TRPV1 receptor funkciójának és farmakológiájának vizsgálata in vivo nociceptív tesztekben

A kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronok és a kapszaicin VR1/TRPV1 receptor funkciójának és farmakológiájának vizsgálata in vivo nociceptív tesztekben

Doktori (PhD) értekezés

Dr. Bölcskei Kata

Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Pécs Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

Elméleti Orvostudományok – Neurofarmakológia program

Programvezető: Dr. Szolcsányi János Témavezető: Dr. Pethő Gábor, Dr. Helyes Zsuzsanna

2006

Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke ........................................................................................................ 3 Bevezetés .......................................................................................................................... 4 1. Általános bevezetés

4

1.1. A kapszaicin-érzékeny nociceptorok ................................................................. 4 1.2. A kapszaicin VR1/TRPV1 receptor................................................................... 6 1.3. A TRPV1 receptor szerepe a nociceptorok szenzibilizációjában .................... 10 1.4. A kapszaicin-érzékeny rostokból felszabaduló szomatosztatin gyulladásgátló és antinociceptív hatása .......................................................................................... 11 1.5. Cannabinoid receptorok és endogén agonistáik: további új támadáspontok a fájdalomcsillapításban ............................................................................................ 12 2. In vivo nociceptív vizsgálatok

14

2.1. Etika ................................................................................................................. 14 2.2. Termonocicepció: nociceptív hőküszöbmérésen alapuló módszerek.............. 14 2.3. Mechanonociceptív küszöb mérése ................................................................. 17 2.4. Kemonocicepció vizsgálata ............................................................................. 18 2.5. Krónikus neuropátia modellek......................................................................... 19 Célkitűzések.................................................................................................................... 21 Kísérletes munka............................................................................................................. 22 I. Anandamid (arachidonil-etanolamid – AEA) és palmitoil-etanolamid (PEA) gátló hatása in vivo reziniferatoxinnal kiváltott neuropeptid felszabadulásra és neuropátiás mechanikai hiperalgéziára

23

I/1. Bevezetés.......................................................................................................... 23 I/2. Módszerek ........................................................................................................ 24 I/3. Eredmények...................................................................................................... 25 I/4. Megbeszélés és következtetések ...................................................................... 28 II. A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232 analgetikus hatása akut kémiai és termális nociceptív tesztekben és streptozotocinnal kiváltott diabéteszes mechanikai allodyniában

29

1

II/1. Bevezetés ........................................................................................................ 29 II/2. Módszerek....................................................................................................... 30 II/3. Eredmények .................................................................................................... 32 II/4. Megbeszélés és következtetések ..................................................................... 36 III. A TRPV1 receptor szerepének vizsgálata akut és krónikus nociceptív modellekben génhiányos egerek segítségével

38

III/1. Bevezetés ....................................................................................................... 38 III/2. Módszerek...................................................................................................... 39 III/3. Eredmények ................................................................................................... 41 III/4. Megbeszélés és következtetések.................................................................... 48 IV. Hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésen alapuló új termális hiperalgézia modell kidolgozása az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő alkalmazásával

50

IV/1. Bevezetés....................................................................................................... 50 IV/2. Módszerek ..................................................................................................... 51 IV/3. Eredmények................................................................................................... 52 IV/4. Megbeszélés és következtetések.................................................................... 58 A kísérletes munka összefoglalása és értékelése ............................................................ 61 Köszönetnyilvánítás........................................................................................................ 65 Irodalomjegyzék ............................................................................................................. 66 A disszertáció alapjául szolgáló publikációk.................................................................. 76 Eredeti közlemények............................................................................................... 76 Idézhető absztraktok ............................................................................................... 76 A disszertációban nem szereplő publikációk listája ....................................................... 78 Eredeti közlemények............................................................................................... 78 Idézhető absztraktok ............................................................................................... 78 Függelék.......................................................................................................................... 80

2

Rövidítések jegyzéke AEA ATP cAMP CB1, CB2 CFA CGRP COX CPS ED50 EDTA LTB4 MED NDGA NGF PEA PGE2 PKA PKC PMA RIA RTX SOM SP SRIF sst STZ TRPV1 VR1 12-HPETE

arachidonil-etanolamid adenozin-trifoszfát ciklikus adenozin-monofoszfát cannabinoid receptor 1, 2 komplett Freund adjuváns calcitonin gén-rokon peptid ciklooxigenáz Composite Pain Score (Összetett Fájdalom Pontszám) 50 %-ban effektív dózis (félmaximális hatást kiváltó dózis) etilén diamin tetraecetsav leukotrién B4 minimális effektív dózis nordihidroguaiarénsav nerve growth factor (idegnövekedési faktor) palmitoil-etanolamid prosztaglandin E2 protein kináz A protein kináz C forbol 12-mirisztát 13-acetát radioimmunoassay reziniferatoxin szomatosztatin substance P somatotropin release-inhibiting factor (=szomatosztatin) szomatosztatin receptor streptozotocin tranziens receptor potenciál vanilloid 1 vanilloid receptor 1 12-hidroperoxi-eikozatetraénsav

3

Bevezetés 1. Általános bevezetés A nociceptorok specializált idegvégződések, amelyek potenciálisan szövetkárosító ingereket érzékelnek és közvetítenek a központi idegrendszer felé. A bőrt beidegző nociceptív primer afferens neuronok pszeudounipoláris sejtek, melyeknek perifériás nyúlványai alkotják a fájdalomérző idegrostokat, sejttestei a gerincvelő hátsó gyöki ganglionokban illetve a trigeminus ganglionban találhatóak, centrális nyúlványaik pedig a gerincvelő hátsó szarvába vagy a trigeminus magba továbbítják az ingerületet. A nociceptorok több szempontból osztályozhatók. Axonjaik alapján két csoportra oszthatók: a mielinizált, gyorsan vezető (12–30 m/s) Aδ nociceptorokra, melyeknek sejtteste is nagyobb átmérőjű (2–6 µm), és a kis méretű (0,4–1,2 µm) mielinhüvely nélküli, lassan vezető (0,5–2 m/s) rostokkal rendelkező C nociceptorokra. Fázikus inger esetén előbbiek a fájdalomérzet első, gyorsan kialakuló, éles komponenséért felelősek, míg utóbbiak a második, később érezhető, diffúz és tompa komponenst hozzák létre. A szomatikus szenzoros receptorokat, így a nociceptorokat is, érzékenységük alapján is csoportosíthatjuk. Ellentétben a nem-nociceptív érző receptorokkal, melyekre nagyfokú specializáltság jellemző, a nociceptorok jelentős hányada polimodális, vagyis egyaránt aktiválható fájdalmas intenzitású hő- és mechanikai ingerekkel valamint endogén és exogén kémiai anyagokkal is.

1.1. A kapszaicin-érzékeny nociceptorok A nociceptív primer afferens neuronok élettanának és farmakológiájának kutatásában a csípős paprika hatóanyaga, a kapszaicin, szelektív tesztanyagként kitüntetett szerepet játszott. A csípős paprika kivonatának érző idegekre kifejtett hatását Hőgyes Endre már 1878-ban leírta, a kapszaicin hatásainak részletes tanulmányozását pedig a 40-50-es évektől kezdődően Jancsó Miklós és munkacsoportja kezdte el Szegeden. Az első eredménynek évtizedekig komoly nemzetközi visszhang nélkül maradtak, azonban az

4

elmúlt 30 évben a kapszaicinhez kapcsolódó kutatások mégis a neurofarmakológia egyik legnépszerűbb témái közé kerültek. A bőrben található kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronok polimodális nociceptorok, amelyek a C és Aδ nociceptorok jelentős részét alkotják. Emellett a kapszaicinérzékenység jellemző számos viszcerális primer afferens neuronra is. A kapszaicin szelektíven izgatja ezeket a rostokat, magasabb koncentrációk és tartósabb expozíció hatására pedig az aktivációt követően a végződés tartós funkcionális blokkolása alakul ki. Ennek során minden ingerrel szemben csökken a neuron válaszkészsége, azonban a szelektivitás folytán az egyéb szenzoros funkciók (tapintás, hidegérzékelés, ízlelés stb.) nem érintettek (Jancsó & Jancsó-Gábor, 1959; Jancsó, 1960; Szolcsányi, 1977). Ezt a jelenséget kapszaicin deszenzibilizációnak nevezik, amelynek mechanizmusa nem a klasszikus értelemben vett receptoriális deszenzibilizáció, mivel a válaszképtelenség az egész rostra kiterjed. A kapszaicin-érzékeny nociceptorok ortodrómos vagy antidrómos ingerlése a beidegzés területén vazodilatációt és plazma extravazációt vált ki. A jelenséget neurogén gyulladásnak

nevezték

el,

mivel

denerváció

vagy

kapszaicinnel

történő

deszenzibilizáció egyaránt meggátolta a kialakulását (Jancsó et al., 1967; Jancsó et al., 1968). A neurogén gyulladást a kapszaicin-érzékeny rostokból exocitózissal felszabaduló szenzoros neuropeptidek, többek között tachikininek (substance P, neurokinin A és B) és calcitonin gén-rokon peptid (CGRP) hozzák létre. A viszcerális szerveket ellátó kapszaicin-érzékeny rostokból felszabaduló neuropeptidek pedig a simaizmokon hatva motoros válaszokat is kiváltanak (részletesen l. Maggi, 1995). A kapszaicin-érzékeny végződések a tachikinineken és a CGRP-n kívül tartalmaznak más neuropeptideket, például szomatosztatint is, amely aktiváció hatására szintén felszabadul (l. 1.4. pont). A neurogén gyulladás illetve a neuropeptidek exocitózisa az axonális ingerületvezetés gátlása esetén is létrejön (Szolcsányi, 1984a,b), ami azt igazolja, hogy a neuropeptidek nem axonreflex révén, hanem a nociceptor stimuláció közvetlen következményeként ugyanazon végződésből szabadulnak fel. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronok kettős funkcióval rendelkeznek: klasszikus, afferens működésük az ingerek felfogása és az ingerület továbbítása a perifériáról a központi idegrendszer felé, a végződésből felszabaduló neuropeptidek révén pedig lokális effektor funkciót is ellátnak (Szolcsányi, 1984b; Szolcsányi, 1996; 1. ábra). A bőrben

található

végződésekből

fiziológiai

körülmények

között

felszabaduló 5

neuropeptideknek feltételezhetően trofikus és a lokális keringést szabályozó szerepük van (Sann et al., 1988; Szolcsányi, 1988).

1. ábra: A kapszaicin-érzékeny idegvégződések kettős funkciója

1.2. A kapszaicin VR1/TRPV1 receptor A kapszaicin receptor létezését Jancsó-Gábor Aranka és Szolcsányi János már 1975-ben feltételezte

és

kapszaicin-analóg

vegyületek

szerkezet-hatás

összefüggéseinek

vizsgálatával modellezték is (Szolcsányi & Jancsó Gábor, 1975). A receptormolekulát klónozni azonban csak 1997-ben sikerült, amelynek akkor a vanilloid receptor 1 (VR1) elnevezést adták (Caterina et al., 1997), mivel a receptor akkor ismert agonistái tartalmazták a 3-metoxi-4-hidroxi-benzil, azaz vanillil funkciós csoportot. Újabb vizsgálatok alapján kiderült, hogy a receptor hasonlóságot mutat az úgynevezett tranziens receptor potenciál (TRP) fehérjékkel, és így a nevét tranziens receptor potenciál vanilloid 1-re (TRPV1) módosították (Gunthorpe et al., 2002). A TRPV1 receptor egy 6 transzmembrán doménből álló, nem-szelektív kationcsatorna (2. ábra), amelyet a kapszaicinen túl a fájdalmas hőingerek (>43 °C), az alacsony pH és egyéb exogén irritáns anyagok (reziniferatoxin, piperin, zingeron, eugenol; 3. ábra) és 6

endogén mediátorok (anandamid, lipoxigenáz-termékek, N-arachidonoil-dopamin, Noleoil-dopamin; 4. ábra) képesek aktiválni. A hő- és kémiai ingerek a molekula eltérő pontjain hoznak létre konformációváltozást (2. ábra) és egymás hatását képesek felerősíteni, így a TRPV1 receptor különböző fájdalmas ingerek integrátorának tekinthető (Tominaga et al., 1998). A receptor aktivációja során a csatorna megnyílásával Na+ és Ca2+ ionok áramlanak be, amely a végződés depolarizációjához, illetve akciós potenciál kialakulásához vezet, valamint a Ca2+ ionok hatására a végződésben tárolt neuropeptidek exocitózisa következik be. Nem mellékes, hogy a Ca2+ ionok beáramlásának fontos szerepe van olyan jelátviteli utak aktiválódásában is, amelyek a neuron későbbi deszenzibilizációjához vezetnek (Koplas et al., 1997; Liu & Simon, 1998). A TRPV1 receptor az elsőként azonosított hőérzékeny ioncsatorna, azonban nem ez az egyetlen olyan transzducer struktúra, amely képes hőingerek felfogására. A közelmúltban 5 további, hővel aktiválható TRP-receptort is felfedeztek, amelyek érzékenysége közel lefedi azt a hőmérséklettartományt, amelyet a szervezet érzékelni képes. A TRPV2 (korábban vanilloid receptor-like 1 – VRL1) az 53 °C feletti, a TRPV3 a 31–39 °C közötti, a TRPV4 receptor pedig a 24–33 °C közötti hőingerekre aktiválódik (Benham et al. 2003), míg a hideg stimulusokra a TRPM8 és a TRPA1 receptorok válaszolnak (Peier et al, 2002; Story et al., 2003).

2. ábra: A TRPV1 receptor szerkezete. A receptor aktiválására képes ingerek a fehérje eltérő pontjain hoznak létre konformációváltozást, amely a kationcsatorna megnyílásához vezet. A szürke pontokkal jelölt helyek a protein kináz C illetve protein kináz A támadáspontjai, amelyek foszforilációja igazoltan a receptor érzékenységének fokozódásához vezet (l. 1.3. pont).

7

3. ábra: Természetes eredetű, irritáns vegyületek, amelyek a TRPV1 receptor stimulációjával fejtik ki hatásukat. A kapszaicint a csípős paprika (Capsicum annuum és Capsicum frutescens), a reziniferatoxint egy Marokkóban honos kutyatejféle (Euphorbia resinifera), a piperint a feketebors (Piper nigrum), a zingeront a gyömbér (Zingiber officinale), az eugenolt pedig a szegfűszeg (Syzygium aromaticum) tartalmazza.

8

9

4 ábra: A TRPV1 receptor lehetséges endogén ligandjai: az anandamid (Zygmunt et al., 1999; Smart et al., 2000) a cannbinoid CB1 receptorok endogén aktivátora a központi idegrendszerben és a periférián egyaránt, a 12hidroperoxieikozatetraénsav (Hwang et al., 2000) arachidonsavból 12-lipoxigenáz hatására testszerte keletkezik, az N-

1.3. A TRPV1 receptor szerepe a nociceptorok szenzibilizációjában Szövetsérülés vagy gyulladás következtében hiperalgézia, azaz fokozott fájdalomérzet alakul ki, amely definíció szerint az ingerintenzitás-fájdalomérzet görbe balratolódását és maximumának növekedését jelenti. A stimulus alapján termális illetve mechanikai hiperalgéziát különböztethetünk meg; előbbi főleg perifériás, míg utóbbi centrális mechanizmusok következtében jön létre. A termális hiperalgézia kifejlődésének egy jelentős komponense a nociceptorok perifériás végződéseinek szenzibilizációja, amely során az aktivációjukhoz szükséges küszöb csökken, illetve küszöb feletti ingerek nagyobb választ váltanak ki (részletesen l. Raja et al., 1999). A hiperalgézia kialakulásában döntő szerepet játszanak a szövetsérülés során a károsodott sejtekből és környezetükből felszabaduló anyagok, mint például a bradikinin, prosztaglandinok, leukotriének, szerotonin, hisztamin, ATP stb., amelyek közvetlenül képesek a nociceptorok aktiválására és/vagy szenzibilizálására (Martin et al, 1987; Pitchford & Levine, 1991; Khan et al, 1992). A hőszenzibilizáció kialakulásának egyik lehetséges mechanizmusa, hogy a TRPV1 receptor érzékenysége foszforiláció következtében jelentősen fokozódik (Premkumar & Ahern, 2000; Vellani et al., 2001; Bhave et al., 2002; Crandall et al., 2002; Rathee et al., 2002; Vulcu et al., 2003). Egyre több adat áll rendelkezésre arról, hogy a nociceptorokat érzékenyíteni képes mediátorok (bradikinin, prosztaglandinok, ATP, szerotonin stb.) részben úgy vezetnek hőszenzibilizációhoz, hogy saját receptorukhoz kötődve, intracelluláris jelátviteli utakon keresztül, protein kinázok (protein kináz C – PKC, protein kináz A – PKA) működését serkentik, amelyek azután foszforilálják a TRPV1 receptort (Tominaga et al., 2001; Sugiura et al., 2002; Moriyama et al., 2005). Különböző gyulladásos mediátorok elegye („inflammatory soup”) a gyulladt szövetekre jellemző alacsony pH-val együttesen képes a TRPV1 receptor aktivációját is kiváltani (Vyklicky et al., 1998), feltehetően úgy, hogy hőküszöbét a környezeti hőmérséklet alá csökkentik, így ez a hőinger vezet a csatorna megnyílásához. Újabb megfigyelések szerint különböző lipoxigenáz-termékek, például a 12-hidroperoxi-eikozatetraénsav (12HPETE) és a leukotrién B4 (LTB4) képesek közvetlenül aktiválni a TRPV1 receptort (Hwang et al., 2000). Számos bizonyíték mutatja tehát azt, hogy ezekben a folyamatokban a TRPV1 receptor központi szerepet tölt be és egyelőre nem ismert, hogy más TRP-csatornák modulációja hozzájárulna a hőszenzibilizációhoz. A TRPV1

10

receptor kulcsfontosságú szerepét igazolja az is, hogy receptor génhiányos (knockout) egerekben nem alakul ki gyulladásos termális hiperalgézia (Caterina et al., 2000; Davis et al., 2000). A fentiekből az is következik, hogy a TRPV1 receptort expresszáló neuronok potenciális

perifériás

célpontot

jelenthetnek

új

fájdalomcsillapító

vegyületek

kifejlesztésére.

1.4.

A

kapszaicin-érzékeny

rostokból

felszabaduló

szomatosztatin

gyulladásgátló és antinociceptív hatása Évezredes tapasztalatok alapján számos olyan gyógymódot használnak mind a hagyományos, népi, mind a modern orvoslásban, ami lokális bőrizgatáson keresztül fejt ki fájdalom- és gyulladáscsökkentő hatást (pl. kapszaicines vagy kámforos oldat bedörzsölése, mustártapasz). Ezeket az eljárásokat „ellenirritációnak” is nevezik, arra utalva, hogy az elsődlegesen irritációt kiváltó beavatkozás ellentétes, a gyulladásos tüneteket enyhítő hatáshoz vezet. A felületi, lokális szövetizgatás a mélyebb rétegekre, illetve a szervezet egészére kifejtett hatásának pontos mechanizmusa azonban kevéssé vált ismertté; hatékonyságukat elsősorban a keringés fokozódásával vagy reflexes folyamatokkal magyarázták. A polimodális nociceptorok működésének vizsgálata során azonban olyan meglepő eredmények születtek, amelyek újszerű magyarázatot kínálnak a látszólag paradox „ellenirritáció” jelenségére. Amint már ismertettem, a kapszaicin-érzékeny neuronok végződéseiből

stimuláció

következtében

felszabaduló

neuropeptidek

közül

a

tachikininek és a CGRP az innervációs területen lokális gyulladáskeltő hatást fejtenek ki, létrehozva a neurogén gyulladást. Bebizonyosodott azonban, hogy ezzel párhuzamosan felszabadul egy olyan mediátor is, ami a szervezet távolabbi területein gyulladásgátló hatást tud kifejteni (Pintér & Szolcsányi, 1996). A kapszaicin-érzékeny rostokban található gátló hatású mediátorok közül a szomatosztatinról igazolódott, hogy plazmaszintje jelentősen megnő a stimuláció után, azaz képes bejutni a keringésbe, és szisztémás gyulladásgátló (Szolcsányi et al., 1998a,b) és antinociceptív hatást fejt ki (Helyes et al., 2000). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kapszaicin-érzékeny neuronok afferens és lokális efferens hatásaikon kívül, szisztémás neurohumorális regulációs avagy „szenzokrin” funkcióval is rendelkeznek (Thán et al., 2000). A 11

jelenség szervezetben betöltött szerepének szempontjából érdekes az a megfigyelés, hogy a hatás már az igen alacsony, 0,1 Hz frekvenciával történő stimuláció következtében is kialakul, ami még sem fájdalmat, sem neurogén gyulladást nem vált ki (Szolcsányi, 1996; Szolcsányi et al., 1998a). Ezek az adatok mind a kapszaicinérzékeny neuronok élettani szerepének komplexitására utalnak. A szomatosztatin receptor antagonista ciklo-szomatosztatin felhasználásával további bizonyítékok születtek az endogén szomatosztatin szisztémás antinociceptív hatására. Ezek azt igazolták, hogy a szomatosztatin tónusos gátló hatást fejt ki a formalinnal kiváltott fájdalomreakcióra (Carlton et al., 2001b), valamint azt is, hogy kapszaicines „ellenirritációval” kiváltott antinocicepció mediátora lehet (Carlton et al., 2003). Celluláris szinten az antinociceptív hatás feltehetően annak a következménye, hogy a szomatosztatin Gi-proteinhez kapcsolt receptorokon keresztül hatva, többek között facilitálja K+-csatornák és gátolja a feszültségfüggő Ca2+ csatornák működését, ezáltal hiperpolarizálja a neuront, és a transzmitterek exocitózisát is gátolja (Patel, 1999). Ugyanezt eredményezi az is, hogy az adenilát-cikláz gátlása révén képes az intracelluláris cAMP-szintet is csökkenteni. Gyulladásgátló hatásának mechanizmusa részben a szenzoros neuropeptid felszabadulás gátlásán alapul (Helyes et al., 2001), így csökkentve a gyulladás neurogén komponensét. Ismert azonban az is, hogy nemneurogén gyulladás modellekben is hatékony (Helyes et al., 2003), amelynek hátterében az állhat, hogy immunmoduláns hatásai révén képes befolyásolni egyéb, gyulladásban részt vevő sejtek működését is (ten Bokum et al., 2000).

