland. Flavour and Fragrance Journal 13:367-372, 1998. 136. Sylvestre M, Legault J, Dufour D, Pichette A: Chemical composition and anticancer activity of leaf essential oil of Myrica gale L. Phytomedicine 12:299-304, 2005. 137. Szepeshazi K, Schally AV, Halmos Gabor: LH-RH receptors in human colorectal cancers: Unexpected molecular targets for experimental therapy. International journal of oncology 30:1485-1492, 2007. 138. SZÚ: http://www.szu.cz/tema/prevence/nadorova-onemocneni – staženo 15. 2. 2013. 139. Tan W, Lu J, Huang M, Li Y, Chen M, Wu G, Gong J, Zhong Z, Xu Z, Dang Y, Guo J, Chen X, Wang Y: Anti-cancer natural products isolated from chinese medicinal herbs. Chinese medicine 6:27, 2011. 140. Tanaka M, Bateman R, Rauh D, Vaisberg E, Ramachandani S, Zhang C, Hansen KC, Burlingame AL, Trautman JK, Shokat KM, Adams CL: An unbiased cell morphology -based screen for new, biologically active small molecules. Plos Biology 3:128, 2005. 141. Tasso MJ, Boddy AV, Price L, Wyllie RA, Pearson ADJ, Idle JR: Pharmacokinetics and metabolism of cyclophosphamide in paediatric patients. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 30:207-211, 1992. 142. Theodoulou M, Hudis C: Cardiac profiles of liposomal anthracyclines: greater cardiac safety versus conventional doxorubicin? Cancer 100:2052-2063, 2004. 143. Thigpen JT: Innovations in anthracycline therapy: overview. Community Oncology 2:3-7, 2005. 144. Thomas AM, Kapanen AI, Hare JI, Ramsay E, Edwards K, Karlsson G, Bally MB: Development of a liposomal nanoparticle formulation of 5-fluorouracil for parenteral administration: Formulation design, pharmacokinetics and efficacy. Journal of controlled release 150:212-219, 2011. 145. Tidefelt U, Prenkert M, Paul C: Comparison of idarubicin and daunorubicin and their main metabolites regarding intracellular uptake and efect on sensitive and mutidrug -resistant HL60 cells. Cancer chemotherapy and Pharmacology 38:476-480, 1996. 146. Trédan O, Galmarini CM, Patel K, Tannock IF: Drug resistance and the solid tumor microenvironment. Journal of the National Cancer Institute 99:1441-1454, 2007. 147. Václavíková R, Boumendjel A, Ehrlichová M, Kovář J, Gut I: Modulation of paclitaxel by flavonoid derivatives in human breast cancer cells. Is there a correlation between binding affinity to NBD of P-gp and modulation of transport? Bioorganic & Medicinal Chemistry 14:4519-4525, 2006. 148. Vaclavikova R, Kondrova E, Ehrlichova M, Boumendjel A, Kovar J, Stopka P, Soucek P, Gut I: The Effect of Flavonoid Derivatives on Doxorubicin Transp ort and Metabolism. Bioorganic & Medicinal Chemistry 16:2034-2042, 2008.

60

149. Webb MS, Harasym TO, Masin D, Bally MB, Mayer LD: Sphingomyelin -cholesterol liposomes significantly enhance the pharmacokinetic and therapeutic properties of vincristine in murine and human tumour models. British Journal of Cancer 72: 896-904, 1995. 150. Veitch ZW, Guo B, Hembruff SL, Bewick AJ, Heibein AD, Eng J, Cull S, Maclean DA, Parissenti AM: Induction of 1C Aldoketoreductases and Other Drug Dose -Dependent Genes Upon Acquisition of Anthracycline Resistance. Pharmacogenetics and Genomics 19:477-488, 2009. 151. Werle M: Natural and synthetic polymers as inhibitors of drug efflux pumps. Pharmaceutical Research 25:500-511, 2008. 152. WHO: http://www.euro.who.int/en/what-we-do/health-topics/noncommunicable-diseases/cancer – staženo 15. 2. 2013. 153. Vincent MJ, Greco F, Nicholson RI, Paul A, Griffiths PC, Duncan R: Polymer therapeutics designed for a combination therapy of hormone-dependent cancer. Angewandte Chemie (International Ed. in English) 44:4061-4066, 2005. 154. Vodozova EL, Kuznetsova NR, Kadykov VA, Khutsyan SS, Gaenko GP, Molotkovsky YG: Liposomes as nanocarriers of lipid-conjugated antitumor drugs melphalan and methotrexate. Nanotechnologies in Russia 3:228-239, 2008. 155. Woo SY, Dilliplane P, Rahman A, Sinks LF: Liposomal methotrexate in the treat ment of murine L1210 leukemia. Cancer Drug Delivery 1:59-62, 1983. 156. Yoshizawa Y, Kona Y, Ogawara K, Kimura T, Higaki K: PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo dispozition and anti-tumor efficacy. International Journal of Pharmaceutics 412: 132-141, 2011. 157. Yoshizawa Y, Kona Y, Ogawara K, Kimura T, Higaki K: PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo disposition and anti-tumor efficacy. International Journal of Pharmaceutics 412:132-141, 2011. 158. Zachariae H: Methotrexate side-effects. British journal of Dermatology 122:127-133, 1990. 159. Zhang FY, Du GJ, Zhang L, Zhang CL, Lu WL, Liang W: Naringenin Enhances the Anti-Tumor Effect of Doxorubicin Through Selectively Inhibiting the Activity of Multidrug Resistance Associated Proteins but Not P-Glycoprotein. Pharmacological Research 26:914-925, 2009a. 160. Zhang J, Jin W, Wnag X, Wang J, Zhang X, Zhang Q: A novel octreotide modified lipid vesicle improved the anticancer efficacy of doxorubicin in somatostatin receptor 2 positive tumor models, Molecular Pharmaceutics 7:1159-1168, 2010. 161. Zhang S, Sagawa K, Arnold RD, Tseng E, Wang X, Morris ME: Interactions Between the Flavonoid Biochanin A and P-Glycoprotein Substrates in Rats: in Vitro and in Vivo. Journal of Pharmaceutical Sciences 99:430-441, 2010b. 162. Zhang Z, Ma L, Jiang S, Liu Z, Hunag J, Chen L, Yu H, Li Y: A self-assembled nanocarrier loading teniposide improves the oral delivery and drug concentration in tumor. Journal of Controlled Release 166:30-37, 2013. 163. Zhao LM, Zhang L-M, Liu JJ, Wan LJ, Chen Y-Q, Zhang S-Q, Yan Z-W, Jiang J-H: Synthesis and antitumor activity of conjugates of 5-FU and emodin. European Journal of medicinal chemistry 47:255-260, 2012. 164. Zheng H, Rao Y, Yin Y, Xiong X, Xu P, Lu B: Preparation, characterization and in vitro drug release behavior of 6-mercaptopurine-carboxymethyl chitosan. Carbohydrate polymers 83: 1952-1958, 2011. 165. Zimmermann TJ, Niesen FH, Pilka ES, Knapp S, Oppermann U, Maier ME: Discovery of a Potent and Selective Inhibitor for Human Carbonyl Reductase 1 From Propionate Scanning Applied to the Macrolide Zearalenone. Bioorganic & Medicinal Chemistry 17:530-536, 2009.

