Testosteron
ELISA test pro kvantitativní stanovení testosteronu v lidském séru nebo plazmě Obj. číslo : 55010 96 testů
kompletní souprava
Účel použití Testosteron (17ß-hydroxy-4-androsten-3-on) je C19 steroid s molekulovou hmotností 288 Daltonů. Je to nejdůležitější mužský pohlavní hormon. U mužů je primárně tvořen ve varlatech, u žen ve vaječnících (25%), kůrou nadledvinek (25%) a periferální konverzí androstendionu (50%). Syntetizovaný testosteron je vylučován do oběhu a je transportován plazmou, vázaný na betaglobulin. Vázáno je asi 98% cirkulujícího hormonu, o zbývající části, volném testosteronu, se předpokládá, že je aktivní steroid. Stanovení testosteronu umožňuje posoudit funkci varlat nebo vaječníků. Nízké hladiny testosteronu mají za následek hypogonadismus, jeho klinický obraz je v přímém vztahu k době vývoje hormonální nedostatečnosti. V těchto poruchách je zahrnuto mnoho syndromů jako Klinefeterův nebo Turnerův, ale také kryptorchismus nebo anarchie, ale také ženské období klimakteria menopausy. Hypergonadismus díky zvýšeným hodnotám testosteronu, je zjišťován u mužských a ženských pacientů při produkci androgenů nádorem varlat, vaječníků nebo kůry nadledvinek. Zvýšená hladina testosteronu u žen může potvrzovat husitismus, virilizaci nebo polycystický syndrom vaječníků 1,2. Princip - Kompetitivní EIA Test Testosteron ELISA je založen na kompetitivní interakci testosteronu a hormon-enzymovému konjugátu o omezený počet imobilizovaných (myších) monoklonálních protilátek proti testosteronu. Množství vázaného hormonenzymového konjugátu je tedy nepřímo úměrné koncentraci testosteronu ve vzorku. Po inkubaci vzorku a hormon-enzymového konjugátu v jamce je nenavázaný konjugát odstraněn promytím. Po přidání substrátového roztoku se vyvine modré zbarvení, které se po zastavení reakce ukončovacím roztokem mění na žluté. Intenzita zbarvení je nepřímo úměrná množství testosteronu ve vzorku. Absorbance kalibrátorů a vzorků je stanovena s využitím čtečky mikrodestiček ELISA (HUMAREADER). Koncentrace neznámých vzorků je interpolována z kalibrační křivky za využití kalibrátorů séra o známých koncentracích testosteronu. Obsah soupravy [MIC]
[CAL]
[CON]
[WS]
12
Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené antitestosteronovými protilátkami (myší)
A - G Kalibrátory (bile víčko) 7x1.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru Testosteron koncentrace: 0 (A), 0,2 (B), 0,5 (C), 1,0 (D), 2,0 (E), 6,0 (F) a 16,0 (G) ng/ml 25 ml Enzymový konjugát (bílé víčko) připraveno k použití, červené Testosteron-HRP konjugát BSA 0.5 % TRIS/MOPS pufr NaCl 30 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1200 ml Trisem pufrovaná sůl TWEEN 20
[SUB]
25 ml Substrátový roztok (žluté víčko) Připravené k použití 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) Peroxid vodíku Acetátový pufr DMSO
[STOP] 14
1
ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová
pH 6.9 ± 0.2
0.05 mol/l 0.1 mol/l pH 7.3 ± 0.1 3 mmol/l 0.2 % pH 3.5 - 4 0,26 g/l 0,015% 0.05 mol/l <5% 0.5 mol/l
Lepící páska
Konzervanty: Celková koncentrace <0,7% Bezpečnostní poznámky Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické ošetření) v souladu s příslušnými předpisy. [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem.