1.5.

Cannabinoid

receptorok

és

endogén

agonistáik:

további

új

támadáspontok a fájdalomcsillapításban Az endogén opioidok felfedezéséhez hasonlóan, az indiai kender (Cannabis sativa) hatóanyagának támadáspontjaként fedezték fel a cannabinoid receptorokat (Matsuda et al., 1990; Munro et al., 1993) és később azonosítottak endogén cannabinoidokat is, közülük elsőként az anandamidot (Devane et al., 1992; szerkezetét l. 4. ábra). Az anandamid elsősorban a cannabinoid CB1 receptorokhoz kötődik, amelyek a központi

idegrendszer

számos

területén

megtalálhatók

(cortex,

hippocampus,

extrapyramidalis idegrendszer struktúrái), de emellett nagy számban fordulnak elő a nociceptív transzmisszióban résztvevő felszálló pályák, valamint a leszálló gátló pályák

12

területein (thalamus, periaqueductalis szürkeállomány, amygdala, gerincvelő substantia gelatinosa), ami arra utal, hogy szerepet játszanak a fájdalompercepció centrális modulációjában (részletesen l. Pertwee, 2001). A CB1 receptorok jelenlétét a primer afferens neuronokon is kimutatták, amelyek a centrális támadáspontokon túl, a cannabinoidok lehetséges perifériás antinociceptív hatását közvetíthetik. A CB2receptorokat korábban főleg nem-neuronális sejteken mutatták ki, amelyek feltehetően a cannabinoidok immunmoduláns hatásért felelősek (Facci et al., 1995), de vannak arra utaló adatok is, hogy léteznek további, CB2-szerű receptorok is, amelyek szintén részt vesznek a fájdalom-transzmisszió kontrolljában (Calignano et al., 1998). A cannabinoid receptorok, a szomatosztatin receptorokhoz hasonlóan, Gi-proteinen keresztül gátolják az adenilát-ciklázt valamint a feszültségfüggő Ca2+-csatornák működését, és fokozzák a K+-csatornák megnyílását, tehát összességében a neuronok válaszkészségét és a transzmitterek exocitózisát egyaránt csökkentik. Számos akut és krónikus fájdalommodellben vizsgálták a cannabinoidok antinociceptív és antihiperalgetikus hatását, és egyaránt hatásosnak találták azokat akut hő- és kémiai ingerrel kiváltott nocicepció gátlására (Buxbaum, 1972; Lichtman & Martin, 1991; Smith et al., 1994; Calignano et al., 1998), gyulladásos termális és mechanikai hiperalgézia csökkentésére (Jaggar et al., 1998; Richardson et al., 1998; Smith et al., 1998) valamint különböző eredetű neuropátia modellekben is (Herzberg et al., 1997; Fox et al., 2001; Scott et al., 2004).

13

2. In vivo nociceptív vizsgálatok A fájdalom komplex szenzoros-emocionális érzet, és mint ilyen, állatkísérletekben közvetlenül nem mérhető, csak az állat elhárító magatartásformáiból következtethetünk a mértékére. Az elhárító flexor reflex megjelenése azonban humán vizsgálatok szerint jól korrelál a szubjektív fájdalomérzettel (Chan & Dalliere, 1989), vizsgálata tehát jó elvi megközelítést jelent. A nocicepció vizsgálatára számos állatkísérletes modell áll rendelkezésünkre. A dolgozat alapjául szolgáló kísérletekben akut termo- és kemonociceptív teszteket alkalmaztunk, valamint krónikus neuropátia modellekben mértük a mechanonociceptív küszöb változását, patkányokban és egerekben egyaránt. Egy újonnan kifejlesztett készülék, az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő segítségével kidolgoztunk egy új, enyhe hőtraumával kiváltott termális hiperalgézián alapuló modellt is, amely rendkívüli érzékenységet mutatott számos analgetikum iránt. Az alábbiakban összefoglalom az alkalmazott tesztmódszerek alapelveit és legfontosabb jellegzetességeit. A kísérleti protokollok részletes leírása az adott fejezetben található.

2.1. Etika A nocicepció állatkísérletes vizsgálata komoly etikai megfontolásokat tesz szükségessé. A fájdalomkutatás nemzetközi szervezete, az International Association for the Study of Pain (IASP) összeállította azokat az etikai alapelveket, amelyeket a kísérletek során követni kell (Zimmermann, 1983), ennek teljes szövegét a Függelékben mellékeltem. Kísérletes módszereinket a Pécsi Tudományegyetem Állatkísérletes Etikai Bizottsága is jóváhagyta.

2.2. Termonocicepció: nociceptív hőküszöbmérésen alapuló módszerek A hagyományos termonocicepciós módszereknél állandó intenzitású, küszöb feletti hőingereket alkalmaznak, és az elhárító (nocifenzív) reakció megjelenéséig tartó latenciaidőt mérik. Ezen módszerek közé tartozik például az állandó hőmérsékletű forró

14

lap (Woolfe & MacDonald, 1944; O'Callaghan & Holzman, 1975), amelyet 50–55 °Cos hőmérsékletre fűtenek, majd az állatot a lapra helyezik, tehát minden végtagját egyszerre teszik ki a hőingernek. Egy másik igen elterjedt módszer az ún. plantar teszt (Hargreaves et al., 1988), amelyben az állat egy üveglapra helyezett kamrában helyezkedik el, a vizsgált talpat pedig alulról egy fókuszált hősugárral stimulálják. Ezzel szemben munkacsoportunk a termonocicepció vizsgálatára új elven alapuló módszereket

vezetett

be,

amelyek

megbízhatóbbaknak

és

érzékenyebbeknek

bizonyultak a latenciamérésnél (Almási et al., 2003). Az új módszerekben emelkedő intenzitású hőingerrel a nociceptív küszöbhőmérséklet határozható meg, azaz a legalacsonyabb hőmérséklet, ami nocifenzív reakciót vált ki. 2.2.1. Emelkedő hőmérsékletű forró lap (hot plate) Ez az intézetünkben kifejlesztett új módszer szabadon mozgó patkányok és egerek nociceptív küszöbhőmérsékletének meghatározására alkalmas (Almási et al., 2003). Az állatokat

a

fűtőelemmel

ellátott

fémlemezre

helyeztük,

amelyet

ezután

szobahőmérsékletről indulva egyenletes sebességgel fűtöttünk fel. Nociceptív hőküszöbnek tekintettük azt a hőmérsékletet, amelynél az állat nocifenzív reakciót mutatott, amely többnyire a hátsó végtag megnyalása vagy megemelése volt. Ekkor a fűtést megállítottuk és az állatot a lapról azonnal levettük.

5. ábra: Lábnyalási reakció az emelkedő hőmérsékletű forró lapon

15

Az egyes anyagok antinociceptív hatását kétféle megközelítéssel vizsgáltuk. Egyrészt megmértük, hogy a kezelés után megemelkedik-e a hőküszöb, ekkor a szer beadását követően ismételt méréseket végeztünk, és az eredményeket a kezelés előtti kontroll küszöbhöz viszonyítottuk. 2.2.2. Emelkedő hőmérsékletű vízfürdő A készüléket szintén újonnan fejlesztettük ki intézetünkben a nociceptív hőküszöb mérésére. Az állatokat lazán tartva, egyik hátsó lábukat vagy farkukat egy fűthető, vízzel teli tartályba merítettük, majd szobahőmérsékletről indulva egyenletesen melegítettük a vizet mindaddig, amíg az állat ki nem húzta a végtagját a vízből. Nociceptív hőküszöbnek pedig a vízfürdő aktuális hőmérsékletét tekintettük. A dolgozat IV. fejezetének témája a módszer részletes bemutatása, valamint a készülék használatával kifejlesztett új hiperalgézia-modell, ami megbízható és érzékeny tesztmódszernek bizonyult.

6. ábra: Nociceptív hőküszöb mérése az emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel

16

2.3. Mechanonociceptív küszöb mérése 2.3.1. Randall-Selitto módszer (Ugo Basile analgeziméter) A készülékkel a mechanikai fájdalomküszöb mérhető patkányokon (Randall & Selitto, 1957). Az állatokat lazán lefogva tartottuk függőleges testhelyzetben és egyik hátsó lábukat a gép tompa, kúp alakú stimulátorai közé illesztettük, amelyek azután fokozatosan növekvő erővel szorították össze a lábfejet. Mechanonociceptív küszöbnek azt az erőt tekintettük, amelynél az állat elrántotta a lábát.

7. ábra: Mechanonociceptív küszöb mérése Randall-Selitto módszerrel

2.3.2. Dinamikus plantáris eszteziométer A készülék segítségével a talp finom mechanikai küszöbe határozható meg szabadon mozgó patkányokon vagy egereken. Az állatokat egy lábakon álló, rácsozott aljú plexikamrába helyeztük. A kamra alatt található a tükörrel felszerelt mozgatható stimulátor egység, amellyel megcélozható alulról a talp. A stimulátor előre beállított paraméterek alapján fokozatosan növekvő erővel egy tompa hegyű tűt nyom a talphoz mindaddig, amíg az állat a lábát el nem rántja. Ekkor a tű azonnal visszaesik a 17

kiindulási helyzetbe, és a kijelzőn leolvasható a mechanonociceptív küszöb grammokban. Patkányok esetén 10 g/sec sebességgel maximum 50 g-ig emeltük az erőt, míg egereknél a meredekség 2 g/sec volt, a maximum pedig 10 g. Amennyiben az állat a maximális erő eléréséig nem húzta el a lábát, úgy küszöbnek ezt az értéket tekintettük.

8. ábra: Dinamikus plantáris eszteziométer

2.4. Kemonocicepció vizsgálata 2.4.1. Szomatikus kemonocicepció – formalin-teszt A

teszt

egyike

a

legelterjedtebb,

széles

körben

alkalmazott

nociceptív

tesztmódszereknek (Dubuisson & Dennis, 1977). Formalin híg oldatának (1-5 %) intraplantáris

befecskendezése

után

markáns,

jellegzetes

lefolyású

nocifenzív

magatartás figyelhető meg, amely egy akut (0-5. perc) és egy késői fázisból áll (20-45. perc). A korai fázis a nociceptorok közvetlen aktiválásából ered, míg a késői komponens a fokozatosan kialakuló gyulladás következménye (Tjolsen et al., 1992). A

18

kísérlet során a nocifenzív viselkedést a lábemelések illetve lábnyalások időtartama alapján értékelik. 2.4.2. Viszcerális kemonocicepció – „writhing”-teszt Irritáns anyagok (ecetsav, kaolin, fenilbenzokinon, stb.) intraperitoneális injekciója jellegzetes viselkedési választ vált ki egerekben, amellyel a viszcerális fájdalom modellezhető (Hendershot & Forsaith, 1959). A peritoneum irritációja a hasfal izomzatának defenzív összehúzódásához vezet, amelynek következtében az állat kísérletesen jól megfigyelhető, sajátos „vonagló” mozgást végez („writhing”), amelyben a hasizomzat görcsös összehúzódását a törzs és végtagok extenziója követi, melyet abdominális konstrikciónak is neveznek. A teszt az algogén anyag beadását követő meghatározott időintervallumban jelentkező „writhing” mozdulatok száma alapján értékelhető.

2.5. Krónikus neuropátia modellek A neuropátiás fájdalom krónikus, terápiásan nehezen befolyásolható állapotot jelent, melynek számos etiológiája lehet, így például traumás károsodás, diabetes mellitus, vírusfertőzés, krónikus alkohol abúzus, egyéb toxikus idegrendszeri károsodás. Az afferens idegek sérülése krónikusan fenntartja a hiperalgéziát, tehát a nociceptorok küszöbe csökken, nagyobb frekvenciájú kisüléssel reagálnak az ingerekre, és spontán aktivitást is mutatnak. A számos kóreredetnek megfelelően állatkísérletben is többféle módon válthatunk ki neuropátiás fájdalmat utánzó állapotokat. 2.5.1. Traumás mononeuropátia modell (Seltzer-modell) A n. ischiadicus egyoldali részleges lekötése után az érintett végtagon mechanikai hiperalgézia alakul ki (Seltzer et al., 1990; Malmberg et al., 1998). A műtét során a n. ischiadicus 1/3-1/2 részét atraumatikus varróanyaggal aláöltjük és szorosan lekötjük. Az állatokon a műtétet követően már néhány nap után megfigyelhető volt a végtag kímélése, kényszertartása. A 7. nap után szignifikáns mechanikai küszöbcsökkenés volt

19

mérhető. A hiperalgézia mértékét a műtétet megelőző küszöbhöz viszonyítva százalékban adtuk meg. 2.5.2. Streptozotocinnal kiváltott diabéteszes polineuropátia modell A streptozotocin szelektíven elpusztítja a pancreas β-sejtjeit, így a kezelést követő hetek során kísérletes diabetes mellitus alakul ki (Courteix et al., 1993). Az állatok általános állapota is fokozatosan romlik, és ezzel párhuzamosan szenzoros polineuropátia következtében mechanikai hiperalgézia is kialakul. Kontroll méréseket követően i.v. streptozotocinnal kezeltük az állatokat. Két héttel később a farokvénából vett vérmintákban megmértük a vér glükóz szintjét, és a továbbiakban csak azokkal az állatokkal folytattuk a kísérleteket, amelyeknél ez az érték 15 mmol/l feletti volt. A diabetes kialakulása után hetente mértük a mechanonociceptív küszöböt. A hiperalgézia mértékét a kezelést megelőző küszöbhöz viszonyítva százalékban adtuk meg. 2.5.3. Ciszplatinnal kiváltott toxikus polineuropátia modell A citosztatikus hatású ciszplatin kezelés mellékhatása lehet a perifériás idegrendszer károsodása, így alkalmas kísérletes toxikus eredetű polineuropátia kiváltására (Authier et al., 2003). Kontroll méréseket követően az állatokat 5 héten keresztül hetente háromszor kezeltük ciszplatinnal (2 mg/kg i.p., kumulatív dózis: 30 mg/kg). A mechanonociceptív küszöböt hetente mértük, ügyelve arra, hogy az ne essen egybe a kezelések napjával. A hiperalgézia mértékét a kezelést megelőző küszöbhöz viszonyítva százalékban adtuk meg.

20

Célkitűzések Kutatásaink a TRPV1 receptort expresszáló neuronokon található potenciális támadáspontok és az ezeken ható szerek in vivo vizsgálatára irányultak állatkísérletes nociceptív modellekben. A dolgozat négy különálló fejezetének konkrét célkitűzéseit a következőképpen lehet összefoglalni: I. A kapszaicin-érzékeny nociceptorokon expresszálódó cannabinoid receptorok (CB1 és CB2) aktivációja gátló hatást fejt ki a neuron működésére. Célunk volt megvizsgálni a szervezetben is előforduló cannabinoidok, az anandamid és palmitoil-etanolamid hatásait

a

TRPV1

receptor

stimulációval

kiváltott

szenzoros

neuropeptid

felszabadulásra és neuropátiás mechanikai hiperalgéziára. II. A TRPV1 receptor aktiváció révén felszabaduló endogén szomatosztatin hatásainak felderítése újabb perifériás támadáspont azonosítását jelentette, és ezzel utat nyitott szomatosztatin receptoron ható molekulák kifejlesztéséhez. Jelen kísérleteinkben a potens heptapeptid szomatosztatin receptor agonista TT-232 antinociceptív hatásait kívántuk vizsgálni. III. A TRPV1 receptor számos különböző fájdalmas stimulussal aktiválható, ezért fontos integrátormolekula a kapszaicin-érzékeny neuronok működésében. Célunk volt, hogy TRPV1 receptor génhiányos egerek segítségével megvizsgáljuk a receptor patofiziológiai szerepét különböző akut és krónikus nociceptív modellekben in vivo. IV. A nocicepció in vivo állatkísérletes vizsgálatához elengedhetetlen, hogy módszereinkkel

minél

megbízhatóbb

és

gyakorlati

szempontból

is

releváns

eredményeket nyerjünk, ezért egy új termonocicepciós vizsgálómódszer kifejlesztését is célul tűztük ki. Egy emelkedő hőmérsékletű vízfürdőt alkalmazva, amely alkalmasnak bizonyult patkányok nociceptív küszöbhőmérsékletének mérésére, kidolgoztunk egy hőtraumával kiváltott hiperalgézia modellt. A továbbiakban részletesen ismertetem a felvázolt négy fejezet kísérleteit, eredményeit és az azokból nyert következtetéseinket.

21

Kísérletes munka

22

I. Anandamid (arachidonil-etanolamid – AEA) és palmitoil-etanolamid (PEA) gátló hatása in vivo reziniferatoxinnal kiváltott neuropeptid felszabadulásra és neuropátiás mechanikai hiperalgéziára (Neuropeptides 2002, 36:467; Life Sci 2003, 73:2345-2353.)

I/1. Bevezetés Az anandamid (arachidonil-etanolamid, AEA) a cannabinoid receptorok – elsősorban a CB1 receptor – endogén ligandja. A CB1 receptorok megtalálhatók a központi idegrendszerben és a periférián egyaránt (Pertwee, 2001), és aktivációjuk révén az anandamid gátolja a depolarizáció hatására történő neurotranszmitter felszabadulást (Vaughan et al., 2000). Az AEA számos különböző in vivo állatkísérletes modellben antinociceptív hatásúnak bizonyult és csökkentette a gyulladásos hő- és mechanikai hiperalgéziát is (Calignano et al., 1998; Jaggar et al., 1998; Richardson et al., 1998; Farquhar-Smith et al., 2002). A palmitoil-etanolamid (PEA) – egy másik, a szervezetben előforduló cannabinoid ligand – szintén hatásos volt több nociceptív tesztben (Calignano et al., 1998, 2001; Jaggar et al., 1998; Farquhar-Smith et al., 2002). A PEA feltehetően egy perifériás CB2-szerű receptoron fejti ki hatását, mivel in vitro ugyan nem kötődik a CB2 receptorokhoz, de hatásai CB2 receptor antagonistákkal kivédhetők (Calignano et al., 1998; 2001). Az anandamid a TRPV1 receptorokat is képes aktiválni in vitro (Zygmunt et al., 1999; Smart et al., 2000), azonban ezen tulajdonságának in vivo szerepe és jelentősége vita tárgyát képezi. A vita alapját az adja, hogy a CB1 és TRPV1 receptorok ugyanazokon a kis méretű neuronokon expresszálódnak (Ahluwalia et al., 2000), és a TRPV1 receptor aktivációhoz szükséges anandamid koncentráció nagyságrendekkel nagyobb, mint ami ahhoz kell, hogy a CB1 receptorokon keresztül gátolja a szenzoros neuronok aktivációját (Szolcsányi, 2000a,b). A célkitűzésünk az volt, hogy újabb eredményeket nyerjünk az anandamid és a palmitoil-etanolamid in vivo hatásairól patkányokban. Megvizsgáltuk, hogy hogyan befolyásolják a bazális CGRP és szomatosztatin plazmakoncentrációkat valamint ugyanezen neuropeptidek TRPV1 receptor agonista reziniferatoxinnal stimulált

23

felszabadulását. A kísérletsorozat másik részében pedig a neuropátiás mechanikai hiperalgéziára kifejtett hatásukat mértük éber állatokon.

