Tubulin, mikrotubuláris rendszer és mikrotubulus asszociált fehérjék Talián Csaba Gábor PTE ÁOK, Biofizika Intézet 2011. február 22.
Transzmissziós elektronmikroszkópos felvétel egy Heliozoa axopódiumának keresztmetszetéről spirálisan elrendezett microtubulusokkal. Nagyítás - 65,000x. (Wikipedia)
Mikrotubulusok
A három citoszkeletális filamentum egyike
Harris, 1962.
Üreges, hengeres, merev cső, általában hosszú és egyenes
Kisméretű fehérjealegységekből felépülő polimer
első mikroszkópos felvételek
Köztük vég-vég és oldalirányú, másodlagos kötőerők
Dinamikus rendszer: folyamatos fel- és leépülés, alegységek állandó cseréje
Számos fehérje kapcsolódik hozzá: működés szabályozása
Membránorganellumok pozícionálása, intracelluláris transzport, mitotikus orsó, csilló/ostor, sejtalak meghatározása
Tubulin
Globuláris fehérje, emberben 444-475 aminosav, 50-55kDa
Emberben 5 fő típus
Mikrotubulusokban leginkább α és β Centroszóma és poláris test: γ mikrotubulus nukleáció Centriolum és magorsó: δ és ε
Számos gén
β3 tubulin pl. csak neuronokban Igen nagyfokú hasonlóság, C-terminális változékonyabb Kopolimerizálnak, de specifikus sejten belüli eloszlás is
Prokariótákban evolúciós rokon fehérje: FtsZ sejtosztódásban fontos
Dimerizáció
Heterodimer képződés α és β tubulin csak együtt, komplexben fordul elő polarizált: - és + vég
GTP kötőhely
Alegységek közti
mindig GTP nem kicserélhető
β-alegységen
hidrolizálható lehet GTP vagy GDP kicserélhető
α β +
Szerkezeti felépülés
Protofilamentumok
Szomszédos protofilamentumok
α-α és β-β egységek közti kapcsolatok
Mikrotubulus
α(-) – β(+) típusú kapcsolódás hasonló a dimeren belülihez, erős kötés
13 párhuzamos protofilamentum 20-30nm külső átmérő 14nm belső átmérő hossza 200 nm-25 µm
Minden dimer és protofilamentum azonos irányban áll → szerkezeti polaritás
A képződés lépései
Protofilamentumok felépülése dimerekből hosszirányban
Lapok kialakulása protofilamentumokból oldalirányban
Lapok begörbülése, csővé záródás
Szabad végekhez további dimerek kapcsolódása
Az egyes protofilamentum végek többé-kevésbé eltérő hosszúak lehetnek
Filamentum növekedés
A két vég növekedési sebessége elvileg egyforma (szabadenergia változás és kritikus koncentráció megegyezik) koff/kon ugyanakkora, de k+on és k+off külön lehet eltérő (k-on és k-off is) a szerkezeti polaritás miatt
gyorsabban változó vég a +, a lassabban változó a –
Valóságban GTP-hidrolízis
a filamentumban sokkal gyorsabb!
A hidrolízis során felszabaduló energia a fehérje-GDP komplexben marad, és csak leváláskor adódik le ez nagyobb szabadenergia-változást jelent, mint a GTP forma leválása
Ezért:
GTP GTP GDP GDP / kon > K DGTP = koff K DGDP = koff / kon
Egyensúlyban:
dF / dt = k + ⋅ N ⋅ c + k − ⋅ N = 0
illetve ezért
CcGDP >
CcGTP
Cc = k − / k +
Treadmilling
Szabad alegységek többnyire GTP-kötött állapotban az alegység beépülésének és a GTP hidrolízis sebességének a mértékétől függ, hogy a végen milyen nukleotid van: a + végen az előbbi gyorsabb: a – végen gyorsabb a hidrolízis:
GTP-sapka alakul ki GDP-tartalmú alegységek
A + vég kritikus koncentrációja kisebb, mint a – végé köztes koncentrációkon a + vég növekszik, a – vég lebomlik
TREADMILLING
A folyamatot a GTP hidrolízis energiája hajtja
„steady-state treadmilling”
Ha az egyik végen a polimerizáció és a hidrolízis sebessége hasonló, akkor növekedés közben is elveszhet a GTP-sapka
Random és hirtelen folyamat, valószínűsége függ a dimerkoncentrációtól
Az ilyen végek gyorsan elkezdenek lebomlani
Később újra kialakulhat a GTP-sapka, és megint beindul a növekedés
lebomló és felépülő állapotok váltakozása: katasztrófa és megmentés
Dinamikus instabilitás
Mikrotubulus egyik vége általában rögzített: dinamikus instabilitás jellemző
Dinamikus instabilitás Relaxáció egy görbültebb GDP filamentum-konformációba
Mi a dinamikus viselkedés haszna?
