Interactive Conference of Young Scientists 2016
Ultrasenzitivní lektinové biosenzory pro včasnou detekci rakoviny prostaty Dominika Pihíková, Zuzana Pakanová, Štefan Belický, Tomáš Bertók, Ján Mucha, Ján Tkáč Chemický ústav SAV, Dúbravská cesta 9, Bratislava 845 38, Slovensko
[email protected]
Rakovina prostaty Více než
600 000 nových případů ročně (celosvětově)
90 000 můžu ročně umírá Výskyt rakoviny (v %) Rakovina prostaty Rakovina plic Rakovina kolorekta Rakovina močového měchýře Non-Hodgkin lymphoma Rakovina kůže Rakovina jater Rakovina hltanu Leukémie Rakovina pankreasu Další
Každé 2,3 min je diagnostikován nový případ rakoviny prostaty
Průměrný věk, ve kterém je mužům diagnostikována rakovina prostaty je 66 let
Výborná prognóza pacientů
při včasné diagnóze Celosvětová akce pro podporu pacientů MOVEMBER s rakovinou prostaty
Role glykanů v lidském těle • Glykosylace = jedna z nejčastějších post-translačních modifikací proteinů
• Glykany = polysacharidy, které jsou kovalentně navázány na proteiny nebo lipidy • 70-80% proteinů v lidském těle jsou glykosylovány
Buněčná komunikace
Stavební prvky
Host-patogenní interakce (virusy, bakterie)
Glykany Ochrana buněk a proteinů
• Glykany jsou součástí fyziologických i patologických procesů v lidském těle
Počet vědeckých publikací
1000
"Glycan"
Rozlišování krevních skupin
800 600 400 200
Obr. 1 – Zvyšující se počet publikací s klíčovým slovem „glycan“
Obr. 2 – Oligosacharidový obal HIV-1 trimeru zodpovídající za virovou nákazu (K. J. Doores, 2010, Proc Natl Acad Sci )
Glykosylace při patologických stavech • Během různých onemocněních (rakovina, AIDS, revmatoidní artritida, aj.) nastávají změny a abnormality v glykosylaci • Detekce glykanových změn = potenciální biomarker při včasné diagnostice onkologických onemocněních
• Mezi nejčastější abnormality v glykosylaci patří změny v obsahu/vazbě kyseliny sialové, fukózy nebo dochází k zvýšenému β-větvení glykanových struktur
Obr. 3 – Zaznačení nejčastějších glykanových změn při tumorigenezi; změny u kyseliny sialové, fukózy a zvýšené větvení oligosacharidů
Biosenzory a biočipy
Lektiny = proteiny neimunitního původu, které dokáží s vysokou mírou specificity rozpoznávat a vázat sacharidové jednotky (ať už volné nebo vázané na glykoproteinech či glykolipidech)
SNA lektin
α-2,3-Neu5Ac
RCA lektin
Con A lektin
Gal
Man, Glc
Design experimentů
-Z'' [Ω]
Elektrochemická impedanční spektroskopie (EIS)
Z' [Ω]
Lektin Blokovací činidlo Protilátka Tvorba SAM vrstvy
EDC/NHS imobilizace biomolekul na zlatý povrch elektrody
Prostatický specifický antigen (PSA)
Glykoprofilace PSA – elektrochemicky • Klíčová optimalizace složení samo-uspořádané vrstvy (SAM) na zlaté elektrodě
MCH Merkaptohexanol
MUA Merkaptoundekanová kys.
• Optimální složení 1:3 (MUA:MCH) • Dosažení velmi nízkého limitu detekce (4 aM koncentrace) Obr. 4 – Kalibrační křivky pro analýzu PSA v závislosti na různém složení SAM vrstvy
• Glykoprofilace a kvantifikace PSA na povrchu zlaté elektrody • Přítomnost α-2,6-sialové kyseliny (lektin SNA) Obr. 5 – Odezva biosenzoru na lektin SNA (α-2,6-Neu5Ac) a na lektin MAA (α-2,3Neu5Ac)
• Nepřítomnost α-2,3-sialové kyseliny (lektin MAA)
Redukce nespecifických interakcí 75
8,E+03
no block
55
0.1% gelatin CF buffer
35
A
SAM+Ab SAM+Ab+SNA
6,E+03
1M ETA -Z'' [Ω]
ΔRct after SNA [%]
0.8% gelatin + 0.05% Tween
4,E+03 2,E+03 0,E+00 0,E+00 3,E+03 6,E+03 9,E+03 1,E+04 2,E+04 2,E+04
15
Z' [Ω]
-5
Anti-PSA + blokovací činidlo + SNA
B
Obr. 6 – Účinnost různých blokovacích činidel při sledování nespecifických interakcí SNA lektinu na povrch imunosenzoru
SAM+Ab SAM+Ab+CF buffer
1,E+04
SAM+Ab+CF buffer+SNA 8,E+03 -Z' [Ω]
• Porovnání 4 blokovacích činidel (0.8% želatina + 0.05% Tween; 1M etanolamin; 0.1% želatina; carbo-free (CF) blokovací činidlo
4,E+03
• Snížení nespecifických interakcí SNA lektinu na povrch biosenzoru s imobilizovanou anti-PSA
0,E+00 0,E+00
• Nejlepší blokovací schopnosti vykazoval carbo-free pufr (CF-buffer) → použití v dalších experimentech
Obr. 7 – (A) Nespecifické interakce SNA lektinu na povrch imunosenzoru bez použití blokovacího činidlo, (B) Redukce nespecifických interakcí SNA lektinu na povrch imunosenzoru za použití carbo-free blokovacího činidla