I/2. Módszerek I/2.1. Plazma CGRP és szomatosztatin koncentrációk mérése Hím Wistar patkányokat 12 órás éheztetés után Na-tiopentállal altattunk (Trapanal, 100 mg/kg i.p.). A farokvénát és a jobb oldali a. carotist kanüláltuk i.v. anyagadásra illetve artériás vérminta nyerésére. A szenzoros neuropeptid felszabadulás kiváltásához szükséges reziniferatoxin (RTX) dózisának megválasztásához dózis-hatás görbét vettünk fel (0,1-3 µg/kg i.v.), majd a további kísérletekben a kiszámított ED50-et használtuk (0,6 µg/kg i.v.). Az állatokat az RTX beadása előtt 5 perccel kezeltük elő AEA és PEA különböző dózisaival (10 vagy 100 µg/kg i.v.). Az artériás vérmintákat 5 perccel az RTX injekció után vettük le jégen tartott csövekbe, amelyekbe előzőleg EDTA-t (8 mg) és Trasylolt (1250 U) mértünk be. A mintákat ezután lecentrifugáltuk (2200 rpm 10 percig 4°C-on), majd a peptideket a plazmából háromszoros térfogatú abszolút alkohollal extraháltuk. Precipitáció után ismételt centrifugálást követően a mintákat nitrogén alatt beszárítottuk. A plazmából az intézetünkben kifejlesztett, rendkívül érzékeny radioimmunoassay (RIA) módszerekkel határoztuk meg a CGRP (Németh et al., 1996) valamint a szomatosztatin koncentrációkat (Németh et al., 1998). I/2.2. Részleges n. ischiadicus sérülést követő (traumás) neuropátiás mechanikai hiperalgézia vizsgálata (Seltzer-modell) Hím Sprague-Dawley patkányok (180-250 g) mechanikai fájdalomküszöbét RandallSelitto módszerrel határoztuk meg. A neuropátia kiváltásához Na-pentobarbitál altatásban (Nembutal, 50 mg/kg i.p.) az egyik oldali n. ischiadicust a combon kipreparáltuk, és az ideg 1/3-1/2 részét atraumatikus varróanyaggal (Ethicone 6/0) aláöltöttük és szorosan lekötöttük, majd a sebet zártuk (Seltzer et al., 1990). A műtétet követő 8. napon újabb küszöbméréseket végeztünk, hogy meggyőződjünk a hiperalgézia kialakulásáról. Ezután az állatokat AEA vagy PEA injekcióval kezeltük (100 µg/kg i.p.) 24

és 30 perccel később ismételtük a mérést. CB1 és/vagy CB2 receptor antagonistát (SR141716A ill. SR144528, 3 mg/kg i.p.) 30 perccel az AEA vagy PEA kezelés előtt adtunk. A küszöbcsökkenéseket a műtét előtti küszöbökhöz viszonyítva százalékosan fejeztük ki. Kontroll csoportként minden esetben szolvenssel kezelt állatokat használtunk.

I/3. Eredmények

I/3.1. AEA és PEA hatása a plazma CGRP és szomatosztatin koncentrációkra Az intravénás RTX (0,1-3 µg/kg i.v.) dózisfüggően megemelte a plazma CGRP és szomatosztatin koncentrációját, a maximális növekedés 5,8-szoros illetve 22,3-szoros volt. Az RTX ED50-e 0,6 µg/kg i.v. volt, ami 3,1-szeres CGRP koncentráció, illetve 10,7-szeres szomatosztatin koncentráció emelkedést váltott ki (I/1.ábra). A neuropeptidek bazális plazmakoncentrációját sem az AEA, sem a PEA (100 µg/kg i.v.) kezelés nem befolyásolta. Az RTX kezeléssel kiváltott CGRP- és szomatosztatinszint emelkedést az AEA dózisfüggően csökkentette, és ezt a hatást a CB1-receptor antagonista SR141617A előkezelés (100 µg/kg i.v.) gátolta. Hasonlóképpen a PEA is dózisfüggően csökkentette az RTX-indukálta szenzoros neuropeptid felszabadulást (I/2. ábra).

25

I/1. ábra: Plazma CGRP és szomatosztatin (SOM) koncentrációk változása szisztémás RTX kezelés után 5 perccel. Az adatok 6-6 eredmény átlaga ± SEM. A csillagok a statisztikailag szignifikáns különbséget mutatják a kezeletlen kontrollhoz képest (Mann-Whitney U-teszt, p<0,05).

I/2. ábra: AEA és PEA hatása a CGRP és a szomatosztatin bazális plazmakoncentrációira illetve az RTX injekcióval kiváltott peptidfelszabadulásra. A zárójelben feltüntetett értékek a µg/kg i.v. dózist jelölik. A 7. oszloppár a CB1 receptor antagonista SR141716A előkezelés (100 µg/kg i.v.) utáni AEA hatást mutatja. Az adatok 6-6 eredmény átlaga ± SEM. A csillagok a bazális értékhez, míg a kettős keresztek az RTX-indukált peptidfelszabaduláshoz viszonyított statisztikailag szignifikáns különbséget mutatják (Mann-Whitney U-teszt, p<0,05).

26

I/3.2. AEA és PEA hatása a n. ischiadicus részleges lézióját követő neuropátiás mechanikai hiperalgéziára A n. ischiadicus részleges lekötése után 7 nappal az állatok mechanonociceptív küszöbe szignifikánsan, 29,7 ± 0,6%-kal csökkent. AEA kezelés (100 µg/kg i.p.) 30 perccel később teljesen megszüntette a hiperalgéziát. A CB1-receptor antagonista SR141617A előkezelés (3 mg/kg i.p.) önmagában 37,1%-kal fokozta a hiperalgéziát és az ezt követő AEA kezelés antihiperalgetikus hatását teljesen kivédte. A PEA kezelés (100 µg/kg i.p.) 79,4%-kal csökkentette a mechanikai hiperalgéziát, és ezt a hatást a CB2-receptor antagonista SR144528 (3 mg/kg i.p.) meggátolta. A CB1receptor antagonistához hasonlóan ez a vegyület is fokozta a küszöbcsökkenést 47,5 %kal. A két antagonista együttes adásakor azonban a hiperalgéziát súlyosbító hatásuk nem adódott össze (I/3. ábra).

I/3. ábra: AEA és PEA hatása a részleges n. ischiadicus lekötés után 7 nappal kialakuló mechanikai hiperalgéziára. A mechanonociceptív küszöb százalékos csökkenését a műtét előtti kontrollokhoz viszonyítottuk. Az adatok 6-6 eredmény átlaga ± SEM. Az üres oszlopok a kezelés előtti, míg a fekete oszlopok az AEA vagy PEA (100 µg/kg i.p.) illetve szolvenseik injekciója utáni értékeket jelölik. Az átlósan csíkozott oszlopokkal a CB1 receptor antagonista SR141716A és/vagy CB2 receptor antagonista SR144528 (3 mg/kg i.p.) előkezelés után 30 perccel mért eredményeket ábrázoltuk. A csillagok az oldószerrel kezelt kontroll csoportokhoz viszonyított statisztikailag szignifikáns különbséget mutatják (Mann-Whitney U-teszt, p<0,05).

27

I/4. Megbeszélés és következtetések Eredményeink igazolták, hogy mind az anandamid (AEA), mind a palmitoil-etanolamid (PEA) gátolta a TRPV1 receptor agonista RTX injekciójával kiváltott szenzoros neuropeptid felszabadulást in vivo, CB1 illetve egy CB2-szerű receptoron keresztül, miközben a plazma bazális CGRP és szomatosztatin koncentrációját nem befolyásolták. Az AEA potenciális TRPV1 receptor aktiváló hatását feltehetően ellensúlyozza az, hogy ugyanazon a végződésen sokkal nagyobb affinitással képes a CB1 receptorokhoz kötődni, és azokat aktiválni. Izolált artériákon kimutatták ugyan, hogy az anandamid TRPV1 receptoron keresztül CGRP felszabadulást váltott ki (Zygmunt et al., 1999), azonban lehetséges, hogy a vizsgált érszakaszok CB1 receptor sűrűsége túl alacsony volt a gátló hatás megjelenéséhez. Az idegsérülést követő neuropátiás hiperalgézia kialakulásához hozzájárulhat az, hogy az épen maradó primer afferensek sejttestében növekszik a TRPV1 receptor illetve a neuropeptidek expressziója (Fukuoka et al., 1998; Hudson et al., 2001). Mindkét cannabinoid agonista hatékonyan csökkentette a traumás neuropátiás mechanikai hiperalgéziát is, szintén CB1 illetve CB2-szerű receptor aktivációja révén. Ennek egyik lehetséges mechanizmusa, hogy képesek csökkenteni a kapszaicin-érzékeny primer afferensekből a szenzoros neuropeptidek felszabadulását. A CB1 ill. CB2 receptor antagonisták külön-külön és kombinációban is súlyosbították a mechanikai hiperalgéziát, ami arra utal, hogy az endocannabinoidok tónusos gátló hatást fejtenek ki neuropátiában és így mérséklik a hiperalgéziát. Ezt az elméletet támasztja alá az is, hogy idegsérülést követően a thalamusban CB1 receptorok upregulációja volt kimutatható (Siegling et al., 2001). Az endocannabinoidok lokális felszabadulása szövetsérülés esetén is szerepet játszhat a nociceptorok aktivációjának kontrolljában (Calignano et al., 1998), mivel a CB1 ill. CB2 receptor antagonisták súlyosbítják az intraplantáris formalin injekcióra adott nocifenzív válaszreakciót. Következtetésképpen, a cannabinoid receptor agonisták – különösen a centrális hatásoktól mentes szelektív CB2 receptor agonisták – új terápiás lehetőséget jelentenek a nehezen csillapítható neuropátiás fájdalom kezelésében.

28

II. A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232 analgetikus hatása akut kémiai és termális nociceptív tesztekben és streptozotocinnal kiváltott diabéteszes mechanikai allodyniában (Br J Pharmacol 2003, 138 Proc Suppl 218P; Eur J Pharmacol 2004, 498:103-109.)

II/1. Bevezetés A neurofarmakológiai kutatásban szemléletváltozást hozott az a felfedezés, hogy a kapszaicin-érzékeny idegekből stimuláció hatására felszabaduló szomatosztatin a keringésbe bejutva szisztémás gyulladásgátló és antinociceptív hatást tud kifejteni (Szolcsányi et al., 1998a,b; Helyes et al., 2000; Thán et al., 2000). Ez lehetővé teszi új, perifériás támadáspontú gyulladásgátló és fájdalomcsillapító gyógyszerek kifejlesztését. Az új támadáspont jelentőségét az is adja, hogy a hagyományos nem-szteroid gyulladásgátló szerek a neurogén gyulladást nem voltak képesek befolyásolni (JancsóGábor & Szolcsányi, 1970). Ismert volt már korábban is, hogy az exogén szomatosztatin képes csökkenteni a neurogén gyulladást és analgetikus hatással is rendelkezik (Lembeck et al. 1982; Chrubasik, 1991; Fioravanti et al., 1995; Matucci-Cerinic et al., 1995; Corsi et al., 1997). A natív szomatosztatin viszont nem alkalmas arra, hogy ilyen indikációval a terápiában alkalmazzák, mivel széles körű élettani hatásai révén a szervezetben befolyásol számos egyéb, endokrin és gasztrointesztinális funkciót, valamint plazma féléletideje is igen rövid (T1/2= 3 min). A szomatosztatin receptorok (sst) élettani funkciójuk és ligandkötő sajátosságaik alapján két csoportba sorolhatók, így a SRIF1 csoportba tartozik a sst2, az sst3 és az sst5, míg a SRIF2 csoportba a sst1 és sst4 (Hoyer et al., 1995). Az utóbbi receptorok endokrin hatásokat nem közvetítenek, azonban szenzoros neuronokon expresszálódnak, ezért potenciális szelektív támadáspontot jelenthetnek. Intézetünkben az elmúlt években endokrin mellékhatásoktól mentes stabil szomatosztatin analóg molekulák hatásainak vizsgálata kezdődött meg. Az MTA Peptidbiokémiai Kutatócsoportja által szintetizált heptapeptid

TT-232

(D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH2),

amely

potens

antiproliferatív hatással rendelkezik, a növekedési hormon illetve a gasztrin szekrécióját nem befolyásolta (Kéri et al., 1996). A TT-232 hatékonyan csökkentette a szenzoros 29

neuropeptidek felszabadulását in vivo, és több modellben potensen gátolta a kapszaicinnel vagy mustárolajjal keltett neurogén gyulladást, valamint a dextránnal, carrageninnel vagy bradikininnel kiváltott nem-neurogén gyulladásos folyamatokat (Helyes et al., 2001; Pintér et al., 2002). A rheumatoid arthriritist modellező komplett Freund adjuváns (CFA) kezelés következtében kialakuló ízületi duzzanatot és mechanikai hiperalgéziát egyaránt dózisfüggően mérsékelte (Helyes et al., 2004), és a traumás neuropátiás hiperalgézia modellben is hatásosnak bizonyult (Pintér et al., 2002). Jelen kísérleteink célja az volt, hogy megvizsgáljuk a TT-232 antinociceptív és antihiperalgetikus hatását több különböző modellben, így fájdalmas kémiai, hő- és mechanikai ingereken alapuló nociceptív tesztekben egyaránt.

II/2. Módszerek II/2.1. Formalin-teszt Hím Wistar patkányokon (180-220 g) formalin intraplantáris injekciójával (2,5 %, 50 µl i.pl.) váltottunk ki nocifenzív reakciót. A TT-232 különböző dózisait (20-80 µg/kg) 30 perccel a formalin előtt adtuk intraperitoneálisan (0,1 ml/100 g i.p.), és a szer hatását egy szolvenssel kezelt kontroll csoporthoz viszonyítottuk. A spontán elhárító magatartás kvantitatív értékelése a következő képlet alapján történt: (2x a lábnyalások időtartama + 1x a lábemelések időtartama)/a megfigyelés ideje (Composite Pain Score – CPS; Watson et al., 1997). II/2.2. Fenilkinonnal kiváltott abdominális konstrikció (“writhing”-teszt) Hím Balb/c egereken intraperitoneális fenilkinon injekcióval (0,02 %, 0,2 ml) váltottunk ki fájdalomreakciót. A TT-232-t 30 perccel korábban szubkután adtuk be (5-200 µg/kg s.c.). A fenilkinon injekciót követő 20 percben számoltuk az abdominális konstrikciók számát és az eredményeket egy szolvenssel kezelt csoporthoz viszonyítottuk.

30

II/2.3. Nociceptív hőküszöb és reziniferatoxinnal kiváltott termális hiperalgézia mérése Nőstény Wistar patkányok (140-180 g) nociceptív hőküszöbét emelkedő hőmérsékletű forró lappal határoztuk meg. Kontroll méréseket követően TT-232-vel kezeltük az állatokat (10-200 µg/kg i.p.), majd 30 perccel később ismételt méréseket végeztünk és az

eredményeket

kísérletsorozatban

a

kezelés

termális

előtti

küszöbhöz

hiperalgéziát

váltottunk

viszonyítottuk. ki

Egy

másik

reziniferatoxin

(RTX)

intraplantáris injekciójával (0,05 nmol i.pl.), és 5, 10, 15 és 20 perccel ezután ismételtük a méréseket. A TT-232 különböző dózisait (5-100 µg/kg i.p.) 10 perccel az RTX előtt adtuk be. A csoport egyik felét minden esetben szolvenssel kezeltük, így az eredményeket az aktuális kontroll csoporthoz tudtuk viszonyítani. II/2.4. Diabéteszes neuropátiás mechanikai allodynia mérése Hím Wistar patkányokban (180-210 g) 50 mg/kg i.v. streptozotocinnal váltottunk ki kísérletes diabetes mellitust. Két héttel később a farokvénából vett vérminták glükózszintjét Accu-Check glükométerrel (Roche) határoztuk meg és a továbbiakban csak azokkal az állatokkal folytattuk a kísérleteket, amelyeknél ez az érték 15 mmol/l feletti volt. A mechanonociceptív küszöböt dinamikus plantáris eszteziométerrel mértük (Ugo Basile). A diabetes kialakulását követően hetente mértük a küszöböket addig, amíg a mechanikai allodynia ki nem alakult. A küszöbcsökkenés mértékét a kezelést megelőző küszöbhöz viszonyítva százalékban adtuk meg.

31

II/3. Eredmények II/3.1. TT-232 hatása a formalinnal kiváltott nocifenzív reakcióra Az intraplantáris formalin injekcióval keltett nocifenzív reakció első fázisát a CPS értékelése alapján csak a 80 µg/kg i.p. dózis csökkentette szignifikánsan. A második fázisban a TT-232 harang alakú dózis-hatás görbét eredményezett, miután a 40 és 80 µg/kg i.p. dózisoknak szignifikáns antinociceptív hatása volt, de a 160 µg/kg már nem csökkentette a CPS-t. A referencia-vegyületként alkalmazott diclofenac a második fázisban csak az 50 mg/kg i.p. dózisban gátolta szignifikánsan a nocifenzív magatartást (II/1. ábra).

II/1. ábra: TT-232 illetve diclofenac, mint referenciaanyag i.p. injekcióinak hatása az intraplantáris formalin injekcióval kiváltott nocifenzív reakcióra patkányon. Az adatok 9-10 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A Composite Pain Score-t a következő képlet alapján számoltuk: (2x lábnyalások időtartama + 1x lábemelések időtartama) /megfigyelési idő. A csillagok a szolvenssel kezelt csoporthoz viszonyított statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik (Mann-Whitney U-teszt, * p<0,05, ** p<0,01).

32

II/3.2. TT-232 hatása a fenilkinonnal kiváltott abdominális konstrikcióra A TT-232-előkezelés (10-200 µg/kg s.c.) képes volt szignifikánsan csökkenteni a fenilkinon i.p. injekciót követő „writhing” mozdulatok számát, azonban dózis-hatás összefüggést nem állapíthattunk meg. A 20 és 200 µg/kg dózisok eredményezték a legnagyobb mértékű gátlást (70 illetve 75 %-os csökkenés), míg a köztes dózisok harang alakú dózis-hatás görbét eredményeztek, a formalin-tesztben tapasztaltakhoz hasonlóan (II/2. ábra).

II/2. ábra: TT-232 kezelés (sc.) hatása a fenilkinonnal kiváltott viszcerális kemonocicepcióra egéren. Az adatok 9-10 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A csillagok a szolvenssel kezelt csoporthoz viszonyított statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik (Mann-Whitney U-teszt, * p<0,05, ** p<0,01).

II/3.3. TT-232 hatása a nociceptív hőküszöbre és a reziniferatoxinnal kiváltott termális hiperalgéziára A patkányok kontroll hőküszöbe 44,5 ± 0,2 °C volt. A TT-232 szignifikánsan megemelte a nociceptív hőküszöböt a 20-200 µg/kg-os dózistartományban, azonban

33

egyértelmű dózis-hatás összefüggést ebben a tesztben sem nyertünk. A maximális küszöbemelkedést (1,48 ± 0,4 °C) a 200 µg/kg i.p. dózis eredményezte (II/3. ábra, bal panel). A reziniferatoxin intraplantáris injekciója 7,39 ± 1,3 °C-os hőküszöbcsökkenést váltott ki 5 perccel a beadás után. A TT-232 előkezelés szignifikánsan csökkentette a küszöbesést a 10-50 µg/kg i.p. közötti dózisokban, azonban az ennél magasabb, 100 µg/kg-os dózis hatása már nem volt szignifikáns (II/3. ábra, jobb panel).

II/3. ábra: TT-232 (i.p.) hatása a nociceptív hőküszöbre (A) és az intraplantáris RTX injekcióval kiváltott termális allodyniára (B) patkányon. Az adatok 8-12 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A csillagok a statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik. A hőküszöbemelő hatás esetében az eredményeket a kezelés előtti kontroll értékekhez viszonyítottuk (egymintás t-teszt, *p<0,05), míg a hőallodynia gátlását az RTX injekció utáni 5. percben mért hőküszöbcsökkenések alapján számítottuk ki (kétmintás t-teszt, *p<0,05).

II/3.4. TT-232 hatása a diabéteszes neuropátiás mechanikai allodyniára A streptozotocin kezelés után az állatokban a diabetes mellitus jellegzetes tünetei alakultak ki: polyuria, polydypsia, polyphagia, valamint növekedésük is lelassult. Két

34

héttel a kezelés után minden állatban kifejlődött a diabetes; vércukorszintjük 23,6 ± 2,8 mmol/l, inzulinszintjük 8,48 ± 0,2 µIU/ml volt. A további vizsgálatokból egyetlen patkányt sem kellett kizárni rossz általános állapota miatt. A mechanonociceptív küszöb 5 héttel a kezelés után 28,6 ± 3,1%-kal csökkent. A TT232 szignifikánsan csökkentette a mechanikai allodyniát 10, 20 és 100 µg/kg-os dózisokban, melyek közül a 20 µg/kg fejtette ki a maximális, 54 %-os gátlást (II/4. ábra). Egészséges patkányokban a TT-232 20 µg/kg-os dózisa nem befolyásolta a mechanikai küszöböt.

II/4. ábra: TT-232 (i.p.) hatása a streptozotocinnal kiváltott diabéteszes neuropátiás mechanikai allodyniára. A mechanonociceptív küszöb változását a streptozotocin kezelés előtti kontrollhoz viszonyítottuk. Az adatok 6-9 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A csillagok a szolvenssel kezelt csoporthoz viszonyított statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik (Mann-Whitney U-teszt, * p<0,05, ** p<0,01).