61

7 Přílohy 7.1 Publikace vztahující se k tématu disertační práce I.

Hanušová V, Boušová I., Skálová L. (2011). Possibilities to increase the effectivness of doxorubicin in cancer cells. Drug Metabolism Reviews, 43(4):540-557. [IF2011 =6.4]

II.

Hanušová V., Králová V., Schröterová L., Trilecová L., Pakostová A., Skálová L. (2010).The effectiveness of oracin in enhancing the cytotoxicity of doxorubicin through the inhibition of doxorubicin deactivation in breast cancer MCF7 cells. Xenobiotica, 40(10):681-690. [IF2011 =1.791]

III.

Hanušová V., Boušová, I., Pakostová A., Skálová L. (2012). The influence of oracin on reduction and toxicity of doxorubicin in hepatocytes and mammary epithelial cells MCF10A. Xenobiotica, 42(6):571-579. [IF2011 =1.791 ]

IV.

Hanušová V., Tomšík P., Kriesfalusyová L., Pakostová A., Boušová I., Skálová L. (2013). In vivo effect of oracin on doxorubicin reduction, biodistribution and efficacy in Ehrlich tumor bearing mice. Pharmacological reports, 65(2):445-452. [IF2011 =2.445]

V.

Přibylová M., Dvořáková M., Hanušová V., Neméthová I., Skálová L., Vaněk

T.

(2011).

Paclitaxel

conjugation

with

the

analog

of the

gonadotropin-releasing hormone as a targeting moiety. International Journal of Pharmaceutics, 415(1-2):175-180. [IF2011 =3.350]

VI.

Králová V., Hanušová V., Staňková P., Knoppová K., Čáňová K., Skálová L.

(2013).

Antiproliferative

effect

of

benzimidazole

anthelmintics

albendazole, ricobendazole and flubendazole in intestinal cancer cell lines. Anti-cancer drugs. Submitted [IF2011 =2.407]

62

7.1.1 Publikace I

I.

Hanušová V, Boušová I. Skálová L. (2011). Possibilities to increase the effectiveness of doxorubicin in cancer cells. Drug Metabolism Reviews. 43(4):540-57.

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

7.1.2 Publikace II

II.

Hanušová V., Králová V., Schröterová L., Trilecová L., Pakostová A., Skálová L. (2010).The effectiveness of oracin in enhancing the cytotoxicity of doxorubicin through the inhibition of doxorubicin deactivation in breast cancer MCF7 cells. Xenobiotica, 40(10):681-690.

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

7.1.3 Publikace III

III.

Hanušová V., Boušová, I., Pakostová A., Skálová L. (2012). The influence of oracin on reduction and toxicity of doxorubicin in hepatocytes and mammary epithelial cells MCF-10A. Xenobiotica, 42(6):571-579.

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

7.1.4 Publikace IV

IV.

Hanušová V., Tomšík P., Kriesfalusyová L., Pakostová A., Boušová I., Skálová L. (2013). In vivo effect of oracin on doxorubicin reduction, biodistribution and efficacy in Ehrlich tumor bearing mice. Pharmacological reports, 65(2):445-452.

103

104

105

106

107

108

109

110

111

7.1.5 Publikace V

V.

Přibylová M., Dvořáková M., Hanušová V., Neméthová I., Skálová L., Vaněk T. (2011). Paclitaxel conjugation with the analog of the gonadotropin-releasing hormone as a targeting moiety. International Journal of Pharmaceutics, 415(1-2):175-180.

112

113

114

115

116

117

118

7.1.6 Publikace VI

VI.

Králová V., Hanušová V., Staňková P., Knoppová K., Čáňová K., Skálová L. (2013). Antiproliferative effect of benzimidazole anthelmintics albendazole, ricobendazole and flubendazole in intestinal cancer cell lines. Anti-cancer drugs. Submitted

119

Antiproliferative

effect

of

benzimidazole

anthelmintics

albendazole, ricobendazole and flubendazole in intestinal cancer cell lines. Věra Kralova 1*, Veronika Hanušova 2, Petra Staňkova 2, Kateřina Knoppova 2, Kristyna Čaňova2, and Lenka Skalova 2 1Department

of Biology, Charles University in Prague, Faculty of Medicine, Šimkova 870,

Hradec Králové, CZ-500 38, Czech Republic

2Department

of Biochemical Sciences,

Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy, Heyrovského 1203, Hradec Králové, CZ-500 05, Czech Republic Abstract Purpose To test antiproliferative effect of three benzimidazole anthelmintics in intestinal cancer cells and to investigate whether these drugs that inhibit tubulin polymerization can potentiate the efficacy of microtubule- stabilizing drug paclitaxel (PTX) Methods Five intestinal cancer cell lines SW480, SW620, NCM460, HCT8 and Caco2 with different origin and growth characteristics were used. The antiproliferative effect of albendazole (ABZ), ricobendazole (RBZ), flubendazole (FLU) and their combinations with PTX was tested using three different end-point viability assays, cell cycle distribution analysis and x-Celligence System for real-time cell analysis. Results ABZ and FLU significantly inhibited cell proliferation in concentration-dependent and time-dependent manner via cell arrest in G2/M phase. RBZ was not effective in any concentration tested. The cell lines differed in sensitivity to FLU and ABZ with HCT8 being the most sensitive showing IC50 for ABZ and FLU that reached 0.4 µM and 0.9 µM, respectively. Combinations of PTX+ABZ and PTX+FLU decreased cell viability more effectively when compared to treatment with individual drugs alone. Conclusions Anthelmintic benzimidazole drugs ABZ and FLU show significant cytostatic effect and potentiate efficacy of PTX in intestinal cancer cells.

