UNIVERSITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická Fakulta v Hradci Králové
Rigorosní práce
Vliv pH na transdermální permeaci adefoviru
Kateřina Lorencová, 2007
Poděkování: Děkuji PharmDr. Kateřině Vávrové, Ph.D., za profesionální přístup a nemalou pomoc při vypracování mé rigorosní práce.
OBSAH Abstract - anglická verze .............................................................................. 3 Abstrakt - česká verze ................................................................................... 4 1. ÚVOD A CÍL PRÁCE ............................................................................... 5 2. TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................... 7 2.1. Hepatitida B ................................................................................. 7 2.2. Adefovir (PMEA) dipivoxil ......................................................... 9 2.2.1. Mechanismus účinku ..................................................... 9 2.2.2. Farmakokinetika ........................................................... 10 2.2.3. Fyzikálně chemické vlastnosti ....................................... 10 2.3. Transdermální podání léčiv ........................................................ 12 2.3.1. Výhody transdermálního podání léčiv .......................... 13 2.3.2. Nevýhody transdermálního podání léčiv ...................... 13 2.4. Kožní bariéra ............................................................................... 14 2.4.1. Stratum corneum ........................................................... 15 2.4.1.1. Lipidy tvořící SC ............................................. 15 2.4.2. Permeace látek přes kůži ............................................... 16 2.4.3. Fyzikálně-chemické parametry permeace ..................... 17 2.5. Akceleranty kožní permeace ...................................................... 18 2.5.1. Rozdělení akcelerantů ................................................... 19 2.5.2. Mechanismus účinku akcelerantů ................................ 19 2.5.2.1. Interakce s intercelulárními lipidy ................. 20 2.5.2.2. Interakce s proteinovými strukturami ............ 20 2.5.2.3. Podpora rozdělování ........................................ 20 2.5.2.4. Mechanismus tvorby iontového páru ............. 20 2.5.2.5. Námi použité akceleranty ................................ 21 2.6. Modely membrán .......................................................................... 22 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ...................................................................... 23 3.1. Použité chemikálie ........................................................................ 23 3.2. HPLC ............................................................................................. 23 3.3. Donorové vzorky ........................................................................... 23 3.4. Příprava kůže ................................................................................ 24 3.5. Permeační experimenty ................................................................ 24 3.6. Stanovení PMEA v kůži ................................................................ 25 1
3.7. Stanovení distribučního koeficientu SC/vehikulum .................. 26 3.8. Vyhodnocení dat ........................................................................... 26 4. VÝSLEDKY ................................................................................................. 27 5. DISKUSE ...................................................................................................... 42 6. ZÁVĚR .......................................................................................................... 46 7. LITERATURA ............................................................................................. 47 8. PŘÍLOHA ..................................................................................................... 52
2
ABSTRACT: Adefovir (PMEA) belong to the group of acyclic nucleoside analogues exhibiting various biological (e.g. antiviral, cytostatic, antiparasitic, immunomodulatory) activities. Its prodrug adefovir dipivoxil (PMEAd) has recently been approved for the treatment of chronic hepatitis B. The aim of this work was to study permeation properties of 2% PMEA in vitro in the broad spectrum of pH using different vehicles with or within presence of permeation enhancers. We also evaluated penetration of PMEA into the porcine skin. Transdermal permeation of 2% PMEA was studied in vitro using the Franz diffusion cell and full-thickness porcine skin. Tris, phosphate buffer (PB) and water (only for pH 3.4) were used as vehicles, pH was in range from 3.4 to 8.8. 1% Dodecyl 6dimethylaminohexanoat (DDAK) and 1% Transkarbam 12 (5-dodecyloxycarbonyl) pentylammonium-5-(dodecyloxycarbonyl)pentylcarbamate
(T12))
were
used
as
permeation enhancers. The flux values were 1.8 ± 0.5, 0.2 ± 0.1, and 0.7 ± 0.4 μg/cm2/h from aqueous, PB and Tris donor samples at pH 3.4. The respective skin concentrations at 48 h were 294 ± 75, 110 ± 39, and 178 ± 71 μg/g from these vehicles. The flux values of 2% PMEA in PB were from 0.2 ± 0.1 to 2.7 ± 1.32, and from 9.4 ± 4.3 to 26.9 ± 3.4 μg/cm2/h without and with the presence of 1% DDAK, respectively, over the pH range from 3.4 to 8.8. The flux values of 2% PMEA in Tris were from 0.7 ± 0.4 to 5.4 ± 2.4, and 1.7 ± 0.5 to 11.3 ± 3.6 μg/cm2/h without and with the presence of 1% T12, respectively, over the studied pH range. The flux of PMEA without enhancers slightly increased with higher pH values. The activity of permeation enhancers is strongly dependent on pH. The optimal effect on the PMEA permeation was obtained at about pH 6 for DDAK and pH 4 for T12. Interestingly, T12 was inactive at pH values above 6.8. Dependence of PMEA skin concentration on pH values was analogous to that of the flux. Maximal values were obtained at pH 4 for T12 (1549 ± 416 μg/g) and pH 6 for DDAK (778 ± 86 μg/g). The presence of enhancers T12 and DDAK did not increase the fraction of PMEA soluble in the vehicle and had only minor influence on its partitioning into the stratum corneum. This preliminary work presents the first data on PMEA delivery into and through the skin and the results clearly deserve further study.
3
ABSTRAKT: Adefovir (PMEA) patří do skupiny acyklických nukleosid fosfonátů. U těchto látek byly prokázány různé biologické (např. antivirové, cytostatické, antiparasitické a immunomodulační) aktivity. Ve formě proléčiva adefovir dipivoxilu (PMEAd) byl nedávno schválen pro léčbu chronické hepatitidy B. Smyslem této práce bylo sledovat permeační charakteristiky 2% PMEA in vitro v širokém spektru pH za pouţití různých vehikul. Porovnávali jsme také permeační chování samotného PMEA nebo v přítomnosti akcelerantu transdermální permeace. Sledovali jsme také penetraci PMEA do prasečí kůţe. Permeační experimenty 2% PMEA byly prováděny s vyuţitím Franzových difusních cel a prasečí kůţe plné tloušťky. Jako vehikulum byly pouţity tris, fosfátový pufr (PB) a voda, sledované pH bylo v rozmezí 3.4 aţ 8.8. Jako akceleranty transdermální permeace byly pouţity 1% dodecylester kyseliny 6-dimethylaminohexanové (DDAK) a Transkarbam 12, tj. 5-(dodecyloxykarbonyl)pentylammonium-5-(dodecyloxykarbonyl) pentylkarbamát (T12). Při pH 3.4 byly zjištěny hodnoty fluxu 1.8 ± 0.5, 0.2 ± 0.1 a 0.7 ± 0.4 μg/cm2/h pro vzorky ve vodném roztoku, PB a tris. Koncentrace PMEA v kůţi po 48 hodinách pro tyto vzorky byla 294 ± 75, 110 ± 39 a 178 ± 71 μg/g. Hodnoty fluxu 2% PMEA v PB se pohybovaly v rozmezí od 0.2 ± 0.1 do 2.7 ± 1.32 μg/cm2/h u vzorků bez akcelerantu a od 9.4 ± 4.3 do 26.9 ± 3.4 μg/cm2/h pro vzorky s obsahem 1% DDAK, při pH od 3.4 do 7.8. Hodnoty fluxu 2% PMEA v tris byly v rozmezí od 0.7 ± 0.4 do 5.4 ± 2.4 μg/cm2/h pro vzorky bez akcelerantu a od 1.7 ± 0.5 do 11.3 ± 3.6 μg/cm2/h u vzorků s obsahem 1% T12, rozpětí pH 3.4 aţ 8.8. U vzorků bez akcelerantu hodnoty fluxu se vzrůstajícím pH mírně rostly. Aktivita pouţitých akcelerantů transdermální permeace je silně závislá na pH. Optimálního účinku na permeaci PMEA dosahuje DDAK při pH kolem 6 a T12 při pH 4. T12 byl neúčinný při pH 6.8 a vyšším. Závislost koncentrace PMEA v kůţi na pH donorového vzorku byla obdobná jako závislost fluxu na pH. Maximální hodnoty byly zjištěny při pH 4 pro T12 (1549 ± 416 μg/g) a při pH 6 pro DDAK (778 ± 86 μg/g). Přítomnost akcelerantů nijak neovlivňovala rozpustnost PMEA v donorovém vzorku a měla jen nepatrný vliv na rozdělování PMEA do stratum corneum. Tato úvodní studie presentuje první data charakterizující permeaci a penetraci PMEA a její výsledky si jistě zaslouţí další pozornost.
4
1. ÚVOD A CÍL PRÁCE
V posledních dvaceti letech se jako jedna z hlavních záleţitostí veřejného zdravotnictví vynořila problematika persistujících virových infekcí zahrnujících virus lidské immunodeficience (HIV), virus chronické hepatitidy B (HBV) a virus hepatitidy C. Pátrání po terapii HIV vedlo částečně také k odhalení mnoha antivirových agens aktivních proti hepatitidě B. Jedním z těchto případů je také látka adefovir (PMEA). Zpočátku se předpokládalo, ţe bude PMEA ve vyšších dávkách určen pro léčbu HIV. V těchto studiích však byla prokázána nefrotoxicita, která se ukázala jako dávku limitující vedlejší účinek. Nakonec byl PMEA v roce 2002 schválen pro léčbu HBV (Hepsera™) a tak můţe být zvaţován jako nový lék volby pro chronickou hepatitidu B společně s interferonem alfa (INFα) a lamivudinem. Stejně, jako se vyvíjí výzkum a objevování nových látek, zdokonalují se i léčebné postupy. Inovace v oblasti podání léčiv nejenţe umoţňují zdárné zapojení mnoha nových léčiv do terapeutických postupů, ale dovolují také vývoj nových léčebných pouţití jiţ existujících léčiv. Vznik transdermálních systémů pro podání léčiv byl jednou z nejzajímavějších novinek nabízejících řadu výhod oproti perorálnímu podání léčiva. V případě PMEA by mohlo transdermální podání poskytnout stabilní plasmatický profil bez výrazného kolísání plasmatické hladiny léčiva, které se objevuje po perorálním podání, coţ by mohlo být vyuţito při případném zvyšování dávky bez manifestace nefrotoxicity jako limitujícího neţádoucího účinku. Perkutánní aplikací by bylo moţné vyhnout se i dalšímu neţádoucímu účinku a tím je gastrointestinální nesnášenlivost. Uváţíme-li chronickou povahu onemocnění, předpokládanou dlouhodobou léčbu a spolupráci pacienta, mohla by být méně častá aplikace léčiva výhodou. Navíc bylo zjištěno, ţe acyklické nukleosid fosfonáty jsou slibnými látkami pro léčbu některých koţních virových infekcí. Zejména PMEA je účinný proti několika typům herpesvirů zahrnujících HSV-1 a HSV-2, a to jak při pokusech na buněčných kulturách1,2, tak i u myší in vivo1. V tomto případě by se mohla topická aplikace PMEA stát jedním z terapeutických postupů. V současné době nejsou data o permeaci PMEA přes kůţi dostupná.
5
V této práci jsme se pokusili poodhalit teoretické moţnosti transdermálního a topického podání antivirotik ze skupiny acyklických nukleosidových analogů, v našem případě konkrétně PMEA. Cílem této práce bylo studovat transdermální permeaci PMEA in vitro v širokém spektru pH za pouţití různých vehikul, popřípadě v přítomnosti akcelerantu permeace. Zjišťovali jsme také penetraci PMEA do kůţe.
