Amplifikasi Internal Transcribed Spacer dan β-tubulin pada Tanaman Jacobaea sp. (Asteraceae) Setelah Perlakuan Fungisida Sistemik
Skripsi
Disusun Oleh : Fuad Dwi Atmaja 10/301078/BI/8439
FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2014
Amplifikasi Internal Transcribed Spacer dan β-tubulin pada Tanaman Jacobaea sp. (Asteraceae) Setelah Perlakuan Fungisida Sistemik
Skripsi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan guna mencapai derajad Sarjana Sains Program Studi Biologi
Oleh : Fuad Dwi Atmaja 10/301078/BI/8439
Dosen Pembimbing Dr. Tri Rini Nuringtyas, S. Si., M. Sc.
FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2014 i
ii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas rahmat dan karunia yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan naskah Skripsi dengan judul “Amplifikasi Intenal Transcribed Spacer dan β-tubulin pada Tanaman Jacobaea sp. (Asteraceae) setelah Perlakuan Fungisida Sistemik.”. Naskah Skripsi ini disusun sebagai syarat untuk memenuhi persyaratan guna mencapai sarjana sains program studi biologi. Dengan terselesaikannya naskah Skripsi ini, penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada: 1. Dr. Suwarno Hadisusanto, S.U., selaku Dekan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada 2. Budi Setiadi Daryono, M.Agr. Sc., Ph.D., selaku Wakil Dekan Bidang Akademik Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada. 3. Dr. Tri Rini Nuringtyas, S.Si., M.Sc., selaku Dosen Pembimbing Skripsi dan Dosen Penguji I 4. Dr. Rarastoeti Pratiwi, M. Sc., selaku Dosen Penguji Skripsi II 5. Dr. Maryani, M. Sc., selaku Dosen Penguji Skripsi III 6. Dra Siti Susanti, SU selaku Dosen Pengelola Mata Kuliah Skripsi Fakultas Biologi UGM 7. Orangtua dan seluruh keluarga besar saya yang selalu memberikan dukungan moral, spiritual, dan materi. 8. Anggadia Shinta Wardani yang selalu memberikan semangat dan bantuan untuk penulis, serta 9. Pihak-pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu-persatu. Penulis menyadari bahwa penyusunan naskah Skripsi ini masih banyak kekurangan dan kesalahan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari pembaca dalam memperbaiki kualitas ke depan menjadi lebih baik. Yogyakarta, 2 Juli 2014
iii
Amplifikasi Internal Transcribed Spacer dan β-tubulin pada Tanaman Jacobaea sp. (Asteraceae) Setelah Perlakuan Fungisida Sistemik Fuad Dwi Atmaja Intisari Ragwort (Jacobaea sp.) adalah tumbuhan yang tersebar di berbagai wilayah sub tropis dan mampu mensintesis metabolit sekunder terutama alkaloid pirolisidin yang diketahui beracun dan berperan untuk pertahanan diri terhadap herbivora. Penelitian terkini menunjukan bahwa sintesis alkaloid pada tanaman sering melibatkan bantuan jamur endofit. Pada penelitian terdahulu diketahui terjadi penurunan kandungan alkaloid pirolisidin pada tanaman yang diberi perlakuan fungisida folikur. Belum diketahui apakah penurunan tersebut disebabkan oleh pengaruh fungisida atau hilangnya jamur endofit dari tanaman Jacobaea sp.. Ragwort memiliki kadar polisakarida dan fenolat tinggi sehingga isolasi DNA genom pada tanaman ini memerlukan optimasi khusus, untuk itu perlu perlu dilakukan tiga metode isolasi DNA yang berbeda. Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan prosedur isolasi DNA yang dapat digunakan untuk memperoleh DNA genom tanaman Jacobaea sp dengan kualitas cukup baik dan mengamplifikasi gen ITS (Internal Transcribed Spacer) dan β-tubulin jamur endofit dari DNA genom Jacobaea sp. Penelitian diawali dengan isolasi DNA sampel dari akar dan daun tanaman Jacobaea sp yang diperlakukan folikur dan kontrol yang diperoleh dari penelitan sebelumnya. Isolasi DNA dilakukan dengan tiga metode yang berbeda yaitu menggunakan genAid kit, metode Cheung, dan metode CTAB dengan modifikasi. Selanjutnya hasil isolasi DNA yang memenuhi standar digunakan sebagai template untuk PCR. Primer yang digunakan yaitu ITS1, ITS4 dan ITS5 untuk gen ITS dan T1 dan T22 untuk gen β-tubulin. Hasil amplifikasi PCR dipisahkan menggunakan elektroforesis gel agarose (1.5%). Sebagai kontrol positif jamur endofit digunakan Fusarium solanii. Hasil menunjukan metode yang paling baik untuk mengisolasi DNA sampel Jacobaea sp. adalah metode CTAB dengan modifikasi. Hasil amplifikasi primer ITS 1 dan ITS 4; serta ITS 4 dan ITS 5 menunjukan kontrol positif menghasilkan pita spesifik berukuran 550 bp dan tanaman sampel menghasilkan pita spesifik 750 bp. Hasil amplifikasi primer T1 dan T22 menunjukan kontrol positif menghasilkan pita spesifik berukuran 1500 bp, sedangkan tanaman sampel Jacobaea sp. tidak menghasilkan pita DNA. Dari hasil tersebut diketahui bahwa tanaman Jacobaea sp. baik yang diperlakukan dengan fungisida folikur dan kontrol tidak mengandung jamur endofit. Kata kunci : Jacobaea sp., Alkaloid Pirolisidin, Fungisida, Endofit, PCR, Elektroforesis.
iv
Internal Transcribed Spacer and β-tubulin Amplification of Jacobeaea sp. (Asteraceae) Treated by Systemic Fungicide Fuad Dwi Atmaja Abstract
Ragwort (Jacobaea sp.) is plant dispersed in sub-tropical regions and able to synthesize secondary metabolites such as pyrrolizidine alkaloids. Pyrrolizidine alkaloids are known to be toxic and serve as defense against herbivore. Recent study indicates that alkaloid synthesis often involves endophytic fungi. Previous studies showed a decrease of pyrrolizidine alkaloids content were observed in Jacobaea sp. plants treated with folicur fungicide. It had not been known whether the decrease was caused by fungicide or the absent of endophytic fungi. Ragwort have a high level of polysaccharides and phenolic. Therefore DNA isolation from this plant need optimization, then three different DNA isolation were conducted. The purpose of this research was to obtain DNA isolation procedure with good quality genomic DNA from Jacobaea sp. plant and amplify endophytic fungi ITS (Internal Transcribed Spacer) and β-tubulin gene from Jacobaea sp. plant. DNA isolation from fungicide folicur treated Jacobaea sp. roots and leaves obtained from previous research. To isolate DNA, three different methods were used, genAid kit, Cheung method, and CTAB method with modifications. Furthermore, DNA isolated from the best DNA isolation method was used as a template for PCR. DNA was amplified in PCR using the 5 types of primer that were ITS1, ITS4 and ITS5 for ITS gene and T1 and T22 for β-tubulin gene. Amplification product was ran in electrophoresis apparatus using agarose gel (1.5%). Fusarium solanii was used as endophytic fungi positive control. The results showed that the best method to isolate DNA of Jacobaea sp. was CTAB method with modifications. The results of the primer amplification ITS 1 and ITS 4; and ITS 4 and ITS 5 positive control produced specific band of 550 bp in size and the plant sample produce specific band of 750 bp in size. The results of the primer amplification T1 and T22, positive control produce a specific band of 1500 bp in size, while Jacobaea sp. plant sample did not produce any band. From these results it is known that Jacobaea sp. plant both treated with folicur and control do not have endophytic fungi. Keyword : Jacobaea sp., Pyrrolizidine Alkaloid, Fungicide, Endophyte, PCR, Electrophoresis.
v
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL............................................................................................... HALAMAN PENGESAHAN................................................................................. PRAKATA .............................................................................................................. INTISARI................................................................................................................ ABSTRAK .............................................................................................................. DAFTAR ISI ........................................................................................................... DAFTAR TABEL ................................................................................................... DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ............................................................................................ B. Permasalahan ............................................................................................... C. Tujuan.......................................................................................................... D. Manfaat ....................................................................................................... BAB II. TINJAUAN PUSTAKA A. Tanaman Ragwort (Jacobaea sp.)............................................................... B. Metabolit Sekunder ..................................................................................... C. Alkaloid Pirolisidin ..................................................................................... D. Endofit ......................................................................................................... E. Isolasi DNA ................................................................................................. F. Amplifikasi DNA......................................................................................... G. Hipotesis...................................................................................................... BAB III. METODE A.Tempat danWaktu Pelaksanaan ................................................................... B. Bahan ........................................................................................................... C. Alat .............................................................................................................. D. Cara Kerja ................................................................................................... BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... BAB V. KESIMPULAN ......................................................................................... DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................
vi
i ii iii iv v vi vii viii 1 4 4 4 5 7 8 10 11 12 15 16 16 17 17 23 34 35
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Sekuen Primer ITS. ................................................................................... Tabel 2. Komposisi Premix PCR ............................................................................ Tabel 3. Program PCR ............................................................................................ Tabel 4. Hasil Uji Kuantitatif DNA 11 Sampel Jacobaea sp. ................................ Tabel 5. Primer dan optimasi suhu annealing.........................................................