Keywords albendazole, flubendazole, paclitaxel, intestinal cancer cells, microtubule-targeting agents

120

Introduction Benzimidazole-based compounds are widely used anthelmintic drugs with low mammalian toxicity and high effectivity against a wide range of helminth species [1]. While a broad spectrum of benzimidazoles is available for veterinary use, only thiabendazole, albendazole (ABZ) and mebendazole are established in human medicine. They were studied extensively as to their pharmacology, pharmacokinetics and toxicity profiles and they has been used for decades to treat a number of human parasitic infections [2, 3]. Main anthelmintically active metabolite of ABZ, ABZ sulphoxide, is solely used under name ricobendazole (RBZ). Recently another benzimidazole derivative, flubendazole (FLU), has been registered in Europe for treatment of gut-residing nematodes in humans [4]. The molecular mechanism of action of benzimidazoles is based on specific binding to tubulin, the microtubule subunit protein, which results in disruption of microtubule structure and function and in the interference with the microtubule-mediated transport of secretory vesicles in absorptive tissues of helminths [5-7]. Microtubules play key roles in proliferation, trafficking and migration of eukaryotic cells including invasion and metastatic spread of tumor cells. Compounds interfering with microtubule structure have been integrated in chemotherapy regimens in cancer patients. These compounds have been used as anti-mitotic agents that suppress microtubule function during mitotic stage of the cell cycle [8]. The microtubule-disrupting properties of benzimidazole derivatives raised recently interest in these compounds as possible anticancer agents. Several promising reports describing anti-tumor properties of benzimidazoles in in vitro and animal models including cells resistant to standard antineoplastic agents that target the cytoskeleton has been published. ABZ was, for example, effective against hepatocellular carcinoma cells [9], epothilone-paclitaxel resistant leukemic cells [10], paclitaxel-resistant ovarian carcinoma cells [11], metastatic melanoma and small cell lung cancer cell lines [12]. FLU showed antiproliferative potential in leukemic and myeloma cell lines including

vinblastine-resistant cells. FLU bound to tubulin at a site distinct from

vinblastine and potentiated the effect of vinblastine and vincristine in leukemia xenograft model [13]. Benzimidazole anthelmintics are commonly administered orally and absorbed via the gastrointestinal tract, with varying absorption depending on the type of molecule and on the composition of the diet [3]. Low absorption rate decreased the systemic availability of the

drug, but may present an advantage when local effects are concerned. This was

demonstrated in a xenograft model of peritoneal carcinomatosis using colorectal carcinoma cell line HT-29, where ABZ after intraperitoneal administration profoundly inhibited

121

peritoneal tumor growth anthelmintics

enabling

considerable

[14]. Owing to relatively high lipophilicity of benzimidazole their

concentrations

penetration of these

through

membrane

into

intestinal cells,

benzimidazoles in intestinal cells after p.o.

administration could be reached. Therefore, we performed this study to investigate the antiproliferative potential of three benzimidazole anthelmintics ABZ, RBZ and FLU (see Fig. 1) in a panel of cell lines isolated from intestinal tumors. We also investigated whether these drugs that inhibit tubulin

polymerization can potentiate the efficacy of anticancer drug paclitaxel (PTX) that

acts via microtubule stabilizing.

Materials and Methods Chemicals and reagents FLU was purchased from Janssen Pharmaceutica (Prague, Czech Republic). ABZ, RBZ, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, coenzyme NADPH and neutral red were supplied by Sigma-Aldrich (Prague, Czech Republic). WST and BrdU kit were purchased from Roche Diagnostics (Manheim, Germany). Fetal bovine serum and gentamicin sulfate were purchased

from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) and bovine serum albumin (BSA) from

Fluka (Prague, Czech Republic). All other used chemicals were in HPLC or analytical grade.

Stock

solutions

were

prepared

in

double-distilled

deionized

water

or

dimethylsulphoxide (DMSO) and stored at 4 oC in the dark.

Cell culture Human colon cell lines were purchased in ATCC. Cells were multiplied in three passages, frozen in aliquots and stored in liquid nitrogen. The absence of mycoplasma in all cell lines used in the laboratory is periodically checked by Generi Biotech (Hradec Kralove, Czech Republic). For every sets of experiments (lasted 3-9 weeks) new storage cells were resuscitated. SW480, SW620 and NCM460 cells were maintained in DMEM medium supplemented with 10 % heat-inactivated FBS and 1 % penicillin/streptomycin. The HCT8 cells were maintained in RPMI-1640 medium supplemented with 5 % heat-inactivated FBS, 5 % heat-inactivated horse serum, 1 % Na-pyruvate and 0,5 % penicillin/streptomycin. Caco2 cells were cultured in MEME supplemented with 10 % heat-inactivated FBS, 1 % non-essential amino-acid, 1,5 % L-glutamine solution and 0,5 % penicillin/streptomycin. Cells were grown in T-75 cm2 culture flasks in a humidified atmosphere containing 5 % CO2 at 37 °C.