35

II/4. Megbeszélés és következtetések Eredményeink igazolták, hogy a perifériás támadáspontú szomatosztatin receptor agonista TT-232 kifejezett analgetikus hatással rendelkezik különböző módon kiváltott nociceptív folyamatokban, patkányokon és egereken egyaránt. A hagyományos kemonocicepciós

tesztekben,

az

újonnan

kifejlesztett

termonocicepciós

vizsgálómódszerrel, és a diabéteszes neuropátiás modellben igen alacsony dózisok hatása kimutatható volt. A TT-232 a formalin tesztben a diclofenachoz képest mintegy 1000-szer, a két termonocicepciós tesztben pedig, korábbi eredményeinkkel összevetve (Almási et al., 2003), mind a morfinnál, mind a diclofenacnál körülbelül 300-szor potensebbnek bizonyult. A formalin teszt első fázisa a nociceptorok közvetlen stimulációjának következménye, míg a második a fokozatosan kialakuló gyulladás következménye (Tjolsen et al., 1992). A TT-232 mindkét fázisban képes volt csökkenteni a nocifenzív viselkedést, ami arra utal, hogy képes a nociceptorok aktivációját, valamint a gyulladás által létrehozott szenzibilizációt is csökkenteni. Hasonlóképpen, a termonocicepciós tesztekben egyaránt gátló hatású volt a kezeletlen állatok fájdalmas hőingerrel kiváltott reakciójára és a TRPV1

receptor

agonistával

előidézett

termális

hiperalgéziára.

Ezekkel

az

eredményekkel összhangban áll, hogy egy rost preparátumokon az oktapeptid szomatosztatin analóg octreotid képes csökkenteni a fájdalmas hőingerrel kiváltott nociceptorkisülést, és a bradikininnel keltett termális szenzibilizációt is (Carlton et al., 2001a,b). A TT-232 gyulladásgátló hatása döntően a Gi-proteinhez kötött sst-receptorokon keresztül jön létre (Pintér et al., 2002), antiproliferatív hatása azonban elsősorban tirozin-kináz

gátlás

következménye

(Kéri

et

al.,

1996).

Antinociceptív

és

antihiperalgetikus hatásában mindkét folyamatnak lehet szerepe. A sst-receptorokhoz kötött Gi-protein aktiváció következtében csökkentheti a nociceptorok ingerelhetőségét és a transzmitterfelszabadulást (Weckbecker et al., 2003). Ismert azonban az is, hogy a szövetsérülés hatására felszabaduló idegnövekedési faktor (nerve growth factor – NGF) tirozin-kinázhoz kötött receptorához (trkA) kötődve képes a kapszaicin-érzékeny nociceptorokat szenzibilizálni illetve hiperalgéziát kiváltani (Lewin et al., 1993; Shu & Mendell, 1999; 2001; Galoyan et al., 2003), ezért nem zárható ki, hogy a tirozin-kináz gátlásnak is hozzájárul az antinociceptív hatáshoz. 36

Különböző szomatosztatin receptor agonisták szintén analgetikus hatásúnak bizonyultak in vivo (Eschalier et al., 1991; Betoin et al., 1994; Carlton et al., 2001a). A TT-232 előnyét az jelenti, hogy támadáspontja szelektív, elsősorban a sst4-receptoron keresztül hat (Helyes et al., 2005), tehát mentes a szomatosztatin széles hatásspektrumából adódó számos mellékhatástól. A mellékhatásokat csökkenti az is, hogy a vér-agy gáton nem jut át (preklininkai dokumentáció), tehát támadáspontja kizárólag a periférián található. Ez utóbbi azért is fontos, mivel azt is kimutatták, hogy intratekális szomatosztatin kezelés neurotoxikus hatású lehet (Gaumann & Yaksh, 1988; Mollenholt et al., 1988). A TT-232 gyulladásgátló hatása dózisfüggőnek bizonyult (Helyes et al., 2001; Pintér et al., 2002; Helyes et al., 2004), azonban a nociceptív vizsgálatok többször is harang alakú dózis-hatás görbét eredményeztek. Az ennek hátterében álló mechanizmusok tisztázása további vizsgálatokat tesz szükségessé. Ennek ellenére megállapíthatjuk, hogy miután a TT-232 széles analgetikus spektrummal rendelkezik, amely magába foglalja a nehezen kezelhető neuropátiás fájdalomállapotokat is, ígéretes új analgetikumjelöltnek tekinthető.

37

III. A TRPV1 receptor szerepének vizsgálata akut és krónikus nociceptív modellekben génhiányos egerek segítségével (Pain 2005, 117:368-376.)

III/1. Bevezetés A TRPV1 receptort expresszáló polimodális nociceptorok funkcióinak vizsgálata a kapszaicin szelektív izgató és ezt követő blokkoló hatásának megfigyelésével kezdődött meg. A nagy dózisú kapszaicin kezelés által kiváltott szelektív szenzoros neuron blokkolás, azaz deszenzibilizáció, az egész végződés válaszképtelenségéhez vezet, vagyis a nociceptor semmilyen stimulusra sem reagál. A többi afferens rost működését viszont nem befolyásolja, tehát az egyéb érző funkciók nem károsodnak (Szolcsányi, 1977). A kapszaicin deszenzibilizáló hatásának vizsgálatával azonban kizárólag a teljes rost működéséről nyerhetünk információt, a kapszaicin TRPV1 receptor izolált szerepéről nem. A receptor antagonisták, mint például a kapszazepin (Bevan et al., 1992), ruténium vörös (Maggi et al., 1988; Amman & Maggi, 1991), jodo-reziniferatoxin (Wahl et al., 2001) új lehetőséget jelentettek. Alkalmazásukat megnehezíti viszont, hogy nem eléggé szelektívek (Docherty et al., 1997; Liu & Simon, 1997) és in vivo nem mindig hatékonyak (Jakab et al., 2005), továbbá a jodo-reziniferatoxin agonista hatásokat is kiválthat, ha a szervezetben reziniferatoxinná alakul. A receptor klónozása után nyert igazolást, hogy a receptort a fájdalmas hőingerek és az alacsony pH közvetlenül képesek aktiválni, valamint központi szerepe van a nociceptort érő fájdalmas stimulusok integrálásában is (Caterina et al., 1997; Tominaga et al., 1998). A klónozást követően vált lehetővé TRPV1 receptor génhiányos egerek előállítása és vizsgálata in vivo modellekben (Davis et al., 2000; Caterina et al., 2000). Az eredmények azt igazolták, hogy a kezeletlen génhiányos állatok hőküszöbe nem különbözött a vad típusú egerekétől, ami meglepő volt annak ismeretében, hogy a kapszaicinnel deszenzibilizált állatok fájdalmas hőérzete csökken (Szolcsányi, 1985; Szolcsányi, 1987). Gyulladásos termális hiperalgézia viszont nem alakult ki a receptor hiányában, ami arra utal, hogy a nociceptorok hőszenzibilizációja a TRPV1 receptor közvetítésével jön létre. 38

Jelen kísérleteink célja az volt, hogy újabb adatokat nyerjünk a receptor in vivo funkcióiról, ezért egyéb akut nociceptív modellekben, valamint hosszabb távú vizsgálatok során krónikus polineuropátiás állapotokban hasonlítottuk össze a TRPV1 receptor génhiányos egereket vad típusú társaikkal.

III/2. Módszerek Állatok A kísérletekben TRPV1 génhiányos (TRPV1-/-) illetve vad típusú egereket (TRPV1+/+) használtunk, melyeket a PTE Központi Állatkísérleti Laboratóriumában tenyésztettek. A tenyészetet két heterozigóta (TRPV1+/-) párból kiindulva hozták létre, amelyeket John B. Davis-től (GlaxoSmithKline, Harlow, UK) kaptunk ajándékba. Az első generációs utódok közül a homozigóta egyedek Southern blot és polimeráz láncreakció (PCR) segítségével kerültek kiválogatásra, amelyekből ezután homozigóta TRPV1-/- és TRPV1+/+ tenyészetet építettek fel. III/2.1. Forbolészterrel kiváltott akut kemonocicepció vizsgálata (PMA-teszt) A protein kináz C (PKC) aktivátor forbolészter, forbol 12-mirisztát 13-acetát (PMA, 10 µg/ml, 20 µl) intraplantáris injekciójával váltottunk ki nocifenzív reakciót, amelyet a beadást követő 45 percen keresztül figyeltünk meg. A kvantitatív értékeléshez a lábnyalással és lábemeléssel eltöltött időt mértük meg. III/2.2. Formalin-teszt Formalin (2,5 %, 20 µl) intraplantáris injekciójával váltottunk ki nocifenzív reakciót, ami két fázisban zajlik: az első fázis a 0-5. percig, míg a második fázis a 20-45. percig tart. A kvantitatív értékeléshez a lábnyalással és lábemeléssel eltöltött időt mértük meg.

39

III/2.3. Hőtraumával kiváltott hő- és mechanikai hiperalgézia vizsgálata Az egerek nociceptív hőküszöbét emelkedő hőmérsékletű forró lappal mértük meg (IITC Life Science), egy másik kísérleti csoportban pedig a mechanonociceptív küszöböt mértük dinamikus plantáris eszteziométerrel (Ugo Basile). Kontroll méréseket követően az állatok egyik hátsó lábát éteres anesztéziában 51 °C-os vízfürdőbe mártottuk 15 másodpercre, majd ismételt méréseket végeztünk. A hőküszöb változását abszolút értékben, míg a mechanikai küszöb csökkenését a kontroll küszöbhöz viszonyított százalékos arányban fejeztük ki. III/2.4. Intraplantáris carrageninnel kiváltott gyulladásos mechanikai hiperalgézia vizsgálata Az állatok mechanonociceptív küszöbét eszteziométerrel mértük, majd carragenin (3 %, 100 µl) intraplantáris injekciójával gyulladást idéztünk elő az egyik hátsó végtagon. A küszöböket 3 óra múlva mértük meg újra, és a hiperalgéziát a kontroll küszöbhöz viszonyított százalékos csökkenés arányában fejeztük ki. III/2.5. Streptozotocinnal kiváltott diabéteszes polineuropátia A kísérletes diabetes mellitust streptozotocin kezeléssel (STZ, 250 mg/kg i.v.) hoztuk létre. 2 héttel később a farokvénából vett vérminták glükóz-szintjét Accu-Check glükométerrel (Roche) határoztuk meg és a további méréseket csak azokon az állatokon végeztük el, amelyeknél ez az érték 15 mmol/l feletti volt. A mechanonociceptív küszöböket eszteziométerrel mértük, és a hiperalgéziát a kezelést megelőző értékhez viszonyított százalékos változásban fejeztük ki. III/2.6. Ciszplatinnal kiváltott toxikus neuropátia Az egereket 5 héten keresztül hetente háromszor oltottuk ciszplatinnal (2 mg/kg i.p., kumulatív dózis 30 mg/kg). A mechanonociceptív küszöböket eszteziométerrel mértük, és a hiperalgéziát a kezelést megelőző értékhez viszonyított százalékos változásban fejeztük ki. A mérések és a kezelések különböző napokon történtek, hogy az akut hatások ne befolyásolják a küszöb meghatározását. 40

III/2.7. Részleges n. ischiadicus lézióval létrehozott traumás mononeuropátia Az egereket ketamin-xilazin (Calypsol, 100 mg/kg – Xylavet, 5 mg/kg i.p.) kombinációval altattuk. Operációs mikroszkóp segítségével a combon kipreparáltuk a n. ischiadicust és atraumatikus varróanyaggal (Ethicon 9/0) az ideg 1/3-1/2 részét aláöltöttük és lekötöttük, majd a sebet zártuk. A mechanonociceptív küszöböket eszteziométerrel mértük a műtétet megelőzően, a műtét után pedig 7 nap gyógyulást követően kezdtük újra a méréseket. A hiperalgéziát a kontroll küszöbhöz viszonyított százalékos csökkenés arányában fejeztük ki. III/2.8. Plazma szomatosztatin koncentrációk mérése a krónikus polineuropátia modellekben A

krónikus

polineuropátia

modellekben

az

intézetünkben

kifejlesztett

radioimmunoassay (RIA) módszerrel határoztuk meg a plazma szomatosztatin koncentrációit (Németh et al., 1996). A mintavétel időpontját a szerint választottuk ki, hogy a korábbi mérések alapján melyik időszakban volt legnagyobb különbség a két egércsoport eredményei között. Az állatokat egy éjszakán keresztül éheztettük, hogy a gasztrointesztinális szomatosztatin felszabadulás minimális legyen. Altatásban artériás vérmintákat gyűjtöttünk (0,8-1 ml egerenként) jégen tartott csövekbe, amelyekbe előzőleg EDTA-t (2 mg) és Trasylolt (350 U) mértünk be. A mintákat ezután lecentrifugáltuk (2200 rpm 10 percig 4°C-on), majd a peptidet a plazmából ötszörös térfogatú abszolút alkohollal extraháltuk. Precipitáció után ismételt centrifugálást követően a mintákat nitrogén alatt beszárítottuk, és a RIA mérés előtt pufferben oldottuk vissza.

III/3. Eredmények III/3.1. PMA-teszt A vad típusú (TRPV1+/+) egerekben a PMA injekciója akut nocifenzív reakciót váltott ki (lábnyalás és lábemelés), ami a beadást követő 5-45. percig tartott. A lábnyalások és lábemelések összes időtartama 669,2 ± 170,8 sec volt. A TRPV1 receptor génhiányos 41

(TRPV1-/-) állatokban a PMA nem váltott ki fájdalomreakciót, vagyis annak időtartama nem különbözött szignifikánsan a szolvenssel kezelt csoporthoz képest (16,8 ± 8 sec illetve 20,2 ± 10,3 sec, III/1. ábra).

III/1. ábra: Forbol 12-mirisztát 13-acetát (PMA) i.pl. injekciójával kiváltott nocifenzív reakció vad típusú (TRPV1+/+) és TRPV1 receptor génhiányos (TRPV1-/-) egerekben, amelyet az injekció utáni 5-45. percben a lábemelések és lábnyalások időtartama alapján értékeltünk. Az adatok 9-12 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A csillagok a két csoport közötti statisztikailag szignifikáns különbséget jelölik (Mann-Whitney U-teszt, *** p<0,001).

III/3.2. Formalin-teszt A formalin intraplantáris injekciója kétfázisú nocifenzív reakciót váltott ki. Az első fázisban (0-5. perc) a lábnyalások és lábemelések időtartama 130,7 ± 12,6 sec volt a TRPV1+/+ egerekben és 99,7 ± 16,1 sec a TRPV1-/- csoportban, míg a második fázisban (20-45. perc) ezek az értékek rendre 268,7 ± 50,7 sec és 363,6 ± 37,8 sec voltak. Statisztikailag szignifikáns különbség nem volt kimutatható a két egércsoport között egyik fázis eredményeiben sem. III/3.3. Hőtraumával kiváltott hő- és mechanikai hiperalgézia A kezeletlen TRPV1+/+ illetve TRPV1-/- egerek hőküszöbe 44,3 ± 0,4 °C illetve 44,4 ± 0,3 °C, míg mechanonociceptív küszöbeik 7,9 ± 0,3 g és 7,5 ± 0,3 g voltak, tehát a kontroll küszöbökben nem volt szignifikáns eltérés a két csoport között.

42

Az egerek az enyhe hőtrauma után néhány perc múlva magukhoz tértek és spontán fájdalomreakciót nem mutattak. A hő- és mechanikai hiperalgézia szignifikáns küszöbcsökkenésként jelentkezett a hőtrauma után 10 illetve 20 perccel kezdődően. Mindkét hiperalgézia szignifikánsan kisebbnek bizonyult a TRPV1-/- egerekben minden mérési időpontban. A maximális hőküszöbcsökkenés 10,23 ± 1,0 °C illetve 3,59 ± 0,6 °C, a legnagyobb mechanikai hiperalgézia pedig 56,9 ± 2,4 % illetve 23,6 ± 7,9 % volt a TRPV1+/+ és a TRPV1-/- egércsoportban (III/2. ábra).

III/2. ábra: A nociceptív hőküszöb (A) illetve a mechanonociceptív küszöb (B) változása hőtraumát követően (51°C 15 s) vad típusú (TRPV1+/+) és TRPV1 receptor génhiányos (TRPV1-/-) egerekben. A vízszintes tengely a hőtrauma után eltelt időt jelöli. Az adatok 8-8 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A csillagok a két csoport közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik (Mann-Whitney U-teszt, * p<0,05).

43

III/3.4. Carrageninnel kiváltott gyulladásos mechanikai hiperalgézia A kontroll mechanonociceptív küszöb 7,85 ± 0,2 g volt a vad típusú és 7,31 ± 0,3 g a TRPV1 receptor génhiányos egerekben. A carragenin injekció a kezelt láb gyulladásához vezetett, a végtag jól láthatóan duzzadt és kipirosodott lett. A kezelés után 3 órával a mechanikai küszöb csökkenése volt mérhető: a TRPV1+/+ egerek küszöbe 5,35 ± 0,3 g-ra (31,7 ± 4,1%-os hiperalgézia), a TRPV1-/- állatoké pedig 4,9 ± 0,3 g-ra csökkent (31,8 ± 6,1%-os hiperalgézia). Szignifikáns eltérés tehát nem alakult ki a két állatcsoport között. III/3.5.

Mechanikai

hiperalgézia

streptozotocinnal

kiváltott

diabéteszes

polineuropátiában A TRPV1+/+ egerek kontroll mechanonociceptív küszöbe 6,7 ± 0,2 g volt, míg a TRPV1/-

csoportban 6,9 ± 0,3 g. A streptozotocin kezelés után 2 héttel minden egérben

kialakult a kísérletes diabetes mellitus. A TRPV1 receptor génhiányos egerekben a mechanikai hiperalgézia már a kezelést követő 3. hétre kialakult, és a 7. hétig tartó kísérleti periódus alatt végig szignifikánsan súlyosabb volt a vad típusú egerekéhez képest. A legnagyobb különbséget az 5. héten találtuk a két csoport között (a TRPV1+/+ csoportban 10,29 ± 2,6 % ill. a TRPV1-/- csoportban 31,12 ± 2,7 % hiperalgézia, III/3. ábra). III/3.6. Mechanikai hiperalgézia ciszplatinnal kiváltott toxikus neuropátiában A ciszplatinnal kezelt állatok mechanonociceptív küszöbe a kezelés első 3 hetében nem változott a kontroll küszöbökhöz képest (6,6 ± 0,2 g, mindkét csoportban). A TRPV1-/egerekben a 4. héttől alakult ki szignifikáns hiperalgézia, míg a vad típusúakban csak 4 héttel később. A 8. héttől azonban már szignifikáns különbség már nem mutatkozott a két csoport eredményei között. A legnagyobb különbség a 7. héten volt mérhető (a TRPV1+/+ csoportban 2,64 ± 4,0 % ill. a TRPV1-/- csoportban 7,87 ± 3,6 % hiperalgézia, III/4. ábra).

44

III/3. ábra: Diabéteszes neuropátiás mechanikai hiperalgézia vad típusú (TRPV1+/+) és TRPV1 receptor génhiányos (TRPV1-/-) egerekben 3-7 héttel a streptozotocin kezelés (250 mg/kg i.v.) után. Az adatok 810 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A csillagok a két csoport közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik (Mann-Whitney U-teszt, * p<0,05 **p<0,01).

III/4. ábra: Ciszplatinnal kiváltott toxikus neuropátiás mechanikai hiperalgézia vad típusú (TRPV1+/+) és TRPV1 receptor génhiányos (TRPV1-/-) egerekben 4-9 héttel a ciszplatin kezelés elkezdése után. Az adatok 8-10 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A csillagok a két csoport közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik (Mann-Whitney U-teszt, * p<0,05 ** p<0,01).

45

III/3.7. Mechanikai hiperalgézia traumás neuropátiában A részleges n. ischiadicus léziót követő első héten az operált végtagon mechanikai hiperalgézia fejlődött ki, amely a mérési periódus 5 hetén keresztül fennmaradt. A mértéke a 2. héten volt a legnagyobb, ekkor a TRPV1+/+ állatokban 45,13 ± 4,7 %, a TRPV1-/- állatokban pedig 40,53 ± 4,0% volt. Szignifikáns különbséget egyik mérés során sem találtunk a vad típusú és a TRPV1 receptor génhiányos egerek között (III/5. ábra).

III/5. ábra: Traumás neuropátiás mechanikai hiperalgézia vad típusú (TRPV1+/+) és TRPV1 receptor génhiányos (TRPV1-/-) egerekben 1-5 héttel a részleges n. ischiadicus lekötés után. Az adatok 6-8 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A két csoport közötti statisztikailag szignifikáns különbséget nem találtunk (Mann-Whitney U-teszt).

III/3.8.