6
2. TEORETICKÁ ČÁST
2.1. Hepatitida B Virem hepatitidy B je celosvětově infikováno asi 350 - 400 milionů osob. Tři čtvrtiny jich ţijí v tzv. endemických oblastech Asie, Jiţního Pacifiku, subsaharské Afriky a Středního Východu. Prevalence chronické infekce HBV v České republice je podle údajů z roku 2001 0,56 %3. Moţnosti léčby chronické hepatitidy B jsou v současné době tyto:
interferon α: Jeho účinek je komplexní, působí přímo na imunitní systém, jeho přímý antivirový účinek je relativně slabý. Nevýhodou je nedobrá tolerance léčby, léčba je vţdy provázena výskytem neţádoucích účinků jako jsou: flu-like syndrom, únava, deprese, nechutenství, pokles počtu leukocytů a trombocytů bývá pravidlem, dále padání vlasů a poruchy erekce. Pouţití INFα je limitováno u pacientů s pokročilou jaterní cirhózou. Léčba má trvat 16-24 týdnů v dávce 510 MU 3 x týdně, u HBeAg negativní formy chronické hepatitidy B déle, nejméně 48 týdnů. Podává se intramuskulární nebo subkutánní injekcí.
pegylovaný interferon α: Pegylované INFα jsou připravovány navázáním molekuly konvenčního INFα na polyethylenglykol, tím je dosaţeno delšího biologického poločasu a relativně konstantní hladiny léku. Oba dostupné pegylované INFα, peginterferon α-2a a peginterferon α-2b se liší způsobem pegylace a velikostí molekuly, jejich klinická účinnost je ale srovnatelná. I přes niţší antivirovou aktivitu in vitro jsou díky delšímu biologickému poločasu účinnější neţ konvenční INFα. Zatím jsou registrovány pouze pro léčbu chronické hepatitidy C. V současné době probíhá v EU jejich registrace pro léčbu chronické hepatitidy B. Podání je subkutánní injekcí.
nukleosidová analoga (tzv. syntetická antivirotika): Jsou to látky strukturálně podobné přirozeným purinovým či pyrimidinovým nukleosidům. Nukleosidová analoga kompetují s přirozenými purinovými či pyrimidinovými nukleosidy ve vazbě na HBV-DNA polymerasu. Podmínkou pro dosaţení antivirové aktivity je intracelulární fosforylace na sloučeniny analogické přirozeným deoxyribonukleotidtrifosfátům. Začlenění molekuly nukleosidového analogu, kterému chybí 3'-hydroxylová skupina na cukerné sloţce molekuly, do řetězce HBV7
DNA vede k jeho zakončení a znemoţňuje jeho další prodluţování. Některé z těchto sloučenin jsou nepřirozené L-enantiomery (lamivudin, emtricitabin) a virová HBV-DNA polymerasa má, na rozdíl od buněčné DNA polymerasy, vyšší afinitu k L-enantiomerům neţ k přirozeným D-enantiomerům. Zmíněné sloučeniny tak vykazují vysokou antivirovou aktivitu a nízkou toxicitu. Lamivudin a adefovir dipivoxil (PMEAd) patří k dobře tolerovaným a velmi málo toxickým lékům. Léčba nukleosidovými analogy bohuţel příliš neovlivňuje mnoţství intracelulární cccDNA a to je příčinou, proč léčba musí být dlouhodobá nebo dokonce trvalá. Mezi nukleosidová analoga patří tyto látky: Lamivudin, který účinně suprimuje replikaci HBV, jednoduše se uţívá, perorálně v podobě tablet nebo roztoku, a nemá závaţné neţádoucí účinky. S délkou léčby se zlepšuje její účinnost - 1 rok 17 % HBeAg sérokonverzí, 2 roky 27 % - ale také se zvyšuje podíl pacientů s mutací rezistentní na lamivudin - 38 % po 2 letech léčby a dokonce 65 % po 5 letech. Léčba pokračující déle neţ 2 roky při rezistenci k lamivudinu jiţ ztrácí účinek a můţe být provázena vzplanutím zánětu - "flare-up"4. Adefovir dipivoxil (viz.dále) Emtricitabin je fluorovaný analog cytosinu, inhibuje HBV-DNA polymerasu a HIV transkriptasu. Jeho molekula má podobnou strukturu jako lamivudin a léčba emtricitabinem vede k selekci stejných rezistentních mutant jako léčba lamivudinem. V současné době je registrován v USA, ale jeho blízká strukturální i klinická podoba s lamivudinem z něj činí lék, který nebude mít významné uplatnění. Tenofovir je acyklický nukleotidový inhibitor HBV-DNA polymerasy a HIV reverzní transkriptasy, strukturou je blízký PMEA a také s ním vykazuje zkříţenou rezistenci. V USA je registrován pro léčbu infekce HIV1, ale jeho antivirová aktivita na HBV je vyšší neţ aktivita PMEA5. Entecavir a clevudin jsou další v současnosti vyvíjená a zkoušená syntetická antivirotika6,7. I kdyţ v posledních letech došlo k výraznému pokroku při léčbě chronické hepatitidy B, musíme si bohuţel přiznat, ţe dostupnou léčbou lze dosáhnout jen trvalé či přechodné suprese virémie, nikoli úplné eradikace viru. Léčba je také 8
nesmírně finančně náročná a tak i nedostupná v chudých oblastech s nejvyšším výskytem infekce na světě. Stále nejúčinnějším způsobem, jak zabránit přenosu infekce, je vakcinace. V současné době je plošné očkování zavedeno ve 135 zemích světa. V ČR se od 80. let očkují rizikové skupiny obyvatelstva a dle Vyhlášky MZ 439/2000 Sb. o očkování proti přenosným nemocem je prováděno plošné očkování novorozenců a dětí ve věku 12 let7.
2.2. Adefovir (PMEA) dipivoxil Molekula PMEA byla syntetizována českým vědcem prof. Holým v laboratořích Akademie věd. Další vývoj léku pak probíhal v USA, kde byl jiţ ve formě proléčiva PMEAd v roce 2002 zaregistrován k léčbě HBeAg pozitivní i HBeAg negativní formy chronické hepatitidy B. Jeho účinnost byla ověřena velkými klinickými studiemi v USA, Evropě i Asii8,9. PMEA patří do skupiny acyklických nukleosid fosfonátů, coţ jsou analogy nukleotidů vykazující různé biologické (např. antivirové, cytostatické, antiparasitické a immunomodulační) aktivity. Tři sloučeniny z této skupiny acyklických nukleosid fosfonátů (cidofovir, PMEA a tenofovir) jsou aktivními komponenty silných antivirotik schválených pro terapeutické uţití v humánní medicíně zaměřené na hepatitidu B, AIDS a různé choroby způsobené DNA viry10. 2.2.1. Mechanismus účinku PMEA difosfát působí selektivní inhibici reversní transkriptasy HIV, reverzní transkriptasy DNA-polymerasy HBV a DNA-polymerasy herpesvirů přímou vazbou na enzym. Působí v kompetici s endogenním substrátem deoxyadenosintrifosfátem (dATP)11. PMEA difosfát postrádá 3'-hydroxy skupinu a tak po zabudování do vznikající virové DNA končí syntéza virové DNA předčasnou terminací12. Aktivní intracelulární metabolit PMEA difosfát selektivně inhibuje HBV DNA-polymerasu v koncentraci 10700krát niţší, neţ je potřeba k inhibici lidské DNA-polymerasy24. PMEA je aktivní in vitro proti všem známým lamivudin-, emtricitabin-, famciklovir- a hepatitis B immunoglobulin-rezistentním HBV, a to jak při pouţití buněčných kultur, tak i u in vitro enzymatických pokusů13. Bylo také naznačeno, ţe PMEA má immunostimulační 9
efekt, zvyšuje aktivitu "natural killer" lymfocytů a indukuje produkci INF-γ u myší14. PMEA vykazuje silnou in vitro aktivitu proti hepadnavirům, retrovirům a herpesvirům15,16,17,18.
2.2.2. Farmakokinetika PMEA není dobře absorbován po perorálním podání. Je to důsledek omezené intestinální permeability fosfonátu19. Biologická dostupnost byla výrazně zlepšena vyvinutím proléčiva PMEAd. Perorálně podaný PMEAd podléhá rychlé enzymatické hydrolýze pomocí nespecifických esteras. Tím vzniká PMEA, který je transportován do buněk, kde je následně přeměněn pomocí dvou fosforylačních reakcí na PMEA difosfát - aktivní molekulu20. Narozdíl od ostatních nukleosidových analogů, jako je např. lamivudin, je PMEA monofosfát a není tedy závislý na prvotní fosforylaci pomocí virových nukleosidkinas k tomu, aby se projevil jeho antivirový efekt. PMEA má dlouhý nitrobuněčný poločas, přibliţně 16 - 18 hodin, a lze ho podávat jedenkrát denně21. Po perorálním podání jednorázové dávky PMEA 10 mg pacientům s chronickou hepatitidou B bylo dosaţeno maximální koncentrace v plazmě (cmax) v průměru po 1,75 hod. (rozmezí 0,58 - 4 h) s naměřenými hodnotami v rozsahu 18,4 ± 6,3 ng/ml. Průměrné hodnoty PMEA plochy pod křivkou (AUCo-∞) jsou v rozsahu 220 ± 70 ng*h/ml. Biologická dostupnost PMEA po perorálním podání PMEAd 10 mg je 59 % a není závislá na jídle21,22. Vazba PMEA na bílkoviny krevní plazmy je zanedbatelná a eliminace PMEA probíhá výhradně renální exkrecí. PMEA je vylučován ledvinami v nezměněné formě, a to nejen pasivní filtrací, ale také za výrazného přispění aktivní tubulární sekrece. Proto je nutné sníţení dávky PMEA při poškozené funkci ledvin23. 2.2.3. Fyzikálně chemické vlastnosti PMEAd je perorálně biologicky dostupné proléčivo PMEA24. Chemický název PMEA je 9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]adenin, molekulová hmotnost je 273,19. Chemický název
proléčiva
je
9-[2[[bis(pivaloyloxy)methoxy]methoxy]ethyl]adenin
a
má
molekulovou hmotnost 501,47 (obr. 1).
10
NH 2
NH2
N
N
N
N
N
N
N
N
O
O
O O P O
OH O P OH
O
O
O
O
Obr. 1 Chemický vzorec PMEA a jeho proléčiva PMEAd PMEA je látka, která se nachází v ionizovaném stavu v širokém spektru pH (obr. 2).
NH2 H
NH2 H
N
N+ N
N
1.2
N
N+ N
NH2
NH2
N
N
N 4.2
N
N
N
N 6.8
N
N
Obr. 2 Ionizace PMEA, nad šipkami jsou vyznačeny hodnoty pKa O
O
O
O
OH OP O na formu monokationtu, O P pH dochází k ionizaci O PMEA O P Při velmi nízkém se zvyšujícím OH OH OH
se pH dochází ke změně poměrného zastoupení dalších ionizovaných forem: zwitteriontu, monoaniontu a dianiontu (obr. 3).
11
-
O O P O-
Obr. 3 Zastoupení jednotlivých ionizovaných forem PMEA v širokém spektru pH25.
2.3. Transdermální podání léčiv Transdermální podání léčiva nabízí řadu výhod oproti tradičním cestám podání léčiva26,27. Patří k nim eliminace first - pass efektu metabolismu léčiva v játrech a gastrointestinálním traktu, coţ má za následek jeho vyšší biologickou dostupnost, niţší moţnost interakcí s dalšími léky a potravinami a také sníţení výskytu vedlejších účinků. Mimo to lze dosáhnout stabilnějších plazmatických hladin, coţ je důleţité především pro léčiva s úzkým terapeutickým indexem. Transdermální aplikace je výhodná a náplast můţe být jednoduše odstraněna v případě nepříznivé reakce. Všechny tyto výhody mohou zlepšit pacientovu spolupráci (compliance) v průběhu terapie28. Jen velmi omezené mnoţství léčiv má optimální fyzikálně-chemické vlastnosti k tomu, aby byl moţný jejich přestup přes koţní bariéru v dostatečném mnoţství a také v celé šíři jejich terapeutických koncentrací. V současné době existuje řada transdermálních náplastí pro léčiva, jako jsou klonidin, fentanyl (Durogesic drm. empl.), lidocain (Emla drm. empl.), nicotin (Nicorette drm. empl.), nitroglycerin, estradiol (Estraderm drm. empl.), oxybutynin (Kentera drm. empl.), scopolamin a testosteron. Na trhu jsou také kombinované náplasti pro kontracepci (ethinyl estradiol, norelgestromin (Evra drm. empl.)), stejně jako náplasti pro hormonální substituci6,29.
12
Charakteristika těchto léčiv, která snadno přecházejí přes koţní bariéru, zahrnuje malou denní dávku (max. miligramy), molekulární hmotnost niţší neţ 500 g*mol -1 (největším léčivem aplikovaným v náplasti je oxybutynin s 359 g*mol-1), nízký bod tání a vyrovnanou lipofilitu. Otevření transdermální cesty pro velké hydrofilní molekuly léčiv patří mezi největší výzvy v oblasti transdermálního podání léčiv29. Proto, aby byl rozšířen počet transdermálně aplikovatelných léčiv, je třeba reversibilně sníţit bariérové vlastnosti kůţe. Bylo jiţ objeveno mnoho různých postupů, jak urychlit permeaci přes kůţi. Tyto postupy zahrnují akceleranty permeace, ultrazvuk, iontoforesu, elektroporaci, magnetoforesu, fotoakustické vlnění, mikrojehly, cílenou folikulární absorpci, liposomy a jiné vesikuly, eutektický systém, iontové páry a další30. 2.3.1. Výhody transdermálního podání léčiv
absorpce léčiva není ovlivněna pH prostředí gastrointestinálního traktu
nezávislé na mnoţství a typu stravy
lze vyuţít i pro léčiva, která podléhají inaktivaci v kyselém nebo zásaditém prostředí gastrointestinálního traktu
dlouhodobější účinek i u léčiv s krátkým biologickým poločasem
dlouhodobě stabilní hladiny léčiva v krvi
snadná aplikace a snadné přerušení přívodu léčiva
výhodná aplikační forma pro chronické pacienty
2.3.2. Nevýhody transdermálního podání léčiv
lze vyuţít jen u malé skupiny léčiv, která dobře překonávají koţní bariéru
nevhodné pro léčiva, jejichţ denní dávka přesahuje 25 mg
absorpce léčiva ze systému závisí na místě aplikace, stavu pokoţky, teplotě, věku pacienta ap.
není moţná aplikace na ochlupenou kůţi
při dlouhodobé aplikaci mohou vznikat alergické projevy, koţní změny
vyšší cena31.