122

Tests of viability The FLU, ABZ and RBZ were pre-dissolved in DMSO. The concentration of DMSO in medium was 0.1 %. In screening of antiproliferative effect of individual drugs, the cells were exposed to various concentrations (0.1 – 10 µM) of tested drugs in culture medium. In

tests of combined antiproliferative effects of PTX, ABZ and FLU, fixed

concentration of PTX (10 nM) and two different concentrations of FLU (0.25 and 1.0 µM) and ABZ (0.25 and 0.5 µM) were used. The cells cultured in medium with pure DMSO without drugs were used as

control samples. The viability of cells was monitored using

xCellingence system and assayed

using following end-point tests after 24-, 48-, 72-hour

expositions

The neutral red uptake (NRU) test The cells were cultured in 96-well plates. After 48- and 72-hour exposure, medium was removed and 100 µl of neutral red-containing medium was added into each well and plates were incubated at 37 °C for additional 3 h. Then the cells were washed with 100 µl of PBS. Cells were fixed in a solution of 0.5 % formaldehyde / 1 % calcium chloride for 15 min. The neutral red dye was extracted from the viable cells with a solvent (50 % ethanol / 1 % acetic acid) by shaking for 30 min at room temperature. The absorbance of solubilized dye was measured using a spectrophotometer (Tecan Infinite M200) at wavelength 540 nm. Each

sample was assayed in 6 parallels and three independent experiments were

performed. The viabilities of treated cells were expressed as percentage of untreated controls (100 %).

The WST assay The cells were cultured in 96-well plates. After 24-, 48- and 72-hour exposure, the medium was removed and the cells were washed twice with 150 µl PBS. Then, 100 µl of culture medium containing WST-1 (0,3 mg/ml) was added to each well. Absorbance of the samples was measured immediately at 450 nm /650 nm wavelength. The samples were then placed in the incubator and the absorbance was measured again after 2 h. Each sample was assayed in 6 parallels and three independent experiments were performed. The viabilities of treated cells were expressed as percentage of untreated controls (100 %).

The BrdU assay

123

Chemiluminiscent immunoassay of cell proliferation is based on incorporation Bromodeoxyuridine (BrdU) into DNA of proliferating cells. Commercially available BrdU kit (Roche Diagnostics GmbH, 68298 Manheim, Germany) was used according to the manufacturer´s protocol. In brief, the cells (2 500 cells/well) were seeded in 96-well plates. After 24 h, the cells were treated with various concentrations of FLU, ABZ, PTX and ABZ + PTX, FLU + PTX combinations, for 48 h. Subsequently, 10 µl of BrdU-labeling solution was added to each well and the cells were incubated overnight. After removal of the BrdUlabeling solution, cells were fixed and denatured with the kit´s FixDenat solution for 30 min at room temperature. Denaturation of the DNA is necessary to improve the accessibility of the incorporated BrdU for immunodetection. After denaturation, samples were incubated for 90 min with peroxidase-conjugated anti-BrdU antibody (anti-BrdU-POD) which binds to BrdU incorporated into newly synthesized cellular DNA. The unbound anti-BrdU-POD was

washed out, chemiluminiscent substrate solution was added and chemiluminiscence of

the samples were measured using luminometer (Tecan Infinite M200).

Test of impedance using xCELLigence The system measures electrical impedance across interdigitated microelectrodes integrated at the bottom of tissue culture E-plates. The impedance measurement provides quantitative information about the biological status of the cells, including cell number, viability and morphology. 90 µl of culture medium was added into each well and plates were inserted in device for background measurement. Then, 100 µl of cell suspension was added in quadruplicate to the appropriate wells. The plates were left in incubator at 37 °C for 30 min and then plates

were inserted in the device. In the first phase, the growing

impedance (corresponding to cell

proliferation) was measured every one hour for 24 h.

After 24 h, 10 µl of exposition medium was added into each well, plates were inserted back to device and impedance was measured every hour for 72 h. Each sample was assayed in quadruplicate and two independent experiments were performed. The obtained results were expressed as percentage of untreated controls.

Cell cycle distribution analysi Cells were cultured in 75 cm2 culture flasks in 20 ml of culture medium for 24 h. Then the culture medium was replaced by fresh medium containing ABZ or FLU or 0,1 % DMSO as a control. After 24 h of treatment, the cells were trypsinized, collected by centrifugation, washed with PBS and fixed with ice-cold 70 % ethanol while gently vortexing. Fixed samples were stored overnight in 4°C. Then they were washed with PBS,

124

incubated with 0,5 ml phosphate-citrate buffer (0.2 M Na 2HPO4, 0.1 M citrate, pH 7.8) for 5 min, washed with PBS and incubated with 0,5 ml of the Vindelov solution (1.2 g/l TRIS, 0,6 g/l NyCl, 0.01 g/l Rnase and 0.05g/l propidium iodide) for 1 h at 37 °C. The samples were analysed at the Cell Lab Quanta SC MPL Flow cytometer with PI fluorescence detected in FL2 channel. Cell cycle distributions in control and treated samples were analysed with MultiCycle AV for Windows (Phoenix Flow Systems, San Diego, USA).

Statistical analysis The experiments (each performed in six replicates) were repeated three times. All calculations were performed with Microsoft Excel and GraphPad Prism 5.0. Data are presented as mean ± SD. The concentration of selective inhibitor causing 50 % decrease in cell viability (IC50) was determined by GraphPad Prism 5.0. Statistical analysis was carried out using one way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni’s test for multiple comparisons. Statistical significance was acceptable to a level of p < 0.05.

Results Antiproliferative effect of ABZ, RBZ and FLU in different colon cancer cell lines Five colon cancer cell lines NCM460, SW480, SW620, Caco2 and HCT8 were treated with different concentrations of ABZ, RBZ and FLU (0.1 – 10 µM) for 24, 48 and 72 h. After incubation, cell viability was assayed using Neutral red uptake (NRU) test and WST-1 test. While RBZ was not effective in any concentration tested, ABZ and FLU significantly inhibited cell proliferation in concentration-dependent and time-dependent manner. As RBZ did not inhibit cell proliferation in any cell line tested, only ABZ and FLU were used for further experiments. The comparison of concentration-dependent antiproliferative effect of ABZ and FLU in different cancer cell lines after 48-hour treatment is shown in Fig. 2. The IC 50 values for ABZ and FLU in colon cell lines are shown in Table 1. Interestingly, FLU and ABZ slightly differed in efficacy in various cell lines. Comparing IC 50 of both drugs, FLU was more effective in HCT8 and Caco2 cells, while ABZ showed more pronounced effect in SW480 cells. Also individual cell lines differed in sensitivity to FLU and ABZ with HCT8, Caco2 and SW480 being the most sensitive. In HCT8 cells, the IC 50 for ABZ and FLU reached 0.4 µM and 0.9 µM, respectively. Lines HCT8, Caco2 and SW480 were chosen for further experiments.