Plazma

szomatosztatin

koncentrációk

a

krónikus

polineuropátia

modellekben Kezeletlen állatokban a plazma szomatosztatin koncentrációja 8,5 ± 0,2 fmol/ml a TRPV1+/+ csoportban és 7,44 ± 0,6 fmol/ml a TRPV1-/- egerekben. A neuropátiás állatok plazma szomatosztatin koncentrációjának meghatározására a viselkedési vizsgálatok eredményei alapján azokat az időpontokat választottuk, amikor a legnagyobb különbséget találtuk a mechanikai hiperalgéziában a vad típusú és a 46

génhiányos egerek között, így a diabéteszes neuropátiás állatoknál a kezelést követő 5. héten, míg a ciszplatinnal kiváltott neuropátiában a 7. héten történt a vérminták levétele. A neuropátiás TRPV1+/+ egerek plazma szomatosztatin szintje szignifikánsan magasabb volt a kezeletlen kontroll csoporthoz képest mind a diabéteszes (10,08 ± 0,6 fmol/ml), mind a ciszplatinnal kezelt állatokban (10,46 ± 0,9 fmol/ml). Ezzel szemben, a TRPV1-/egerekben nem alakult ki szomatosztatin szint emelkedés, a plazma szomatosztatin koncentrációk 8,02 ± 0,6 fmol/ml illetve 7,63 ± 0,5 fmol/ml voltak (III/6. ábra).

III/6. ábra: Radioimmunoassay-vel meghatározott plazma szomatosztatin koncentrációk kezeletlen, streptozotocinnal (STZ) kiváltott diabéteszes valamint ciszplatinnal kezelt vad típusú (TRPV1+/+) illetve TRPV1 receptor génhiányos (TRPV1-/-) egerekben. A mintákat 5 héttel a streptozotocin kezelés után illetve 7 héttel a ciszplatin kezelés megkezdése után vettük le. Az adatok 6-7 állat eredményeinek átlaga ± SEM. A csillagok a TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerek közötti, míg a kettős keresztek a kezeletlen kontrollok és a neuropátiás egerek közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik (Mann-Whitney U-teszt, p<0,05).

47

III/4. Megbeszélés és következtetések A TRPV1 receptor génhiányos egerek vizsgálata során kimutattuk, hogy ez a fájdalmas ingerekkel aktiválható ioncsatorna kulcsfontosságú a forbolészterrel kiváltott akut nocicepció és az enyhe hőtrauma után kialakuló termális és mechanikai hiperalgézia kialakulásában. A receptor hiánya nem befolyásolta a formalinnal kiváltott nocifenzív magatartást, a carrageninnel keltett gyulladásos, valamint a traumás eredetű mononeuropátiában kialakuló mechanikai hiperalgéziát. Krónikus diabéteszes illetve toxikus eredetű polineuropátiában azonban protektív funkcióval rendelkezett, mivel jelenlétében a mechanikai hiperalgézia mérsékeltebb volt és később alakult ki. A forbolészter PMA a protein kináz C (PKC) aktivációja révén vált ki akut fájdalomreakciót. A PKC fontos eleme azon jelátviteli utaknak, amelyek a szövetsérülés vagy gyulladás következtében létrejövő hiperalgézia kialakulásában részt vesznek (Cesare & McNaughton, 1996; Cesare et al., 1999). A TRPV1 receptor PKC általi foszforilációja annak jelentős szenzibilizációjához vezet (Premkumar & Ahern, 2000; Vellani et al., 2001; Crandall et al., 2002), és ismert az is, hogy a bradikinin PKC aktiváción keresztül képes a TRPV1 receptor hőküszöbét csökkenteni in vitro (Sugiura et al., 2002). Jelen in vivo eredményeink magyarázata az lehet, hogy a forbolészterrel aktivált PKC kizárólag a TRPV1 receptor foszforilációja és annak következményes szenzibilizációja/aktivációja által képes a nociceptorokat stimulálni. A hőtrauma eredményeképpen kialakuló termális hiperalgézia a perifériás nociceptorok szenzibilizációjának következménye, míg a mechanikai hiperalgézia kialakulásában döntően centrális folyamatok vesznek részt (Raja et al., 1999). Ismert az is, hogy a kapszaicin-érzékeny rostok (Saria, 1984) illetve a belőlük felszabaduló tachikininek (Löfgren et al., 1999) központi szerepet játszanak a hőtrauma hatására kialakuló gyulladásos reakciókban. Ez utóbbival összhangban, eredményeink az igazolják, hogy mind a hő-, mind a mechanikai hiperalgézia kifejlődéséért a TRPV1 receptor önmagában nagy mértékben felelős. Két lehetséges mechanizmus állhat ennek a hátterében: a hőtrauma során felszabaduló gyulladásos mediátorok szenzibilizálják a receptort, és/vagy a fájdalmas hőingerrel történő receptoraktiváció következtében felszabaduló szenzoros neuropeptidek járulnak hozzá a hiperalgézia kialakulásához. A krónikus polineuropátiás hiperalgézia patomechanizmusa kevéssé tisztázott, a különböző eredetű állapotok közös jellemzője, hogy kialakulásukhoz az idegrostok 48

valamely eredetű károsodása vezet. Hátterében mind a perifériás idegműködés, mind a centrális nociceptív transzmisszóban bekövetkező kóros aktivitás áll. A periférián a károsodott rost küszöbének csökkenése mellett kóros, ektópiás spontán aktivitás is kialakul, míg a neuron sejttestében a neuropeptidek expressziójának jelentős megváltozását írták le (részletesen l. Devor & Seltzer, 1999; Ueda, 2006). Mindemellett az ép afferensek funkcionális változásai is hozzájárulhatnak a hiperalgéziához, így vannak adatok arról, hogy a TRPV1 receptor expressziója is fokozódik az ép neuronokban (Hudson et al., 2001), illetve korábban nem kapszaicin-érzékeny neuronokon is megjelenik (Rashid et al., 2003a,b). Jelen kísérletsorozatunkban arra utaló adatokat nyertünk, hogy a TRPV1 receptor hiánya súlyosbította a mechanikai hiperalgéziát a két vizsgált polineuropátia modellben. Számos bizonyíték van arra, hogy a TRPV1 receptort expresszáló rostokból felszabaduló szomatosztatin szisztémás gyulladásgátló és antinociceptív hatást képes kifejteni (Szolcsányi et al., 1998a,b; Helyes et al., 2000; Carlton et al., 2001a,b; 2003; Helyes et al., 2004). Hasonló mechanizmusra utal az a megfigyelés, amely szerint a neuropátiás hiperalgézia elektroakupunktúrás kezelése során fokozódik a szomatosztatin expressziója a hátsó gyöki ganglionsejtekben (Dong et al., 2005). Hipotézisünk az volt, hogy a polineuropátiás állapotokban ez a szomatosztatin-mediált ellenregulációs mechanizmus aktiválódik, tehát kiesése ezért eredményezte a hiperalgézia mértékének fokozódását és korábbi megjelenését. Ezt igazolhatja az, hogy a plazma szomatosztatin koncentrációk mérése során a vad típusú polineuropátiás állatokban szignifikáns mértékű szomatosztatin szint emelkedés volt kimutatható a kezeletlenekhez képest, míg a TRPV1 receptor génhiányos egerekben a peptid szintje változatlan maradt. Összefoglalásképpen megállapíthatjuk, hogy míg egyes modellekben a TRPV1 receptor közvetíti, vagy fokozza a nocicepciót, a krónikus polineuropátia modellekben meglepő módon ellentétes, antinociceptív hatás kiváltásáért felelős, az aktivációjával felszabadított szomatosztatinon keresztül. Azokban a modellekben, amelyekben a TRPV1 receptor génhiányos egerek nociceptív viselkedése nem volt eltérő, a receptor feltehetően nem játszik döntő szerepet, de nem kizárt, hogy ezekben a két mechanizmus kioltja egymás hatását. Miután vizsgált nociceptív modelleinkben a TRPV1 receptor két, ellentétes funkcióját mutattuk ki, a TRPV1 receptor antagonistái és agonistái egyaránt terápiás értékkel bírhatnak az adott betegség patomechanizmusától függően.

49

IV. Hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésen alapuló új termális hiperalgézia modell kidolgozása az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő alkalmazásával (Pharmacology 2004, 72:147)

IV/1. Bevezetés A termonocicepció hagyományos állatkísérletes vizsgálómódszerei azon alapulnak, hogy az állatok végtagját vagy farkát állandó intenzitású, küszöb feletti hőingernek teszik ki, például forró lapra helyezve (állandó hőmérsékletű hot plate) vagy irányított hősugárral stimulálva (Hargreaves-féle „plantar”-teszt), és az elhárító reakció megjelenéséig tartó latenciaidőt mérik (részletesen l. Le Bars et al., 2001). Ezt a latenciaidőt tekintik, nem teljesen konzekvens módon, nociceptív hőküszöbnek. Ezeknek a módszereknek a hátránya az, hogy ismételt mérések során szenzibilizáció vagy habituáció miatt a latencia csökkenhet illetve növekedhet, és nem kevésbé fontos, hogy csak az opioid analgetikumok antinociceptív hatását képesek megbízhatóan mérni. Ellentmondásos eredmények születtek nagy dózisú kapszaicin injekció hatásának mérésekor is, annak ellenére, hogy ez a kezelés a primer afferens neuronok nagy részének funkcionális deszenzibilizációját eredményezi (Szolcsányi, 1985). További hátrány, hogy a latenciaértékek nehezen vethetők össze az elektrofiziológiai kísérletekben (pl. patch clamp módszer, egy rost elvezetések) rutinszerűen meghatározott hőküszöbbel. Emelkedő intenzitású hőingerrel az állatok nociceptív küszöbhőmérséklete határozható meg, vagyis az a legalacsonyabb hőmérséklet, amelynél az állat nocifenzív reakciót mutat. Munkacsoportunk sikeresen alkalmazta ezt a mérési elvet az emelkedő hőmérsékletű forró lap és egy új hiperalgézia-modell kifejlesztésénél (Almási et al., 2003), és ez a módszer alkalmas volt morfin, diclofenac és paracetamol alacsony dózisainak hőküszöbemelő és antihiperalgetikus hatásának kimutatására is. A kiváló farmakológiai érzékenységen felül a küszöbmérés az etikai irányelveknek is jobban megfelel (Zimmermann, 1983), mivel az állatokat a lehető legkisebb és legrövidebb ideig tartó fájdalomnak teszi ki.

50

Jelen kísérleteinkben szintén egy új fejlesztésű készüléket, az emelkedő hőmérsékletű vízfürdőt alkalmaztuk, amelybe az állatok teljes lába vagy farka meríthető bele a nociceptív

hőküszöb

meghatározásához.

Célunk

az

volt,

hogy

a

vízfürdő

felhasználásával egy újabb hiperalgézia modellt fejlesszünk ki, amelyben enyhe hőtraumával váltottunk ki hőküszöbcsökkenést. A modell validálásához megvizsgáltuk különböző

támadáspontú

analgetikumok

antihiperalgetikus

hatását.

Külön

kísérletsorozatban pedig a hiperalgéziában résztvevő mediátorok szerepét vizsgáltuk.

IV/2. Módszerek IV/2.1. A nociceptív hőküszöb meghatározása az emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdőt a budapesti Experimetria Kft.-vel közösen fejlesztettük ki. A készülék egy beépített fűtőelemmel ellátott víztartályból és egy vezérlőegységből áll, amelyen beállítható a kiindulási hőmérséklet és a fűtési sebesség, és digitális kijelzőjén leolvasható a vízfürdő aktuális hőmérséklete. Kísérleteinkben nőstény Wistar patkányokat használtunk (120-200 g). A kísérletet megelőző nap kondicionáló méréseket végeztünk, hogy a patkányok hozzászokjanak a mérési körülményekhez. A kísérletekben mindig ugyanaz az asszisztensnő működött közre, hogy azonos feltételeket biztosítsunk a különböző vizsgálatokhoz. A hőküszöb méréséhez az állatot függőleges testhelyzetben, lazán szorítva tartottuk a vízfürdő fölé, biztosítva a hátsó lábak szabad mozgását, majd egyik hátsó lábát a vízfürdőbe merítettük és elindítottuk a fűtést. Minden mérést 30 °C-ról indítottunk, a fűtési sebesség 24 °C/perc volt. Amikor az állat a lábát a vízből kihúzta, a fűtést egy pedál segítségével megállítottuk, az aktuális hőmérsékletet leolvastuk a kijelzőn, és ezt tekintettük nociceptív hőküszöbnek. Amennyiben az állat a lábát 50 °C-os vízhőmérsékletnél sem emelte ki, a mérést megszakítottuk, hogy elkerüljük az esetleges szövetsérülést.

51

IV/2.2. Termális hiperalgézia kiváltása enyhe hőtraumával és antihiperalgetikus hatások vizsgálata A kísérlet elején két hőküszöbmérést végeztünk és a két mérés átlagát tekintettük a kontroll hőküszöbnek. Ezt követően a hőtraumát a következő protokoll szerint hoztuk létre: az állatokat dietil-éterrel altattuk, majd egyik hátsó lábukat egy 51 °C-os vízfürdőbe merítettük 20 másodpercre. Az anesztézia elmúlása után ismételt hőküszöbméréseket végeztünk a hőtrauma után 10 és 20 perccel, hogy meggyőződjünk a hiperalgézia kialakulásáról. A vizsgálandó anyagok adására a 20 perces mérés után került sor, hatásuk kimutatásához pedig újabb hőküszöbméréseket végeztünk a hőtrauma utáni 40., 50. és 60. percben (azaz az anyag adását követő 20., 30, és 40. percben). Lokális, intraplantáris kezelés esetén már a hőtrauma utáni 30. percben (injekció utáni 10. percben) is történt mérés. Minden mérési sorozatban az állatcsoport egyik felét szolvenssel kezeltük, és az anyagok hatását a szolvenssel kezelt csoport eredményeihez viszonyítottuk. Az antihiperalgetikus hatás jellemzésére a legkisebb alkalmazott hatékony dózist, azaz a minimális effektív dózist (MED) használtuk, valamint a kiszámított ED50 értéket, amelynek a hiperalgézia 50 %-os gátlását eredményező dózist tekintettük.

IV/3. Eredmények A kezeletlen állatok hőküszöbe 43,1 ± 0,4 °C volt és akár 10 percenként ismételt mérések során is reprodukálhatónak bizonyult, vagyis az egyes végtagokon a különböző időpontokban mért küszöbök között nem volt statisztikailag szignifikáns különbség (ANOVA, Neumann-Keuls post hoc analízis). A kísérletből egyetlen állatot sem kellett kizárni a nocifenzív reakció értékelhetetlensége vagy a mérés reprodukálhatatlansága miatt. Kezeletlen állatoknál az éter önmagában nem befolyásolta a hőküszöböt. A hőtrauma létrehozása után az állatok néhány percen belül magukhoz tértek az éter narkózisból, és ezután spontán fájdalomreakciót nem mutattak. A hőtrauma utáni 10. és 20. percben mérve azonban egy 7-8 °C-os hőküszöbcsökkenést tapasztaltunk, amely legalább egy órán keresztül változatlan mértékben fennállt.

52

A morfin a hőtrauma után 20 perccel beadva dózisfüggően csökkentette a kialakult termális hiperalgéziát, minimális effektív dózisa (MED) 0,3 mg/kg i.p. (IV/1. ábra). A nem-szelektív ciklooxigenáz gátló diclofenac és ibuprofen szintén dózisfüggő antihiperalgetikus hatást eredményezett (MED: 0,3 mg/kg i.p., illetve 10 mg/kg; IV/2. és 3. ábra), és hatásosnak bizonyult a feltehetően centrális támadáspontú paracetamol is (MED: 30 mg/kg i.p; IV/4. ábra). A MED értékeket és a kiszámított ED50-eket a IV/1. táblázatban foglaltam össze. A modell alkalmas volt az új analgetikumjelölt vegyület, a perifériás támadáspontú, szomatosztatin receptor agonista TT-232 hatásának kimutatására is (MED: 0,1 mg/kg i.p; IV/5. ábra).

szolvens i.p. morfin 1 mg/kg i.p. morfin 0,3 mg/kg i.p.

o

hőtrauma: 51 C 20 s 44

*

*

42

*

kezelés

o

Hőküszöb ( C)

* 40

*

*

40

50

38 36 34 Kontroll

10

20

30

60 min hőtrauma után

IV/1. ábra: Morfin hatása a hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésre. Az adatok 8-10 állat átlaga ± SEM. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbséget mutatnak a szolvenssel kezelt csoportokhoz képest (p<0,05, kétmintás t-próba).

53

46

szolvens i.p. diclofenac 0,1 mg/kg i.p. diclofenac 0,3 mg/kg i.p. diclofenac 1 mg/kg i.p. diclofenac 3 mg/kg i.p. diclofenac 10 mg/kg i.p.

o

hőtrauma: 51 C 20 s

*

42

*

*

kezelés

o

Hőküszöb ( C)

44

40

**

38

*

* * *

** *

36 34 Kontroll

10

20

30

40

50

60 min hőtrauma után

IV/2. ábra: Diclofenac hatása a hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésre. Az adatok 8-10 állat átlaga ± SEM. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbséget mutatnak a szolvenssel kezelt csoportokhoz képest (p<0,05, kétmintás t-próba). szolvens i.p. ibuprofen 3 mg/kg i.p. ibuprofen 10 mg/kg i.p. ibuprofen 30 mg/kg i.p.

o

hőtrauma: 51 C 20 s 44

*

o

Hőküszöb ( C)

42 40

kezelés

*

*

*

*

*

40

50

38 36 34 32 Kontroll

10

20

30

60 min hőtrauma után

IV/3. ábra: Ibuprofen hatása a hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésre. Az adatok 8-10 állat átlaga ± SEM. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbséget mutatnak a szolvenssel kezelt csoportokhoz képest (p<0,05, kétmintás t-próba).

54

szolvens i.p. paracetamol 10 mg/kg i.p. paracetamol 30 mg/kg i.p. paracetamol 100 mg/kg i.p.

o

hőtrauma: 51 C 20 s 44

o

Hőküszöb ( C)

42

*

40

kezelés

* *

38

* *

36 34 32 Kontroll

10

20

30

40

50

60 min hőtrauma után

IV/4. ábra: Paracetamol hatása a hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésre. Az adatok 8-10 állat átlaga ± SEM. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbséget mutatnak a szolvenssel kezelt csoportokhoz képest (p<0,05, kétmintás t-próba). o

hőtrauma: 51 C 20 s

szolvens i.p. TT-232 0,1 mg/kg i.p. TT-232 0,2 mg/kg i.p.

44

o

Hőküszöb ( C)

42

*

40

*

*

kezelés

38

*

36

*

*

34 32 Kontroll

10

20

30

40

50

60 min hőtrauma után

IV/5. ábra: A szomatosztatin receptor agonista TT-232 hatása a hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésre. Az adatok 8-10 állat átlaga ± SEM. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbséget mutatnak a szolvenssel kezelt csoportokhoz képest (p<0,05, kétmintás t-próba).

55

MED (mg/kg i.p.)

ED50 (mg/kg i.p.)

dózis (mg/70 kg)

morfin

0,3

0,5

21

diclofenac

0,3

3

21

ibuprofen

10

18

700

paracetamol

30

100

2100

IV/1. táblázat: A vizsgált analgetikumok minimálisan hatékony dózisai (MED) és megközelítő ED50 értékei, amelyeket a hőtraumával kiváltott hőhiperalgézia gátlása alapján nyertünk. A jobb szélső oszlopban a MED értékek alapján 70 kg-os emberre átszámított dózisok találhatók.

Intraplantáris injekcióban adva a morfin (10 µg), a diclofenac (100 µg) és az ibuprofen (100 µg) szintén szignifikánsan mérsékelte a hőküszöbcsökkenést (IV/6. ábra).

szolvens 100 µl i.pl. morfin 10 µg i.pl. ibuprofen 100 µg i.pl. diclofenac 10 µg i.pl.

o

hőtrauma: 51 C 20 s 44

o

Hőküszöb ( C)

42

*

*

*

kezelés

40

* *

36

*

*

38

*

*

*

34 Kontroll

10

20

30

40

50

60 min hőtrauma után

IV/6. ábra: Analgetikumok intraplantáris injekciójának (100 µl i.pl.) hatása a hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésre. Az adatok 8-10 állat átlaga ± SEM. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbséget mutatnak a szolvenssel kezelt csoportokhoz képest (p<0,05, kétmintás t-próba).