13
2.4. Kožní bariéra Kůţe savců je sloţena ze dvou hlavních vrstev, dermis a epidermis. Dermis je tvořena fibroblasty a extracelulární matrix. Je bohatá na kapiláry a nervy. Vyţivuje avaskulární epidermis32.
Obr. 4 Anatomie kůţe33 Epidermis je sloţena z keratinocytů (95 %), melanocytů, Langerhansových buněk a Merkelových buněk. Lze ji rozdělit do čtyř vrstev: stratum basale, spinosum, granulosum a corneum (SC)34. Pro tyto vrstvy je charakteristický různý stav diferenciace buněk, které vznikají z kmenových buněk bazální vrstvy a migrují vzhůru ke koţnímu povrchu. V tomto směru klesá koncentrace kyslíku a nutrientů v buňkách, ty odumírají, jejich organely jsou postupně degradovány a dochází ke kumulaci keratinu a lipidů. Tento proces, jehoţ výsledkem je formování koţní bariéry, se nazývá keratinizace35. Hlavní bariéru, jak pro vstup xenobiotik, tak pro výdej vody organismem, tvoří nejsvrchnější vrstva epidermis SC. Je-li bariérová funkce zásadně narušena, jako 14
v případě generalizované psoriázy, můţe dojít aţ k denní ztrátě 6 litrů vody a to pouze samotnou kůţí. Epidermis zprostředkovává také ochranu proti škodlivému vlivu slunečního UV záření. Integrita SC má význam také jako bariéra proti vstupu moţných patogenů36.
2.4.1. Stratum corneum Bariérová funkce kůţe byla přisouzena právě SC, nejsvrchnější vrstvě epidermis. SC je sloţena z korneocytů (jsou to keratinocyty ve finálním stadiu diferenciace) a intercelulární lipidové matrix. Tato struktura bývá často nazývána cihla a malta37 a tvoří cestu pro průnik sloučenin. U lidí má SC obvykle 18 - 21 vrstev38. Vlastnosti koţní bariéry jsou zaloţeny na specifickém obsahu a sloţení lipidů SC39,40, zejména pak na neobyčejném strukturálním uspořádání intercelulární lipidové matrix, stejně jako na lipidovém obalu obklopujícím korneocyty41. Lipidová fáze je souvislá v celém SC a penetrující látky musí s touto fází interagovat, ať uţ pronikají intracelulárně nebo intercelulárně. U koţních chorob s pozměněným obsahem lipidů v kůţi42,43 nebo po jejich extrakci propustnost kůţe stoupá v obou směrech. To znamená, ţe jak transepidermální ztráta vody, tak i propustnost kůţe pro exogenní substance je vyšší. Topická aplikace koţních lipidů nebo jejich analogů pak můţe bariérovou funkci kůţe obnovit44,45. 2.4.1.1. Lipidy tvořící SC Ceramidy tvoří asi 50 %, cholesterol 25 % a volné mastné kyseliny 10 % z celkového mnoţství lipidů46. Jsou zde zastoupeny také malé podíly esterů cholesterolu, cholesterol sulfát a glukosylceramidy, ale ţádné fosfolipidy. Rozdíly v zastoupení jednotlivých lipidů jsou způsobeny individuálními rozdíly, věkem, typem a stavem pokoţky, umístěním na těle, stejně jako pouţitím určité metody pro získání vzorků a následného stanovení lipidů47. Hlavními lipidy, které tvoří bariéru, jsou ceramidy48,49. Jsou strukturálně heterogenní skupinou tvořící 9 různých subtypů50. Obecně jsou koţní ceramidy sloţeny z polární hlavy a dvou hydrofobních řetězců. Jádrem molekuly ceramidu je aminoalkohol sphingosin, phytosphingosin nebo 6-hydroxysphingosin. Průměrná délka jejich řetězce je 18 uhlíků. Mastná kyselina (MK) je navázána na primární aminoskupinu v pozici 2 aminoalkoholu vytvořením amidové vazby. Navázaná MK můţe být nehydroxylovaná, α-hydroxylovaná nebo ω-hydroxylovaná, ke které je navíc pomocí esterové vazby 15
připojená kyselina linoleová51. Acylující MK má nejčastěji délku řetězce 24 uhlíků, toto neplatí pro ceramidy obsahující ω-hydroxy MK s navázanou kyselinou linoleovou, kde je délka řetězce 30 aţ 34 uhlíků. Právě tato skupina ceramidů je nepostradatelná při tvorbě a stabilizaci koţní bariéry52. Důvodů pro neobyčejně nízkou permeabilitu SC v porovnání s ostatními biologickými membránami je několik. Jsou to: a) neobvyklá délka řetězce volných MK (mají více neţ 18 uhlíků53) a acylových řetězců v ceramidech (délka řetězce ω-hydroxy MK je 30 aţ 34 uhlíků52) b) relativně malá polární hlava ceramidů (v porovnání např. s fosfolipidy), coţ umoţňuje jejich těsnější shluknutí c) vysoká soudrţnost způsobená vodíkovými vazbami54 d) tvorba sloţitějších vícevrstvých lamel Kůţe musí zabezpečit optimální bariérovou kapacitu, která je vyrovnaná i za náhle se měnících podmínek (teplota, pH, koncentrace solí, relativní vlhkost aj.)55. 2.4.2. Permeace látek přes kůži Transdermální absorpce do systémové cirkulace zahrnuje permeaci přes SC, ţivou epidermis a vrchní koţní vrstvy. Hlavní bariéru pro permeaci valné většiny látek tvoří SC. Ţivá epidermis působí jako důleţitá bariéra pouze pro permeaci extrémně lipofilních sloučenin56,57. Existují tři potenciální cesty přestupu přes koţní bariéru: 1. přestup přes SC 2. cesta přes vlasové folikuly 3. permeace pomocí potních ţláz. Protoţe vlasové folikuly a potní ţlázy tvoří asi jen 0,1 % koţního povrchu, zdá se cesta přes póry zajímavou pouze pro omezený počet sloučenin, např. látky s vysokou molekulární hmotností30,58. Jako příklad lze uvést DNA, velikou molekulu, která můţe imunizovat po topické aplikaci, coţ naznačuje moţnost folikulárního transportu59. Přes SC byly popsány dvě cesty permeace: 1. intracelulární (transcelulární) cesta přes korneocyty 2. intercelulární (paracelulární) cesta přes intercelulární lipidy Bylo prokázáno, ţe pro mnoţství substancí s širokým spektrem polarity je intercelulární cesta nejčastější cestou penetrace60,61,62. Byly také popsány vztahy mezi cestou koţní 16
permeace u různých sloučenin a jejich fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Zjistilo se, ţe moţnost vytvoření vodíkové vazby, velikost a lipofilita molekuly jsou nejdůleţitějšími faktory, které rozhodují o permeabilitě sloučenin63,64,65. Experimentálně bylo prokázáno, ţe délka difusní cesty je mnohem větší neţ je tloušťka SC (přibliţně 20 μm) a byla přibliţně vypočtena na 500 μm. Důleţité je, ţe intercelulární prostor obsahuje lipidové struktury a difundující molekuly musí překonat různé lipofilní a hydrofilní prostory předtím, neţ dosáhnou spojení mezi SC a ţivou epidermis. Prostředí koţní bariéry je velmi heterogenní a je proto moţná překvapující, ţe difuse přes ní můţe být popsána podobně jako u jednoduchých roztoků Fickovým difusním zákonem66. 2.4.3. Fyzikálně-chemické parametry permeace Nejzákladnější rovnicí vyjadřující difusi je Fickův 1. zákon (1), který popisuje flux v ustáleném stavu (J) pomocí následujících veličin:
J=KxDxc/h
(1)
J ... flux, ustálený stav přechodu látky přes jednotku plochy [μg/cm2/h] K .. rozdělovací koeficient permeantu mezi kůţí a aplikovanou formou D .. difusní koeficient v kůţi [m2/s] h ... tloušťka membrány [μm] c ... koncentrace je vyjádřena jako rozdíl aplikované koncentrace permeantu ve vehikulu a koncentrace permeantu v receptorové fázi (capp - crec). Ve většině případů je crec<
J = kp x capp
(2)
kde kp (=KD/h) je permeabilitní koeficient [m/s]. Tento parametr lze vypočítat na základě empirického vztahu popsaného Pottsem a Guyem67
log kp = -2,7 + 0,71 x logKo/v - 0,0061M (3) kde kp je permeabilitní koeficient [cm/h], Ko/v je rozdělovací koeficient oktanol/voda a M je molekulární hmotnost29. 17
Jednoduchý rozbor rovnic ukazuje, ţe proměnné, které mohou být ovlivněny tak, abychom dosáhli maximálního J látky, jsou rozdělovací koeficient, difusní koeficient a koncentrace aplikovaného permeantu. Maximální J pro sloučeniny nastává v případě, ţe capp je rovna rozpustnosti. V nejjednodušším případě tak lze zvýšit koncentraci aplikovaného permeantu aţ na hodnotu jeho vlastní rozpustnosti. Následné zvýšení koncentrace by jiţ nemělo ţádný efekt na permeační křivku. Bylo zjištěno, ţe 1% suspenze by byla stejně účinná jako 5% suspenze68. Velké molekuly mají tendenci difundovat pomalu, molekuly s dobrou rozpustností v obou prostředích, ve vodě i v hydrofobním prostředí, permeují dobře. Rovnice (1) nebo (3) naznačují, ţe vysoká hodnota rozdělovacího koeficientu K bude prospěšná pro vyšší hodnoty J, ačkoli velké hodnoty K mívají molekuly s malou rozpustností a v podstatě molekuly s logKoct ~1-3 mají optimální rozdělovací vlastnosti. Toto nakonec vedlo k představě, ţe vyrovnaná rozpustnost v hydrofobním prostředí i ve vodě je ţádoucí69. Mnohé permeanty jsou slabými kyselinami nebo slabými basemi. Permeace je závislá na stupni ionizace, na tom, jak ionizace ovlivňuje rozpustnost v aplikované fázi a na rozdělování ionizované látky do kůţe. Bylo provedeno jen málo studií, které by právě toto zkoumaly, ale ty, které byly provedeny, ukázaly, ţe můţe být prospěšné aplikovat léčivo v jeho ionizované formě, ve které sice bude mít menší permeabilitní koeficient, ale zato bude mít mnohem větší rozpustnost70. U ionizovaných látek se setkáváme s problémem, kdy nelze dostatečně správně doplnit data pro výpočet všech koeficientů. Jedním z problémů je ten, ţe nelze u ionizovaných sloučenin přesně určit, zda sloučenina, která permeuje je sloţena pouze z volných kyselin (nebo basí) ionizovaného materiálu, nebo zda se jedná o iontové páry, které tvoří v daném vehikulu nebo přímo v kůţi. Mechanismus tvorby iontového páru byl také zařazen mezi způsoby urychlení permeace71,72,73,74.
2.5. Akceleranty kožní permeace Látky zvyšující permeaci, nazývané také akceleranty koţní permeace, usnadňují absorpci léčiv kůţí pomocí reversibilního sníţení bariérové funkce kůţe27.