Fig. 2 and 3 hereabout

125

Tab. 1 hereabout

Fig. 3 demonstrates time-dependence of antiproliferative effect of ABZ and FLU in SW480 cells. Similar results were obtained in other cell lines (data not shown).

Effect of ABZ and FLU on cell cycle distribution. The effect of ABZ and FLU on the cell cycle distribution in SW 480 cells after 24hour treatment is shown in Fig. 4. Both compounds induced a concentration-dependent increase in G2/M phase in comparison to the control samples, which was more prominent after FLU treatment. While ABZ was effective starting from the 0.4 µM concentration, FLU induced comparable shift in the cell cycle distribution already at the 0.2 µM concentration. Increasing concentrations of FLU caused rapid increase in G2/M portion of the cell cycle which reached 90 % at the concentration 1 µM, compared to 54 % in samples treated with 1 µM ABZ.

Fig.4 hereabout

Antiproliferative effect of ABZ and FLU in combination with PTX in cancer colon cell lines. Two colon cancer cell lines, Caco2 and HCT8, were treated with PTX, ABZ and FLU alone and with combinations ABZ+PTX and FLU+PTX. Fixed low concentration of PTX (10 nM) and two different concentrations of FLU (0.25 and 1.0 µM) and ABZ (0.25 and 0.5 µM) were used. The concentrations of FLU and ABZ were chosen according to the results of previous experiments in these cell lines. Higher concentrations of FLU than ABZ were used as FLU possessed higher values of IC 50. 10 nM concentration of PTX was the highest concentration without significant antiproliferative effect. After 72- hour incubation, cell viability was assayed using NRU test and BrdU test. Results are shown in Fig. 5.

Fig.5 hereabout

In both cell lines, addition of ABZ as well as FLU to PTX significantly potentiated antiproliferative effect of PTX alone. This potentiation was the most pronounced in case of HCT8 cells with the lower concentration of ABZ: while PTX alone and ABZ (0.25 µM) alone had no significant effect on cell viability, combination of PTX+ABZ killed approx. 50 % of cells.

126

Effect of PTX addition to antiproliferative effect of anthelmintics differed between ABZ and FLU and also between HCT8 and Caco2 lines. In Caco2 cells, the combinations of ABZ+PTX had more pronounced antiproliferative effect than ABZ alone, while FLU+PTX combinations exhibited similar antiproliferative effect as FLU alone. In HCT8 cells, combination of PTX with 0.25 µM FLU stopped cell proliferation more effectively than 0.25 µM FLU alone but combination of PTX with 1.0 µM FLU showed similar effect as 1.0 µM FLU alone. Both combinations of ABZ+PTX decreased cell proliferation more effectively than ABZ alone. To confirm these results, viability of HCT8 cells treated with PTX, ABZ and FLU alone and with combinations ABZ+PTX and FLU + PTX was monitored for 72 h using XCelligence System for Real-time cell assay (RTCA, Roche). As in previous experiment, fixed concentration of PTX (10 nM) and two different concentrations of FLU (0.25 and 1 µM) and ABZ (0.25 and 0.5 µM) were used. Results (see Fig 6) proved that FLU as well as ABZ potentiated antiproliferative effect of PTX in HCT8 cells.

Fig. 6 hereabout

Discussion Drugs

approved for

indications

other

than cancer that possess previously

unrecognized cytostatic effect toward cancer cells could be rapidly repurposed for this new indication given their prior toxicity testing in humans and animals [13]. This could be a case of benzimidazole anthelmintics FLU, ABZ and RBZ which are used in medicine for a long time. The mechanism of action of benzimidazoles is mainly based on their binding to microtubule subunit protein, which results in disruption of microtubule structure and function in helminths. Moreover, benzimidazoles have been also shown to inhibit glucose uptake to deplete glycogen stores and to decrease formation of ATP leading to the death of the parasite [15]. The abilities of benzimidazoles to inhibit microtubule formation and glucose uptake predetermine the benzimidazoles to possible cytostatic effects. Therefore, anticancer efficacy of benzimidazoles has been studied and antiproliferative effect of FLU and/or ABZ was described in leukemic, ovarian, myeloma, melanoma, hepatocellular, breast and lung cancer cells. Regardless promising results, certain problems arose from low systemic bioavailability of possibilities

to

benzimidazoles overcome

this

after

p.o.

problem

by

administration [16]. complexation

of

In spite of some benzimidazoles

with

hydroxypropyl-cyclodextrin or loading into chitosan-alginate microspheres [17, 18], low

127

bioavailability represent considerable limitation for use of benzimidazoles in treatment of many tumors. On the other hand, high lipophilicity and low systemic bioavailability could present an advantage of benzimidazoles in their possible use for treatment of tumors in gastrointestinal tract. After p. o. administration, easy entry of benzimidazoles trough plasma membranes and their accumulation into intestinal cells could be expected. Regardless this fact, ABZ and RBZ anticancer efficacy has been studied only in one intestinal cell line (HT29) and FLU efficacy in any intestinal cells has not yet been assayed. Therefore, our study was designed to test and compare antiproliferative effect of FLU, ABZ and RBZ in a panel of intestinal cell lines. Firstly, the cytostatic effect of these benzimidazoles was assayed using three different end-point tests of cell viability and monitored using flow cytometer and xCelligence System for real-time cell analysis. In the case of RBZ, obtained results did not show any antiproliferative effect up to the highest concentration tested (10 µM). When antiproliferative effect of RBZ (ABZ-sulfoxide) was tested in HT-29 cells, significant antiproliferative effect (IC50 = 2.35 µM) was observed [14]. On the other hand, only weak antiproliferative effect of RBZ (with IC50 around 40 µM) was described in breast, lung and melanoma cancer cells [19]. Low antiproliferative effect of RBZ could be related to its higher hydrophilicity (in comparison to ABZ or FLU) which can limit its penetration into cells. Moreover, RBZ was