vii
14 21 22 24 28
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Tanaman dan bunga Ragwort (Jacobaea sp.). ...................................... Gambar 2. Struktur Senesionin N-Oksida ............................................................... Gambar 3. Hasil Elektroforesis primer ITS1-ITS4 ................................................. Gambar 4. Hasil Elektroforesis primer ITS5-ITS4 ................................................. Gambar 5. Hasil Elektroforesis primer T1-T22 ......................................................
viii
6 9 29 31 32
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Tanaman yang menerima cekaman dari dalam maupun dari lingkungan hidupnya akan mensintesis metabolit sekunder untuk mempertahankan diri. Berbeda dengan senyawa metabolit primer yang memberi pengaruh biologis terhadap pertumbuhan dan perkembangan tanaman itu sendiri, metabolit sekunder berfungsi untuk pertahanan diri menghadapi tekanan biotik dan abiotik. Menurut Wink (2010) metabolit sekunder bukan produk buangan yang tidak berguna, tetapi merupakan senyawa penting yang berperan untuk melawan herbivora dan mikrobia. Senyawa metabolit sekunder jumlahnya sangat banyak, menurut Springbob & Kutchan (2009) sampai saat ini ada lebih dari 20.000 struktur metabolit sekunder telah dilaporkan. Secara umum metabolit sekunder dibagi menjadi tiga kelompok utama yaitu alkaloid, flavonoid, dan tanin. Alkaloid merupakan salah satu metabolit sekunder yang paling banyak ragamnya dan diketahui dapat berperan sebagai antibakteri, antijamur dan sebagai insektisida. Ragwort (Jacobaea sp.) mampu mensintesis berbagai metabolit sekunder terutama alkaloid golongan pirolisidin. Golongan alkaloid ini telah dilaporkan berperan dalam pertahanan tanaman, khususnya untuk menghadapi herbivora (Hartmann & Dierich, 1998). Alkaloid Pirolisidin (AP) pada tanaman ragwort telah banyak dipelajari dan diketahui mempunyai komposisi dan konsentrasi AP yang sangat bervariasi, baik antar individu, dan antar organ dalam satu individu.
1
Menurut Hartmann & Dierich (1998), biosintesis AP secara umum dilakukan di akar dan dikatalis oleh enzim homospermidin sintase (HSS) untuk menghasilkan senesionin N-oksida. Senesionin N-oksida ini merupakan produk awal yang berperan sebagai kerangka AP jenis lainnya. Senesionin N-oksida kemudian dibawa ke daun melalui floem dan didiversifikasi menjadi 4 golongan AP yaitu senesionin, jakobin, erusifolin dan otosenin (Pelser et al., 2005). Setidaknya sebanyak 37 macam AP telah dilaporkan sampai saat ini (Cheng et al., 2011; Pelser et al., 2005). Kandungan AP yang dimiliki tumbuhan sangat bervariasi tergantung jenis tanaman, faktor biotik, dan faktor abiotik. Faktor abiotik dapat berupa intensitas cahaya, radiasi UV, cekaman air, kelembaban dan nutrien, sedangkan faktor biotik dapat berupa herbivora, patogen dan endofit (Hol et al., 2003). Endofit merupakan bagian dari faktor biotik dalam pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan, endofit dapat berupa jamur atau bakteri yang bersimbiosis dengan tumbuhan hospesnya. Jamur endofit paling melimpah jika dibandingkan endofit bakteri. Endofit berbeda dengan mikoriza, karena mikoriza berkembang diluar akar dan membentuk rhizosphere. Endofit hidup di dalam jaringan tanaman dan dapat tumbuh di dalam akar, batang atau daun (Sherwood & Caroll, 1974; Caroll, 1988;Stone et al., 2004). Endofit memiliki peran yang luas dalam perkembangan tanaman dan dapat meningkatkan toleransi terhadap stress, meningkatkan biomasa dan meningkatkan pertahanan tumbuhan dari serangga (Rodriguez et al., 2008). Keterlibatan jamur endofit dalam biosintesis alkaloid pada berbagai tanaman telah banyak ditemukan, salah satunya adalah jamur endofit Fusarium solani yang memproduksi alkaloid kuinolin yaitu kamfotekin pada tumbuhan Camptotheca 2
acuminata (Kusari et al., 2011). Secara umum simbiosis antara tanaman hospes dan endofit adalah mutualistik jika endofit dan tanaman hospes sama sama diuntungkan. Keterlibatan jamur endofit dalam biosintesis alkaloid pada berbagai tanaman telah banyak diteliti akan tetapi kemungkinan keterlibatan jamur endofit dalam biosintesis AP pada tanaman Jacobaea sp. masih belum diketahui. Endofit pada tanaman dapat dieliminasi menggunakan fungisida sistemik. Penelitian terdahulu menunjukkan tanaman Jacobaea sp. yang diperlakukan dengan fungisida sistemik folikur diketahui mengalami penurunan kandungan AP (Nuringtyas et al., 2013)., akan tetapi belum diketahui apakah penurunan tersebut dikarenakan hilangnya endofit pada tanaman Jacobaea sp. atau dikarenakan oleh perlakuan fungsida tersebut. Untuk itu pada penelitian ini dilakukan penelitian untuk mengetahui keberadaan jamur endofit pada tanaman Jacobaea sp. dengan pendekatan molekuler. Jacobaea sp. merupakan tanaman yang memiliki kadar polisakarida dan fenolik tinggi, sehingga perlu dicari metode isolasi DNA yang dapat menghilangkan senyawa pengganggu tersebut. Adanya senyawa penggangu ini menyebabkan konsentrasi dan kemurnian DNA yang rendah sehingga tidak dapat digunakan untuk template PCR. Dalam penelitian ini dilakukan 3 metode isolasi DNA yang berbeda yaitu, GeneAid kit, Metode Cheung dan Metode CTAB dengan modifikasi. Dasar pemilihan GeneAid kit karena mudah pengerjaannya dan efisien untuk mengisolasi DNA. Metode Cheung dipilih karena metode ini cukup banyak digunakan untuk tanaman yang memiliki kadar fenolik yang cukup tinggi. Metode CTAB dipilih karena sangat potensial dalam mengisolasi DNA tanaman dengan kadar polisakarida tinggi.
3
B. Permasalahan Permasalahan dalam penelitian ini adalah: 1. Prosedur isolasi DNA apa yang efektif untuk mendapatkan DNA tanaman Jacobaea sp. dengan kualitas baik untuk template PCR? 2. Apakah gen ITS dan β-tubulin jamur endofit dapat diamplifikasi dari DNA genom Jacobaea sp.?
C. Tujuan Tujuan penelitian ini adalah: 1. Mendapatkan prosedur isolasi DNA yang efisien untuk mendapatkan DNA genom tanaman Jacobaea sp. dengan kualitas baik untuk template PCR 2. Mengamplifikasi gen ITS dan β-tubulin jamur endofit dari DNA genom Jacobaea sp.
D. Manfaat Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah mengenai kemungkinan keterlibatan jamur endofit pada biosintesis AP pada tanaman Jacobaea sp.
4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
A. Ragwort (Jacobaea sp.) Ragwort (Jacobaea sp.) yang sebelumnya dikenal sebagai Senecio sp. merupakan tanaman yang memiliki habitus perdu, perenial, dengan tinggi tanaman 175-200 cm pada kondisi optimal.
Tanaman ragwort memiliki akar tunggang
bercabang yang dapat menembus tanah sampai kedalaman 30 cm (Bain, 1991). Batang ragwort tidak berkayu berwarna hijau baik saat muda atau tua, bentuknya bulat tegak dan tipe pertunasan roset. Daun tanaman ini berkarakteristik pinnate dan berbentuk oval, bagian bawah daun sangat halus dan tidak ditemukan derivat epidermis seperti trikoma dan bulu halus. Pertulangan daun ragwort adalah menyirip, dengan warna daun warna daun hijau muda hingga tua, memiliki panjang sekitar 2.3-5.4 cm dan lebar 1.22 cm. Bunga ragwort pada umumnya berwarna kuning cerah dengan mahkota bunga terlihat dari bagian pedikel, dengan pedikel bagian luar lebih panjang dibanding dengan pedikel bagian bawah sehingga bunga terlihat datar (flat) (Gambar 1.). Biji tanaman Jacobaea sp. berwarna putih dan memiliki palpus agar mudah dalam penyebaran dengan angin. Satu tanaman ragwort mampu menghasilkan 150.000 biji, dan biji dapat dormansi dan tetap hidup dalam selama 4-5 tahun, bahkan sampai 20 tahun jika terkubur. Biasanya biji berkecambah pada musin semi atau musim gugur (Bain, 1991).
5
Klasifikasi tanaman ragwort digolongkan sebagai berikut : Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Kelas
: Dicotyledonae
Ordo
: Asterales
Famili
: Asteraceae
Genus
: Jacobaea
Species
: Jacobaea sp. (Pelser et al., 2006).