18
Ideální akcelerant by měl být netoxickou, nedráţdivou, nealergizující a farmakologicky inaktivní sloučeninou, která bude působit rychle a jejíţ aktivita a trvání efektu budou předvídatelné a reprodukovatelné. Po odstranění z kůţe by měly být její původní bariérové vlastnosti rychle a plně obnoveny. Akceleranty by měly být kompatibilní s daným léčivem, s prostředím, ve kterém působí, a také kosmeticky akceptovatelné75,30. 2.5.1. Rozdělení akcelerantů V podstatě lze většinu známých akcelerantů rozdělit do dvou velkých skupin : 1. malá polární rozpouštědla (např. ethanol, propylenglykol, dimethylsulfoxid, ethylacetát atp.) 2. amfifilní sloučeniny obsahující polární hlavu a hydrofobní řetězec (např. mastné kyseliny a alkoholy, Azon, SEPA 009, DDAIP atd.). Malé polární akceleranty jsou obvykle účinné ve vyšších koncentracích a mají sklon k působení různými mechanismy. Některé z nich vytvářejí ireversibilní změny ve strukturách SC a nejsou proto akceptovatelné pro klinické uţití. Novější sloučeniny jsou obvykle aktivní v nízkých koncentracích a má se za to, ţe jejich mechanismus účinku zahrnuje reversibilní fluidizaci intercelulární lipidové matrix. Některé z těchto akcelerantů jsou biodegradovatelné na netoxické sloučeniny27. Nejčastěji pouţívanou biodegradovatelnou vazbou je vazba esterová, jelikoţ přítomnost esteras je známá v lidské i zvířecí kůţi27,76. Logické je umístění esterové vazby mezi polární hlavu a hydrofobní řetězec. Po odeznění akceleračního působení můţe být daná látka degradována na malou polární molekulu alkoholu nebo kyseliny a mastnou kyselinu a příslušný alkohol mastné kyseliny, které poté mohou obohatit metabolicky aktivní vrstvy kůţe. Biodegradovatelnost bývá často prezentována jako terminace aktivity akcelerantů. Je zajímavé, ţe akcelerant ze skupiny esterů svým rozpadem dá vzniknout mastné kyselině nebo odpovídajícímu alkoholu jako dalším moţným akcelerantům27. 2.5.2. Mechanismus účinku akcelerantů Působení akcelerantů na kůţi lze rozdělit do dvou stupňů: penetrace látky na místo působení, čímţ dochází k porušení specifické struktury bariéry a to vede k jednodušší permeaci léčiva. Mimoto mohou akceleranty působit nepřímo ovlivňováním léčiva ve vehikulu27. Přesné mechanismy, kterými mnohé chemické akceleranty permeace sniţují bariérové vlastnosti kůţe, nebyly dosud detailně vysvětleny. Je téměř jisté, ţe akceleranty 19
nepůsobí pouze jedním mechanismem, ale ţe se na výsledném efektu podílí většinou více různých mechanismů. Akceleranty mohou působit na intracelulární keratin ve SC, ovlivňovat desmosomy, modifikovat intercelulární lipidové domény nebo pozměnit rozpouštěcí vlastnosti SC. Výsledkem takového působení je sníţení koţní bariérové rezistence77,78,79,80. 2.5.2.1. Interakce s intercelulárními lipidy V
klinicky
akceptovatelných
koncentracích
interaguje
většina
akcelerantů
s intercelulární lipidovou doménou SC30. Malé polární molekuly mohou porušit vodíkové vazby, které drţí pohromadě molekuly ceramidů. Amfifilní akceleranty se pravděpodobně vmezeří mezi lamely, svou polární hlavou do polární oblasti a hydrofobním řetězcem (popř. řetězci) mezi hydrofobní řetězce lipidů SC. To můţe indukovat porušení lipidového uspořádání, laterální fluidizaci lamel a sníţení odporu koţní bariéry81. Některé akceleranty, např. kyselina olejová a terpeny, mohou ve vyšších koncentracích mezi lamelami vytvářet vlastní separované fáze82. Tyto prostory poté vytváří více propustné póry pro polární sloučeniny. Některá rozpouštědla, např. ethanol a dimethylsulfoxid, mohou působit cestou extrakce lipidů83,84. 2.5.2.2. Interakce s proteinovými strukturami Tyto akceleranty mohou ovlivňovat strukturu keratinu v korneocytech nebo proteinů v desmosomech. Např. dithiotreitol, sloučenina redukující disulfidické vazby v keratinu, urychluje permeaci hydrofilních sloučenin. Nicméně v porovnání s akceleranty interagujícími s koţními lipidy je jejich efekt relativně malý82. Lze to přisoudit přítomnosti lipidové fáze, která souvisle prochází SC a není těmito akceleranty ovlivněna. Navíc jsou některé konformační změny proteinů irreversibilní27. 2.5.2.3. Podpora rozdělování Změna rozpouštěcího prostředí SC vedoucí ke zvýšení rozdělování léčiva do kůţe byla popsána jako třetí mechanismus působení akcelerantů27. 2.5.2.4. Mechanismus tvorby iontového páru Iontové párování umoţňuje sníţit polaritu ionizovaných sloučenin (např. aminokyselin). Po začlenění lipofilního, opačně nabitého, iontu do roztoku vzniká iontový pár s danou
20
látkou za přesně definovaných podmínek Poté má vytvořený iontový pár vyšší lipofilitu neţ samotná sloučenina a má zvýšenou afinitu vůči nepolárnímu prostředí85. Iontové páry jsou definovány jako neutrální směsi zaloţené pouze na existenci elektrostatické přitaţlivosti mezi opačně nabitými ionty86, které jsou dostatečně lipofilní na to, aby byly rozpustné v lipoidním médiu, jakým je SC. Tvorba iontových párů má několik výhod oproti jiným akceleračním postupům. Můţe urychlit koţní transport iontově nabitých léčiv bez modifikace jejich struktury, změny bariérové funkce kůţe nebo pouţití jiných specifických postupů (iontoforesa87, ultrazvuk88)89. Koncept iontového páru byl pouţit v oblasti farmacie pro transepidermální podání některých léčiv, např. erythromycinu nebo kyseliny salicylové90. Bylo dokázáno, ţe permeabilitní koeficient přestupu přes kůţi neionizované směsi je mnohem větší neţ směsi ionizované86 a permeabilitní koeficient pro kationty je vyšší neţ pro anionty87,91. Protoţe pro hydrofilní ionizované aminokyseliny a jiné látky je lipofilní SC největší bariérou penetrace přes kůţi, můţe být iontové párování s lipofilními opačnými ionty jednoduchou cestou ke zvýšení afinity těchto sloučenin k lipidům SC85. 2.5.2.5. Námi použité akceleranty Akceleranty permeace, dodecylester kyseliny 6-dimethylaminohexanové (DDAK) a Transkarbam 12, tj. 5-(dodecyloxykarbonyl)pentylammonium-5-(dodecyloxykarbonyl) pentylkarbamát (T12), byly syntetizovány na Farmaceutické fakultě University Karlovy v Hradci Králové92,93.
O
N O
DDAK
O -O
N H
O O O
+H N 3
O
Transkarbam 12 Obr. 5 Chemické vzorce pouţitých akcelerantů DDAK a T12
21
2.6. Modely membrán Jelikoţ je poměrně sloţité získat lidskou kůţi, jsou mnohé studie prováděny uţitím náhrad. Uvaţovalo se o pouţití tekutých membrán, avšak jejich jednoduchá struktura nemůţe poskytnout adekvátní model heterogenního prostředí intercelulárních prostor94. Mohou být sice dále upraveny pomocí inkorporace lipidů, které vytvoří rozdělené prostředí, ale i tak je tu malá jistota, ţe by mohly být spolehlivě pouţity jako model lidské kůţe. Uvaţovalo se také o polymerních systémech s nejjednoduššími silikonovými membránami. Za omezených podmínek lze získat převod hodnot mezi silikonem a kůţí, ale pouze pokud je dominantním efektem kontrolujícím transport přes kůţi chemický potenciál95. Pro více komplexní membrány, jako je např. Carbosil, byly také vytvořeny zajímavé korelace28. Nejrozšířenější je pouţití zvířecí kůţe a ukázalo se, ţe nejspolehlivější tkáň pochází z prasečího ucha. V poslední době byly prováděny výzkumy také s pouţitím koţních kultur, ale ty mají tendenci vytvářet více limitovanou bariéru neţ pravá tkáň. V podstatě to znamená, ţe nejlepší studie jsou prováděné in vivo následované in vitro studiemi na lidské kůţi36.
22
3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1. Použité chemikálie Účinná látka PMEA byl laskavě poskytnut prof. A. Holým (Akademie věd, Praha, ČR). Zásobní roztok byl připraven v akceptorové fázi (isotonizovaný fosfátový pufr o pH 7,4 (PBS) s 0,03% NaN3) v koncentraci 100 μg/ml, a byl uchováván při -20 °C maximálně po dobu 1 měsíce. Konečná koncentrace kalibračních a kontrolních vzorků byla připravena zředěním zásobního roztoku v čisté akceptorové fázi, která byla v kontaktu s kůţí po 48 hod za stejných podmínek, za kterých probíhaly permeační pokusy. Acetonitril a methanol pro HPLC, Bu4NHSO4 a NaN3 byly zakoupeny od firmy SigmaAldrich (Schnelldorf, SRN). KH2PO4, NaH2PO4, Na2HPO4 a NaCl byly zakoupeny od firmy LachNer (Neratovice, ČR). Isopropylmyristát (IPM) byl zakoupen od firmy Kulich (Hradec Králové, ČR). Ultračistá voda pro HPLC byla získána pouţitím Milli-Q, filtračního systému pro vodu (Millipore, Bedford, MA). Akceleranty dodecylester kyseliny 6-dimethylaminohexanové (DDAK) a Transkarbam 12, chemickým názvem 5-(dodecyloxykarbonyl)pentylammonium-5-(dodecyloxykarbonyl)pentylkarbamát (T12) byly získány z Katedry anorganické a organické chemie FaF UK v Hradci Králové.
3.2. HPLC Vzorky byly analyzovány systémem sestávajícím z vysokotlaké pumpy Shimadzu LC20AD a autosampleru Shimadzu SIL-20AC (Kyoto, Japonsko), UV detektoru LCD 2083 (Ecom, Praha) a integračního softwaru CSW v.1.7 pro Windows (Data Apex, Praha). Pro separaci PMEA byla pouţita kolona LiChroCART 250-4 s náplní Purospher STAR, RP 18e, 5μm (Merck, Darmstadt, SRN) s předkolonou obsahující stejný sorbent. Teplota kolony byla nastavena na 40°C. Pouţitá mobilní fáze byla sloţena z 10mM KH2PO4 a 2mM Bu4NHSO4, přidáním NaOH byla upravena na pH 6,0 a doplněna 7 % acetonitrilu, průtok byl 1,5 ml/min. Detektor byl nastaven na vlnovou délku 260 nm a objem nástřiku byl 20 μl. 3.3. Donorové vzorky Donorové vzorky byly připraveny dispergováním 20 mg PMEA v 1 ml příslušného vehikula vţdy s obsahem nebo bez obsahu 10 mg akcelerantu. Vzorky byly míchány po dobu 5 minut při teplotě 50°C, následovalo ustálení na 37°C po dobu 48 hodin a 23
opětovné protřepání před aplikací na kůţi, pokud bylo potřeba. Koncentrace PMEA v donorovém vzorku byla zvolena tak, aby při permeačním pokusu nedošlo k vyčerpání léčiva v donorové fázi (tzv. nekonečná dávka). PMEA byl rozpuštěn buď ve 100 mM tris nebo fosfátovém pufru (PB) o pH 7,4. Výsledné pH bylo nastaveno přidáním 2-(hydroxymethyl)-2-amino-1,3-propandiolu (tris), popř. HCl u vzorků v tris pufru. Pro vzorky v PB bylo k úpravě pH pouţito H3PO4, popř. NaOH, pH vzorků bylo měřeno pouţitím mikroelektrody HC153 (Fisher Scientific, Pardubice). Byla připravena řada vzorků se vzrůstajícími hodnotami pH (3,4 aţ 8,8) bez akcelerantu, další s přidáním akcelerantů permeace 1% DDAK resp. 1% T12 a pro doplnění informací byla vytvořena i řada vzorků s koncentracemi PMEA 0,5 %, 1 % a 5 % a DDAK 0,5 %, 1 %, 2 % a 3 %. Pro vzorky s 1% DDAK byl jako vehikulum pouţit PB, pro vzorky s obsahem 1 % T12 byl pouţit tris. Ve skutečnosti nebyly vzorky pufrovány, ale byla pouze nastavena daná hodnota pH přidáním vhodných iontů. V této práci pouţíváme terminologii pufr kvůli přehlednosti. Pro stanovení rozpustnosti PMEA v daném vehikulu (cveh) byl kaţdý vzorek připraven třikrát, poté následovalo ustálení na 37°C. Po 48 hodinách byly vzorky zcentrifugovány při 10000 otáčkách po dobu 5 minut, pokud bylo potřeba, byl supernatant zředěn pouţitím PB a analyzován na obsah PMEA. 3.4. Příprava kůže Prasečí uši byly získány z jatek (Zemko a.s., Česká Skalice). Kůţe plné tloušťky byla odpreparována z dorsální strany ucha, zbavena chlupů zastřihovačem tak, aby nedošlo k jejímu poškození a ponořena na 5 minut do fyziologického roztoku s přídavkem 0,05% azidu sodného jako konzervantu. Vzorky kůţe byly vakuově uzavřeny do polyethylenového obalu a uchovány při -20°C maximálně po dobu 2 měsíců. 3.5. Permeační experimenty Koţní permeabilita PMEA byla hodnocena in vitro pouţitím Franzových difusních cel96. Koţní vzorky byly bezprostředně před pouţitím pomalu rozmraţeny, rozřezány na části cca 2 x 2 cm, vloţeny do cel tak, aby dermální strana směřovala směrem dolů a utěsněny silikonovým mazadlem. Difusní plocha byla 1 cm2. Akceptorové kompartmenty cel byly naplněny PBS o pH 7,4 s přídavkem 0,03% azidu sodného jako konzervantu, bylo přidáno magnetické míchadlo. Z důvodu ustálení podmínek byly cely 24
postaveny do vodní lázně vytemperované na 32°C na dobu 30 minut před vlastním nanesením vzorků. Přesný objem akceptorového kompartmentu kaţdé cely (přibliţně 18 ml) byl změřen, zaznamenán a zahrnut do výpočtů. Donorový vzorek o objemu 150 μl byl aplikován na koţní povrch a donorový kompartment cely byl uzavřen krycím sklíčkem. Akceptorová fáze byla po celý průběh experimentu promíchávána a temperována na 32°C. Vzorky akceptorové fáze o objemu 600 μl byly odebírány v předem určených časových intervalech (16, 20, 24, 28, 40, 44 a 48 hodin), po kaţdém odběru byl objem akceptorové fáze doplněn čistým PBS. Odebrané vzorky byly vyhodnoceny HPLC. Při experimentech s pretreatment aplikací byl postup stejný jako bylo popsáno výše. Pouze 2 hodiny před samotným nanesením vzorku byl na kůţi aplikován 1% roztok akcelerantu v daném vehikulu při určitém pH nebo samotné vehikulum. Před aplikací PMEA byl vzorek akcelerantu (vehikula) odstraněn a kůţe opláchnuta a opatrně osušena vatovou tyčinkou. 3.6. Stanovení PMEA v kůži Po ukončení permeačního experimentu byly difusní cely rozebrány. Z důvodu odstranění zbytků donorových vzorků byl koţní povrch třikrát opláchnut 0,5 ml PBS. Plocha 1 cm2 kůţe, která byla vystavena působení donorového vzorku, byla vyříznuta, osušena, přesně zváţena a umístěna spolu s magnetickým míchadlem do vialky. Do kaţdé vialky bylo přidáno 5,0 ml PBS a kůţe byla ponechána vyluhovat při 32°C po dobu 48 hodin. Poté byl extrakt zfiltrován a analyzován obsah PMEA (μg/cm2). Výsledná koncentrace PMEA v kůţi (ckůţe, μg/g) byla získána z podílu zjištěného absolutního mnoţství PMEA v kůţi a příslušné hmotnosti kůţe. Účinnost extrakce PMEA z kůţe byla stanovena podáním 20 μl roztoku PMEA (10,50 a 200 μg) na povrch koţního fragmentu o ploše 1 cm2. Kůţe byla udrţována nezakrytá při 32°C po dobu 48 hodin tak, aby mohla proběhnout penetrace PMEA do hlubších koţních vrstev. Následná extrakce probíhala stejně, jako bylo popsáno výše. Experiment byl prováděn pro kaţdou koncentraci třikrát a porovnáván s kontrolními vzorky PMEA. Účinnost extrakce byla více neţ 96 %97.