56

A lipoxigenáz-gátló nordihidroguaiarénsav (NDGA, 10 mg/kg i.p.) nem volt hatással a termális hiperalgéziára, azonban a bradikinin B2-receptor antagonista HOE140 (0,1 mg/kg i.p.) szignifikáns gátlást eredményezett, a TRPV1 receptor antagonista JYL1421 (2 mg/kg i.p.) pedig majdnem teljesen megszüntette a hőküszöbcsökkenést (IV/7.ábra). o

hőtrauma: 51 C 20 s

szolvens i.p. NDGA 10 mg/kg i.p.

o

Hőküszöb ( C)

44 42 40

kezelés

38 36 34 32

Kontroll 10

20

30

40

50

60 min hőtrauma után

o

44

hőtrauma: 51 C 20 s

szolvens i.p. HOE140 0,1 mg/kg i.p.

o

Hőküszöb ( C)

42 40

kezelés

*

*

40

50

38

*

36 34 32

Kontroll

10

20

30

o

szolvens i.p. JYL1421 2 mg/kg i.p.

hőtrauma: 51 C 20 s

o

Hőküszöb ( C)

44 42

60 min hőtrauma után

*

*

40

50

*

kezelés

40 38 36 34 Kontroll 10

20

30

60 min hőtrauma után

IV/7. ábra: A lipoxigenáz-gátló NDGA, a bradikinin B2-receptor antagonista HOE140 és a TRPV1 receptor antagonista JYL1421 hatása a hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenésre. Az adatok 8-10 állat átlaga ± SEM. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbséget mutatnak a szolvenssel kezelt csoportokhoz képest (p<0,05, kétmintás t-próba).

57

IV/4. Megbeszélés és következtetések Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő alkalmasnak bizonyult éber patkányok nociceptív hőküszöbének megbízható és reprodukálható mérésére. A kiváló reprodukálhatóság feltehetően annak köszönhető, hogy a küszöbhöz közeli hőingerek kevésbé befolyásolják a nociceptorok válaszkészségét, szemben a küszöb feletti ingerléssel, amely képes szenzibilizálni a nociceptív rostokat illetve hátsó gyöki ganglionsejteket (Fitzgerald & Lynn, 1977; Lyfenko et al., 2002). A hőtraumát, mint természetes szövetkárosító stimulust alkalmaztuk hiperalgézia kiváltására, azaz tulajdonképpen elsőfokú égést modelleztünk, amely a nociceptív hőküszöb markáns csökkenését eredményezte. Az anyaghatások vizsgálatában is a mindennapi klinikai gyakorlatot követtük azáltal, hogy a trauma után kezeltük az állatokat, ellentétben a típusos kísérleti elrendezésekkel, amelyekben előkezelés történik. A modell rendkívül érzékenynek bizonyult mind a morfin, mind a ciklooxigenáz gátlók antihiperalgetikus hatásának mérésére, és a hagyományos analgetikumokon túl, az új támadáspontú szomatosztatin receptor agonista TT-232 vizsgálatára is alkalmas volt (l. II. fejezet). A morfin, diclofenac, ibuprofen és paracetamol ED50 értékei nem magasabbak, sőt esetenként még alacsonyabbak is azoknál irodalmi adatoknál, amelyeket termális hiperalgézia modellekben nyertek (Gelgor et al., 1992; Bianchi & Panerai, 1996; Dirig et al., 1998; Berg et al., 2000; Hamura et al., 2000; Sluka, 2000). A módszerünkkel nyert minimális hatékony dózisokból átszámított humán dózisok a klinikai gyakorlatban alkalmazott dózistartományba esnek (IV/1. táblázat), ami kiválóan példázza eredményeink gyakorlati értékét. Az érzékenység magyarázata egyrészt a küszöbmérésen alapuló megközelítés lehet, de tovább növelheti az a tény, hogy ellentétben a forró lapon észlelt komplexebb elhárító magatartásformákkal, a lábkihúzás spinálisan integrált reflex, amelyet valószínűleg kevésbé befolyásolnak egyéb tényezők. Fontos kiemelni azt is, hogy modellünk lokális analgetikus kezelés hatásának kimutatására is alkalmas volt. A lokális kezelés perifériás hatását az igazolja, hogy az alkalmazott intraplantáris dózisok jóval alacsonyabbak voltak az adott anyag korábban meghatározott szisztémás MED értékénél. Ez a tulajdonság azért előnyös, mivel az új fájdalomcsillapítók fejlesztésében jelentős irányt képviselnek a topikálisan ható anyagok, és nem minden tesztmódszer felel meg ennek az elvárásnak. A perifériás 58

antihiperalgetikus

hatás

alapja

az,

hogy

a

ciklooxigenáz-gátlók

a

lokális

prosztaglandintermelődés gátlása révén (Ferreira et al., 1972), míg a morfin µ-opioid receptorokhoz kötődve képes a perifériás nociceptorvégződések válaszkészségét csökkenteni (Stein et al., 1995). Humán és állatkísérletes vizsgálatokban egyaránt alkalmazták a hőtraumát a perifériás és centrális nociceptor szenzibilizáció tanulmányozására (Hardy et al., 1950; Meyer & Campbell, 1981; LaMotte et al., 1982; Coderre & Melzack, 1987; Nozaki-Taguchi & Yaksh, 1998), valamint gyógyszerek hőhiperalgéziát csökkentő hatásának mérésére (Moiniche et al., 1994; Lundell et al., 1996; Jun & Yaksh, 1998; Hamura et al., 2000; Johanek & Simone, 2004; Wang et al., 2005). Utóbbiak azonban nem kerültek be a széles körben rutinszerűen használt farmakológiai tesztmódszerek közé. A kiváló érzékenységen túl módszerünket ígéretessé teszi az is, hogy a gyógyszerek hatását közvetlenül az enyhe szöveti sérülés után vizsgáljuk, mielőtt jelentősebb gyulladás kialakulna, így valódi antihiperalgetikus hatást vizsgálhatunk, ellentétben azokkal a módszerekkel, amelyek a hőtrauma után órákkal mérik a gyógyszerhatást (Wang et al., 2005), illetve egyéb gyulladáskeltő anyaggal (pl. carragenin) váltanak ki gyulladásos termális hiperalgéziát (Hargreaves et al., 1988). Ezeknél a módszereknél ugyanis nem különíthető el a fájdalomcsillapító és gyulladásgátló hatás. A hőtrauma következtében kialakuló hőküszöbcsökkenés patomechanizmusának vizsgálata során olyan mediátorok szerepét néztük meg, amelyek irodalmi adatok szerint képesek a nociceptorokat hővel szemben szenzibilizálni (Martin et al, 1987; Pitchford & Levine, 1991; Khan et al, 1992), illetve termális hiperalgéziát kiváltani (Bisgaard & Kristensen, 1985; Manning et al., 1991; Negus et al., 1993; Kindgen-Milles et al., 1994). Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy prosztaglandinok (feltehetően döntően a PGE2) minden bizonnyal fontos szerepet játszanak, miután a ciklooxigenáz-gátlók alacsony dózisban és lokális alkalmazás során is gátolták a hiperalgéziát. Továbbá igazoltuk, hogy nagy részben felelős a hiperalgézia kifejlődéséért a bradikinin is, amelyről ismert, hogy szövetsérülés hatására képződik és B2-receptorhoz kötődve képes termális hiperalgéziát előidézni (Dray & Perkins, 1993). Igazoltuk továbbá, hogy a TRPV1 receptor aktivációjának illetve szenzibilizációjának központi szerepe van a hőküszöbcsökkenés kialakulásában. Ez utóbbit a TRPV1 receptor génhiányos egereknél talált eredményeink is alátámasztják (l. III. fejezet). A TRPV1 receptort egyes lipoxigenáz-termékek közvetlenül is képesek aktiválni (Hwang et al., 2000), és ismert az is, hogy az 5- illetve 12-lipoxigenáz enzim gátlói más 59

modellekben hatékonyan csökkentették a termális hiperalgéziát (Amman et al., 1996; Shin et al., 2002; Chou et al., 2003), modellünkben a lipoxigenáz-gátló viszont hatástalannak bizonyult. Így arra következtethetünk, hogy a hőtraumával kiváltott szövetsérülés során vagy nem képződnek lipoxigenáz-termékek vagy hatásuk nem olyan jelentős, hogy annak kiesése befolyásolni tudja a hiperalgézia mértékét. Összefoglalásképpen megállapíthatjuk, hogy az általunk kifejlesztett és validált termonocicepciós teszt egy megbízható, könnyen kivitelezhető és érzékeny új módszer, ami perifériás és centrális támadáspontú analgetikumok vizsgálatára egyaránt alkalmas. A hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés egyben kiváló in vivo modell a termális hiperalgézia patomechanizmusának tanulmányozására.

60

A kísérletes munka összefoglalása és értékelése Az új gyógyszerek fejlesztésére fordított erőfeszítések ellenére a mai orvosi gyakorlatban használatos fájdalomcsillapító vegyületek lényegében két támadásponton fejtik ki hatásukat: az opioid receptorokon illetve a prosztanoidok szintéziséért felelős ciklooxigenáz enzim gátlása révén. A klinikai gyakorlatban ezek a gyógyszerek többnyire jól csökkentik a gyulladásos, traumás vagy posztoperatív fájdalmat, azonban tartós használatukat hátráltatják a sokszor kellemetlen és potenciálisan súlyos mellékhatások, és ez megnehezíti a krónikus, például mozgásszervi betegségekhez vagy daganatokhoz társuló fájdalom kezelését. Új gyógyszerek fejlesztését teszi szükségessé az is, hogy a különböző eredetű krónikus neuropátiás fájdalom kórképekben az opioidok és a COX-gátlók hatékonysága csekély. Az ún. adjuváns fájdalomcsillapítók (például triciklikus antidepresszánsok, antiepileptikumok) csak bizonyos típusú neuropátia és azon belül sem minden egyes beteg esetében hatásosak. A fájdalomcsillapítás legszelektívebb módja a fájdalom-szignál kialakulásának megakadályozása lenne közvetlenül a nociceptoron, jelenleg azonban még nem rendelkezünk olyan gyógyszerekkel, amelyeknek ez lenne a hatásmechanizmusa. Az analgetikumok fejlesztési stratégiájának tehát fontos eleme a nociceptorok végződésén található támadáspontok felderítése illetve az ezeket befolyásoló lehetséges új gyógyszerjelöltek hatásának igazolása in vivo. A nociceptorok aktivációját szelektíven gátló anyagok kitüntetett fontosságúak lehetnek, mivel szelektivitásuk révén kedvezőbb mellékhatásprofillal rendelkezhetnek és hatékonyabbak lehetnek a neuropátiás fájdalom kezelésére is, mint a mai gyakorlatban használatos gyógyszerek. Kísérleteinkben két lehetséges célpont, a cannabinoid receptorok és a szomatosztatin receptorok agonistáinak hatását vizsgáltuk, amelyekről korábbi adatok alapján ismert volt, hogy közvetlenül képesek csökkenteni a kapszaicin-érzékeny nociceptorok aktivációját. Eredményeink igazolták, hogy a CB1 és CB2 receptorok szervezetben előforduló agonistái, az anandamid és a palmitoil-etanolamid csökkentik a TRPV1 receptor aktivációval kiváltott neuropeptid felszabadulást in vivo, valamint a traumás neuropátiás hiperalgéziát. A szomatosztatin receptor agonista TT-232, amelyről korábbi eredmények alapján szintén ismert volt, hogy erősen gátolja a szenzoros neuropeptidek felszabadulását (Helyes et al., 2001), potens antinociceptív és antihiperalgetikus hatást fejtett ki akut kémiai, termális nociceptív modellekben és krónikus diabéteszes 61

neuropátiában. Mindezek alapján elmondhatjuk, hogy a TRPV1 receptort expresszáló kapszaicin-érzékeny nociceptorok afferens (akciós potenciál generáció) illetve efferens működését

(neuropeptid

felszabadulás)

csökkentő

vegyületek

ígéretes

analgetikumjelöltnek tekinthetők. Külön jelentősége van annak, hogy a PEA és a TT232 esetében olyan anyagok antinociceptív hatását mutattuk ki, amelyeknél kizárható a központi idegrendszeri támadáspont, mivel CB2-receptorok csak a periférián expresszálódnak, a TT-232 pedig nem jut át a vér-agy gáton. A TRPV1 receptor különböző, fizikai és kémiai jellegű fájdalmas ingereket integrál (Caterina et al., 1997; Tominaga et al., 1998), ezért maga a receptormolekula is fontos célpont lehet új típusú analgetikumok számára. Kísérleteink jelentős új információt szolgáltattak a receptor akut és krónikus nociceptív folyamatokban betöltött szerepéről. Génhiányos egerek segítségével arra a következtetésre jutottunk, hogy bizonyos akut fájdalomállapotok kifejlődéséhez elengedhetetlen a TRPV1 receptor jelenléte, másokban viszont nincs kizárólagos szerepe. Azonban krónikus polineuropátia modellekben a receptor hiánya meglepő módon súlyosbítja a mechanikai hiperalgéziát. Hipotézisünk

szerint

a

TRPV1

receptor

krónikus

aktivációja

következtében

ellenregulációs folyamatok indulhatnak be, amelyeknek mediátora a TRPV1 receptort expresszáló végződésekből felszabaduló és a keringésbe jutó szomatosztatin. Ezt az elméletet a plazma szomatosztatin koncentrációjának mérésével is alátámasztottuk. A TRPV1 receptor tehát az adott kórfolyamattól függően pronociceptív vagy antinociceptív hatást is közvetíthet, tehát akár az agonistákból és az antagonistákból is lehetnek gyógyszerjelöltek. A gyógyszerfejlesztés szempontjából viszont figyelembe kell venni azt, hogy bár a TRPV1 receptor agonisták vagy antagonisták egyaránt analgetikus hatásúak lehetnek bizonyos állapotokban, más esetekben nem befolyásolják, sőt még súlyosbíthatják is a fájdalmat. Eredményeink megerősítették azokat a korábbi adatokat, amelyek szerint mind az endogén cannabinoidok (Calignano et al., 1998), mind a szomatosztatin (Carlton et al., 2001b; 2003; Helyes et al., 2004) tónusos gátló hatást képes kifejteni a nociceptorok működésére a periférián. Így az endogén opioidok mellett (Stein et al., 1995) jelentős szerepük lehet a fájdalomtranszmiszió perifériás kontrolljában és a centrális leszálló gátló pályákkal együtt szabályozhatják a fájdalomérzet mértékét. A szomatosztatinról az is igazolódott, hogy bekerül a keringésbe és így nem csak lokális, hanem szisztémás hatást is képes kiváltani (Szolcsányi et al., 1998a,b; Helyes et al., 2000; 2004). Ezen folyamatok vizsgálata érdekes új terület lehet a kutatás számára, mivel az endogén 62

regulációs mechanizmusok modulációja farmako- vagy fizikoterápiás beavatkozásokkal új lehetőségeket kínálhat a fájdalomcsillapításra. A nocicepció vizsgálatát és új analgetikumok fejlesztését megnehezíti, hogy a fájdalomérzet – szubjektivitásából eredően – in vivo állatkísérletekben objektíven nem mérhető. A fájdalmas intenzitású stimulusokra adott viselkedési reakciók vagy elhárító reflexek megfigyelésén alapuló vizsgálómódszerek egyike sem felel meg teljesen a farmakológiai tesztekkel szemben támasztott kritériumoknak, azaz specificitás, szenzitivitás, validitás, reprodukálhatóság vagy megbízhatóság szempontjából nem ideálisak (Le Bars et al., 2001). A

termonocicepció

vizsgálatának

jelentőségét

az

adja,

hogy

a

szubjektív

hőfájdalomérzet küszöbe és mértéke szempontjából jól korrelál a C-nociceptorok kisüléseivel (Gybels et al., 1979; Torebjörk & Ochoa, 1980; Van Hees & Gybels, 1981; Meyer & Campbell, 1981), továbbá a primer termális hiperalgézia kialakulásáért döntően a nociceptorok perifériás végződéseinek szenzibilizációja felelős (Meyer & Campbell, 1981; LaMotte et al., 1982). Elméletileg tehát a hőküszöb mérésével illetve a hőhiperalgézia vizsgálatával közvetlenül felderíthető a végződéseken található potenciális támadáspontok szerepe. A klasszikus termonocicepciós mérőmódszerek azonban nem a valós hőküszöböt mérik, hanem a küszöb feletti hőingerre adott nocifenzív reakció latenciaidejét (Le Bars et al., 2001), ami több szempontból sem előnyös. Ez a paraméter nem vethető össze a humán pszichofiziológiai illetve az in vitro módszerekkel meghatározott nociceptív hőküszöbbel, és további hátrány, hogy a latenciaidő ismételt mérések során nem mindig reprodukálható. A módszerek farmakológiai érzékenysége sem teljesen felel meg az elvárásoknak, mivel a klinikailag hatékony analgetikumok közül csak az opioidok hatását mutatják ki megbízhatóan (Le Bars et al., 2001). A kísérletes munka utolsó részeként egy saját fejlesztésű, hőküszöbmérésen alapuló termonocicepciós tesztet dolgoztunk ki, amely igen megbízható és érzékeny módszernek bizonyult különböző támadáspontú anyagok antihiperalgetikus hatásának kimutatására. Jelentőségét az is adja, hogy a hőtraumával egy valós klinikai szituációt modelleztünk, ellentétben azokkal a modellekkel, amelyek valamely exogén anyag (pl. formalin, carragenin, zymosan stb.) beadásával váltanak ki hiperalgéziát. Az emelkedő hőmérsékletű

vízfürdőt

patomechanizmusának

sikeresen

használtuk

tanulmányozására

is,

fel és

a

termális

megállapítottuk,

hiperalgézia hogy

a

hőküszöbcsökkenésben ciklooxigenáz-termékek és bradikinin felszabadulása valamint a 63

TRPV1 receptor is fontos szerepet játszik. A készülék tehát nemcsak analgetikumok tesztelésére alkalmazható, hanem a termonocicepció folyamatainak megbízható in vivo vizsgálatára is kiválóan alkalmas. A dolgozatban szereplő új adatok legfőbb értékének azt tartom, hogy döntő többségükben in vivo vizsgálatok eredményeképpen születtek, ami következtetéseink gyakorlati jelentőségét növeli. Kísérleteink részben korábbi adatok megerősítésére szolgáltak, de ugyanakkor előzetes ismeretek alapján nem várt új eredményeket is nyertünk, például a TRPV1 receptor krónikus polineuropátiában betöltött szerepéről. A nocicepciót, mint minden más idegi működést, komplex szabályozó folyamatok befolyásolják, tehát csakis a szervezet egészének válaszai alapján értékelhető, ami az in vivo nociceptív tesztek kísérletes alkalmazását, az elektrofiziológiai és molekuláris biológiai módszerek rendkívül gyors fejlődése ellenére a jövőben is nélkülözhetetlenné teszi.

64

Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném kifejezni köszönetemet témavezetőimnek dr. Pethő Gábornak és dr. Helyes Zsuzsannának, valamint a Neurofarmakológia program vezetőjének, dr. Szolcsányi János professzornak a szakmai irányításért és támogatásért, amelyben a munkám során mindvégig részesültem. Külön köszönet illeti asszisztensnőnket, Gógl Csabáné Katit a kísérletekben nyújtott nélkülözhetetlen segítségéért. Köszönet dr. Németh Józsefnek a szenzoros neuropeptid koncentrációk RIA módszerrel történő méréséért. Köszönet dr. Pintér Erikának a sok szakmai és baráti jó tanácsért. Köszönet dr. Almási Róbertnek, aki a kezdetekkor beavatott az in vivo mérésekbe. Sándor Katalinnak és Horváth Dórának, akik diákkörösként jelentős részt vállaltak a kísérletek elvégzésében. Köszönöm minden PhD hallgatótársamnak és a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet minden dolgozójának azt a baráti légkört, amelyben az elmúlt négy évben eredményesen végezhettem a munkámat. Végül pedig nem lehetek eléggé hálás édesanyámnak és testvéreimnek minden szeretetért, türelemért, bíztatásért és támogatásért.

65

Irodalomjegyzék Ahluwalia J, Urban L, Capogna M, Bevan S, Nagy I. Cannabinoid 1 receptors are expressed in nociceptive primary sensory neurons. Neuroscience 2000; 100: 685-688. Almási R, Pethő G, Bölcskei K, Szolcsányi J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol 2003; 139: 49-58. Amann R, Maggi CA. Ruthenium red as a capsaicin antagonist. Life Sci 1991; 49: 849-56. Amann R, Schuligoi R, Lanz I, Peskar BA. Effect of a 5-lipoxygenase inhibitor on nerve growth factorinduced thermal hyperalgesia in the rat. Eur J Pharmacol 1996; 306: 89-91. Authier N, Gillet JP, Fialip J, Eschalier A, Coudore F. An animal model of nociceptive peripheral neuropathy following repeated cisplatin injections. Exp Neurol 2003; 182: 12-20. Benham CD, Gunthrope MJ, Davis JB. TRPV channels as temperature sensors. Cell Calcium 2003; 33: 479-487. Berg J, Fellier H, Christoph T, Kremminger P, Hartmann M, Blaschke H, Rovensky F, Towart R, Stimmeder D. Pharmacology of a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, HN-56249: a novel compound exhibiting a marked preference for the human enzyme in intact cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2000; 361: 363-372. Betoin F, Ardid D, Herbet A, Aumaitre O, Kemeny JL, Duchene-Marullaz P, Lavarenne J, Eschalier A. Evidence for a central long-lasting antinociceptive effect of vapreotide, an analog of somatostatin, involving an opioidergic mechanism. J Pharmacol Exp Ther 1994; 269: 7-14. Bevan S, Hothi S, Hughes G, James IF, Rang HP, Shah K, Walpole CS, Yeats JC. Capsazepine: a competitive antagonist of the sensory neurone excitant capsaicin. Br J Pharmacol 1992; 107: 544552. Bhave G, Zhu W, Wang H, Brasier DJ, Oxford GS, Gereau RW 4th. cAMP-dependent protein kinase regulates desensitization of the capsaicin receptor (VR1) by direct phosphorylation. Neuron 2002; 35: 721-731. Bianchi M, Panerai AE. The dose-related effects of paracetamol on hyperalgesia and nociception in the rat. Br J Pharmacol 1996; 117: 130-132. Bisgaard H, Kristensen JK. Leukotriene B4 produces hyperalgesia in humans. Prostaglandins. 1985; 30: 791-797. Buxbaum DM. Analgesic activity of ∆9-tetrahydrocannabinol in the rat and mouse. Psychopharmacologia 1972; 25: 275-280. Calignano A, La Rana G, Giuffrida A, Piomelli D. Control of pain initiation by endogenous cannabinoids. Nature 1998; 394: 277-281. Calignano A, La Rana G, Piomelli D. Antinociceptive activity of the endogenous fatty acid amide, palmitylethanolamide. Eur J Pharmacol 2001; 419: 191-198. Carlton SM, Du J, Davidson E, Zhou S, Coggeshall RE. Somatostatin receptors on peripheral primary afferent terminals: inhibition of sensitized nociceptors. Pain 2001a; 90: 233-244.