(a)
(b)
Gambar 1. Bunga Ragwort (Jacobaea sp.)(a) dan (b) Tanaman Ragwort (Jacobaea sp.) (Bond et al., 2007).
Menurut Bond et al. (2007) habitat dari tanaman ini tersebar di padang rumput, hutan, gumuk pasir, bahkan pinggir jalan. Gumuk pasir merupakan habitat alaminya tetapi sekarang lebih tersebar pada padang rumput, pinggir jalan dan pinggir rel kereta api (Harper, 1958). Tanaman ini sudah dinyatakan sebagai tanaman invasif disebagian 6
wilayah atau habitat dan dapat menghilangkan tanaman lokal jika tidak dikendalikan dengan baik. Tanaman ini dikenal beracun, menyebabkan kerusakan lingkungan, dan menyebabkan kematian hewan ternak yang memakan tanaman ini. Sifat beracun tanaman ini karena mengandung AP (Bond et al., 2007). Tanaman pada daerah tropis juga ada yang memiliki karakteristik seperti Jacobaea sp. yaitu spesies Chromolaena odorata dalam bahasa Indonesia disebut kirinyuh, tanaman ini merupakan herba yang biasa menjadi gulma pada perkebunan. Tanaman ini mampu mensintesis AP dan dapat meracuni hewan ternak yang memakan tanaman ini (Alamprabu, 2013)
B. Metabolit sekunder Menurut Mursyidi (1990), metabolit sekunder merupakan suatu zat kimia bukan nutrien yang berperan dalam pertahanan diri. Metabolit sekunder memiliki ciri spesifik yakni struktur kimianya beragam, biosintesisnya dipengaruhi oleh jumlah dan aktivitas enzim serta spesialisasi sel dalam proses diferensiasi dan perkembangan organisme. Distribusi golongan senyawa metabolit sekunder di alam sangat banyak diantaranya adalah alkaloid, flavonoid dan tanin. Alkaloid merupakan golongan senyawa aromatik yang mengandung nitrogen dan paling banyak ditemukan di alam. Hampir seluruh senyawa alkaloid berasal dari tumbuh-tumbuhan dan tersebar luas dalam berbagai jenis tumbuhan (Lenny, 2006). Secara kimia, alkaloid biasanya mengandung satu atau lebih atom nitrogen pada cincin heterosiklik yang bentuknya bermacam-macam. Atom nitrogen alkaloid umumnya berada dalam bentuk gugus amin (-NR2-) dan gugus amida (-CO-NR2-). Nitrogen
7
berperan sebagai basa (menerima ion hidrogen), sehingga banyak alkaloid yang bersifat basa sesuai dengan namanya (alkali = basa) (Harbone, 1987). Sebagian besar alkaloid berupa zat padat, kristal putih, tidak berwarna, amorf, berasa pahit, bersifat optis aktif, memiliki efek farmakologis dan umumnya sukar larut dalam air tetapi larut dalam pelarut non-polar seperti kloroform dan eter. Alkaloid merupakan derivat dari asam amino arginin, lisin, ornitin, fenilalanin, tirosin dan triptofan (Harborne, 1987). Hampir semua alkaloid yang ditemui di alam mempunyai aktivitas biologis tertentu, ada yang bersifat racun tetapi ada pula yang berkhasiat untuk pengobatan, misalnya kuinin, morfin dan stiknin. Alkaloid biasanya disintesis pada bagian tajuk tanaman, tetapi ada pula yang disintetis pada bagian akar (Salisbury & Ross, 1995). Alkaloid dapat ditemukan dalam berbagai bagian tumbuhan, seperti biji, daun, ranting dan kulit batang. Alkaloid umumnya ditemukan dalam kadar yang sangat kecil dan harus pisahkan dari senyawa yang berasal dari jaringan tumbuhan (Lenny, 2006).
C. Alkaloid Pirolisidin Alkaloid pirolisidin (AP) merupakan golongan alkaloid yang diproduksi oleh tumbuhan untuk melindungi diri dari herbivora (Hartmann & Ober, 2000). Konsentrasi AP bervariasi pada setiap organ baik pada daun, batang atau akar. Alkaloid Pirolisidin merupakan alkaloid ester yang terdiri dari basa nesin. Karakter bisiklis adalah struktur yang paling umum untuk semua AP (Gambar 2.). Sebagian besar tanaman, AP cenderung terdapat secara alami dalam bentuk N-oksida. Lebih dari 660 AP dan derivatnya telah dideteksi pada 6000 tanaman dari 3 famili tanaman yang berbeda yaitu 8
Boraginaceae, Asteraceae, dan Fabaceae (Roeder, 2000; Stegelmeier et al ., 1999). Sintesis AP pada tanaman Jacobaea sp. diawali dengan penyusunan basa nesin dan asam nesik dalam akar, kemudian dibentuk Senesionin N-oksida sebagai bentuk awal AP. Selanjutnya AP didiversifikasi menjadi 4 golongan utama yaitu, senesionin, jakobin, erusifolin dan otosenin di daun. Transport AP dari akar ke daun melalui floem. Alkaloid Pirolisidin terdapat pada semua jaringan tanaman tetapi pada Jacobaea vulgaris hampir 80% terdapat pada bagian daun dan AP disimpan dalam vakuola sel tanaman (Hartmann & Ober, 2000).
Asamnecic asam nesik
Basanecic Basa nesin
Gambar 2. Struktur Senesionin N-oksida (Hartmann & Ober, 2000).
Alkaloid Pirolisidin sangat beracun untuk berbagai spesies hewan termasuk hewan ternak. Telah banyak kasus kematian hewan ternak yang disebabkan oleh konsumsi tanaman yang mengandung AP (Araya & Fuentealba, 1990). Studi mengenai toksisitas AP terhadap hewan uji coba sudah banyak dilakukan dan diketahui bahwa AP menyebabkan tumor hati dan luka pada paru-paru (Mattock, 1986).
9
D. Endofit Endofit dapat ditemukan hampir di semua tumbuhan di muka bumi, dan tumbuh di dalam jaringan tumbuhan. Endofit dapat diisolasi dari akar, batang dan daun suatu tumbuhan. Bakteri dan fungi adalah jenis mikroba yang umum ditemukan sebagai mikroba endofit, akan tetapi yang banyak diisolasi adalah golongan fungi. Hubungan antara mikroba endofit dan hospesnya dapat berbentuk simbiosis mutualisme sampai hubungan yang antagonik (Strobel, 2003). Hubungan simbiosis mutualisme ditandai dengan hubungan yang saling menguntungkan antara mikroba endofit dan tumbuhan hospes. Mikroba endofit dapat melindungi tumbuhan hospes dari serangan patogen dengan senyawa yang dikeluarkan oleh mikroba endofit. Senyawa yang dikeluarkan mikroba endofit berupa senyawa metabolit sekunder yang merupakan senyawa bioaktif dan dapat berfungsi untuk mempertahankan kelangsungan hidup tumbuhan hospes. Tumbuhan hospes menyediakan nutrien yang dibutuhkan oleh mikroba endofit untuk melengkapi siklus hidupnya (Strobel, 2003). Metabolit sekunder yang dihasilkan akan lebih aktif dan spesifik jika diisolasi dari endofit yang hidup pada biotop yang spesifik. Endofit terutama yang hidup di lingkungan yang spesifik atau bahkan di lingkungan yang tidak umum sering digunakan sebagai sumber penemuan senyawa bioaktif baru. Beberapa tumbuhan dapat menurunkan senyawa bioaktif yang dimiliki kepada mikroba endofit yang tumbuh dalam jaringan tumbuhan tersebut, sehingga endofit tersebut dapat menghasilkan senyawa yang sama dengan tanaman hospes. Sebagai contoh adalah senyawa taksol, sebagai senyawa antikanker yang dihasilkan oleh tumbuhan Taxus brevifolia. Pada tahun 1993, senyawa ini ternyata dapat diisolasi dari Taxomyces andreanae, fungi 10
endofit yang tumbuh pada tumbuhan T. brevifolia (Strobel, 2003). Contoh lain adalah senyawa Oleandrin sebagai senyawa antikanker, selain dihasilkan oleh tanaman Nerium indicum, ternyata juga dihasilkan oleh fungi endofit yang diisolasi dari daun Nerium indicum. Menurut Tan & Zou (2000), endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif dengan karakter mirip atau sama dengan hospesnya. Hal ini disebabkan adanya pertukaran genetik yang terjadi antara hospes dan mikroba endofit secara evolusioner.