25
3.7. Stanovení distribučního koeficientu SC/vehikulum Vzorky SC byly připraveny podle předem stanoveného postupu 98, vysušeny ve vakuu a uloţeny při -20 °C. Před experimentem byly připravené vzorky o hmotnosti cca 10 mg přesně zváţeny a hydratovány v 1 ml PBS s 0,03% NaN3 při 32 °C. Po 48 hodinách bylo SC vyjmuto z roztoku a osušeno na filtračním papíře. Vzorky s obsahem 10 μg/ml PMEA, kaţdý s nebo bez akcelerantu permeace DDAK a T12 (5 μg/ml) v daném vehikulu, byly aplikovány na SC (1 ml/10 mg) a ponechány 24 hodin ustálit při 32°C. Poté byly vzorky centrifugovány 5 minut při 10000 otáčkách a výsledná koncentrace PMEA v supernatantu stanovena pomocí HPLC (c24). Jako srovnávací byl vyhodnocen ten samý vzorek bez aplikace na SC (c0). Distribuční koeficient K byl stanoven následovně: K = (c0 - c24)/c24. 3.8. Vyhodnocení dat Kumulativní mnoţství PMEA (μg/cm2), které proniklo kůţí do akceptorové fáze, bylo přepočítáno vzhledem k odběrům a doplňování akceptorové fáze a přesnému objemu Franzovy cely. Hodnoty byly vyneseny do grafu v závislosti na čase. Pro vytvoření permeačních profilů byly pouţity průměrné hodnoty kumulativních mnoţství v daném čase. Výsledné hodnoty byly presentovány včetně směrodatné odchylky ± SD (n = 4-8). V kaţdém experimentu byla pouţita kůţe nejméně dvou zvířat. Flux PMEA v ustáleném stavu (J, μg/cm2/h) byl vypočten z lineární oblasti průběhu křivky permeačních profilů a lagT extrapolací lineární části k ose x. Permeabilitní koeficient kůţe (P, cm/h) byl vypočten z podílu J/ cveh.
26
4. VÝSLEDKY Permeační charakteristiky PMEA při prostupu přes prasečí kůţi plné tloušťky a obsah PMEA v kůţi po 48 hodinách pro dané vzorky při sledovaných hodnotách pH jsou shrnuty v tabulce (tab. 1). tab. 1 Permeační charakteristiky 2%PMEA přes prasečí kůži plné tloušťky in vitro a jeho koncentrace v kůži P rozpustnost J (10*e-5 lagT ckůže 2 donorový vzorek pH (mg/ml) (μg/cm /h) cm/h) (h) (μg/g) voda 3,4 2,5 ± 0,05 1,8 ± 0,5 72 18 ± 6 294 ± 75 PB 3,4 5,0 ± 0,0 0,2 ±0,1 4 18 ± 2 110 ± 39 3,8 9,6 ± 3,4 0,6 ± 0,4 6 20 ± 6 209 ± 93 4,8 20,1 ± 0,2 1,4 ± 0,7 7 13 ± 3 219 ± 61 5,8 18,8 ± 1,3 0,6 ± 0,4 3 12 ± 4 186 ± 104 6,8 19,0 ± 1,0 1,7 ± 0,8 9 16 ± 3 182 ± 68 7,8 18,9 ± 1,2 2,7 ± 1,3 14 14 ± 2 209 ± 71 PB+1%DDAK 3,4 4,6 ± 0,0 9,4 ± 4,3 206 17 ± 2 410 ± 143 3,8 9,6 ± 0,0 9,8 ± 3,2 102 16 ± 2 542 ± 39 4,8 17,8 ± 0,0 18,5 ± 1,7 104 14 ± 1 714 ± 95 5,8 19,4 ± 0,4 26,3 ± 5,7 135 14 ± 2 778 ± 86 6,8 18,6 ± 0,0 26,9 ± 3,4 144 9±2 695 ± 55 7,8 18,4 ± 0,0 9,6 ± 3,5 52 12 ± 1 405 ± 82 tris 3,4 6,9 ± 0,2 0,7 ± 0,4 10 18 ± 2 178 ± 71 4,0 12,8 ± 1,7 1,8 ± 1,0 14 14 ± 3 349 ± 40 4,4 15,6 ± 0,2 2,3 ± 1,3 15 14 ± 2 350 ± 128 4,8 18,8 ± 0,7 1,1 ± 1,1 6 18 ± 5 145 ± 74 5,8 19,3 ± 0,6 2,0 ± 0,5 10 21 ± 1 120 ± 30 6,8 19,6 ± 0,4 3,1 ± 2,0 16 20 ± 1 210 ± 55 7,8 19,6 ± 0,4 5,4 ± 2,4 27 20 ± 3 273 ± 45 8,8 19,5 ± 0,0 5,3 ± 2,5 27 13 ± 2 272 ± 98 tris+1%T12 3,4 7,1 ± 0,1 6,4 ± 4,2 89 21 ± 1 599 ± 199 4,0 12,3 ± 0,3 11,3 ± 3,6 92 21 ± 1 1549 ± 416 4,4 14,8 ± 0,5 10,4 ± 5,1 70 17 ± 3 1372 ± 319 4,8 18,5 ± 3,9 8,1 ± 4,5 44 18 ± 2 1244 ± 372 5,8 17,6 ± 0,9 6,6 ± 2,7 37 19 ± 3 985 ± 246 6,8 16,4 ± 0,1 1,7 ± 0,5 10 17 ± 3 138 ± 52 7,8 17,3 ± 0,5 4,1 ± 2,2 24 19 ± 2 173 ± 33 8,8 16,4 ± 1,1 7,2 ± 0,4 44 18 ± 1 227 ± 26 PB+1%DDAK 2 h pretr.,2%PMEA 5,8 18,8 ± 1,3 16,0 ± 4,6 85 8±3 436 ± 24 tris+1%T12 2 h pretr.,2%PMEA 7,8 19,6 ± 0,4 6,0 ± 2,9 31 16 ± 3 186 ± 25 PB+1%PMEA 5,8 10 0,8 ± 0,5 8 10 ± 4 162 ± 139 PB+1%DDAK+1%PMEA 5,8 10 12,2 ± 4,5 122 12 ± 4 275 ± 59 PB+0,5%PMEA 5,8 5 0,2 ± 0,0 4 19 ± 3 143 ± 15 PB+1%DDAK+0,5%PMEA 5,8 5 4,8 ± 1,2 96 14 ± 2 205 ± 13 IPM 0,098±0,006 0,6 ± 0,3 612245 14 ± 1 971 ± 162
27
Permeační profily 2% PMEA v daných vehikulech byly zaneseny do grafů (grafy č. 115). Grafy byly vytvořeny vţdy pro jednu hodnotu pH a byly porovnávány permeační profily u vzorků s akcelerantem a bez akcelerantu vţdy ve stejném vehikulu (2% PMEA v PB a 2% PMEA v PB s 1% DDAK, 2% PMEA v tris a 2% PMEA v tris s 1% T12). Roztok, který vznikne rozpuštěním PMEA ve vodě, má pH 3,4. Proto jsme zvolili tuto hodnotu pH jako první ve sledované řadě. Porovnávali jsme také permeační profily nepufrovaného vodného roztoku 2% PMEA, 2% PMEA v PB a 2% PMEA v tris, vše při pH 3,4 (graf č. 1). Zjistili jsme, ţe při tomto pH má PMEA, při porovnání všech tří sledovaných vzorků, ve vodném roztoku bez obsahu dalších iontů nejniţší rozpustnost (2,5 mg/ml), nejvyšší flux (1,8 g/cm2/h) a tím i nejvyšší permeabilitní koeficient (72*10e-5 cm/h). Také mnoţství PMEA stanovené v kůţi po 48 hodinách bylo nejvyšší právě ve vodném roztoku (294 g/g). Srovnání viz. grafy č. 2 – 5.
Flux PMEA při pH 3,4 Flux PMEA (μg/cm2/h)
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
permeační profil PMEA při pH 3,4 voda 80 70 60 50 40 30 20 10 0
PB tris
0
12
24
36
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 voda
48
čas (h)
Rozpustnost donorového vzorku při pH 3,4 Rozpustnost (mg/ml)
tris
graf č. 2
8 6 4 2 0 voda
PB
Donorové vehikulum
tris
Permeab. koef. (*10e-5cm/h)
graf č. 1
graf č. 3
PB
Donorové vehikulum
Permeabilitní koeficient při pH 3,4
8 6 4 2 0 voda
PB
tris
Donorové vehikulum
graf č. 4
28
Obsah PMEA v kůži (µg/g)
Obsah PMEA v kůži při pH 3,4 400 300 200 100 0 voda
PB
tris
Donorové vehikulum
graf č. 5 U vzorků, u kterých byl jako vehikulum pouţit tris, jsme sledovali permeační charakteristiky v této řadě pH: 3,4; 4,0; 4,4; 4,8; 5,8; 6,8; 7,8; 8,8 a to jak pro vzorky 2% PMEA, tak i pro vzorky s obsahem 1% T12 jako akcelerantu permeace (grafy č. 6 – 13)
300
tris
250
1%T12
200 150 100 50 0 0
permeační profil PMEA při pH 4,0 kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
permeační profil PMEA při pH 3,4
12
24
36
400 tris 300
1%T12
200 100 0 0
48
12
24
čas (h)
graf č. 6
600 500
tris
400
1%T12
300 200 100 0 0
12
permeační profil PMEA při pH 4,8 kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
48
graf č. 7 permeační profil PMEA při pH 4,4
24
36
400 350 300 250 200 150 100 50 0
48
tris 1%T12
0
čas (h)
graf č. 8
36
čas (h)
12
24
36
48
čas (h)
graf č. 9
29
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
permeační profil PMEA při pH 5,8 300 tris
250
1%T12
200 150 100 50 0 0
12
24
36
48
čas (h)
graf č. 10 Zjistili jsme, ţe kumulativní mnoţství PMEA v akceptorové fázi je zpravidla vyšší u vzorků s obsahem akcelerantu v porovnání se stejnými vzorky bez akcelerantu. Toto pravidlo však neplatí u vzorků obsahujících 2% PMEA v tris v porovnání se stejnými vzorky obsahujícími navíc 1% T12 jako akcelerant permeace při pH 6,8 a vyšším. Při těchto pH (6,8; 7,8 a 8,8) jsou zjištěná kumulativní mnoţství PMEA v akceptorové fázi, pokud vezmeme v úvahu i směrodatné odchylky, v podstatě totoţná (grafy č. 11-13).