reported as a good substrate for BCRP and P-glycoprotein

transporters in kidney cells [20] and thus interaction of RBZ with these efflux transporters might contribute to its lower cytostatic efficacy. Contrary to RBZ, FLU and ABZ significantly inhibited cell proliferation in timeand concentration-dependent manner in all intestinal cell lines tested. Five cancer cell lines with different origin and proliferation rate were used: non-metastatic SW480 established from a primary adenocarcinoma of the colon, its metastatic derivative SW620, normal human colon mucosal cell line NCM460; human epithelial colorectal adenocarcinoma Caco2 and human ileocecal adenocarcinoma cell line HCT8 [21]. Individual cell lines differed in sensitivity to FLU and ABZ, HCT8 being the most sensitive to both drugs with IC50 0.3 µM and 0.9 µM. Hepatocellular carcinoma cells HepG2, Hep3-B, SKDEP-1, HTC, Novikoff, Hep1-6 exhibited similar sensitivity to ABZ (IC 50 0.2-0.4 µM) [9], in colorectal cell line HT-29 ABZ was more effective (IC50 0.12 leukemia cells, FLU had

µM) [14]. In several myeloma and

IC50 below 1 µM [13]. In intestinal cell lines (with exception

HCT8), ABZ as well as FLU exhibited mildly higher IC50 (1.2 -6.8 µM). Similar values of IC50 for ABZ were observed in breast, lung and myeloma cancer cells [19]. Whereas these

128

concentrations of benzimidazoles could be easily reached in intestinal cells (e.g. usual oral dose for FLU is 200 mg in treatment of parasitic diseases in human), much lower concentrations were found in blood [16]. Comparing FLU and ABZ, their antiproliferative effect significantly differed in some intestinal cell lines: while in HCT8 cells IC 50 was 3-times lower for ABZ than for FLU, in SW480 was ABZ less effective than FLU with IC50 2.5-times higher. These results might indicate certain differences in mechanisms of action of both drugs. Measurement of cell cycle distribution did not show significant differences between both drugs: FLU as well as ABZ treatment led to arrest of SW480 cells in G2/M phase. FLU caused significant shift in cell distribution at lower concentration than ABZ which is in agreement with lower IC 50 for FLU obtained using tests of cell viability in this cell line. No concentration of ABZ or FLU tested led to arrest of SW480 cells in G0/G1 phase, while in hepatoma cells, ABZ at 0.25 µM caused cell arrest in this phase of the cell cycle [9]. But in all other cell lines reported, ABZ or FLU treatment stopped cell cycle in G2/M phase [13,14], which is in agreement with ability of

benzimidazoles to inhibit microtubule structures essential for cell

division. In second part of the project, we tested the antiproliferative effect of FLU and ABZ in combination with PTX with the aim to find out whether benzimidazoles that inhibit tubulin polymerization can potentiate efficacy of PTX that acts via microtubule stabilizing. PTX, well known suppressor of microtubule dynamics, is a leading anticancer drug in chemotherapy of lung, ovarian, breast, head and neck cancer. It stabilizes microtubules and, as a result, interferes with the normal breakdown of microtubules during cell division [22]. Recent studies have demonstrated that suppression of microtubule dynamics occurs at concentrations lower than those needed to block mitosis. At the higher therapeutic concentrations, PTX

appears to suppress microtubule detachment from centrosomes, a

process normally activated

during mitosis [23]. Although PTX is not commonly used in

colon cancer therapy, many recent studies have shown that PTX, particularly encapsulated, could be effective also in these types of cancer [24,25]. In our experiments, PTX significantly inhibited proliferation of intestinal cancer cell lines and reached IC50 at 1.5 µM and 2.4 µM concentrations in Caco2 and HCT8 cells, respectively. When combinations of PTX with ABZ or with FLU were tested, fixed 10 nM concentration of PTX was chosen as treatment of cells with 10 nM PTX alone had very mild, mostly insignificant effect on cell proliferation. Combinations of PTX with ABZ or with FLU in Caco2 and HCT8 cells caused more effective inhibition of cell proliferation when compared to PTX alone. The most intensive potentiation was reached in combination

129

of PTX with low concentrations of ABZ or FLU. Comparing effects of those combinations with effect of FLU and ABZ alone, certain differences between both benzimidazoles were observed. This finding indicates again differences in mechanism of action of both drugs. Interestingly,

potentiation

combinations were more

of

antiproliferative

effect of

PTX+ABZ and PTX+FLU

pronounced in HCT8 cells than in Caco2, although PTX alone

was more effective in Caco2 cells. Therefore, benzimidazoles seem to be able inhibit proliferation of cells with lower sensitivity to PTX. This assumption is supported by results of Chu et al. [11], which showed ABZ to be highly effective in PTX-resistant ovarian cancer cells. This observation could be explained by fact, that ABZ contrary to PTX is not substrate of efflux transporters BCRP, MRP2 and MDR1 (P-glycoprotein) obviously overexpressed in resistant cancer cells [26,27]. The inability of efflux transporters to eliminate ABZ from the cells indicates that this drug could be effective in treatment of multidrug resistant cancers, but this possibility should be verified by further studies. In conclusion, anthelmintic benzimidazole drugs ABZ and FLU have significant cytostatic effect and potentiate efficacy of PTX in intestinal cancer cell lines.

Acknowledgements This work was supported by The Ministry of Education Czech Republic research project SVV267 004 and by the programme PRVOUK P37/01.

References [1] Kohler P (2001) The biochemical basis of anthelmintic action and resistance. Int J Parasitol 31:336-345. [2] Velik J, Baliharova V, Fink-Gremmels J, Bull S, Lamka J and Skalova L (2004) Benzimidazole drugs and modulation of biotransformation enzymes. Res Vet Sci 76:95108. [3] Dayan AD (2003) Albendazole, mebendazole and praziquantel. Review of non-clinical toxicity and pharmacokinetics. Acta Trop 86:141-159. [4] Mackenzie CD and Geary TG (2011) Flubendazole: a candidate macrofilaricide for lymphatic filariasis and onchocerciasis field programs. Expert Rev Anti Infect Ther 9:497501.