E. Isolasi DNA Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein, RNA dan kontaminan lainnya dari suatu sel (Alatar et al., 2012). Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yaitu penghancuran sel (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari makromolekul lainnya, dan pemurnian DNA (Corkill & Rapley, 2008). Beberapa hal perlu diperhatikan dalam isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan dan metodenya harus efektif. Prinsip isolasi DNA pada berbagai sel atau jaringan pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam teknik dan bahan yang digunakan. Beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan, diantaranya GenAid kit dan Nucleon Phytopure. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual masing-masing memiliki kelebihan dan kekurangan. Kit untuk isolasi DNA memiliki kelebihan waktu pengerjaan lebih cepat dan lebih mudah, sementara kekurangan penggunaan kit yaitu harga kit isolasi DNA masih cukup mahal dan didesain untuk tanaman yang memiliki kadar metabolit sekunder dan polisakarida rendah. Metode manual, contohnya metode CTAB dan Cheung memiliki kelebihan 11
dalam penggunaannya yaitu harga yang lebih murah dan digunakan secara luas sementara kelemahannya membutuhkan waktu yang relatif lebih lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel yang digunakan. Metode isolasi manual dapat dimodifikasi untuk menanggulangi kelemahan yang ada dalam metode tersebut baik dari pengerjaannya atau reagen yang digunakan. Tahap awal dalam isolasi DNA adalah perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme & Hazel, 1998). Tahap ini memiliki beberapa cara yaitu cara fisik, kimiawi dan enzimatik. Cara fisik diataranya menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair, menggunakan freezethawing atau iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara kimiawi dapat dilakukan dengan penggunaan deterjen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel (Surzycki, 2000). Cara enzimatik dapat digunakan enzim proteinase K, pronase E ataupun enzim lainnya (Surzycki, 2000). Dalam ekstraksi DNA, sering digunakan chelating agent seperti EDTA yang berperan menginaktivasi enzim DNAse, dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium sebagai kofaktor enzin DNAse (Corkill & Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi selanjutnya harus dipisahkan dari kontaminan makromolekul lainnya agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.
F. Amplifikasi DNA Amplifikasi DNA merupakan teknik memperbanyak segmen DNA secara eksponensial dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction. PCR mendorong kemajuan yang sangat luar biasa dalam studi biologi molekular. Metode
12
PCR sangat sensitif dan spesifik sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu segmen DNA tertentu (Yuwono, 1992). PCR merupakan suatu teknik yang dikembangkan untuk menghasilkan berjutajuta kopi segmen DNA tertentu sehingga kuantitas DNA akan mencukupi untuk kebutuhan analisis genetik. Diketahui bahwa dengan menggunakan metode PCR, dapat diperoleh pelipatgandaan suatu segmen DNA sebesar 200.000 kali setelah 20 siklus (Yuwono, 1992). Kelebihan lain metode ini adalah penggunaan komponen reaksi dalam jumlah sangat sedikit. Prinsip PCR adalah mengamplifikasi suatu segmen DNA dalam suatu siklus berjangka pendek. Satu siklus terdiri dari tiga tahapan perubahan suhu secara cepat, yaitu denaturasi dengan suhu berkisar 92 - 95 °C, penempelan primer (annealing) dengan suhu berkisar 50 - 60 °C, dan pemanjangan primer (extension) 72 °C (Fukino et al., 2004) Empat komponen utama dalam proses PCR adalah (a) DNA template, yaitu segmen DNA yang akan dilipatgandakan, (b) Oligonukleotida primer, yaitu suatu segmen oligonukleotida pendek, (c) Deoksiribinukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP, (d) Enzim DNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA (Yuwono, 1992). Primer suatu molekul yang dapat menempelkan enzim polimerase untuk memulai sintesis DNA baru secara de novo. PCR memerlukan primer yang berkomplemen dengan DNA yang digunakan karena primer menentukan bagian yang akan diamplifikasi (Berg et al., 2002). Jenis primer yang umum digunakan untuk identifikasi jamur adalah adalah Small subunit RNA (17-18S), Large subunit RA (25-
13
28S), Internal Transcribed Spacer (ITS) region, β-tubulin primers, dan Intergenic Spacer (IGS) (Gargas dan Depriest, 1996). Internal Transcribed Spacer adalah region yang paling banyak digunakan untuk sistematik molekuker pada level spesies dan bahkan dibawah spesies dalam segmen DNA khususnya untuk fungi. Karena banyaknya variasi didalam region rDNA (SSU dan LSU), maka variasi antar rDNA dapat berulang-ulang sehingga dapat terobservasi dalam region ITS dan IGS. Selain itu ITS1-ITS4 merupakan standar yang biasa digunakan oleh setiap laboratorium. Beberapa taxon-specific primers telah dideskripsikan dapat mengamplifikasi segmen DNA fungi secara selektif (Gardes & Bruns, 1993). Sekuen primer ITS dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Sekuen primer ITS yang biasa digunakan untuk amplifikasi DNA fungi Nama Primer ITS1 ITS2 ITS3 ITS4 ITS5 ITS1-F ITS4-B 5.8S 5.8SR SR6R
Sekuen (5'->3') TCCGTAGGTGAACCTGCGG GCTGCGTTCTTCATCGATGC GCATCGATGAAGAACGCAGC TCCTCCGCTTATTGATATGC GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG CGCTGCGTTCTTCATCG TCGATGAAGAACGCAGCG AAGWAAAAGTCGTAACAAGG
Referensi White et al, 1990 White et al, 1990 White et al, 1990 White et al, 1990 White et al, 1990 Gardes & Bruns, 1993 Gardes & Bruns, 1993 Vilgalys lab Vilgalys lab Vilgalys lab
Tubulin adalah komponen utama dari mikrotubul dan berasosiasi dengan protein lain seperti kinesin dan dynein. Protein tubulin sendiri terdiri dari alpha (α), beta (β), gama (γ), delta (δ), epsilon (ε), zeta (ζ) dan eta (η) tubulin. β-tubulin ditemukan sangat banyak pada semua eukariot dan tidak ditemukan pada prokariot. Gen ini sangat ideal digunakan untuk analisis filogenetik, khususnya untuk estimasi filogeni yang sangat
14
rinci (Einax & Voigt, 2003). β-tubulin menarik banyak perhatian dalam penelitian mengenai kerabatan evolusioner pada semua tingkatan (Baldauf et al., 2000)
G. Hipotesis Hipotesis dari penelitian ini adalah: 1. Hasil isolasi DNA tanaman Jacobaea sp. dengan menggunakan metode CTAB dengan modifikasi dapat menghasilkan DNA genom dengan kualitas yang lebih baik dibandingkan GeneAid kit dan metode Cheung
2. Gen ITS dan β-tubulin jamur endofit dapat diamplifikasi dari DNA genom sampel Jacobaea sp.
15
BAB III METODE PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Jl. Teknika Selatan, Sekip Utara, Yogyakarta 55281. Penelitian ini dilakukan pada tanggal 16 Februari 2014 hingga 1 Mei 2014
B. Bahan 1. Bahan Umum Pada penelitian ini bahan yang digunakan adalah daun dan akar tanaman Jacobaea sp. yang diperoleh dari penelitian sebelumnya oleh Nuringtyas dkk (2013). Bahan tersebut dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan fungisida folikur. Kelompok perlakuan fungisida folikur adalah bagian tanaman Jacobaea sp. umur 6 minggu yang telah disemprot menggunakan 0,15% folikur setiap 2 minggu sekali sebanyak 4 kali. Bagian tanaman yang diambil adalah daun (FF) dan akar (FW). Kelompok kontrol (FC) merupakan seluruh bagian tanaman Jacobaea sp. yang telah disemprot dengan akuades dan dipelihara dalam waktu yang sama dengan kelompok perlakuan. Fusarium solanii (Fusa) diperoleh dari Pusat Studi Bioteknologi Laboratorium Mikrobiologi yang digunakan sebagai kontrol positif jamur endofit.
16
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah kloroform:isoamilalkohol (24:1), 2-propanol, buffer Cheung (Tris, EDTA dan NaCl), buffer CTAB (Tris, EDTA, NaCl dan CTAB 2X), PVP, β-mercaptoetanol, natrium asetat 3M, high salt TE, etanol 100 %, etanol 70 %, buffer TE, enzim RNAse, nitrogen cair, agar agarose, running buffer TBE 1X, SYBR Safe DNA gel stain (Goodview), buffer PCR 10X, Taq polimerase, dNTPs, dan ddH2O, loading dye. 2. Primer Primer yang digunakan untuk mendeteksi adanya jamur endofit pada tanaman Jacobaea adalah primer ITS dan β-tubulin. Amplifikasi dari gen ITS menggunakan primer ITS1–ITS4 dan ITS5-ITS4 (White et al., 1990). Amplifikasi gen β-tubulin menggunakan primer T1 dan T22 (Myllys et al., 2001).
C. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoclave, inkubator, oven, freezer, timbangan analitik, timbangan semi analitik, mikropipet, berbagai alat gelas (seperti Erlenmeyer, gelas ukur, pipet ukur, dan petridish), mortar, microwave, horizontal agarose gel elektrophoresis apparatus, power-supply, waterbath, shaker, centrifuge, alat PCR, spektrofotometer, kuvet 100 µl, vortex, termos nitrogen cair, UV transilluminator.