160 140
tris
120
1%T12
100 80 60 40 20 0 0
12
permeační profil PMEA při pH 7,8 kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
permeační profil PMEA při pH 6,8
24
36
48
300 tris
250
1%T12
200 150 100 50 0 0
čas (h)
12
24
36
48
čas (h)
graf č. 11
graf č. 12
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
permeační profil PMEA při pH 8,8 300 tris
250
1%T12 200 150 100 50 0 0
12
24
36
48
čas (h)
graf č. 13 30
Pro druhou řadu vzorků byl jako vehikulum pouţit PB a permeační charakteristiky byly sledovány v řadě pH: 3,4; 3,8; 4,8; 5,8; 6,8; 7,8 a to opět jak pro vzorky 2% PMEA, tak i pro stejné vzorky s obsahem akcelerantu permeace 1% DDAK (grafy č. 14 – 19).
PB
500,0
1%DDAK
400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 0
12
permeační profil PMEA při pH 3,8 Kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
permeační profil PMEA při pH 3,4
24
36
500 PB
400
1%DDAK 300 200 100 0
48
0
12
24
čas (h)
graf č. 14
600
PB
500
1%DDAK
400 300 200 100 0 12
24
permeační profil PMEA při pH 5,8 kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
700
36
1200 PB
1000
1%DDAK
800 600 400 200 0
48
0
12
čas (h)
48
1200
PB 1%DDAK
900 600 300 0 12
24
permeační profil při pH 7,8 kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
kumulativní množství PMEA (µg/cm2)
36
graf č. 17
permeační profil PMEA při pH 6,8
36
48
500 PB 400
1%DDAK
300 200 100 0 0
12
24
36
48
čas (h)
čas (h)
graf č. 18
24 čas (h)
graf č. 16
0
48
graf č. 15
permeační profil PMEA při pH 4,8
0
36
čas (h)
graf č. 19
Hodnoty J u vzorků bez akcelerantu se pohybovaly v rozmezí 0,22 ± 0,05 aţ 2,7 ± 1,32 μg/cm2/h pro PB a 0,66 ± 0,4 aţ 5,39 ± 2,41 μg/cm2/h pro tris. Při porovnání obou 31
vehikul jsou závislosti J na hodnotách pH zhruba stejné, permeabilita se zvyšujícím se pH mírně roste (graf č. 20).
Flux PMEA (μg/cm2/h)
Závislost fluxu PMEA na pH tris
10
PBS
8 6 4 2 0 3
4
5
6
7
8
9
pH
graf č. 20 Při sledování závislosti J na pH u vzorků s obsahem akcelerantu jsme zjistili, ţe DDAK vykazuje nejvyšší aktivitu při pH 5,8 a 6,8 (J = 26,27 ± 5,7 μg/cm2/h resp. 26,86 ± 3,37 μg/cm2/h); zatímco T12 je nejúčinnější při pH 4,0 a 4,4, kdy jsou hodnoty J (11,29 ± 3,6 μg/cm2/h a 10,43 ± 5,12 μg/cm2/h). T12 je jako akcelerant neúčinný při pH 6,8 a vyšším, kdy jsou hodnoty J prakticky stejné jako u vzorků bez akcelerantu (grafy č. 21 22).
32
Flux PMEA (μg/cm2/h)
Závislost fluxu PMEA na pH tris 1%T12
20 15 10 5 0 3
4
5
6
7
8
9
pH graf č. 21
Flux PMEA (μg/cm2/h)
Závislost fluxu PMEA na pH 35 30 25 20 15 10 5 0
PB 1%DDAK
3
4
5
6
7
8
9
pH graf č. 22 Zjišťovali jsme také vliv akcelerantů DDAK a T12 na rozpustnost PMEA. Z vytvořených grafů je zřejmé, ţe přítomnost těchto akcelerantů rozpustnost PMEA v daných vehikulech neovlivňuje. Od hodnoty pH 4,8 rozpustnost PMEA se sniţujícím 33
se pH klesá a to jak u vzorků v PB, tak v tris. Vzorky obsahující 2% PMEA s pH 4,8 a vyšším byly ve formě roztoku, ostatní byly suspenze (grafy č. 23 - 24).
Konc. PMEA v donorovém vzorku
25 20 15 10 5 0
Koncentrace (mg/ml)
Koncentrace (mg/ml)
Konc. PMEA v donorovém vzorku
tris T12 3
4
5
6
7
8
9
25 20 15 10 5 0
PB DDAK 3
4
5
6
7
8
9
pH
pH
graf č. 23
graf č. 24
Jednoduchým výpočtem P = J/cvzorku jsme zjistili hodnoty permeabilitních koeficientů P pro jednotlivé vzorky při daných hodnotách pH (tab.1). Sledovali jsme závislost P (*10e-5 cm/h) na pH pro daná vehikula a vzorky s obsahem akcelerantu (grafy č. 25 27). Permeabilitní koeficient PMEA
tris
30 25 20 15 10 5 0
P (*10e-5 cm/h)
P (*10e-5 cm/h)
Permeabilitní koeficient PMEA
PB
3
4
5
6
7
8
9
100
tris
80
T12
60 40 20 0 3
pH
4
5
6
7
8
9
pH
graf č. 25
graf č. 26
P (*10e-5 cm/h)
Permeabilitní koeficient PMEA PB
250 200 150 100 50 0
DDAK
3
4
5
6
7
8
9
pH
graf č. 27 34
Vypočtené hodnoty distribučního koeficientu K jsou shrnuty v tabulce 2. Rozdělování mezi SC a daným vehikulem se v námi sledovaném rozsahu pH výrazně neměnilo. Pohybovalo se v rozsahu hodnot 0,038 - 0,050 (PB) a 0,060 - 0,088 (tris). Přítomnost měla jen nepatrný vliv na rozdělování do SC. Hodnoty distribučního
akcelerantu
koeficientu K byly v rozmezí 0,042 - 0,077 pro DDAK a 0,063 - 0,186 pro T12 (grafy č. 28 - 29).
tab. 2 Distribuční koeficient K (SC/vehikulum) vzorky pH PB
DDAK
tris
T12
3,4 0,038 ± 0,011
0,042 ± 0,011
0,060 ± 0,010
0,063 ± 0,023
3,8 0,042 ± 0,015
0,051 ± 0,022 0,063 ± 0,019
0,081 ± 0,025
4 4,8 0,046 ± 0,005
0,066 ± 0,007
0,060 ± 0,024
0,108 ± 0,011
5,8 0,046 ± 0,028
0,077 ± 0,014
0,074 ± 0,028
0,138 ± 0,022
6,8 0,050 ± 0,010
0,064 ± 0,008
0,084 ± 0,018
0,130 ± 0,015
7,8 0,045 ± 0,003
0,054 ± 0,014
0,088 ± 0,016
0,186 ± 0,060
Distribuční koeficient SC/vehikulum
Závislost hodnot distribučního koeficientu SC/vehikulum na pH PB
0,10
DDAK
0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 3
4
5
6
7
8
pH
graf č. 28
35
Distribuční koeficient SC/vehikulum
Závislost hodnot distribučního koeficientu SC/vehikulum na pH 0,30
tris
0,25
T12
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 3
4
5
6
7
8
pH
graf č. 29 Jako další jsme stanovili obsah PMEA v kůţi po proběhlých permeačních pokusech, tj. po 48 hodinách působení donorového vzorku na kůţi. Vypočtené hodnoty ckůţe (μg/g) jsme zanesli do tabulky (tab.1) a následně sestavili grafy závislosti koncentrace PMEA v kůţi na pH donorového vzorku. Sledovali jsme hlavně vliv pouţitých akcelerantů na mnoţství PMEA v kůţi (grafy č. 30 - 31).
36
Obsah PMEA v kůži po 48 h
PMEA (μg/g)
2000
tris T12
1500 1000 500 0 3
4
5
6
7
8
9
pH graf č. 30
PMEA (μg/g)
Obsah PMEA v kůži po 48 h 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
PB DDAK
3
4
5
6
7
8
9
pH graf č. 31 Z grafů je zřejmé, ţe zde je závislost stejná jako u sledovaných hodnot J (grafy č. 21 22), ale vzorky s T12 dosahují v tomto případě vyšších hodnot výsledného obsahu PMEA v kůţi, při pH 4,0 je to dokonce 1549 ± 416 μg/g. U vzorků s DDAK bylo 37
dosaţeno maximálního obsahu v kůţi při pH 4,8 aţ 6,8 (714 ± 95, 778 ± 86 a 695 ± 55 μg/g). Sledovali jsme také vliv koncentrace PMEA a akcelerantu DDAK v donorovém vzorku na výsledný J. Zjistili jsme, ţe k dosaţení maximálního J (26,27 ± 5,7 μg/cm 2/h) stačí 2 % PMEA a 1 % DDAK. Při zvýšení koncentrace PMEA na 5 % zůstává J prakticky stejný, stejně tak při dalším zvyšování koncentrace akcelerantu (grafy č. 32 - 33).
Závislost fluxu PMEA na jeho koncentraci v donorovém vzorku
Flux PMEA (μg/cm2/h)
30 25 20
1 % DDAK
15
0 % DDAK
10 5 0 0
1
2
3
4
5
6
% PMEA
graf č. 32
Závislost fluxu PMEA na koncentraci DDAK v donorovém vzorku
Flux PMEA (μg/cm2/h)
35 30 25 20 15 10 5 0 0
1
2
3
% DDAK
graf č. 33 38
Trochu jiná je závislost při sledování výsledného obsahu PMEA v kůţi. Zde by u 2% PMEA postačilo přidání 0,5 % DDAK pro dosaţení maximálního obsahu PMEA v kůţi (837 ± 94 μg/g). S rostoucí koncentrací PMEA ve vzorku však výsledné mnoţství PMEA v kůţi stoupá (grafy č. 34 - 35). Tyto experimenty byly prováděny při pH 5,8.
Obsah PMEA v kůži (μg/g)
Závislost obsahu PMEA v kůži na koncentraci DDAK v donorovém vzorku 1200 1000 800 600 400 200 0 0
1
2
3
% DDAK
graf č. 34
Obsah PMEA v kůži (μg/g)
Závislost obsahu PMEA v kůži na jeho koncentraci v donorovém vzorku 2000
1 % DDAK
1500
0 % DDAK
1000 500 0 0
1
2
3
4
5
6
% PMEA
graf č. 35 Pozornost jsme věnovali také moţnosti aplikace akcelerantů DDAK a T12 jako pretreatmentu. DDAK zvyšuje permeaci PMEA i při pretreatment aplikaci, ale jeho účinek je menší neţ při současném podání (graf č. 36). 39
Pretreatment aplikace 1% DDAK při pH 5,8
Flux PMEA (μg/h/cm²)
35 30 25 20 15 10 5 0 2% PMEA + 1% 1% DDAK 2 h DDAK pretreatment; 2% PMEA
2% PMEA
graf č. 36 Také výsledný obsah PMEA v kůţi je vyšší při pretreatment aplikaci DDAK, ale opět ne takový, jakého bylo dosaţeno při současném podání (graf č. 37).
Obsah v kůži (μg/g)
Pretreatment aplikace 1% DDAK při pH 5,8 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 2% PMEA + 1% DDAK
1% DDAK 2 h pretreatment; 2% PMEA
2% PMEA
graf č. 37 U vzorků s obsahem 1% T12 není rozdíl mezi současnou a pretreatment aplikací, v obou případech je T12 při pH 7,8 neúčinný (grafy č. 38 - 39).