Stabilita Při skladování při teplotě 2 – 8°C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 – 8°C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. Destičky skladované tímto způsobe lze použít do 60 dnů (viz poznámka). Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -zřeďte [WS] 1200 ml čerstvé deionizované vody do vhodné nádoby. Lahvičku roztokem několikrát propláchnete. - Stabilita: 2 týdny při 15-25 °C Vzorky Sérum nebo EDTA plasma Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky a vzorky obsahující azid sodný. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 3 dny nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] – vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] – inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] – jemně kývejte s destičkou 20-30 sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama. Pipetovací schéma Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu
Krok 1
Jamka [µl] A1...F2
[CAL] A-G;
dvakrát Vzorky, Kontroly; dvakrát
25 -[CON] 200 Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou. Inkubujte 60 min při 20...25°C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] 400
G2... -25 200
400
Krok 2 [SUB]
200
200
100
100
Inkubujte 15 min při 20...25°C (viz P8) [STOP]
Opatrně promíchejte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné
nebo během 30 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové délky 630-690 nm (je-li to možné).
Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: 1) Maximální absorbance (kalibrátor A) O.D. max. ≥ 1,0 2) Analyzuje se na třech úrovních: Koncentrace testosteronu při 80 % O.D . max. = 0,15 – 0,7 ng/ml Koncentrace testosteronu při 50 % O.D . max. = 0,82 – 3,1 ng/ml Koncentrace testosteronu při 20 % O.D . max. = 3,90 – 14,8 ng/ml Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace testosteronu v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci testosteronu v ng/ml (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. 3. Koncentraci testosteronu v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v ng/ml). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretace výsledků Výsledky musí být interpretovány s přihlédnutím ke skutečnosti, že koncentrace testosteronu vykazují cyklické změny. Krátká intenzivní námaha může mít za následek jeho zvýšení, dlouhá vyčerpávající práce snížení jeho koncentrace v séru3 . Jeho koncentraci mohou také snížit těžké nemoci (např. jater, ledvin nebo oběhu), stres, anestezie, drogy (heroin, metadon) a léky (např. antimykotika). Hodnoty < 3 ng/ml v čerstvém ranním séru jsou u dospělých mužů indikací hypogonadismu. Výskyt hypognadismu se zvyšuje u mužských pacientů s věkem. Androgenismus žen způsobený polycystickými vaječníky může být indikován hodnotami 0,6-1,5 ng/ml. Při hodnotách > 1,5 ng/ml u žen je podezření na rakovinu. Stanovení testosteronu a DHEA-S poskytuje příležitost pro odlišení nádorů produkujících androgen od ostatních nemocí testováním séra z vaječníků a kůry nadledvinek 4 . Stanovení hodnoty testosteronu samotné není postačující pro diagnózu patologických stavů. Musí být použito ve spojení s jinými klinickými projevy a diagnostickými (hormonálními) parametry. Očekávané hodnoty pohlavně zralé ženy postmenopausa chlapci před pubertou dospělí muži
Hladina testosteronu < 0,6 ng/ml < 0,8 ng/ml 0,3 – 1,2 ng/ml 3,5 – 8,6 ng/ml
konverzní koeficient: 1 ng/ml = 3,47 nmol/l
Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím technikám obecně v této laboratoři užívaným. Parametry testu Test ELISA Testosteron firmy Human má analytickou citlivost 0,05 – 0,09 ng/ml vzorku. Vzorky s koncentrací testosteronu nad 16 ng/ml musí být zředěny (1 + 9) kalibrátorem A (0 ng/ml) a znovu analyzovány. Výsledek násobte 10. Typické údaje o parametrech procesu můžete nalézt ve Verification Report dostupném na: www.human.de/data/gb/vr/EL-TESTO.pdf nebo www.human-de.com/data/gb/vr/EL-TESTO.pdf
Poznámka Výrobky jsou i po otevření stabilní do data exspirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti stanoven 60denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní práce (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality!
(* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 – 8°C).
Literatura 1. 2. 3. 4.
Kicklighter, E.J. and Norman, R.J., Clin. Chem. 43, 658-660 (1989) Schwartz, U. et al., J. Gynecol. 14, 119-130 (1981) Schürmeyeer, T. and Nieschlag, E., Int. J. Androl. 7, 276-282 (1984) Moltz, L. et al., Fertil. Steril. 42, 69-75 (1984)
Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbH Max -Planck -Ring 21 - D-65205 Wiesbaden - Germany Telefon: +49 6122 9988 0 - Telefax: +49 6122 9988 100 - eMail:
[email protected]
EL-TESTO INF 5501001 GB 06-2004-5