D. Cara Kerja Langkah-langkah pengerjaan yang dilakukan pada penelitian ini tahapannya terdiri dari: 17
1. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan dengan 3 metode isolasi yaitu: a. GenAid kit (PT. Genetikascience) b. Metode Cheung (Cheung et al., 1993) c. Metode CTAB (Doyle & Doyle 1990) dengan modifikasi
a. GenAid KIT (PT. Genetikascience) Isolasi DNA mengikuti protokol yang tersedia. Akar dan daun seberat 20 mg digerus dengan nitrogen cair sampai menjadi serbuk kering dan dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 ml. Pada tube ditambahkan 400 µl buffer GP1 dan 5 µl RNase A (700 unit/ml) dan divortex. Campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suh 60 oC dan tube dibolak-balik setiap 5 menit. Sebanyak 100 µl buffer GP2 dimasukkan ke dalam tabung dan divortex kembali, sampel kemudian dimasukkan ke dalam freezer selama 3 menit. Campuran buffer dan sampel dipindahkan ke dalam filter column yang diletakan pada 2 ml collection tube. Campuran buffer dan sampel disentrifugasi pada 2000 RPM selama 2 menit, sampel kemudian dilepaskan dari filter column. Supernatan dipindah ke dalam 1,5 ml mikrotube baru dan ditambahkan GP3 buffer sebanyak 1,5 kali volume supernatan dan divortex selama 5 detik, selanjutnya dipindahkan ke dalam GD column yang diletakan pada 2 ml collection tube. Campuran buffer dan sampel disentrifugasi pada 13000 RPM selama 4 menit dan supernatan di bawah collection tube dibuang. GD column yang berisi DNA dipindahkan ke collection tube dan ditambah 400 µl buffer W1 dan disentrifugasi pada 13000 RPM selama 1 menit, selanjutnya supernatan dibuang. 18
Ditambahkan 600 µl wash buffer kedalam GD column dan disentrifugasi pada 13000 RPM selama 1 menit, supernatan dibuang, dan diulang 2 kali sampai supernatan bening. Setelah bening GD column disentrifugasi pada 13000 RPM selama 6 menit sampai kering. GD column dipindahkan ke dalam mikrotube 1,5 ml dan ditambah 100 µl TE buffer dan didiamkan selama 3-5 menit, lalu disentrifugasi pada 13000 RPM selama 1 menit. Setelah itu ditambahkan 40 µl buffer TE. b. Metode Cheung (Cheung et al., 1993) Daun dan akar tanaman Jacobaea sp. seberat 60 mg digerus dengan nitrogen cair hingga halus. Selanjutnya ditambah 1000 µl buffer Cheung dan digerus kembali. Selanjutnya dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 ml dan diinkubasi dengan waterbath selama 10 menit pada suhu 60 ºC, setelah diinkubasi kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 13000 RPM, dan diambil supernatan. Supernatan dipindahkan ke mikrotube baru dan ditambah 600 µl 2propanol serta 100 µl natrium asetat 3M, lalu diinkubasi dalam freezer selama 20 menit, selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 13000 RPM. Supernatan dibuang lalu ditambah 500 µl etanol 70 % dan dibolak-balik, kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 RPM selama 3 menit. Pencucian oleh etanol 70 % diulang sebanyak 2 kali. Setelah pencucian etanol dibuang dan pelet dikeringkan selama 20 menit. Setelah itu ditambahkan 40 µl TE.
c. Metode CTAB (Doyle & Doyle, 1990) dengan modifikasi Daun dan akar tanaman Jacobaea sp. seberat 60 mg digerus dengan nitrogen cair hingga halus, sampel kemudian ditambah 1000 µl buffer CTAB yang sudah 19
dihangatkan pada suhu 65 ºC. Campuran sampel dan buffer kemudian diinkubasi pada waterbath selama 15 menit dengan suhu 65 ºC. Setelah diinkubasi ditambahkan 500 µl kloroform:isoamilalkohol (24:1) dan dibolak-balik selama 5 menit dan selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 13000 RPM, pada akhirnya dihasilkan 3 lapisan, lapisan atas adalah DNA, lapisan tengah debris sel, dan lapisan paling bawah adalah kloroform. Supernatan bagian atas diambil dan dipindahkan ke tabung baru dan selanjutnya ditambah 500 µl kloroform:isoamilalkohol (24:1) dan di bolak-balik selama 5 menit dan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 13000 RPM. Supernatan selanjutnya dipindah ke tabung baru dan ditambahkan 1000 µl 100 % etanol serta 110 µl Natrium Asetat 3M. Campuran diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Setelah diinkubasi dilakukan sentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 13000 RPM dengan suhu (4 ºC). Supernatan dibuang secara hati-hati dan ditambahkan 500 µl 70% etanol. Sampel disentrifugasi selama 3-5 menit dengan kecepatan 13000 RPM dengan suhu (4 ºC) selama 3 menit, etanol dibuang dan DNA dikeringkan selama 20 menit. Setelah itu ditambahkan 40 µl buffer TE.
2. Uji Kuantitatif DNA hasil isolasi Uji kuantitatif sampel DNA hasil ekstraksi dilakukan dengan mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA dengan spektrofotometer UV/VIS (Hoefer). Sebelum dilakukan pengukuran, terlebih dahulu DNA diencerkan. Larutan blanko yang digunakan adalah ddH2O (Barbas III et al., 2007). Konsentrasi DNA diperoleh dari nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan kemurnian DNA 20
diperoleh dari nilai rasio absorbansi panjang gelombang
260 nm dengan 280 nm
(Sambrook et al., 1989). dengan demikian konsentrasi DNA dapat ditentukan dengan persamaan berikut: [DNA]= OD 260 x 50 x FC
(Barbas III et al., 2007).
Keterangan: [DNA] : konsentrasi DNA (µl/ml) OD 260 : nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm FC : faktor pengenceran Kemurnian DNA ditentukan dengan persamaan:
DNA =
(Sambrook et al., 1989).
Keterangan: DNA : kemurnian DNA OD260 : besarnya absorbansi pada panjang gelombang 260 nm OD280 : besarnya absorbansi pada panjang gelombang 280 nm.
3. Amplifikasi DNA Amplifikasi DNA dilakukan dengan Thermocycler (Eppendorf). Sebelum sampel dimasukkan ke dalam Thermocycler, dibuat Premix PCR dengan komposisi seperti yang tercantum pada Tabel 2. Tabel 2. Komposisi premix PCR No. Komposisi 1. Buffer 10x 2. DNTPS 3. Forward Primer 4. Reverse Primer 5. Taq-Polimerase 6. ddH2O 7. Sampel DNA Volume Total
Konsentrasi (Mg2+ 2mM) 2,5 mM 10µM 10µM (5U/µl) Murni (70 ng/µl)
Volume Per Sampel 2 µl 0.5 µl 1 µl 1 µl 0.2 µl 14.3 µl 1 µl 20 µl (Fukino et al., 2004 dengan modifikasi).
21
Premix PCR dibuat sesuai dengan jumlah sampel yang akan diamplifikasi. Semua bahan untuk premix PCR dimasukkan dalam satu tube khusus tanpa menambahkan DNA template. Setelah semua ramuan dicampur sampai homogen kemudian dibagi dalam tube yang baru sesuai dengan jumlah sampel yang akan di PCR, dengan volume total dikurangi volume DNA template. DNA template ditambahkan pada masing-masing tube dan dihomogenkan dengan cara diketukketuk. Tube yang berisi komponen PCR selanjutnya dimplifikasi dengan Thermocycler (Eppendorf) yang telah diatur sesuai dengan kondisi pada Tabel 3. Tabel 3. Program PCR gen ITS dan β-tubulin No. Reaksi 1. Predenaturation 2. Denaturation 3.
Annealing
4. 5. 6.
Elongation Postelongation Endless
Suhu Waktu 95°C 3 menit 95°C 30 detik 55°C(ITS) & 1 menit 59°C(β-tubulin) 72°C 1 menit 72°C 15 menit 4°C 5 menit
Siklus diulang sebanyak 40X
Tube PCR yang telah berisi sampel dan premix dimasukkan ke dalam mesin PCR dan dijalankan sampai mesin berhenti setelah sekitar 3 jam. Tube berisi produk PCR disimpan dalam freezer jika akan disimpan dalam waktu lama (-20 °C).
4. Elektroforesis produk PCR Disiapkan agarose 1,5 % yang telah ditambahkan pewarna menggunakan SYBR Safe DNA gel stain. Penelitian ini menggunakan perbandingan DNA dan loading dye 5:1. Kondisi elektroforesis yang digunakan adalah 50 Volt selama 60 menit. Gel hasil elektroforesis diamati dengan UV Transilluminator. Visualisasi pita-pita DNA hasil elektroforesis didokumentasikan menggunakan kamera digital. 22
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini mendeteksi keberadaan endofit jamur pada tanaman Jacobaea sp. kontrol dan yang telah diperlakukan oleh fungisida sistemik untuk mengetahui keberadaan endofit pada tanaman tersebut. Penelitian ini dilakukan dengan tiga tahapan, yaitu isolasi DNA, amplifikasi gen ITS dan β-tubulin dan deteksi DNA endofit. Penelitian ini menggunakan 9 sampel dari kelompok kontrol, bagian daun dan batang Jacobaea sp. dengan perlakuan fungisida folikur, masing-masing tiga ulangan. DNA genom tanaman Jacobaea sp. akan diteliti untuk mendeteksi adanya jamur endofit. Hasil penelitian dijabarkan pada uraian berikut.