130

[5] Kohler P and Bachmann R (1981) Intestinal tubulin as possible target for the chemotherapeutic action of mebendazole in parasitic nematodes. Mol Biochem Parasitol 4:325-336. [6] Jasmer DP, Yao C, Rehman A and Johnson S (2000) Multiple lethal effects induced by a

benzimidazole anthelmintic in the anterior intestine of the nematode Haemonchus

contortus. Mol Biochem Parasitol 105:81-90. [7] Lacey E (1988) The role of the cytoskeletal protein, tubulin, in the mode of action and mechanism of drug resistance to benzimidazoles. Int J Parasitol 18:885-936. [8] Dumontet C and Jordan MA (2010) Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov 9:790-803. [9] Pourgholami MH, Woon L, Almajd R, Akhter J., Bowery P and Morris DL (2001) In vitro

and in vivo suppression of growth of hepatocellular carcinoma cells by albendazole.

Cancer Lett 165:43-49. [10] Khalilzadeh A, Wangoo KT, Morris DL and Pourgholami MH (2007) Epothilonepaclitaxel

resistant

leukemic

cells

CEM/dEpoB300

are

sensitive

to

albendazole:

Involvement of apoptotic pathways. Biochem Pharmacol 74:407-414. [11] Chu SW, Badar S, Morris DL and Pourgholami MH (2009) Potent inhibition of tubulin polymerisation and proliferation of paclitaxel-resistant 1A9PTX22 human ovarian cancer cells by albendazole. Anticancer Res 29:3791-3796. [12] Patel K, Doudican NA, Schiff PB and Orlow SJ (2011) Albendazole sensitizes cancer cells to ionizing radiation. Radiat Oncol 6:160. [13] Spagnuolo PA, Hu J, Hurren R et al. (2010) The antihelmintic flubendazole inhibits microtubule function through a mechanism distinct from Vinca alkaloids and displays preclinical activity in leukemia and myeloma. Blood 115:4824-4833. [14] Pourgholami MH, Akhter J, Wang L, Lu Y and Morris DL (2005) Antitumor activity of

albendazole against the human colorectal cancer cell line HT-29: in vitro and in a

xenograft model of peritoneal carcinomatosis. Cancer Chemother Pharmacol 55:425-432. [15] Jasra N, Sanyal SN, Khera S (1990) Effect of thiabendazole and fenbendazole on glucose uptake and carbohydrate metabolism in Trichuris globulosa. Vet parasitol 35: 201209. [16] http://www.ema.europa.eu. Accessed 20 February 2013. [17] Ehteda A, Galletis P, Chu SWL, Pillaii K, Morris DL (2012) Complexation of albendazole

with

pharmacokinetic

hydroxypropyl-beta-cyclodextrin

significantly

improves

its

profile, cell cytotoxicity and antitumor efficacy in nude mice. Anticancer

Res 32:3659-3666.

131

[18] Simi SP, Saraswathi SP, Sankar C, Krishnan PN, Dilip C, Ameena K (2010) Formulation

and evaluation of albendazole microcapsules for colon delivery using

chitosan. Asian Pacific J Trop Med 3: 374-378. [19] Belaz KRA, Denadai M, Almeida AP, Lima RT, Vasconcelos MH, Pinto MM, Cass QB,

Oliveira

RV

(2012)

Enantiomeric

resolution

of

albendazole

sulfoxide

by

semipreparative HPLC and in vitro study of growth inhibitory effects on human cancer cell lines. J Pharmaceut Biomed Anal 66:100-108. [20] Muenster U, Grieshop B, Ickenroth K, Gnoth MJ (2008) Characterization of substrates and inhibitors for the in vitro assessment of Bcrp mediated drug-drug interactions. Pharmaceut Res 25: 2320-2326. [21] http://www.lgcstandards-atcc.org/. Accessed 11 February 2013. [22] Jordan MA, Wilson, L (2004) Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Rev Cancer 4:253–65. [23] Ganguly A, Yang H, Cabral F (2010) Paclitaxel-dependent cell lines reveal a novel drug activity. Mol Cancer Therap 9:2914–23. [24] Yoshizawa Y, Kona Y, Ogawara K, Kimura T, Higaki K (2011) PEG liposomalization of

paclitaxel improved its in vivo disposition and anti-tumor efficacy. Int J Pharmaceutics

412:132-141. [25] Lee SJ, Hong GY, jeong YI, Kang MS, Oh JS, Song CE, Lee HC (2012) Paclitaxelincorporated nanoparticles of hydrophobized polysaccharide and their antitumor activity. Int J pharmaceutics 43: 121-128. [26] Merino G, Jonker JW, Wagenaar E, Pulido MM, Molina AJ, Alvarez AI, Schinkel AH (2005)

Transport

of

benzimidazole

drugs

by

breast

cancer

resistance

protein

(BCRP/ABCG2). Drug Metab Dispos 33:614-618. [27] Dupuy J, Alvinerie M, Menez C, Lespine A (2010) Interaction of anthelmintic drugs with

P-glycoprotein in recombinant LLC-PK1-mdr1a cells. Chem-Biol Interact 186: 280-

286.

132

Table 1: Values of IC50 (µM) of ABZ and FLU in five intestinal cancer cell lines after 48hour treatment. The viability was assayed using NRU test. The data respresent the mean ± S.D.

SW 480

SW 620

NCM 460

CACO2

HCT8

ABZ

4.4 ± 0.2

6.8 ± 0.2

3.5 ± 0.2

1.2 ± 0.2

0.3 ± 0.1

FLU

1.9 ± 0.2

6.5 ± 0.2

6.5 ± 0.2

1.9 ± 0.3

0.9 ± 0.2

133

Fig. 1: Structures of benzimidazoles.

134

Fig. 2: Cell viability (measured using NRU test) after 48-hour treatment of five intestinal cell lines with ABZ and FLU at concentration range 0.1 – 10 µM. Results were expressed as percentage of control (=100 %). Data represent the means from three independent experiments (with six parallels in each); S.D. does not exceed 10 %.