40
Flux PMEA (μg/h/cm²)
Pretreatment aplikace 1% T12 při pH 7,8 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 2% PMEA + 1% T12
1% T12 2 h pretreatment; 2% PMEA
2% PMEA
graf č. 38
Pretreatment aplikace 1% T12 při pH 7,8
Obsah v kůži (μg/g)
350 300 250 200 150 100 50 0 2% PMEA + 1% 1% T12 2 h T12 pretreatment; 2% PMEA
2% PMEA
graf č. 39
41
5. DISKUSE Tato práce byla vypracována jako úvodní studie při výzkumu permeačních vlastností PMEA. Soustředili jsme se především na sledování vlivu pH na permeační chování PMEA ve vybraných vehikulech. Sledovali jsme také vliv některých akcelerantů permeace. Acyklické nukleosid fosfonáty jsou zajímavou skupinou sloučenin, které disponují různými biologickými aktivitami. Působí jako antivirotika, cytostatika, antiparasitika a immunomodulační látky. Vlivem polárního charakteru fosfonátové skupiny je resorpce těchto látek z gastrointestinálního traktu omezena a proto jednou z moţností, jak zvýšit jejich biologickou dostupnost, je hledání nových proléčiv. Jinou moţností, jak zlepšit jejich farmakokinetické parametry, je podání těchto léčiv přes kůţi. Permeační pokusy byly prováděny za předem stanovených podmínek (časy odebírání vzorků, stálá teplota 32°C). PBS o pH 7,4 jako akceptorové médium byl vybrán proto, aby se podmínky pokusu pokud moţno co nejvíce blíţili podmínkám in vivo. Zjistili jsme, ţe PMEA vykazuje překvapivě dobré permeační vlastnosti a to i přes to, ţe se jedná o látku obsahující fosfonátovou skupinu. V současné době nejsou běţně dostupná data o permeaci PMEA přes kůţi, která by nám slouţila pro porovnání našich výsledků. Jediným zástupcem ze skupiny acyklických nukleosid fosfonátů, u kterého byla provedena studie týkající se transdermálního a dermálního podání, je cidofovir. Průměrné hodnoty J u cidofoviru při permeaci přes prasečí kůţi in vitro byly 3,6 a 5,3 μg/cm2/h z mikropartikulí a roztoku cidofoviru99,100. Tyto hodnoty zhruba korespondují s námi zjištěnými hodnotami při permeaci PMEA. PMEA je látkou kyselé povahy, nepufrovaná suspenze ve vodě měla pH 3,4. Zajímavé bylo porovnání permeačních charakteristik pro pouţitá vehikula při tomto pH. Ačkoli měl PMEA ve vodném vzorku bez přítomnosti jiných iontů nejniţší rozpustnost, nakonec prokázal vyšší hodnoty J a P neţli vzorky v PB a tris. Také jeho obsah v kůţi byl téměř dvojnásobný. Tento výsledek bychom mohli vysvětlit následovně. Při pH 3,4 je PMEA přítomen z větší části ve formě zwitteriontu s kationtem na N1 adeninového cyklu a hydrogenfosfonátovým aniontem. Jiţ dříve byly popsány dvě konformace PMEA - syn a anti101 (obr. 6). Syn konformace PMEA s intramolekulární iontovou interakcí mezi hydrogenfosfonátovým aniontem a protonizovaným N1 byla nalezena ve vodném roztoku. Tato struktura by mohla být spojena s niţší rozpustností ve vodném prostředí a vyšší 42
permeabilitou přes lipofilní koţní bariéru. Anti konformace byla nalezena jak v krystalické formě zwitteriontu PMEA, tak i u mono- a dianiontu PMEA a napodobuje konformaci adenosin monofosfátu. Permeabilita tohoto konformeru přes kůţi je pravděpodobně omezenější. Rozdílnou permeabilitu PMEA z pouţitých vehikul bychom mohli, na základě teorie přítomnosti různých konformací, pravděpodobně přisuzovat rozdílnému zastoupení jednotlivých konformerů, které by mohlo být způsobeno přítomností či absencí opačně nabitých iontů.
NH 2 H
N
N+
OHO P O
NH 2
N
N
H
N
N+ N
N
O
O -
syn-like
anti-like
O O P OH
Obr. 6 Konformace PMEA101 Při sledování závislosti permeability PMEA na pH jsme zjistili, ţe permeabilita PMEA bez přítomnosti akcelerantů, se zvyšujícím se pH mírně stoupá. To platí pro vzorky v PB i tris. Vzhledem k tomu, ţe se PMEA v takovéto šíři pH spektra nachází postupně ve formě zwitteriontu, mono- nebo dianiontu, jsou jen minimální změny permeability poněkud překvapivé. V tomto případě lze předpokládat, ţe za zvýšením permeability nestojí zvyšující se podíl dianiontu PMEA, ale spíše negativní vliv bazického prostředí na koţní bariéru. Nicméně dlouhodobá aplikace bazických látek na koţní povrch není vhodná pro praktické vyuţití. Pozornost jsme věnovali také působení akcelerantů permeace na zvýšení permeability PMEA. Zjistili jsme účinnost obou námi pouţitých akcelerantů (DDAK i T12), kaţdý však dosahoval maximálního účinku při jiném pH. Ţádný z námi pouţitých akcelerantů nijak neovlivňoval rozpustnost PMEA v donorovém vehikulu. T12 je nedávno popsaný biodegradovatelný akcelerant koţní permeace s vysokým akceleračním účinkem pro různá léčiva, se širokým spektrem fyzikálně-chemických vlastností, nízkou toxicitou a s dobrou koţní snášenlivostí102.
43
V naší studii dosahoval T12 optimálního akceleračního účinku při pH kolem 4, kdy jsme dosáhli přidáním 1 % T12 ke vzorku PMEA zvýšení J z původní hodnoty 1,8 μg/cm2/h na hodnotu 11,3 μg/cm2/h. Účinek samotného T12 je také závislý na pH a ionizaci jeho molekuly. T12 je ammonium karbamát a bylo prokázáno, ţe za jeho akcelerační aktivitu je zodpovědná právě přítomnost ionizované polární hlavy, zatím co původní aminoester byl celkově inaktivní102. Takovéto karbamátové soli bývají stabilní při neutrálním nebo slabě zásaditém pH. Během acidifikace je totiţ karbámová kyselina uvolněna a okamţitě rozloţena. Oproti tomu alkalizace vede ke tvorbě karbonátu. Při pH kolem 4 je T12 ve formě amoniové soli a mohl by tedy působit jednak jako povrchově aktivní látka, či vytvářet iontový pár s monoaniontem PMEA. Překvapivě neúčinný byl T12 při pH 6,8 a vyšším, kdy došlo k rapidnímu poklesu J aţ na hodnoty bez akcelerantu. To by mohlo pravděpodobně znamenat, ţe PMEA by mohl při tomto pH způsobit rozpad karbamátu a inaktivovat tak akcelerační účinek T12. Ke stejnému výsledku, tedy ţe je T12 inaktivní, jsme došli i při jeho aplikaci jako pretreatmentu 2 hodiny před aplikací samotného PMEA při pH 7,8. Nejvyššího J dosahuje PMEA při současné aplikaci s DDAK a to při pH kolem 6. Přidáním 1% DDAK ke vzorku PMEA jsme dosáhli zvýšení J z původních 0,64 μg/cm2/h na 26,3 μg/cm2/h. Tato hodnota J přibliţně odpovídá mnoţství 12,6 mg PMEA, které by se dostalo do organismu z náplasti o ploše 20 cm2 za 24 hodin, zatímco tableta obsahující 10 mg PMEAd (mnoţství odpovídá 5,4 mg PMEA) s 59% biologickou dostupností poskytuje 3,2 mg PMEA. Toto zjednodušené srovnání ukazuje, ţe PMEA, vysoce hydrofilní sloučenina ve formě zwitteriontu, by mohla být úspěšně podávána přes kůţi. Důvodem působení DDAK by mohlo být to, ţe při pH okolo 6 je PMEA přítomen převáţně ve formě monoaniontu (pKa 4,2 a 6,8) a tak by moţným mechanismem účinku DDAK jako akcelerantu permeace mohla být tvorba iontového páru. Jako ověření této hypotézy jsme provedli ještě další permeační pokusy s DDAK aplikovaným jako tzv. pretreatment 2 hodiny před podáním vzorku se samotným PMEA při pH 5,8. I v tomto případě došlo ke zvýšení J v porovnání se vzorkem, který DDAK neobsahoval, ale ne jiţ k tak výraznému. Došlo také ke značnému sníţení lag T na 8 hod, coţ je hodnota téměř poloviční, neţ při současném podání. Lze tedy předpokládat, ţe na zvýšení prostupu PMEA přes koţní bariéru se podílí jednak tvorba iontového páru s DDAK, ale pravděpodobně i přímá interakce DDAK s koţní bariérou. Při současném podání 44
DDAK s PMEA a pH 5,8 byl také více neţ třikrát vyšší zjištěný obsah PMEA v kůţi (778 μg/g) neţ u vzorku bez akcelerantu (186 μg/g). Nejvyšší koncentrace PMEA v kůţi po 48 hodinách jsme dosáhli u vzorků s 1% T12 při pH 4, kdy se maximální hodnota pohybovala kolem 1549 μg/g. Tento výsledek je zajímavý především proto, ţe zjištěné hodnoty EC50 nebo IC50 PMEA pro herpes viry jsou v rozsahu desítek mikrogramů na mililitr103,104,105. V této studii však byla hodnocena pouze koncentrace PMEA nakumulovaného v kůţi plné tloušťky, bez konkrétní lokalizace v jednotlivých koţních vrstvách. DDAK a T12 jsou amfifilní akceleranty koţní permeace. Jiţ jejich 1% koncentrace postačí k výraznému zvýšení permeace PMEA. Krom toho, ţe jako ionizované sloučeniny mohou tvořit iontové páry, působí pravděpodobně i na lipidy ve SC. Zvyšují nejen permeaci, ale i penetraci vybraných léčiv. Do tabulky jsme zařadili také IPM jako donorové vehikulum lipofilního charakteru pro porovnání jednotlivých permeačních charakteristik. PMEA v IPM má absolutně nejniţší rozpustnost (méně neţ 0,1 mg/ml, coţ je o tři řády méně neţ v hydrofilních vehikulech), hodnota J byla 0,6 μg/cm2/h a výsledná hodnota P 6,12 cm/h je o několik řádů vyšší neţ u ostatních vzorků. Celkový obsah PMEA v kůţi po 48 hodinách byl dokonce 971 μg/g. Tyto výsledky poukazují na moţné výhodné topické podání PMEA v lipofilním médiu s nízkou systémovou absorpcí léčiva.
45
6. ZÁVĚR V této práci jsme se snaţili vytvořit ucelenou charakteristiku PMEA ve vztahu k potenciálnímu transdermálnímu a dermálnímu podání. Zabývali jsme se vytvořením permeačních profilů PMEA při různých hodnotách pH, sledovali jsme závislost permeability PMEA na jeho koncentraci, na přítomnosti akcelerantů permeace DDAK a T12. Zjistili jsme, ţe pomocí akcelerantu transdermální permeace DDAK můţeme dosáhnout klinicky vyuţitelných hodnot fluxu PMEA. Výsledky této práce jsou součástí tří publikací: K. Vávrová, K. Lorencová, J. Klimentová, J. Novotný, A. Hrabálek. HPLC method for determination of in vitro delivery through and into porcine skin of adefovir (PMEA), J. Chrom. B, v tisku, viz příloha. K. Vávrová, K. Lorencová, J. Klimentová, J. Novotný, A. Holý, A. Hrabálek. Transdermal and Dermal Delivery of Adefovir (PMEA); Effect of pH and Permeation Enhancers, zasláno k posouzení. K. Vávrová, K. Lorencová, J. Klimentová, J. Novotný, A. Holý, A. Hrabálek. Dodecyl 6-dimethylaminohexanoate (DDAK) enhances transdermal delivery of adefovir (PMEA), v přípravě.
46
7. LITERATURA
1
De Clercq, E., Holy, A., Rosenberg, I.; Antimicrob Agents Chemother, 33, 1989, 185.
2
De Clercq, E., Sakuma, T., Baba, M., Pauwels, R., Balzarini, J., Rosenberg, I., Holy, A.; Antiviral Res, 8, 1987, 261.
3
Němeček, V.; Zprávy CEM, 12, 2003, 55-61.
4
Dienstag, J.L., Goldin, R.D., Heathcote, J.E., et al.; Gastroenterology, 124, 2003, 105-117.
5
Van Bommel, F., Wunsche, T., Schurmann, D., et al.; 54th Annual Meeting of AASLD, October 24-8, 2003, Boston, MA.Abstract 246.
6
AISLP, Micro-verze, 2007.1 pro Windows
7
Šperl. J.; Remedia, 15, 2005, 67-74.