A. Hasil Isolasi dan Uji Kuantitatif DNA Dalam penelitian ini diketahui bahwa metode yang paling untuk isolasi DNA genom sampel Jacobaea sp. adalah metode CTAB dengan modifikasi yang menghasilkan konsentrasi DNA tinggi dan memiliki kemurnian DNA yang tinggi. Sedangkan metode Cheung dan menggunakan kit menunjukan hasil isolasi DNA yang buruk yaitu memiliki konsentrasi DNA sedikit dan rasio kemurnian DNA yang rendah. Hasil uji kuantitatif DNA tanaman Jacobaea sp. disajikan dalam Tabel 3.
23
Tabel 3. Hasil uji kuantitatif DNA 11 sampel menggunakan tiga metode isolasi DNA No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7 8 9 10 11
GenAid KIT Ratio Sampel Konsentrasi Kemurnian (µg/mL) DNA FUSA1 TD TD FUSA2 TD TD FC1 0,227 2,5 FC2 10,172 0 FC3 -1,771 0 FF1 -1,619 0 FF1 TD TD FF2 TD TD FW1 TD TD FW2 TD TD FW3 TD TD Keterangan : TD : Tidak dilakukan
Cheung Ratio Konsentrasi Kemurnian (µg/mL) DNA TD TD TD TD TD TD TD TD TD TD TD TD 6,809 0 0,584 45,1 -3,392 0 -0,845 0 TD TD
CTAB Ratio Konsentrasi Kemurnian (µg/mL) DNA 1,852 207 1,872 229,3 2,037 805,6 1,625 650 1,857 650 2,00 1100 2,03 757,3 1,835 253,1 1,869 1164,8 1,787 1370,8 1,985 1289
1. GenAid kit (PT. Genetikascience) Isolasi DNA menggunakan kit menunjukan hasil yang tidak memuaskan, ditandai dengan rendahnya konsentrasi dan kemurnian DNA yang rendah (Tabel 3). Prinsip kerja isolasi DNA dengan genAid kit adalah lisis membran sel menggunakan SDS dan pengendapan DNA menggunakan etanol dan DNA akan diikat pada matrik silika. Kemungkinan penyebab hasil yang kurang memuaskan karena di dalam kit tersebut tidak terdapat reagen yang berfungsi untuk menghilangkan senyawa-senyawa pengganggu dalam isolasi DNA seperti polisakarida, DNAse, protein dan senyawa fenolat. Untuk itu digunakan metode isolasi DNA yang lainnnya termasuk metode Cheung dan CTAB dengan modifikasi.
2. Metode Cheung (Cheung et al., 1993) Hasil DNA dengan metode ini belum memuaskan ditandai dengan kecilnya konsentrasi dan kemurnian DNA yang didapat (Tabel 3). Metode Cheung dipilih
24
karena metode ini relatif aman dan sederhana. Metode ini aman karena tidak menggunakan banyak pelarut organik dan memiliki tahapan yang cukup singkat. Metode Cheung menggunakan cara lisis dinding sel secara mekanik menggunakan nitrogen cair. Tahapan kerja metode Cheung hampir sama seperti metode Doyle & Doyle atau yang dikenal sebagai CTAB, tetapi berbeda pada reagen yang digunakan. Pada metode Cheung, buffer yang digunakan hanya terdiri dari Tris, EDTA dan NaCl sebagai pengekstraksi DNA dan menggunakan 2-propanol untuk mengendapkan DNA.. Kegagalan isolasi DNA dengan metode ini dimungkinkan karena tanaman Jacobaea sp. relatif memiliki
kandungan polisakarida dan fenolik yang tinggi,
sedangkan metode ini tidak mempunyai reagen yang dapat menghilangkan atau mengurangi senyawa pengganggu dalam dalam isolasi DNA seperti polisakarida, DNAse, protein dan senyawa fenolat. Untuk itu pada penelitian ini dilakukan isolasi menurut CTAB dengan modifikasi.
3. Metode CTAB (Doyle & Doyle 1990) dengan modifikasi Prinsip kerja isolasi DNA dengan metode CTAB dengan modifikasi adalah lisis membran sel menggunakan CTAB, lisis dinding sel menggunakan nitrogen cair dan pengendapan DNA menggunakan etanol. Modifikasi teknik isolasi DNA perlu dilakukan pada setiap jenis tanaman, karena pada tiap tanaman mempunyai senyawa pengganggu yang berbeda sehingga jika tidak dilakukan modifikasi maka akan mengurangi kemurnian DNA yang dihasilkan. Teknik Doyle dan Doyle menggunakan buffer yang terdiri dari CTAB, tris, EDTA, PVPP dan β-mercaptoetanol. CTAB 25
(cetyltrimethylammonium bromide) merupakan sejenis surfaktan yang dapat melisiskan membran sel dan dapat mengikat polisakarida dalam sel, sedangkan tris dalam buffer berfungsi sebagai pengatur PH agar kondisi didalam dan diluar sel sama sehingga kondisi sel relative stabil, selanjutnya fungsi EDTA (Etilandiamintetraasetat) berfungsi untuk mengikat ion Mg2+ dalam sel dan menginaktifkan enzim DNAse sehingga DNA tidak rusak selama proses isolasi DNA, fungsi PVP dan βmercaptoethanol adalah mengikat polyphenol serta mendenaturasi protein agar kemurnian DNA hasil isolasi lebih tinggi. Tahapan isolasi DNA menggunakan metode CTAB sendiri pertama sampel dihaluskan menggunakan nitogen cair sampai menjadi bubuk halus, digunakan nitrogen cair agar suhu sampel selalu dingin sehingga enzim DNAse tidak aktif, selanjutnya bubuk sampel campur dengan buffer CTAB untuk memulai extraksi DNA dari dalam sel. Selanjutnya suspensi sampel dengan buffer CTAB diinkubasi selama 15 menit pada suhu 65°C. Tahap ini berfungsi untuk mempercepat ekstraksi DNA serta menginaktifkan
enzim
DNAse.
Setelah
proses
inkubasi
ditambahkan
kloroform:isoamilalkohol yang berfungsi untuk mengikat protein sehingga akan didapatkan DNA yang murni. kemudian disentrifuge dan diambil bagian supernatan. Presipitasi DNA menggunakan etanol absolut yang akan mendehidrasi DNA sehingga bisa diendapkan dengan cara sentrifugasi. Isolasi DNA menggunakan CTAB dengan modifikasi diperoleh pellet DNA berwarna putih. Konsentrasi
dan
kemurnian
DNA
diuji
dengan metode
spectrofotometry. Hasil dari uji kuantitatif diperoleh hasil seperti pada Tabel 4. Dari Tabel 4 dapat dilihat bahwa tingkat kemurnian DNA dari semua sampel cukup 26
bagus, yaitu berada pada kisaran nilai 1,8 dengan nilai tertinggi adalah 2,037 dan nilai terendah 1,625. Dengan tingkat kemurnian DNA yang diperoleh sudah dapat memenuhi standar kemurnian DNA untuk digunakan dalam proses PCR (Li and Zhao, 1996 ; Holme and Peck, 1998). Konsentrasi DNA yang diperoleh dari hasil isolasi menggunakan metode CTAB dengan modifikasi memiliki nilai terendah adalah 207 µg/mL dan nilai tertinggi adalah 1370,8 µg/mL. Hasil konsentrasi DNA tersebut kemudian digunakan dalam proses PCR dengan diencerkan terlebih dahulu. Hasil isolasi DNA yang didapatkan dari metode ini cukup baik yang disebabkan karena adanya beberapa perlakuan untuk mengurangi senyawa pengganggu dalam isolasi DNA dan menjaga agar enzim DNAse tidak aktif. Konsentrasi DNA yang paling baik digunakan untuk PCR perlu diketahui dengan dilakukan optimasi konsentrasi DNA dengan PCR.
B. Amplifikasi DNA Hasil Isolasi dan Deteksi DNA Jamur Endofit Dalam penelitian ini digunakan PCR dengan primer (Tabel 5) untuk mendeteksi adanya jamur endofit pada tanaman Jacobaea sp. Ada tidaknya jamur endofit pada tanaman Jacobaea sp. dapat diketahui dengan melihat dan menganalisis pita-pita DNA hasil amplifikasi pada gel elektroforesis. Kondisi PCR yang digunakan pada penelitian ini pada mulanya dilakukan menurut White et al. (1990), untuk primer ITS dengan suhu denaturasi 94 oC dan annealing 50 oC, untuk primer β-tubulin dengan suhu denaturasi 95 oC dan suhu annealing 55 oC. Percobaan menggunakan kondisi tersebut tidak diperoleh hasil pita
27
DNA yang maksimal sehingga, dalam penelitian ini dilakukan optimasi terlebih dahulu yang meliputi konsentrasi DNA template dan suhu annealing primer Konsentrasi DNA template dilakukan dengan kisaran 25-70 ng/µL. Berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan, konsentrasi DNA template yang menunjukan hasil terbaik adalah sebesar 70 ng/µL, sedangkan untuk suhu annealing dalam PCR tercantum pada Tabel 5. Tabel 5. Primer dan optimasi suhu annealing No.