66

Carlton SM, Du J, Zhou S, Coggeshall RE. Tonic control of peripheral cutaneous nociceptors by somatostatin receptors. J Neurosci 2001b; 21: 4042-4049. Carlton SM, Zhou S, Kraemer B, Coggeshall RE. A role for peripheral somatostatin receptors in counterirritation-induced analgesia. Neuroscience. 2003; 120: 499-508. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997; 389: 816-824. Caterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen-Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum AI, Julius D. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science 2000; 288: 306-313. Cesare P, McNaughton P. A novel heat-activated current in nociceptive neurons and its sensitization by bradykinin. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 15435-15439. Cesare P, Dekker LV, Sardini A, Parker PJ, McNaughton PA. Specific involvement of PKC-epsilon in sensitization of the neuronal response to painful heat. Neuron. 1999; 23: 617-624. Chan CW, Dalliere M. Subjective pain sensation is linearly correlated with the flexion reflex in man. Brain Res 1989; 479: 145-150. Chou TC, Chang LP, Li CY, Wong CS, Yang SP. The antiinflammatory and analgesic effects of baicalin in carrageenan-evoked thermal hyperalgesia. Anesth Analg 2003; 97: 1724-1729. Chrubasik J. Somatostatin and chronic pain management. In: Parris WCW (ed.) Contemporary issues in chronic pain management. Kluwer, Boston, 1991; pp. 87-96. Chu CJ, Huang SM, De Petrocellis L, Bisogno T, Ewing SA, Miller JD, Zipkin RE, Daddario N, Appendino G, Di Marzo V, Walker JM. N-oleoyldopamine, a novel endogenous capsaicin-like lipid that produces hyperalgesia. J Biol Chem 2003;278:13633-13639. Coderre TJ, Melzack R. Cutaneous hyperalgesia: contributions of the peripheral and central nervous systems to the increase in pain sensitivity after injury. Brain Res 1987; 404: 95-106. Corsi MM, Ticozzi C, Netti C, Fulgenzi A, Tiengo M, Gaja G, Guidobono F, Ferrero ME.. The effect of somatostatin on experimental inflammation in rats. Anesth Analg 1997; 85: 1112-1115. Courteix S, Eschalier A, Lavarenne J. Streptozotocin-induced diabetic rats: behavioural evidence for a model of chronic pain. Pain 1993; 53: 81-88. Crandall M, Kwash J, Yu W, White G. Activation of protein kinase C sensitizes human VR1 to capsaicin and to moderate decreases in pH at physiological temperatures in Xenopus oocytes. Pain. 2002; 98: 109-117. Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latcham J, Clapham C, Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PL, Rogers DC, Bingham S, Randall A, Sheardown SA. Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature 2000; 405: 183-187. Devor M, Seltzer Z. Pathophysiology of damaged nerves in relation to chronic pain. In: Wall PD & Melzack R (eds.). Textbook of Pain. Fourth Edition. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK. 1999. pp. 79-100. Dirig DM, Isakson PC, Yaksh TL. Effect of COX-1 and COX-2 inhibition on induction and maintenance of carrageenan-evoked thermal hyperalgesia in rats. J Pharmacol Exp Ther 1998; 285: 1031-1038.

67

Docherty RJ, Yeats JC, Piper AS. Capsazepine block of voltage-activated calcium channels in adult rat dorsal root ganglion neurones in culture. Br J Pharmacol 1997; 121: 1461-1467. Dong ZQ, Xie H, Ma F, Li WM, Wang YQ, Wu GC. Effects of electroacupuncture on expression of somatostatin and preprosomatostatin mRNA in dorsal root ganglions and spinal dorsal horn in neuropathic pain rats. Neurosci Lett 2005; 385: 189-194. Dray A, Perkins M. Bradykinin and inflammatory pain. Trends Neurosci 1993; 16: 99-104. Dubuisson D, Dennis SG. The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats. Pain 1977; 4: 161-174. Eschalier A, Aumaitre O, Ardid D, Fialip J, Duchene-Marullaz P. Long-lasting antinociceptive effect of RC-160, a somatostatin analog, in mice and rats. Eur J Pharmacol 1991; 199: 119-121. Facci L, Dal Toso R, Romanello S, Buriani A, Skaper SD, Leon A. Mast cells express a peripheral cannabinoid receptor with differential sensitivity to anandamide and palmitoylethanolamide. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 3376-3380. Farquhar-Smith WP, Jaggar SI, Rice AS. Attenuation of nerve growth factor-induced visceral hyperalgesia via cannabinoid CB1 and CB2-like receptors. Pain 2002; 97: 11-21. Fioravanti A, Govoni M, La Montagna G, Perpignano G, Tirri G, Trotta F, Bogliolo A, Ciocci A, Mauceri MT, Marcolongo R. Somatostatin 14 and joint inflammation: evidence for intraarticular efficacy of prolonged administration in rheumatoid arthritis. Drugs Exp Clin Res 1995; 21: 97-103. Fitzgerald M, Lynn B. The sensitization of high threshold mechanoreceptors with myelinated axons by repeated heating. J Physiol 1977; 265: 549-563. Fox A, Kesingland A, Gentry C, McNair K, Patel S, Urban L, James I. The role of central and peripheral Cannabinoid1 receptors in the antihyperalgesic activity of cannabinoids in a model of neuropathic pain. Pain 2001; 92: 91-100. Fukuoka T, Tokunaga A, Kondo E, Miki K, Tachibana T, Noguchi K. Change in mRNAs for neuropeptides and the GABA(A) receptor in dorsal root ganglion neurons in a rat experimental neuropathic pain model. Pain 1998; 78: 13-26. Fukuoka T, Tokunaga A, Tachibana T, Dai Y, Yamanaka H, Noguchi K. VR1, but not P2X3, increases in the spared L4 DRG in rats with L5 spinal nerve ligation. Pain 2002; 99: 111-120. Galoyan SM, Petruska JC, Mendell LM. Mechanisms of sensitization of the response of single dorsal root ganglion cells from adult rat to noxious heat. Eur J Neurosci 2003; 18: 535-541. Gaumann DM, Yaksh TL. Intrathecal somatostatin in rats: antinociception only in the presence of toxic effects. Anesthesiology 1988; 68: 733-742. Gelgor L, Butkow N, Mitchell D. Effects of systemic non-steroidal anti-inflammatory drugs on nociception during tail ischaemia and on reperfusion hyperalgesia in rats. Br J Pharmacol 1992; 105: 412-416. Gunthorpe MJ, Benham CD, Randall A, Davis JB. The diversity in the vanilloid (TRPV) receptor family of ion channels. Trends Pharmacol Sci 2002; 23: 183-191. Gybels J, Handwerker HO, Van Hees J. A comparison between the discharges of human nociceptive nerve fibres and the subject's ratings of his sensations. J Physiol 1979; 292: 193-206.

68

Hamura H, Yoshida M, Shimizu K, Matsukura T, Suzuki H, Narita M, Suzuki T. Antinociceptive effect of the combination of pentazocine with morphine in the tail-immersion and scald-pain tests in rats. Jpn J Pharmacol 2000; 83: 286-292. Hardy JD, Wolff HG, Goodell H. Experimental evidence on the nature of cutaneous hyperalgesia. J Clin Invest 1950; 29: 115-140. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain 1988; 32: 77-88. Helyes Zs Thán M, Oroszi G, Pintér E, Németh J, Kéri G, Szolcsányi J. Anti-nociceptive effect induced by somatostatin released from sensory nerve terminals and by synthetic somatostatin analogues in the rat. Neurosci Lett 2000; 278: 185-188. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Thán M, Oroszi G, Horváth A, Szolcsányi J. Anti-inflammatory effect of synthetic somatostatin analogues in the rat. Br J Pharmacol 2001; 134: 1571-1579. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J. Pharmacological targets for the inhibition of neurogenic inflammation. Curr Med Chem AIAA 2003; 2: 191-218. Helyes Zs, Szabó Á, Németh J, Jakab B, Pintér E, Bánvölgyi Á, Kereskai L, Kéri Gy, Szolcsányi J. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum 2004; 50: 1677-1685. Helyes Zs, Pintér E, Szolcsányi J. TT-232. Somatostatin sst1/sst4 receptor agonist. Treatment of neuropathic pain. Treatment of inflammation. Drug Future 2005; 30: 558-566. Hendershot LC, Forsaith J. Antagonism of the frequency of phenylquinone-induced writhing in the mouse by weak analgesics and nonanalgesics. J Pharmacol Exp Ther 1959; 125: 237-240. Herzberg U, Eliav E, Bennett GJ, Kopin IJ. The analgesic effects of R(+)-WIN 55,212-2 mesylate, a high affinity cannabinoid agonist, in a rat model of neuropathic pain. Neurosci Lett 1997; 221: 157-160. Hőgyes A. Beitrage zur physiologischen Wirkung der Bestandteile des Capsicum annuum. Arch Exp Pathol Pharmacol 1878; 9: 117-130. Hoyer D, Bell GI, Berelowitz M, Epelbaum J, Feniuk W, Humphrey PP, O'Carroll AM, Patel YC, Schonbrunn A, Taylor JE, Reisine T. Classification and nomenclature of somatostatin receptors. Trends Pharmacol Sci 1995; 16: 86-88. Hudson LJ, Bevan S, Wotherspoon G, Gentry C, Fox A, Winter J. VR1 protein expression increases in undamaged DRG neurons after partial nerve injury. Eur J Neurosci. 2001; 13: 2105-2114. Huang SM, Bisogno T, Trevisani M, Al-Hayani A, De Petrocellis L, Fezza F, Tognetto M, Petros TJ, Krey JF, Chu CJ, Miller JD, Davies SN, Geppetti P, Walker JM, Di Marzo V. An endogenous capsaicin-like substance with high potency at recombinant and native vanilloid VR1 receptors. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 8400-8405. Hwang SW, Cho H, Kwak J, Lee SY, Kang CJ, Jung J, Cho S, Min KH, Suh YG, Kim D, Oh U. Direct activation of capsaicin receptors by products of lipoxygenases: endogenous capsaicin-like substances. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 6155-6160.

69

Jaggar SI, Hasnie FS, Sellaturay S, Rice AS. The anti-hyperalgesic actions of the cannabinoid anandamide and the putative CB2 receptor agonist palmitoylethanolamide in visceral and somatic inflammatory pain. Pain 1998; 76: 189-199. Jakab B, Helyes Zs, Varga A, Bölcskei K, Szabó Á, Sándor K, Elekes K, Börzsei R, Keszthelyi D, Pintér E, Pethő G, Németh J, Szolcsányi J. Pharmacological characterization of the TRPV1 receptor antagonist JYL1421 (SC0030) in vitro and in vivo in the rat. Eur J Pharmacol 2005; 517: 35-44. Jancsó N, Jancsó-Gábor A. Dauerausschaltung der chemischen Schmerzempfindlichkeit durch Capsaicin. Naunyn-Schmierdebergs Arch Exp Path Pharmak 1959; 236: 142-145. Jancsó N. Role of nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions. Bull Millard Fillmore Hosp, Buffalo, NY 1960; 7: 53-77. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J. Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br J Pharmacol Chemother 1967; 31: 138-151. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J. The role of sensory nerve endings in neurogenic inflammation induced in human skin and in the eye and paw of the rat. Br J Pharmacol Chemother 1968; 33: 32-41. Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J. Action of rare earth metal complexes on neurogenic as well as on bradykinin-induced inflammation. J Pharm Pharmacol 1970; 22: 366-371. Johanek LM, Simone DA. Activation of peripheral cannabinoid receptors attenuates cutaneous hyperalgesia produced by a heat injury. Pain 2004; 109: 432-442. Jun JH, Yaksh TL. The effect of intrathecal gabapentin and 3-isobutyl gamma-aminobutyric acid on the hyperalgesia observed after thermal injury in the rat. Anesth Analg 1998; 86: 348-354. Kéri Gy, Érchegyi J, Horváth A, Mező I, Idei M, Vántus T, Balogh Á, Vadász Zs, Bökönyi Gy, Seprődi J, Teplán I, Csuka O, Tejeda M, Gaál D, Szegedi Zs, Szende B, Roze C, Kalthoff H, Ullrich A. A tumor-selective somatostatin analog (TT-232) with strong in vitro and in vivo antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93: 12513-12518. Khan AA, Raja SN, Manning DC, Campbell JN, Meyer RA. The effects of bradykinin and sequencerelated analogs on the response properties of cutaneous nociceptors in monkeys. Somatosens Mot Res 1992; 9: 97-106. Kindgen-Milles D, Klement W, Arndt JO. The nociceptive systems of skin, paravascular tissue and hand veins of humans and their sensitivity to bradykinin. Neurosci Lett 1994; 181: 39-42. Koplas PA, Rosenberg RL, Oxford GS. The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurosci 1997; 17: 3525-3237. LaMotte RH, Thalhammer JG, Torebjörk HE, Robinson CJ. Peripherial neuronal mechanisms of cutaneous hyperalgesia following mild injury by heat. J Neurosci 1982; 2: 765-781. Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW. Animal models of nociception. Pharmacol Rev 2001; 53: 597-652. Lembeck F, Donnerer J, Barthó L. Inhibition of neurogenic vasodilation and plasma extravasation by substance P antagonists, somatostatin and [D-Met2, Pro5]-enkephalinamide. Eur J Pharmacol 1982; 85: 171-176. Lewin GR, Ritter AM, Mendell LM. Nerve growth factor-induced hyperalgesia in the neonatal and adult rat. J Neurosci 1993; 13: 2136-2148.

70

Lichtman AH, Martin BR. Spinal and supraspinal components of cannabinoid-induced antinociception. J Pharmacol Exp Ther 1991; 258: 517-523. Liu L, Simon SA. Capsazepine, a vanilloid receptor antagonist, inhibits nicotinic acetylcholine receptors in rat trigeminal ganglia. Neurosci Lett 1997; 228: 29-32. Liu L, Simon SA. The influence of removing extracellular Ca2+ in the desensitization responses to capsaicin, zingerone and olvanil in rat trigeminal ganglion neurons. Brain Res 1998; 809: 246-252. Löfgren O, Qi Y, Lundeberg T. Inhibitory effects of tachykinin receptor antagonists on thermally induced inflammatory reactions in a rat model. Burns 1999; 25: 125-129. Lundell JC, Silverman DG, Brull SJ, O'Connor TZ, Kitahata LM, Collins JG, LaMotte R. Reduction of postburn hyperalgesia after local injection of ketorolac in healthy volunteers. Anesthesiology 1996; 84: 502-509. Lyfenko A, Vlachova V, Vyklicky L, Dittert I, Kress M, Reeh PW. The effects of excessive heat on heatactivated membrane currents in cultured dorsal root ganglia neurons from neonatal rat. Pain 2002; 95: 207-214. Maggi CA, Santicioli P, Geppetti P, Parlani M, Astolfi M, Pradelles P, Patacchini R, Meli A. The antagonism induced by ruthenium red of the actions of capsaicin on the peripheral terminals of sensory neurons: further studies. Eur J Pharmacol 1988; 154: 1-10. Maggi CA. Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog Neurobiol 1995; 45: 1-98. Malmberg AB, Basbaum AI. Partial sciatic nerve injury in the mouse as a model of neuropathic pain: behavioral and neuroanatomical correlates. Pain 1998; 76: 215-222. Manning DC, Raja SN, Meyer RA, Campbell JN. Pain and hyperalgesia after intradermal injection of bradykinin in humans. Clin Pharmacol Ther 1991; 50: 721-729. Martin HA, Basbaum AI, Kwiat GC, Goetzl EJ, Levine JD. Leukotriene and prostaglandin sensitization of cutaneous high-threshold C- and A-delta mechanonociceptors in the hairy skin of rat hind limbs. Neuroscience 1987; 22: 651-659. Matsuda LA, Lolait SJ, Brownstein MJ, Young AC, Bonner TI. Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature. 1990; 346: 561-564. Matucci-Cerinic M, Borrelli F, Generini S, Cantelmo A, Marcucci I, Martelli F, Romagnoli P, Bacci S, Conz A, Marinelli P, Marabini S. Somatostatin-induced modulation of inflammation in experimental arthritis. Arthritis Rheum 1995; 38: 1687-1693. Meyer RA, Campbell JN. Myelinated nociceptive afferents account for the hyperalgesia that follows a burn to the hand. Science. 1981 25; 213: 1527-1529. Moiniche S, Pedersen JL, Kehlet H. Topical ketorolac has no antinociceptive or anti-inflammatory effect in thermal injury. Burns. 1994; 20: 483-486. Mollenholt P, Post C, Rawal N, Freedman J, Hökfelt T, Paulsson I. Antinociceptive and 'neurotoxic' actions of somatostatin in rat spinal cord after intrathecal administration. Pain. 1988; 32: 95-105. Moriyama T, Higashi T, Togashi K, Iida T, Segi E, Sugimoto Y, Tominaga T, Narumiya S, Tominaga M. Sensitization of TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of prostaglandins. Mol Pain 2005; 1: 3-15.

71

Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature. 1993; 365: 61-65. Negus SS, Butelman ER, Al Y, Woods JH. Prostaglandin E2-induced thermal hyperalgesia and its reversal by morphine in the warm-water tail-withdrawal procedure in rhesus monkeys. J Pharmacol Exp Ther 1993; 266: 1355-1363. Németh J, Helyes Zs, Görcs T, Gardi J, Pintér E, Szolcsányi J. Development of somatostatin radioimmunoassay for the measurement of plasma and tissue contents of hormone. Acta Physiol Hung 1996; 84: 313-315. Németh J, Görcs T, Helyes Zs, Oroszi G, Kocsy T, Pintér E, Szolcsányi J Development of a new sensitive CGRP radioimmunoassay for neuropharmacological research. Neurobiology (Bp.) 1998; 6: 473-475. Nozaki-Taguchi N, Yaksh TL. A novel model of primary and secondary hyperalgesia after mild thermal injury in the rat. Neurosci Lett 1998; 254: 25-28. O'Callaghan JP, Holzman SG. Quantification of the analgesic activity of narcotic antagonists by a modified hot plate procedure. J Pharmacol Exp Ther 1975; 192: 497-505. Patel YC. Somatostatin and its receptor family. Front Neuroendocrinol 1999; 20: 157-198. Peier AM, Moqrich A, Hergarden AC, Reeve AJ, Andersson DA, Story GM, Earley TJ,Dragoni I, McIntyre P, Bevan S, Patapoutian A. A TRP channel that senses cold stimuli and menthol. Cell 2002; 108: 705-715. Pertwee RG. Pharmacology of cannabinoid CB1 and CB2 receptors. Pharmacol Ther 1997; 74: 129-180. Pertwee RG. Cannabinoid receptors and pain. Prog Neurobiol 2001; 63: 569-611. Pintér E, Szolcsányi J. Systemic anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of the dorsal roots in the rat. Neurosci Lett 1996; 212: 33-36. Pintér E, Helyes Zs, Németh J, Pórszász R, Pethő G, Thán M, Kéri Gy, Horváth A, Jakab B, Szolcsányi J. Pharmacological characterisation of the somatostatin analogue TT-232: effects on neurogenic and non-neurogenic inflammation and neuropathic hyperalgesia. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002; 366: 142-150. Pitchford S, Levine JD. Prostaglandins sensitize nociceptors in cell culture. Neurosci Lett 1991; 132: 105108. Premkumar LS, Ahern GP. Induction of vanilloid receptor channel activity by protein kinase C. Nature 2000; 408: 985-990. Raja SN, Meyer RA, Ringkamp M, Campbell JN. Peripheral neural mechanisms of nociception. In: Wall PD & Melzack R (eds.). Textbook of Pain. Fourth Edition. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK. 1999. pp. 11-57. Randall LO, Selitto JJ. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch Int Pharmacodyn Ther 1957; 111: 409-419. Rashid MH, Inoue M, Kondo S, Kawashima T, Bakoshi S, Ueda H. Novel expression of vanilloid receptor 1 on capsaicin-insensitive fibers accounts for the analgesic effect of capsaicin cream in neuropathic pain. J Pharmacol Exp Ther 2003a; 304: 940-948.