8
Hadziyannis, S.J., Tassopoulos, N.C., Haethcote, E.J., et al.; N Engl J Med, 348, 2003, 800-807.
9
Marcellin, P., Chang, T.T., Lim, S.G., et al.; N Engl J Med, 348, 2003, 808-816.
10
Holy, A.; Curr Pharm Des, 9, 2003, 2567-2592.
11
Heijtink, R.A., De Wilde, G.A., Kruining, J., et al.; Antiviral Res, 21, 1993, 141153.
12
Holy, A., Votruba, I., Merta, A., et al.; Antiviral Res, 13(6), 1990, 295-311.
13
Xiong, X., Flores, C., Yang, H., Toole, J.J., Gibbs, C.S.; Hepatology, 28(6), 1998, 1669-1673.
14
Calio, R., Villani, N., Balestra, E., et al.; Antiviral Res, 23(1), 1994, 77-89.
15
Balzarini, J., Naesens, L., Herdewijn, P., et al.; Proc Natl Acad Sci U S A, 86 (1), 1989, 332-336.
16
De Clercq, E.; Antiviral Res, 12(1), 1989, 1-19.
17
De Clercq, E.; Drugs Exp Clin Res, 16(7), 1990, 319-326.
18
Lin, J.C., De Clercq, E., Pagano, J.S.; Antimicrob Agents Chemother, 31(9), 1987, 1431-1433.
19
Shaw, J.P., Louie, M.S., Krishnamurthy, V.V, et al.; Drug Metab Dispos, 25(3), 1997, 362-366.
20
Annaert, P., Kinget, R., Naesens, L., De Clercq, E., Augustijns, P.; Pharm Res, 14(4), 1997, 492-496. 47
21
Bronson, J.J., Ho, H.T., De Boeck, H., et al.; Ann N Y Acad Sci, 616, 1990, 398407.
22
Hepsera, package insert.Gilead Sciences, Inc., Foster City, CA., 2002.
23
Cundy, K.C., Barditch-Crovo, P., Walker, R.E., et al.; Antimicrob Agents Chemother, 39, 1995, 2401-2405.
24
Kramata, P., Votruba, I., Otova, B., Holy, A.; Mol Pharmacol, 49, 1996, 10051011.
25
Blindauer, C.A., Holy, A., Dvorakova, H., Sigel, H.; J Chem Soc [Perkin 1], 2, 1997, 2353-2363.
26
Guy, R.H., Hadgraft, J.; Pharm Int, 6, 1985, 112.
27
Vávrová, K., Zbytovská, J., Hrabálek, A.; Curr Med Chem, 12, 2005, 2273-2291.
28
Feldstein, M.M., Raigorodskii, I.M., Iordanskii, A.L., Hadgraft, J.; J Control Release, 52, 1998, 25-40.
29
Prausnitz, M.R., Mitragotri, S., Langer, R.; Nat Rev Drug Discov, 2004, 115-124.
30
Barry, B.W.; Eur J Pharm Sci, 14 (2), 2001, 101-114.
31
Chalabala, M., et al.; Technologie léků, 1997, 338
32
Odland, G.F. In Biochemistry and physiology of the skin,Goldsmith, L.A.,Ed., Oxford University Press: New York, 1983, 3-63.
33
www.seminarky.cz
34
Menon, G.K.; Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54, Suppl. 1, S3.
35
Agache, P., Humbert, P.; Eds. Measuring the skin, Springer-Verlag: Berlin, Heildelberg, 2004.
36
Hadgraft, J.; Eur J Pharm Biopharm, 58, 2004, 291-299.
37
Williams, M.L., Elias, P.M; Arch Dermatol, 129, 1993, 626.
38
Ya-Xian, Z., Suetake, T., Tagami, H.; Arch Dermatol Res, 291, 1999, 555.
39
Elias, P.M.; J Invest Dermatol, 80, 1983, 44-49.
40
Grubauer, G., Feingold, K.R., Harris, R.M., Elias, P.M.; J Lipid Res, 30, 1989, 89.
41
Potts, R.O., Francoeur, M.L.; J Invest Dermatol, 96, 1991, 495.
42
Imokawa, G., Abe, A., Jin, K., Higaki, Y., Kawashima, M., Hidano, A.; J Invest Dermatol, 96, 1991, 523.
43
Paige, D.G., Morse-Fisher, N., Harper, J.I.; Br J Dermatol, 131, 1993, 23.
44
Mao-Qiang, M., Feingold, K.R., Elias, P.M.; Arch Dermatol, 129, 1993, 728.
48
45
Vávrová, K., Zbytovská, J., Palát, K., Holas, T., Klimentová, J., Hrabálek, A., Doleţal, P.; Eur J Pharm Sci, 21, 2004, 581.
46
Long, S.A., Wertz P.W., Strauss, J.S., Downing, D.T.; Arch Dermatol Res, 277, 1985, 284.
47
Lampe, M.A., Burlingame, A.L., Whitney, J., Williams, M.L., Brown, B.E., Roitman, E., Elias, P.M.; J Lipid Res, 24, 1983, 120.
48
Schurer, N.Y., Elias, P.M.; Adv Lipid Res, 24, 1991, 27.
49
Wertz, P.W., Downing, D.T.; J Lipid Res, 24, 1983, 759.
50
Ponec, M.; Adv Drug Deliv Rev, 54, 2002, Suppl. 1, S19.
51
Motta, S., Monti, M., Sesana, S., Caputo, R., Carelli S., Ghidoni, R.; Biochim Biophys Acta, 1182, 1993, 147.
52
Wertz, P.W.; Adv Drug Deliv Rev, 18, 1996, 283.
53
Weerheim, A., Ponec, M.; Arch Dermatol Res, 293, 2001, 191.
54
Williams, M.L., Elias, P.M.; Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 3, 1987, 95.
55
Norlén, L.; J Invest Dermatol, 117 (4), 2001, 830-836.
56
Flynn, G.L.; In Percutaneous Absorption: Mechanisms - Methodology - Drug Delivery; Bronaugh, R.L., Maibach, H.I., Eds., Marcel Dekker: New York, 1989, 27-51.
57
Kou, J.H., Roy, S.D., Du, J., Fujiki, J.; Pharm Res, 10, 1993, 986.
58
Hueber, F., Schaefer, H., Wepierre, J.; Skin Pharmacol, 7 , 1994, 237.
59
Barry, B.W.; Adv Drug Deliv Rev, 54, 2002, Suppl. 1, S31.
60
Albery, W.J., Hadgraft, J.; J Pharm Pharmacol, 31, 1979, 140.
61
Potts, R.O., Guy, R.H.; J Invest Dermatol, 96, 1991, 580.
62
Potts, R.O., Guy, R.H.; Pharm Res, 9, 1992, 663.
63
Guy, R.H., Hadgraft, J.; Pharm Res, 5, 1988, 753.
64
Potts, R.O., Guy, R.H.; Pharm Res, 12, 1995, 1628.
65
Pugh, W.J., Roberts, M.S., Hadgraft, J.; Int J Pharm, 138, 1996, 149.
66
Barry, B.W.; Pharm Sci Technolo Today, 2 (2), 1999, 41-43.
67
Potts, R.O., Guy, R.H.; Pharm Res, 9, 1992, 663-669.
68
Hadgraft, J.; Skin Pharmacol Appl Skin Physiol, 14, 2001, 72-81.
69
Hadgraft, J.W.,Somers, G.F.; J Pharm Pharmacol, 8, 1956, 625-634.
70
Hadgraft, J.W., Valenta, C.; Int J Pharm, 200, 2000, 243-247.
71
Valenta, C., Siman, U., Kratzel, M., Hadgraft, J.W.; Int J Pharm, 197, 2000, 77-85. 49
72
Hadgraft, J.W., Green, P.G., Wotton, P.K.; In R. Bronaugh, H.I. Maibach (Eds.), Percutaneous Absorption, Marcel Dekker, New York, 1989, 555-565.
73
Green, P.G., Hadgraft, J.W., Ridout, G.; Pharm Res, 6, 1989, 628-632.
74
Barker, N., Hadgraft, J.W.; Acta Pharm Suec, 20, 1983, 61-62.
75
Barry, B.W.; Dermatological Formulations: Percutaneous Absorption, Marcel Dekker, New York, 1983.
76
Tauber, U., Rost, K.L. In Pharmacology of the skin, Vol. 1., Skin Pharmacokinetics; Shroot, B., Schaefer, H., Eds., S. Karger: Basel, 1987; 170.
77
Barry, B.W.; Int J Cosmet Sci, 10, 1988, 281.
78
Goodman, M., Barry, B.W.; Int J Pharm, 57, 1989, 29.
79
Barry, B.W.; In In Vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals, and Applications, Bronaugh R.L., Maibach, H.I., Eds., CRC Press: Boca Raton, FL, 1991, 165-185.
80
Barry, B.W.; J Control Release, 15, 1991, 237.
81
Moser, K., Kriwet, K., Naik, A., Kalia, Y.N., Guy, R.H.; Eur J Pharm Biopharm, 52, 2001, 103.
82
Suhonen, T.M., Bouwstra, J.A., Urtti, A.; J Control Release, 59, 1999, 149.
83
Menczel E.M.; In Percutaneous Penetration Enhancers, Smith E.W., Maibach, H.I., Eds., CRC Press: Boca Raton, FL, 1995, 383-392.
84
Menon, G.K., Lee S.H., Roberts, M.S.; In Dermal Absorption and Toxicity Assessment, Roberts, M.S., Walters, K.A., Eds., Marcel Dekker: New York, 1998, 727-751.
85
Arct, J., Chelkowska, M., Kasiura, K., Pietrzykowski, P.; Int J Cosm Sci, 24, 2002, 313-322.
86
Kraus, C.A.; J Phys Chem, 60, 1956, 129-141.
87
Sloan, J.B., Soltani, K.; J Am Acad Dermatol, 15, 1986, 671-684.
88
Kost, J., Langer, R.; In V.P.Shah, H.I.Maibach (Eds.), Topical Drug Bioavailability, Bioequivalence and Penetration, Plenum Press, New York, 1993, 91-104.
89
Hatanaka, T., Kamon, T., Morigaki, S., Katayama, K., Koizumi, T.; J Contr Rel, 66, 2000, 63-71.
90
Arct, J., Gronwald, M., Kasiura, K.; Eur Cosmetics, 8, 2000, 46-48.
91
Hatanaka, T., Morigaki, S., Aiba, T., Katayama, K., Koizumi, T.; Int J Pharm, 125, 1995, 195-203. 50
92
Hrabálek, A., Doleţal, P., Farsa, O., Škubalová, Z., Kuneš, J.; Pharmazie, 55, 2000, 759-761.
93
Hrabálek, A., Doleţal, P., Vávrová, K., Zbytovská, J., Holas, T., Klimentová, J., Novotný, J.; Pharm Res, 23 (5), 2006, 912-919.
94
Houk, J., Guy, R.H.; Chem Rev, 88, 1988, 455-471.
95
Iervolino, M., Raghavan, S.L., Hadgraft, J.; Int J Pharm, 198, 2000, 229-238.
96
Franz, T.J.; J Invest Dermatol, 64 (3), 1975, 190-195.
97
Vávrová, K., Lorencová, K., Klimentová, J., Novotný, J., Hrabálek, A.; J Chromatogr B, 2007, in press, doi:10.1016/j.jchromb.2007.03.012.
98
Kligman, A.M., Christophers, E.; Arch Dermatol, 88, 1963, 709-712.
99
Santoyo, S., De Jalon, E.G., Campanero, M.A., Ygartua, P.; J Pharm Biomed Anal, 29, 2002, 819.
100
Santoyo, S., De Jalon, E.G., Ygartua, P., Renedo, M.J., Blanco-Prieto, M.J.; Int J Pharm, 242, 2002, 107.
101
Kopecky, V., Jr., Mojzes, P., Burda, J.V., Dostal, L.; Biopolymers, 67, 2002, 285288.
102
Hrabálek, A., Doleţal, P., Vávrová, K., Zbytovská, J., Holas, J., Klimentová, J., Novotný, J.; Pharm Res, 23, 2006, 912-919.
103
De Clercq, E., Holy, A., Rosenberg, I.; Antimicrob Agents Chemother, 33, 1989, 185-191.
104
Perno, C.F., Balestra, E., Aquaro, S., Panti, S., Cenci, A., Lazzarino, G., Tavazzi, B., Di Pierro, D., Balzarini, J., Calio, R.; Mol Pharmacol, 50, 1996, 359-366.
105
Reymen, D., Naesens, L., Balzarini, J., Holy, A., Dvorakova, H., De Clercq, E.; Antiviral Res, 28, 1995, 343-357.
51