Primer
Primer Sekuen
1. 2. 3. 4. 5.
T1 T22 ITS 1 ITS 4 ITS 5
AACATGCGTGAGATTGTAAGT (Myllys et al., 2001) TCTGGATGTTGTTGGGAATCC (Myllys et al., 2001) TCCGTAGGTGAACCTGCGG (White et al, 1990) TCCTCCGCTTATTGATATGC (White et al, 1990) GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG (White et al, 1990)
Suhu annealing (˚C) 59 59 55 55 55
Perbedaan optimasi konsentrasi DNA template dan suhu annealing dapat terjadi kerena kalibrasi alat yang digunakan, master mix PCR dan kualitas DNA sampel yang digunakan. Dari hasil optimasi yang telah diperoleh selanjutnya diterapkan untuk semua sampel DNA yang akan dianalisis. Pita DNA yang menunjukkan adanya variasi dapat
divisualisasi
menggunakan
gel
elektroforesis
(1,5%)
dengan
UV
Transilluminator. Jenis primer yang digunakan sangat berpengaruh pada pita DNA yang terbentuk. Pita DNA yang bisa dihasilkan juga dapat dipengaruhi oleh penggunaan kalibrasi Thermocycler dan protokol yang berbeda untuk persiapan PCR. Pengamatan terhadap pola pita DNA pada gel hasil elektroforesis menunjukan bahwa setiap jenis primer menghasilkan pita DNA yang berbeda baik jumlah ataupun ukuran, kadangkala yang berbeda hanya jumlahnya saja ataupun ukurannya saja. Selain itu, hasil amplifikasi pita DNA menunjukan variasi penampakan pita yaitu tebal atau tipis
28
dan kabur. Pita DNA yang dihasilkan menunjukan jarak migrasi yang bervariasi. Pita DNA yang lebih dekat dengan sumuran gel memiliki berat molekul yang lebih tinggi dibandingkan pita yang letaknya lebih jauh dari sumuran gel. Hal ini disebabkan karena molekul yang lebih berat bergerak lebih lambat didalam media gel elektroforesis. Primer yang digunakan pada penelitian ini, adalah T1, T2 untuk gen β tubulin dan ITS 1, ITS 4 dan ITS 5 untuk gen ITS Primer yang dipilih adalah primer yang spesifik menunjukan adanya DNA tanaman dan DNA jamur endofit, selain itu primer ini dipilih berdasarkan kejelasan pita DNA yang diamplifikasi.
1. Gen ITS Hasil elektroforesis primer ITS1 - ITS4 dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Hasil elektroforesis 11 sampel tanaman Jacobaea.sp dan kontrol positif jamur endofit menggunakan primer ITS1-ITS4. Marker: Marker 1 kb; Fusa 1 dan Fusa 2: Fusarium solani; FC1-FC3: Kontrol dengan ulangan 1-3; FF1-FF3: Perlakuan fungisida, bagian daun dengan ulangan 1-3; FW1-FW3: Perlakuan fungisida, bagian akar dengan ulangan 1-3.
Berdasarkan hasil PCR dengan primer ITS 1 dan ITS 4 dihasilkan 1 pita spesifik yang berukuran kurang lebih 550 dan 750 bp. Kontrol positif memiliki pita yang
29
berukuran 550 bp dan sampel FC1 sampai FW3 memiliki pita yang berukuran 750 bp. Sampel Fusa 1 dan Fusa 2 merupakan jamur dari spesies Fusarium solanii yang digunakan sebagai kontrol positif. Genus Fusarium dipilih sebagai kontrol positif karena pada penelitian sebelumnya digunakan spesies Fusarium oxysporum. Diharapkan dengan penggunaan genus jamur yang sama maka dapat diminimalisir hasil bias yang mungkin diperoleh. Kontrol positif juga digunakan untuk mengetahui apakah sistem yang dilakukan benar atau tidak. Genus Fusarium digunakan sebagai kontrol juga karena genus ini biasa menjadi jamur endofit pada tanaman-tanaman tertentu khususnya Jacobaea sp. (Pearson, 2011). Gambar 3 menunjukkan Fusa 1 dan Fusa 2 memiliki pita yang berukuran 550 bp yang merupakan ukuran pita jamur endofit yang akan terdeteksi pada tanaman Jacobaea sp. Sedangkan pada sampel tanaman Jacobaea sp. dihasilkan pita berukuran 750 bp. Dari hasil elektroforesis diatas pada semua sampel tanaman Jacobaea sp. tidak ditemukan pita berukuran 550 bp yang merupakan penunjuk adanya jamur endofit pada tanaman tersebut. Untuk mengkonfirmasi amplifikasi primer ITS1-ITS4, maka dilakukan amplifikasi primer ITS5-ITS4. Hasil amplifikasi primer ITS5-ITS4 dapat dilihat pada Gambar 4.
30
Gambar 4. Hasil elektroforesis 11 sampel tanaman Jacobaea.sp dan kontrol positif jamur endofit menggunakan primer ITS5- ITS4. Marker: Marker 1 kb; Fusa 1 dan Fusa 2: Fusarium solani; FC1-FC3: Kontrol dengan ulangan 1-3; FF1-FF3: Perlakuan fungisida, bagian daun dengan ulangan 1-3; FW1-FW3: Perlakuan fungisida, bagian akar dengan ulangan 1-3.
Untuk Hasil amplifikasi oleh ITS 5 dan ITS 4 menunjukan 1 pita spesifik yang berukuran 550 dan 750 bp. Kontrol positif memiliki pita yang berukuran 550 bp dan sampel FC1 sampai FW3 memiliki pita yang berukuran 750 bp. Keberadaan pita DNA berukuran 550 bp menunjukan besar gen ITS spesifik untuk jamur. Hasil ini tidak menunjukan perbedaan dengan amplifikasi primer ITS 1 dan ITS 4. Sehingga dapat dinyatakan bahwa gen ITS jamur memiliki ukuran 550 bp dan ITS pada tanaman Jacobaea sp. memiliki ukuran 750 bp. Dapat dikatakan Jacobaea sp. tidak mengandung jamur endofit karena tidak terdapat pita DNA dengan ukuran 550 bp. Primer ITS digunakan karena dapat mengamplifikasi DNA jamur dan DNA tanaman secara simultan sehingga dapat mendeteksi endofit secara langsung serta mengetahui apakah metode yang digunakan sudah benar atau tidak. Variasi ukuran pita yang dihasilkan pada gel elektroforesis bergantung pada berapa banyak sekuen DNA template yang dikenali oleh primer yang digunakan. Sehingga walaupun berbeda
31
primer dan sekuen template yang dikenali berukuran sama maka akan menghasilkan pita yang berukuran sama juga. Primer ITS merupakan primer yang sangat bervariasi strukturnya, sehingga biasa digunakan untuk mendeteksi jamur sampai level spesies. Keuntungan menggunakan primer ITS yaitu mudah diamplifikasi, spesifik, dan sensitif dalam penggunaannya. 2. β-tubulin Hasil amplifikasi primer T1-T22 dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Hasil elektroforesis 11 sampel tanaman Jacobaea.sp dan kontrol positif jamur endofit menggunakan primer T1-T22. Marker: Marker 1 kb; Fusa 1 dan Fusa 2: Fusarium solani; FC1-FC3: Kontrol dengan ulangan 1-3; FF1-FF3: Perlakuan fungisida, bagian daun dengan ulangan 1-3; FW1-FW3: Perlakuan fungisida, bagian akar dengan ulangan 1-3.
Amplifikasi gen β tubulin menghasilkan pita DNA hanya terdapat pada kontrol positif dan memiliki ukuran 1500 bp, 550 bp dan 375 bp. Pita yang terbentuk adalah fragmen DNA yang dapat dikenali dan diamplifikasi oleh primer T1 dan T22. Primer ini diketahui sangat spesifik terhadap jamur (Ross, 2010). Pada semua sampel tanaman baik kontrol dan perlakuan folikur tidak terdeteksi adanya pita DNA. Hal ini menunjukan bahwa sampel tanaman Jacobaea baik di akar dan daun tidak mengandung
32
endofit jamur karena pada tanaman sampel Jacobaea sp. tidak terdapat adanya pita DNA spesifik. Dalam penelitian ini digunakan dua macam organ yaitu akar dan daun. Organ akar digunakan untuk mengetahui keberadaan jamur endofit pada tanaman Jacobaea sp. karena biosintesis AP terjadi di akar sehingga dimungkinkan keberadaan letak jamur endofit yang berperan dalam biosintesis AP hanya spesifik di akar. Penggunaaan organ daun dikarenakan kemungkinan keberadaan jamur endofit berperan pada saat proses diversifikasi AP. Proses diversifiksi AP terjadi didaun sehingga kemungkinan juga jamur endofit akan berada pada bagian daun. Hasil yang didapatkan baik pada akar ataupun daun tidak ditemukannya keberadaan jamur endofit.
33
BAB V KESIMPULAN
A. Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian dan analisis, dapat disimpulkan bahwa: 1.
Metode CTAB dengan modifikasi dapat digunakan untuk mengisolasi DNA tanaman yang memiliki kandungan polisakarida dan senyawa fenolat tinggi seperti Jacobaea sp. dengan kualitas baik untuk dapat digunakan sebagai template PCR
2.