72

Rashid MH, Inoue M, Bakoshi S, Ueda H. Increased expression of vanilloid receptor 1 on myelinated primary afferent neurons contributes to the antihyperalgesic effect of capsaicin cream in diabetic neuropathic pain in mice. J Pharmacol Exp Ther 2003b; 306: 709-717. Rathee PK, Distler C, Obreja O, Neuhuber W, Wang GK, Wang SY, Nau C, Kress M. PKA/AKAP/VR-1 module: A common link of Gs-mediated signaling to thermal hyperalgesia. J Neurosci 2002; 22: 4740-4745. Richardson JD, Kilo S, Hargreaves KM. Cannabinoids reduce hyperalgesia and inflammation via interaction with peripheral CB1 receptors. Pain 1998; 75: 111-119. Sann H, Pintér E, Szolcsányi J, Pierau FK. Peptidergic afferents might contribute to the regulation of skin blood flow. Agents Actions 1988; 23: 14-15. Saria A. Substance P in sensory nerve fibers contributes to the development of oedema in the rat hind paw after thermal injury. Br J Pharmacol 1984; 82: 217-222. Scott DA, Wright CE, Angus JA. Evidence that CB1 and CB2 cannabinoid receptors mediate antinociception in neuropathic pain in the rat. Pain 2004; 109: 124-131. Seltzer Z, Dubner R, Shir Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 1990; 43: 205-218. Shu XQ, Mendell LM. Neurotrophins and hyperalgesia. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 7693-7696. Shu X, Mendell LM. Acute sensitization by NGF of the response of small-diameter sensory neurons to capsaicin. J Neurophysiol 2001; 86: 2931-2938. Siegling A, Hofmann HA, Denzer D, Mauler F, De Vry J. Cannabinoid CB1 receptor upregulation in a rat model of chronic neuropathic pain. Eur J Pharmacol 2001; 415: R5-7. Sluka KA. Systemic morphine in combination with TENS produces an increased antihyperalgesia in rats with acute inflammation. J Pain 2000; 1: 204-211. Smart D, Gunthorpe MJ, Jerman JC, Nasir S, Gray J, Muir AI, Chambers JK, Randall AD, Davis JB. The endogenous lipid anandamide is a full agonist at the human vanilloid receptor (hVR1). Br J Pharmacol 2000; 129: 227-230. Smith PB, Compton DR, Welch SP, Razdan RK, Mechoulam R, Martin BR. The pharmacological activity of anandamide, a putative endogenous cannabinoid, in mice. J Pharmacol Exp Ther 1994; 270: 219-227. Smith FL, Fujimori K, Lowe J, Welch SP. Characterization of ∆9-tetrahydrocannabinol and anandamide antinociception in nonarthritic and arthritic rats. Pharmacol Biochem Behav 1998; 60: 183-191. Stein C. The control of pain in peripheral tissue by opioids. N Engl J Med 1995; 332: 1685-1690. Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, Hricik TR, Earley TJ, Hergarden AC, Andersson DA, Hwang SW, McIntyre P, Jegla T, Bevan S, Patapoutian A. ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell 2003; 112: 819-829. Sugiura T, Tominaga M, Katsuya H, Mizumura K. Bradykinin lowers the threshold temperature for heat activation of vanilloid receptor 1. J Neurophysiol 2002; 88: 544-548. Szolcsányi J. A pharmacological approach to elucidation of the role of different nerve fibres and receptor endings in mediation of pain. J Physiol (Paris) 1977; 73: 251-259.

73

Szolcsányi J. Capsaicin and neurogenic inflammation: history and early findings. In: Chahl LA, Szolcsányi J. and Lembeck F. (eds.) Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1984a; pp. 7-26. Szolcsányi J. Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensory-efferent function. In: Chahl LA, Szolcsányi J. and Lembeck F. (eds.) Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1984b; pp. 27-53. Szolcsányi J. Sensory receptors and the antinociceptive effects of capsaicin. In: Hakanson R. & Sundler F. (eds.) Tachykinin Antagonists. Elsevier, Amsterdam, 1985; pp. 45-54. Szolcsányi J. Capsaicin and nociception. Acta Physiol Hung 1987; 69: 323-332. Szolcsányi J. Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents Actions 1988; 23: 4-11. Szolcsányi J. Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions: facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanism. Prog Brain Res 1996; 113: 343-359. Szolcsányi J. Are cannabinoids endogenous ligands for the VR1 capsaicin receptor? Trends Pharmacol Sci 2000a; 21: 41-42. Szolcsányi J. Anandamide and the question of its functional role for activation of capsaicin receptors. Trends Pharmacol Sci 2000b; 21: 203-204. Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A. Sensory effects of capsaicin congeners I. Relationship between chemical structure and pain-producing potency of pungent agents. Arzneimittelforschung 1975; 25: 18771881. Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A, Joó F. Functional and fine structural characteristics of the sensory neuron blocking effect of capsaicin. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1975; 287: 157-169. Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E. Release of somatostatin and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. Br J Pharmacol 1998a; 123: 936-942. Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J. Systemic anti-inflammatory effect induced by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. Br J Pharmacol 1998b; 125: 916-922. Szolcsányi J, Sándor Z, Pethő G, Varga A, Bölcskei K, Almási R, Riedl Zs, Hajós G, Czéh G. Direct evidence for activation and desensitization of the capsaicin receptor by N-oleoyldopamine on TRPV1 transfected cell line, gene deleted mice and in the rat. Neurosci Lett 2004; 361: 155-158. ten Bokum AM, Hofland LJ, van Hagen PM. Somatostatin and somatostatin receptors in the immune system: a review. Eur Cytokine Netw 2000; 11: 161-176. Thán M, Németh J, Szilvássy Z, Pintér E, Helyes Zs, Szolcsányi J. Systemic anti-inflammatory effect of somatostatin released from capsaicin-sensitive vagal and sciatic sensory fibres of the rat and guineapig. Eur J Pharmacol 2000; 399: 251-258. Tjolsen A, Berge OG, Hunskaar S, Rosland JH, Hole K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain 1992; 51: 5-17. Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann BE, Basbaum AI, Julius D. The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron 1998; 21: 531-543.

74

Tominaga M, Wada M, Masu M. Potentiation of capsaicin receptor activity by metabotropic ATP receptors as a possible mechanism for ATP-evoked pain and hyperalgesia. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 6951–6956. Torebjörk HE, Ochoa JL. Specific sensations evoked by activity in single identified sensory units in man. Acta Physiol Scand 1980; 110: 445-447. Ueda H. Molecular mechanisms of neuropathic pain-phenotypic switch and initiation mechanisms. Pharmacol Ther 2006; 109: 57-77. Van Hees J, Gybels J. C nociceptor activity in human nerve during painful and non painful skin stimulation. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1981; 44: 600-607. Vaughan CW, Connor M, Bagley EE, Christie MJ. Actions of cannabinoids on membrane properties and synaptic transmission in rat periaqueductal gray neurons in vitro. Mol Pharmacol 2000; 57: 288-295. Vellani V, Mapplebeck S, Moriondo A, Davis JB, McNaughton PA. Protein kinase C activation potentiates gating of the vanilloid receptor VR1 by capsaicin, protons, heat and anandamide. J Physiol 2001; 534: 813-825. Vulcu SD, Rupp J, Wiwie C, Gillen C, Jostock R, Nawrath H. The cAMP pathway sensitizes VR1 expressed in oocytes from Xenopus laevis and in CHO cells. Pharmacology 2003; 69: 38-43. Vyklicky L, Knotkova-Urbancova H, Vitaskova Z, Vlachova V, Kress M, Reeh PW. Inflammatory mediators at acidic pH activate capsaicin receptors in cultured sensory neurons from newborn rats. J Neurophysiol 1998; 79: 670-676. Wahl P, Foged C, Tullin S, Thomsen C. Iodo-resiniferatoxin, a new potent vanilloid receptor antagonist. Mol Pharmacol 2001; 59: 9-15. Wang S, Lim G, Yang L, Zeng Q, Sung B, Jeevendra Martyn JA, Mao J.A rat model of unilateral hindpaw burn injury: slowly developing rightwards shift of the morphine dose-response curve. Pain. 2005; 116: 87-95. Watson GS, Sufka KJ, Coderre TJ. Optimal scoring strategies and weights for the formalin test in rats. Pain 1997; 70: 53-58. Weckbecker G, Lewis I, Albert R, Schmid HA, Hoyer D, Bruns C. Opportunities in somatostatin research: biological, chemical and therapeutic aspects. Nat Rev Drug Discov 2003; 2: 999-1017. Woolfe G, MacDonald AL. The evaluation of the analgesic action of pethidine hydrochloride (Demerol). J Pharmacol Exp Ther 1944; 80: 300-307. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain 1983; 16: 109-110. Zygmunt PM, Petersson J, Andersson DA, Chuang H, Sorgard M, Di Marzo V, Julius D, Hogestatt ED. Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature 1999; 400: 452-457.

75

A disszertáció alapjául szolgáló publikációk

Eredeti közlemények 1. Helyes Zs., Németh J., Thán M., Bölcskei K., Pintér E., Szolcsányi J. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci 2003; 73: 2345-2353. IF: 1,944 Citáció (független/összes): 6/9 2. Szolcsányi J., Bölcskei K., Szabó Á., Pintér E., Pethő G., Elekes K., Börzsei R., Almási R., Szűts T., Kéri Gy., Helyes Zs. Analgesic effect of TT-232, a heptapeptide somatostatin analogue, in acute pain models of the rat and the mouse and in streptozotocin-induced diabetic mechanical allodynia. Eur J Pharmacol 2004; 498: 103-109.

IF: 2,432 Citáció (független/összes): 3/4

3. Bölcskei K., Helyes Zs., Szabó Á., Sándor K., Elekes K., Németh J., Almási R., Pintér E., Pethő G., Szolcsányi J. Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-deficient mice. Pain 2005; 117: 368-376.

IF (2004): 4,061

Idézhető absztraktok 1. Helyes Zs., Németh J., Thán M., Bölcskei K., Pethő G., Szolcsányi J. Inhibitory effect of anandamide on neuropathic hyperalgesia and sensory neuropeptid release mediated by CB1 receptors in the rat. Neuropeptides 2002; 36: 467.

IF: 1,48

2. Helyes Zs., Bölcskei K., Pintér E., Pethő G., Németh J., Bánvölgyi Á., Szolcsányi J. Analgesic effect of TT-232, a heptapeptide somatostatin analogue, in acute and chronic pain models of the rat. Br J Pharmacol 2003; 138 Proc Suppl: 218. IF: 3,611 3. Bölcskei K., Pethő G., Szolcsányi J. Heat Injury-Induced Drop of the Noxious Heat Threshold: A Novel Method for the Study of Thermonociception and Its Pharmacological Modulation. Pharmacology 2004; 72: 147.

IF:1,132

76

Kongresszusi előadások / poszterbemutatások 1. Helyes Zs., Németh J., Thán M., Bölcskei K., Pethő G., Szolcsányi J. Inhibitory effect of anandamide on neuropathic hyperalgesia and sensory neuropeptid release mediated by CB1 receptors in the rat. Neuropeptides 2002, 12th Meeting of European Neuropeptide Club, May 22-25 2002, Olsztyn, Poland. 2. Helyes Zs., Bölcskei K., Pintér E., Pethő G., Németh J., Bánvölgyi Á., Szabó Á., Szolcsányi J. Heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232, analgetikus hatása akut és krónikus fájdalom modellekben patkányban. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság V. Kongresszusa, Debrecen, 2002. december 12-14. 3. Helyes Zs., Bölcskei K., Pintér E., Pethő G., Németh J., Bánvölgyi Á. & Szolcsányi J. Analgesic effect of TT-232, a heptapeptide somatostatin analogue, in acute and chronic pain models of the rat. British Pharmacological Society 2002 Winter Meeting, Brighton, UK 7-10 January 2003. 4. Helyes Zs., Bölcskei K., Szabó Á., Pintér E., Pethő G., Elekes K., Almási R., Börzsei R., Szűts T., Kéri Gy., Szolcsányi J. A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232 analgetikus hatása akut és krónikus nociceptív modellekben patkányban. Magyar Élettani Társaság 68. Vándorgyűlése, Debrecen, 2004. június 7-9. 5. Bölcskei K., Pethő G., Szolcsányi J. Heat Injury-Induced Drop of the Noxious Heat Threshold: A Novel Method for the Study of Thermonociception and Its Pharmacological Modulation. 10th Scientific Symposium of the Austrian Pharmacological Society (APHAR), Vienna, Austria, 23-26 September 2004. 6. Pethő G., Bölcskei K., Horváth D., Szolcsányi J. Thermal hyperalgesia evoked by a mild heat injury and its pharmacological modulation as measured with a novel increasing-temperature

water

bath.

Magyar

Idegtudományi

Társaság

11.

Kongresszusa, Pécs, 2005. január 26-29. 7. Bölcskei K., Horváth D., Pethő G., Szolcsányi J. Enyhe hőtraumával indukált termális hiperalgézia patkányokon: új állatkísérletes model analgetikumok vizsgálatára. Magyarországi Fájdalom Társaság 2005. évi Tudományos Ülése, Siófok, 2005. október 21-22.

77

A disszertációban nem szereplő publikációk listája

Eredeti közlemények 1. Almási R., Pethő G., Bölcskei K., Szolcsányi J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol 2003; 139: 49-58.

IF: 3,611

2. Lázár Zs., Benkó R., Bölcskei K., Rumbus Z., Wolf M., Holzer P., Maggi C.A., Barthó L. Actions of endothelin and corticotropin releasing factor in the guinea-pig ileum: no evidence for an interaction with capsaicin-sensitive neurons. Neuropeptides 2003; 37: 220-232.

IF: 2,153

3. Szolcsányi J., Sándor Z., Pethő G., Varga A., Bölcskei K., Almási R., Riedl Zs., Hajós Gy., Czéh G. Direct evidence for activation and desensitization of the capsaicin receptor by N-oleoyldopamine on TRPV1 transfected cell line, gene deleted mice and in the rat. Neurosci Lett 2004; 361: 155-158.

IF: 2,019

4. Szabó Á., Helyes Zs., Sándor K., Bite A., Pintér E., Németh J., Bánvölgyi Á., Bölcskei K., Elekes K., Szolcsányi J. Role of TRPV1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo study using gene-deficient mice. J Pharmacol Exp Ther 2005; 314: 111-119.

IF: 4,335

5. Jakab B., Helyes Zs., Varga A., Bölcskei K., Szabó Á., Sándor K., Elekes K., Börzsei R., Keszthelyi D., Pintér E., Pethő G., Németh J., Szolcsányi J. Pharmacological characterization of the TRPV1 receptor antagonist JYL1421 (SC0030) in vitro and in vivo in the rat. Eur J Pharmacol 2005; 517: 35-44.

IF: 2,432

6. Varga A., Bölcskei K., Szőke É., Almási R., Czéh G., Szolcsányi J., Pethő G. Relative roles of protein kinase A and protein kinase C in modulation of TRPV1 receptor responsiveness in rat sensory neurons in vitro and peripheral nociceptors in vivo. Neuroscience 2006 (közlésre elfogadva)

IF: 3,45

Idézhető absztraktok 1. Bölcskei K., Almási R., Pethő G., Szolcsányi J. Inhibition of resiniferatoxin-induced drop of the noxious heat threshold by analgesics and anandamide in the rat as measured with an increasing temperature hot plate. Neuropeptides 2002; 36: 470. 78

2. Pethő G., Almási R., Bölcskei K., Szolcsányi J. Measurement of the noxious heat threshold: a novel approach to study heat hyperalgesia and the antinociceptive effects of drugs. Br J Pharmacol 2003; 138 Proc Suppl 217P. 3. Bölcskei K., Peitl B., Pethő G., Szolcsányi J. In vivo investigation of the sensory desensitizing action of TRPV1 agonists. Fund Clin Pharmacol 2004; 18 Suppl 1:56. 4. Bölcskei K., Peitl B., Pethő G., Szolcsányi J. Measurement of the homologous and heterologous desensitization evoked by TRPV1 agonists in conscious animals. Acta Physiol Hung 2004; 91: 278. 5. Varga A., Bölcskei K., Sándor Z., Almási R., Pethő G., Czéh G., Riedl Zs., Hajós Gy., Szolcsányi J. Studying of OLDA as endogenous ligand for TRPV1 capsaicin receptor in vitro and in vivo. Acta Physiol Hung 2004; 91: 372.

79

Függelék

80

International Association for the Study of Pain® Pain 16:109-110, 1983 Elsevier

Guest Editorial

Ethical Guidelines for Investigations of Experimental Pain in Conscious Animals The Committee for Research and Ethical Issues of the International Association for the Study of Pain (IASP®) is concerned with the ethical aspects of studies producing experimental pain and any suffering it may cause in animals. Such studies are essential if new and clinically relevant knowledge about the mechanisms of pain is to be acquired. Investigations in conscious animals intended to stimulate chronic pain in man are being performed. Such experiments require careful planning to avoid or at least minimize pain in the animals. Investigators of animal models for chronic pain, as well as those applying acute painful stimuli to animals, should be aware of the problems pertinent to such studies and should make every effort to minimize pain. They should accept a general attitude in which the animal is regarded not as an object for exploitation, but as a living individual. In practice, investigators engaged in research on pain in animals should consider the following guidelines aimed at minimizing pain in animals and, when submitting a manuscript, state explicitly that they have been followed. The guidelines are concerned with the importance of the investigation, the severity and the duration of the pain. 1. It is essential that the intended experiments on pain in conscious animals be reviewed beforehand by scientists and lay-persons. The potential benefit of such experiments to our understanding of pain mechanisms and pain therapy needs to be shown. The investigator should be aware of the ethical need for a continuing justification of his investigations. 2. If possible, the investigator should try the pain stimulus on himself; this principle applies for most non-invasive stimuli causing acute pain. 3. To make possible the evaluation of the levels of pain, the investigator should give a careful assessment of the animal's deviation from normal behavior. To this end, physiological and behavioral parameters should be measured. The outcome of this assessment should be included in the manuscript. 4. In studies of acute or chronic pain in animals measures should be taken to provide a reasonable assurance that the animal is exposed to the minimal pain necessary for the purposes of the experiment.

81

5. An animal presumably experiencing chronic pain should be treated for relief of pain, or should be allowed to self-administer analgesic agents or procedures, as long as this will not interfere with the aim of the investigation. 6. Studies of pain in animals paralyzed with a neuromuscular blocking agent should not be performed without a general anesthetic or an appropriate surgical procedure that eliminates sensory awareness. 7. The duration of the experiment must be as short as possible and the number of animals involved kept to a minimum. The investigators should cooperate with the Committee for Research and Ethical Issues or seek its advice. It is expected that responses from readers will help to improve these guidelines. The Committee intends to edit a comprehensive set of guidelines aimed at giving advice to investigators, local ethical committees and editors of journals who may be concerned with animal experiments on pain, or with general animal experimentation involving pain The above Guidelines have been approved by the Council of IASP in December 1982. They replace a previously published version [2] and account for comments and suggestions of scientists as solicited in a Newsletter of IASP (Pain, 13/2; 1982).

The Committee suggests that all those concerned should read the following publications:

Bowd, A.D., Ethics and animal experimentation, Amer. Psychol., 35 (1980) 224-225. Covino, B.G., Dubner, R., Gybels, J., Kosterlitz, H.W., Liebeskind, J.C., Sternbach, R.A., Vyklicky, L., Yamamura, H. and Zimmermann, M., Ethical Standards for Investigations of Experimental Pain in Animals, Pain, 9 (1980) 141-143. Halsbury, The Earl of, Ethics and the exploitation of animals, Conquest, 164 (1973) 2-11. Hoff, C., Immoral and moral uses of animals, New Engl. J. Med., 302 (1980) 115-118. Iggo, A., Experimental study of pain in animals -- ethical aspects. In: Bonica, J.J., Liebeskind, J.C. and Albe-Fessard, D.G. (Eds), Advances in Pain Research and Therapy, Vol. 3, Raven Press, New York, 1979, pp. 773-778. Smyth, D.HY., Alternatives to Animal Experiments, Scolar-RDS, London, 1978. Sternbach, R.A., The need for an animal model of chronic pain, Pain, 2 (1976) 2-4. Wall, P.D., Editorial, Pain, 1 (1975) 1-2. Wall, P.D., Editorial, Pain, 2 (1976) 1. For the Committee: Manfred Zimmermann, Chairman 1978-1990, Heidelberg (F.R.G.)

82