5,E+03
1,E+04 2,E+04 Z' [Ω]
2,E+04
3,E+04
Workflow analýzy MALDI TOF/TOF • Enzymatické uvolnění N-glykanů z glykoproteinu PSA → purifikace a izolace N-glykanů → MALDI-TOF/TOF analýza (interpretace dat, hledání glykanových struktur u PSA) → rozlišení glykosidické vazby u kyseliny sialové • Potvrzení α-2,6-sialové kyseliny na povrchu PSA pomocí hmotnostní spektroskopie (derivatizace kyseliny sialové pomocí EDC/HOBt)
Proteolytické štěpení trypsinem, redukce a alkylace
Získávání glykopeptidů (anion exchange chromatography)
Uvolnění N-glykanů pomocí PNGaseF
Separace N-glykanů od peptidů
α-2,6-Neu5Ac
Purifikace N-glykanů (nPGC, C18)
Rozlišení glykosidické vazby u kyseliny sialové (EDC/HOBt) α-2,3-Neu5Ac
MALDI TOF/TOF analýza, interpretace dat, hledání glykanových struktur
Rozlišení vazby kyseliny sialové (MS) Princip rozlišení vazby kyseliny sialové (EDC/HOBt):
α-2,6-sialová kyselina → přírůstek 28 Da (ester)
α-2,3-sialová kyselina → úbytek 18 Da (cyklický lakton) Obr. 8 – Schéma derivatizace kyseliny sialové pomocí EDC/HOBt; (A) Ethyl-esterifikace α-2,6-sialové kyseliny za vzniku esteru (přírůstek 28 Da v spektru), (B) laktonizace α-2,3-sialové kyseliny za vzniku cyklického laktonu (úbytek 18 Da ve spektru)
Obr. 9 - (A) Přírůstek 28 Da ve spektru způsobený ethyl-esterifikací reprezentativního ((Hex)2(HexNAc)2(Deoxyhexose)1 (Neu5Ac)1 + (Man)3(GlcNAc)2) N-glykanu, (B) MALDI TOF/TOF (LIFT) spektrum tohoto glykanu po EDC/HOBt derivatizaci dokazující α-2,6-Neu5Ac
Mikroskopie atomárních sil (AFM)
12,5
PSA 1 PSA 2 PSA 3 PSA-Ab 1 PSA-Ab 2 PSA-Ab 3
Z axis [nm]
10 7,5 5
• Analýza povrchů biosenzorů pomocí AFM • Průměrná výška imobilizovaných protilátek (8,8 ± 0,9) nm
2,5
• PSA-Ab komplex (10 ± 1)nm; individuální imobilizované PSA (4,1 ± 0,5) nm
0 -2,5 0
50
100
150 X axis [nm]
200
250
Obr. 10 – Velikost PSA glykoproteinu a komplexu PSA-Ab na základě AFM experimentů
300
Glykoprofilace reálných vzorků od pacientů • Lektinový imunosensor v analýze lidských sér (depletovaných od IgG a HSA) pomocí elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS)
65
∆Rct after lecitn [%]
55 45
• Pacienti s diagnostikovanou rakovinou prostaty (PCa) mají mnohem vyšší podíl α-2,3-sialové kyseliny v porovnání se zdravými jedinci
35 25
• Ověřena specificita biosenzoru s negativními kontrolami (lidský sérový albumin – HSA, lidský kalikrein2 – hK2)
15 5 -5
MAA
SNA
Obr. 11 – Rozdílné elektrochemické odezvy (Rct) na lektiny MAA,SNA u zdravých jedinců a pacientů s rakovinou prostaty
Lektin (MAA,SNA) PSA z lidského séra Carbo-free blokovací činidlo Anti-PSA protilátka SAM vrstva Obr. 12 – Schéma imunosenzoru při glykoprofilaci PSA z lidských sér
Obr. 13 – Ověření specificity imunosensoru (pacienti s PCa, zdraví jedinci, lidský sérový albumin, lidský kalikren2)
Závěr V této práci byly připraveny lektinové imunosensory, které dosahují velmi nízkých detekčních limitů (až 4 aM koncentrace)
Byla zkoumána efektivita 4 blokovacích činidel, přičemž nejlepší schopnost snižovat nespecifické interakce měl carbo-free pufr Lektiny byly schopny rozlišit vazbu kyseliny sialové, která hraje v těle velmi důležitou roli
Pomocí bioanalytických metod (MALDI TOF/TOF) jsme potvrdili vazbu kyseliny sialové Námi navržené biosenzory byly využity pro glykoprofilaci PSA z lidských sér (pacienti s rakovinou prostaty a zdraví jedinci) Bylo zjištěno, že pacienti s rakovinou prostaty mají mnohem větší podíl α-2,3-vázané kyseliny sialové na povrchu PSA než zdraví jedinci Změny glykosidické vazby u kyseliny sialové by mohly sloužit jako nový glykobiomarker rakoviny prostaty Tato studie může zvýšit citlivost a specificitu biomarkerů používaných v diagnostice onkologických onemocnění
Poděkování Tato práce je financována v rámci projektu National Priorities Research Program (Qatar National Research Fund), č. projektu NPRP 6-381-1-078. Speciální poděkování: • Ing. Ján Tkáč, DrSc. • Spolupracovníci z oddělení glykobiotechnologie, Chemický ústav SAV • Spolupracovníci z Centra excelence pro glykomiku, Chemický ústav SAV • Oddělení biotechnologie, FCHPT STU