135

Fig. 3: Cell viability (measured using WST test) after 24-,48- and 72- hour treatment of SW480 cells with ABZ and FLU at concentration range 0.1 – 10 µM. Results were expressed as percentage of control (=100 %). Data represent the mean ± S.D. from three independent experiments (with six parallels in each).

136

100

% buněk

80

60 G1 S 40

G2/M

20

0

control

0,2

0,3

0,4

0,5

1

koncentrace albendazolu [uM] 100

% buněk

80

60

G1

S

40

G2/M

20

0 control

0,2

0,3

0,4

0,5

1

koncentrace flubendazolu[uM]

Fig. 4: Cell cycle distribution after 24-hour treatment of SW480 cell line with FLU and ABZ at concentration range 0.1 – 1 µM. Total number of cells =100 %. Data represent the mean ± S.D. from two independent experiments (with three parallels in each). * significant (P ≤ 0.5) difference from control.

137

Fig. 5: Cell viability, measured using NRU test (A, B) or BrdU test (C, D) after 72- hour treatment of Caco2

and HCT8 cells with PTX ABZ and FLU alone or with

combinations PTX+ABZ and PTX+FLU. Results were

expressed as percentage of

control (=100 %). Data represents the mean ± S.D. from two independent experiments (with six parallels in each). Significant differences between effect of benzimidazoles alone and their combinations with PTX are starred (* P≤0.05; ** P≤0.01; *** P≤0.001)

138

Fig.6: Cell proliferation of HCT8 cells monitored for 72 hours by X-Celligence system. Cells were treated with PTX ABZ and FLU alone or with combinations PTX+FLU and PTX+ABZ. Data represents the mean ± S.D. from two independent experiments (with three parallels in each).

139

7.2 Ostatní publikace v recenzovaných časopisech: Křížová-Forstová V., Lamka J., Cvilink V., Hanušová V., Skálová L. (2011). Factors affecting pharmacokinetics of benzimidazole anthelmintics in food-producing animals: The consequences and potential risks. Research in veterinary science. 91(3):333-341. [IF2011 =1.649].

7.3 Abstrakta z konferencí: Hanušová V., Skálová L. (2010): Possibilities to increase the effectivness of doxorubicin in breast cancer. Acta Medica, Vol. 3, 173. 60. Česko-Slovenské Farmakologické dny, 15. -17. 9. 2010; Hradec Králové, Česká republika Hanušová V., Vildová L., Králová V., Schröterová L., Trilecová L., Pakostová A., Skálová L. (2010): The effectiveness of oracin in enhancing the cytotoxicity of doxorubicin through the inhibition of doxorubicin deactivation in breast cancer cell line MCF-7, Sborník abstraktů: XXII. Biochemický Zjazd, 8. -12. 9. 2010; Martin, Slovensko

Hanušová V.; Pakostová A.; Skálová L. (2011): The influence of oracin on the cytotoxicity of doxorubicin in breast cancer cell line MCF-7 and human mammary epithelial cells MCF-10A, The FEBS Journal, Vol. 278, Supplement 1, 210: 36th FEBS Congress, Biochemistry for Tomorrows Medicine, 25. -30. 6. 2011; Turín, Itálie Hanušová V., Pakostová A., Skálová L. (2011): The influence of oracin on reduction and toxicity of doxorubicin in hepatocytes, Sborník abstraktů: XXVI. Xenobiochemické Sympózium, 7. -9. 9. 2011, Trenčianské Teplice, Slovensko Kotelevets N., Fabbro D., Hanušová V., Huwiler A., Zangemeister-Wittke U. (2012): Targeting sphingosine kinase 1 in carcinoma cells decreases proliferation and survival by compromising PKC activity and cytokinesis, Book of abstracts: 11th International Summer School – Inflammation, Immunomodulation, Inspiration; 12. -14. 8. 2012; Bönigen, Switzerland

140

7.4 Seznam zkratek:

5-FU

5-fluorouracil

6-MP

6-merkaptopurin

ABC transportéry

ATP binding cassette transporters

ABZ

albendazol

AKR

aldoketoreduktasy

ALDH

aldehyddehydrogenasa

BCRP

„breast cancer resistance protein“

BSEP

„bile salt export pump“

CBR1

karbonylreduktasa 1

CD

povrchové molekuly

CDK

cyklin dependentní kinasy

CNS

centrální nervový systém

CYP

cytochrom P450

DAU

daunorubicin

DAUNOL

daunorubicinol

DNA

deoxyribonukleová kyselina

DOX

doxorubicin

DOXOL

doxorubicinol

EGFR

epidermální růstový faktor

EPR efekt

„enhanced permeability and retention effect“

EST

Ehrlichův solidní tumor

Fas

transmembránový protein

FGF

fibroblastový růstový faktor

FLU

flubendazol

FSH

folikuly stimulující hormon

GH

růstový hormon

GIT

gastrointestinální trakt

GnRH

gonadotropní hormon

GSH

glutathion

hCG

lidský choriogonadotropin

HER2

lidský epidermální růstový faktor 2

141

HIF-1α

hypoxii indukovatelný faktor 1

HPMA

N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide

IC50

koncentrace léčiva inhibující proliferaci buněk z 50 %

LeY antigen

Lewis antigen – karbohydrátový antigen exprimovaný na mnoha nádorech

LH

luteinizační hormon

LHRH

„luteinizing hormone releasing hormone“ - gonadotropní hormon

mAb

monoklonální protilátka

MDR

„multidrug resistance protein“

MMP

matrixová metaloproteinasa

MRP

„multidrug resistance associated protein“

MTX

metotrexát

NFκβ

nukleární faktor kappa β

ORC

oracin

OTR

receptor vázající oxytocin

PEG

polyethylenglykol

PTX

paklitaxel

RNA

ribonukleová kyselina

ROS

reaktivní formy kyslíku

SST

somatostatin

SSTR

receptor somatostatinu

STAT3

signální transduktor a aktivátor transkripce 3

SZÚ

Státní zdravotní ústav

TSH

tyreotropní hormon

VEGF

vaskulární endoteliální růstový faktor

VEGFR

receptor vaskulárního endoteliálního růstového faktoru

WHO

Světová zdravotnická organizace

142