Gen ITS dapat diamplifikasi dari DNA genom jamur endofit dan DNA genom tanaman Jacobaea sp., sedangkan β-tubulin hanya dapat diamplifikasi dari DNA genom jamur endofit saja.
34
DAFTAR PUSTAKA
Alam, P. 2013. Kirinyuh (Chromolaena odorata), Gulma dengan banyak potensi manfaat. http://ditjenbun.pertanian.go.id/perlindungan/berita-226-kirinyuhchromolaena-odorata-gulma-dengan-banyak-potensi-manfaat.html diakses tanggal 12 Juli 2014 Alatar, A. A., M. A. Mahmoud, S. A. Al-Sohaibani and K. A. Abd-Elsalam. 2012. Simple and Rapid Protocol fot the Isolation of PCR-amplifiable DNA from Medicinal Plants. Genetics and Molecular Research. 11 (1): 348 – 354. Araya, O., Fuentealba, I. C. (1990). Chronic hepato-toxicity of Senecio erraticus in calves from two 50-day feeding periods in consecutive years. Vet. Hum. Toxicol. 32:555–557. Bain, J.F. 1991. The biology of Canadian weeds. 96. Senecio jacobaea L. Canadian Journal of Plant Science 71: 127-140. Barbas III, C. F., D. N. Burton, J. K. Scott, and G. J. Silverman. 2007. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harb Protoc. http://cshprotocols.cshlp.org/content/ 2007/11/pdb.ip47.full. Baldauf, S. L., Roger, A. J., Wenk-Siefert, I. & Doolittle, W. F. (2000): A kingdomlevel phylogeny of eukaryotes based on combined protein data. Science 290: 972–977. Bond, W., G. Davies & R. Turner. 2007. The biology and non-chemical control of Common Ragwort. The Organic Organization. (Senecio jacobaea L.) Cheng, D., Kirk, H., Mulder, P.P.J., Vrieling, K., Klinkhamer, P.G.L. 2011. Pyrrolizidine alkaloid variation in shoots and roots of segregating hybrids between Jacobaea vulgaris and Jacobaea aquatica. New Phytol. 192: 10101023. Cheung, W.Y, N. Hubert, and B. S. Landry. 1993. A simple and rapid DNA microextraction method for plant, animal, and insects suitable for RAPD and other PCR analyses. PCR Methods Appl. 3: 69 – 70. Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA. Doyle, J. J., and J. L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13 – 15. Einax, E. & K. Voight. 2003. Oligonucleotide primers for the universal amplification of β-tubulin genes facilitate phylogenetic analyses in the regnum Fungi. Organism Diversity & Evolution 3: 185 – 194. Fukino, N., Kunihisa, M. and Matsumoto, S. 2004. Characterization of rekombinant inbred lines derived from crosses in Melon (Cucumis melo L.), „PMAR No. 5‟ x „Harukei No. 3‟. Breeding Science 54:141-145.
35
Gardes, M., and T. D. Bruns. 1993. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes - application to the identification of mycorrhizae and rusts. Mol. Ecol. 2: 113-118. Gargas, A., and P.T. DePriest. 1996. A nomenclature for fungal PCR primers with examples from intron-containing SSU rDNA. Mycologia 88: 745-748 Giacomazzi, S., Lerol, F., Joffraud, J.J., 2005. Comparison of three methods of DNA extraction from cold-smoked salmon and impact of physical treatments. Journal of Applied Microbiology.98: 1230-1238 Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia. Edisi Kedua. Terjm.: K. Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung, hal. 9, 234 – 235. Harper, J. L. 1958. The ecology of ragwort (Senecio jacobaea L.) with special reference to control. Farnham Royal. 28(3): 151 – 157. Hartmann, T. and Dierich, B.1998. Chemical diversity and variation of Alkaloid Pyrrolizidines of the senecionine type: biological need or coincidence? Planta 206: 443-451 Hartmann T, Ober D (2000) Biosynthesis and metabolism of Alkaloid Pyrrolizidines in plants and specialized insect herbivores. InFJ Leeper, JC Vederas, eds, Topics in Current Chemistry, Vol 209. Springer, Berlin [u.a.], pp 207–244. Hol, W. 2003. The role of pyrrolizidine alkaloids from Senecio jacobaea in the defence against fungi. PhD Dissertation. Leiden University. Leiden. The Netherlands Holme, D. J. And H. Peck. 1998. Analytical Biochemistry. Third ed. Addison Wesley Longman. New York, p. 456 Huda, I. N. 2011. Analisis Variasi Genetik Melon (Cucumis melo L.) Kultivar Gama Melon Basket dan Melodi Gama-1 dengan Metode Random Amplified Polymorphic DNA. Skripsi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Kusari, S., Zuìˆhlke, S., and Spiteller, M. 2011. Effect of artificial reconstitution of the interaction between the plant Camptotheca acuminata and the fungal endophyte Fusarium solani on camptothecin biosynthesis. J Nat Prod. 74: 764775 Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoida, Fenilpropanoida dan Alkaloida. Departemen Kimia FMIPA Universitas Sumatra Utara. Medan, hal. 14 – 18. Leroux, P., Fritz, R., Debieu, D., Albertini, C., Lanen, C., Bach, J., Gredt, M., and Chapeland, F. 2002. Mechanisms of resistance to fungicides in field strains of Botrytis cinerea. Pest Manag Sci 58: 876-888 Li, Y. M. and Y. Zhao. 1996. Practical Protocols in Molecular Biology. Science Press Beijing. New York. Pp. 18-19 Mursyidi, A. 1990. Analisis Metabolit Sekunder. Pusat Antar Universitas UGM. Yogyakarta, hal. 1 – 4. Myllys, L., Lohtander, K., and Tehler, A. 2001. b-tubulin, ITS and group I intron sequences challenge the species pair concept in Physcia aipolia and P. caesia. Mycologia: 335-343 Nicholl, D. S. T. 2008. An Introduction to Genetic Engineering. 3th ed. Cambridge University Press. Singapore. Pp. 35-36 36
Nuringtyas, T. R., P. P. J. Mulder, Y. H. Choi, R. Verpoorte, P. G. R. Klinkhamer and K. A. Leiss. 2013. The Role of Fungal Endophytes on Pyrrolizidine Alkaloid Synthesis in Jacobaea Plants. Journal of Chemical Ecology. Pearson, K, A. 2011. Characterisation of Fusarium Isolate Infecting Roots of Ragwort (Jacobaea vulgaris syn. Senecio jacobaea) and as Assesment of Their Potential as Biological Control Agents. Institute of Biological and Enviromental Science. University of Aberdeen. Pelser, P. B., J. F. Veldkamp and R. van der Meijden. 2006. New Combination in Jacobaea Mill. (Asteraceae – Senecioneae). Compositae Newsletter 44: 1 – 12. Rodriguez RJ, Henson J, Van Volkenburgh E, Hoy M, Wright L, Beckwith F, Kim Y, Redman RS. 2008. Stress tolerance in plants via habitat-adapted symbiosis. International Society of Microbial Ecology 2: 404–416. Roeder, E. (2000). Medicinal plants in China containing Alkaloid Pyrrolizidines. Salisbury, F. B. and C. W. Ross. 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid 2. Terjm.: d. Lukman dan sumaryono. Penerbit ITB. Bandung, hal. 151 – 154. Sambrook, J. , Fritsch, E. F & Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab Press. Sherwood M, Carroll G. 1974. Fungal succession on needles and young twigs of oldgrowth Douglas fir. Mycologia 66: 499–506. Springob and Kutchan (2009). Introduction to the Different Classes of Natural Products. Eds. A. E. Osbourn • and V. Lanzotti. Plant-derived Natural Products: Synthesis, Function, and Application. Springer Stegelmeier, B. L., Edgar, J. A., Colegate, S. M., Gardner, D. R., Schoch, T. K., Coulombe, R. A., Molyneux, R. J. (1999). Alkaloid Pyrrolizidine plants, metabolism and toxicity. J. Nat. Toxins 8:95–116. Pharmazie 55:711–726. Stone JK, Polishook JD, White JRJ. 2004. Endophytic fungi. In: Mueller G, Bills GF, Foster MS, eds. Biodiversity of fungi: inventory and monitoring methods. Burlington, MA, USA: Elsevier, 241–270 Strobel, G.A. 2003. Endophytes as sources of bioactive products. Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Tamarin, R. H. 1999. Principles of Genetics. 6th edition. McGraw-Hill. New York, pp. 293-295. Tan, R.X., and W.X. Zou. 2001. Endophytes : a rich source of functional metabolites. Nat. Prod. Rep. 18: 448-459. White, T.J., T. Bruns, S. Lee and J. Taylor. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. (Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds). Academic Press, New York, USA: 315–322. Wink, M. 2010. Introduction: Biochemistry, Physiology and Ecological Functions of Secondary Metabolites. Annual Plant Reviews 40: 1–19. Yuwono, T. 1992. Petunjuk Laboratorium Reaksi Rantai Polimerase. PAU Bioteknologi UGM. Yogyakarta.
37