Mikrotubulusok percenként többször is változtatják a hosszukat, ez fénymikroszkóppal is követhető
Nagy mennyiségű energiát igényel
Az alegységek gyorsan diffundálnak, könnyen eljutnak a nukleációs helyekre → ez a sebességmeghatározó lépés
A sejt folyamatosan monitorozza a sejtvázat 2. Elég a nukleációs helyeket szabályozni 3. Csak a hasznos struktúrákat stabilizálja 4. Nagyfokú tér- és időbeli flexibilitás 5. Külső hatásokra gyorsan képes változni 1.
Toxinok
Taxol a mikrotubulusokhoz kötve azokat stabilizálja, „befagy” a sejtváz
Colchicin a monomerekhez kötve gátolja a polimerizációt
Vinblasztin szintén polimerizációgátló
Antimitotikus, daganatellenes szerek
Mikrotubuluskötő fehérjék 1. Motorfehérjék
Dineinek: - vég motorok, legnagyobb és leggyorsabb (14μm/s)
Citoplazmatikus: homodimer, vezikulatranszport, Golgi-apparátus rögzítése Axonémális: heterodimer vagy -trimer, csilló és ostor
Kinezinek: + vég motorok, miozinhoz hasonló szerkezet, 2-2 nehéz és könnyű lánc, két globuláris fej, megnyúlt coiled-coil farok
Mikrotubuluskötő fehérjék 2. Mikrotubulus asszociált proteinek (MAP) Szerkezeti funkciók:
Stabilizálás Destabilizálás Keresztkötés
I. Típus
kb. 100nm, pálcikaszerű, MT-kötő domén az N-terminálison Számos (Lys-Lys-Glu-X) ismétlődés; A:11, B:21
C-terminális projekciós domén: kiáll a felszínről: távtartás, kötegképzés polimerizációt serkentik (Cc-t csökkentik), stabilizálnak
II. Típus
MT-kötő domén a C-terminális felől (+ töltésű), több is lehet N-terminális projekciós domén változatos hosszúságú Számos kináz fehérje dokkoló helye Sok foszforilálható hely (~40) - MAP-kinázok foszforiláció csökkenti az affinitást a mikrotubulusokhoz Sok PEST (Pro-Glu-Ser-Thr) szekvencia: proteolitikusan érzékeny Tau: hiperfoszforilált formája kóros neurodegeneratív folyamatokban (pl. Alzheimer-kór) lerakódik – páros helikális filamentumok
Filamentumvég dinamika
Stathmin két dimert szekvesztrál, csökkenti a szabad alegységkoncentrációt, fokozza a depolimerizációt és a dinamikus instabilitást Katanin mikrotubulusokat elhasítja gyors depolimerizálódás szabályozása a sejtosztódás során
Mikrotubulus dokkolás
Mikrotubulus organizáló központ (MITOK)
Mikrotubulus nukleáció
γ-tubulint tartalmaz, számos MAP fehérjével egy gyűrűkomplexet képez, ehhez kapcsolódik az α-tubulin – vége
Centroszóma
Csillagszerű, membránmentes organellum A mikrotubulusok szervezésének helye a sejtben Centroszóma mátrixból és gyűrűkomplexekből áll Gombákban és növényekben a magmembránhoz kapcsolódik
Állati sejtekben egy pár centriólumot is tartalmaz
Egymásra merőlegesen állnak 9 rövid mikrotubulus-triplet Egymáshoz kapcsolódó A, B és C gyűrűk A két utóbbit csak 10 protofilamentum alkotja
Csilló/ostor Keskeny, mozgékony sejtnyúlványok Központi része az axonéma, amelyet membrán borít
